JPH09508795A

JPH09508795A - Ｍａｐキナーゼホスファターゼ及びそれらをコードする核酸の生産並びに使用

Info

Publication number: JPH09508795A
Application number: JP7521061A
Authority: JP
Inventors: アシュウォース，アラン; オザンヌ，ブラッド; キング，アンドレア
Original assignee: ザインスティチュートオブキャンサーリサーチ：ロイヤルキャンサーホスピタル
Priority date: 1994-02-10
Filing date: 1995-02-10
Publication date: 1997-09-09
Also published as: CA2182967A1; EP0742827A1; AU1586195A; WO1995021923A1; AU696939B2

Abstract

(57)【要約】 CL100に関連するMAPキナーゼホスファターゼ及び脱リン酸化MAPキナーゼは、増殖を含む多数の細胞の調節に関係する。腫瘍抑制因子は治療に用い得る。MAPキナーゼホスファターゼをコードする核酸は、コードされたポリペプチドの生産に、遺伝子異常性のスクリーニングに及びファミリーのさらなるメンバー並びに他の種のオルソ体及び同族体を得るのに用い得る。ポリペプチドは抗体を産生するのに用いることができ、抗体自身は正常なまたは異常なポリペプチドの存在のスクリーニングに有用性がある。

Description

【発明の詳細な説明】 MAPキナーゼホスファターゼ及びそれらをコードする核酸の生産並びに使用本発明はホスファターゼに関する。特に、MAPキナーゼホスファターゼ活性を有するポリペプチド、それらをコードする核酸、そのための抗体並びにホスファターゼ、コードする核酸及び抗体の生産方法及び使用に関する。本発明はホスファターゼの活性に影響を有する物質のスクリーニング及びMAP キナーゼホスファターゼポリペプチド及び遺伝子のスクリーニングにも関する。さらに、本発明はMAPキナーゼホスファターゼ機能の喪失を含む増殖性の病気の診断及び治療方法に関する。増殖及び差別化のための細胞外シグナルを核に伝達して遺伝子の発現を変更するメカニズムは現在非常に普及している研究課題である。多くの場合、これらのシグナルの導入は、「マイトジェン−活性化タンパク質(MAP)キナーゼ」として一般的に知られている鍵酵素の活性を必要とする。MAPキナーゼ経路は多数のシグナル導入経路に関係している。たとえば、MAPキナーゼの活性化は、DNA合成の増殖因子刺激の間に並びにグリコーゲン合成の区別、分泌及び刺激の間に観察された〔１〕。MAPキナーゼは、エフェクター基質、たとえば、転写因子Ｃ−jun及びelk−１をリン酸化及び活性化することが分かった。MAPキナーゼ及びそれらが関係していることが知られている経路の概要については、Roger Davis(50)の報告を参照。 MAPキナーゼは、二元的特異的キナーゼ「MAPキナーゼキナーゼ」による、トレオニン及びチロシンのリン酸化によって活性化される。このキナーゼキナーゼは順番に「MAPキナーゼキナーゼキナーゼ」によるリン酸化により活性化され、その一つの型はプロト−オンコジーンｃ−rafである。ｃ −rafの活性化は現在充分には分かっていないが、明らかにGTP−結合ｐ21 rasタンパク質〔２〕との相互作用の必要性がある。どのようにしてMAPキナーゼ経路のスイッチが切られるかの全容はいまだにはっきりとはしていない。脱−リン酸化によるMAP活性のダウンレギュレーションは重要な解決の手がかりでありそうである。ヒト遺伝子CL100〔３〕及びそのネズミの同族体3CH134（チャールズ他、1992）は、最初は、増殖因子、酸化ストレス及び熱衝撃によってその転写が刺激される遺伝子として発見された。その後それらはセリン／トレオニン及びチロシンフォスファターゼ活性〔５＆６〕の両方を有するポリペプチドをコードすることが分かった。MAPキナーゼ上の両トレオニン及びチロシンからのこのホスフェートの除去は異常である。生体内で発現された時、この遺伝子生産物〔６〕は、MAPキナーゼに非常に特異的であり、その不活性化をもたらすことが分かった。ネズミの遺伝子3CH134及びerk2 MAPキナーゼイソ型タンパク質の哺乳類細胞における共発現はMAPキナーゼ〔７〕の脱リン酸化及び不活性化をもたらす。さらに、このホスファターゼ遺伝子は、ラットの胚繊維芽細胞中のrasオンコジーンの活性化変形により誘導された細胞のDNA合成も妨げることができることが最近分かった〔51〕。本発明は、各々がMAPキナーゼ調節システムに関係しているポリペプチドをコードする、いくつかの新しい遺伝子の驚異的な発見の結果として生じた。この目的のために、用語「マイトジェン−活性化タンパク質キナーゼ」、「MAPキナーゼ」及び「MAPK」はトレオニン及びチロシン上の二元的リン酸化により活性化されるタンパク質キナーゼに用いる。これは、広汎な一連の刺激に対する反応であり得る。異なったMAPキナーゼは（MAPKに依存する）ストレス、浸透性ストレス、交配フェロモン（イーストにおける）、増殖因子、TNF 、IL−１及びLPSを含む異なった細胞外の刺激に対する反応において活性化される。MAPキナーゼは、SMKI，HOG1，MPK1，FUS3／KSS1，spk1，ERK1／ERK2，JNK／ SAPK，ｐ38を含む。「MAPキナーゼホスファターゼ」活性または機能は、MAPキナーゼ上のトレオニン及びチロシン残基（その残基はMAPキナーゼの活性化でリン酸化される）の一方または好ましくは両方を脱リン酸化する能力である。言い換えると、MAPキナーゼホスファターゼは、MAPキナーゼ上のホスホトレオニン及びホスホチロシン残基のいずれか、または好ましくは両方を加水分解することができる。タンパク質チロシンホスファターゼによるシグナル化（PTPs）増殖及び差別化のための細胞外シグナルを核に伝達して遺伝子の発現を変更するメカニズムは、現在非常に普及している研究課題である。チロシンのリン酸化は、これらの行事〔８，９〕において主要な役割を演じ、キナーゼ及びホスファターゼの対抗する活性によって調節される。ホスファターゼはタンパク質チロシンキナーゼ(PTK）受容体の脱リン酸化により直接作用し得るが、PTK受容体は少くとも部分的にはインターナリゼーションにより調節されるので、それらはシグナル化分子下流(signalling molecules downstream)を脱リン酸化すると想像することができる。受容体様及び非受容体分子〔10〜12〕として分類し得るタンパク質チロシンホスファターゼの拡大したファミリーに、ますます関心が集中してきた。いくつかの非経膜チロシンホスファターゼの脱調節化発現は細胞の増殖に影響し、多核細胞の比率を増加させることを示した〔13，14〕。 PTPsは細胞の増殖の負の調節剤として機能するかもしれないことを証拠が示唆している。これは、PTPアーゼ阻害剤が過渡的に増殖因子に代り、マイトジェン反応を誘導することができるという観察によって支持される〔19，20〕。さらに、PTPsの過発現はｖ−srcの形質転換表現型を復帰し、オンコジーンneu 及びｖ−erbBの両方による引き続く形質転換を抑制することができることを論証した〔21，22〕。しかしながら、PTPsは増殖刺激効果を促進することができ〔23 〕、だから、細胞内の臨界的なバランスは、適当な増殖調節を保証するためにこれらの活性の間に存在しなければなぱらないことは明らかである。 MAPキナーゼを調節するシグナル導入経路活性化された受容体チロシンキナーゼから、細胞内反応へのシグナル導入における鍵要素は、MAPキナーゼのファミリー、すなわち、多くの多様な細胞型に関係している経路を含むことが今や認識される〔１〕。MAPキナーゼの二つの型は、分子量Ｐ42^mapk及びＰ44^mapk（それぞれERK−２及びERK−１）を有するヒト繊維芽細胞から精製された〔24〕。活性化は、保護されたキナーゼサブドメイン８ (Ｔ183，Ｙ185)内に位置するトレオニン及びチロシンの規則正しいリン酸化を必要とする〔25，26〕。イーストに優性の負の変異及び同族体実験を用いることは、このシグナルカスケードの説明に評価できないほどの手段であることが証明された。増殖因子活性化PTKsに応じて、予め存在するGrb2−SOS１錯体は、SH２ドメインを経てチロシルリン酸化Shc，〔27〕、に結合し、したがってRas活性化剤分子を形質膜に補充することを証拠は示唆する〔28，29〕。あるいは、Grb2は直接に自動リン酸化受容体と相互に作用するかもしれない。広範囲にわたる研究は、シグナルはRasを経由して集中し〔30，32〕、そして、Ser／ThrキナーゼRafを経由して継続する〔33，35〕という仮説を支持する。Raf−１の活性化は現在完全には理解されていないが、明らかに、GTPが結合したｐ21 rasタンパク質との相互作用の必要がある〔36，37 〕。Raf−１のオンコジーン型を用いることにより、それが推定のMKKKとして〔3 3〜35〕，MEKK〔38〕及びｃ−Mos 〔39，40〕といっしょに作用することが分かり、それは引き続くScr／Thr MEKの活性化をもたらし〔24，41〕、最終的にMAP キナーゼをリン酸化する。図１参照。最近いくつかのMAPキナーゼ遺伝子ファミリーの新しいメンバーが発見された〔50〕。これらの、JNK及びｐ38と呼ばれるキナーゼは多様な細胞反応に含まれる。JNKはストレス、腫瘍壊死因子(TNF）、インターロイキン−１（IL−１）及び紫外（UV）光により活性化される。ｐ38はリポ多糖(LPS)により活性化される。両キナーゼはそれらがチロシン及びトレオニンの両方のリン酸化により活性化されるという点でerk型MAPキナーゼに関係する。ホスファターゼによる脱活性化を示す。タンパク質ホスファターゼの新規なサブファミリー経路は、細胞サイクル調節及びオンコジーンの形質転換において機能的に重要である、即時型初期遺伝子の複合体セットを誘導することができるタンパク質リン酸化のカスケードを含むと定義された。これらのリン酸化行事の必須の特徴は、その可逆性であり、そして、まったくチロシンリン酸化はしばしば一過性である。PP2AによるトレオニンまたはCD45によるチロシンのいずれかからのホスフェートの除去は、この経路がどのように正確に生体内でスイッチを切られるかいまだに同定できていないけれども、MAPキナーゼ活性の喪失を生じる〔25〕。本発明は既知のMAPキナーゼホスファターゼに関係するタンパク質をコードするいくつかの核酸分子の発見及び単離に基づく。この分野の専門家の知識から得た洞察を用いて、本発明者は新しい遺伝子の獲得をもたらす研究の手順を設計することができた。用いられた実際の手順を次に詳細に示す。新規な核酸配列によりコードされたポリペプチドの配列は、既知のキナーゼホスファターゼCL100の配列と同程度の相同性を有し、それは、ホスファターゼ、特にMAPキナーゼホスファターゼとして表示するのに充分である。これは興味深く、有用である。 MAPキナーゼホスファターゼは細胞増殖についてオフスイッチの役をするようである。多数のMAPキナーゼホスファターゼがあるという事実は、オフスイッチに対していくらかの特異性があるかもしれないことを示唆する。MAPキナーゼホスファターゼの活性化剤は、一般的に、またはファミリーのメンバーに対して特異的であるかのいずれかであって、抗−増殖剤である。ホスファターゼをコードする核酸の供給はこのような活性化剤のスクリーニングを可能にする。たとえば、変異による、MAPキナーゼホスファターゼ活性の喪失は調節されていない細胞増殖をもたらすだろう。だから、これらの遺伝子のいくつかは「腫瘍抑制遺伝子」であることを証明するかもしれない。 MAPキナーゼに加えて、該ホスファターゼは新規な基質を持つかもしれない。これらの基質は、細胞増殖の鍵調節剤及び薬物阻害剤による干渉のための潜在的標的でもあり得る。種々のMAPキナーゼホスファターゼ及びそれらをコードする核酸の供給は、ホスファターゼポリペプチドに結合することができるか、またはそれに特異的である抗体の生産を可能にする。これらの抗体は、たとえばポリペプチドのレベルや性質のいくらかの異常性の検出のために、たとえば組織または細胞物質を含有する試料中のホスファターゼの存在を検出するのに有用である。正常な分子と異常な分子を区別することができる抗体は、診断またはスクリーニングの情況、たとえば腫瘍のような増殖性疾患の根本的な原因の検出に用いることができる。同様に、核酸プローブは個体の細胞から核酸をスクリーニングして、たとえば、それらの細胞が特定のホスファターゼをコードする野生型遺伝子を含んでいるかどうか及びもし含んでいるならそれらはホモ接合性であるか、ヘテロ接合性であるかどうかを決定するために用い得る。MAPキナーゼホスファターゼはMAPキナーゼの脱活性化に関係するので、野生型の存在しないことが細胞増殖の調節に不利な影響を有し、ヘテロ接合性が個体を増殖性疾患にかかりやすくするかもしれないというような、腫瘍抑制作用を有するらしい。したがって、重要な臨床的情報を得ることができ、適当な治療行為を採用することを可能にする。細胞中の正常のMAPキナーゼホスファターゼ活性の喪失の影響に対抗するために、MAPキナーゼホスファターゼをコードする核酸を治療情況で用いることができる。全体であれ、部分的であれ、このような活性の喪失は増殖性の疾患をもたらし、細胞の増殖の正常な調節を破壊する。調節されていない細胞の増殖、すなわち、適切に調節されていない細胞の増殖は、多くの疾患、悪性腫瘍（がん）及び良性腫瘍の両方に関係する。１またはそれよりも多いMAPキナーゼホスファターゼをコードする核酸分子を用いる遺伝子療法は、正常なMAPキナーゼホスファターゼ活性の喪失に起因する疾患の回復に用い得る。配列情報を添付図面に示し、実験プロトコル及びMAPキナーゼホスファターゼ活性を示す結果といっしょに下文に記載する。1995年２月９日にはEMBL／GENB ANKのデータベースには、この配列は存在していない。本発明の一面によると、図２に示されたコード配列のいずれか一つの核酸によりコードされたアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチドの配列を含んでなる核酸分子を提供する。核酸分子は図２に示された任意の配列を含むか、または、図２に示された配列の変異体、誘導体または対立遺伝子である配列を含み得る。配列は、図２に示された任意の１またはそれよりも多いヌクレオチドの付加、挿入、欠失または置換である変化によって、それらのいずれとも異なっていてもよい。ヌクレオチド配列への変化は、遺伝子コードにより決定されるように、タンパク質レベルでまたはそうでない、アミノ酸の変化をもたらす。したがって、本発明の核酸は図２に示された配列のいずれとも異なる配列を含んでもよいし、さらに示された配列の任意のものと同じアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードしていてもよい。他方、コードされたポリペプチドは、図２に示されたコード配列によりコードされた任意のものと、１またはそれよりも多いアミノ酸残基によって異なるアミノ酸配列を含んでいてもよい。本発明により、上述のような核酸を含むベクター、特にコードされたポリペプチドを適当な条件下で発現することができる任意の発現ベクター及びそのような任意のベクターまたは核酸を含有する宿主細胞も提供する。この文脈では、発現ベクターは注目のポリペプチドをコードする核酸及び適当な調節配列を含んでなる核酸であって、試験管内発現系、たとえば、網状赤血球溶解物または生体内、たとえばCOSもしくはCHO細胞のような真核細胞またはＥ．コリのような原核細胞内のいずれかにおけるポリペプチドの発現のためのものである。本発明の核酸は、自然環境から取り除かれるという意味で、単離されるか（「単離物」）、または同じ種（たとえば他のポリペプチドをコードしている）から得ることができる他の核酸を含んでいない。もちろん、本願発明の核酸は、全体的にまたは部分的に合成である。本発明はMAPキナーゼホスファターゼ活性を有し、図２に示されるコード配列のいずれか一つを持つ核酸によりコードされるアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドも提供する。図２の配列によりコードされるアミノ酸配列は図３にある。これらのポリペプチドの変異体、突然変異体または誘導体、特に、しかしながら必ずというわけではないが、MAPキナーゼホスファターゼ活性を保持するもの（たとえば、１またはそれよりも多いアミノ酸の挿入、欠失または置換に起因する変異体）も、本発明に包含される。MAPキナーゼホスファターゼ活性を欠く、変異体、突然変異体または誘導体ポリペプチドは、特にそれらがMAPキナーゼと相互作用するか、または結合する能力を保持しているなら、有用であり得る。たとえば、チロシン及び二重の特異的ホスファターゼは、活性部位に位置するシステイン残基を持つ。CL100及びそのネズミ同族体3CH134中のセリンとこのシステインの交替は、触媒活性の全廃をもたらす〔８〕。しかしながら、この触媒的に死んだ型の発現は、MAPキナーゼ（ERK2）のリン酸化に増加をもたらす。突然変異体／誘導体はERK2 MAPキナーゼと特異的複合体を形成する。多分この会合は、内因性のCL100／3CH134によるERK2の脱リン酸化を妨げる。したがって、本発明により、図２に示されたコード配列のいずれか一つを有する核酸によりコードされたアミノ酸配列の（一つまたはそれよりも多いアミノ酸の付加、挿入、欠失または置換を経て）、対立形質、誘導体または突然変異体を含むアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドも提供する。誘導体はポリペプチドから誘導し得る物質である。該誘導体は、ポリペプチドへの１またはそれよりも多いアミノ酸の付加、欠失もしくは挿入または他の分子の結合もしくは融合により誘導される点で、該ポリペプチドと異ることができる。変化、たとえば、付加、欠失、置換または挿入は、ヌクレオチドまたはタンパク質段階で行うことができる。 MAPキナーゼホスファターゼ活性を持つ種々のポリペプチドのためのアミノ酸及び核酸配列情報の提供、すなわち、このようなポリペプチドのファミリーが存在するという最初の証明は、本明細書に与えられた配列にかなりの程度の相同性を有している、他のポリペプチド及びそれらをコードする核酸の入手を可能とする。このような相同性は約70％より多く、好ましくは約80％より多く、さらに好ましくは約85％または約90％より多く、最も好ましくは約95％よりも多い。オルソ体（orthologue）、すなわち、異なる種における同等の配列の間の相同性は非常に高いのに対し、本明細書に説明するように、与えられた種の配列の間の相同性はいくらか変化する。本発明のさらなる面では、図２に示されたコード配列のいずれか一つを持つ核酸によりコードされたアミノ酸の配列に相同であり、MAPキナーゼホスファターゼ活性を有するが、CL100またはそれらのオルソ体ではないアミノ酸配列を有するポリペプチドを提供する。論述してきたように、本発明は多数のMAPキナーゼホスファターゼが存在するという最初の証明を提供する。過去には、CL100 及びそのネズミのオルソ体3CH134のみが哺乳類から得ることができるMAPキナーゼホスファターゼとして知られていた。本発明をする前には、PAC −１〔42〕がＴ−細胞特異的タンパク質と同定されていた。その後、これがMAP キナーゼホスファターゼ活性を有することが発見された。それゆえ、PAC−１、それをコードする核酸なども本発明から除外される。本発明の一態様では、相同ポリペプチドは、図２に示されたヌクレオチド配列によってコードされたアミノ酸配列を含むポリペプチドのオルソ体である。もちろん、本発明は図２に示された配列、たとえば、対立遺伝子、誘導体または突然変異体（１またはそれよりも多いアミノ酸の付加、挿入、欠失または置換がある）によりコードされるものと相同の天然のポリペプチドのポリペプチド変異体にわたる。これらはMAPキナーゼホスファターゼ活性を有しても有さないでもよいが、好ましくは少くともMAPキナーゼと相互作用するか、結合することができる。本発明のポリペプチドを生産する慣用の方法はそれをコードする核酸を発現することである。したがって、本発明はMAPキナーゼホスファターゼ活性を有するポリペプチドを製造する方法であって、該ポリペプチドをコードする核酸を含むベクターからの発現を含んでなる方法であって、図２に示されるコードヌクレオチド配列によりコードされたアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドをコードする核酸を含んでなる核酸も包含する。これは適宜、このようなベクターを含有する宿主細胞の、ポリペプチドを発現させるかまたは許容する条件のもとでの、増殖により達成することができる。ポリペプチドは、試験管内系、たとえば網状化赤血球溶解物中でも発現し得る。対立遺伝子、誘導体、変異体及び突然変異体は同様に発現され得る。多数の異なった宿主細胞中のポリペプチドのクローン化及び発現のための系は良く知られている。適当な宿主細胞は、バクテリア、真核細胞、たとえば哺乳類の細胞及びイースト並びにバキュロウイルス(baculovirus)系を含む。異種性のポリペプチドの発現について当業界で入手可能な哺乳類細胞系は、チャイニーズハムスター卵巣、ヒーラー（HeLa）細胞、赤ちゃんハムスター腎臓細胞、COS細胞、その他多数を含む。一般的な好ましいバクテリア宿主はＥ．コリである。プロモーター配列、ターミネーター断片、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子及び他の適当な配列を含む、適当な調節配列を含有するベクターを選択するか、または組み立てることができる。さらに詳細には、たとえば「分子クローニング：実験マニュアル（Molecular Cloning：a Laboratory Ma nnual）第２版」Sambrook他、Cold Spring Harbor Laboratory Press．（1989年）参照。形質転換の手順は用いられる宿主に依存するが、良く知られている。本発明により提供されるタンパク質は、天然源から精製するか、組み換え的に生産される。天然源から、または組み換え的に生産された、このような精製タンパク質及びそれらの精製法は本発明に包含される。新規なポリペプチドの供給は、それらに結合し得る抗体の生産を最初に可能にする。したがって、本発明のさらなる面は本明細書に開示されたポリペプチドに結合することができる抗体を提供する。このような抗体は１またはそれよりも多いポリペプチドに、それが結合できるポリペプチドと、結合できないかまたはもっと弱く結合する他のMAPキナーゼホスファターゼとの間で区別することができるという意味で、特異的であり得る。本発明の他の抗体は一般にMAPキナーゼホスファターゼに結合することができる。本発明の好ましい抗体は、汚染物、たとえば、他のポリペプチドと結合し得る抗体、を含まず、及び／または血清成分を含まないという意味で単離されている。ポリクローナル抗体は本発明の範囲内であるが、モノクローナル抗体は、いくつかの目的で好まれる。抗体は当分野において普通の技術を用いて得ることができる。抗体を生産する方法は哺乳類（たとえば、マウス、ラット、ウサギ、ウマ、ヤギ、ヒツジまたはサル）をタンパク質またはその断片で免疫することを含む。抗体は免疫された動物から、当分野で既知の種々の技術のいずれかを用いて得ることができ、好ましくは注目の抗原への抗体の結合を用いてスクリーニングし得る。たとえば、ウエスタンブロット技術または免疫沈殿を用い得る(Armitage 他、「Nature」357：P.80〜82(1992))。ペプチドを用いる哺乳類の免疫化の代わりに、あるいは補足として、タンパク質に特異的な抗体が、たとえばそれらの表面に機能的な免疫グロブリン結合ドメインを表わす、ラムダバクテリオファージまたは繊維状ファージを用いて、発現された免疫グロブリンの可変ドメインの組み換え的に生産されたライブラリーから得ることができる；たとえばWO92／01047号参照。ライブラリーはけがされていない、すなわち、タンパク質（または断片）のいずれによっても免疫されていない生物体から得られた配列から組み立てられているか、または、注目の抗原にさらされていない生物体から得られた配列を用いて組み立てられたものであり得る。本発明の抗原は、多くの方法で修飾し得る。実際に、用語「抗体」は、所望の特異性を持つ結合ドメインを有する結合物質のいずれにも及ぶものと解すべきである。したがって、本発明は抗体断片、抗体の誘導体、機能的等価物及び同族体に及び、抗原またはエピトープに結合可能とする抗体の形に似せた形の合成分子及び分子を含む。抗原または他の結合相手と結合可能な抗体断片の例は、VL，VH,C1及びCH１ドメインからなるFab断片；VH及びCH１ドメインからなるFd断片；抗体の一本腕のV L及びVHドメインからなるFv断片；VHドメインからなるdAb断片、単離されたCDR 領域及びＦ（ab′）２断片、ヒンジ領域でジスルフィド架橋により結合される二つのFab断片を含む２価の断片である。一本鎖Fv断片も含まれる。本発明のモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマは、遺伝子的突然変異または他の変化を受けやすいかもしれない。さらに、当業者はモノクローナル抗体を、原抗体の特異性を保持する、他の抗体またはキメラ分子を生産するために組み換えDNA技術の手法を受けさせることができることを理解するだろう。このような手法は、免疫グロブリン可変領域または不変領域に対して抗体の相補性の決定領域（CDRs）または異なった免疫グロブリンの不変領域を加えて枠組み構造領域をコードするDNAを導入することを含む。たとえば、EP184187A号、GB218863 8A号またはEP-A-0239400号参照。キメラ抗体のクローン化及び発現はEP-A-01206 94号及びEP-A-0125023号に記載されている。所望の結合特性を持つ抗体を生産することができるハイブリドーマは、真核または原核の宿主細胞であって、抗体（抗体断片を含む）をコードする核酸を含有し、それらの発現を可能とするので、本発明の範囲内である。本発明は、抗体が生産され好ましくは分泌される条件下で抗体を生産することができる細胞の増殖を含んでなる抗体の生産方法も提供する。本発明の抗体は、ポリペプチドの存在についてのスクリーニングに、たとえば細胞または細胞溶解物を含む供試試料において用い得る。同様な提案は既知の腫瘍抑制遺伝子、網膜芽細胞腫になされた（たとえば、WO94／01467及びAU-A-52461／90）。たとえば、特定の抗体を野性型ポリペプチドと、１またはそれよりも多いエピトープにおけるいくつかの差異を有する対応するポリペプチドとを、アミノ酸配列における変化の結果として区別することが可能かもしれない。特定のエピトープの存在はMAPキナーゼホスファターゼ活性の喪失を示すか、あるいはその逆に増殖性疾患への感受性または傾向の予報となり得る。同様に、ポリペプチドの発現の喪失が増殖性疾患への弱い患者の予後または感受性の予報である場合に、野生型ポリペプチドの存在の決定に抗体を用い得る。抗体はたとえば、ポリペプチドの変異またはポリペプチドの発現の喪失のために、腫瘍の細胞が異常なMAPキナーゼホスファターゼを欠くか、または持つかを決定するのに用い得る。試料への抗体の結合は、その抗体についての適当な標識化システムを用いることにより適宜決定し得る。多数のアプローチ及び標識が当業界、特に免疫アッセイにおいてよく知られている。標識化は直接的であっても間接的であってもよい。検出し得る標識は、いかなる検出し得る物理的または化学的性質を有する物質であってもよく、酵素の基、たとえばアルカリ性ホスファターゼ及びペルオキシダーゼ、蛍光剤、発光剤及び放射性同位元素を含む。ビオチン及びアビジン／ストレプトアビジン系を用い得る。特に適切なものは、コルドン−カルド（Cordon -Cardo）他により記載されたアビジン−ビオチン複合体−免疫ペルオキシダーゼ技術である(Amer．J．Pathl．126：p.269〜284(1987年))。本発明の抗体はさらに変異体、対立形質、誘導体を含む、本明細書に開示された任意のポリペプチドを、標準の方法によって単離または精製するのに用い得る。新しい遺伝子はPCR及び低ストリンジェンシーハイブリダイズアッセイの組み合せを用いて単離された。PCRで用いられたプライマーは、配列 TA(T,C)GA(T,C)CA(A,G)GG(A,G,T)GG(T,C,G,A)CC(A,T)GT(A,G,T)GA及び AT(G,C,T)CC(A,T)GC(T,C)TG(A,G)CA(A,G)TG(T,C,G,A)AC を有しており、アミノ酸配列、YDQGGPVE及びヒト及ひマウスCL100及びヒトPAC− １遺伝子の間に保存されたアミノ酸配列、YDQGGPVE及びVHCQAGIに基づいて設計された〔42〕。（本発明をした当時、PAC−１はMAPキナーゼホスファターゼ活性を持つことは知られていなかった。）本発明のさらなる面は、標的核酸への二つのプライマーのハイブリダイズを含む、ホスファターゼ活性、特にMAPキナーゼホスファターゼ活性を持つタンパク質をコードする核酸を得る方法で用いるための、これらの配列の一つ、すなわち、これらの一つと相補的な配列を持つオリゴヌクレオチドを提供する。ハイブリダイズはPCR手順の一部であるか、PCRを含まないプローブ手順の一部である。例示的な手順は、本発明者により用いられたものに匹敵する、PCR及び低ストリンジェンシーハイブリダイズの組み合せであろう。スクリーニングの手順は、当業者に利用し得る多くのものから選択され、好結果のハイブリダイズ行事を同定するのに用いられ、ハイブリダイズ核酸を単離した。図２に提供された配列は、それら自身、他のホスファターゼタンパク質、たとえば、MAPキナーゼホスファターゼ活性をもつもの、をコードする核酸を同定するのに有用である。したがって、本発明は、ホスファターゼ活性を持つタンパク質、特にMAPキナーゼホスファターゼ活性を持つタンパク質をコードする核酸を得る方法であって、該方法は、標的核酸に対する図２に示される任意の配列または相補配列を有するプローブへのハイブリダイズを含む。通常、ハイブリダイズには、好結果のハイブリダイズの同定及びプローブにハイブリダイズした核酸の単離が続く。該方法は１またはそれよりも多いPCRの段階を含む。図に示された完全な配列の一つを持つプローブを用いることはいつも必要であるとは限らない。短かい断片、特に１またはそれよりも多い配列の間に保存された配列を持つ断片を用い得る。配列中にいくらかの変更がある核酸、たとえばヌクレオチドの１またはそれより多い挿入、欠失または置換は、与えられた配列の一つとの相同性の程度が高いなら、有用であろう。配列を持つ核酸プローブは、（ｉ）TA(T,C)GA(T,C)CA(A,G)GG(A,G,T)GG(T,C,G,A)CC(A,T)GT(A,G,T)GA；（ii）AT(G,C,T)CC(A,T)GC(T,C)TG(A,G)CA(A,G)TG(T,C,G,A)AC；（iii）（ｉ）または（ii）と相補的な配列；（iv）図２に示されたヌクレオチド配列のいずれか一つ；（ｖ）図２に示された配列のいずれか一つに相補的なヌクレオチド配列；（vi）図２に示された配列のいずれか一つの、１またはそれよりも多いヌクレオチドの付加、挿入、欠失もしくは置換による、対立遺伝子、誘導体もしくは変異体を含むヌクレオチド配列またはそれらと相補的なヌクレオチド配列；（vii）（ｖ），（vi）及び（vii）のいずれか一つの断片であるヌクレオチド配列；から選択された配列を持ち、図２に示されたコード配列のいずれか一つを持つ核酸によりコードされたアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸、または図２に示されたコード配列のいずれか一つの、１またはそれよりも多いヌクレオチドの付加、挿入、欠失または置換による、対立遺伝子、誘導体または変異体の存在について細胞をスクリーニングする方法であって、上記核酸プローブを細胞の核酸の試料とのハイブリダイズ及びプローブの試料への結合を定量する方法において等しく用い得る。核酸が二本鎖DNAである場合、一般に変性により一本鎖DNAを生産することを、ハイブリダイズの前に行うだろう。探査(probing)はサザンブロット法を用い得る。たとえば、DNAは注目の細胞から（たとえば、正常の、疑わしいまたは腫瘍組織）から抽出し、異なった制限酵素を用いて消化する。次いで、制限断片を、変性及びニトロセルロースフィルターへの移動の前に、アガロースゲル上で電気泳動により分離する。標識化プローブをフィルター上のDNA断片にハイブリダイズし、結合を決定し得る。標的核酸(たとえばDNA)へのプローブの結合は、当業者が自由に多数の方法の任意のものを用いて測定し得る。たとえば、プローブは放射性で、蛍光でまたは酵素で標識化し得る。他のプローブの標識化を用いない方法は、制限断片長さ多型性の試験、PCRを用いる増幅、RNAアーゼ切断及び対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド探査を含む。個体の細胞からの標的DNAへのプローブの結合の異常性は、異常なMAPキナーゼホスファターゼ機能から生ずる細胞増殖疾患に感染しやすいことを示すかもしれない。したかって、個体を、MAPキナーゼホスファターゼ遺伝子の１またはそれより多いコピーの存在についてスクリーニングし、制御できない細胞増殖を含む病気に進展する可能性を評価する助けとし得る。スクリーニングは出産前でもよい。同様に、腫瘍の細胞からの核酸へのプローブの結合が、正常な細胞からの核酸へのプローブの結合と適合しないなら、腫瘍はMAPキナーゼホスファターゼ機能の喪失に起因すると同定し得る。これは、たとえば腫瘍細胞におけるMAPキナーゼホスファターゼ活性の操作を含む、適当な療法の同定を容易にし得る（下記参照）。オリゴヌクレオチドを、プライマーとして、MAPキナーゼホスファターゼとして作用しそうな関連する遺伝子を増幅するために、ヒトまたは動物または植物または微生物起源の任意の組織から単離されたmRNAから誘導されたcDNAを用いる PCRで用い得る。さらに、ゲノムDNAもたとえばヒト、ネズミ等のゲノム中のすべてのMAPキナーゼに関連する遺伝子を入手する方法を提供するために増幅し得る。すでに単離されたクローン及び断片は低ストリンジェンシーハイブリダイズによって、遺伝子ファミリーのメンバーをさらに単離するのに用い得る。低ストリンジェンシー条件で、種々のプローブを制限酵素を用いて消化したヒトDNAのサザンブロットとハイブリダイズすることにより予備試験を実施し得る。適当な条件は、バックグラウンドハイブリダイズが低く、大多数のハイブリダイズ断片が得られたときに達成されるだろう。これらの条件を用いて、種々のヒトまたは動物または植物の組織における発現された配列を代表するcDNAライブラリーは、ヒトまたは動物または植物または微生物起源のゲノムDNAから作られた。この方法によるゲノムライブラリーのスクリーニングは上記の種からのすべてのこのような相同遺伝子の単離をもたらす。核酸分子をコードする完全な長さのホスファターゼが得られていないところでは、完全な分子の小さい分子を表わす部分、たとえば図２に示されたもの、は完全な長さのクローンを得るのに用い得る。挿入物を部分的なcDNAクローンから調製し、種々のヒト組織の任意のものから作られたcDNAライブラリーをスクリーニングするのに用いる。単離された完全な長さのクローンを哺乳類の発現ベクター中にサブクローン化し、COS細胞または他の宿主細胞中に、MAPキナーゼもしくは他の基質をコードするレポータープラスミド、またはそれらの適当な断片との共トランスフェクションによりMAPキナーゼホスファターゼ活性を評価し得る。MAPキナーゼは、それがリン酸化されているか否かに依存して異なった電気泳動移動性を有する。活性MAPキナーゼホスファターゼの存在下でのリン酸化型と脱リン酸化型とのシフトはたとえばウエスタンブロットを用いて検出し得る。たとえば、レポータープラスミドのMAPキナーゼは、たとえば、myc−エピトープ〔32〕（抗−標識抗体を用いて検出を可能とする）を用いて標識をつけることができる。適当なアンチ−myc抗体は9E10〔43〕である。検出／可視化のためにタンパク質を標識化する多くの方法は当業者に既知であるから、詳細をここに示す必要はない。実際に、アンチ−MAPキナーゼ抗体はタンパク質に加えるべき何等の標識も必要とせずに用い得る。標識化されたMAPキナーゼと共に共−トランスフェクトされたCOS細胞をEGFで刺激でき、EGFは、ホスファターゼ活性の不在で、標識手段により検出できるMAPキナーゼにおける移動度シフトをもたらす。細胞内でのMAPキナーゼホスファターゼ活性の存在は、移動度シフトを全廃し、したがって、MAPキナーゼホスファターゼ活性のための便利なアッセイを提供し、コード核酸の同定を可能にする。クローン化された核酸によってコードされたタンパク質のMAPキナーゼホスファターゼ活性のための他のアッセイも用い得る。これらは、適当な標識または他の標識（たとえばヒスチジン標識またはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ融合タンパク質として）を持ったバクテリア宿主、たとえば、Ｅ．コリ中の発現を包含し、組み換えタンパク質の精製及びその後の組み換えリン酸化MAPキナーゼとのインキュベーションがそれに続く。脱リン酸化をシンチレーション計数により評価できる。もちろん、MAPキナーゼとの混合のために、MAPキナーゼリン酸塩の組み換え体の生産及び精製は、当分野で既知のいかなる方法でもなし得る。 MAPキナーゼを含有する試験管内翻訳系における網状赤血球溶解物を、移動度シフトによりMAPキナーゼのリン酸化を評価するのに、再度、用い得る。ホスファターゼクローンになりそうなものを試験管内の網状赤血球溶解物中で翻訳し、移動度シフトの全廃を評価し得る。移動度シフトは、上記アッセイ系のいずれにおいても、MAPキナーゼホスファターゼのためのエフェクター分子（活性化剤または阻害剤）のスクリーニングに用い得る。たとえば、研究のために選ばれるMAPキナーゼホスファターゼの阻害剤は、ホスファターゼの脱リン酸化活性を廃止または減じ、だから、適当なところではMAPキナーゼまたは他の基質の移動度シフトを復活させるだろう。前記スクリーニングは本発明の一面として提供される。生化学のアッセイはエフェクター分子のスクリーニングに用い得る。いかなるアッセイにおいても、MAPキナーゼの適当な断片（または注目のホスファターゼの任意の他の基質）、たとえばホスファターゼの作用部位、を含む断片は有用であり得る。イーストの２−ハイブリッド系〔43，44〕をホスファターゼ分子と相互作用する分子を同定するのに用い得る。この系はβ−ガラクトシダーゼ遺伝子及びイーストのアミノ酸ヒスチジンの不存在下の増殖もしくは毒性化合物３−アミノトリアゾールの存在下の増殖を可能にする遺伝子（His3）に結合するGAL4反応性プロモーターを含有するイーストを利用する。該ホスファターゼをイーストベクター中にクローン化し、GAL4のDNA結合ドメインとの融合としてこれらのタンパク質を発現するであろう。これらのイーストは、次いで種々のヒト組織から組み立てられたcDNAライブラリーを用いて、GALA活性化剤融合として、タンパク質を発現するように設計されたベクター中に、形質転換され得る。指示薬皿上で青色を有し（β−ガラクトシダーゼの活性化による）、ヒスチジンの不存在下（そしてアミノトリアゾールの存在下）で増殖するイーストを選択し、プラスミドのライブラリーを単離し得る。プラスミドのライブラリーはホスファターゼと相互作用できるタンパク質をコードし得る。そのようなタンパク質は、ホスファターゼと相互作用し、活性を調節する分子であり得る。MAPキナーゼ以外の基質が単離されることもありそうである。これらはシグナルの導入に含まれる、非 −古典的（すなわち、非−erk−型）MAPキナーゼまたは新規な分子であり得る。 MAPキナーゼホスファターゼ及びコード核酸配列の供給は、新規なイースト系を用いて、たとえばシゾサッカロミセスポンベ(Schizosaccharomyces pombe )中で、エフェクター分子のスクリーニングを可能する。ホスファターゼは、MAPキナーゼ系の成分を特異的に阻害できる分子の同定のために発明されたスクリーニング系に導入することができる（46及びWO94／2303 9)。この系においては、Byr1またはByr2遺伝子中でのイースト変異体の繁殖不能性を補足するように、哺乳類のｃ−raf及びMAPキナーゼを、イーストＳ．ポンベに導入した。これらのイースト遺伝子は交配経路に含まれる。哺乳類の遺伝子は経路の成分と置換することができ、次いで標的とされ得る。このスクリーニングは、哺乳類の酵素（ｃ−raf及びMAPキナーゼ）が、哺乳類のMAPキナーゼの活性化を経て、β−ガラクトシダーゼ酵素の生産をもたらし、これらのイーストが適当な指示薬媒体上で青となるように適合させる。この系は、それらの青色を喪失したイーストを数えることによって、哺乳類のシグナル導入分子を特異的に阻害することができる物質を評価するのに用い得る。いかなる非−特異的キナーゼまたは他の阻害剤も単純に青色を喪失するというよりは、むしろイーストの増殖を阻害するので、このスクリーニングの特異性は保証される。他のマーカー、たとえば、Ｓ．ポンベ株の配能力を用い得る。本明細書において提供されるもの及び既知のCL100を含むいかなるMAPキナーゼホスファターゼもこのスクリーニング系に導入しる。たとえばβ−ガラクトシダーゼ活性を部分的に減少させ、適当な指示薬皿上のイーストの青色の減少をもたらすように、イースト中に存在する哺乳類のMAPキナーゼ活性を部分的に減じるために適当な発現ベクターを使用することによってホスファターゼの構成的な発現を操作することができる。したがって、この系を選択されたホスファターゼを阻害する（より強い青色をもたらす）か、活性化する（青色の希薄化）ことができる化合物をスクリーニングするのに用い得る。このような化合物は治療薬、たとえば、抗増殖性または抗炎症性薬物として有用であり得る。新しい薬物の同定をもたらす薬学の研究は先導する化合物が発見される前及び後ですら、一般に非常に多数の候補物質のスクリーニングを含むことが良く知られている。これが、薬学の研究を非常に高価に、そして時間のかかるものとする１つの因子であり、したがって、スクリーニングの過程を援助する方法は少なからぬ商業的な重要性を持ち得る。もちろん、用いられるマーカーはMAPキナーゼ活性の存在または不存在及びしたがって、MAPキナーゼホスファターゼ活性のそれぞれの不存在または存在を示す単純な「陽性／陰性」であり得る。供試分子(MAPキナーゼ活性を可能とする)によるMAPキナーゼホスファターゼの阻害は、したがって、ホスファターゼの阻害剤として該分子を同定して、陽性の結果、たとえば青色、交配能力及びその他、として証明されるだろう。たぶんMAPキナーゼホスファターゼが細胞の増殖のスイッチを切る作用をするだろう。このように、たとえば欠失または変異によるそれらの酵素活性の喪失は制御されていない細胞の増殖またはがんをもたらすかもしれない。ヒトゲノムのヘテロ接合性の喪失を示すと言われたいくつかの領域が、換言すれば、多様なヒト腫瘍において欠失されている。本明細書に提供された任意のホスファターゼの遺伝子が、ヒトゲノムの任意のこれらの領域の近くに位置するかどうかを決定し得る。ヒトゲノム内での遺伝子の位置を定める方法は、良く知られており、ヒト染色体の細胞ハイブリッド分離における遺伝子の存在の特異的PCRプライマー及び蛍光インサイトーハイブリダイズ(FISH)を用いる分析を含む。特定の腫瘍における欠失されている任意の遺伝子はこのような腫瘍の分類及びその診断のための試薬として有用であり得る。 STY8様配列は、蛍光インサイト− ハイブリダイズ（FISH）を用いて、ヒト染色体１ｑ及び８ｐについて検出された。腫瘍物質のより詳細な位置決め及び分析は腫瘍抑制機能を確認するのに用い得る。上述のように、診断の方法は、本明細書に提供された配列を持つ任意の核酸分子またはそれらの任意の断片変異体、対立遺伝子もしくは誘導体の使用を含み、本発明に包含される。都合のいいことには、これは、これらの遺伝子の多型領域を認識する特異的なPCRプライマーの使用または腫瘍から単離されたDNAのサザンブロット上でのこれらの遺伝子から誘導されたプローブの使用を含む。本発明は、MAPキナーゼホスファターゼポリペプチド、それへの抗体またはそのためのコード核酸を用いる治療法も提供する。原則としては、MAPキナーゼホスファターゼ活性を持つポリペプチドをコードする核酸を用いる遺伝子治療は、野生型のMAPキナーゼホスファターゼ活性の喪失から生ずる任意の疾患の治療に用い得る。このような疾患は一般に細胞増殖性であろう、そして、通常には適用されない、「オフ−スイッチ」により「スイッチが入る」MAPキナーゼ、すなわち、MAPキナーゼホスファターゼによるMA Pキナーゼの脱リン酸化を用いる、通常は増殖を調節する細胞経路の結果としての不適当な細胞増殖を含む。細胞増殖の疾患は良性または悪性であり得る。網膜芽細胞腫は、正常に発現された遺伝子の機能の喪失に起因する細胞増殖疾患の「古典的な」例である。Rb−１遺伝子にホモ接合型である個体（すなわち、遺伝子の唯一の野生型のコピーを有する）は、遺伝子の作業しないコピーを残す変異の増大した可能性のために病気にかかりやすい。Rb−１遺伝子を含む核酸構成物を用いる網膜芽細胞腫のため遺伝子療法が提案された(たとえばWO91／15580 及びWO94／06910)。Rb−１遺伝子を喪失した腫瘍細胞へのRb−１遺伝子の導入は、腫瘍の増殖の抑制をもたらす。意義深いことには腫瘍形成性フェノタイプはRb −１遺伝子により抑制されたが、正常な細胞には影響がなかった。ｐ53は「腫瘍抑制機能」を有し、遺伝子療法のための適当な標的である他の遺伝子である。本発明によると、遺伝子療法は、全体的または部分的なMAPキナーゼホスファターゼの活性の喪失を含む、疾患、特に細胞増殖の疾患の治療に用い得る。本発明による人体または動物体に実施される治療法は、本明細書に開示するようにMAPキナーゼホスファターゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸の投与を含み得る。好ましくは、核酸は個体の細胞内での発現を可能とする遺伝子構成物の部分を形成する。都合よく、レトロウイルスベクター、好ましくは非−増殖細胞を形質転換しないものを用いるか、リポソーム技術を用いて、核酸を細胞中に導入し得る。治療は現存する病気のものであっても、予防であってもよい。予防治療は、たとえば野生型のMAPキナーゼホスファターゼ遺伝子の二つのコピーを欠くか、異常な活性を持つMAPキナーゼホスファターゼをコードする変異された遺伝子を持つという理由で、疾患にかかる危険な状態と同定された固体のために適当であり得る。投与は好ましくは「治療上有効な量」であり、これは患者に役立つのに十分な量である。投与される実際の量及び投与の速度と時間経過は、治療されるものの性質と病状のひどさに依存するだろう。治療の処方箋、たとえば投与量の限定などは、一般開業医及び他の内科医の責任範囲である。投与が単独であるか、他の治療と組み合わせるか、同時であるか、連続的であるかは、治療される状態に依存し得る。本発明による投与のための医薬組成物は、医薬として許容し得る補形剤、担体、緩衝剤、安定化剤または他の当業界で良く知られた物質を含み得る。このような物質は非−毒性であって、活性成分の効能を妨げてはならない。担体または他の物質の正確な性質は、投与の経路に依存するであろう。その投与は原則としては、経口、鼻腔内、局所または皮膚、皮下、静脈もしくは筋肉注射によってもよい。経口投与用の医薬組成物は、錠剤、カプセル、粉末または液型であり得る。錠剤は、固体担体、たとえばゼラチンまたは補助剤を含んでよい。液体医薬組成物は一般に液体担体、たとえば、水、石油、動物もしくは植物油、鉱油もしくは合成油を含む。生理的塩類液またはグリコール、たとえばエチレングリコール、プロピレングリコールもしくはポリエチレングリコールを包含し得る。静脈、皮膚または皮下注射のために、活性成分は発熱物質がなく、適当なpH、等張性及び安定性を有する非経口的に許容し得る水溶液の形であろう。当業者は、たとえば等張性媒体、たとえば塩化ナトリウム注射剤、リンガー注射剤、乳酸加リンガー注射剤を用いて適当な溶液を上手に調製するであろう。保存剤、安定化剤、緩衝液、抗酸化剤及び／または他の添加剤を必要により包含し得る。注射は、核酸を病気の部位、たとえば腫瘍に供給するのに用い得る。体内に、たとえば内蔵、体腔などに注射針を所望の部位へ導くのに適当な影像装置を用い得る。いくつかの増殖性の病気、たとえば骨髄のもの、白血病などにおいては、ある場合には正常な細胞及び腫瘍細胞を包含する細胞を体から除去し、それらを治療し、それからそれらを体に戻すことも望ましいかもしれない。トランスフェクション、エレクトロポレーション、ミクロインジェクション、リポソーム、リポフェクチンまたは裸のDNAもしくはRNA、または他の任意の技術を用いて、核酸を局所的に細胞に導入し得る。レトロウイルスベクター(Wilson 他「PNAS USA」85：ｐ.3014，Gilboa「J.Virology」44：ｐ.845（1982年）及びH oche「Nature」320：ｐ.275(1986年))及びワクシニアウイルス(chakrabarty他「 Mol.Cell Biol.」５：ｐ.3403(1985年))は当業者に利用し得る、中でも優れた選択である。増殖している細胞は複製に必要とされる遺伝子を欠く欠損のあるレトロウイルスを用いて特に標的とされるかもしれない。というのは、このようなレトロウイルスは、それらのゲノムの完成のために細胞DNAの複製及びその内にコードされたポリペプチドの発現を当てにしなければならないからである。このような「複製不全」レトロウイルスベクターはチェン（Chen）他(「Science」250：ｐ. 1576〜80(1990年))及びミラー（Miller）他(「Bio Technique」７：ｐ.980〜990 (1989年))に記載されているものを包含する。本発明の他の面によると、特に細胞増殖性疾患の治療または予防に用いるための、開示されたように、MAPキナーゼホスファターゼ活性を持つポリペプチドをコードする核酸を含んでなる、開示された医薬組成物及び開示された治療で用いるための組成物または薬剤の製造において、MAPキナーゼホスファターゼ活性を持つポリペプチドをコードする核酸の使用を提供する。哺乳類細胞への核酸の導入技術は、トランスジェニック動物、たとえば、マウス、ラット、ハムスターなどのような齧歯動物であって、一つもしくはそれよりも多い、欠損をコードする遺伝子または少なくとも変更されたMAPキナーゼホスファターゼを担うものを創造するのにも用い得る。たとえば相同的組み換えを含む技術を用い得る。該動物はMAPキナーゼホスファターゼ活性を持つポリペプチドをコードする生殖系列または体細胞の変異した遺伝子を持ち得る。このようなトランスジェニック動物はMAPキナーゼホスファターゼを包含する病気の進行の研究に、またはたとえば野生型の遺伝子を導入し得る遺伝子治療を包含する、治療作用もしくは療法のテストのための物質のスクリーニングまたは評価に用い得る。本発明の面を添付図面に関連して説明するが、これは例示であって限定ではない。さらなる面及び態様は当業者に明らかであろう。この本文中で言及したすべての文献は引用により本明細書に組み入れられる。図には；図１は哺乳類のMAPキナーゼシグナル導入経路の機構の図表である（引用文献２から）。リガンドは細胞の表面で受容体チロシンキナーゼと相互作用する。受容体はチロシン残基上でリン酸化し、GRB2との会合を可能とし、rasは因子SOS を交換する。SOSはrasをGTP結合型に活性化し、次いで該結合型はMAPキナーゼキナーゼキナーゼrafと相互作用し得る。今だ分かっていない過程で、これは、rafがMAPキナーゼキナーゼをリン酸化できるようにrafを活性化し、MAPキナーゼキナーゼは、順番に、トレオニン及びチロシン残基上のMAPキナーゼをリン酸化する。このMAPキナーゼの活性型は、次いで細胞増殖を刺激できる。図２は新規なリン酸塩分子のDNA配列を示す。STY2〜STY4は、本文に記載したようにＡ431細胞から生産したRNAから増幅したPCR生産物である。STY5及びSTY6 は、パート（ａ）及び（ｂ）に示されたSTY2及びSTY3プローブの混合物を用いて、ハムスターの肝臓細胞cDNAライブラリーをスクリーニングすることによって単離された。STY7〜STY10は、パート（ａ）及び（ｂ）中に示されたSTY2及びSTY3 プローブの混合物を用いてヒト脳cDNAライブラリーをスクリーニングすることにより単離されたcDNAクローンの部分である。STY7及びSTY10を除く、すべての配列は、CL100と相同性を示す。これらのクローンの場合に、該示された配列はCL1 00との相同性を示さないが、該cDNAクローンは、STY2／３プローブと強くハイブリダイズすることは、これらのクローンが新規なホスファターゼ遺伝子もコードすることを示唆する。（ａ）−STY2；（ｂ）−STY3；（ｃ）−STY4；（ｄ）−ST Y5；（ｅ）−STY6；（ｆ）−STY7；（ｇ）−STY8；（ｈ）−STY9；（ｉ）−STY1 0。図３は、CL100のアミノ酸配列といっしょに並べたホスファターゼクローンの推測されたアミノ酸配列を示す；（ａ）−STY2，STY3 ，STY4及びSTY5；（ｂ）STY6；（ｃ）STY9；（ｄ）STY8。パート（ａ）〜（ｃ）の空欄はCL100と同一の残基を示し、点はまだ決定されていない残基を示す。 STY8についての完全な長さのクローンとCL100との比較であるパート（ｄ）について、ダッシュ（−）は、それらの整列を最高に活用するために配列に導入した空白を示す。陰をつけた残基はSTY8とCL100の間で同一である残基に相当する。示されたアミノ酸配列は、残基177〜255がパート（ａ）に、231〜302がパート（ｂ）に、223〜267がパート（ｃ）に、１〜36７がパート（ｄ）に一致する。図４は、STY8がMAPキナーゼホスファターゼ活性をコードする証拠を示す。細胞をEGFで刺激する前または後に、種々の組み換えプラスミドでトランスフェクトされたCOS細胞から、タンパク質抽出物を調製した。これらの抽出物をSDS／ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動し、次いでタンパク質をニトロセルロース膜に移動した。この膜を、次いでアンチ−myc抗体9E10とインキュベートし、ECL 手順で処理し、生じた化学発光をＸ−線フィルム上で検出した。刺激リガンド(E GF)の不存在では、アンチ−myc抗体9E10はウェスタンブロット上に単にMAPキナーゼの単一のバンドのみを現わす（レーン１）。EGFの存在下では（レーン２）、MAPキナーゼの部分リン酸化を示す、明確な二本のバンドが存在する。これは親発現ベクターの発現により影響されない（レーン３及び４）。しかしながら、 EGFの存在下のCL100またはSTY8の発現は（レーン７〜10）、これらの分子の両方共がMAPキナーゼホスファターゼをコードすることを示す、EGF誘発シフトの全廃をもたらす。細胞をMycでしるしをつけたSTY8でトランスフェクトした、レーン５及び６はSTY8タンパク質が本当に発現されていることを示す。レーン１−MA PK ；レーン２−MAPK＋EGF；レーン３−MAPK＋pMT；レーン４−MAPK＋pMT＋EGF；レーン５−Myc−STY8；レーン６−Myc−STY8＋EGF；レーン７−MAPK＋CL100；レーン８−MAPK＋CL100＋EGF；レーン９−MAPK＋STY8；レーン10−MAPK＋STY8＋EGF 。図５は、SDS−ポリアクリルアミドゲル上で（ａ）MAPキナーゼ及びERK2または（ｂ）MAPキナーゼ、ERK2及びSTY8を含有する試料を³²P-ATPの存在下でしばらくインキュベートした、レーンの頂部にわたって分で示した、オートラジオグラフィーの結果を示す。リン酸化ERK2及びSTYの位置が示されている。左手のレーンは分子量マーカーを示す。遺伝子をコードするMAPキナーゼホスファターゼの単離関連するタンパク質アミノ酸配列を同定するために、ヒトCL100及びそのネズミ同族体3CH134及びヒトPAC−１遺伝子〔42〕を、未知の機能の関連するＴ細胞特異的遺伝子について比較した。それはタンパク質の保持された領域に基づく縮重したPCRプライマーを設計することが可能であることを証明した。これらのプライマーは、ヒト扁平細胞系Ａ431から単離されたポリ（Ａ）⁺RNAから作られたc DNAから、関連する配列を増幅するのに用いられた。270bpの断片を精製し、サブクローン化した。50の個体のクローン配列のうち、６はCL100に同一であることを証明した。さらに、12のクローンがCL100と区別ができるが、相同性であることが分かった：すなわちSTY2は６回、STY3は４回、STY4及びSTY5は１回単離されている。さらに関連する遺伝子を同定するために、我々はヒト脳及び肝臓cDNAライブラリーをSTY2及び３PCR生成物の混合プローブを用いてスクリーニングした。いくつかのハイブリダイズクローンを、制限エンドヌクレアーゼマッピング及び部分DNA配列決定により、さらに詳細に分析した。これはいくつかの追加の遺伝子ファミリーSTY6 〜10とSTY１がCL100であるという同定をもたらした。全体で９の新しい遺伝子が同定され、これらをCL100のアミノ酸配列と比較する（図３参照）。これらの遺伝子の高程度の類似はそれらがMAPキナーゼホスファターゼ活性を持つタンパク質をコードすることを示唆する。細胞培養及びRNAの調製Ａ431細胞を10％のウシ胎児血清を補足したダルベツコの修正イーグル最少必須培地（DMEM）中で増殖させた。全細胞RNAを、RNAzolB(Promega)及びダイナビーズ(Dynabeads)オリゴ(oligo)(dT)25により単離されたポリ（Ａ）＋RNAを用いて調整した。 CL100-関連cDNAの単離二つの縮重オリゴヌクレオチド TA(T,C)GA(T,C)CA(A,G)GG(A,G,T)GG(T,C,G,A)CC(A,T)GT(A,G,T)GA及びAT(G,C, T)CC(A,T)GC(T,C)TG(A,G)CA(A,G)TG(T,C,G,A)AC を、アミノ酸配列、すなわちヒト及びマウスCL100並びにヒトPAC−１遺伝子の間に保持されたYDQGGPVE及びVHCQAGIに基づいて設計した。Ａ431ポリ（Ａ）−RNA （１μｇ）をスーパースクリプト（Super Script）逆転写酵素(BRL−GIBCO)を用いて逆転写し、Techne PHC−１熱サイクラー上でこれらのオリゴヌクレオチド〔 47〕を用いて次の条件下でPCRを受けさせた：94℃で30秒、50℃で30秒、72℃で１分。270bpをアガロースゲル電気泳動により精製し、ｐブルースクリプト（Blu escript）中にサブクローン化した。 50個体のサブクローンを配列決定し、これらの内６がCL100であることを証明した。他の12はCL100に相同性であるが同一でないことが分かり、これらをSTY1 であるCL100とは異なった４の可能性のあるホスファターゼ、すなわちSTY2〜STY 5と呼ばれるものと分類した。図２ａに示されたSTY2及びSTY3配列を含有するプラスミドの挿入物から作られた32Ｐ−標識プローブを用いてcDNAライブラリーをスクリーニングすることにより、STY6〜STY10を単離した。STY6をヒト脳ライブラリーから単離した。 STY cDNAの構造的分析ヒト脳から単離されたcDNAクローンの一つは完全な長さである。CL100といっしょに直線状に並んだSTY遺伝子は、高度に保持された触媒的ドメインの周囲のアミノ酸は異なり、二つのCL100及びcdc25の間に保持された領域もSTY8に存在することを示す。3CH134のゲノム構造の研究は、転写ユニットが2.8kbpの長さであって四つのエキソンに分裂していることを明らかにした〔46〕。STY遺伝子のゲノム構造を明瞭にし、それらのプロモーター領域が転写因子についてコンセンサス配列を含有するかどうかを決定することも興味深いことであろう。予備研究は STY8が3CH134と同様な遺伝子構造を持つことを示唆している。機能的アッセイヒトCL100及びそのネズミの相対物3CH134は、その転写が数分以内に急速に、過渡的に引き起こされ増殖因子刺激から１時間以内に現われるタンパク質の蓄積を有する迅速な遺伝子として機能する〔７，48〕。いくつかの迅速な遺伝子の発現を観察すると、増殖因子受容体チロシンキナーゼ活性の急速な増加及びそれに続くシグナル分子の活性化は異常な増殖を避けるために通常のレベルに戻す必要がある。これを達成する一つの方法は、その発現が外部の刺激により引き起こされるタンパク質ホスファターゼを、それらが特定の状況下でのみ細胞内に存在するように関係させる。 CL100及び3CH134が試験管内で〔４，５〕または生体で〔７〕発現される時、遺伝子生成物は血清、オンコジーンRaSまたは活性化されたRafを妨げるｐ42^mapk の選択的脱リン酸化をもたらすのに対し、ホスファターゼの触媒的に不活性な変異体はMAPキナーゼのリン酸化を増大させることを証拠は示している。我々は、COS細胞一過性の発現系を用いて生体内でホスファターゼSTY8が同様な特異性を示すかどうかを試験した。我々はCOS細胞を受容体プラスミドpEXV3-M yc-p42^mapkといっしょにpMT-Myc-STY8を包含する種々のプラスミドと共トランスフェクトした。図４はこのような実験の典型的なものである。刺激リガンド(EGF)の不存在では、アンチ−myc抗体9E10はウエスタンブロット上にMAPキナーゼの一本のバンドのみを現す（レーン１）ことが分かる。EGFの存在下では（レーン２）、MAPキナーゼの部分的リン酸化を示す、明瞭な二本のバンドが存在する。これは親発現ベクターの発現により影響されない（レーン３および４）。しかしながら、EGFの存在下（レーン７〜10）のCL100またはSTY8の発現はこれらの分子の両方がMAPキナーゼホスファターゼをコードすることを示す、EGF誘導シフトの全廃をもたらす。細胞がMycでしるしを付けたSTY8を用いてトランスフェクトされているレーン５及び６はSTY8タンパク質が本当に発現されていることを示す。我々は組み換えSTY8は二つのタンパク質が試験管内でインキュベートされた時、MAPキナーゼ（erk2）を脱リン酸化できることを証明した。組み換え活性化MAP キナーゼキナーゼ(MEK／EE)(50ng)を組み換えERK2（３μｇ）または組み換えE RK2（３μｇ）及び組み換えSTY8（0.75μｇ）と、50mMのトリス−Cl(pH7.5)／0. 1mM EGTA／10mM酢酸マグネシウム／0.125mM ATP中で³²Ｐ−ATP(2.5nCi)の存在下で、図５に示された時間（分）の間インキュベートした。次いで、試料を10％SD S／ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動し、ゲルを乾燥させ、オートラジオグラフした。リン酸化ERK2及び（驚くべきことに）STY8の位置を図に示す。STY8はこの実験により驚くべきことに、それ自身、MAPキナーゼerk2の基質であることが分かった。これは図５でerk2とのインキュベーションの間のリン酸化されたSTY8の様子により分かる。このリン酸化の意義は現在は不明であるがリン酸化のためのいくつかの可能性のある部位はSTY8の配列中に位置する。STY8のerk2によるリン酸化が、その活性を増大または減少させるかで、活性を調節するのに役立つこともあり得る。他の可能性はリン酸化が縮重についてタンパク質を標的にすることである。さらなる可能性はST Y8中の可能性のあるMAPキナーゼリン酸化部位の存在が、erk2及びSTY8の相互作用を容易にするのに役立ち、その結果がSTY8のリン酸化及びerk2の脱リン酸化であることである。 STY8もバキュロウイルス転移ベクター中にクローン化され、組み換え後、グルタチオン−Ｓ−転移酵素(GST)−STY8融合タンパク質の生産をもたらした。このベクターを線状ウイルスゲノムDNAといっしょに昆虫の細胞中に共トランスフェクトした。組み換えは、発現ベクターを導入されたバキュロウイルスDNAを含有するウイルス粒子の生産をもたらす。このウイルスはさらに昆虫の細胞を感染させるのに用いられ、組み換えGST−STY8タンパク質をグルタチオンアガロース上にアフイニテイクロマトグラフィーにより精製した。 STY2は完全にクローン化され、配列決定され、そしてMAPキナーゼホスファターゼ活性、すなわち、MAPキナーゼ（ERK2）を脱リン酸化する能力を持つことが分かった〔52〕。該配列はCL100及びSTY8のすみからすみまで、特に触媒的ドメインにおいて関連している。 MAPキナーゼホスファターゼをコードする核酸の供給は次のことを実施することを可能にする。 STY cDNAの発現型 3CH134がマウス成体の肺中に主として発現されることを、実験は証明した〔４〕．我々はノザンブロット分析によりSTY8／9及びCL100は組織の範囲中の至る所に発現されることを示した。興味深いことに3CH134の発現は分裂終了細胞に相当し〔48〕、それはホスファターゼが細胞増殖の負のエフェクターとして作用し、細胞の分化に役割を演じ得ることを示唆する。我々は、また、Mycでしるしを付けたSTY8がトランスフェクトされた核中に位置することをミクロインジェクションによって明らかにした。これは、MAPキナーゼの活性は二段階であるという証拠を考慮して、MARKホスファターゼは、核のトランスロケーション及びDNA合成の開始と相互に関係のある第２の持続されたピークとともに作用すると期待されるところである〔49〕。 MAPキナーゼ経路は細胞増殖及び腫瘍化を促進し、したがって、MAPキナーゼホスファターゼは腫瘍抑制遺伝子として機能し得る。我々は、単一のヒト染色体を持つハムスターの細胞の染色体のハイブリッドパネルを用いて、STY遺伝子の染色体の位置を決定しようとしている。これらは、各STY遺伝子に対して特有のプライマーを用いてスクリーニングされ、インサイト− ハイブリダイズを用いて正確な位置を決定されるだろう。（STY8様配列が蛍光剤を用いる、ヒト染色体１ｑ及び８ｐ上のインサイト− ハイブリダイズで検出された。）これらの遺伝子座は次いで、BICR細胞系中で、既知のヘテロ接合性の領域または既知の腫瘍抑制遺伝子座に相当する領域と比較し得る。

【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９６年４月４日【補正内容】請求の範囲１．MAPキナーゼホスファターゼ活性を有するポリペプチドであって、図２に示されたコード配列のいずれか一つを持つ核酸によってコードされたアミノ酸の配列を含んでなるポリペプチド。２．MAPキナーゼホスファターゼ活性を有するポリペプチドであって、図２に示されたコード配列のいずれか一つを持つ核酸によってコードされたアミノ酸配列に少くとも80％の相同性を示し、前記ポリペプチドはアミノ酸配列を含んでなり、前記アミノ酸配列は図２に示された前記コード配列の核酸によってコードされたアミノ酸の、一つまたはそれよりも多いアミノ酸の付加、挿入、欠失もしくは置換による、対立形質、誘導体または変異体を含むが、CL100，PAC−１またはそれらのオルソ体ではないポリペプチド。３．アミノ酸配列を有するポリペプチドであって、該アミノ酸配列は、図２に示されたコード配列のいずれか一つを持つ核酸によりコードされたアミノ酸配列に少くとも80％の相同性を示し、該ポリペプチドはMAPキナーゼホスファターゼ活性を有するがCL100，PAC−１またはそれらのオルソ体ではない、ポリペプチド。４．前記アミノ酸の配列を含んでなるポリペプチドのオルソ体である請求項３に記載のポリペプチド。５．MAPキナーゼホスファターゼ活性を有するポリペプチドであって、アミノ酸配列を含んでなり、該アミノ酸配列は請求項３または請求項４に記載のポリペプチドの一つまたはそれよりも多いアミノ酸の付加、挿入、欠失もしくは置換による、対立形質、誘導体または変異体を含み、図２に示されたコード配列のいずれか一つによってコードされたポリペプチドに少くとも80％の相同性を示すが、CL100，PAC−１またはそれらのオルソ体ではないポリペプチド。６．MAPキナーゼホスファターゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチドの配列を含んでなる核酸分子であって、該ポリペプチドは図２に示されたコード配列のいずれか一つを持つ核酸によってコードされたアミノ酸の配列を含むものである、核酸分子。７．ヌクレオチドの配列が図２によって示されたコード配列のいずれか一つである、請求項６に記載の核酸分子。８．請求項６に記載の核酸分子であって、そのヌクレオチドの配列が、図２に示されたコードヌクレオチド配列のいずれか一つの、一つまたはそれよりも多いヌクレオチドの付加、挿入、欠失もしくは置換による、対立遺伝子、誘導体または変異体を含むものであり、該核酸分子は、前記核酸配列によってコードされたポリペプチドに少くとも80％の相同性を示すが、CL100，PAC−１またはそれらのオルソ体ではないポリペプチドをコードするものである核酸分子。９．ポリペプチドをコードするヌクレオチドの配列を含んでなる核酸分子であって、該ポリペプチドはMAPキナーゼホスファターゼ活性を有し、図２に示されたコード配列のいずれか一つによりコードされたアミノ酸配列の、一つまたはそれよりも多いアミノ酸の付加、挿入、欠失もしくは置換による、対立形質、誘導体または変異体を含む、アミノ酸配列を含んでなり、前記コード配列によってコードされたポリペプチドに少くとも80％の相同性を示すが、CL100，PAC−１またはそれらのオルソ体ではないものである、核酸分子。 10．MAPキナーゼホスファターゼ活性を有し、CL100，PAC−１以外であるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、前記配列は図２に示された配列のいずれか一つとハイブリダイズし得るヌクレオチドに相補的なヌクレオチド配列を含んでなる、核酸分子。 11．請求項６〜10のいずれか１項に記載の核酸及び前記ポリペプチドの発現のための調節配列を含んでなるベクター。 12．請求項６〜10のいずれか１項に記載の核酸分子を含んでなる宿主細胞。 13．請求項11に記載のベクターからの発現を含む、ポリペプチドの製造方法。 14．請求項11に記載のベクターを含んでなる宿主細胞。 15．原核細胞である請求項14に記載の宿主細胞。 16．真核細胞である請求項14に記載の宿主細胞。 17．ポリペプチドの製造方法であって、前記ポリペプチドの発現のための条件下で、請求項14〜16のいずれか１項に記載の宿主細胞を増殖することを含んでなる製造方法。 18．次の配列を有するオリゴヌクレオチド： TA(T,C)GA(T,C)CA(A,G)GG(A,G,T)GG(T,C,G,A)CC(A,T)GT(A,G,T)GA； AT(G,C,T)CC(A,T)GC(T,C)TG(A,G)CA(A,G)TG(T,C,G,A)AC；またはこれらの配列のいずれかに相補的な配列。 19．MAPキナーゼホスファターゼ活性を持つポリペプチドをコードする核酸を得る方法であって、請求項18に記載のオリゴヌクレオチドまたは前記オリゴヌクレオチドを含んでなるオリゴヌクレオチドの標的核酸へのハイブリダイズを含んでなる方法。 20．MAPキナーゼホスファターゼ活性を持つポリペプチドをコードする核酸を得る方法であって、核酸分子の標的核酸へのハイブリダイズを含んでなり、該核酸分子は、（ｉ）図２に示されたヌクレオチド配列のいずれか一つ；（ii）図２に示された配列のいずれか一つに相補的であるヌクレオチド配列；（iii）図２に示されたコード配列のいずれか一つの、一つまたはそれよりも多いヌクレオチドの付加、挿入、欠失もしくは置換による、対立遺伝子、誘導体または変異体を含むヌクレオチド配列であって、前記コード配列によってコードされたポリペプチドに少くとも80％の相同性を示すポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（iv）（iii）に相補的なヌクレオチド配列；または（ｖ）（ｉ），（ii），（iii）及び（iv）のいずれか一つの断片であるヌクレオチド配列；を含んでなる、方法。 21．請求項19または20に記載の方法であって、前記ハイブリダイズに、好結果のハイブリダイズの同定及び標的核酸の単離が続く方法。 22．ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)の使用を包含してなる、請求項19〜21のいずれか１項に記載の方法。 23．核酸または対立遺伝子、誘導体もしくは変異体の存在について細胞をスクリーニングする方法であって、該核酸は図２に示されたコード配列のいずれか一つを持つ核酸によってコードされたアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドをコードするものであり、該対立遺伝子、誘導体もしくは変異体は、図２に示されたコード配列のいずれか一つの、一つまたはそれよりも多いヌクレオチドの付加、挿入、欠失もしくは置換によるものであって、前記コード配列によってコードされたポリペプチドに少くとも80％の相同性を示すポリペプチドをコードし、CL10 0，PAC−１またはをコードしないものであって、該方法は、核酸プローブの、細胞の核酸の試料へのハイブリダイズ及び該試料へのプローブの結合の定量を含んでなり、該プローブは、次の配列；（ｉ）TA(T,C)GA(T,C)CA(A,G)GG(A,G,T)GG(T,C,G,A)CC(A,T)GT(A,G,T)GA; （ii）AT(G,C,T)CC(A,T)GC(T,C)TG(A,G)CA(A,G)TG(T,C,G,A)AC; （iii）（ｉ）または（ii）に相補的な配列；（iv）図２に示されたヌクレオチド配列のいずれか一つ；（ｖ）図２に示された配列のいずれか一つに相補的なヌクレオチド配列；（vi）図２に示された配列のいずれか一つの、一つまたはそれよりも多いヌクレオチドの付加、挿入、欠失もしくは置換による、対立遺伝子、誘導体もしくは変異体、またはそれらに相補的なヌクレオチド配列であって、前記コード配列によってコードされたポリペプチドに少くとも80％の相同性を示すポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（vii）（vi）に相補的であるヌクレオチド配列；並びに（viii）（iv），（ｖ），（vi）及び（vii）のいずれか一つの断片であるヌクレオチド配列；から選択された１種である前記方法。 24．請求項１に記載のポリペプチドに特異的に結合し得る抗体。 25．モノクローナル抗体である請求項24に記載の抗体。 26．ポリクローナル抗体である請求項24に記載の抗体。 27．前記ポリペプチドの存在のスクリーニングにおける請求項24〜26のいずれか１項に記載の抗体の使用。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ１２Ｐ 21/08 7823−4ＢＣ１２Ｑ 1/68 ＡＣ１２Ｑ 1/68 0276−2ＪＧ０１Ｎ 33/573 ＡＧ０１Ｎ 33/573 9282−4ＢＣ１２Ｎ 5/00 Ａ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者オザンヌ，ブラッドイギリス国，グラスゴウジー61 ４エービー，ベアスデン，レッドカメロチロード９エー (72)発明者キング，アンドレアイギリス国，ケントティーエヌ12 ９エージー，マーデン，メンドストンロード，コーチハウスグラナリー（番地なし)

Claims

【特許請求の範囲】１．MAPキナーゼホスファターゼ活性を有するポリペプチドであって、図２に示されたコード配列のいずれか一つを持つ核酸によってコードされたアミノ酸の配列を含んでなるポリペプチド。２．アミノ酸配列を含んでなるポリペプチドであって、該アミノ酸配列は、図２に示されたコード配列のいずれか一つを持つ核酸によってコードされたアミノ酸の、一つまたはそれよりも多いアミノ酸の付加、挿入、欠失もしくは置換による、対立形質、誘導体または変異体を含むものであるポリペプチド。３．MAPキナーゼホスファターゼ活性を有する請求項２に記載のポリペプチド。４．アミノ酸配列を有するポリペプチドであって、該アミノ酸配列は、図２に示されたコード配列のいずれか一つを持つ核酸によりコードされたアミノ酸の配列と相同であって、MAPキナーゼホスファターゼ活性を有するが、CL100，PAC −１またはそれらのオルソ体ではない、ポリペプチド。５．前記アミノ酸の配列を含んでなるポリペプチドのオルソ体である請求項４に記載のポリペプチド。６．アミノ酸配列を含むポリペプチドであって、該アミノ酸配列は請求項４または請求項５に記載のポリペプチドの一つまたはそれよりも多いアミノ酸の付加、挿入、欠失もしくは置換による、対立形質、誘導体または変異体を含むものであるポリペプチド。７．MAPキナーゼホスファターゼ活性を有する請求項６に記載のポリペプチド。８．核酸分子であって、該核酸分子はポリペプチドをコードするヌクレオチドの配列を含んでなり、該ポリペプチドは、図２に示されたコード配列のいずれか一つを持つ核酸によってコードされたアミノ酸の配列を含むものである、核酸分子。９．該ヌクレオチドの配列が、図２に示されたコード配列のいずれか一つである請求項８に記載の核酸分子。 10．請求項８に記載の核酸分子であって、該ヌクレオチドの配列が、図２に示されたコードヌクレオチド配列のいずれか一つの、一つまたはそれよりも多いヌクレオチドの付加、挿入、欠失もしくは置換による、対立遺伝子、誘導体または変異体を含むものである、核酸分子。 11．ポリペプチドをコードするヌクレオチドの配列を含んでなる核酸分子であって、該ポリペプチドはアミノ酸配列を含んでなり、該アミノ酸配列は、図２に示されたコード配列のいずれか一つを持つ核酸によってコードされたアミノ酸配列の一つまたはそれよりも多いアミノ酸の付加、挿入、欠失もしくは置換による、対立形質、誘導体または変異体を含むものである、核酸分子。 12．前記ポリペプチドがMAPキナーゼホスファターゼ活性を有する、請求項８〜11項のいずれか１項に記載の核酸分子。 13．MAPキナーゼホスファターゼ活性を有し、CL100，PAC−１以外であるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、該配列は図２に示された配列のいずれか一つとハイブリダイズし得るヌクレオチドに相補的なヌクレオチド配列を含んでなる、核酸分子。 14．請求項８〜13のいずれか１項に記載の核酸及び前記ポリペプチドの発現のための調節配列を含んでなるベクター。 15．請求項８〜13のいずれか１項に記載の核酸分子を含んでなる宿主細胞。 16．請求項14に記載のベクターからの発現を含む、ポリペプチドの製造方法。 17．請求項14に記載のベクターを含んでなる宿主細胞。 18．原核細胞である請求項17に記載の宿主細胞。 19．真核細胞である請求項17に記載の宿主細胞。 20．ポリペプチドの製造方法であって、前記ポリペプチドの発現のための条件下で、請求項17〜19のいずれか１項に記載の宿主細胞を増殖することを含んでなる製造方法。 21．次の配列を有するオリゴヌクレオチド： TA(T,C)GA(T,C)CA(A,G)GG(A,G,T)GG(T,C,G,A)CC(A,T)GT(A,G,T) GA; AT(G,C,T)CC(A,T)GC(T,C)TG(A,G)CA(A,G)TG(T,C,G,A)AC; またはこれらの配列のいずれかに相補的な配列。 22．ホスファターゼ活性を持つポリペプチドをコードする核酸を得る方法であって、請求項21に記載のオリゴヌクレオチドまたは前記オリゴヌクレオチドを含んでなるオリゴヌクレオチドの標的核酸へのハイブリダイズを含んでなる方法。 23．ホスファターゼ活性を持つポリペプチドをコードする核酸を得る方法であって、核酸分子の標的核酸へのハイブリダイズを含んでなり、該核酸分子は、（ｉ）図２に示されたヌクレオチド配列のいずれか一つ；（ii）図２に示された配列のいずれか一つに相補的であるヌクレオチド配列；（iii）図２に示された配列のいずれか一つの、一つまたはそれよりも多いヌクレオチドの付加、挿入、欠失もしくは置換による、対立遺伝子、誘導体または変異体を含むヌクレオチド配列、またはそれらに相補的なヌクレオチド配列；または（iv）（ｉ），（ii）及び（iii）のいずれか一つの断片であるヌクレオチド配列である、方法。 24．請求項22または23に記載の方法であって、前記ハイブリダイズに、好結果のハイブリダイズの同定及び標的核酸の単離が続く方法。 25．ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）の使用を包含してなる、請求項22〜24のいずれか１項に記載の方法。 26．核酸または対立遺伝子、誘導体もしくは変異体の存在について細胞をスクリーニングする方法であって、該核酸は図２に示されたコード配列のいずれか一つを持つ核酸によってコードされたアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドをコードするものであり、該対立遺伝子、誘導体もしくは変異体は、図２に示されたコード配列のいずれか一つの、一つまたはそれよりも多いヌクレオチドの付加、挿入、欠失もしくは置換によるものであって、該方法は、核酸プローブの、細胞の核酸の試料へのハイブリダイズ及び該試料へのプローブの結合の定量を含んでなり、該プローブは、次の配列；（ｉ）TA(T,C)GA(T,C)CA(A,G)GG(A,G,T)GG(T,C,G,A)CC(A,T)GT(A,G,T)GA; （ii）AT(G,C,T)CC(A,T)GC(T,C)TG(A,G)CA(A,G)TG(T,C,G,A)AC; （iii）（ｉ）または（ii）に相補的な配列；（iv）図２に示されたヌクレオチド配列のいずれか一つ；（ｖ）図２に示された配列のいずれか一つに相補的なヌクレオチド配列；（vi）図２に示された配列のいずれか一つの、一つまたはそれよりも多いヌクレオチドの付加、挿入、欠失もしくは置換による、対立遺伝子、誘導体もしくは変異体、またはそれらに相補的なヌクレオチド配列；並びに（vii）（ｖ），（vi）及び（vi）のいずれか一つの断片であるヌクレオチド配列；から選択された１種である前記方法。 27．請求項１〜７のいずれか１項に記載のポリペプチドに結合し得る抗体。 28．前記ポリペプチドに特異的である請求項27に記載の抗体。 29．モノクローナル抗体である請求項27または請求項28に記載の抗体。 30．ポリクローナル抗体である請求項27または請求項28に記載の抗体。 31．前記ポリペプチドの存在のスクリーニングにおける請求項27〜30のいずれか１項に記載の抗体の使用。