JPH09508014A - ウマ動脈炎ウイルスペプチド、該ペプチドに対する抗体、及びこれらの診断検査での使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 動物においてウマ動脈炎ウイルスに対する免疫応答を生起し得るエピトープを１個以上含むペプチドまたはペプチド複合体であって、そのエピトープがウマ動脈炎ウイルスＧ_Lタンパク質（配列番号２）のアミノ酸２８〜１３７に対応するアミノ酸配列中に存在するエピトープの中から選択され、その際ペプチドはウマ動脈炎ウイルスＧ_Lタンパク質そのものではないことを特徴とするペプチドまたはペプチド複合体を提供する。この発明のペプチド及びペプチド複合体は、ウマ動脈炎ウイルスに対するワクチン及びウマ流産に関連する薬剤に用いられ、またそのペプチド及びペプチド複合体に対する抗体についてのＥＬＩＳＡアッセイを含めた結合アッセイ用の結合剤として用いられる。そのうえ、この発明のペプチド及びペプチド複合体に対する抗体及び抗血清を、ウイルスそのものを対象とするアッセイにおいて上で述べたような結合剤として用いることも可能である。

Description

【発明の詳細な説明】ウマ動脈炎ウイルスペプチド、該ペプチドに対する抗体、 及びこれらの診断検査での使用 本発明は、ウマ動脈炎ウイルス（ＥＡＶ）及びウマ動脈炎ウイルス媒介疾患に 関する組み換えＤＮＡ及び該組み換えＤＮＡによってコードされる、ワクチン製 造に用いられるタンパク質並びに診断検査キット及び診断方法に係わる。 ウイルス性ウマ動脈炎は報告されている患者がウマ及びロバのみである疾患で 、４０年ほど前から知られており、きわめて様々な臨床徴候を伴って発症する。 ＥＡＶ感染はその最も重篤な形態では流産を惹起し、この事実により前記感染は 、特に競走馬育種産業にとって潜在的に重大な商業的脅威となる。初期の獣医学 論文ではＥＡＶ感染は、流行性化膿性（ｃｅｌｌｕｌｉｔｕｓ）結膜炎またはウ マインフルエンザとして言及されている。疾患の発生は希にしか確認されず、一 本鎖ＲＮＡウイルスそれ自体の野生単離株はまれである。 上記ウイルスは呼吸経路及び交尾経路によって伝達され、血清反応陽性種牡馬 の３０％がキャリヤであると認められることから、交尾経路が特に懸念材料とな るが、これはウ イルスを放出する（ｓｈｅｄｄｉｎｇ）前記のような種牡馬は結果的に繁殖用牝 馬を感染させかねないからである。上記ウイルス、及び該ウイルスの種牡馬キャ リヤが媒介する感染の可能性の潜在的な経済的重要性に照らして、ＥＡＶの予防 処置と確実な診断との両方が必要とされている。 ＥＬＩＳＡ、ウイルス中和（ＶＮ）方式及び補体結合（ＣＦ）方式に基づく室 内検査法が開発されている（Ｃｈｉｒｎｓｉｄｅ，Ｂｒ．ｖｅｔ．Ｊ．１４８， ｐ．１８１，１９９２参照）。周知のＥＬＩＳＡは、インフルエンザなど他の疾 患及びヘルペスウイルスに関して以前に予防接種を受けたウマに由来する組織、 例えば血清等に適用した場合比較的低感度であり、一方ＶＮ及びＣＦ方式は限ら れた一時的感度しか有しない。ＶＮ検査は予防接種と自然感染とを区別できない 。 予防接種操作では、不活化ワクチン及び弱毒生ワクチンの安全性及び効力が専 ら求められてきた。生ワクチンは鼻咽腔からのウイルス放出を惹起する恐れが有 り、その結果として同じ建物内で飼われている、予防接種処理を受けていない動 物が感染しかねない。公知のホルマリン処理（ｆｏｒｍａｌｉｎｉｓｅｄ）ワク チンは確実な防御を実現し ない。 診断検査とワクチンとの両方に改良を加える試みには、様々なＥＡＶタンパク 質に対する抗体群についての研究が含まれている。特に２９Ｋエンベロープタン パク質は、マウスにおいて抗原性であり、かつ中和抗体の産生を惹起し得ること が確認されている（Ｂａｌａｓｕｒｉｙａ等，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅ ｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ７４，ｐｐ．２５２５−２５２９，１９９３）。この タンパク質の特性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）は未知であるが、本出願の優先権主張日 以後にＤｅｒｅｇｔ等によって報告された研究（Ｊ．Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏ ｌｏｇｙ ７５，ｐｐ．２４３９−２４４４）は、Ｇ_Lタンパク質に対する幾つ かのモノクローナル抗体はヌクレオキャプシドＮタンパク質に対する抗体のよう にＥＡＶ中和性であることを示している。だが、ウマでの検査結果は報告されて いない。 本発明者は、動物、特にウマに投与した時にＥＡＶに対する有効な中和免疫応 答を生起する単離ペプチドを提供し、このペプチドは結合アッセイ方式で結合剤 として用いた場合高感度のＥＡＶ抗体検出を実現する。本発明者は、上記 のようなペプチドをコードするＤＮＡも提供する。 本発明は第一の態様において、動物においてウマ動脈炎ウイルスを中和する抗 体を生成させる免疫応答を誘起し得るエピトープを１個以上含むペプチドまたは ペプチド複合体（ｐｅｐｔｉｄｅ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ）であって、前記エピ トープがウマ動脈炎ウイルス（ＥＡＶ）Ｇ_Lタンパク質のアミノ酸１９〜１３７ に対応するアミノ酸配列（配列番号３）中に存在するエピトープの中から選択さ れ、ペプチドはＧ_Lタンパク質ではないことを特徴とするペプチドまたはペプチ ド複合体を提供する。 好ましい本発明のペプチドまたはペプチド複合体はＥＡＶ Ｇ_Lのアミノ酸２ ８〜１３７に対応するアミノ酸配列（配列番号４）中に存在するエピトープを含 み、更に好ましくはＥＡＶ Ｇ_Lのアミノ酸７５〜９７に対応するアミノ酸配列 （配列番号５）、最も好ましくはアミノ酸８５〜９７に対応するアミノ酸配列（ 配列番号７）中に存在するエピトープを含む。好ましい本発明のペプチドまたは ペプチド複合体はウマ動脈炎ウイルスＧ_Lタンパク質のアミノ酸７５〜９７に対 応するアミノ酸配列またはこれと少なくとも９０％相同である配列；好ましくは ウマ動脈炎ウイ ルスＧ_Lタンパク質のアミノ酸２８〜１３７の配列（配列番号４）と少なくとも ９０％相同である配列で、ただしアミノ酸８５〜９７、より好ましくは７５〜９ ７の配列または当該配列と少なくとも９０％相同である配列に対応するアミノ酸 配列を含む。場合によっては用い得る他の望ましい同定エピトープに、アミノ酸 ３３〜４４及び５３〜６４が有る。 本発明の第二の態様は、動物においてウマ動脈炎ウイルスを中和する抗体を生 成させる免疫応答を誘起し得るエピトープを１個以上含むペプチドまたはペプチ ド複合体であって、診断薬としての使用のために前記エピトープがウマ動脈炎ウ イルスＧ_Lタンパク質のアミノ酸１９〜１３７に対応するアミノ酸配列（配列番 号３）中に存在するエピトープの中から選択されることを特徴とするペプチドま たはペプチド複合体を提供する。このようなペプチドまたはペプチド複合体は特 に、ＥＡＶを検出する診断薬として用いられる。この態様には当然ながら、上記 のような用途に充てるものとしてウマ動脈炎ウイルスＧ_Lタンパク質そのものも 含まれる。配列番号２を含むペプチドまたはペプチド複合体が好ましい。上記の ような用途のためにはＧ_Lタン パク質も包含される。しかし、ウマ動脈炎ウイルスＧ_Lタンパク質のアミノ酸１ ９〜１３７の配列（配列番号３）または配列番号４の配列と少なくとも９０％相 同である一方で配列番号２のアミノ酸７５〜９７（配列番号５）、最も好ましく はアミノ酸８５〜９７（配列番号７）、またはこれらの配列と少なくとも９０％ 相同である配列を保持する配列に対応するアミノ酸配列を含むペプチドまたはペ プチド複合体が用いられ得る。 本発明は第三の態様において、特に例えば予防または診断目的で中和抗体応答 の誘起に用いるＧ_Lを含めた、それ自体前述した単離ペプチドまたはペプチド複 合体を含有する組成物を提供する。典型的には、上記のような組成物は本発明の ペプチドまたはペプチド複合体を、医薬上許容可能な担体かまたは結合試験の使 用に適した担体いずれかと共に含有する。 本発明は第四の態様において、本発明のペプチドまたはペプチド複合体をコー ドする組み換えＤＮＡ、または該ＤＮＡから誘導されるＲＮＡと、前記ＤＮＡを 本発明のペプチドまたはペプチド複合体が発現可能であるように含むプラスミド 及び該プラスミドで形質転換された細胞とを提供 する。上記ＤＮＡは配列番号３〜７の配列及び下記表１に示した配列を有し、プ ラスミドなどのベクターの形態で細胞内に導入され得るか、または染色体組み込 みにより‘裸の（ｎａｋｅｄ）ワクチン’として用いられ得る。これらの技術は いずれも当業者には十分に理解される。 本発明は第五の態様において、特異的結合剤として本発明のペプチドもしくは ペプチド複合体、またはＧ_Lタンパク質を用いることを含む、ウマ動脈炎ウイル スに対する抗体の存在を検査する方法を提供する。このような検査は好ましくは ＥＬＩＳＡ方式を取るが、いわゆるサンドイッチアッセイにおいては本発明のペ プチドまたはペプチド複合体を固定化結合剤として、または標識した二次結合剤 として用い得る。 ペプチドまたはペプチド複合体を固定化する結合アッセイでは上記方法は、市 販のアッセイプレートを用いることによって都合好く実施でき、その際前記プレ ートを、公知のように行なう適当なインキュベーションにより本発明のペプチド またはペプチド複合体で被覆する。アッセイを行なうには、ＥＡＶ抗体に関して スクリーニングするべき試料、例えば血清試料を、典型的には例えばウェル内で プレ ートとの接触下にインキュベートし、その後試料中に存在するＥＡＶ抗体を、例 えばリポーター基に結合した抗ウマＩｇＡ、ＩｇＧまたはＩｇＭへの曝露によっ て同定する。上記リポーター基は放射ラベル、化学ラベルまたは生物ラベルの形 態を取り得る。典型的な生物ラベルは酵素または補因子、例えばビオチンであり 、リポーター基の存在に依存してリポーター反応が生起するのに必要なあらゆる 反応物への曝露によって検出される。ビオチンの場合、ウェルをストレプトアビ ジン−ペルオキシダーゼに、次いでｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩に曝露し、 ４９０ｎｍにおけるプレートの吸光度を測定し得る。 別の一具体例では、別の動物において生成させた抗ウマＩｇＡ、ＩｇＭまたは ＩｇＧ抗体を固定化し、これを用いて特異的なウマ抗体群を結合させ、次にこの ようにして得られた固定化ウマ抗体を、標識した本発明のペプチドまたはペプチ ド複合体を含有する溶液に曝露し得、それによって抗ＥＡＶ抗体の存否を、存在 するラベルの量のアッセイによって示す。結合した、及び結合していないペプチ ドまたはペプチド複合体を用いる競合アッセイなど、他のアッセイ方式も当業者 には自明である。そのようなアッセイに は、単純な稀釈検査におけるペプチドまたはペプチド複合体と抗体との凝集の単 純な観察が含まれる。 本発明は更に別の態様において、本発明のアッセイの実施に用いる検査キット も提供し、このキットは本発明のペプチド、ペプチド複合体または抗体を前記の ようなアッセイの実施に必要な任意の薬剤及び物品（ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ ｉ ｔｅｍｓ）と共に含むことを特徴とする。上記薬剤及び物品には、標識抗体、例 えばビオチニル化抗ウマＩｇＧ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ストレプトアビ ジン−ペルオキシダーゼ結合体及びｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩など、他の 結合剤または発色剤が含まれ得る。本明細書中に用いた‘ペプチド’及び‘ペプ チド複合体’という語は、エピトープ配列の免疫活性及び内容に関して本発明の 基準を満たすものであれば、オリゴペプチド、ポリペプチド及びタンパク質を包 含すると理解される。‘複合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）’という語は、生理学的 に許容可能な実体（ｅｎｔｉｔｙ）との結合を意味する。 次に本発明のペプチド、ペプチド複合体及び結合アッセイの単なる具体例を、 以下の配列表、添付図面及び実施例を参照して説明する。配列表の説明 配列番号１は、完全ＥＡＶゲノムから最初の１８塩基及びポリＡテールを除い たものに等しいＤＮＡ配列である。 配列番号２は、ＥＡＶ Ｇ_Lタンパク質（シグナル配列含む）のアミノ酸１〜 １３７に対応するアミノ酸配列である。 配列番号３は、ＥＡＶ Ｇ_Lタンパク質のアミノ酸１９〜１３７に対応するア ミノ酸配列である。 配列番号４は、ＥＡＶ Ｇ_Lタンパク質のアミノ酸２８〜１３７に対応するア ミノ酸配列である。 配列番号５は、ＥＡＶ Ｇ_Lタンパク質のアミノ酸７５〜９７に対応するアミ ノ酸配列である。 配列番号６は実施例３のＥＬＩＳＡで用いた、Ｆｐ５．ＲｓａＩにおいてＧＳ Ｔと融合したアミノ酸配列である。 配列番号７は、Ｇ_Lの８５〜９７に位置するエピトープに対応するアミノ酸配 列である。図面の説明 第１図は実施例３に述べるように行なったＦｐ５．ＲｓａＩ融合タンパク質Ｅ ＬＩＳＡによって得られたＡ₄₉₀値を、同じウマから得た試料に関するＶＮから 導いた結果 と関連させて示すグラフである。 第２図は実施例３に述べるように行なったＳｐ２５ ＥＬＩＳＡによって得ら れたＡ₄₉₀値を、同じウマから得た試料に関するＶＮから導いた結果と関連させ て示すグラフである。実施例１ 本発明のペプチド及びペプチド複合体並びにこれらをコードするＤＮＡ及びベク ターの製造 ＥＡＶタンパク質Ｇ_s、３、４、Ｇ_L、Ｍ及びＮに対応するＥＡＶ読み取り枠（ ＯＲＦ）２〜７（Ｄｅ Ｖｒｉｅｓ等，１９９２による呼称）を含むｃＤＮＡを 細菌発現ベクターｐＧＥＸ−３Ｘ及びｐＧＥＸ−２Ｔ（表１）中へクローニング し、構築物を、ＰＡＧＥを用いて融合タンパク質発現に関してスクリーニングし 、その際クローニングはプラスミド−挿入部連結体全体のＲＥ消化分析及び配列 決定によって確認した。アフィニティー精製したグルタチオン−Ｓ−トランスフ ェラーゼ（ＧＳＴ）融合タンパク質を、ウイルス中和ウマ血清パネルを用いる間 接ＥＬＩＳＡにより反応性に関してスクリーニングした。上記ＥＬＩＳＡによっ てスクリーニングした６種の融合タンパク質（Ｆｐ２． ０〜Ｆｐ７．０）のうち、ＥＡＶ Ｇ_Lのアミノ酸２８〜１３７にＧＳＴを付加 したものに対応するＦｐ５．０（ＥＡＶペプチドの内容については配列番号２参 照）のみが中和血清と強く反応した。次に、９６の中和血清と９６の非中和血清 とからなるパネルをＦｐ５．０に対して、間接ＥＬＩＳＡにより試験した。試験 したウイルス中和血清は９６中９６がＥＬＩＳＡにおいてＦｐ５．０に対し０． ４より大きいＡ₄₉₀を現わし、その際吸光度はウイルス中和抗体力価に対して線 形の相関関係を示した（第１図）。試験した９６の中和ウマ血清のうちの１２は 上記ＥＬＩＳＡにおいてＦｐ５．０に対し陽性であった。 ＯＲＦ５を用いて追加のクローニング実験を行ない、それによって融合生成物 ５．１、５．２及び５．４を得、これらをアフィニティー精製してからＥＬＩＳ Ａで試験した。上記一連の構築物のうち、Ｆｐ５．２は培養中に過発現（ｏｖｅ ｒｅｘｐｒｅｓｓ）したが、この構築物はアフィニティー精製しにくいことが判 明したので更に１ラウンドのクローニングを行ない、Ｆｐ５．ＲｓａＩを製造し た。 ウマ動脈炎ウイルスＧ_Lタンパク質のアミノ酸７５〜９７のアミノ酸配列に対 応するペプチドＳｐ２５（配列番号５）も直接合成し、これと生成物Ｆｐ５．Ｒ ｓａＩとを実施例３に述べるＥＬＩＳＡで試験した（第１図及び第２図参照）。 Ｆｐ５．ＲｓａＩは後に、１９９３年６月英国で のＥＡＶ発生の際に血清を迅速にスクリーニングするＥＬＩＳＡ検査に用い（表 ２）、またイタリア産種牡馬に対して行なわれたセロサーヴェイ（ｓｅｒｏｓｕ ｒｖｅｙ）に由来する１２６４のウマ血清の検査に用いた（表３）。実施例２ 免疫試験 Ｆｐ５．０、Ｆｐ５．ＲｓａＩ及びＳｐ２５を用いてウサギを免疫し、これら が中和抗体応答を誘起し得ることを証明した。その後３頭ずつ３グループのウマ を免疫し、それによってＳｐ２５及びＦｐ５．ＲｓａＩが、これらで免疫したい ずれのグループの場合もＥＡＶ特異的ペプチド／ペプチド複合体薬剤の投与量６ ０μｇにおいて中和抗体を誘起することを確認した。ペプチドは、スカシガイヘ モシアニン（ＫＬＨ）に結合したＳｐ２５から成る薬剤として送達し、また総て のワクチン１回分に０．５％のＤｕｐｈａｒポリマーアジュバントを添加した。 投与は０、５１及び１１４日目に行なった。Ｓｐ２５及びＲｓａＩは投与の度に 強い抗体産生を実現した。実施例３ 結合剤としてＦｐ５．ＲｓａＩまたはＳｐ２５を用いるＥ ＬＩＳＡ Ｄｙｎａｔｅｃｈ Ｉｍｍｕｌｏｎ ３マイクロタイタープレートウェルを、 ５μｇ／ｍｌの抗原を含有するｐＨ９.６の０.０５Ｍ炭酸塩緩衝液(Ｓｉｇｍａ ｃａｔ．Ｎｏ．Ｃ３０４１)１００μｌに４℃で一晩曝露することによりＦｐ ５．ＲｓａＩまたはＳｐ２５抗原で被覆した。 プレートを、リン酸緩衝食塩液（ＰＢＳ）に０．０５％のＴｗｅｅｎ ２０を 含有させたもの（以後ＰＢＳＴ）で３回洗浄し、その後３７℃で一晩、５％の正 常ヤギ血清（Ｓｅｒａｌａｂ）を含有するＰＢＳＴ（以後ＰＢＳＴＧ）１００μ ｌでブロックした。プレートを再びＰＢＳＴで３回洗浄し、使用準備を完了した 。 試験血清をＰＢＳＴＧで１：１００に稀釈し、この溶液１００μｌを上述のよ うに準備したウェルに添加し、３７℃で９０分間インキュベートした。プレート を再びＰＢＳＴで３回洗浄し、１００μｌのヤギ抗ウマＩｇＧビオチン複合体（ ＫＰＬカタログＮｏ．１６２１０２）をＰＢＳＴＧで１：１０００に稀釈するこ とによって溶液を調製し、これを各ウェルに添加した後３７℃で９０分間インキ ュベートした。プレートを再びＰＢＳＴで３回洗浄し、１ ００μｌのストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ結合体（ＫＰＬカタログＮｏ ．１４−３０−００）をＰＢＳＴＧで１：１０００に稀釈することによって溶液 を調製し、これを各ウェルに添加した後室温で３０分間インキュベートした。プ レートをＰＢＳＴで３回洗浄し、１００μｌのｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩 （Ｓｉｇｍａ ｃａｔ．Ｎｏ．Ｐ８２８７）［ｐＨ５．０の０．０５Ｍリン酸ク エン酸緩衝液（Ｓｉｇｍａ ｃａｔ．Ｎｏ．Ｐ４９２２）中に０．５ｍｇ／ｍｌ ］を各ウェルに添加し、室温で１０分間インキュベートした。５０μｌの４Ｍ Ｈ₂ＳＯ₄を添加して反応を停止させ、４９０ｎｍにおける吸光度を読み取った。 １：１００に稀釈したウマ血清は天然のＧＳＴに結合し得るので、ＧＳＴに対す る血清に関して得られる吸光度をＧＳＴ−融合タンパク質吸光度から減算しなけ ればならない。各血清サンプルを各抗原に対し、二重ウェルにおいて試験する。 いずれのＥＬＩＳＡ試験においても、八つのＥＡＶ ＶＮ陽性血清と八つのＥＡ Ｖ ＶＮ陰性血清とを内部対照として用いた。

【手続補正書】特許法第１８４条の８ 【提出日】１９９６年１月２３日 【補正内容】 １５．請求項１から１３のいずれか１項に記載のペプチドまたはペプチド複合体 をコードする組み換えＤＮＡまたはＲＮＡ。 １６．配列番号１の配列の塩基１１２１０〜１１５３８、１１１１４〜１１２９ １、１１２４０〜１１４７５、１１７３９〜１１８７６または１１２９２〜１１ ４２３に対応する配列を含む組み換えＤＮＡ。 １７．請求項１６に記載のＤＮＡに対応する配列を含む組み換えＲＮＡ。 １８．請求項１４から１７のいずれか１項に記載のＤＮＡを含むプラスミド。 １９．請求項１５に記載のＤＮＡを含むｐＧＥＸプラスミド。 ２０．請求項１から１３のいずれか１項に記載のペプチドまたはペプチド複合体 を発現させ得る、請求項１５から１９のいずれか１項に記載の組み換えＤＮＡま たはプラスミドで形質転換した細胞。 ２１．ＥＡＶ媒介疾患を検出する診断薬として用いられる、請求項１から１３の いずれか１項に記載のペプチドもしくはペプチド複合体または組成物に対して生 成した抗血清ま たは抗体。 ２２．請求項２１に記載の抗血清を、固定化された請求項１から１３のいずれか １項に記載のペプチドもしくはペプチド複合体またはＧ_Lタンパク質を結合剤と して収容したカラムを用いるアフィニティークロマトグラフィーに掛けることに よって得られることを特徴とする請求項２１に記載の抗体。 ２３．試料中に存在するウマ動脈炎ウイルスに対する抗体の存在または量を検査 する方法であって、特異的結合剤として請求項１から１３のいずれか１項に記載 のペプチドまたはペプチド複合体を用いることを含む方法。 ２４．ＥＬＩＳＡアッセイまたはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）の使用を含む ことを特徴とする請求項２３に記載の方法。 ２５．ペプチドまたはペプチド複合体をアッセイプレート上に固定化して、検査 するべき液体試料中に存在するＥＡＶ抗体を特異的に結合させるのに用いること を特徴とする請求項２３または２４に記載の方法。 ２６．ペプチドまたはペプチド複合体を標識して、アッセイプレート上に固定化 したＥＡＶ抗体の同定に用い、その 際前記抗体を、標識したペプチドまたはペプチド複合体に曝露し、その後プレー トに結合したラベルの量を測定し、このラベル量を試料における抗体の存在また は量と関係付けることを特徴とする請求項２３から２５のいずれか１項に記載の 方法。 ２７．試料においてウマ動脈炎ウイルスの存在を検査する方法であって、特異的 結合剤として請求項１から１３のいずれか１項に記載のペプチドまたはペプチド 複合体に対する抗体を用いることを含む方法。 ２８．実質的に実施例３に述べたとおりであることを特徴とする請求項２３から ２７のいずれか１項に記載の方法。 ２９．実質的に実施例１または２に述べたとおりであることを特徴とする請求項 １から１３のいずれか１項に記載のペプチドもしくはペプチド複合体またはその 使用。 ３０．試料においてウマ動脈炎ウイルスに対する抗体の存在を検出する検査キッ トであって、請求項１から１３のいずれか１項に記載のペプチドまたはペプチド 複合体を請求項２３から２８のいずれか１項に記載の方法の実施に必要な１種以 上の他の物品と共に含むキット。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 1/21 9282−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 9637−4Ｂ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｇ０１Ｎ 33/569 0276−2Ｊ Ｇ０１Ｎ 33/569 Ｌ // Ａ６１Ｋ 39/395 9284−4Ｃ Ａ６１Ｋ 39/395 Ｄ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ)，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，Ｃ Ｎ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，Ｍ Ｘ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．動物においてウマ動脈炎ウイルスを中和する抗体を生成させる免疫応答を誘 起し得るエピトープを１個以上含むペプチドまたはペプチド複合体であって、前 記エピトープがウマ動脈炎ウイルスＧ_Lタンパク質配列（配列番号２）のアミノ 酸１９〜１３７に対応するアミノ酸配列（配列番号３）中に存在するエピトープ の中から選択され、前記ペプチドはウマ動脈炎ウイルスＧ_Lタンパク質そのもの ではないことを特徴とするペプチドまたはペプチド複合体。 ２．エピトープが前記Ｇ_Lタンパク質のアミノ酸２８〜１３７に対応するアミノ 酸配列（配列番号４）中に存在するエピトープであることを特徴とする請求項１ に記載のペプチド。 ３．ウマ動脈炎ウイルスＧ_Lタンパク質のアミノ酸７５〜９７に対応するアミノ 酸配列（配列番号５）中に存在するエピトープを含むことを特徴とする請求項１ または２に記載のペプチドまたはペプチド複合体。 ４．ウマ動脈炎ウイルスＧ_Lタンパク質のアミノ酸８５〜９７に対応するアミノ 酸配列（配列番号７）中に存在するエピトープを含むことを特徴とする請求項１ または２に記 載のペプチドまたはペプチド複合体。 ５．ウマ動脈炎ウイルスＧ_Lタンパク質のアミノ酸８５〜９７に対応するアミノ 酸配列（配列番号７）またはこの配列と少なくとも９０％相同である配列を含む ことを特徴とする請求項１から４のいずれか１項に記載のペプチドまたはペプチ ド複合体。 ６．エピトープがウマ動脈炎ウイルスＧ_Lタンパク質のアミノ酸２８〜１３７に 対応するアミノ酸配列（配列番号４）またはこの配列と少なくとも９０％相同で ある配列のペプチドフラグメントの形態であることを特徴とする請求項５に記載 のペプチドまたはペプチド複合体。 ７．配列番号３、４、５、６または７に対応するアミノ酸配列のペプチド。 ８．動物においてウマ動脈炎ウイルスを中和する抗体を生成させる免疫応答を誘 起し得るエピトープを１個以上含むペプチドまたはペプチド複合体であって、ウ マ動脈炎ウイルスを検出する診断薬としての使用のために前記エピトープがウマ 動脈炎ウイルスＧ_Lタンパク質のアミノ酸１９〜１３７に対応するアミノ酸配列 （配列番号３）のペプチド中に存在するエピトープの中から選択されることを特 徴と するペプチドまたはペプチド複合体。 ９．エピトープが前記Ｇ_Lタンパク質のアミノ酸２８〜１３７に対応するアミノ 酸配列（配列番号４）のペプチド中に存在するエピトープであることを特徴とす る請求項８に記載のペプチドまたはペプチド複合体。 １０．ペプチドが更に別のペプチド、タンパク質、または他の生理学的に許容可 能な分子と結合していることを特徴とする請求項１から９のいずれか１項に記載 のペプチド複合体。 １１．グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼと結合した配列番号３、４、５、 ６または７に対応するアミノ酸配列のペプチドまたはペプチド複合体。 １２．動物に投与された時ウマ動脈炎ウイルスアミノ酸配列に対する免疫応答を 促進し得る、ペプチドまたはタンパク質と結合したウマ動脈炎ウイルスアミノ酸 配列に対応するアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項１から１１のいずれ か１項に記載のペプチド複合体。 １３．アミノ酸配列がスカシガイヘモシアニン、ウシ血清アルブミン及びニワト リ卵アルブミンの中から選択されたタンパク質と結合することを特徴とする請求 項１２に記載 のペプチド複合体。 １４．単離された請求項１から１３のいずれか１項に記載のペプチドまたはペプ チド複合体を医薬上許容可能な担体と共に含有するワクチン組成物。 １５．請求項１から１３のいずれか１項に記載のペプチドまたはペプチド複合体 をコードする組み換えＤＮＡまたはＲＮＡ。 １６．配列番号１の配列の塩基１１２１０〜１１５３８、１１１１４〜１１２９ １、１１２４０〜１１４７５、１１７３９〜１１８７６または１１２９２〜１１ ４２３に対応する配列を含む組み換えＤＮＡ。 １７．請求項１６に記載のＤＮＡに対応する配列を含む組み換えＲＮＡ。 １８．請求項１４から１７のいずれか１項に記載のＤＮＡを含むプラスミド。 １９．請求項１５に記載のＤＮＡを含むｐＧＥＸプラスミド。 ２０．請求項１から１３のいずれか１項に記載のペプチドまたはペプチド複合体 を発現させ得る、請求項１５から１９のいずれか１項に記載の組み換えＤＮＡま たはプラスミ ドで形質転換した細胞。 ２１．ＥＡＶ媒介疾患を検出する診断薬として用いられる、請求項１から１３の いずれか１項に記載のペプチドもしくはペプチド複合体または組成物に対して生 成した抗血清または抗体。 ２２．請求項２０に記載の抗血清を、固定化された請求項１から１３のいずれか １項に記載のペプチドもしくはペプチド複合体またはＧ_Lタンパク質を結合剤と して収容したカラムを用いるアフィニティークロマトグラフィーに掛けることに よって得られることを特徴とする請求項２０に記載の抗体。 ２３．試料中に存在するウマ動脈炎ウイルスに対する抗体の存在または量を検査 する方法であって、特異的結合剤として請求項１から１３のいずれか１項に記載 のペプチドもしくはペプチド複合体、または単離したウマ動脈炎ウイルスＧ_Lタ ンパク質を用いることを含む方法。 ２４．ＥＬＩＳＡアッセイまたはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）の使用を含む ことを特徴とする請求項２３に記載の方法。 ２５．ペプチドまたはペプチド複合体をアッセイプレート 上に固定化して、検査するべき液体試料中に存在するＥＡＶ抗体を特異的に結合 させるのに用いることを特徴とする請求項２３または２４に記載の方法。 ２６．ペプチドまたはペプチド複合体を標識して、アッセイプレート上に固定化 したＥＡＶ抗体の同定に用い、その際前記抗体を、標識したペプチドまたはペプ チド複合体に曝露し、その後プレートに結合したラベルの量を測定し、このラベ ル量を試料における抗体の存在または量と関係付けることを特徴とする請求項２ ３から２５のいずれか１項に記載の方法。 ２７．試料においてウマ動脈炎ウイルスの存在を検査する方法であって、特異的 結合剤として請求項１から１３のいずれか１項に記載のペプチドまたはペプチド 複合体に対する抗体を用いることを含む方法。 ２８．実質的に実施例３に述べたとおりであることを特徴とする請求項２３から ２７のいずれか１項に記載の方法。 ２９．実質的に実施例１または２に述べたとおりであることを特徴とする請求項 １から１３のいずれか１項に記載のペプチドもしくはペプチド複合体またはその 使用。 ３０．試料においてウマ動脈炎ウイルスに対する抗体の存 在を検出する検査キットであって、請求項１から１３のいずれか１項に記載のペ プチドもしくはペプチド複合体または単離されたウマ動脈炎ウイルスＧ_Lタンパ ク質を、請求項２３から２８のいずれか１項に記載の方法の実施に必要な１種以 上の他の物品と共に含むキット。 ３１．ＥＬＩＳＡ検査キットであり、１種以上の他の物品が結合剤または発色剤 の中から選択されることを特徴とする請求項３０に記載のキット。 ３２．他の物品がビオチン標識抗体、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ストレプト アビジン−ペルオキシダーゼ結合体及びｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩の中か ら選択されることを特徴とする請求項３１に記載のキット。