ES2283355T3 - Anticuerpos que activan un receptor de eritropoyetina. - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo, o su fragmento bivalente, que activa un receptor de eritropoyetina, en el que el anticuerpo, o su fragmento bivalente, se une a un péptido de restos de aminoácidos 49 a 78, inclusive de un receptor de eritropoyetina humano.

Description

Anticuerpos que activan un receptor de eritropoyetina.

Esta invención se refiere a anticuerpos y fragmentos bivalentes de los mismos, que reconocen un receptor de eritropoyetina y activan un receptor de eritropoyetina y estimulan la eritropoyesis.

La eritropoyetina (EPO) es una hormona glicoproteica implicada en el crecimiento y maduración de células progenitoras eritroides para producir eritrocitos. La EPO se produce en el hígado durante la vida fetal y en el riñón en adultos, y estimula la producción de glóbulos rojos a partir de precursores eritroides. La disminución en la producción de EPO, que normalmente se produce en adultos como resultado de una insuficiencia renal, conduce a la anemia. Se ha producido EPO mediante técnicas de ingeniería genética, que implacan la expresión y secreción de la proteína por parte de una célula hospedante transfectada con el gen que codifica la eritropoyetina. La administración de EPO recombinante ha resultado eficaz en el tratamiento de la anemia. Por ejemplo, Eschbach et al. (N. Engl J Med, 316, 73 (1987)) describen el uso de EPO para corregir la anemia resultante de una insuficiencia renal crónica.

La purificación de EPO urinaria humana ha sido descrita por Miyake et al. (J. Biol. Chem., 252, 5558 (1977)). La identificación, clonación y expresión de los genes que codifican la eritropoyetina se describe en la patente US 4,703, 008 de Lín. Una descripción de un método para la purificación de EPO recombinante a partir de un medio celular se incluye en la patente US 4,667,016 de Lai et al.

El mecanismo mediante el cual la EPO estimula la eritropoyesis apenas es conocido. Aunque es evidente que la EPO activa a las células para que crezcan y/o se diferencien mediante su unión a receptores específicos de la superficie celular, el mecanismo específico de activación, así como la estructura del receptor y de cualquier proteína(s) asociada(s), no se entiende por completo. Se cree que el receptor de eritropoyetina (EPO-R) existe como un complejo multímero. Los estudios de sedimentación sugieren que su peso molecular es de 330 \pm 48 kDa (Mayeux et al., Eur. J. Biochem., 194, 271 (1990)). Los estudios de entrecruzamiento indican que el complejo del receptor consiste en al menos dos polipéptidos distintos, una especie de 66-72 kDa, y una especie de 85 y 100 kDa (Mayeux et al., J. Biol. Chem., 266, 23380 (1991); McCaffery et al., J. Biol. Chem., 264, 10507 (1991)). También se ha detectado una proteína de 95 kDa distinta mediante inmunoprecipitación del receptor EPO (Miura e Ihle, Blood, 81, 1739 (1993)). Otro estudio de entrecruzamiento reveló tres complejos que contienen EPO de 110, 130 y 145 kDa. Los complejos de 110 y 145 kDa contenían el receptor EPO, puesto que podían inmunoprecipitarse con anticuerpos generados contra el receptor (Miura e Ihle, supra). La expresión de un receptor EPO truncado en el extremo carboxiterminal da como resultado la detección del complejo de 110 kDa, pero no del complejo de 145 kDa. Esto sugiere que el complejo de mayor peso molecular contiene polipéptidos presentes en el complejo de 110 kDa y otra proteína de 35 kDa.

Se obtuvo un mayor conocimiento de la estructura y función del complejo del receptor EPO tras la clonación y expresión de los receptores EPO de ratón y humano (D'Andrea et al., Cell, 57, 277 (1989); Jones et al., Blood, 76, 31 (1990); Winkelmann et al., Blood, 76, 24 (1990); solicitud PCT WO90/08822; patente US 5,278,065 de D'Andrea et al.). El receptor EPO humano de longitud completa es una proteína transmembrana de 483 aminoácidos con un dominio extracelular de aproximadamente 224 aminoácidos y un péptido señal de 25 aminoácidos. El receptor humano tiene una homología de secuencia de aproximadamente 82% de aminoácidos con el receptor de ratón. Se ha demostrado que el receptor EPO clonado de longitud completa expresado en células de mamífero (66-72 kDa) se une con la EPO con una afinidad (100-300 nM) similar a la del receptor nativo en células progenitoras eritroides. Por tanto, se cree que esta forma contiene el determinante de unión a EPO principal, y se denomina receptor EPO. Las proteínas de 85 y 100 kDa observadas como parte de un complejo entrecruzado son distintas del receptor EPO, pero deben encontrarse muy cerca de EPO porque EPO puede unirse a ellas. Las proteínas de 85 y 100 kDa están relacionadas entre sí, y la proteína de 85 kDa puede ser un producto de rotura proteolítica de la especie de 100 kDa (Sawyer, J. Biol. Chem., 264, 13343 (1989)).

Se ha producido una forma soluble (truncada) del receptor EPO que contiene sólo el dominio extracelular, y se ha descubierto que se une con la EPO con una afinidad de aproximadamente 1 nM, o aproximadamente 3 a 10 veces menor que el receptor de longitud completa (Harris et al., J. Biol. Chem., 267, 15205 (1992)); Yang y Jones, Blood, 82, 1713 (1993)). Se desconoce la razón de la afinidad reducida cuando se compara con la proteína de longitud completa. Existe la posibilidad de que otra especie de proteína también forme parte del complejo EPOR y que contribuya a la unión de la EPO, aumentando con ello la afinidad. En apoyo a esta posibilidad se encuentra la observación de Dong y Goldwasser (Exp. Hematol., 21, 483 (1993)) de que la fusión de una línea celular que tienen un receptor EPO de baja afinidad, con una célula CHO que no une la EPO da como resultado una línea celular híbrida que muestra una elevada afinidad de unión a EPO del receptor para EPO. Además, la transfección de un EPOR de longitud completa en células CHO da como resultado una línea celular con receptores de alta y baja afinidad, según se mide mediante el análisis de Scatchard. La amplificación del número de copias de EPOR aumenta la unión de baja afinidad, pero no la de alta afinidad. Estos resultados son coherentes con la presencia de una cantidad limitada de la proteína presente en las células CHO, que convierte el EPOR de baja afinidad en EPOR de alta afinidad.

La activación del receptor EPO da como resultado varios efectos biológicos. Tres de las actividades incluyen la estimulación de la proliferación, la estimulación de la diferenciación y la inhibición de la apoptosis (Liboi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 11351 (1993); Koury, Science, 248, 378 (1990)). Las vías de transducción de la señal que dan como resultado la estimulación de la proliferación y la estimulación de diferenciación parecen ser separables (Noguchi et al., Mol. Cell. Biol., 8, 2604 (1988); Patel et al., J. Biol. Chem., 267, 21300 (1992); Liboi et al., ibid). Algunos resultados sugieren que puede resultar necesaria una proteína accesoria para mediar en la señal de diferenciación (Chiba et al., Nature, 362, 646 (1993); Chiba et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 11593 (1993)). Sin embargo, existe controversia acerca del papel de las proteínas accesorias en la diferenciación, puesto que una forma constitutivamente activada del receptor puede estimular la proliferación y la diferenciación (Pharr et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 938 (1993)).

La activación del receptor EPO puede ser debida a su dimerización. Es decir, la EPO puede actuar como entrecruzador entre dos moléculas de receptor EPO. Una mutación de argigina a cisteína en la posición 129 del receptor EPO murino da como resultado una activación constitutiva del receptor, probablemente debido al enlace disulfuro formado entre dos subunidades de los receptores (Yoshimura et al., Nature, 348, 647 (1990)). Además, EPOR aparece en complejos multímeros en células (Miura e Ihle, Arch. Biochem. Biophys., 306, 200 (1993)). Sin embargo, no se ha indicado el aislamiento de una forma multímera estable del receptor soluble EPO purificado. Además, puede requerirse la dimerización de EPOR, pero por sí misma puede no ser suficiente para la activación completa de las células. Por ejemplo, la dimerización puede dar como resultado una señal de proliferación, pero no una señal de diferenciación. Es decir, pueden requerirse proteínas accesorias para enviar la señal de diferenciación.

La posible relación entre la dimerización y la activación del receptor EPO puede explotarse para identificar compuestos que son diferentes de EPO pero que activan el receptor. Por ejemplo, los anticuerpos poseen dos sitios de unión idénticos para el antígeno. Un anticuerpo anti-EPOR puede unirse a dos moléculas EPOR y las puede aproximar entre sí para que se pueda producir la dimerización. Con el fin de funcionar in vivo, estos anticuerpos deben reconocer el EPOR sobre la superficie de las células y unirse de modo que se pueda producir la activación de la vía de transducción de señal. Además, resulta deseable que la activación de como resultado la proliferación y diferenciación de los progenitores eritroides. Se ha indicado un enfoque similar para entender la activación del receptor de la hormona del crecimiento humana (Fuh et al., Science, 256, 1677 (1992)) y el receptor del factor del crecimiento epidérmico (Schreíber et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 7535 (1981)).

Resultaría deseable identificar moléculas que tienen la propiedad de activar el receptor EPO y estimular la eritropoyesis. Con el fin de lograrlo, resulta importante entender el mecanismo de la transducción de señal y la activación del receptor EPO. Un enfoque para comprender este mecanismo puede ser identificar anticuerpos que reconocen el receptor EPO, de modo que se active el receptor y se estimule la eritropoyesis. Estos anticuerpos son útiles en aplicaciones terapéuticas y de diagnóstico, y también serían útiles para investigar la función del receptor EPO.

Las siguientes referencias describen anticuerpos que se unen al receptor EPO de ratón o humano:

D'Andrea et al., en The Biology of Hematopoiesis, Wiley-Liss, Inc. (1990), pp. 153-159, generaron anticuerpos policlonales antipéptidos contra péptídos amino-terminales y carboxi-terminales del receptor EPO murino. Se demostró que los anticuerpos reaccionaban con el receptor EPO de ratón en una transferencia Western.

Bailey et al., Exp. Hematol., 21, 1535-1543 (1993) generaron anticuerpos policlonales antipéptidos contra péptidos sintéticos homólogos a los dominios extracelular y citoplásmico del receptor EPO de ratón. No se detectó la activación del receptor por estos anticuerpos, según se midió mediante la captación de ^{3}H-timidina por las células pancreáticas en ratones tratados con fenilhidrazina.

Baynes et al., Blood, 82, 2088-2095 (1993) generaron un anticuerpo policlonal contra un péptido amino-terminal en el receptor EPO humano. Se demostró que el anticuerpo reaccionaba con una forma soluble del receptor presente en suero humano.

D'Andrea et al., Blood, 82, 46-52 (1993) generaron anticuerpos monoclonales contra el receptor EPO humano. Los anticuerpos se unen a células Ba/F3 transfectadas con el clon de cDNA de EPO humana, y algunos inhibían la unión de EPO y neutralizaban el crecimiento dependiente de EPO.

Fisher et al., Blood, 82, 197A (1993) utilizaron los mismos anticuerpos monoclonales que los descritos en
D'Andrea, supra, para diferenciar entre células progenitoras eritroides que tienen un crecimiento y maduración dependientes de EPO, y las que tienen un crecimiento y maduración independientes de EPO.

No se ha indicado que ninguno de los anticuerpos descritos en las referencias mencionadas anteriormente haya activado el receptor EPO, o haya estimulado el crecimiento y/o maduración de las células progenitoras eritroides.

Por tanto, un objeto de la invención es producir anticuerpos y fragmentos bivalentes de los mismos, que reconocen un receptor EPO y se unen a él, entre los restos de aminoácidos 49 a 78, de forma que el receptor se activa. Otro objeto de la invención es producir anticuerpos y fragmentos bivalentes de los mismos,que se unen a un receptor EPO entre los restos de aminoácidos 49 a 78, y estimulan la eritropoyesis, mediante la estimulación de la proliferación y/o la diferenciación de células progenitoras eritroides para producir eritrocitos. Estos anticuerpos y fragmentos bivalentes de los mismos resultan útiles en el tratamiento de la anemia o en el diagnóstico de enfermedades caracterizadas por un receptor EPO disfuncional. Además, estos anticuerpos y fragmentos bivalentes de los mismos pueden conducir a la identificación de agentes terapéuticos para el tratamiento de la anemia.

La invención se refiere a anticuerpos o fragmentos bivalentes de los mismos, según se define en la reivindicación 1. La investigación de anticuerpos que reconocen el receptor EPO humano ha revelado que dos anticuerpos, denominados Mab 71 y Mab 73, estimulan la proliferación de células UT7-EPO, una línea celular dependiente de EPO que no prolifera en ausencia de EPO añadida. Además, Mab 71 estimula la formación de colonias eritroides a partir de progenitores eritroides en sangre humana. Los anticuerpos son preferiblemente anti- cuerpos monoclonales, y pueden ser anticuerpos humanizados o humanos. También se incluyen líneas celulares de hibridoma que producen los anticuerpos de la invención.

También se suministran métodos y kits de ensayo para detectar receptores EPO en muestras biológicas, y estos métodos y kits de ensayo comprenden anticuerpos del receptor EPO o sus fragmentos bivalentes de la invención. También se incluyen en la invención las composiciones farmacéuticas que comprenden anticuerpos del receptor EPO o fragmentos bivalentes de los mismos y adyuvantes farmacéuticamente aceptables. Estas composiciones pueden utilizarse para tratar pacientes que tienen trastornos caracterizados por bajos niveles de glóbulos rojos.

La figura 1 muestra los resultados de un ensayo ELISA que mide la unión, a las concentraciones indicadas, de péptidos sintéticos por Mab 71. Los péptidos se corresponden con los restos aminoácidos indicados del receptor EPO humano. El resto 1 es la prolina amino terminal que se halla en EPOR segregado, después de la escisión de la secuencia conductora.

La figura 2 muestra el efecto de cantidades variables de proteína rHuEPO y de Mab 71 y 73 purificados sobre la captación de ^{3}H-timidina de células UT7-EPO.

La figura 3 muestra los efectos de cantidades variables de proteína rHuEPO, Mab 71, Mab 73 o un Mab control no neutralizante dirigido contra EPO (Mab F12), sobre la inhibición de la unión de ^{125}I-EPO a los receptores EPO sobre la superficie de células OCIMI.

La figura 4 muestra el gel SDS teñido con Coomassie de preparaciones purificadas de anticuerpos monoclonales 71 y 73, así como de fragmentos de anticuerpo monoclonal (Fab) derivados de Mab 71 y 73. Las muestras se ensayaron en condiciones reductoras (con 2-mercaptoetanol) o no reductoras (sin 2-mercaptoetanol).

La figura 5 muestra el efecto de concentraciones variables de proteína rHuEPO, Mab 71 o Fab 71 purificados, sobre la captación de ^{3}H-timidina en células UT7-EPO.

La figura 6 muestra el efecto de cantidades variables de Mab 71 o Fab 71 purificados, sobre la captación de ^{3}H-timidina en células UT7-EPO, a las que también se le había añadido 30 munidades/ml de EPO recombinante humana (rHuEPO).

La figura 7 muestra una fotografía de células CD 34^{+} purificadas a partir de sangre periférica, que fueron cultivadas 21 días en metilcelulosa en presencia de EPO o Mab71, bajo condiciones de crecimiento exentas de suero. Las fotografías son de células incubadas con 500 munidades/ml de EPO (A), 25 de EPO (B), o 2,1 microgramos/ml de Mab 71 (C).

La figura 8 muestra el efecto de cantidades variables de rHuEPO, Mab 71 y un anticuerpo monoclonal control generado contra Her2/neu, en la formación de colonias eritroides a partir de precursores esferoides cuando se cultivan en condiciones de crecimiento exentas de suero en agar blando.

Se han generado anticuerpos monoclonales (Mab) que reconocen el receptor de eritropoyetína, mediante la inmunización de ratones con el receptor EPO humano soluble purificado. El receptor EPO humano soluble se expresó y se purificó como se describe en los ejemplos 1 y 2. De todos los Mab que reaccionaron con el receptor EPO humano soluble en ensayos inmunoabsorbentes de enzimas ligados (ELISA), se seleccionaron 96 Mab para su posterior investigación. Estos Mab se ensayaron para detectar la unión al receptor EPO mediante un análisis BIAcore (ejemplo 4A), y para detectar la unión al receptor EPO sobre la superficie de células CHO transfectadas mediante FACS (ejemplo 4C). Los resultados de estas investigaciones aparecen en la tabla 1. Aunque varios anticuerpos se unieron al receptor EPO, según se determinó mediante el análisis BIAcore, sólo cinco anticuerpos de los 96 ensayados se unieron al receptor EPO que aparece sobre la superficie de células CHO transfectadas, según se determinó mediante barrido FACS. Los 24 anticuerpos que eran positivos en los ensayos ELISA (incluyendo los cinco que eran positivos con barrido FACS) se ensayaron para detectar la estimulación de la proliferación de células UT7-EPO. De modo sorprendente, se descubrió que dos anticuerpos, denominados Mab 71 y Mab 73, estimulaban la captación de ^{3}H-timidina en la línea celular UT7-EPO (Komatsu et al., Blood, 82, 456 (1993)) en ausencia de EPO (ejemplo 8A). La línea celular UT7-EPO requiere la presencia de EPO en el medio para su crecimiento. Por tanto, la estimulación del crecimiento de células UT7-EPO probablemente es debida a la activación del receptor EPO por Mab 71 y Mab 73. Tal como aparece en la figura 2, la respuesta de las células UT7-EPO es mayor en presencia de Mab 71 que de Mab 73. También se descubrió que Mab 71 estimula la formación de colonias eritroides a partir de precursores eritroides humanos (véase el ejemplo 9). Éste es el primer caso de un anticuerpo que estimula la formación de colonias eritroides a partir de precursores eritroides.

La invención suministra un anticuerpo, o su fragmento, que activa un receptor de eritropoyetina y se une a un péptido de restos de aminoácidos 49 a 78. Tal como se utiliza en la presente, la expresión "activación de un receptor EPO" indica uno o más procesos moleculares que sufre un receptor EPO, que dan como resultado una transducción de la señal hacia el interior de una célula que porta el receptor, en la cual la señal, en último término, produce uno o más cambios en la fisiología celular. Las respuestas celulares a la activación del receptor EPO son típicamente cambios en la proliferación o diferenciación de las células que portan el receptor. Las células que portan el receptor son típicamente células progenitoras eritroides. En la actualidad, los acontecimientos moleculares que conducen a la transducción de la señal por el receptor EPO apenas se comprenden. Sin embargo, como se ha indicado en los antecedentes, algunas pruebas sugieren que la dimerización del receptor EPO es al menos un acontecimiento que probablemente sea necesario para la activación. La presente memoria también apoya esta idea. Tal como aparece en la figura 5, la estimulación de la captación de ^{3}H-timidina en células UT7-EPO por Mab 71 se suprime cuando éste se sustituye por el correspondiente fragmento Fab, denominado Fab 71.

Por tanto, la sustitución del anticuerpo bivalente intacto por un correspondiente fragmento monovalente elimina la respuesta proliferativa. Además, Mab 71 inhibe la activación del receptor EPO a concentraciones elevadas. Ambas observaciones apoyan el modelo de dimerización de la activación del receptor EPO. Se ha demostrado que Mab 71 interacciona con un péptido sintético de los restos 49 a 78 del EPO-R humano (véase el ejemplo 6). Por tanto, esta región del EPO-R, cuando se une a un entrecruzador como Mab 71, puede dar como resultado una activación del EPO-R. Las moléculas que entrecruzan dos moléculas EPO-R mediante la unión a los restos 49 a 78 representan la invención. Estas moléculas son anticuerpos o fragmentos bivalentes de los mismos, que tienen la propiedad de reticular los dos receptores EPO mediante la unión a los restos contenidos en la región entre los restos 49 y 78, dando con ello como resultado la dimerización y activación del receptor EPO.

Los receptores EPO mencionados en esta descripción son preferiblemente receptores EPO de mamífero, y en una realización particularmente preferida, son el receptor EPO humano. Se entiende que los análogos de los receptores EPO humanos también se incluyen en la invención. Estos análogos se construyen mediante inserciones, deleciones, extensiones o sustituciones de aminoácidos en la secuencia del receptor EPO humano. Los ejemplos de análogos de EPO-R se han descrito en la patente US 5,292,654 de Yoshimura et al., mientras que la sustitución de un resto cisteína en la posición 129 de la secuencia de aminoácidos de EPOR da como resultado una EPOR constitutivamente activada. En general, los análogos de EPO-R que tienen cambios en los aminoácidos en otras regiones diferentes de los dominios de unión a anticuerpos necesarios para la activación que mantienen la estructura secundaria y terciaria del receptor EPO humano, pueden ser reconocidos por los anticuerpos de la presente invención. Se ha demostrado que Mab 71 interacciona con un péptido sintético de restos 49 a 78 del EPO-R humano (véase el ejemplo 6). Por tanto, los análogos de EPO-R que tienen cambios en restos aminoácidos diferentes de los que se encuentran en las posiciones 49 a 78, y que mantienen la estructura secundaria y terciaria del receptor EPO humano, es probable que sean reconocidos por Mab 71. La numeración de los restos aminoácidos en el polipéptido EPOR humano, tal como se utiliza en la presente, comienza con la prolína en la posición 1, que es el resto amino-terminal después de la escisión del péptido señal de 25 aminoácidos.

Los anticuerpos de la invención se unen a un epítopo sobre un receptor EPO que abarca los restos aminoácidos 49 a 78 en la EPO-R humana. Por tanto, es probable que Mab 71 reconozca un epítopo sobre EPO-R que es definido, en todo o en parte, por esta secuencia. Tal como se utiliza en la presente, la expresión "epítopo" hace referencia a la región de un EPO-R unida por un anticuerpo, y esta unión evita la asociación de un segundo anticuerpo a un EPO-R.

La invención también proporciona anticuerpos policlonales, y anticuerpos monoclonales y sus fragmentos bivalentes. Los fragmentos de anticuerpos incluyen los fragmentos que activan un receptor EPO uniéndose a un epítopo de un péptido que abarca los restos aminoácidos 49 a 78 de la EPO-R. También se incluyen anticuerpos humanizados, de forma típica producidos mediante métodos recombinantes, en los cuales las secuencias humanas comprenden todo o parte de un anticuerpo de la invención. Los ejemplos de anticuerpos humanizados incluyen anticuerpos quiméricos o injertados con CDR (patentes US 4,816,567 y 5,225,539). Los anticuerpos de la invención también pueden tener unido un marcador detectable. Este marcador puede ser fluorescente (p. ej., isotiocianato de fluoresceína, FITC), enzimático (p. ej., peroxidasa de rábano), de afinidad (p. ej., biotina) o isotópico (p. ej., ^{125}I).

También se incluyen en la invención las líneas celulares de hibridoma que producen un anticuerpo monoclonal de la invención. La generación de líneas celulares de hibridoma que producen anticuerpos monoclonales contra el EPO-R humano se describe en el ejemplo 3. La línea celular de hibridoma que produce el Mab 71 se ha depositado en la American Type Culture Collection, Rockville, MD, el 26 de julio de 1994, con número de registro HB11689. La línea celular de hibridoma que produce el Mab 73 se ha depositado en la American Type Culture Collection, Rockville, MD, el 26 de julio de 1994, con número de registro HB11690.

Los anticuerpos de la presente invención resultan útiles para diagnosticar la anemia y otras enfermedades caracterizadas por un EPO-R disfuncional. En una realización, un método para detectar en una muestra biológica un receptor EPO que es capaz de ser activado comprende las etapas de: (a) poner en contacto la muestra con un anticuerpo que activa un receptor EPO; y (b) detectar la activación del receptor por el anticuerpo. Las muestras biológicos incluyen especímenes de tejidos, células intactas o sus extractos. Los anticuerpos pueden utilizarse como parte de un kit de ensayo de diagnóstico para detectar la presencia de receptores EPO en una muestra biológica. Estos kits de ensayo emplean anticuerpos que tienen unido un marcador para permitir la detección. Los anticuerpos resultan útiles para identificar receptores normales o anómalos. La presencia de receptores anómalos en una muestra biológica puede ser indicativa de trastornos como la anemia de Diamond Blackfan, en la cual se cree que el receptor EPO es
disfuncional.

Los anticuerpos de la invención resultan útiles para tratar trastornos que se caracterizan por niveles bajos de glóbulos rojos. Se incluyen en la invención los métodos para modular la actividad endógena de un receptor EPO en un mamífero, preferiblemente los métodos para aumentar la actividad de un receptor EPO. En general, cualquier trastorno que puede tratarse con eritropoyetina, como la anemia, también puede tratarse con los anticuerpos de la invención. Los anticuerpos terapéuticos se administran en una cantidad y mediante una vía de administración que son las apropiadas para la naturaleza y gravedad del trastorno que se está tratando, y un experto en la técnica puede determinarlas. Preferiblemente, la administración se realiza mediante inyección subcutánea, intramuscular o intra-
venosa.

La invención suministra una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo que activa un EPO-R, junto con un adyuvante farmacéuticamente aceptable, y el adyuvante puede seleccionarse de uno o más diluyentes, vehículos, conservantes, emulgentes, antioxidantes y/o estabilizantes. Una "cantidad terapéuticamente eficaz", tal como se usa en la presente, hace referencia a la cantidad de anticuerpo que proporciona un efecto terapéutico para un trastorno y un régimen de administración concretos. En esta invención, el efecto terapéutico es la estimulación de la producción de glóbulos rojos, según se pone de manifiesto por un aumento del hematocrito en el paciente que se está tratando. En una realización preferida, los anticuerpos son anticuerpos humanizados o humanos, que pueden prepararse usando procedimientos conocidos por un experto en la técnica. Los adyuvantes farmacéuticamente aceptables son conocidos por los expertos, y se analizan en profundidad en Remington's Pharmaceutical Sciences, 18ª edición, A.R. Gennaro, ed. Mack, Easton, PA (1990).

Se ofrecen los siguientes ejemplos para ilustrar mejor la invención, pero no se considera que limiten su alcance.

Ejemplo 1 Producción del receptor de eritropoyetina humano soluble A. Aislamiento de clones para la expresión del receptor de eritropoyetina humano soluble

Utilizando un clon que contiene el receptor de eritropoyetina humano según se describe en Jones et al., supra, se empleó la técnica de PCR para obtener un clon para la expresión del receptor de eritropoyetina humano soluble (sHu EPOR). Los cebadores para la amplificación PCR del receptor de eritropoyetina humano son:

cebador 5':
CTC CAA GCT TGC CGT CAC CAT GGA CCA CCT CGG GGC GTC CCT	(SEQ. ID No:1), y
cebador 3':
CAG GTC TAG ATT ACT AGG GAT CCA GGT CGC TAG GC	(SEQ. ID NO:2)

Las reacciones de PCR se llevaron a cabo usando 2,5 ng de un plásmido que contenía el EPOR humano, 5 pmol de cada uno de los anteriores cebadores oligonucleótidos, Tris HCl 10 mM (pH 8,3), KCl 50 mM, MgCl_{2} 1,5 mM, 200 \muM de cada dNTP, y 1 unidad de Taq-polimerasa. La amplificación se realizó durante 5 ciclos de 30 segundos a 94°C, 1 minuto a 50°C, 1 minuto a 72°C, seguidos de 20 ciclos de 30 segundos a 94°C, 1 minuto a 55°C, 1 minuto a 72°C. El DNA se purificó mediante el tránsito a través de una columna de exclusión de tamaño G-50 (Boehringer Mannheim Corp.), después se digirió con Hind III y XbaI, y se ligó en el vector de expresión pDSR\alpha2 (DeClerck et al., J. Biol. Chem., 266, 3893 (1991)), que también se había digerido con Hind III y XbaI. Los clones que contenían el inserto deseado se verificaron mediante un análisis de la secuencia de DNA.

El clon d40EPOR se preparó mediante PCR a partir de un clon de EPOR humano de longitud completa (ver antes). El carboxi-terminal de d40EPOR es tyr 467, el resultado de añadir un codón de terminación dentro del cebador. Los cebadores para la amplificación PCR son:

cebador 5':
5'-CTC CAA GCT TGC CGT CAC CAT GGA CCA CCT CGG GGC GTC CCT-3'	(SEQ. ID NO:1); y
cebador 3':
5'-AGG TCG ACT ACT AGT AGT CAG TTG AGA-3'	(SEQ. ID NO:3)

La amplificación PCR utilizó pfu-polimerasa en tampón pfu 2 (Stratagene, La Jolla, CA). Las condiciones de reacción son: 1 ciclo a 96°C durante 30 segundos, 45°C durante 1 minuto, 72°C durante 1 minuto; 25 ciclos a 96°C durante 1 minuto, 55°C durante 1 minuto, 72°C durante 2 minutos. Entonces se llevó a cabo una incubación final a 72°C durante 5 minutos. Los productos de reacción se separaron mediante una electroforesis en gel de agarosa, y la banda de aproximadamente 1,3 Kb se aisló utilizando un kit de ensayo de gen definido (BIO 101, Vista, Ca.). El fragmento purificado se ligó en PCR II (kit de ensayo de clonación TA, Invitrogen, San Diego, CA). Se identificaron los recombinantes mediante análisis de restricción y se secuenciaron para confirmar que los insertos deseados estaban presentes. Se aisló un fragmento HindIII-SalI como se ha descrito previamente, y se ligó en un vector pDSR\alpha2 aislado que antes se había cortado con HindIII y SalI. El vector resultante, pDSR\alphaEPORd40, se utilizó para la expresión en células CHO.

B. Expresión de EPOR soluble humano y d40 EPOR en células CHO

La expresión del plásmido pDSR\alpha2-EPOR-X contiene secuencias que codifican los aminoácidos del EPOR humano Met 1-Pro 249, como se demuestra en Jones et al., supra. El plásmido pDSR\alphaEPORd40 contiene secuencias que codifican Met 1-Tyr 467. Diez microgramos de cada plásmido se introdujeron independientemente en células CHO mediante transfección mediada por fosfato de calcio (Wigler et al., Cell, 11, 233 (1977)). Las colonias individuales se seleccionaron basándose en la expresión del gen de la dihidrofolato-reductasa a partir del vector. La expresión de EPOR humano se controló mediante hibridación de RNA (Hunt et al., Exp. Hematol., 19: 779 (1991)) y mediante inmunotransferencia Western utilizando un anticuerpo purificado por afinidad. Las líneas celulares que eran positivas en estos ensayos se seleccionaron para su posterior expansión. Las líneas celulares se adaptaron a metotrexato (Mtx) 30 nM para estimular la amplificación de la expresión de EPO-R.

La generación de medios condicionados que contienen EPOR humano soluble se realizó en botellas giratorias y en un biorreactor de fibra hueca. Las botellas giratorias se inocularon con 2 x 10^{7} células en 200 ml de medio de crecimiento (DMEM:F12 de Ham (1:1) suplementado con aminoácidos no esenciales (NEAA), Mtx 30 nM y suero bovino fetal al 5% (FBS) (reactivos de GIBCO, Grand Island, NY). Después de alcanzar la confluencia en 3-4 días, el medio se sustituyó con 200 ml de DMEM:F12 de Ham, NEAA, Mtx 30 nM sin suero. El medio condicionado se recogió después de 6-7 días y se sustituyó por medio exento de suero fresco. Se recogió una segunda y una tercera recolección.

Se inoculó un cartucho de biorreactor Cell Pharm con 5 x 10^{8} células en medio de crecimiento (como anteriormente) suplementado con 5 ug/ml de gentamicina. El pH se mantuvo a 7,3. Comenzando en el día 12 después de la inoculación, las células se fueron retirando del suero para generar un medio condicionado exento de suero. La recolección del medio condicionado comenzó el día 17.

Ejemplo 2 Purificación del receptor de eritropoyetina humano soluble

Se realizaron cuatro preparaciones diferentes de EPOR humano recombinante soluble. En la primera preparación, se acopla Sepharose 6B activado con Epoxi (Pharmacia, Piscataway, NJ) con eritropoyetina humana recombinante (rHuEPO), esencialmente según las instrucciones del fabricante. Se añade 218 mg de rHuEPO en 4,5 ml de ZnCl_{2} 32 mM a 7,2 g de Sepharose 6B activado con Epoxi previamente hidratado y lavado con H_{2}O. Esta suspensión se valora hasta pH 10,8, luego se mezcla durante la noche a temperatura ambiente. Cualquier grupo reactivo remanente entonces se bloquea mediante la adición de etanolamina hasta una concentración final de 1 M y se mezcla durante 4 horas a temperatura ambiente. Las posteriores etapas se llevan a cabo a 8°C \pm 2°C. La resina acoplada (Epoxi-EPO) se introduce en una columna y se lava con ciclos alternantes de NaCl 0,5 M/HOAc 0,1 M, pH 4, y NaCl 0,5 M/borato 0,1 M, pH 8. La columna se equilibra con NaCl 140 mM/Tris 10 mM, pH 7,6 (TBS). Se carga con 1560 ml del medio condicionado producido en las botellas giratorias a partir de células CHO que expresan EPO-R soluble (sHuEPO-R). Después de finalizar la introducción, la columna se lava con NaCl 300 mM/Tris 10 mM, pH 7,6, después el sHuEPOR unido se eluye con NaCl 1 M/urea 3M/Tris 10 mM, pH 7,6. Dos picos de absorción a UV280 eluyen con este tampón. El segundo pico que eluye, que contiene el sHuEPOR, se reúne y se diluye 20 veces con H_{2}O. La reunión diluida entonces se carga en una columna precargada con 1 ml de Mono Q (Pharmacia) y se eluye con un gradiente NaCl en Tris 10 mM, pH 7,6. Eluye un único pico, que se reúne, se divide en partes alícuotas y se conserva congelado
a -80°C.

En la segunda preparación, se prepara una columna Epoxi-EPO mayor. Se hidratan 20,4 g de Sepharose 6B activada con Epoxi y se lava con H_{2}O, después con acetona y por último con formamida al 50% en H_{2}O, pH 10, 6. Se valoran 729 mg de rHuEPO en 15 ml de H_{2}O hasta pH 10,6, se añade a la resina y se mezcla durante la noche a temperatura ambiente. Cualquier grupo reactivo remanente entonces se bloquea mediante la adición de etanolamina hasta una concentración final de 1 M y se mezcla durante 140 minutos a temperatura ambiente. Las posteriores etapas se llevan a cabo a 8°C \pm 2°C. La Epoxi-EPO se introduce en una columna y se lava con urea 3 M/NaCl 750 mM/Tris 10 mM, pH 7,6, y después la columna se equilibra con TBS. Se mezclan 100 ml de medio condicionado producido en el biorreactor a partir de células CHO que expresan sHuEPOR, con 2 ml de Q Sepharose Fast Flow (Pharmacia). Se incuba durante 30 minutos a 8°C \pm 2°C con agitación frecuente, después se filtra a través de un filtro de tapón de botella de nitrato de celulosa de 0,45 micras (Corning). El filtrado se carga en la columna Epoxi-EPO, se lava con NaCl 250 mM/Tris 10 mM, pH 7,6, después se eluye con urea 3 M/NaCl 750 mM/Tris 10 mM, pH 7,6. El pico eluido se reúne y se diluye 20 veces con H_{2}O. La reunión diluida entonces se carga en una columna de 15 ml de Q Sepharose Fast Flow y se eluye con un gradiente de NaCl en Tris 10 mM, pH 7,6. El único pico que eluye se reúne, se divide en partes alícuotas y se conserva congelado a -80°C.

En la tercera preparación, se emplea la misma columna Epoxi-EPO utilizada en la preparación 2. Se mezclan 850 ml del medio condicionado producido en botellas giratorias a partir de células CHO que expresan sEPO-R, con 1,7 ml de Q Sepharose Fast Flow. Se procesa de la misma manera que en la preparación 2.

En la cuarta preparación, 7,25 l del medio condicionado producido en el biorreactor a partir de células CHO que expresan sHuEPOR, se mezclan con 110 ml de Q Sepharose Fast Flow. Se incuba durante 1 hora a 8°C \pm 2°C con agitación frecuente, después se filtra a través de un filtro de tapón de botella de nitrato de celulosa de 0,45 micras. El filtrado entonces se diluye con 7,25 1 de H_{2}O y se carga en una columna de 770 ml de Q Sepharose Fast Flow equilibrada con Tris 20 mM, pH 7,6. La columna se eluye con un gradiente de NaCl en Tris 20 mM, pH 7,6. Se reúnen las fracciones que contienen cantidades significativas de sHuEPOR, basándose en un análisis SDS-PAGE. Se añade (NH_{4})_{2}SO_{4} sólido a la reunión hasta una concentración final de 1,2 M, después se filtra a través de un filtro de tapón de botella de nitrato de celulosa de 0,45 micras. El filtrado se carga en una columna de 60 ml de Phenyl Sepharose 6 (bajo sub, Pharmacia) y se eluye con un gradiente descendiente de (NH_{4})_{2}SO_{4} desde 1,2 M a 0 M en Tris 20 mM, pH 7,6. El principal pico de elución se reúne y se hace 2,4 M en (NH_{4})_{2}SO_{4} para que precipite el sHuEPORt. El sHuEPOR precipitado se recoge mediante centrifugación, se resuspende con H_{2}O y se valora hasta pH 7,9 con Tris\cdotHCl. La disolución resultante se filtra a través de un filtro de nitrato de celulosa de 0,45 micras, se divide en partes alícuotas y se conserva congelado a -80°C.

Ejemplo 3 Preparación e investigación de líneas celulares de hibridoma A. Ensayo inmunoabsorbente de enzimas ligados (EIA)

En primer lugar se llevaron a cabo EIA para determinar las valoraciones de anticuerpos (Ab) séricos de animales individuales, y después para la investigación de los hibridomas potenciales. Se revistieron placas de EIA/RIA de microvaloración de 96 pocillos de fondo plano y elevada unión (Costar Corporation, Cambridge, MA) con sHuEPOR purificado a 5 \mug por ml de tampón de carbonato-bicarbonato, pH 9,2 (Na_{2}CO_{3} 0,015 M, NaHCO_{3} 0,035 M). Se añadieron 50 \mul de Ab a cada pocillo. Las placas entonces se cubrieron con una película de acetato (ICN Biomedicals, Inc., Costa Mesa, CA) y se incubaron a temperatura ambiente sobre una plataforma oscilante durante 2 horas, o durante la noche a 4°C. Se utilizó el sHuEPOR lote n° 1 después del primer y segundo refuerzo, y se utilizó el lote n° 2 después del tercer refuerzo. Se utilizaron los sHuEPOR lotes n° 3 y 4 para la investigación de los hibridomas. Las placas se bloquearon durante 30 minutos a temperatura ambiente con 250 \mul por pocillo de una disolución de BSA al 5% preparada mezclando 1 parte de diluyente BSA/concentrado de disolución de bloqueo (Kirkegaard and Perry Laboratories, Inc.) con 1 parte de agua desionizada (dH_{2}O). Después de eliminar la disolución de bloqueo, se añade a cada pocillo 50 \mul de diluciones en 2 veces de suero (desde 1:400 a 1:51.200), o sobrenadantes de cultivo de tejidos de hibridoma. El diluyente del suero era BSA al 1% (diluyente BSA al 10%/concentrado de disolución de bloqueo diluida 1:10 en disolución salina tamponada con fosfato de Dulbecco, D-PBS; Gibco BRL, Grand Island, NY), mientras que los sobrenadantes de los hibridomas se ensayaron sin diluir. En el caso del ensayo de los hibridomas, un pocillo se mantuvo como conjugado control, y un segundo pocillo como control Ab positivo. Las placas de nuevo se incubaron a temperatura ambiente con oscilación durante 1 hora, y después se lavaron 4 veces utilizando 1 x preparación de disolución de lavado, 20 x concentrado (Kirkegaard and Perry Laboratories, Inc.) en dH_{2}O. Entonces se incubó durante 30 minutos en cada pocillo Ab secundario conjugado con peroxidasa de rábano de cabra específico anti-cadena pesada y ligera de IgG de ratón (Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianápolis, IN) diluido 1:1000 en BSA al 1%. Las placas se lavaron como antes, se secaron con papel secante y se añadió sustrato de componente único de peroxidasa ABTS (Kirkegaard and Perry Laboratories, Inc.). Se leyó la absorbancia a 405 nm para cada pocillo utilizando un lector de microplacas EL310 (Bio-tek Instrments, Inc., Winooski, VT). Se calculó la valoración semimáxima de anticuerpo sérico mediante la representación del log_{10} de la dilución de suero frente a la densidad óptica a 405 nm, y después se extrapoló en el punto del 50% de máxima densidad óptica obtenida en ese suero. Se consideró que los hibridomas eran positivos si la densidad óptica obtenida era mayor que 5 veces el efecto de fondo.

B. Inmunización

Diez ratones Babl/c de 4,5 semanas (Charles Rivers Laboratories, Wilmington, MA) se inyectaron por vía subcutánea con 50 \mug de sHuEPOR; lote 1; antígeno, emulsionados en adyuvante de Freund completo (CFA al 50% v/v; Difco Laboratories, Detroit, MI). Estos animales recibieron un refuerzo (por vía subcutánea) 4 semanas después con 25 \mug de antígeno (Ag; lote 1) preparado de forma similar utilizando adyuvante de Freund incompleto (ICFA; Difco Laboratories, Detroit, MI). Los ratones se sangraron a través de la cola 9 días después y se determinaron las valoraciones de anticuerpos (Ab) séricos mediante un ensayo inmunoabsorbente de enzimas ligados (EIA). A medida que la valoración semimáxima de cada ratón aumentaba por encima de 5000, los animales individuales se fueron seleccionando para la preparación de los hibridomas. Los tres animales (n° 7, 8 y 9) que se utilizaron para generar los híbridos de interés (n° 71A y 73A) requirieron más refuerzos a las 5 semanas, y de nuevo a las 29 semanas utilizando 12,5 \mug de Ag (lote 1) y 25 \mug de Ag (lote 2), respectivamente. Estos refuerzos se llevaron a cabo de la misma manera que el refuerzo inicial; es decir, como una emulsión en ICFA al 50% vol/vol. Se siguieron controlando las valoraciones de Ab séricos 9 días después de cada refuerzo. Las valoraciones finales de estos ratones antes de la fusión eran de 5026, 6842 y 12,945 para los animales 7, 8 y 9, respectivamente.

C. Fusión de las células

Se inyectó a los animales 7, 8 y 9 por vía intravenosa 25 \mug de sHuEPOR (lote n° 3), 8 semanas después del refuerzo final. Cuatro días después, los ratones se sacrificaron con dióxido de carbono y se recogieron los bazos bajo condiciones estériles con 25 ml de medio de Eagle modificado de Dulbecco que contenía 200 U/ml de penicilina G, 200 \mug/ml de sulfato de estreptomicina, y glutamina 4 mM (2 x P/S/G DMEM). Se cortó el exceso de tejido graso de los bazos y después se enjuagaron en 3 placas de 2 x P/S/G DMEM limpio. Después se trasladaron a una bolsa estomaguera estéril (Tekmar, Cincinnati, OH) que contenía 10 ml de 2 x P/S/G DMEM, y se rompieron hasta conseguir una suspensión de células separadas con el mezclador de laboratorio estomaguero 80 (Seward Laboratory UAC House; Londres, Reino Unido). A medida que las células se liberaban de la cápsula del bazo hacia el medio, iban siendo retiradas de la bolsa y se las hacía pasar a través de un filtro de células de malla de nailon de 70 \mum (Becton Dickinson and Company; Lincoln Park, NJ). Se introdujo medio fresco en la bolsa y el proceso continuó hasta que se liberó el contenido en células enteras del bazo. Estos esplenocitos se lavaron 3 veces mediante centrifugación a 225 x g durante 10 minutos. En la primera fusión, se usaron los esplenocitos del animal n° 9; en la segunda, se reunieron los de los animales n° 7 y 8.

Al mismo tiempo, se lavaron de manera similar cultivos en fase logarítmica de células de mieloma de ratón Sp2/0-Ag14 (disponibles en la American Type Culture Collection, Rockville, MD, con el número de registro CRL 1581) cultivadas en medio completo (DMEM, suero bovino fetal al 10%, glutamina 2 mM, aminoácidos no esenciales 0,1 mM, piruvato de sodio 1 mM, y tampón Hepes 10 mM; Gibco Laboratories, Inc., Grand Island, NY). A partir de esta población de mieloma, se cogieron 4 x 10^{7} células (fusión 1), u 8 x 10^{7} células (fusión 2), se mezclaron con la suspensión de esplenocitos y se volvieron a sedimentar. Los medios se aspiraron del sedimento celular, y 2 ml de polietilenglicol (PEG de peso molecular 1500; Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianápolis, IN) se mezclaron con suavidad en el medio durante 1 minuto para la fusión 1 de 3,5 ml de PEG, para la fusión 2 a 37°C. Después se añadió lentamente un volumen igual de 2 x P/S/G DMEM. Se dejaron las células en reposo a 37°C durante 2 minutos, después se añadieron 9 ml más de 2 x P/S/G DMEM. Las células se volvieron a poner a 37°C durante 4 minutos.

Por último, se añadieron 30 ml de 2 x P/S/G DMEM a la suspensión celular, y las células se sedimentaron mediante centrifugación. El medio se aspiró del sedimento y las células se resuspendieron con suavidad en aproximadamente 56 ml (fusión 1) o 74 ml (fusión 2) de medio completo que contenía 100 U/ml de penicilina G y 100 \mug/ml de sulfato de estreptomicina. Las células se distribuyeron en 10 placas de cultivo de tejidos de fondo plano de 96 pocillos (Becton Dickinson Labware; Lincoln Park, NJ) mediante gotas individuales con una pipeta de 5 ml. Las placas se incubaron en condiciones humidificadas a 37°C, CO_{2} al 5%, durante la noche. Al día siguiente se añadió un volumen igual de medio de selección a cada pocillo. La selección consistía en hipoxantina 0,1 mM, aminopterina 4 x 10^{-4} mM, y timidina 1,6 x 10^{-2} mM en medio completo. Las placas de fusión se incubaron durante 7 a 10 días con 2 cambios de medio durante este tiempo; después de cada cambio de fluido se utilizó el medio de selección HAT. Se recogieron los sobrenadantes de los cultivos de tejidos de cada pocillo que contenía un híbrido, y se ensayaron mediante EIA para detectar reactividad de anticuerpos específicos contra sHuEPOR. Los 96 pocillos que dieron positivo en EIA se sometieron a investigaciones posteriores.

D. Transferencia por puntos

Se utilizaron transferencias por puntos de sHuEPOR reducido (lote n° 4) como segundo método de investigación para los hibridomas EIA-positivos. Se montó el aparato de microvaloración SF de transferencia por puntos (Bio-Rad Laboratories, Inc.; Richmond, CA) según el manual de instrucciones; se emplearon membranas de nitrocelulosa (9 x 12 cm; Bio-Rad Laboratories, Inc.; Richmond, CA). Se preparó primero el antígeno hirviendo durante 5 minutos bajo condiciones reductoras con 2-mercaptoetanol (al 5% vol/vol; Bio-Rad Laboratories, Inc.; Richmond, CA) en disolución salina tamponada con Tris (TBS; Tris 10 mM, pH 7, 5, NaCl 154 mM, azida de Na al 0,01% p/v). Se cargaron veinticinco ng de sHuEPOR (lote n° 4) en cada pocillo, y se aspiraron a través de la membrana de nitrocelulosa para su unión. Los pocillos se llenaron con 250 \mul de disolución Blotto-Tween (disolución de bloqueo; leche en polvo desnatada al 2% p/v, Tris 50 mM, pH 7,5, NaCl 25 mM, EDTA 0,1 mM, Tween 20 al 0,09% v/v, antiespumante A al 0,01% v/v) y se incubó a temperatura ambiente durante 30 minutos. La disolución de bloqueo se aspiró de los pocillos y el procedimiento se repitió una segunda vez para asegurar el bloqueo completo de los sitios no específicos de la membrana. Esto fue seguido de 3 lavados a través de la membrana con D-PBS que contenía monolaurato de polioxitetilensorbitán al 0,1% v/v (Tween-20; Bio-Rad Laboratories, Inc.; Richmond, CA). Después se añadieron 95 \mul de medio condicionado de hibridoma EIA-positivo a cada pocillo y se incubó durante 45 minutos a temperatura ambiente. Los pocillos se lavaron 3 x con TBS-Tween (Tris 20 mM, pH 7, 5, NaCl 50 mM, Tween 20 al 0,02% v/v) y 2 x con TBS-Tween (Tris 20 mM, pH 7,5, NaCl 0,5 M, Tween 20 al 0,09% v/v) con 250 \mul por lavado, aspirando a través de la membrana después de cada adición. Se incubó en cada pocillo a temperatura ambiente durante 45 minutos 100 \mul de anticuerpo secundario conjugado con HRP de cabra específico anti-cadena pesada y ligera de IgG de ratón (diluido 1:1000 en TBS-Tween; Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianápolis, IN). Las membranas se lavaron como antes, se retiraron del aparato de transferencia, se introdujeron en reactivo quimioluminiscente potenciado preparado (reactivo ECL; Amersham Life Sciences, Corporation; Arlington Heights, IL) y se expuso a una película X-OMAT AR (Kodak Scientific Imaging, Rochester, Nueva York). Quince segundos después, se retiró la película de los casetes de película y se reveló. Se asignó una puntuación desde 3+ a 0 a cada pocillo basándose en la intensidad de puntos para los sobrenadantes de hibridoma individuales.

Ejemplo 4 Unión del anticuerpo anti-EPOR al EPOR A. Unión del anticuerpo a EPO-R por análisis BIAcore

Se utilizó un análisis de interacción bioespecífico en tiempo real (BIA, Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Suecia) basado en la resonancia de plasma de superficie (SPR) (Fiagerstam et al., J. Mol. Recognition, 3, 208 (1990); Malmbory et al., Scand. J. Immunol., 35, 643 (1992)) para la investigación de anticuerpos monoclonales ELISA-positivos.

El HuEPOR soluble preparado como se describe en los ejemplos 1 y 2 se acopló covalentemente al chip detector CM5 a través del grupo amino primario. La inmovilización se llevó a cabo con un flujo de 5 ul/min en HBS (HEPES 10 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, EDTA 3,4 mM, tensioactivo P-20 BIAcore al 0,05%). La matriz carboxilada del chip detector se activó en primer lugar con una inyección de 40 ul de una mezcla de EDC (N-etil-N-(dimetilaminopropil)carbodiimida 400 mM en agua, Pharmacia Biosensor AB) y NHS (N-hidroxisuccinimida 100 mM en agua, Pharmacia Biosensor AB) 1:1. Se inyectaron 65 ul de EPO-R soluble (50 ug/ml en acetato de Na 10 mM, pH 4,0) para inmovilizarlo sobre el chip detector. El exceso de grupos reactivos del chip detector se desactivó con una inyección de 50 ul de etanolamina (Pharmacia Biosensor AB).

Cada ciclo de análisis incluía una inyección de 20 ul de sobrenadante de hibridoma, seguida de una inyección de 10 ul de HCl 10 mM para la regeneración del chip. La respuesta SPR se mide en unidades de resonancia (RU). Para la mayoría de las proteínas, 1000 RU se corresponde con una concentración en superficie de aproximadamente 1 ng/mm^{2}. Los resultados de la investigación de los 96 pocillos que eran EIA-positivos aparecen en la tabla 1. En estos experimentos, el efecto de fondo es de forma típica aproximadamente 20 RU. La unión a EPOR es significativa a 50 RU y por encima de este valor.

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TABLA 1 Anticuerpos monoclonales EPO-R

1

101

102

103

104

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Se ensayó el medio de cultivo de tejidos condicionado por hibridomas que segregaban los anticuerpos indicados, con los ensayos indicados. Los sobrenadantes que contenían todos los anticuerpos mostrados produjeron una señal positiva en los ensayos ELISA. +++, ++, + indican una respuesta positiva; +++ indica los que tienen mayor efecto.

- indica una respuesta menor o igual que la respuesta del medio control. NE indica que las muestras no se ensayaron. ¿ indica que no se pudo asignar una respuesta a la muestra.

(1) Los anticuerpos 1-61 son de los ratones número 7 y 8. Los anticuerpos 62-96 son del ratón número 9.

(2) Unidades de respuesta de Mab utilizando el chip BIAcore con sHuEPOR unido.

(3) La competencia en BIAcore era contra anti-sHuEPOR Mab 1G2. El sHuEPOR unido a un chip detector se incubó con 1G2, y después se determinó el efecto sobre la unión de Mab comparada con la unión a EPOR no preincubado con 1G2. Los anticuerpos cuya unión resultó completamente bloqueada (80-100%) son A. Los anticuerpos cuya unión resultó bloqueada 50-80% son C. Los anticuerpos cuya unión resultó bloqueada en menos de 50% son B.

(4) Se muestran los valores para los anticuerpos que dieron a las células una fluorescencia media mayor que el control (12,73). "-" indica los anticuerpos con una fluorescencia media menor o igual que el control.

(5) Inhibición de la captación de ^{3}H por células UT7-EPO. Se incubaron con las células 30 munidades de EPO y cantidades variables de anticuerpo. Después de una incubación durante la noche, las células se marcaron mediante pulsos con ^{3}H-timidina y se determinó la cantidad de cuentas captadas. Se definió una respuesta positiva como la respuesta que presentaba una disminución progresiva con cantidades crecientes de anticuerpo.

(6) Estimulación de la captación de ^{3}H por células UT7-EPO. Se incubaron con las células cantidades variables de anticuerpo. Después de una incubación durante la noche, las células se marcaron mediante pulsos con ^{3}H-timidina y se determinó la cantidad de cuentas captadas. Se definió una respuesta positiva como la respuesta que presentaba un aumento progresivo en la incorporación con cantidades crecientes de anticuerpo.

(7) La inhibición se produjo a unas concentraciones mayores que las necesarias para la activación.

B. Análisis de competencia del epitopo

El chip detector que estaba inmovilizado con sHuEPOR podía saturarse mediante una inyección de 65 \mul de sobrenadante de hibridoma 1G2. El 1G2 es un anticuerpo monoclonal generado contra sHuEPOR utilizando procedimientos descritos en el ejemplo 3. Cada ciclo de análisis incluye inyecciones de 20 ul del sobrenadante de hibridoma con y sin un epitopo saturado por la inyección de 65 ul de 1G2. La proporción de la señal de unión en RU de la inyección de 20 \mul después de la saturación, frente a la señal de unión en RU de la inyección de 20 \mul solo, se define como el porcentaje de bloqueo por 1G2. Los anticuerpos con un bloqueo de 80-100% se denominan grupo A, los que tienen un bloqueo menor que 50% son el grupo B, y los que tienen un bloqueo de 50-80% son el grupo C. Los resultados aparecen en la tabla 1.

C. Unión del anticuerpo a d40EPOR en células CHO transfectadas mediante análisis de aislamiento en citofluorímetro (FACS)

Se ensayaron sobrenadantes de hibridoma generados contra EPOR para determinar su unión al receptor EPO sobre la superficie de células CHO transfectadas con pDSR\alphaEPORd4O mediante un análisis FACS. Se construyeron células CHO transfectadas con DNA que codifica el receptor d40 EPO como se describe en el ejemplo 1. Las células CHO/EPOR se rascaron de las placas de cultivo de tejidos y se resuspendieron como células individuales en una disolución de PBS/BSA al 0,5%, y después se distribuyeron en una placa de fondo redondo de 96 pocillos a aproximadamente 3 x 10^{5}/pocillo. La placa entonces se colocó en una centrífuga a 1000 x g durante 5 minutos. Después de la centrifugación, se retiró el sobrenadante de PBS/BSA y cada una de las células sedimentadas se resuspendió en un medio control, o en uno de los sobrenadantes de hibridoma EPOR. Las células se incubaron a 4°C durante 1 hora. Después de la incubación, las células se lavaron con PBS/BSA y después se resuspendieron en una disolución de anticuerpo monoclonal de cabra anti-ratón marcado con isotiocianato de fluoresceína (FITC) (Southern Biotech, Birmingham, Ala.). Las células se incubaron de nuevo a 4°C durante 1 hora, se lavaron y se analizaron mediante FACS. De los 96 sobrenadantes ensayados, cinco tenían una fluorescencia celular media mayor que el medio control (ver tabla 1). El Mab 71 produjo el nivel mayor de fluorescencia, seguido por Mab 74, 58, 73 y 87. Ninguno de los sobrenadantes ensayados mostró una fluorescencia mayor que los valores
control.

Ejemplo 5 Purificación de anticuerpos anti-EPOR y fragmentos Fab A. Producción de ascites

Se cebaron ratones Balb/c (Charles River Laboratories, Wilmington, MA) de más de 5 semanas con 2,4,10,14-tetrametilpentadecano (Pristane; Sigma, St. Louis, MO) de 7 a 10 días antes de la inyección de las líneas celulares. Cada ratón recibió una única inyección intraperitoneal de 0,5 ml; se inyectaron de 10 a 20 animales por cada línea celular de la cual se iba a preparar el fluido de ascites.

Las líneas de hibridoma cultivadas en medio completo hasta que se alcanzó la confluencia se lavaron una vez con D-PBS, y después se contaron usando un hemacitómetro Neubauer. Después cada ratón fue inyectado por vía intraperitoneal con 107 células, y se les suministró pienso Rodent Lab Chow y agua sin límite hasta que se desarrolló el fluido de ascites. Los ratones se controlaron para detectar la máxima formación de ascites, se sacrificaron con CO_{2} y se realizaron punturas para la recogida del fluido usando una aguja 18G insertada en la cavidad llena de fluido. El fluido se aclaró mediante centrifugación a 225 x g durante 15 minutos, o durante 3 minutos en una microcentrífuga (Eppendorf). Entonces se conservaron partes alícuotas de 4 ml a -20°C hasta que se purificaron mediante cromatografía en columna de proteína-A.

B. Purificación de proteína-A de los anticuerpos monoclonales

Se purificó la inmunoglobulina de 4 ml de fluido de ascites, o de 10 ml de medio condicionado de hibridoma, mediante cromatografía en columna de proteína-A. Se utilizó el sistema de purificación de anticuerpos monoclonales Bio-Rad II (MAPS II; Bio-Rad Laboratories; Richmond, CA). Brevemente, 5 ml de suspensión de proteína-A Affi-gel se introdujeron en una columna de vidrio desechable de 1 x 10 cm. El gel de proteína-A se lavó con aproximadamente 30 ml de D-PBS, y después se preparó haciendo correr 20 ml de tampón de unión (MAPS II Binding Buffer; Bio-Rad) a través de la columna. Entonces se añadió el fluido de ascites o el medio condicionado diluido 1:1 con el tampón de unión a la parte superior de la columna, y se dejó que fluyese por ella. Después de la unión de la inmunoglobulina a la proteína-A, se desechó la fracción sin unir. La columna después se enjuagó para eliminar la proteína sin unir con 30 ml de tampón de unión, para producir una absorbancia a 280 nm menor que 0,01. La fracción que contenía inmunoglobulina entonces se eluyó con tampón de elución Bio-Rad, aproximadamente 30 ml. Esta fracción se sometió a un intercambio de tampón durante la noche a 4°C mediante diálisis contra 4 litros de D-PBS. La inmunoglobulina equilibrada con PBS resultante se concentró mediante centrifugación a 1700 x g en unidades Centricon Concentrator (Amicon Inc., Beverly, MA).

C. Fraccionamiento del dominio de unión al anticuerpo

La inmunoglobulina purificada con proteína-A se volvió a fraccionar en sus 2 partes componentes, la fracción cristalizable (Fc) y la fracción de unión al anticuerpo (Fab), utilizando un kit de ensayo de preparación de Fab Pierce ImmunoPure (Pierce Chemical Company, Rockford, IL). La inmunoglobulina purificada con proteína-A se dializó en tampón fosfato 20 mM/EDTA 10 mM a pH 7,0, y después se concentró hasta aproximadamente 20 mg/ml. Se fraccionaron 10 mg de inmunoglobulina. Un gel de papaína inmovilizada se enjuagó dos veces con tampón de digestión que contenía 42 mg de cisteína en 12 ml de tampón fosfato, tal como se suministra. La muestra de inmunoglobulina entonces se añadió al gel y se incubó a 37°C durante la noche en un agitador giratorio. El Fab solubilizado se separó de Fc y la inmunoglobulina sin digerir mediante purificación con proteína-A; la fracción sin unir se recogió como en la muestra Fab. Esta porción sin unir se dializó durante la noche contra 4 litros de D-PBS a 4°C y se concentró como antes.

Ejemplo 6 Cartografiado del epitopo de Mab 71 sobre EPOR

Se prepararon péptidos sintéticos solapantes de 17 a 30 aminoácidos de longitud, que abarcaban los restos 1 a 224 del receptor EPO humano, en el que el resto 1 es prolina y el resto 224 es ácido aspártico. Los diez péptidos diferentes se solapaban en seis aminoácidos en ambos extremos. Las secuencias de los péptidos y su colocación dentro de la secuencia de aminoácidos del EPO-R humano son como sigue:

SE-1 PPPNLPDPKFESKAALLAARGPEELCFTE

(restos 1-30)

SE-2A LLCFTERLEDLVCFWEEA

(restos 25-42)

SE-2B CFWEEAASAGVGPGNYSF

(restos 37-54)

SE-3 PGNYSFSYQLEDEPWKLCRLHQAPTARGAV

(restos 49-78)

SE-4 TARGAVRFWCSLPTADTSSFVPLELRVTAA

(restos 73-102)

SE-5 LRVTAASGAPRYHRVIHINEVVLLDAPVGL

(restos 97-126)

SE-6 DAPVGLVARLADESGHVVLRVLPPPETPMT

(restos 121-150)

SE-7 PETPMTSHIRYEVDVSAGNGAGSVQRVEIL

(restos 145-174)

SE-8 QRVEILEGRTECVLSNLRGRTRYTFAVRAR

(restos 169-198)

SE-9 FAVRARMEAPSFGGFWSAWSEPVSLLTPSDLD

(restos 193-224)

Se revistieron pocillos de poliestireno (Costar, Cambridge, MA) con los anteriores péptidos EPO-R a concentraciones de 100 \mug/ml, 20 \mug/ml y 0,8 \mug/ml, respectivamente, en tampón de carbonato-bicarbonato (Na_{2}CO_{3} 0,015 M, NaHCO_{3} 0,035 M, pH 9,2). La placa se incubó a temperatura ambiente durante 2 horas, y después durante la noche a 4°C. El HuEPOR soluble se revistió a concentraciones de 10 \mug/ml, 2 \mug/ml, 0,4 \mug/ml y 0,08 ug/ml, como controles positivos bajo las mismas condiciones. Después de bloquear con BSA al 5% en PBS a temperatura ambiente durante 30 minutos, la placa se incubó con Mab 71 purificado, como se describe en el ejemplo 5, a una concentración de 5 \mug/ml en BSA al 1% a temperatura ambiente durante 2 horas. Después de lavar con tampón de lavado (Kirkegaard and Perry Labs, Inc.), la placa se incubó con una dilución 1:1000 de anti-IgG de ratón de cabra conjugado con peroxidasa de rábano (Boehringer Mannheim) durante una hora a temperatura ambiente. La placa se lavó y se reveló con disolución sustrato ABTS (Kirkegaard and Perry Labs, Inc.). La colorimetría se llevó a cabo a 405 nm. Los resultados de la unión de Mab a los péptidos sintéticos aparecen en la figura 1, e indican que Mab 71 une cantidades significativas de péptido SE-3 (restos aminoácidos 49 a 78 inclusive del EPO-R humano), comparado con los otros péptidos ensayados. Esto indica que Mab 71 se une a una región del EPO-R humano que contiene o se solapa con los restos 49 a 78.

Ejemplo 7 Actividad de los anticuerpos anti-EPOR en ensayos de proliferación de células

Se ensayaron anticuerpos en medio condicionado preparado como se ha descrito anteriormente, para comprobar su capacidad para estimular la captación de ^{3}H-timidina por células UT7-EPO (Komatsu et al., supra). Las células UT7-EPO responden frente a EPO y expresan los receptores EPO humanos sobre su superficie celular. Las células UT7-EPO se cultivaron en medio de crecimiento (1 x medio de Dulbecco modificado de Iscove con L-glutamina, tampón HEPES 25 mM, y 3204 mg/1 de bicarbonato de sodio, pero sin alfa-tioglicerol ni beta-mercaptoetanol (GIBCO)/suero bovino fetal al 10% v/v/ disolución de L-glutamina-penicilina-estreptomicina al 1% v/v (Irvine Scientific)/1 unidad/ml de rHuEPO) hasta aproximadamente 3 x 10^{5} células/ml. Las células se recogieron mediante centrifugación (aproximadamente 500 x g), se lavaron dos veces con disolución salina tamponada con fosfato, y se resuspendieron a 5 x 10^{4} células/ml en medio de ensayo (1 x medio RPMI 1640 sin L-glutamina (GIBCO)/L-glutamina al 1%/ suero bovino fetal al 4%). Las muestras de ensayo o el patrón de EPO (rHuEPO), 100 \mul diluidos en medio de ensayo al menos 5 veces, se añadieron a los pocillos en una placa de microvaloración de 96 pocillos. Entonces se añadieron 50 \mul de células (5000 células/pocillos), y las placas se incubaron en una incubadora humidificada a 37°C y CO_{2} al 5%. Después de 72 horas, se añadieron 50 \mul de metil-^{3}H-timidina (1 mCi/ml; 20 Ci/mmol) diluida 1:100 en medio de ensayo. Las células se incubaron durante 4 horas más a 37°C y 002 al 5%. Las células marcadas se recogieron sobre filtros de fibra de vidrio utilizando un recolector de células PHD (Cambridge Technology Inc.) y agua desionizada como disolución de lavado. Los filtros se enjuagaron finalmente con 2-propanol, después se secaron y se contaron en un contador de centelleo Beckman modelo LS6000IC.

Se ensayó medio condicionado de las placas de cultivo de tejidos que contiene Mab anti-EPOR para determinar su capacidad para estimular la proliferación, como se ha descrito anteriormente. Se ensayaron muestras con varias diluciones. Se define una respuesta positiva como la respuesta que estimula la captación de timidina al menos 2 veces más que los niveles de fondo, y también produce una estimulación decreciente a medida que las muestras se diluyen. Tal como aparece en la tabla 1, dos muestras de las 24 ensayadas produjeron una respuesta positiva (Mab 71 y 73). Cuatro muestras pueden tener una actividad estimulante débil (? en la tabla 1). El resto de las muestras no mostraron un aumento significativo sobre el efecto de fondo. Un suero policlonal del ratón utilizado para generar los anticuerpos monoclonales también estimuló la captación de timidina. Esto sugiere que el anticuerpo policlonal en este suero también es capaz de estimular la proliferación de las células UT7-EPO.

También se ensayaron los sobrenadantes para determinar su capacidad para inhibir la estimulación inducida por EPO de la captación de timidina por las células UT7-EPO. Las células se incubaron con 25 munidades/ml de rHuEPO y cantidades variables de medio que contiene anticuerpo. Se midió la captación de timidina como se ha descrito anteriormente. Los resultados aparecen en la tabla 1. La mayoría de los anticuerpos no se diferenciaban significativamente del medio control. De los anticuerpos que inhibían la captación de timidina, dos muestras (Mab 58 y 73) mostraron una inhibición definida, mientras que tres muestras (Mab 65, 88 y 89) mostraron una posible inhibición. El Mab 73 inhibía a las dosis más altas, pero en dosis bajas estimula la captación de timidina por encima de los valores
control.

Ejemplo 8 Activación de EPOR por anticuerpos y fragmentos anti-EPOR A. Ensayo de la proliferación de UT7-EPO

Los Mab 71 y 73 se purificaron como se describe en el ejemplo 5. Se determinó la actividad proliferativa con ensayos de captación de timidina por UT7-EPO como se ha descrito en el ejemplo 7. Los Mab 71 y 73 estimulaban la captación por las células UT7-EPO de una manera dependiente de la dosis, tal como rHuEPO (véase la figura 2). La actividad se redujo a dosis elevadas de Mab 71. Los picos en la actividad estimulante se observaron a dosis de 1-2 \mug/ml para Mab 71, y a >100 \mug/ml para Mab 73. Un anticuerpo control no neutralizante (Mab F12 anti-EPO) no produjo estimulación, lo cual sugiere que la estimulación es específica para los anticuerpos del receptor EPO.

B. Ensayos de desplazamiento frío de EPO

Los anticuerpos contra el receptor EPO pueden unirse a la misma región que se une EPO. Para ensayar esta posibilidad, se llevaron a cabo ensayos de desplazamiento frío utilizando células OCIM1. Las células OCIM1 son de origen humano y se sabe que contienen receptores EPO sobre su superficie celular (Broudy et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 85, 6517 (1988)). Las células se cultivaron en medio de crecimiento OCIM1 (medio de Dulbecco modificado de Iscove (IMDM)/suero bovino fetal al 10%/penicilina-estreptomicina-fungisona al 1%) hasta aproximadamente 2-5 x 10^{5} células/ml. Las células se recogieron mediante centrifugación, se lavaron dos veces en tampón de unión (RPMI 1640/BSA al 1%/HEPES 25 mM, pH 7,3), después se resuspendieron en tampón de unión que contenía azida al 0,1% y 10 \mug/ml de citocalisina B a 1-2 x 10^{7} células/ml. Las células (100 \mul) en placas de cultivo de tejidos de 96 pocillos entonces se incubaron con 10 \mul de muestra y 10 \mul de ^{125}I-EPO (Amersham de alta actividad específica; 3000 Ci/mmol, 2 \muCi/ml) en una incubadora de cultivo de tejidos humidificada a 37°C. Después de 3 horas, las células se centrifugaron a través de aceite de ftalato (ftalato de dibutilo/dinonilo 60:40 v/v) en tubos de valoración. Los tubos que contienen células se congelaron rápidamente en un baño de hielo seco-etanol, y el sedimento celular se cortó y después se contó en un contador gamma automático Gammamaster LKB 1277.

La figura 3 muestra los resultados del experimento de desplazamiento frío. Cantidades crecientes de ^{125}I-EPO fueron desplazadas de los receptores EPO sobre las células, a medida que aumentaba la cantidad de rHuEPO sin marcar añadido. De forma similar, el Mab 71 purificado como se describe en el ejemplo 5 también desplaza cantidades crecientes de ^{125}I-EPO con cantidades crecientes de anticuerpo. En este caso, se necesitó aproximadamente 4.000 veces más de Mab 71 que de rHuEPO para desplazar cantidades equivalentes de 125I-EPO. Por contraste, Mab 73 no mostró indicaciones de desplazamiento en las dosis mayores, pero un Mab anti-rHuEPO no neutralizante (F12) no desplazó de forma significativa. Estos resultados indican que Mab no interfiere con la unión de EPO a su receptor, pero Mab 71 y 73 sí. Este resultado también indica que Mab 71 se une al receptor EPO y lo activa uniéndose al sitio de unión de EPO o cerca de él.

\newpage

C. Comparación de las actividades de Mab 71 y Fab 71

Se prepararon fragmentos del receptor EPO de Mab 71 como se describe en el ejemplo 5. Las preparaciones se caracterizaron mediante una electroforesis en gel de SDS (Laemmli et al., Nature, 227, 680 (1970), como aparece en la figura 4. Las muestras se hirvieron en SDS al 2% que contenía tampón de muestra con o sin 2-mercaptoetanol 0,7 M, para distinguir las proteínas reducidas (2-mercaptoetanol) de las no reducidas (sin 2-mercaptoetanol), y después se ensayó en geles de SDS-acrilamida al 12,5%. Los geles se tiñeron con azul de Coomassie para visualizar las proteínas. Se estimaron los tamaños de las proteínas mediante la comparación de sus movilidades con las movilidades de patrones de proteínas. Los Mab 71 y 73 se separaron en sus cadenas ligera y pesada cuando se ensayaron bajo condiciones reductoras. Las cadenas pesadas eran aproximadamente 52 kDa. La cadena ligera de Mab 73 era ligeramente más pequeña (28 kDa) que la de Mab 71 (28,5 kDa). Los fragmentos Fab también tenían dos cadenas: de 28,3 y 27,3 kDa para Fab 71, y de 27,5 y 26,5 kDa para Fab 73. Cuando estos fragmentos Fab se ensayan bajo condiciones no reductoras, los tamaños de los Fab 71 y 73 eran aproximadamente 48 y 47 kDa, respectivamente. Esto indica que los fragmentos Fab son monovalentes, el complejo tiene una cadena ligera y una cadena pesada. Por contraste, las movilidades en geles de SDS no reductores para Mab 71 y 73 indican que sus tamaños son aproximadamente 200 kDa. Esto indica que estos Mab son bivalentes, tienen dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras.

Para comprobar si los fragmentos Fab 71 monovalentes pueden activar el receptor EPO, el Mab 71 y el fragmento Fab 71 se incubaron con células UT7-EPO, y se midió la captación de timidina como se describe en el ejemplo 7. Tal como aparece en la figura 5, rHuEPO y Mab 71 estimulan la captación de timidina. Sin embargo, el fragmento Fab 71 monovalente no. Un anticuerpo monoclonal control generado contra un receptor no relacionado (Her2/neu) tampoco estimula la captación de timidina. Esto indica que los anticuerpos deben ser bivalentes para activar el receptor.

D. Estimulación de la captación de timidina por Mab 71 y Fab 71 en presencia de rHuEPO

El hecho de que Mab 71 inhibe la unión de EPO a los receptores EPO sugiere que el anticuerpo puede no activar el receptor EPO en presencia de EPO. Para ensayar esta posibilidad, se incubaron células UT7-EPO con 30 munidades/ml de rHuEPO y cantidades variables de Mab 71, Fab 71 o Mab control (generado contra Her2/neu) purificados. Se midió la captación de timidina como antes descrito. Tal como aparece en la figura 6, Mab 71 y Fab 71 inhiben la captación de timidina en dosis elevadas. Sin embargo, en dosis entre aproximadamente 30 y 3000 \mug/ml, el Mab 71 estimula la captación de timidina por encima de los niveles estimulados por rHuEPO por sí solo. El Fab 71 y los anticuerpos control no producían este efecto. Esto indica que Mab 71 y rHuEPO pueden tener un efecto aditivo en la activación del receptor EPO.

Ejemplo 9 Estimulación de la formación de colonias eritroides por los anticuerpos anti-EPOR

Para comprobar si el Mab 71 purificado puede estimular la formación de células eritroides a partir de precursores en sangre periférica, se llevó a cabo un ensayo eBFU. Para purificar precursores de células eritroides, se linfoferizaron según un protocolo convencional. Las células linfoferizadas (250 ml) se lavaron con 250 ml de disolución salina equilibrada de Hank (HBSS). Las células se resuspendieron en HBSS y se separaron mediante centrifugación de densidad a través de un gradiente (Ficoll-paque) durante 30 minutos a 500 x g. Las células de baja densidad (BD) se recogieron del gradiente, se lavaron con 500 ml de HBSS y se resuspendieron en PBS suplementado con albúmina de suero bovino al 0,5% y EDTA 5 mM a una concentración de 5 x 10^{8} células/ml. Las células BD se purificaron más utilizando un kit de ensayo de aislamiento de células progenitoras CD34 (QBend/10), fabricado por Miltenyl Biotech GmbH. Brevemente, las células se marcaron con un anticuerpo monoclonal anti-CD34, entonces se unieron a microsferas magnéticas según un protocolo. Las células marcadas entonces se hicieron pasar a través de unas columnas de separación MiniMacs prellenas, las columnas se lavaron y las células CD34+ entonces se eluyeron de la columna. Este proceso se repitió una vez más para lograr una mayor pureza de las células CD34+. El ensayo in vitro se realizó en las células CD34+ purificadas como describen Iscove et al. (J. Cell. Physiol., 83, 309 (1974)) con las siguientes modificaciones. El medio de cultivo se obtuvo en Gibco BRL (kit de ensayo de proliferación de células progenitoras de médula ósea humanas; Grand Island, NY). Para lograr placas duplicadas de muestras de 1 ml, sobre placas de cultivo de tejidos de 35 x 100 mm, se preparó un exceso de 3 ml en tubos de poliestireno estéril 17 x 100. Cada tubo recibió 2,5 ml de medio de crecimiento de células progenitoras, 0,1 ml de células CD34+ (resuspendidas a 90.000 células/ml), 0,015 ml de factor de células progenitoras (20 \mug/ml), y una combinación de una muestra y el medio de dilución de células progenitoras igual a 0,385 ml. Los tubos se agitaron en torbellino y se dejaron en reposo para que las burbujas subieran. Entonces se establecieron partes alícuotas del contenido utilizando una jeringa de 3 ml con una aguja 17 x 1-1/2. Las placas se incubaron a 37°C y CO_{2} al 10% en una incubadora de cultivo de tejidos humidificada. Se contaron las colonias eritroides (de color naranja a rojo) después de 21 días. No se observaron colonias eritroides en las placas que carecían de EPO o Mab 71. El rHuEPO (30 munidades/placa) produjo un exceso de 400 colonias por placa. El Mab 71 también produjo colonias eritroides. El pico de actividad se observó a 2-6 \mug/ml. Este resultado indica que el Mab 71 estimula la formación de colonias eritroides.

También se ensayó la actividad del Mab 71 purificado para determinar su capacidad para formar colonias eritroides utilizando condiciones de crecimiento exentas de suero en metilcelulosa. Se aislaron células CD34+ como se ha descrito anteriormente, y se incubaron utilizando el medio de crecimiento exento de suero en el documento WO 95/00632, con las siguientes modificaciones. Los tubos de ensayo se prepararon sin utilizar moléculas de matriz extracelular, hidrocortisona, y los factores del crecimiento EGF, FGF y PDGF. Como se ha descrito anteriormente, se prepararon 3 ml de muestra para lograr placas por duplicado de muestras de 1 ml. Cada tubo recibió 0,030 ml de cada uno de las siguientes 100 x disoluciones patrón (2-mercaptoetanol, nucleósidos, colesterol, piruvato de sodio, Hu-transferrina, lípidos, Hu-insulina), 0,4 ml de BSA desionizado (al 15%), 0,015 ml de SCF (20 ug/ml, 0,1 ml de células CD34+ (resuspendidas a 300.000 células/ml), 1,080 ml de metilcelulosa (al 2,3%) y una combinación de muestra e IMDM igual a 1,195 ml, en la que la muestra no excedía de 150 \mul. Las placas entonces se incubaron como se describe anteriormente, y se contaron las colonias después de 21 días. Se observaron colonias eritroides cuando se cultivaba en presencia de EPO o Mab 71, pero no bajo las condiciones que no tenían estos dos factores. Un ejemplo de los tipos de colonias eritriodes observadas se muestra en la figura 7. Las colonias incubadas con 25 munidades de rHuEPO parecían similares a las cultivadas con 2,1 \mug/ml de Mab 71 purificado. Unas dosis mayores de rHuEPO produjeron colonias mayores. En la figura 8 aparece una curva de dosis-respuesta. El Mab 71 tiene un pico de actividad en las dosis entre 1 y 5 \mug/ml. Unas dosis menores y mayores produjeron menos colonias eritroides. Un anticuerpo monoclonal control generado contra Her2/Neu no produjo ninguna colonia en este intervalo de dosis. Este resultado indica que el Mab 71 estimula la formación de colonias eritroides a partir de precursores eritroides, y que no existe un requerimiento adicional de suero. Por tanto, el Mab 71 puede estimular la diferenciación de los precursores eritroides para producir células eritroides.

Aunque la invención se ha descrito en términos de las realizaciones preferidas, debe entenderse que los expertos en la técnica pueden pensar en variaciones y modificaciones. Por tanto, se pretende que las reivindicaciones adjuntas cubran todas estas variaciones equivalentes, que se encuentran dentro del alcance de la invención, tal como se reivindica.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

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(i)

SOLICITANTE: Amgen Inc.

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: ANTICUERPOS QUE ACTIVAN UN RECEPTOR DE ERITROPOYETINA

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 3

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(iv)

DIRECCIÓN PARA LA CORRESPONDENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESTINATARIO: Acogen Inc.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CALLE: 1840 Dehavilland Drive

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(C)

CIUDAD: Thousand Oaks

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

ESTADO: California

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

PAÍS: Estados Unidos de América

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

CÓDIGO POSTAL: 91320-1789

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

FORMA DE LECTURA POR ORDENADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TIPO MEDIO: disquete

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(B)

ORDENADOR: IBM PC compatible

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

PROGRAMA: PatentIn Release n° 1.0, versión n° 1.25

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASIFICACIÓN:

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(viii)

INFORMACIÓN DEL ABOGADO/AGENTE:

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(A)

NOMBRE: Winter, Robert B.

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE REFERENCIA/REGISTRO: A-307

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 42 pares de bases

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(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:1:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTCCAAGCTT GCCGTCACCA TGGACCACCT CGGGGCGTCC CT

\hfill

42

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 35 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:2:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CAGGTCTAGA TTACTAGGGA TCCAGGTCGC TAGGC

\hfill

35

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 27 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:3:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGGTCGACTA CTAGTAGTCA GTTGAGA

\hfill

27

Claims (19)

1. Un anticuerpo, o su fragmento bivalente, que activa un receptor de eritropoyetina, en el que el anticuerpo, o su fragmento bivalente, se une a un péptido de restos de aminoácidos 49 a 78, inclusive de un receptor de eritropoyetina humano.

2. El anticuerpo, o su fragmento bivalente, de la reivindicación 1, que es un anticuerpo monoclonal, o su fragmento bivalente.

3. El anticuerpo, o su fragmento bivalente, de la reivindicación 1, que es un anticuerpo humanizado, o su fragmento bivalente.

4. El anticuerpo, o su fragmento bivalente, de la reivindicación 1, que es un anticuerpo humano, o su fragmento bivalente.

5. El anticuerpo, o su fragmento bivalente, de la reivindicación 1, que tiene un marcador detectable.

6. Un método para detectar en una muestra biológica un receptor de eritropoyetina que es capaz de ser activado, y dicho método comprende las etapas de:

(a) poner en contacto la muestra con el anticuerpo o un fragmento bivalente del mismo;

(b) detectar la activación del receptor por el anticuerpo, o un fragmento bivalente del mismo, determinando con ello la presencia de un receptor de eritropoyetina capaz de ser activado.

7. Un kit para detectar en una muestra biológica un receptor de eritropoyetina que es capaz de ser activado, que comprende el anticuerpo o su fragmento bivalente, de cualquiera de la reivindicaciones 1 a 5.

8. Un anticuerpo o su fragmento bivalente, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, para modular la actividad endógena de un receptor de eritropoyetina en un mamífero.

9. Un anticuerpo, o su fragmento bivalente, según la reivindicación 8, en el que la modulación consiste en la regulación de la proliferación o diferenciación de células progenitoras eritroides.

10. Un anticuerpo o su fragmento bivalente, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, para tratar la anemia en un paciente.

11. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo de la reivindicación 1 a 5, en un adyuvante farmacéuticamente aceptable.

12. La composición de la reivindicación 11, en la que el anticuerpo, o su fragmento bivalente, es un anticuerpo monoclonal, o su fragmento bivalente.

13. La composición de la reivindicación 11, en la que el anticuerpo, o su fragmento bivalente, es un anticuerpo humanizado, o su fragmento bivalente.

14. La composición de la reivindicación 11, en la que el anticuerpo, o su fragmento bivalente, es un anticuerpo humano, o su fragmento bivalente.

15. El uso del anticuerpo, o su fragmento bivalente, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, para la preparación de un medicamento para modular la actividad endógena de un receptor de eritropoyetina en un paciente.

16. El uso de la reivindicación 15, en el que la modulación consiste en la regulación de la proliferación o diferenciación de células progenitoras eritroides.

17. El uso del anticuerpo, o su fragmento bivalente, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, para preparar un medicamento para el tratamiento de la anemia en un paciente.

18. Un método in vitro para modular la actividad endógena de un receptor de eritropoyetina en una célula, que comprende la administración de una cantidad del anticuerpo, o su fragmento bivalente, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, eficaz para modular la actividad del receptor.

19. El método de la reivindicación 18, en el que la modulación de la actividad del receptor de eritropoyetina consiste en la regulación de la proliferación o diferenciación de la célula.