JPH09508535A

JPH09508535A - エリトロポエチン受容体を活性化する抗体

Info

Publication number: JPH09508535A
Application number: JP8505965A
Authority: JP
Inventors: エリオツト，ステイーブン・ジー
Original assignee: アムジエン・インコーポレーテツド
Priority date: 1994-07-26
Filing date: 1995-07-26
Publication date: 1997-09-02
Anticipated expiration: 2015-07-26
Also published as: DE69524102D1; ES2168376T3; AU697369B2; JP3225493B2; DE69535419T2; MX9700553A; DK0773962T3; ATE356148T1; US5885574A; AU3149995A; DE69535419D1; US20080182976A1; ATE209218T1; NZ290689A; EP1146056A1; US20070014793A1; EP0773962A1; IL114717A0; JP2000095800A; WO1996003438A1

Abstract

(57)【要約】エリトロポエチン受容体を活性化し且つ赤血球形成を刺激する抗体とそのフラグメントを開示する。更に、この抗体を産生するハイブリドーマ細胞系と、貧血の治療のための方法と組成物を開示する。

Description

【発明の詳細な説明】エリトロポエチン受容体を活性化する抗体発明の分野本発明は、エリトロポエチン受容体を認識する抗体に係わる。具体的には、本発明は、エリトロポエチン受容体を活性化し赤血球形成を促進する抗体に係わる。発明の背景エリトロポエチン（ＥＰＯ）は、赤血球前駆細胞の増殖と、赤血球への赤血球前駆細胞の成熟とに関与する糖タンパク質ホルモンである。ＥＰＯは、胎児生活中は肝臓で産生され、成人では腎臓によって産生され、赤血球前駆体からの赤血球細胞の産生を促進する。成人において腎不全の結果として一般的に生じるＥＰＯの産生減少は、貧血の原因となる。ＥＰＯは、エリトロポエチンをコードする遺伝子でトランスフェクトした宿主細胞からのこのタンパク質の発現と分泌を含む遺伝子工学技術によって生産されている。組換えＥＰＯの投与は貧血の治療に有効である。例えば、Ｅｓｃｈｂａｃｈら（Ｎ．ＥｎｇｌＪＭｅｄ３１６，７３（１９８７））は、慢性腎不全による貧血を治療するためにＥＰＯを使用することを記載している。ヒト尿ＥＰＯの精製は、Ｍｉｙａｋｅら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５２，５５５８（１９７７））によって記載されている。エリトロポエチンをコードする遺伝子の同定とクローニングと発現は、米国特許第４，７０３，００８号（Ｌｉｎ）に開示されている。細胞培地からの組換えＥＰＯの精製のための方法の説明は、米国特許第４，６６７，０１６号（Ｌａｉら）に含まれている。ＥＰＯが赤血球形成を促進するメカニズムについては、僅かな知識しか得られていない。ＥＰＯが特異的な細胞表面受容体に結合することによって、細胞を活性化し、その細胞の増殖及び／又は分化を促進することは明らかであるが、この活性化の固有のメカニズムと、上記受容体及びその個々の関連タンパク質の構造は、完全には理解されていない。エリトロポエチン受容体（ＥＰＯ−Ｒ）は、多量体複合体として存在すると考えられている。沈降による研究は、その分子量が３３０±４８ｋＤａであることを示唆した（Ｍａｙｅｕｘら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９４，２７１（１９９０））。架橋による研究から、上記受容体複合体が、少なくとも２つの別々のポリペプチド、即ち、６６−７２ｋＤａ種と８５、１００ｋＤａ種とから成ることが明らかになった（Ｍａｙｅｕｘら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６，２３３８０（１９９１）：ＭｃＣａｆｆｅｒｙら，Ｊ．Ｂｉｏ１．Ｃｈｅｍ．２６４，１０５０７（１９９０））。ＥＰＯ受容体の免疫沈降によって別の９５ｋＤａタンパク質も検出された（Ｍｉｕｒａ及びＩｈｌｅ，Ｂｌｏｏｄ８１，１７３９（１９９３））。別の架橋による研究によって、１１０ｋＤａ、１３０ｋＤａ及び１４５ｋＤａの複合体を含む３つのＥＰＯが明らかになった。１１０ｋＤａと１４５ｋＤａの複合体は、ＥＰＯ受容体に対する抗体で免疫沈降させることが可能だったので、ＥＰＯ受容体を含んでいた（Ｍｉｕｒａ及びＩｈｌｅ，上記）。カルボキシ末端切断ＥＰＯ受容体の発現により、１４５ｋＤａ複合体ではなく、１１０ｋＤａ複合体が検出された。このことは、分子量１４５ｋＤａの複合体が、１１０ｋＤａ複合体と追加分の３５ｋＤａタンパク質とに存在するポリペプチドを含むことを示唆している。ＥＰＯ受容体複合体の構造と機能とに関する更に別の洞察が、マウスＥＰＯ受容体とヒトＥＰＯ受容体のクローニングと発現とによって得られた（Ｄ’Ａｎｄｒｅａら，Ｃｅｌｌ５７，２７７（１９８９）；Ｊｏｎｅｓら，Ｂｌｏｏｄ７６，３１（１９９０）；Ｗｉｎｋｅｌｍａｎら，Ｂｌｏｏｄ７６，２４（１９９０）；ＰＣＴ出願第ＷＯ９０／０８８２２号；Ｄ’Ａｎｄｒｅａらの米国特許第５，２７８，０６５号）。全長ヒトＥＰＯ受容体は、約２２４アミノ酸の細胞外ドメインと２５アミノ酸のシグナルペプチドとを有する４８３アミノ酸膜貫通タンパク質である。ヒトＥＰＯ受容体は、マウス受容体と約８２％のアミノ酸配列相同性を示す。哺乳動物細胞中で発現させたクローン化全長ＥＰＯ受容体（６６−７２ｋＤａ）が、赤血球前駆細胞上の天然型受容体に対するアフィニティーと同様のアフィニティー（１００−３００ｎＭ）でＥＰＯに結合することが明らかになっている。従って、この形態は、主要なＥＰＯ結合決定基を含むと考えられ、ＥＰＯ受容体と呼ばれる。架橋複合体の一部と考えられる８５ｋＤａ及び１００ｋＤａタンパク質は、ＥＰＯ受容体とは異なっているが、ＥＰＯをこれらのタンパク質に架橋することが可能なので、ＥＰＯに極めて近いものであるはずである。８５ｋＤａ及び１００ｋＤａタンパク質は互いに関連しており、８５ｋＤａタンパク質は、１００ｋＤａ種のタンパク質分解切断生成物である可能性がある（Ｓａｗｙｅｒ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４，１３３４３（１９８９））。細胞外ドメインだけを含むＥＰＯ受容体の可溶性（切断）形態を作製し、この形態の受容体が、約１ｎＭのアフィニティーで、即ち、全長受容体の約１／３から約１／１０の低さのアフィニティーで、ＥＰＯに結合することが判明している（Ｈａｒｒｉｓら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７、１５２０５（１９９２）；Ｙａｎｇ及びＪｏｎｅｓ，Ｂｌｏｏｄ８２，１７１３（１９９３））。全長タンパク質よりもアフィニティーが低いことの原因は分かっていない。他のタンパク質種がＥＰＯＲ複合体の一部分であって、ＥＰＯ結合に寄与し、それによってアフィニティーを増大させている可能性もある。この可能性は、低アフィニティーＥＰＯ受容体を有する細胞系と、ＥＰＯに結合しないＣＨＯ細胞との融合の結果として、ＥＰＯに対する上記受容体の高いＥＰＯ結合アフィニティーを示すハイブリッド細胞系が得られたというＤｏｎｇ及びＧｏｌｄｗａｓｓｅｒ（Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２１，４８３（１９９３））の観察によって支持されている。これに加えて、全長ＥＰＯＲをＣＨＯ細胞中にトランスフェクションした結果として、Ｓｃａｔｃｈａｒｄ分析によって定量した場合に高アフィニティー受容体と低アフィニティー受容体の両方を有する細胞系が得られた。ＥＰＯＲコピー数の増幅は低アフィニティー結合を増大させたが、高アフィニティー結合を増大させなかった。これらの結果は、低アフィニティーＥＰＯＲを高アフィニティーに変換するＣＨＯ細胞中に存在するタンパク質の量が限られていることに一致している。ＥＰＯ受容体の活性化は幾つかの生物学的作用を生じさせる。この活性のうちの３つは、増殖の促進と、分化の促進と、アポプトシスの阻害である（Ｌｉｂｏｉら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０，１１３５１（１９９３）；Ｋｏｕｒｙ，Ｓｃｉｅｎｃｅ２４８，３７８（１９９０））。増殖の促進と分化の促進を起こすシグナル導入経路は互いに別々のものであると考えられる（Ｎｏｇｕｃｈｉら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８，２６０４（１９８８）；Ｐａｔｅｌら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７，２１３００（１９９２）；Ｌｉｂｏｉら，同書）。幾つかの結果は、分化シグナルを仲介するために補助タンパク質が必要である可能性を示唆している（Ｃｈｉｂａら，Ｎａｔｕｒｅ３６２，６４６（１９９３）；Ｃｈｉｂａら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０，１１５９３（１９９３））。しかし、上記受容体の構成的活性化形態が増殖と分化の両方を促進することが可能であるので、分化における補助タンパク質の役割に関しては論争がある（Ｐｈａｒｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０，９３８（１９９３））。ＥＰＯ受容体の活性化は、その二量化に起因する可能性がある。即ち、ＥＰＯは２つのＥＰＯ受容体分子の間のクロスリンカーとして働く可能性がある。この提案を支持する証拠がある。マウスＥＰＯ受容体の１２９位におけるアルギニンからシステインへの突然変異の結果として、おそらくは２つの受容体サブユニットの間に形成されるジスルフィド結合のために、受容体の構成的活性化が得られる（Ｙｏｓｉｍｕｒａら，Ｎａｔｕｒｅ３４８，６４７（１９９０））。これに加えて、細胞内の多量体複合体中にＥＰＯＲが発見されている(Ｍｉｕｒａ及びＩｈｌｅ，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３０６，２００（１９９３）)。しかし、精製ＥＰＯ可溶性受容体の安定した多量体形態の単離は現在まで報告されていない。これに加えて、ＥＰＯＲの二量化が必要とされるが、この二量化だけでは細胞の完全な活性化には不十分である可能性がある。例えば、二量化は増殖シグナルを生じさせるが、分化シグナルは生じさせない。即ち、分化シグナルを送るためには、補助タンパク質が必要である可能性がある。ＥＰＯ受容体の二量化と活性化との間の関係を、ＥＰＯとは異なっているがＥＰＯ受容体を活性化する化合物を同定するために、利用することが可能である。例えば、抗体は、抗原に対する２つの同じ結合部位を有する。抗ＥＰＯＲ抗体は２つのＥＰＯＲ分子を結合させることが可能であり、これらの分子を互いに非常に接近させ、二量化を生じさせる。インビボで機能するためには、これらの抗体は細胞表面上のＥＰＯＲを認識し、シグナル導入経路の活性化を可能にするように結合しなければならない。これに加えて、赤血球前駆細胞の増殖と分化の両方が活性化の結果として生じることが望ましい。ヒト成長ホルモン受容体（Ｆｕｈら，Ｓｃｉｅｎｃｅ２５６，１６７７（１９９２））と上皮成長因子受容体（Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７８，７５３５（１９８１））の活性化を理解するための同様のアプローチが報告されている。ＥＰＯ受容体を活性化し且つ赤血球形成を刺激する特性を有する分子を同定することが望ましいだろう。この同定を行うためには、ＥＰＯ受容体活性化とシグナル導入とのメカニズムを理解することが重要である。このメカニズムを解明するためのアプローチの１つは、ＥＰＯ受容体を活性化し且つ赤血球形成を刺激するように、ＥＰＯ受容体を認識する抗体を同定することであると考えられる。こうした抗体は、治療用途と診断用途とに有効だろうし、ＥＰＯ受容体の機能を調べるためにも有効だろう。次に示す幾つかの引例は、マウス又はヒトＥＰＯ受容体に結合する抗体を説明している。Ｄ’Ａｎｄｒｅａら（ＴｈｅＢｉｏｌｏｇｙｏｆＨｅｍｔａｏｐｏｉｅｓｉｓ，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．（１９９０）ｐｐ．１５３−１５９）は、マウスＥＰＯ受容体のアミノ末端とカルボキシ末端ペプチドに対するポリクローナル抗ペプチド抗体を作製した。この抗体がマウスＥＰＯ受容体と反応することがウエスタンブロットによって実証された。Ｂａｉｌｅｙら（Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２１，１５３５−１５４３（１９９３））は、マウスＥＰＯ受容体の細胞外ドメインと細胞質ドメインに対して相同性を有する合成ペプチドに対するポリクローナル抗ペプチド抗体を作製した。これらの抗体による受容体活性化は、フェニルヒドラジン処置マウスからの脾臓細胞の中への³Ｈチミジンの取り込みによって測定した場合には、検出されなかった。Ｂａｙｎｅｓら（Ｂｌｏｏｄ８２，２０８８−２０９５（１９９３））は、ヒトＥＰＯ受容体中のアミノ末端ペプチドに対するポリクローナル抗体を作製した。この抗体は、ヒト血清中に存在する可溶形態のＥＰＯ受容体と反応することが明らかにされた。Ｄ’Ａｎｄｒｅａら（Ｂｌｏｏｄ８２，４６−５２（１９９３））は、ヒトＥＰＯ受容体に対するモノクローナル抗体を作製した。これらの抗体は、ヒトＥＰＯｃＤＮＡクローンでトランスフェクトしたＢａ／Ｆ３細胞に結合し、その抗体の幾つかはＥＰＯ結合を阻害してＥＰＯ依存性増殖を中和した。Ｆｉｓｈｅｒら（Ｂｌｏｏｄ８２，１９７Ａ（１９９３））は、ＥＰＯ非依存性の増殖及び成熟を行う赤血球前駆細胞から、ＥＰＯ依存性の増殖及び成熟を行う赤血球前駆細胞を区別するために、Ｄ’Ａｎｄｒｅａの上記引例で示されたモノクローナル抗体と同じモノクローナル抗体を使用した。上記引例で説明されている抗体のいずれにおいても、ＥＰＯ受容体を活性化すること、又は、赤血球前駆細胞の増殖及び／もしくは成熟を刺激することは、報告されていない。従って、本発明の目的は、ＥＰＯ受容体が活性化されるようにＥＰＯ受容体を認識し且つＥＰＯ受容体に結合する、抗体を作製することである。本発明の更に別の目的は、ＥＰＯ受容体に結合し、且つ、赤血球前駆細胞の増殖及び／又は赤血球への分化を刺激することによって赤血球形成を促進する抗体を作製することである。この抗体は、貧血の治療、又は、機能不全ＥＰＯ受容体を特徴とする疾病の診断に有効である。更に、この抗体は、貧血の治療のための治療薬剤の同定を可能にするだろう。発明の要約本発明は、エリトロポエチン受容体を活性化する抗体又はそのフラグメントに係わる。ヒトＥＰＯ受容体を認識する抗体のスクリーニングによって、「Ｍａｂ７１」と「Ｍａｂ７３」と名付けた２つの抗体がＵＴ７−ＥＰＯ細胞（添加ＥＰＯが存在しない場合には増殖しないＥＰＯ依存性細胞系）の増殖を刺激したことが判明した。更に、Ｍａｂ７１は、ヒト血液中の赤血球前駆細胞からの赤血球コロニー形成を刺激した。本発明の範囲内に含まれる抗体は、Ｍａｂ７１又はＭａｂ７３によって認識されるＥＰＯ受容体の上のエピトープを認識しうる。本発明の抗体がモノクローナル抗体であることが好ましく、ヒト化抗体又はヒト抗体であることが可能である。更に、本発明の範囲内には、本発明の抗体を産生するハイブリドーマ細胞系も含まれる。更に、本発明は、生物試料中のＥＰＯ受容体を検出するための、本発明のＥＰＯ受容体抗体を含む方法とキットとを提供する。本発明のＥＰＯ受容体抗体と医薬上許容可能なアジュバントとを含む医薬組成物も、本発明の範囲内に含まれる。こうした組成物を、低赤血球レベルを特徴とする疾患を有する患者を治療するために使用することが可能である。図面の説明図１は、図に示した濃度の合成ペプチドに対するＭａｂ７１の結合を測定したＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す。ペプチドは、図に示したヒトＥＰＯ受容体のアミノ酸残基に対応する。残基１は、リーダー配列の切断時に分泌されたＥＰＯＲ中に見出されアミノ末端プロリンである。図２は、ＵＴ７−ＥＰＯ細胞の³Ｈチミジン取り込みに対する、様々な量のｒＨｕＥＰＯタンパク質と精製Ｍａｂ７１及び７３の作用を示す。図３は、ＯＣＩＭ１細胞の表面上のＥＰＯ受容体に対する¹²⁵ＩＥＰＯ結合の阻害に関する、様々な量のｒＨｕＥＰＯタンパク質、Ｍａｂ７１、Ｍａｂ７３、又は、ＥＰＯに対する非中和対照Ｍａｂ（ＭａｂＦ１２）の作用を示す。図４は、モノクローナル抗体Ｍａｂ７１及び７３精製試料と、これらの抗体に由来するモノクローナル抗体フラグメント（Ｆａｂ）精製試料の、クーマシー染色ＳＤＳゲルを示す。還元（２−メルカプトエタノールを加えた）条件、又は、非還元（２−メルカプトエタノールを除いた）条件下で、試料を泳動させた。図５は、ＵＴ７−ＥＰＯ細胞の３Ｈチミジン取り込みに対する、様々な量の精製ｒＨｕＥＰＯタンパク質、Ｍａｂ７１又はＦａｂ７１の作用を示す。図６は、組換えヒトＥＰＯ（ｒＨｕＥＰＯ）３０ｍｕｎｉｔｓ／ｍｌも加えたＵＴ７−ＥＰＯ細胞の３Ｈチミジン取り込みに対する、様々な量の精製Ｍａｂ７１又はＦａｂ７１の作用を示す。図７は、無血清増殖条件下においてＥＰＯ又はＭａｂ７１の存在下でメチルセルロース中で２１日間増殖させた、末梢血液からの精製ＣＤ３４⁺細胞の写真を示す。写真は、５００ｍｕｎｉｔｓ／ｍｌＥＰＯ（Ａ）、２５ｍｕｎｉｔｓ／ｍｌＥＰＯ（Ｂ）、又は、２．１μｇ／ｍｌＭａｂ７１（Ｃ）でインキュベートした細胞である。図８は、軟質寒天中において無血清増殖条件下で増殖させた場合の、赤血球前駆体からの赤血球コロニーの形成に対する、様々な量の精製ｒＨｕＥＰＯタンパク質、Ｍａｂ７１、及びＨｅｒ２／ｎｅｕに対する対照モノクローナル抗体の作用を示す。発明の詳細な説明エリトロポエチン受容体を認識するモノクローナル抗体（Ｍａｂ）を、精製した可溶性ヒトＥＰＯ受容体でマウスを免疫することによって産生した。実施例１と実施例２とで説明する通りに可溶性ヒトＥＰＯ受容体を発現させ精製した。酵素抗体法（ＥＬＩＳＡ）において可溶性ヒトＥＰＯ受容体と反応したＭａｂの中から、更にスクリーニングするために９６個のＭａｂを選択した。これらのＭａｂを、ＢＩＡｃｏｒｅ分析によってＥＰＯ受容体結合に関して試験し（実施例４Ａ）、且つ、トランスフェクトしたＣＨＯ細胞の表面上のＥＰＯ受容体に対する結合をＦＡＣＳによって試験した（実施例４Ｃ）。このスクリーニングの結果を表１に示す。ＥＰＯ受容体に結合した抗体の幾つかをＢＩＡｃｏｒｅ分析によって調べたところ、試験した９６個のうちで５個の抗体だけが、ＦＡＣＳ走査法で測定した時に、トランスフェクトしたＣＨＯ細胞の表面上に現れるＥＰＯ受容体に結合したにすぎなかった。ＥＬＩＳＡアッセイで陽性だった２４個の抗体（ＦＡＣＳ走査法で陽性だった５つの抗体を含む）を、ＵＴ７−ＥＰＯ細胞増殖の刺激に関して試験した。驚くべきことに、「Ｍａｂ７１」と「Ｍａｂ７３」と名付けた２つの抗体が、ＥＰＯが存在しない状態でＵＴ７−ＥＰＯ細胞系（Ｋｏｍａｔｓｕら，Ｂｌｏｏｄ８２，４５６（１９９３））中への³Ｈチミジンの取り込みを刺激した（実施例８Ａ）。このＵＴ７−ＥＰＯ細胞系の増殖のためには、培地中にＥＰＯが存在することが必要である。従って、ＵＴ７−ＥＰＯ細胞増殖の刺激は、Ｍａｂ７１とＭａｂ７３によるＥＰＯ受容体の活性化に起因する可能性が高い。図２に示すように、ＵＴ７−ＥＰＯ細胞の応答は、Ｍａｂ７１が存在する場合の方が、Ｍａｂ７３が存在する場合よりも大きかった。更に、Ｍａｂ７１が、ヒト赤血球前駆体からの赤血球コロニー形成を促進したことが判明した（実施例９を参照されたい）。これは、ヒト赤血球前駆体からの赤血球コロニー形成を刺激する抗体の最初の事例である。本発明は、エリトロポエチン受容体を活性化する抗体又はそのフラグメントを提供する。本明細書で使用する場合の用語「ＥＰＯ受容体の活性化」は、受容体をもつ細胞の内部にシグナルを導入させる、ＥＰＯ受容体が行う１つ以上の分子プロセスを意味し、このプロセスではシグナルが最終的に１つ以上の細胞生理学的変化を生じさせる。ＥＰＯ受容体活性化に対する細胞応答は、典型的には、受容体をもつ細胞の増殖又は分化の変化である。受容体をもつ細胞は一般には赤血球前駆細胞（ｅｒｙｔｈｒｏｉｄｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｃｅｌｌｓ）である。現時点では、ＥＰＯ受容体によるシグナル導入を生じさせる分子上の事象は、僅かしか解明されていない。しかし、発明の背景に示したようにのＥＰＯ受容体の二量化が、活性化に必要とされる可能性がある少なくとも１つの事象であることを、幾つかの証拠が示している。本発明の開示内容も、この考えに対する支持を与える。図５に示すように、Ｆａｂ７１と呼ばれる対応するＦａｂフラグメントでＭａｂ７１を置き換えた時には、Ｍａｂ７１によるＵＴ７−ＥＰＯ細胞中への³Ｈ−チミジンの取り込みの刺激が無効化される。従って、対応する一価フラグメントを有する完全な二価抗体が、増殖応答を排除する。これに加えて、Ｍａｂ７１は、高濃度においてＥＰＯ受容体の活性化を阻害する。これらの観察は両方とも、ＥＰＯ受容体の活性化の二量化モデルを支持する．Ｍａｂ７１がヒトＥＰＯ−Ｒの残基４９−７８の合成ペプチドと相互作用することが明らかにされた（実施例６参照）。従って、このＥＰＯ−Ｒ領域は、Ｍａｂ７１のようなクロスリンカーによって結合させられる場合に、ＥＰＯ−Ｒの活性化を生じさせることが可能である。残基４９−７８に結合することによって２つのＥＰＯ−Ｒ分子を架橋する分子も、本発明の範囲内に含まれるということを理解されたい。こうした分子は、残基４９と残基７８との間の領域内に含まれる残基に結合することによって２つのＥＰＯ受容体を架橋し、それによってＥＰＯ受容体の二量化と活性化を生じさせるという特性を有する、抗体又は他の二価の分子（ｍｏｌｅｃｕｌａｒｅｎｔｉｔｉｅｓ）であることが可能である。本発明のＥＰＯ受容体は哺乳動物ＥＰＯ受容体であることが好ましく、特に好ましい実施様態では、ヒトＥＰＯ受容体である。ヒトＥＰＯ受容体の類似体（ａｎａｌｏｇｓ）も本発明の範囲内に含まれることを理解されたい。こうした類似体は、ヒトＥＰＯ受容体配列中におけるアミノ酸の挿入、欠失、伸長（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）、又は、置換によって構築される。ＥＰＯ−Ｒ類似体の例は、米国特許第５，２９２，６５４号（Ｙｏｓｈｉｍｕｒａら）に開示されており、この文献では、ＥＰＯ−Ｒアミノ酸配列の１２９位におけるシステイン残基の置換が、構成的に活性化されたＥＰＯ−Ｒをもたらす。一般的に、活性化に必要な抗体結合ドメイン以外の領域内にアミノ酸の変化を有し且つヒトＥＰＯ受容体の二次構造と三次構造を保持するＥＰＯ−Ｒ類似体を、本発明の抗体によって認識することが可能である。Ｍａｂ７１がヒトＥＰＯ−Ｒの残基４９−７８の合成ペプチドと相互作用することが明らかにされた（実施例６参照）。従って、４９位から７８位のアミノ酸残基以外のアミノ酸残基の変化を有し且つＥＰＯ受容体の二次構造と三次構造を保持するＥＰＯ−Ｒ類似体は、Ｍａｂ７１によって認識されうる。本明細書で使用する場合の、ヒトＥＰＯ−Ｒポリペプチドにおけるアミノ酸残基の番号付けは、２５アミノ酸シグナルペプチドの切断後のアミノ末端残基である１位のプロリンから開始する。本発明の抗体は、受容体活性化に関与するＥＰＯ受容体のエピトープに結合する。実施様態の１つでは、抗体が、Ｍａｂ７１によって認識されるＥＰＯ受容体上のエピトープ、又は、Ｍａｂ７３によって認識されるエピトープを認識する。Ｍａｂ７１は、ヒトＥＰＯ−Ｒ中のアミノ酸残基４９からアミノ酸残基７８に及ぶ合成ペプチドを認識する。従って、Ｍａｂ７１が、この配列によって全体的に又は部分的に定義されるＥＰＯ−Ｒ上のエピトープを認識しうる。本明細書で使用する場合の用語「エピトープ」は、抗体がこの領域に結合し且つこの結合がＥＰＯ−Ｒに対する第２抗体の結合を妨げる、ＥＰＯ−Ｒの領域を表す。本発明は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、及び、これらのフラグメントも提供する。抗体フラグメントは、ＥＰＯ受容体を活性化する抗体フラグメントを含む。典型的には組換え法によって生産されるヒト化抗体も含み、ヒト化抗体では、ヒト配列が、ＥＰＯ受容体を活性化する抗体の一部分又は全体を含む。ヒト化抗体の例は、キメラ抗体又はＣＤＲグラフト化抗体を含む（米国特許第４，８１６，５６７号、及び、同第５，２２５，５３９号）。遺伝子操作したマウスにおいて生産されるＥＰＯ受容体に対する完全ヒト抗体も、本発明の抗体に含まれる（ＰＣＴ出願第９３／１２２２７号）。本発明の抗体は、その抗体に結合させた検出可能標識を有することも可能である。こうした標識は、例えば蛍光標識（例えば、フルオレセインイソチオシアネート、ＦＩＴＣ）、酵素標識（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ）、アフィニティー標識（例えば、ビオチン）、又は、同位体標識（例えば、¹²⁵Ｉ）である。ＥＰＯ受容体を活性化するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞系も、本発明に含まれる。１つの実施様態では、ハイブリドーマ細胞系が、Ｍａｂ７１又はＭａｂ７３によって認識されるＥＰＯ受容体上のエピトープを認識するモノクローナル抗体を産生する。ヒトＥＰＯ−Ｒに対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞系の作製は、実施例３で説明する。Ｍａｂ７１を産生するハイブリドーマ細胞系は、１９９４年７月２６日付けで、ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤに受託番号ＨＢ１１６８９として寄託されている。Ｍａｂ７３を産生するハイブリドーマ細胞系は、１９９４年７月２６日付けで、ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤに受託番号ＨＢ１１６９０として寄託されている。本発明の抗体は、機能不全ＥＰＯ−Ｒによって特徴付けられる貧血及び他の疾病を診断する上で有用である。実施様態の１つでは、活性化されることが可能なＥＰＯ受容体を生物試料の中で検出する方法が、（ａ）ＥＰＯ受容体を活性化する抗体に試料を接触させる段階と、（ｂ）上記抗体によるＥＰＯ受容体の活性化を検出する段階とを含む。生物試料は、組織標本、完全細胞、又は、その抽出物を含む。本発明の抗体を、生物試料中のＥＰＯ受容体の存在を検出するための診断キットの一部として使用することも可能である。このキットは、検出を可能にする標識を結合した抗体を使用する。本発明の抗体は、正常な又は異常な受容体を識別するために有用である。生物試料中の異常受容体の存在は、ＥＰＯ受容体の機能不全であると考えられているダイアモンド−ブラックファン貧血のような疾病の指標であってもよい。本発明の抗体は、低赤血球レベルを特徴とする疾病の治療に有用である。哺乳動物におけるＥＰＯ受容体の内因性活性を調節する方法、好ましくはＥＰＯ受容体の活性を増大させる方法が、本発明に含まれる。一般的に、エリトロポエチンによって治療可能な症状（例えば、貧血）はいずれも、本発明の抗体によって治療可能である。治療用抗体は、治療対象の疾病の種類と重症度とに適合した用量と経路によって投与され、こうした用量と経路は当業者が適宜決定することが可能である。皮下注射、筋肉内注射、又は、静脈注射による投与が好ましい。本発明は、ＥＰＯ−Ｒを活性化する治療有効量の抗体を、医薬上許容可能なアジュバントと共に含む医薬組成物を提供し、上記アジュバントを１つ以上の希釈剤、担体、保存料、乳化剤、酸化防止剤、及び／又は、安定剤から選択することが可能である。本明細書で使用する場合の術語「治療有効量」は、所与の疾病及び投与養生法に関して治療効果をもたらす抗体の量を表す。本発明では、治療効果は、治療対象の患者におけるヘマトクリットの増大によって実証されるような赤血球産生の刺激である。好ましい実施様態では、本発明の抗体は、当業者に公知の方法を使用して調製することが可能なヒト化抗体又はヒト抗体である。医薬上許容可能なアジュバントは当業者に公知であり、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，１８版，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ編，Ｍａｃｋ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ（１９９０）に詳細に示されている。本発明を更に詳細に説明するために下記の実施例を示すが、これらの実施例によって本発明の範囲を限定することは意図していない。実施例１可溶性ヒトエリトロポエチン受容体の作製Ａ．可溶性ヒトエリトロポエチン受容体の発現のためのクローンの単離Ｊｏｎｅｓら（上記）によって記載されている通りにヒトエリトロポエチン受容体を含むクローンを使用し、ＰＣＲ法によって、可溶性ヒトエリトロポエチン受容体（ｓＨｕＥＰＯＲ）の発現のためのクローンを得た。ヒトエリトロポエチン受容体のＰＣＲ増幅のためのプライマーは、５’プライマー：３’プライマー：である。ヒトＥＰＯ−Ｒを含むプラスミド２．５ｎｇ、上記の各オリゴヌクレオチドプライマー５ｐｍｏｌ、トリス塩酸（ｐＨ８．３）１０ｍＭ、ＫＣｌ５０ｍＭ、ＭｇＣｌ₂ １．５ｍＭ、各ｄＮＴＰ２００μＭ、及び、Ｔａｑポリメラーゼ１単位を使用して、ＰＣＲ反応を生じさせた。５サイクルの「９４℃で３０秒間、５０℃で１分間、７２℃で１分間」と、その後での、２０サイクルの「９４℃で３０秒間、５５℃で１分間、７２℃で１分間」とによって、増幅を行った。ＤＮＡをＧ−５０サイズ排除カラム（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍＣｏｒｐ．）を通過させて精製した後で、ＨｉｎｄＩＩＩとＸｂａＩとで消化し、ＨｉｎｄＩＩＩとＸｂａＩとで同様に消化しておいた発現ベクターｐＤＳＲα２（ＤｅＣｌｅｒｃｋら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６，３８９３（１９９１））に連結させた。所期の挿入体片を含むクローンをＤＮＡ配列分析によって確認した。ｄ４０ＥＰＯＲクローンを、全長ヒトＥＰＯＲクローンからＰＣＲによって作製した（上記参照）。ｄ４ＯＥＰＯＲのカルボキシ末端は、上記プライマー内の停止コドンの付加の結果であるｔｙｒ４６７である。ＰＣＲ増幅のためのプライマーは、５’プライマー：３’プライマー：であった。ＰＣＲ増幅は、ｐｆｕ緩衝液２（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ）中のｐｆｕポリメラーゼを使用した。反応条件は、１サイクルの「９６℃ で３０秒間、４５℃で１分間、７２℃で１分間」と、その後での、２５サイクルの「９６℃で１分間、５５ ℃で１分間、７２℃で２分間」であった。その後で、最終の７２℃インキュベーションを５分間行った。反応生成物をアガロースゲル電気泳動で分離し、約１．３Ｋｂのバンドをｇｅｎｅｃｌｅａｎキット（ＢＩＯ１０１，Ｖｉｓｔａ，ＣＡ）を使用して単離した。精製フラグメントをＰＣＲＩＩ（ＴＡｃｌｏｎｉｎｇｋｉｔ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）中に結合させた。組換え体を制限分析で同定し、配列決定し、所期の挿入体が存在することを確認した。ＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｌＩフラグメントを上記のように単離し、ＨｉｎｄＩＩＩとＳａｌＩとで予め切断した単離ｐＤＳＲα２ベクターの中に連結した。その結果得たベクターｐＤＳＲαＥＰＯＲｄ４０をＣＨＯ細胞中での発現のために使用した。Ｂ．ＣＨＯ細胞中での可溶性ヒトＥＰＯＲ及びｄ４０ＥＰＯＲの発現発現プラスミドｐＤＳＲα２−ＥＰＯＲ−Ｘは、Ｊｏｎｅｓら（上記）に示されているようにヒトＥＰＯＲアミノ酸Ｍｅｔ１−Ｐｒｏ２４９をコードする配列を含む。プラスミドｐＤＳＲａＥＰＯＲｄ４０は、Ｍｅｔ１−Ｔｙｒ４６７をコードする配列を含む。各プラスミド１０マイクログラムを、リン酸カルシウム仲介トランスフェクションによってＣＨＯ細胞中に別々に導入した（Ｗｉｇｌｅｒら，Ｃｅｌｌ１１，２３３（１９７７））。個々のコロニーを、上記ベクターからのジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子の発現に基づいて選択した。ヒトＥＰＯＲの発現を、ＲＮＡハイブリダイゼーション（Ｈｕｎｔら，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ，１９：７７９（１９９１））と、アフィニティー精製抗体を使用したウエスタンイムノブロッティングとによって検出した。これらのアッセイで陽性だった細胞系を、更に増殖させるために選択した。ＥＰＯ−Ｒ発現の増幅を促進するために、細胞系を３０ｎＭメトトレキセート（Ｍｔｘ）に適応させた。可溶性ヒトＥＰＯＲを含む順化培地の調製を、ローラーボトル（ｒｏｌｌｅｒｂｏｔｔｌｅ）と中空ファイバーバイオリアクター（ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ）の両方で行った。ローラーボトルに、増殖培地（ＤＭＥＭ：非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）と３０ｎＭＭｔｘと５％牛胎仔血清（ＦＢＳ）とを添加したＨａｍのＦ１２（１：１）培地（ＧＩＢＣＯ，ＧｒａｎｄＩｓｌａｎｄ，ＮＹ製の試薬））２００ｍＬ中の２ｘ１０⁷個の細胞を接種した。３−４日間で集密状態になった時に、ＤＭＥＭ（ＨａｍのＦ１２培地、ＮＥＡＡ、３０ｎＭＭｔｘ、無血清）２００ｍＬで置き換えた。６〜７日後に順化培地を採集して、新鮮な無血清培地で置換した。２回目と３回目の採集物を集めた。ＣｅｌｌＰｈａｒｍバイオリアクターカートリッジに、５μｇ／ｍＬゲンタマイシンを添加した増殖培地（上記の通り）中の５ｘ１０⁸個の細胞を接種した。ｐＨを７．３に維持した。無血清順化培地を調製するために、接種１２日後から開始して、細胞から血清を取り除いた。順化培地の採集を１７日目に開始した。実施例２可溶性ヒトエリトロポエチン受容体の精製可溶性組換えヒトＥＰＯＲの４つの異なった調製物を作製した。第１の調製では、エポキシ活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ６Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を、製造者の指示に概ね従って組換えヒトエリトロポエチン（ｒＨｕＥＰＯ）と結合させる。３２ｍＭＺｎＣｌ₂ ４．５ｍＬ中のｒＨｕＥＰＯ２１８ｍｇを、予め水和し且つＨ₂Ｏで洗浄したエポキシ活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ６Ｂ７．２ｇに加える。このスラリーをｐＨ１０．８に滴定し、その後で室温で一晩混合する。その後で、１Ｍの最終濃度にエタノールアミンを加えることによって、残った反応性基を全てブロックし、室温で４時間混合する。後続の段階を８℃±２℃で行った。結合した樹脂（エポキシ−ＥＰＯ）をカラム内に充填し、０．５ＭＮａＣｌ／０．１ＭＨＯＡｃ（ｐＨ４）及び０．５ＭＮａＣｌ／０．１Ｍホウ酸塩（ｐＨ８）の代替サイクルで洗浄する。カラムを１４０ｍＭＮａＣｌ／１０ｍＭトリスｐＨ７．６（ＴＢＳ）で平衡化する。このカラムに、可溶性ＥＰＯ−Ｒ（ｓＨｕＥＰＯ−Ｒ）を発現させるＣＨＯ細胞からのローラーボトルで調製した順化培地１５６０ｍＬをロードする。ロード完了後に、カラムを、３００ｍＭＮａＣｌ／１０ｍＭトリスｐＨ７．６（ＴＢＳ）で洗浄し、その後で、結合ｓＨｕＥＰＯＲを１ＭＮａＣｌ／３Ｍ尿素／１０ｍＭトリスｐＨ７．６で溶出する。２つのＵＶ₂₈₀吸収ピークが、この緩衝液によって溶出する。ｓＨｕＥＰＯＲを含む、溶出する第２のピークをプールし、Ｈ₂Ｏで２０倍に希釈する。希釈したプールを、ＭｏｎｏＱ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）の１ｍＬ予充填カラムにロードし、１０ｍＭトリスｐＨ７．６中のＮａＣｌ勾配で溶出させる。単一ピークの溶出液をプールし、小分けし、−８０℃で凍結保存した。第２の調製では、より大きなエポキシ−ＥＰＯカラムを作製する。エポキシ活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ６Ｂ２０．４ｇを水和し、Ｈ₂Ｏで洗浄し、その後でアセトンで洗浄し、最後にＨ₂Ｏ中の５０％ホルムアミド（ｐＨ１０．６）で洗浄する。Ｈ₂Ｏ１５ｍＬ中のｒＨｕＥＰＯ７２９ｍｇをｐＨ１０．６に滴定し、上記樹脂に加え、室温で一晩混合する。その後で、１Ｍの最終濃度にエタノールアミンを加えることによって、残った反応性基を全てブロックし、室温で１４０分間混合する。後続の段階を８℃±２℃で行う。エポキシ−ＥＰＯをカラム内に充填し、３Ｍ尿素／７５０ｍＭＮａＣｌ／１０ｍＭＴｒｉｓｐＨ７．６で洗浄し、その後でカラムをＴＢＳで平衡化する。ｓＨｕＥＰＯＲを発現させるＣＨＯ細胞からのバイオリアクターで調製した順化培地１００ｍＬを、ＱＳｅｐｈａｒｏｓｅＦａｓｔＦｌｏｗ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）２ｍＬと混合する。この混合物を、頻繁に混合しながら８℃±２℃で３０分間インキュベートし、その後で０．４５ミクロン硝酸セルロースボトルトップフィルター（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を通して濾過する。炉液をエポキシ−ＥＰＯカラムにロードし、２５０ｍＭＮａＣｌ／１０ｍＭトリスｐＨ７．６で洗浄し、その後で、３Ｍ尿素／７５０ｍＭＮａＣｌ／１０ｍＭトリスｐＨ７．６で溶出する。溶出ピークをプールし、Ｈ₂ Ｏで２０倍に希釈する。希釈したプールを、ＱＳｅｐｈａｒｏｓｅＦａｓｔＦｌｏｗの１５ｍＬカラムに充填し、１０ｍＭトリスｐＨ７．６中のＮａＣｌ勾配で溶出させる。溶出した単一ピークをプールし、小分けし、−８０℃で凍結保存した。第３の調製では、第２の調製で使用したのと同じエポキシ−ＥＰＯカラムを使用する。ｓＥＰＯ−Ｒを発現させるＣＨＯ細胞からのローラーボトル作製順化培地８５０ｍＬを、ＱＳｅｐｈａｒｏｓｅＦａｓｔＦｌｏｗ１．７ｍＬと混合する。この混合物を第２の調製の処理方法と同じ方法で処理する。第４の調製では、ｓＨｕＥＰＯＲを発現させるＣＨＯ細胞からのバイオリアクター作製順化培地７．２５Ｌを、ＱＳｅｐｈａｒｏｓｅＦａｓｔＦｌｏｗ１１０ｍＬと混合する。この混合物を、頻繁に混合しながら８℃±２℃で１時間インキュベートし、その後で０．４５ミクロン硝酸セルロースボトルトップフィルターを通して濾過する。濾液をＨ₂Ｏ７．２５Ｌで希釈し、２０ｍＭトリスｐＨ７．６で平衡化したＱＳｅｐｈａｒｏｓｅＦａｓｔＦｌｏｗの７７０ｍＬカラムにロードする。２０ｍＭトリスｐＨ７．６中のＮａＣｌ勾配でカラムから溶出させる。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に基づく多量のｓＨｕＥＰＯＲを含むフラクションをプールする。固体（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄をそのプールに加えて最終濃度１．２Ｍにした後で、０．４５ミクロン硝酸セルロースボトルトップフィルターを通して濾過する。濾液をＰｈｅｎｙｌＳｅｐｈａｒｏｓｅ６（ｌｏｗｓｕｂ，Ｐｈａｒｍａｃｉａ）の６０ｍＬカラムにロードし、２０ｍＭトリスｐＨ７．６中の１．２Ｍ →０Ｍ（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄減少勾配で溶出させる。主要溶出ピークをプールし、（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄中２．４Ｍにし、ｓＨｕＥＰＯＲｔを沈殿させる。沈殿ｓＨｕＥＰＯＲを遠心によって採集し、Ｈ₂Ｏで再懸濁させ、トリス塩酸でｐＨ７．９に滴定する。その結果得た溶液を０．４５ミクロン硝酸セルロースフィルターを通して濾過し、小分けし、−８０℃で凍結保存した。実施例３ハイブリドーマ細胞系の調製とスクリーニングＡ．酵素抗体アッセイ（ＥＩＡ）最初に、個々の動物の血清抗体（Ａｂ）の力価を定量し、その後で、使用可能なハイブリドーマをスクリーニングするためにＥＩＡを行った。平底、高結合、９６穴マイクロ滴定ＥＩＡ／ＲＩＡプレート（ＣｏｓｔａｒＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）を、炭酸塩−炭酸水素塩緩衝液（ｐＨ９．２）（０．０１５ＭＮａ₂ＣＯ₃、０．０３５ＭＮａＨＣＯ₃）１ｍＬ当たり５μｇの精製ｓＨｕＥＰＯＲでコーティングした。上記Ａｂ５０μＬを各穴に加えた。その後でプレートをアセテートフィルム（ＩＣＮＢｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．，ＣｏｓｔａＭｅｓａ，ＣＡ）で覆い、ロッキング台（ｒｏｃｋｉｎｇｐｌａｔｆｏｒｍ）上で、室温（ＲＴ）で２時間、又は、４℃で一晩、インキュベートした。ｓＨｕＥＰＯＲのロット＃１を第１と第２のブーストの後に使用し、ロット＃２を第３のブーストの後に使用した。ｓＨｕＥＰＯＲのロット＃３とロット＃４をハイブリドーマのスクリーニングのために使用した。ＢＳＡ希釈／ブロッキング液濃厚液（ＫｉｒｋｅｇａａｒｄａｎｄＰｅｒｒｙＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）１部を脱イオン水（ｄＨ₂Ｏ）１部と混合することによって調製した５％ＢＳＡ溶液を穴１個当たり２５０μＬ使用して、ＲＴで３０分間ブロッキングした。ブロッキング液を除去したのち、血清２倍希釈液（１：４００から１：５１２００）、又は、ハイブリドーマ組織培養上清液を、各々の穴に加えた。血清希釈液は１％ＢＳＡ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏのリン酸緩衝塩水（Ｄ−ＰＢＳ）（ＧｉｂｃｏＢＲＬ，ＧｒａｎｄＩｓｌａｎｄ，ＮＹ）中に１：１０に希釈した１０％ＢＳＡ希釈／ブロッキング濃厚液）であり、一方、ハイブリドーマ上清液を未希釈のまま試験した。ハイブリドーマ試験の場合には、１つの穴を結合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）対照とし、別の穴を陽性Ａｂ対照とした。再びプレートをッキングさせながらＲＴで１時間インキュベートし、その後で、ｄＨ₂ Ｏ中の洗浄液２０ｘ濃厚液（ＫｉｒｋｅｇａａｒｄａｎｄＰｅｒｒｙＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）の１ｘ調製物を使用して４回洗浄した。その後で、１％ＢＳＡで１：１０００に希釈したヤギ抗マウスＩｇＧＨ鎖及びＬ鎖特異性西洋ワサビペルオキシダーゼ結合第二Ａｂ（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を、各穴内で３０分間インキュベートした。上記のようにプレートを洗浄し、ブロッティングによって乾燥させ、ＡＢＴＳペルオキシダーゼ単一成分基質（ＫｉｒｋｅｇａａｒｄａｎｄＰｅｒｒｙＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を加えた。ＭｉｃｒｏｐｌａｔｅＥＬ３１０読み取り装置（Ｂｉｏ−ｔｅｋＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．）を使用して各々の穴毎に４０５ｎｍで吸光度を読み取った。「血清希釈度」対「４０５ｎｍでの光学密度」のｌｏｇ₁₀をプロットし、その血清によって得られる最大光学密度の５０％ポイントで外挿することによって、血清抗体の半最大力価を計算した。光学密度がバックグラウンドの５倍よりも大きい場合にハイブリドーマを陽性として選択した。Ｂ．免疫化４．５週齢のＢａｌｂ／ｃマウス（ＣｈａｒｌｅｓＲｉｖｅｒｓＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）１０匹に対し、Ｆｒｅｕｎｄ完全アジュバント（ＣＦＡ；５０％ｖ／ｖ；ＤｉｆｃｏＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）中に乳濁させたｓＨｕＥＰＯＲ（ロット＃１）（抗原）５０μｇを皮下注射（ＳＱＩ）した。４週間後に、Ｆｒｅｕｎｄ不完全アジュバント（ＩＣＦＡ；ＤｉｆｃｏＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）を使用して上記と同様に調製した抗原（Ａｇ；ロット＃１）２５μｇでこれらの動物をブーストした（ＳＱＩ）。９日後にマウスの血液を尾から採取し、血清抗体（Ａｂ）力価を酵素抗体アッセイ（ＥＩＡ）によって定量した。各々のマウスの半最大力価は約５０００に増大し、個々の動物をハイブリドーマ調製のために選択した。目的のハイブリッド（＃７１Ａ及び７３Ａ）を作製するために使用した３匹の動物（＃７、＃８、＃９）に対して、１２．５μ ｇのＡｇ（ロット１）と２５μｇのＡｇ（ロット２）とを別々に使用して５週目と２９週目とに追加のブーストを行うことが必要だった。これらのブーストを、最初のブーストと同様に、即ち、５０％ｖ／ｖＩＣＦＡ中の乳濁液を使用して行った。血清Ａｂ力価を、各ブーストの９日後に、モニターし続けた。これらのマウスの融合前の最終力価は、動物＃７では５０２６、動物＃８では６８４２、動物＃９では１２、９４５であった。Ｃ．細胞融合最終ブーストの８週間後に、ｓＨｕＥＰＯＲ（ロット＃３）２５μｇを動物＃７、＃８、＃９に静脈内注射した。その４日後に、二酸化炭素でマウスを死亡させ、２００Ｕ／ｍＬペニシリンＧと２００μｇ／ｍＬ硫酸ストレプトマイシンと４ｍＭグルタミンとを含むＤｕｌｂｅｃｃｏの改良Ｅａｇｌｅｓ培地（２ｘＰ／Ｓ／ＧＤＭＥＭ）２５ｍＬの中に、無菌条件下で脾臓を取った。その脾臓から余分の脂肪組織を取り除き、清浄な「２ｘＰ／Ｓ／ＧＤＭＥＭ」を入れた３つのディッシュを通して洗浄した。その次に、「２ｘＰ／Ｓ／ＧＤＭＥＭ」１０ｍＬを含む無菌ストマッカーバッグ（ｓｔｏｍａｃｈｅｒｂａｇ）（Ｔｅｋｍａｒ，Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ，ＯＨ）に脾臓を移し、ＳｔｏｍａｃｈｅｒＬａｂＢｌｅｎｄｅｒ８０（ＳｅｗａｒｄＬａｂｏｒａｔｏｒｙＵＡＣＨｏｕｓｅ，Ｌｏｎｄｏｎ，Ｅｎｇｌａｎｄ）によって破砕して単一細胞懸濁液にした。細胞を脾臓包被から培地中に放出させた時には、細胞を上記バッグから取り出し、７０μｍナイロンメッシュセルストレーナー（ｎｙｌｏｎｍｅｓｈｃｅｌｌｓｔｒａｉｎｅｒ）（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎａｎｄＣｏｍｐａｎｙ；ＬｉｎｃｏｌｎＰａｒｋ，ＮＪ）を通過させた。上記バッグ中の培地を新鮮な培地と入れ替え、脾臓の細胞内容物全てが放出され終わるまで上記手順を続けた。これらの脾臓細胞を、２２５ｘｇで１０分間遠心することによって３回洗浄した。第１の融合では、動物＃９からの脾臓細胞を使用した。第２の融合では、動物＃７と動物＃８からの脾臓細胞をプールした。これと同時に、完全培地（ＤＭＥＭ）１０％牛胎仔血清、２ｍＭグルタミン、０．１ｍＭ非必須アミノ酸、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１０ｍＭＨｅｐｅｓバッファ；ＧｉｂｃｏＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＧｒａｎｄＩｓｌａｎｄ，ＮＹ）中で増殖させたＳｐ２／０−Ａｇ１４マウス骨髄腫細胞（ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤから受託番号ＣＲＬ１５８１として入手可能）の対数増殖期培養物を、上記と同様に洗浄した。この骨髄腫細胞集団から、４×１０⁷個の細胞（融合１）又は８×１０⁷個の細胞（融合２）を採取し、脾臓細胞懸濁液と混合し、再びペレット化した。この細胞ペレットから培地を吸引し、「融合１」に関しては、３７℃のポリエチレングリコール（ＰＥＧ１５００ＭＷｔ；ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）２ｍＬを、「融合２」に関しては、同ＰＥＧ３．５ｍＬを、１分間に亙って上記培地中に穏やかに混合した。その後で、等容量の「２ｘＰ／Ｓ／ＧＤＭＥＭ」をゆっくりと加えた。細胞を３７℃で２分間静置し、その後で追加の「２ｘＰ／Ｓ／ＧＤＭＥＭ」９ｍＬを加えた。細胞を再び４分間３７ ℃に置いた。最後に、「２ｘＰ／Ｓ／ＧＤＭＥＭ」３０ｍＬを細胞懸濁液に加え、遠心分離によって細胞をペレット化した。ペレットから培地を吸引し、細胞を、１００Ｕ／ｍＬペニシリンＧと１００μｇ／ｍＬ硫酸ストレプトマイシンとを含む完全培地約５６ｍＬ（融合１）又は約７４ｍＬ（融合２）の中に穏やかに再懸濁させた。５ｍＬピペットからの一滴ずつの滴下によって１０枚の９６穴平底組織培養プレート（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎＬａｂｗａｒｅ；ＬｉｎｃｏｌｎＰａｒｋ，ＮＪ）上に分配した。プレートを、３７℃、５％ＣＯ₂の条件下で、一晩に亙って加湿環境中でインキュベートした。その翌日に、等容量の選択培地を各々の穴に加えた。その選択培地は、完全培地中０．１ｍＭヒポキサンチンと４×１０^-4ｍＭアミノプテリンと１．６ｘ１０^-2ｍＭチミジンとから構成されていた。融合プレートを７−１０日間インキュベートし、このインキュベート期間中に培地を２回交換した。ＨＡＴ選択培地を各々の流体交換の後で使用した。ハイブリッドを収容した個々の穴から組織培養上清液を採取し、ｓＨｕＥＰＯＲに対する特異的抗体活性をＥＩＡで検査した。ＥＩＡで陽性だった９６穴に対して更にスクリーニングを行った。Ｄ．ドットブロット還元ｓＨｕＥＰＯＲ（ロット＃４）のドットブロットを、ＥＩＡ陽性ハイブリドーマの二次スクリーニング方法として使用した。ＤｏｔＢｌｏｔＳＦＭｉｃｒｏｔｉｔｒａｔｉｏｎＡｐｐａｒａｔｕｓ（Ｂｉｏ−ＲａｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）を、そのインストラクションマニュアルに従って準備し、ニトロセルロース膜（９ｘ１２ｃｍ，Ｂｉｏ −ＲａｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）を使用した。まず最初に、トリス緩衝塩水液（ＴＢＳ；１０ｍＭトリスｐＨ７．５、１５４ｍＭＮａＣｌ、０．０１％ｗ／ｖアジ化ナトリウム）中の２−メルカプトエタノール（５％ｖ／ｖ、Ｂｉｏ−ＲａｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）と共に還元条件下で５分間沸騰させることによって、抗原を調製した。ｓＨｕＥＰＯＲ（ロット＃４）２５ｎｇを各々の穴にロードし、結合のためにニトロセルロース膜を通して吸引した。２５０ｐＬのＢｌｏｔｔｏ−Ｔｗｅｅｎ溶液（ブロック液；２％ｗ／ｖ脱脂粉乳、５０ｍＭトリスｐＨ７．５、２５ｍＭＮａＣｌ、０．１ｍＭＥＤＴＡ、０．０９％ｖ／ｖＴｗｅｅｎ２０、０．０１％ｖ／ｖ消泡剤Ａ）を穴にロードし、ＲＴで３０分間インキュベートした。ブロック液を穴から吸引し、この手順を２度繰り返して、ニトロセルロース膜上の非特異的部位を完全にブロッキングした。その後で、０．１％ｖ／ｖポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（Ｔｗｅｅｎ−２０；Ｂｉｏ−ＲａｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）を含むＤ−ＰＢＳを使用して上記膜を通して３回洗浄した。その次に、ＥＩＡ陽性ハイブリドーマ順化培地９５μｌを各々の穴に加え、ＲＴで４５分間インキュベートした。ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（２０ｍＭトリスｐＨ７．５、５０ｍＭＮａＣｌ、０．０２％ｖ／ｖＴｗｅｅｎ２０）を１回の洗浄当たり２５０μＬ使用して穴を３回洗浄し、更に、ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（２０ｍＭトリスｐＨ７．５、０．５ＭＮａＣｌ、０．０９％ｖ／ｖＴｗｅｅｎ２０）を１回の洗浄当たり２５０μＬ使用して穴を２回洗浄し、各々の添加を行った後に膜を通して吸引した。ヤギ抗マウスＩｇＧＨ鎖及びＬ鎖特異性ＨＲＰ結合第二抗体（ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ中に１：１０００に希釈；ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）１００μＬを、各々の穴の中でＲＴで４５分間インキュベートした。膜を上記のように洗浄し、ブロット装置から取り除き、調製したＥｎｈａｎｃｅｄＣｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔＲｅａｇｅｎｔ（ＥＣＬ試薬；ＡｍｅｒｓｈａｍＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ＡｒｌｉｎｇｔｏｎＨｅｉｇｈｔｓ，ＩＬ）の中に浸し、Ｘ−ＯＭＡＴＡＲフィルム（ＫｏｄａｋＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＩｍａｇｉｎｇ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮｅｗＹｏｒｋ）に対し露光した。１５秒後にフィルムをフィルムカセットから取り出し現像した。個々のハイブリドーマ上清液のドットの強度に基づいた各々の穴の評点は、３＋から０だった。実施例４ＥＰＯＲに結合する抗ＥＰＯＲ抗体Ａ．ＢＩＡｃｏｒｅ分析によるＥＰＯＲに結合する抗体表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）（Ｆｉａｇｅｒｓｔａｍら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ３，２０８（１９９０）；Ｍａｌｍｂｏｒｙら，Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３５，６４３（１９９２）））に基づく実時間生物特異性相互作用分析（ｒｅａｌ−ｔｉｍｅｂｉｏｓｐｅｃｉｆｉｃｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓ）（ＢＩＡ，ＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｓｅｎｓｏｒＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を、ＥＬＩＳＡ陽性モノクローナル抗体のスクリーニングのために使用した。実施例１と実施例２で説明した通りに調製した可溶性ＨｕＥＰＯＲを、第一アミン基を介してセンサーチップＣＭ５に共有結合させた。ＨＢＳ（１０ｍＭＨＥＰＥＳｐＨ７．４、１５０ｍＭＮａＣｌ、３．４ｍＭＥＤＴＡ、０．０５％ＢＩＡｃｏｒｅ界面活性剤Ｐ−２０）中で５μＬ／分の流速で固定化を行った。最初に、ＥＤＣ（水中の４００ｍＭＮ−エチル−Ｎ−（ジメチルアミン− プロピル）カルボジイミド、ＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｓｅｎｓｏｒＡＢ）とＮＨＳ（水中の１００ｍＭＮ−ヒドロキシスクシンイミド、ＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｓｅｎｓｏｒＡＢ）との１：１混合物を４０μＬ注入することによって、センサーチップのカルボキシル化マトリックスを活性化した。可溶性ＥＰＯＲ（１０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ４．０中の５０μｇ／ｍＬ）６５μＬを注入し、センサーチップ上に固定化した。センサーチップの余分の反応性基をエタノールアミン（ＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｓｅｎｓｏｒＡＢ）５０μＬの注入によって不活性化した。各々の分析サイクルは、上記チップの再生のための、ハイブリドーマ上清液２０μＬの注入と、その後の、１０ｍＭＨＣｌ１０μＬの注入とを含んだ。ＳＰＲ応答を共鳴単位（ＲｅｓｏｎａｎｃｅＵｎｉｔ）（ＲＵ）で測定する。殆どのタンパク質では、１００００ＲＵが、約１ｎｇ／ｍｍ²の表面濃度に相当する。ＥＩＡで陽性だった９６個の穴をスクリーニングした結果を表１に示す。これらの実験では、バックグラウンドは典型的には約２０ＲＵである。ＥＰＯＲへの結合は５０ＲＵ以上で有意である。表に示した抗体を分泌するハイブリドーマで順化した組織培養培地を、表に示すアッセイで試験した。表に示す抗体全てを含む上清液が、ＥＬＩＳＡアッセイで陽性シグナルを示した。＋＋＋、＋＋、＋は、陽性応答を示し、＋＋＋は最大の効果を示す応答を表す。−は対照培地の応答より小さいか又はそれに等しい応答を表す。ＮＴは、試料を試験しなかったことを示す。？は、応答を示すことが不可能だった試料を示す。（１）抗体１−６１は、マウス＃７と＃８からの抗体である。抗体６２−９６はマウス＃９からの抗体である。（２）ｓＨｕＥＰＯＲが付着したバイアコアチップ（ｂｉａｃｏｒｅｃｈｉｐ）を使用するＭａｂによる応答単位。（３）ＢＩＡＣＯＲＥ上における競合は抗ｓＨｕＥＰＯＲＭａｂ１Ｇ２に対するものだった。センサーチップに結合させたｓＨｕＥＰＯＲを１Ｇ２と共にインキュベートした後に、１Ｇ２と共に予めインキュベートすることがなかったＥＰＯＲに対する結合に比較してＭａｂ結合に対する効果を定量した。結合が完全に（８０−１００％）ブロックされた抗体がＡである。結合が５０−８０％ブロックされた抗体がＣである。結合が５０％未満ブロックされた抗体がＢである。（４）対照（１２、７３）よりも高い平均蛍光を細胞に与えた抗体の値を示す。「−」は、対照よりも低いか又はそれに等しい平均蛍光を有する抗体を示す。（５）ＵＴ７−ＥＰＯ細胞による³Ｈ取り込みの阻害。３０ｍｕｎｉｔｓのＥＰＯと様々な量の抗体をＵＴ７−ＥＰＯ細胞と共にインキュベートした。一晩インキュベートした後に、細胞を³Ｈチミジンでパルス標識し、取り込まれたカウントの量を定量した。陽性応答を、「抗体量の増加につれて取り込みが漸進的に減少する応答」と定義した。（６）ＵＴ７−ＥＰＯ細胞による³Ｈ取り込みの刺激。様々な量の抗体をＵＴ７ −ＥＰＯ細胞と共にインキュベートした。一晩インキュベートした後に、細胞を³ Ｈチミジンでパルス標識し、取り込まれたカウントの量を定量した。陽性応答を、「抗体量の増加につれて取り込みが漸進的に増加する応答」と定義した。（７）阻害は、活性化に必要な濃度よりも高い濃度で確認された。Ｂ．エピトープ競合分析ｓＨｕＥＰＯＲで固定化したセンサーチップをハイブリドーマ上清液１Ｇ２６５μＬの注入によって飽和させることが可能だった。１Ｇ２は、実施例３で説明した手順を使用してｓＨｕＥＰＯＲに対して生じさせたモノクローナル抗体である。各々の分析サイクルは、１Ｇ２６５μＬの注入によるエピトープの飽和を伴う、又は、この飽和を伴わない、ハイブリドーマ上清液２０μＬの注入を含んでいた。「１Ｇ２飽和後にハイブリドーマ上清液２０μＬを注入した場合の結合シグナル（ＲＵ）」対「ハイブリドーマ上清液２０μＬを注入しただけの場合の結合シグナル（ＲＵ）」の比率を、１Ｇ２によるブロッキング％として定義する。ブロッキング８０−１００％の抗体を「グループＡ」と表し、ブロッキング５０％以下の抗体を「グループＢ」と表し、ブロッキング５０ −８０％の抗体を「グループＣ」と表す。分析結果を表１に示す。Ｃ．蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）分析による、トランスフェクトしたＣＨＯ細胞上のｄ４０ＥＰＯＲに結合する抗体ＥＰＯＲに対して生じさせたハイブリドーマ上清液を、ＦＡＣＳ分析によって、ｐＤＳＲａＥＰＯＲｄ４０でトランスフェクトしたＣＨＯ細胞の表面上のＥＰＯ受容体に対する結合に関して試験した。ｄ４０ＥＰＯ受容体をコードするＤＮＡでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞を、実施例１で説明した通りに構築した。ＣＨＯ／ＥＰＯＲ細胞を組織培養ディッシュから擦り取り、ＰＢＳ／０．５％ＢＳＡの溶液中に単一細胞として再懸濁させ、その後で、細胞約３ｘ１０⁵個／穴の割合で９６穴丸底プレートの中に分配した。このプレートを１０００ｘｇの遠心機の中に５分間置いた。遠心後にＰＢＳ／ＢＳＡ上清液を取り除き、ペレット化した細胞の各々を、対照培地、又は、ＥＰＯＲハイブリドーマ上清液の１つの中に再懸濁させた。細胞を４℃で１時間インキュベートした。インキュベーション後に、細胞をＰＢＳ／ＢＳＡで洗浄し、その後で、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識ヤギ抗マウスモノクローナル抗体（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ，ＢｉｒｍｉｎｇｈａｍＡｌａ．）中に再懸濁させた。細胞を再び４℃で１時間インキュベートし、洗浄し、ＦＡＣＳで分析した。試験した９６種の上清液の中で、５つの上清液が対照培地よりも大きい平均細胞蛍光を有した（表１を参照されたい）。Ｍａｂ７１は、最高レベルの蛍光を示し、その次に、Ｍａｂ７４、Ｍａｂ５８、Ｍａｂ７３、Ｍａｂ８７が続いた。試験した他の上清液はいずれも、対照培地の値を上回る蛍光を示さなかった。実施例５抗ＥＰＯＲ抗体とＦａｂフラグメントの精製Ａ．腹水の生産５週齢以上のＢａｌｂ／ｃマウス（ＣｈａｒｌｅｓＲｉｖｅｒｓＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）を、細胞系の注入を行う７から１０日前に、２，４，１０，１４−テトラメチル−ペンタデカン（Ｐｒｉｓｔａｎｅ；Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で初回感作した。各々のマウスに対して０．５ｍＬの腹腔内注入を１回行った。腹水がその細胞系各々に関して調製されることになっている個々の細胞系を、各細胞系毎に１０匹から２０匹の動物に注入した。集密状態が得られるまで完全培地中で増殖させたハイブリドーマ細胞系を、Ｄ −ＰＢＳで１回洗浄した後に、ＮｅｕｂａｕｅｒＨｅｍａｃｙｔｏｍｅｔｅｒを使用してカウントした。各々のマウスに１０⁷個の細胞を腹腔内注入し、その後で、腹水が発生するまで、ＲｏｄｅｎｔＬａｂＣｈｏｗと水を任意に摂取させて生存させた。最大腹水形成に関してマウスを観察し、ＣＯ₂で死亡させ、腹水で満たされた腹腔内に挿入した１８Ｇ注射針を使用して穿刺し、腹水を収集した。マイクロ遠心機（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）内で２２５ｘｇで１５分間又は３分間遠心することによって清澄化した。その後で、４ｍＬアリコートを−２０℃で貯蔵し、その後、プロテインＡカラムクロマトグラフィーで精製した。Ｂ．モノクローナル抗体のプロテインＡ精製腹水４ｍＬ又はハイブリドーマ順化培地１０ｍＬからの免疫グロブリンを、プロテインＡカラムクロマトグラフィーで精製した。Ｂｉｏ−ＲａｄＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｙＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍＩＩ（ＭＡＰＳＩＩ；Ｂｉｏ−ＲａｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）を使用した。簡潔に説明すると、Ａｆｆｉ−ｇｅｌＰｒｏｔｅｉｎ−Ａ懸濁液５ｍＬを、１×１０ｃｍ使い捨てガラスカラムの中にロードした。プロテインＡゲルを約３０ｍＬのＤ−ＰＢＳでロードし、その後で、結合緩衝液（ＭＡＰＳＩＩＢｉｎｄｉｎｇＢｕｆｆｅｒ；Ｂｉｏ−Ｒａｄ）をカラムに通すことによって調製した。その後で、結合緩衝液で１：１に希釈した腹水又は順化培地を上記カラムの頂部に加え、カラム内を素通りさせた。免疫グロブリンをプロテインＡに結合させた後に、非結合フラクションを取り除いた。その次に、カラムを結合緩衝液３０ｍＬで洗浄して非結合タンパク質をカラムから取り除き、２８０ｎｍで０．０１未満の吸光度を得た。その後で、免疫グロブリンを含むフラクションをＢｉｏ−ＲａｄＥｌｕｔｉｏｎＢｕｆｆｅｒ約３０ｍＬで溶出させた。このフラクションを、Ｄ−ＰＢＳ４Ｌに対し透析することによって、４℃で一晩、緩衝液交換を行った。その結果得たＰＢＳ平衡化免疫グロブリンを、ＣｅｎｔｒｉｃｏｎＣｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒＵｎｉｔ（ＡｍｉｃｏｎＩｎｃ．，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）中で１７００ｘｇで遠心することによって濃縮した。Ｃ．抗体結合ドメインの分画ＰｉｅｒｃｅＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅＦａｂＰｒｅｐａｒａｔｉｏｎＫｉｔ（ＰｉｅｒｃｅＣｈｅｍｉｃａｌＣｏｍｐａｎｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を使用して、プロテインＡで精製した免疫グロブリンを、その２つの成分部分、即ち、結晶化可能フラクション（Ｆｃ）と抗体結合フラクション（Ｆａｂ）とに更に分画した。プロテインＡ精製免疫グロブリンを２０ｍＭリン酸／１０ｍＭＥＤＴＡ緩衝液（ｐＨ７．０）の中に透析し、その後で、約２０ｍｇ／ｍＬに濃縮した。１０ｍｇの免疫グロブリンを分画した。固定化パパインゲルを、供給されたままのリン酸緩衝液１２ｍＬ中にシステイン４２ｍｇを含む消化緩衝液で２回洗浄した。その後で、免疫グロブリン試料を上記ゲルに加え、回転振とう装置上で３７℃で一晩インキュベートした。プロテインＡ精製によって、可溶化Ｆａｂを、Ｆｃと未消化免疫グロブリンとから分離させた。非結合フラクションをこの時点でＦａｂ試料として収集した。この非結合部分を４℃で一晩に亙ってＤ−ＰＢＳ４リットルで透析し、上記のように濃縮した。実施例６ＥＰＯＲ上のＭａｂ７１エピトープのマッピングヒトＥＰＯ受容体の残基１〜残基２２４（ここで、残基１がプロリンであり残基２２４がアスパラギン酸である）において長さ１７−３０アミノ酸の重複する合成ペプチドを作製した。１０個の異なるのペプチドは、両端の６個のアミノ酸が重複していた。これらのペプチドの配列と、そのヒトＥＰＯ−Ｒアミノ酸配列中での各ペプチドの位置は、次の通りである。ポリスチレン穴プレート（Ｃｏｓｔａｒ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）を、炭酸塩−炭酸水素塩緩衝液（０．０１５ＭＮａ₂ＣＯ₃、０．０３５ＭＮａＨＣＯ₃ ｐＨ９．２）中に濃度１００ｐｇ／ｍＬ、２０μｇ／ｍＬ、及び、０．８ μｇ／ｍＬの上記ＥＰＯ−Ｒペプチドでコートした。このプレートを室温（ＲＴ）で２時間インキュベートし、その後で４℃で一晩インキュベートした。可溶性ＨｕＥＰＯＲを、同一条件下で、濃度１０μｇ／ｍＬ、２μｇ／ｍＬ、０．４μ ｇ／ｍＬ、及び、０．０８μｇ／ｍＬにおいて陽性対照としてコートした。ＰＢＳ中の５％ＢＳＡによってＲＴでプレートを３０分間ブロッキングした後に、１％ＢＳＡ中の５μｇ／ｍＬの濃度の、実施例５で説明した通りに精製したＭａｂ７１と共に、ＲＴで２時間、上記プレートをインキュベートした。洗浄緩衝液（ＫｉｒｋｅｇａｒｄａｎｄＰｅｒｒｙＬａｂｓ，Ｉｎｃ．）で洗浄した後に、そのプレートを、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ）を結合させたヤギ抗マウスＩｇＧの１：１０００希釈液と共に、ＲＴで１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、ＡＢＴＳ基質溶液（ＫｉｒｋｅｇａｒｄａｎｄＰｅｒｒｙＬａｂｓ，Ｉｎｃ．）で発色させた。４０５ｎｍで比色分析を行った。上記合成ペプチドに結合するＭａｂの結果を図１に示し、この結果は、Ｍａｂ７１が、試験したその他のペプチドに対して結合する場合に比べて、有意量のペプチドＳＥ−３（ヒトＥＰＯ−Ｒのアミノ酸残基４９−７８）に結合することを示している。このことは、残基４９−７８を含む又は残基４９−７８を重複して含むヒトＥＰＯ−Ｒの領域に対して、Ｍａｂ７１が結合することを示している。実施例７細胞増殖アッセイにおける抗ＥＰＯＲ抗体の活性上記の通りに調製した順化培地中の抗体を、ＵＴ７−ＥＰＯ細胞（Ｋｏｍａｔｓｕら，上記）による³Ｈ−チミジンの取り込みを刺激する能力に関してアッセイした。ＵＴ７−ＥＰＯ細胞はＥＰＯに応答し、その細胞表面上でヒトＥＰＯ受容体を発現させる。ＵＴ７−ＥＰＯ細胞を、増殖培地（Ｌ−グルタミン、２５ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液、及び、３０２４ｍｇ／Ｌ炭素水素ナトリウムを含み、且つ、アルファ−チオグリセロール又はベータ−メルカプトエタノールを含まない、１ｘＩｓｃｏｖｅの改良Ｄｕｌｂｅｃｃｏ培地（ＧＩＢＣＯ）／１０％ｖ／ｖ牛胎仔血清／１％ｖ／ｖＬ−グルタミン−ペニシリン−ストレプトマイシン溶液（ＩｒｖｉｎｅＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）／１単位／ｍＬｒＨｕＥＰＯ）中で、約３ｘ１０⁵細胞／ｍＬに増殖させた。細胞を遠心（約５００ｘｇ）によって収集し、リン酸緩衝塩水液で２回洗浄し、アッセイ培地（Ｌ−グルタミンなしの１ｘＲＰＭＩ培地１６４０（Ｇｉｂｃｏ）／１％Ｌ−グルタミン／４％牛胎仔血清）中に５ｘ１０⁴細胞／ｍＬに再懸濁させた。アッセイ培地で５倍以上に希釈した試験試料又はＥＰＯ標準（ｒＨｕＥＰＯ）１００μＬを９６穴マイクロタイタープレートの穴に加えた。その後で、細胞５０μＬを加え（５０００細胞／穴）、プレートを、加湿インキュベーター内で３７℃で５％ＣＯ₂においてインキュベートした。７２時間後に、アッセイ培地中に１：１００に希釈したメチル−³Ｈ−チミジン（１ｍＣｉ／ｍＬ；２０Ｃｉ／ｍｍｏｌ）５０μＬを加えた。細胞を更に３７℃で５％ＣＯ₂において４時間インキュベートした。標識した細胞を、ＰＨＤ細胞ハーベスター（ＣａｍｂｒｉｄｇｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｃ．）と脱イオン水（洗浄水として）を使用してガラス繊維フィルターマット上に収集した。フィルターを２−プロパノールで最終的に洗浄し、その後で脱水し、ＢｅｃｋｍａｎＭｏｄｅｌＬＳ６０００ＩＣシンチレーション計数器でカウントした。抗ＥＰＯＲＭａｂを含む組織培養プレートからの順化培地を、増殖刺激能力に関して上記の通りに試験した。試料を幾つかの濃度で試験した。陽性応答を、「チミジン取り込みをバックグラウンドレベルの２倍以上に刺激し、且つ、試料を希釈した時には刺激の減少も生じる」ものと定義した。表１に示すように、試験した２４個の試料のうちの２個の試料は陽性応答を示した（Ｍａｂ７１、Ｍａｂ７３）。４個の試料は、弱い刺激活性を有するかもしれない（表１の「？」）。残りの試料は、バックグラウンドを上回る大きなチミジン取り込みの増加をもたらさなかった。モノクローナル抗体を作製するために使用したマウスからのポリクローナル血清も、チミジン取り込みを刺激した。このことは、この血清中のポリクローナル抗体もＵＴ７−ＥＰＯ細胞の増殖を刺激することが可能であったことを示唆している。ＵＴ７−ＥＰＯ細胞によるチミジン取り込みのＥＰＯ誘導刺激を阻害する能力に関して上清液も試験した。２５ｍｕｎｉｔｓ／ｍＬのｒＨｕＥＰＯと、順化培地を含む様々な量の抗体と共に、細胞をインキュベートした。チミジン取り込みを上記のように測定した。その結果を表１に示す。大半の抗体は、対照培地とそれほど大きくは相違しなかった。チミジン取り込みの阻害を示した抗体の中で、２つの試料（Ｍａｂ５８、及び、Ｍａｂ７３）は明確な阻害を示したが、一方、３つの試料（Ｍａｂ６５、Ｍａｂ８８、Ｍａｂ８９）は可能な阻害を示した。Ｍａｂ７３は最大用量において阻害を示したが、それよりも少ない用量では、対照値を上回るチミジン取り込みを刺激した。実施例８抗ＥＰＯＲ抗体とフラグメントとによるＥＰＯＲの活性化Ａ．ＵＴ７−ＥＰＯ増殖アッセイＭａｂ７１とＭａｂ７３とを実施例５で説明した通りに精製した。増殖活性を、実施例７で説明したＵＴ７−ＥＰＯチミジン取り込みアッセイで定量した。Ｍａｂ７１とＭａｂ７３の両方が、ｒＨｕＥＰＯの場合と同様に用量に依存した形で、ＵＴ７−ＥＰＯによるチミジン取り込みを刺激した（実施例２を参照されたい）。高用量のＭａｂ７１では活性が減少した。刺激活性のピークは、Ｍａｂ７１の場合には１−２μｇ／ｍＬの用量で、Ｍａｂ７３の場合には１００μｇ／ｍＬより多い用量で観察それた。非中和対照抗体（抗ＥＰＯＭａｂＦ１２）はチミジン取り込みを刺激しなかったが、このことは、チミジン取り込みの刺激がＥＰＯ受容体抗体に特異的であることを示している。Ｂ．ＥＰＯ低温置換アッセイＥＰＯ受容体に対する抗体は、ＥＰＯが結合する領域と同一の領域に結合しうる。この可能性を確かめるために、ＯＣＩＭ１細胞を使用して低温置換アッセイを行った。ＯＣＩＭ１細胞はヒト起源の細胞であり、その細胞表面上にＥＰＯ受容体を含むことが知られている（Ｂｒｏｕｄｙら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５，６５１７（１９８８））。細胞を、ＯＣＩＭ１細胞培地（Ｉｓｃｏｖｅの改良Ｄｕｌｂｅｃｃｏ培地（ＩＭＤＭ）／１０％牛胎仔血清／１％ｐｅｎ−ｓｔｒｅｐ−ｆｕｎｇｉｓｏｎｅ）中で、約２−５×１０⁵ 細胞／ｍＬに増殖させた。細胞を遠心によって収集し、結合緩衝液（ＲＰＭＩ１６４０／１％ＢＳＡ／２５ｍＭＨＥＰＥＳｐＨ７．３）中で２回洗浄し、その後で、０．１％アジドと１０μ ｇ／ｍＬサイトカリシンＢを含む結合緩衝液中に１−２×１０⁷細胞／ｍＬに再懸濁させた。その後で、９６穴組織培養プレート中の細胞（１００μＬ）を、試料１０μＬと¹²⁵Ｉ−ＥＰＯ（Ａｍｅｒｓｈａｍ高比活性；３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ、２μＣｉ／ｍＬ）と共に、加湿組織培養インキュベーター中で３７℃でインキュベートした。３時間後に、細胞をタイターチューブ中のフタレート油（６０：４０（ｖ／ｖ）ジブチル／ジノニルフタレート）を通して遠心した。細胞を収容したチューブをドライアイス−エタノール浴中で迅速に凍結させ、細胞ペレットを採取した後で、ＬＫＢ１２７７ｇａｍｍａｍａｓｔｅｒ自動ガンマカウンターで計数した。図３は、低温置換実験の結果を示す。非標識ｒＨｕＥＰＯの添加量の増大に応じて、ＥＰＯ受容体から置換された¹²⁵Ｉ−ＥＰＯの量が増加した。同様に、実施例５で説明した通りに精製したＭａｂ７１が¹²⁵Ｉ−ＥＰＯを置換した量が、抗体量の増加に応じて増加した。この場合には、同量の¹²⁵Ｉ−ＥＰＯを置換するのにｒＨｕＥＰＯの約４，０００倍の量のＭａｂ７１が必要だった。これとは対照的に、Ｍａｂ７３は、最大用量において置換の徴候を示したが、非中和抗ｒＨｕＥＰＯＭａｂ（Ｆ１２）は有意の置換を示さなかった。こうした結果は、ＭａｂＦ１２が、ＥＰＯ受容体に対するＥＰＯの結合を妨げないが、Ｍａｂ７１及びＭａｂ７３はこの結合を妨げるということを示している。この結果は、更に、Ｍａｂ７１がＥＰＯ受容体に結合し、ＥＰＯ結合部位において又はその付近で結合することによって、ＥＰＯ受容体を活性化することを示している。Ｃ．Ｍａｂ７１とＦａｂ７１の活性の比較Ｍａｂ７１のＥＰＯ受容体フラグメントを、実施例５で説明した通りに調製した。図４に示すように、ＳＤＳゲル電気泳動（Ｌａｅｍｍｍｌｉら，Ｎａｔｕｒｅ２２７，６８０（１９７０））によって、試料を特性化した。ＳＤＳを２％含む試料緩衝液中で０．７Ｍ２−メルカプトエタノールと共に又はそれなしに試料を沸騰させ、非還元（無２−メルカプトエタノール）タンパク質と還元（２−メルカプトエタノール）タンパク質を個々に調製し、１２．５％アクリルアミドＳＤＳゲル上で泳動させた。そのゲルをクーマシーブルーで染色し、タンパク質を可視化した。タンパク質標準の移動度に対して当該タンパク質の移動度を比較することによって、タンパク質のサイズを推定した。Ｍａｂ７１とＭａｂ７３が、還元条件下で泳動させた時に、Ｌ鎖とＨ鎖とに分離した。Ｈ鎖は約５２ｋＤＡであった。Ｍａｂ７３の場合のＬ鎖はＭａｂ７１（２８．５ｋＤａ）の場合よりも僅かに小さかった（２８ｋＤａ）。Ｆａｂフラグメントも２つの鎖を有していた。すなわち、Ｆａｂ７１の場合には、２８．３ｋＤａと２７．３ｋＤａであり、Ｆａｂ７３の場合には、２７．５ｋＤａと２６．５ｋＤａだった。これらのＦａｂフラグメントを非還元条件下で泳動させた時には、Ｆａｂ７１のサイズは約４８ｋＤａであり、Ｆａｂ７３のサイズは約４７ｋＤａだった。このことは、Ｆａｂフラグメントが一価であり、その複合体がＬ鎖とＨ鎖を１つずつ有することを示している。これとは対照的に、非還元ＳＤＳゲル上でのＭａｂ７１とＭａｂ７３の移動度は、これらのサイズが約２００ｋＤａであることを示した。このことは、これらのＭａｂが二価であり、Ｈ鎖とＬ鎖が２つずつあることを示している。一価のＦａｂ７１フラグメントがＥＰＯ受容体を活性化するかどうかを調べるために、Ｍａｂ７１とＦａｂ７１フラグメントをＵＴ７ −ＥＰＯ細胞と共にインキュベートし、チミジン取り込みを実施例７で説明した通りに測定した。図５に示すように、ｒＨｕＥＰＯとＭａｂ７１の両方がチミジン取り込みを剌激した。しかし、一価Ｆａｂ７１フラグメントは、チミジン取り込みを刺激しなかった。無関係の受容体（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ）に対する対照モノクローナル抗体も、チミジン取り込みを刺激しなかった。このことは、受容体を活性化するためには上記抗体が２価でなければならないことを示している。Ｄ．ｒＨｕＥＰＯの存在下でのＭａｂ７１とＦａｂ７１によるチミジン取り込みの刺激ＥＰＯがＥＰＯ受容体に結合することをＭａｂ７１が阻害するという事実は、ＥＰＯの存在下ではＭａｂ７１がＥＰＯ受容体を活性化しない可能性があることを示唆した。この可能性を確かめるために、３０ｍｕｎｉｔｓ／ｍＬのｒＨｕＥＰＯと、様々な量の精製Ｍａｂ７１、Ｆａｂ７１、又は、Ｍａｂ対照（Ｈｅｒ２／ｎｅｕに対する抗体）と共に、ＵＴ７−ＥＰＯ細胞をインキュベートした。チミジン取り込みを上記の通りに測定した。図６に示すように、Ｍａｂ７１とＦａｂ７１の両方が高用量でチミジン取り込みを阻害した。しかし、約３０μｇ／ｍＬから約３０００μｇ／ｍＬの間の用量では、Ｍａｂ７１は、ｒＨｕＥＰＯだけによって刺激されたチミジンの取り込みレベルを上回るレベルにチミジン取り込みを刺激した。Ｆａｂ７１と対照抗体は、この作用を示さなかった。このことは、Ｍａｂ７１とｒＨｕＥＰＯとがＥＰＯ受容体活性化において追加の効果を有することを示している。実施例９抗ＥＰＯＲ抗体による赤血球コロニー形成の刺激末梢血液中の前駆体からの赤血球細胞の形成を精製Ｍａｂ７１が刺激するかどうかを調べるために、ＢＦＵｅアッセイを行った。赤血球前駆細胞を精製するために、正常なヒトドナーを標準的なプロトコルに従ってリンホフェレーゼ（ｌｙｍｐｈｏｐｈｅｒｅｓｅ）した。リンホフェレーゼした細胞（２５０ｍＬ）をＨａｎｋ’ｓＢａｌａｎｃｅｄＳａｌｔＳｏｌｕｔｉｏｎ（ＨＢＳＳ）２５０ｍＬで洗浄した。細胞をＨＢＳＳ中に再懸濁させ、勾配（Ｆｉｃｏｌｌ−ｐａｑｕｅ）上で、５００ｘｇで３０分間、密度遠心分離によって分離した。低密度細胞（ＬＤ）を勾配から収集し、ＨＢＳＳ５００ｍＬで洗浄し、０．５％ウシ血清アルブミンと５ｍＭＥＤＴＡとを添加したＰＢＳ中に、５×１０⁸細胞／ｍＬの濃度に再懸濁させた。その後で、ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃｈＧｍｂＨによって製造されたＣＤ３４前駆細胞ＣｅｌｌＩｓｏｌａｔｉｏｎＫｉｔ（ＱＢｅｎｄ／１０）を使用して、ＬＤ細胞を精製した。短時間の内に、細胞を抗ＣＤ３４モノクローナル抗体で標識し、その後で、プロトコルに従って、細胞を磁性微小球に結合させた。その次に、予め充填したＭｉｎｉＭａｃｓ分離カラムの中を、標識した細胞を通過させ、カラムを洗浄し、ＣＤ３４⁺細胞をカラムから溶出させた。この手順を再び繰り返し、より高純度のＣＤ３４⁺細胞を得た。Ｉｓｃｏｖｅら（Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ８３，３０９（１９７４））の説明の通りに、次に述べる変更を加えて、インビトロアッセイを行った。培養培地をＧｉｂｃｏＢＲＬ（ヒト骨髄幹細胞増殖キット；ＧｒａｎｄＩｓｌａｎｄ，ＮＹ）から得た。３５×１００ｍｍ組織培養プレート上に二重に試料１ｍＬをプレーティングするために、過剰の３ｍＬを１７ｘ１００無菌ポリスチレンチューブ内で調製した。各々のチューブに、幹細胞増殖培地２．５ｍＬ、ＣＤ３４⁺細胞（９０，０００細胞／ｍＬに再懸濁）０．１ｍＬ、幹細胞因子（２０μｇ／ｍＬ）０．０１５ｍＬ、及び、試料と幹細胞希釈培地の組み合わせ０．３８５ｍＬ相当を入れた。そのチューブを激しく撹拌し、沈静させ、発泡するままにした。その後で、１７ｘ１−１／２注射針の付いた３ｍＬ注射器を使用して、内容物を小分けした。加湿組織培養インキュベーター内でプレートを３７℃で１０％ＣＯ₂下でインキュベートした。赤血球コロニー（オレンジ色から赤色）を２１日後に評点した。ＥＰＯ又はＭａｂ７１が欠如したプレートには、赤血球コロニーは見られなかった。ｒＨｕＥＰＯ（３０ｍｕｎｉｔｓ／プレート）は、プレート１枚当たり４００個のコロニーの過剰を生じさせた。Ｍａｂ７１も赤血球コロニーを生じさせた。ピーク活性は２−６μｇ／ｍＬで認められた。この結果は、Ｍａｂ７１が赤血球コロニーの形成を刺激することを示している。精製Ｍａｂ７１の活性を、メチルセルロース中の無血清増殖条件を使用して、赤血球コロニー形成能力に関しても試験した。ＣＤ３４⁺細胞を上記の通りに単離し、本明細書に参考として組み入れる同時係属中で且つ共通の所有者によって所有されている米国特許出願第０８／０７９，７１９号に説明されている無血清増殖培地を使用して、下記の変更を加えて、インキュベートした。細胞外マトリックス分子、ヒドロコルチゾン、及び、増殖因子ＥＧＦ、ＦＧＦ、ＰＤＧＦを使用せずに、アッセイチューブを準備した。上記のように、二重の１ｍＬ試料をプレート上にプレーティングするために、試料３ｍＬを調製した。１００ｘストック溶液（２−メルカプトエタノール、ヌクレオシド、コレステロール、ピルビン酸ナトリウム、Ｈｕ−トランスフェリン、脂質、Ｈｕ−インスリン）各０．０３０ｍＬ、脱イオン化ＢＳＡ（１５％）０．４ｍＬ、ＳＣＦ（２０μｇ／ｍＬ）０．０１５ｍＬ、ＣＤ３４⁺ 細胞（３００，０００細胞／ｍＬに再懸濁）０．１ｍＬ、メチルセルロース（２．３％）１．０８０ｍＬ、及び、１．１９５ｍＬに相当する試料とＩＭＤＭの組み合わせ（試料は１５０μＬを越えない）を、上記チューブの各々に入れた。その後で、プレートを上記に通りにインキュベートし、２１日後にコロニーを評点した。ＥＰＯ又はＭａｂ７１の存在下で増殖させた時に赤血球コロニーを認めたが、これら２つの因子が存在しなかった時には、赤血球コロニーが認められなかった。赤血球コロニータイプの一例を図７に示す。２５ｍｕｎｉｔｓのｒＨｕＥＰＯと共にインキュベートしたコロニーは、２．１μｇ／ｍＬの精製Ｍａｂ７１と共に増殖させたコロニーと類似した外観を有した。ｒＨｕＥＰＯの用量が多けば多いほど、コロニーが大きくなった。用量応答曲線を図８に示す。Ｍａｂ７１は、１μｇ／ｍＬから５μｇ／ｍＬの範囲内の用量で活性のピークを示した。これより少ない又は多い用量の場合は、赤血球コロニーの数が減少した。Ｈｅｒ２／Ｎｅｕに対する対照モノクローナル抗体は、この用量範囲では全くコロニーを生じさせなかった。この結果は、Ｍａｂ７１が赤血球前駆体からの赤血球コロニーの形成を刺激するだろうということと、血清を追加する必要がないということを示している。従って、Ｍａｂ７１は、赤血球前駆体の赤血球細胞への分化を刺激することが可能である。本発明を好ましい実施様態に関して説明してきたが、こうした実施様態に対して当業者が変形と変更とを行うことが可能であるということを理解されたい。従って、添付の請求範囲は、請求する本発明の範囲内に含まれる均等の変形例の全てを、その範囲内に含むことが意図されている。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＧ０１Ｎ 33/53 0276−2ＪＧ０１Ｎ 33/566 33/566 9282−4ＢＣ１２Ｎ 5/00 Ｂ // Ｃ１２Ｎ 15/02 9282−4Ｂ 15/00 Ｃ (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．エリトロポエチン受容体を活性化する抗体又はそのフラグメント。２．前記エリトロポエチン受容体が哺乳動物エリトロポエチン受容体である請求項１に記載の抗体。３．前記エリトロポエチン受容体がヒトエリトロポエチン受容体である請求項１に記載の抗体。４．モノクローナル抗体である請求項１に記載の抗体。５．ヒト化抗体である請求項１に記載の抗体。６．ヒト抗体である請求項１に記載の抗体。７．検出可能な標識を有する請求項１に記載の抗体。８．請求項４に記載の前記モノクローナル抗体を産生することが可能なハイブリドーマ細胞系。９．ハイブリドーマ細胞系ＡＴＣＣＮｏ．ＨＢ１１６８９又はＡＴＣＣＮｏ．ＨＢ１１６９０によって産生されるモノクローナル抗体によって認識される、エリトロポエチン受容体上のエピトープを認識する抗体又はそのフラグメント。１０．エリトロポエチン受容体を活性化する請求項９に記載の抗体。１１．前記エリトロポエチン受容体がヒトエリトロポエチン受容体である請求項９に記載の抗体。１２．モノクローナル抗体である請求項９に記載の抗体。１３．ヒト化抗体である請求項９に記載の抗体。１４．検出可能な標識を有する請求項９に記載の抗体。１５．請求項１２に記載の前記モノクローナル抗体を産生することが可能なハイブリドーマ細胞系。１６．ハイブリドーマ細胞系ＡＴＣＣＮｏ．ＨＢ１１６８９又はＡＴＣＣＮｏ．ＨＢ１１６９０によって産生される抗体。１７．ハイブリドーマ細胞系ＡＴＣＣＮｏ．ＨＢ１１６８９又はＡＴＣＣＮｏ．ＨＢ１１６９０。１８．活性化されることが可能なエリトロポエチン受容体を生物試料中に検出する方法であって、（ａ）請求項１又は９に記載の抗体に前記試料を接触させる段階、及び、（ｂ）前記抗体による前記受容体の活性化を検出する段階を含み、それによって活性化可能なエリトロポエチン受容体の存在を決定すること、を含む前記方法。１９．請求項１又は９に記載の抗体を含む、活性化可能なエリトロポエチン受容体を生物試料中に検出するためのキット。２０．エリトロポエチン受容体の活性を調節するために有効な請求項１又は９に記載の抗体を有効量投与することを含む、哺乳動物におけるエリトロポエチン受容体の内因性活性を調節する方法。２１．エリトロポエチン受容体活性の調節が、赤血球前駆細胞の増殖又は分化を制御する請求項２０に記載の方法。２２．請求項１又は９に記載の抗体を治療有効量投与することを含む、患者の貧血を治療するための方法。２３．医薬上許容可能なアジュバント中に治療有効量の請求項１又は９に記載の抗体を含む医薬組成物。２４．前記抗体がモノクローナル抗体である請求項２３に記載の組成物。２５．前記抗体がヒト化抗体である請求項２４に記載の組成物。２６．前記抗体がヒト抗体である請求項２４に記載の組成物。