JPH07508410A - 酵母人工染色体を有するトランスジェニック非ヒト動物の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 酵母人工染色体を有するトランスジェニック非ヒト動物の製造方法 技術分野 本発明は、異種のポリペプチドを発現できるトランスジェニック非ヒト動物、こ のようなトランスジェニック動物の製造のために用いられるトランスジーン、異 種のポリペプチドを発現できるトランスジーン、ヒトタンパク質例えばヒト免疫 グロブリン又はアミロイド前駆タンパク質（ＡＰＰ）をエンコードするポリヌク レオチド配列を含む酵母人工染色体（ｙｅａｓｔ　ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ　ｃｈ ｒｏｍｏｓｏｍｅｓ　）　、大きなポリヌクレオチド配列を細胞内へ移入させる ための方法及びトランスジーン、及び細胞内へ不連続ポリヌクレオチド配列をコ リボフエクション（ｃｏ−１ｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎ）するための方法に関する。

発明の背景 細胞内へ異種の遺伝物質を移入させることは、現代の分子生物学の基礎である。

移入方法の効率、特異性、及び／又は大きさの限界を改善するための新しい方法 の絶え間ない開発が、従来は構築することが現実的でなく又は不可能であったポ リヌクレオチドクローン及び組換え生物の製造を可能にして、研究及び生産開発 の範囲を拡げてきた。特に、リン酸カルシウム沈降法、エレクトロポレーション 、リポフエクション、弾道移入（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ　ｔｒａｎｓｆｅｒ）　、 ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクション、マイクロインジェクション及び ウィルスに基づいた移入法が、異質のＤＮＡフラグメントを哺乳動物細胞に導入 するために報告されている。

また、大きな（５０〜１０００キロベースを越える）クローン化された異種遺伝 子の挿入物（米国特許第４８８９８０６号明細書）を増殖させることができる酵 母人口染色体（“ＹＡＣ”）クローニングベクターも開発された。ＹＡＣクロー ンライブラリーは、哺乳類動物のゲノムＤＮＡの大きなフラグメントを、同定し 、マツピングし、そして増殖するために用いられてきた。ＹＡＣクローニングは 、無傷の遺伝子、特に数十キロベース以上にわたるエキソンを有する大きな遺伝 子、及びエキソン配列から数十キロベース以上上流或いは下流に配置された遠位 調節因子を有する遺伝子を単離するのに特に有用である。ＹＡＣクローニングは 、大きな複合遺伝子座例えば再配置されていない免疫グロブリン遺伝子座、及び ほぼ正しい染色体領域に厳密でなくマツピングされた遺伝子（例えば、ハンチン トン舞踏病遺伝子）を単離するのに特に有利である。ＹＡＣは、相同な標的ベク ターにおいて組換相同領域として有用な大きな近接した配列のクローニングを可 能にするので、ＹＡＣクローニングはまた、哺乳動物細胞中で標的とされた相同 組換を起こすためのベクターを作成するのに適している。更にＹＡＣは、酵母宿 主細胞中で標的とされた相同組換を行うための系を与えて、ＹＡＣ構築物中に新 しい大きなトランスジーン（例えば、大きなミニジーン、直列の遺伝子配列等） を創造でき、該ＹＡＣ構築物は次いで哺乳動物宿主細胞中に移入されることがで きる。

不運にも、大きなポリヌクレオチドの操作は問題が多い。

大きなポリヌクレオチドは、剪断力によって破壊を受けやすく、そして比較的薄 い濃度ですら高粘度溶液を形成しやすい。そのことはインヒドロの操作を非常に 困難にしている。これらの理由及びその他のために、大きなトランスジーン構築 物或いは相同組換え構築物を構築する方法において、操作されるＹＡＣクローン 及び他の大きなりＮＡフラグメントの量を減少させることが望まれている。

更なる問題は、大きな無傷のポリヌクレオチドの哺乳動物細胞中への移入は、一 般的に非能率的であるか又は移入されるポリヌクレオチドの大きさが制限される という事実である。例えば、５ｃｈｅｄｌら、１９９２年、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａ ｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、第２０巻、第３０７３頁は、マウス胚の前核インジェクシ ヨンによる３５キロベースのＹＡＣクローンのマウスゲノムへの移入を開示して いる。しかしながら、インジェクションマイクロピペット中に生じる剪断力は、 無傷の状態での、著しく大きなＹＡＣの効率的な移入をほぼ確実に不可能にする 。

現在のマイクロインジェクション法では、多くの大きな遺伝子は、哺乳動物細胞 中へ効率よ（移入されることができないようである。

スフェロプラスト融合が、ＹＡＣＤＮＡを線維芽細胞、胚芽腫細胞、及びＣＨＯ 細胞中への導入に用いられている（　Ｐａｃｈｎｉｅら、１９９０年、Ｐｒｏｃ 、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、（Ｕ、Ｓ、Ａ、）。

第８７巻、第５４０９頁、Ｐａｙａｎ　ら、１９９０年、１ｌｏ１．　Ｃｅ１１ ．　Ｂｉｏｌ。

第１０巻、第４１６３頁、Ｃｈｉｒｋｅ　ら、１９９１年、ＥＭＢＯＪ、、第１ ０巻、第１６２９頁、Ｄａｖｉｅｓら、１９９２年、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ ｓ　Ｒｅｓ、、第２０巻、第２６９３頁）。別の、トランスフェクション法例え ばリン酸カルシウム沈降法及びリポフエクション法が、哺乳動物細胞中へＹＡＣ ＤＮＡを移入するために用いられている（　Ｅｔｉｃｃｉｒｉら、１９９１年、 Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。

このように、本技術分野においては、最小の操作及びクローニング手順で、トラ ンスジェニック動物を作るために、大きなりＮＡ上セグメントえば大きなＹＡＣ クローンを哺乳動物細胞例えば胚幹細胞中に移入する効率的な方法が必要とされ ている。特に、もし、大きなりローン化された哺乳動物ゲノムフラグメントがＹ ＡＣライブラリーから単離でき（ＹＡＣ酵母配列に連結されているか又はＹＡＣ 酵母配列から精製されている）、そして、それを無傷で、第２のポリヌクレオチ ド配列（例えば、選択マーカー例えばｎｅｏ発現カセット）とともに、追加のク ローニング或いは操作（例えば、配列を互いに連結）なしに嘩乳動物宿主細胞（ 例えば、ＥＳ細胞）中へ移入できれば、それは非常に有利である。このような方 法は、トランスジェニック細胞、トランスジェニック動物及び相同的に標的とさ れる細胞及び動物を効率よく構築することを可能にする。これらのトランスジェ ニック／相同的に標的とされる細胞及び動物は、例えばヒト遺伝病特にハンチン トン舞踏病及びアルツハイマー病等の有用なモデルを提供することができる。

アルツハイマー病 現在、アルツハイマー病（ＡＤ）の様々な形態のための治療法は知られていない 。しかしながら、有効な処置が可能な、アルツハイマー病に関連する痴呆に酷似 している進行性の知能低下を引き起こすいくつかの病状がある。

アルツハイマー病は、一般に老人性痴呆として知られている進行性の病気である 。大雑把に言えば、その病気は２つのカテゴリー、すなわち晩期の発病と、早期 の発病に分けることができる。晩期発病（すなわち、老齢（６５才以上）で発病 ）は、通常よりも早い速度でそしてより厳しい程度で起こる脳の自然の委縮によ って引き起こされる。早期発病アルツハイマー病は、はるかにまれであるが、老 年期前（すなわち、３５〜６０才の間）によく発生する脳の委縮を伴った病理学 的にまったく同じ痴呆を示す。このタイプのアルツハイマー病の一つの形態は、 遺伝しそしてそれ故、家族性アルツハイマー病（ＦＡＤ）として知られていると いうことが証明されている。

アルツハイマー病のどちらのタイプにおいても病状は同じであるが、その異常は より若い年齢で発病した場合に、より厳しくそしてより広範囲に及ぶ傾向がある 。その病気は、脳における４つのタイプの病変により特徴付けられる。

これらは、ニューロン周辺のアミロイド斑（老人斑）、大脳血管周辺のアミロイ ド沈積物、ニューロン内側の神経細線維のもつれ及びニューロン細胞の死である 。老人斑は、中心に細胞外アミロイド沈積物がある、直径が１５０μｍにも及ぶ 組織が破壊され神経網の領域である。脳血管性アミロイド沈積物は、大脳血管を とり囲むアミロイド物質である。神経細線維のもつれは、２つ１組になって互い に巻きついている２つのフィラメントから成るアミロイドタンパク質の細胞内沈 積物である。

主要なタンパク質サブユニットであるアミロイドβタンパク質は、神経細線維の もつれ及び老人斑の両者のアミロイドフィラメント中に見られ、そして約４．０ ００の相対分子質量の高度に凝集する小さなポリペプチドである。このタンパク 質は、アミロイド前駆タンパク質（ＡＰＰ）と呼ばれるはるかに大きな前駆タン パク質の切断生成物である。

ＡＰＰ遺伝子は、ヒト染色体２１番上に配置されていると知られている。家族性 アルツハイマー病を隔離する遺伝子座は、ＡＰＰ遺伝子の近傍の染色体２１番に マツピングされる（　Ｓｔ、　Ｇｅｏｒｇｅ　ＨｙｓＩｏｐ　ら、１９８７年、 ５ｃｉｅｎｃｅ　１第２３５巻、第８８５頁）。ＡＰＰ遺伝子とＡＤ遺伝子座の 間での組み換え体は、既に報告されている（　５ｃｈｅｌ　ｌｅｎｂｅｒｇら、 １９８８年、５ｃｉｅｎｃｅ　、第２４１巻、第１５０７頁、Ｓｃｈｅｌｌｅｎ ｂｅｒｇら、１９９１年、４ｍ、Ｊ、Ｂｕｎ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、、第４８巻、 第５６３頁、５ｃｈｅｌ　Ｉｅｎｂｅｒｇら、１９９１年、Ａｍ、Ｊ、Ｈｕｍ、 Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、第４９巻、第５１１頁、これらは引用することにより本明細 書の一部である）。ＡＤの病因に含まれる根底にある生化学的現象を更に明らか にするために用いることができる、アルツハイマー病の実験モデルの開発が非常 に望まれている。このようなモデルは、アルツハイマー病における退化過程を変 える薬剤をスクリーニングするために、ある用途において、恐らく用いることが できる。例えば、アルツハイマー病のモデル系は、ＡＤの病因を引き起こす又は 促進する環境要因をスクリーニングするために用いることができる。対照的に、 ＡＤの進行を阻害し、防ぎ、又は逆行させる薬剤のスクリーニングのために実験 モデルを用いることもできる。

恐らく、このようなモデアルは、ＡＤを防ぎ、その進行を止め、又は逆行させる のに有効な製薬の開発のために用いられることができる。

不運にも、ヒト及び老齢な非ヒト霊長類のみがＡＤの病理学的な特徴を示す。即 ち、霊長類を用いることは高価で困難であり、そしてＡＤの病状を表すまでに要 求される時間が長いので、このような動物を用いた広範囲の研究は禁止されてい る。層線類動物は、極度に高齢となってもＡＤを発現しない。β−アミロイドタ ンパク質（βＡＰ）又は細胞毒性のβＡＰフラグメントを、層線類動物の脳に注 入すると、細胞の損失を起こし神経細繊維のからみ成分に対する抗原性マーカー を誘引することが報告されている（Ｋｏｖａｌｌら、１９９１年、Ｐｒｏｃ、Ｎ ａｔｌ、＾ｃａｄ、、Ｓｃｉ、（Ｕ、Ｓ、Ａ　）、第８８巻、第７２４７頁）。

染色体第１６番の部分的三染色体性の結果として、ＡＰＰ遺伝子の余分のコピー を有するマウスは、生まれる前に死ぬ（Ｃｏｙｌｅ　ら、１９８８年、Ｔｒｅｎ ｄｓ　１ｎＮｅｕｒｏｓｃｉ、第１１巻、第３９０頁）。ＡＰＰ遺伝子のクロー ニング以来、ＡＰＰ遺伝子の全て又は一部を含むトランスジーンを用いたＡＤの ためのマウスモデルを作成する試みが成されてきたが、不運にも、それらのマウ スは成育できなかったかＡＤ様の病状を示さなかったので、その研究の多くは発 表されずにいる。２つ発表された報告は、その報告された結果が不規則なので取 り下げられた（　Ｍａｒｘ　Ｊ％５ｃｉｅｎｃｅ、第２５５巻、第１２００頁） 。

従って、本技術分野においては、無傷なヒ１−ＡＰＰ遺伝子、即ち野生型の対立 遺伝子、病気に付随した対立遺伝子或いはこれらの組み合わせのいずれか、又は ヒトＡＰＰ配列に対応する配列修飾を含む変異した層線動物（例えばマウス）対 立遺伝子を有するトランスジェニック非ヒト動物が必要とされている。このよう なトランスジェニック動物由来の細胞株及び細胞系統（例えば、アストログリア 細胞）はまた、ＡＤ療法を開発するための実験モデルとして、本技術分野におい て広い用途がある。

所定の抗原に結合するヒトモノクローナル抗体を作成することは、選択した抗原 で免疫されたかつ免疫源に対し十分な体液性免疫応答を示すヒトからの生存可能 なリンパ球の供給源を要求するので、困難である。特に、ヒトは一般的には、ヒ ト（自己）抗原の攻撃に応答する十分な抗体を作れない。不運にも多くのこのよ うなヒト抗原は、ヒトモノクローナル抗体を含む治療方法の目標物となる見込み がある。所定のヒト抗原に特異的に反応するヒト抗体を作成する一つのアプロー チは、再配列されていないヒト免疫グロブリントランスジーンを有し、そして内 在性免疫グロブリン遺伝子が機能的に破壊されているトランスジェニックマウス を製造することを含む（ＬｏｎｂｅｒｇとＫａｙ、　Ｔｏ　９２１０３９１８゜ ＫｕＣｈｅｒｌａｐａｔｉ　と　Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ、　Ｔｏ　９１／１０７ ４１）。しかしながら、大きなりＮＡ上セグメントえばヒト免疫グロブリンの軽 鎖又は重鎮の遺伝子座の相当な部分に及ぶＤＮＡセグメントを効率よく移入する ことは、潜在的な障害を与え及び／又はトランスジェニック動物の作成方法の効 率を減少させる。

前記のことより、１以上の大きな無傷のトランスジーン、特にヒトＡＰＰ遺伝子 又はヒト免疫グロブリントランスジーンを有する非ヒト細胞及び非ヒト動物が必 要であることが明らかである。従って、本発明の目的は、大きなトランスジーン 及び大きな相同組み換え構築物（通常はＹＡＣとしてクローン化されている）を 哺乳動物細胞特に胚幹細胞中に移入するための方法及び組成物を提供することで ある。

本発明の目的はまた、１以上の本発明のＡＰＰ　トランスジーンを有するトラン スジェニック非ヒト細胞及びトランスジェニック非ヒト動物を提供することであ る。

本明細書中で述べた文献は、本出願の出願日量前の開示のためにのろ提供される ものである。本明細書は、先の発明に基づいて、このような開示よりも日付が先 であるとする権利が発明者にはないということを認めるものであると解釈される ものではない。すべての引用文献は引用することにより、本明細書の一部である 。

発明の概要 前記目的に従って、本発明の一つの観点において、大きなトランスジーン及び大 きな相同標的構築物（典型的には、ＹＡＣとして増殖され、そして好ましくは少 なくとも一つの完全な転写複合体にまで及ぶ）を哺乳動物細胞例えばＥＳ細胞中 へ移入する方法が提供される。一つの観点において、上記方法は、大きなトラン スジーン及び大きな相同標的構築物を、リボフエクンラン法例えばコリボフエク ションにより動物細胞中に移入することを提供し、そこでは、第２の連結されて いないポリヌクレオチドが大きなトランスーン及び／又は大きな相同標的構築物 とともに哺乳動物細胞中に移入される。好ましくは、第２のポリヌクレオチドは 、選択表現型（例えば、６４１８選択に対する耐性）を、該ポリヌクレオチド配 列を受け取りそして組み込んでいる細胞に与える。通常、大きなトランスジーン 又は相同標的構築物は、ポリヌクレオチド結合に酵母由来のＹＡＣ配列とともに 移入されうる。しかし、酵母由来のＹＡＣ配列は、制限酵素消化及び分離（例え ば、パルスゲル電気泳動）により取り除かれる。大きなトランスジーン及び／又 は相同標的構築物は、一般に、連結されていない第２のポリヌクレオチド（例え ば、選択表現型を与えるｎｅｏＲ発現カセット）と混合され、そして、カチオン 性脂質（例えば、ＤＯＧＳ。

ＤＯＴＭＡ　、　ＤＯＴＡＰ　）に接触されて、カチオン性脂質−ＤＮＡ複合体 を形成する。複合体は、細胞中へのＤＮＡの取り込みに適した条件（例えば、培 養液、生理的リン酸塩緩衝食塩溶液、無血清ＥＳ培地）で、哺乳動物細胞（例え ば、ＥＳ細胞）と接触させられる。一般に大きなトランスジーン又は大きな相同 標的構築物を有する細胞は付随的に第２のポリヌクレオチドの少なくとも１つの コピーを有し、その結果、第２のポリヌクレオチドを有する細胞を選択すること は、一般的には、大きなトランスジーン又は大きな相同標的構築物の少なくとも １つのコピーを、内在性染色体遺伝子座の組み込まれたか又は相同的に組み換え られたセグメントとして有するかなりの可能性を有する。従って、第２のポリヌ クレオチド（例えば、ｎｅｏＲ発現カセット）の選択はまた、一般的に、リボフ ェクンヨンに先立つ大きなトランスジーン又は大きな相同標的構築物の第２のポ リヌクレオチドへの面倒なポリヌクレオチド結合（例えば、連結反応）をするこ となしに、大きなトランスジーン又は大きな相同標的構築物を有する細胞を選択 することとなる。本発明のコリボフエクション法に従って、選択マーカー遺伝子 の結合及びそれに続くクローニングを要求することなし、異種ＤＮＡの大きなセ グメントが、素早（そして効率良く哺乳動物細胞（例えばネズミＥＳ細胞）中に 移入される。

本発明はまた、組み込まれた又は相同的に組み換えられた、酵母由来のＹＡＣ配 列に連結された異種（好ましくは、非相同）哺乳動物ゲノムＤＮＡ配列の少なく とも１つのコピーを有する哺乳動物細胞、好ましくはＥＳ細胞を提供する。大き な異種（好ましくは非相同）＃乳動物ゲノムＤＮＡ配列は、好ましくは完全な構 造遺伝子、更に好ましくは完全な転写単位、及び一つの例としては完全なヒトＡ ＰＰ遺伝子を含む。典型的には、得られたトランスジェニック哺乳動物細胞はま た、連結されていない第２のポリヌクレオチド（例えば、選択マーカー）の少な くとも一つの組み込まれたコピーを含み、該第二のポリヌクレオチドは、非相同 的に、通常は少な（とも一つの染色体遺伝子座中に、時々は大きなトランスジー ン又は大きな相同標的構築物が組み込まれているところとは異なった染色体座（ −カ所又は複数箇所）中に組み込まれる。トランスフェクション工程の間及びそ の直後に、大きな外来ＤＮＡ配列、連結されていない選択マーカー遺伝子及び適 当なカチオン性脂質を有する新しい哺乳動物細胞例えばＥＳ細胞が形成される。

このような新しい哺乳動物細胞は、本発明の一つの観点である。

本発明はまた、組み込まれた又は相同的に組み換えられた、酵母由来のＹＡＣ配 列に連結された大きな異種（好ましくは、非相同）ｇｆＲ乳動物ゲノムＤＮＡ配 列の少なくとも１つのコピーを有するゲノムを含むトランスジェニック非ヒト動 物を提供する。大きな異種（好ましくは非相同）ｌ’ｉｉ乳動物ゲノムＤＮＡ配 列は、好ましくは完全な構造遺伝子、更に好ましくは完全な転写単位、及び一つ の例としては完全なヒトＡＰＰ遺伝子を含む。典型的には、得られたトランスジ ェニック非ヒト晴乳動物はまた、連結されていない第２のポリヌクレオチド（例 えば、選択マーカー）の少なくとも一つの組み込まれたコピーを有するゲノムを 含み、該第二のポリヌクレオチドは、非相同的に、通常は少なくとも一つの染色 体遺伝子座中に、時々は大きなトランスジーン又は大きな相同標的構築物が組み 込まれているところとは異なった染色体座（−カ所又は複数箇所）中に組み込ま れる。好ましくは、非ヒト動物の染色体遺伝子座（−カ所又は複数箇所）中に組 み込まれている大きなトランスジーン又は大きな相同標的構築物が発現され、更 に好ましくは、非ヒト動物種の自然存在する相同遺伝子と同様に発現される（例 えば、同様な組織特異的様式及び／又は発生様式で）。　本発明はまた、コリポ フエクションのための組成物、即ち、少なくとも一つの組み込まれている大きな 外来トランスジーンの少なくとも一つのコピーを有する及び／又は少なくとも一 つの相同的に標的とされる構築物をそのゲノム中に有するトランスジェニック非 ヒト動物を作るために、異種の、典型的には非相同の大きな（例えば５０ｋｂ以 上）ポリヌクレオチドを哺乳動物細胞例えばＥＳ細胞中に移入するためのトラン スジエネシス（ｔｒａｎｓｇｅｎｅｓｉｓ）組成物及び相同標的組成物を提供す る。トランスジエネシス組成物は、（１）少なくとも一つの大きなトランスジー ン種、（２）少くとも一つの連結されていない第二のポリヌクレオチド種（例え ば、選択マーカー遺伝子ｎｅｏＲを含む発現カセット）及び（３）少なくとも一 つの適当なカチオン性脂質種を含む。相同標的組成物は、（１）少なくとも一つ の大きな標的構築物種、（２）少なくとも一つの連結されていない第二のポリヌ クレオチド種（例えば、選択マーカー遺伝子ｎｅｏＲを含む発現カセット）及び （３）少なくとも一つの適当なカチオン性脂質種を含む。好ましくは、大きなト ランスジーン又は大きな相同標的構築物は、無傷な転写単位に及ぶ。コリポフエ クション組成物の一つの好ましい実施例は、（１）酵母由来のＹＡＣ配列に連結 されたヒトＡＰＰ遺伝子配列（又は、ヒトＡＰＰ配列に対応する非自然発生的に 生じた配列を有する修飾されたマウス又はラットＡＰＰ遺伝子）　、（２）選択 マーカーをエンコードする発現カセット及び（３）適なカチオン性脂質を含む。

コリポフエクション組成物の他の好ましい実施例は、（１）酵母由来のＹＡＣ配 列に連結されたヒト非再配列免疫グロブリン遺伝子配列（少なくとも二つのＶ遺 伝子の完全なセグメント、少なくとも一つの完全なりセグメント（もし、重鎮遺 伝子であれば）、少な（とも一つの完全なＪセグメント及び少なくとも一つの定 常領域遺伝子を含む重鎮及び軽鎖遺伝子配列）、（２）選択マーカーをエンコー ドする発現カセット及び（３）適当なカチオン性脂質を含む。

本発明の一つの観点において、連結されていないポリヌクレオチド配列の複数種 が、ネズミ胚幹細胞及び／又は他の哺乳動物細胞中にコリボフエクションされ、 そこでは、少なくとも一つの連結されていないポリヌクレオチド配列の種は、そ れを取り込んでいる細胞に選択表現型を与える選択マーカーを含む。得られた細 胞は、選択マーカーの存在により選択される。このように選択された細胞は、細 胞中に導入されたポリヌクレオチド配列の他の種の少なくとも一つの組み込まれ たコピーを含んでいる可能性が非常に高い。

図面の簡単な説明 図に本発明のコリボフェクション複合体を形成するための代表的なカチオン性脂 質の化学構造。

図２．ヒトＡＰＰｈランスジーンでコリボフェクションされたＥＳクローンのＰ ＣＲ分析。陰をつけた円は、用いなかったウェルを示す。横列のプール（Ａ−Ｐ ）は、それぞれ１８クローン（Ａ−Ｅｌ）又は１６クローン（Ｉ−Ｐ）を含んで いた。

縦列の一ル（ＰＩ−ＰＩ８）は、それぞれ１６クローン（ＰＬ−ＰＩ２）又は８ クローン（ＰＩ３−ＰＩ８）を含んでいた。

図３　ヒトＡＰＰトランスジーンでコリボフエクションされたＥＳクローンのＰ ＣＲ分析。プールＰ３．Ｐ４．Ｐ９、ＰＬＯ，ｐＨ及びＰＩ２、及びプールＧ、 Ｈ，Ｋ。

Ｍ、Ｎ、Ｏ及びＰは、プロモーター配列及びエキラン１フ配列を共に含んでいる クローンの候補であった。

図４＝ヒトＡＰＰトランスジーンでコリボフエクションされたＥＳクローンのＰ ＣＲ分析。

図５：ヒヒトｌｕ配列プローブを用いたＹＡＣクローンＤＮＡのサザンプロット 分析。

図６：ヒトＡＰＰ　ＹＡＣの部分的制限消化マツピング。

図７・組み込まれたヒトＡＰＰ　トランスジーンから発現されたＲＮＡ転写物の ＰＣＲ分析。

図８＝ヒトＡＰＰ）ランスジーンからのＡＰＰ　ＲＮＡ転写物を検出するための 定量的ＲＮａｓｅ防護検定。

定義 特に断りのない限り、本明細書中で用いた全ての技術及び科学用語は、本発明が 属する技術分野の当業者によって通常理解されているのと同じ意味である。本明 細書中に記した方法及び物質と類似か又は等しいものが、本発明の実施及び試験 において用いることができるが、好ましい方法及び物質を記す。本発明の目的に そって、用語を以下のように定義する。

”一致する”又は“対応する”という用語は、本明細書中で、ポリヌクレオチド 配列が、参照するポリヌクレオチド配列の全て或いは一部に対して相同である（ 即ち、厳密に進化的には関係していないが同一である）、又はポリヌクレオチド 配列が参照するポリヌクレオチド配列と同一であることを意味するものとして用 いられる。対照的に、”相補的”という用語は、本明細書中で、相補的配列が、 参照するポリヌクレオチド配列の全て或いは一部に対して相同であるということ を意味するものとして用いられる。例えば、ヌクレオチド配列”　ＴＡＴＡＣ” は、参照配列”ＴＡＴＡＣ”と一致し、そして参照配列”ＧＴＡＴＡ”と相補的 である。

本明細書中で用いた”実質的に一致”、”実質的に相同”又は”実質的に同一” とは、核酸配列が参照配列と比べて少な（とも７０％の配列同一性、典型的には 少なくとも８５％の配列同一性、そして好ましくは核酸配列が参照配列と比べて 少なくとも９５％の配列同一性を有するところの核酸配列の特徴を示す。配列同 一性の％は、全部合わせても参照配列の２５％未満の、小さな欠失又は付加を除 外して計算する。参照配列は、大きな配列のサブセット、例えば遺伝子或いはフ ランキング配列の一部又は染色体の反復部分でありうる。しかしながら、参照配 列は、少なくとも１８ヌクレオチド長、典型的には少な（とも３０ヌクレオチド 長、そして好ましくは少なくとも５０〜１００ヌクレオチド長である。本明細書 中で用いる”実質的に相補的”とは、参照配列に実質的に一致する配列に相補的 である配列を意味する。

特異的ハイブリダイゼーションとは、本明細書中では、標的トランスジーン配列 （例えば、置換、欠失及び／又は付加を含みうる本発明のポリヌクレオチド）と 特定の標的ＤＮＡ配列（例えば、ヒトＡＰＰ遺伝子配列又はヒト免疫グロブリン 遺伝子配列）との間のハイブリッドの形成と定義され、そこでは、標識された標 的トランスジーン配列は、標的と優先的に対合して、例えば遺伝子の制限フラグ メントに一致する単一バンドが、プローブである該標識標的トランスジーン配列 を用いて、細胞より調製されたＤＮＡのサザンプロットで同定されうる。最適の ハイブリダイゼーション条件は、標的トランスジーン及び内在性標的の配列組成 及び長さ、及び実験者によって選択された実験方法に依存して変化する。種々の ガイドラインが、適当なハイブリダイゼーション条件を選択するために用いられ つる（Ｍａｎｉａｔｉｓ　ら、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌ ａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、１９８９年、第２版、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉ ｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　Ｎ、Ｙ、、及びＢｅｒｇｅｒとＫｉｍｍｅｌ、　Ｍｅｔ ｈｏｄ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第１５２巻、Ｇｕｉｄｅ　ｔ。

Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｒａｎｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　、　１９８７年 、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｉｎｃ、　、Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、　ＣＡ を参照、これらは引用することにより本明細書の一部でる）。

目的物に対して用いる、明細書中で用いる”自然存在する”とは、目的物が自然 に見いだされうるという事実を意味する。例えば、自然の供給源から単離されう る及び実験室でヒトによって意図的に修飾されていない生物（ウィルスを含む） 中に存在するポリペプチド又はポリヌクレオチド配列は、自然存在する、である 。本明細書中においては、古典的な遺伝学に従って選択的に生育されうる層線動 物の実験室系統は、自然存在する動物とみなされる。

本明細書中で用いる”同族”とは、種間で進化的及び機能的に関係している遺伝 子配列を意味する。例えば、これには限定されないが、ヒトゲノムにおいてはヒ ト免疫グロブリン重鎮遺伝子座はマウス免疫グロブリン重鎮遺伝子座に対して同 族遺伝子である。なぜならこれら二つの遺伝子の配列及び構造は、それらが非常 に相同であり、かつ両方の遺伝子が共に特異的に抗原に結合するために機能する タンパク質をエンコードする遺伝子であるということを示しているからである。

本明細書中で用いる”異種の”は、宿種哺乳動物宿主細胞又は非ヒト動物との関 係で定義され、アミノ酸配列又はポリヌクレオチド配列が、それぞれ宿種哺乳動 物宿主細胞又は非ヒト動物の自然存在するゲノムによってエンコードされない又 はゲノム中に存在しないことを意味する。異種ＤＮＡ配列は外来ＤＮＡ配列であ る。即ち、例えばヒトＡＰＰ遺伝子又は免疫グロブリン遺伝子は、ネズミＥＳ細 胞にとっては異種であり、また、例えばヒトすい嚢胞性繊維症関連ＣＦＴＲ対立 遺伝子は、野生型（正常）ＣＦＴＲ対立遺伝子のホモ接合体であるヒト細胞系統 にとっては異種である。従って、（例えば、特定部位の突然変異誘発により）変 異を受けているクローン化されたネズミ核酸配列は、もし変異した配列がネズミ ゲノム中で自然に発生したものでなければ、該配列がそれから由来したところの ネズミゲノムにとっては異種である。

本明細書中で用いる”非相同遺伝子”又は”非相同ポリヌクレオチド配列”は、 そのような遺伝子生成物を作るトランスジェニック非ヒト生物との関係で定義さ れる。非相同ポリペプチド（これはまた、異種ポリペプチドとしても表される） は、該トランスジェニック非ヒト動物ではない生物中に見られる同族遺伝子のそ れと一致するアミノ酸配列又はエンコードするＤＮＡ配列を有するポリヌクレオ チドとして定義される。従って、ヒトＡＰＰ遺伝子を有するトランスジェニック マウスは、非相同ＡＰＰ遺伝子を有すると記述されうる。ヒト免疫グロブリン遺 伝子を有するトランスジェニックマウスは、非相同免疫グロブリン遺伝子を有す ると記述されつる。非相同タンパク質配列をエンコードする種々の遺伝子セグメ ントを含むトランスジーンは、例えば、ハイブリダイゼーション又はＤＮＡ配列 決定により、トランスジェニック動物以外の生物種由来として、容易に同定され つる。例えば、ヒトＡＰＰアミノ酸配列の発現は、ヒトＡＰ遺伝子セグメントに よってエンコードされたヒトＡＰＰエピトープに特異的な抗体を用いて、本発明 のトランスジェニック非ヒト動物中で容易に検出されつる。

同族非相同遺伝子は、他の種からの一致する遺伝子として表される。従って、も しネズミＡＰＰが参照されれば、ヒトＡＰＰは同族非相同遺伝子である（他の種 からのＡＰ遺伝子に加えて、ブタ、ヒツジ又はラットのＡＰＰも同様である）。

本明細書中で用いる”標的構築物”なる用語は、（１）宿主細胞内在性遺伝子座 中に存在する配列に対して実質的に同−又は実質的に相補的である配列を有する 少なくとも一つの相同領域、及び（２）標的構築物相同領域及び該内在性遺伝子 座配列の間での相同組み換えによって、宿主細胞内在性遺伝子座中に組み込まれ ることになる標的領域、を含むポリヌクレオチドを表す。もし標的構築物が”ヒ ツトアンド　ラン”又は”イン　アンド　アウト”タイプ構築らは引用すること により本細書の一部である）であれば、標的領域は内在性遺伝子座中にほんの一 時的に取り込まれ、そして選択により宿主ゲノムから除去される。標的領域は、 内在性遺伝子配列に対して実質的に相同である配列を含みことができ、及び／又 は非相同配列例えば選択マーカー（例えば、ｎｅｏ　Ｓｔｋ、　ｇｐｔ　）を含 むことができる。”標的構築物”なる用語は、必ずしも、ポリヌクレオチドが宿 主ゲノム中に組み込まれることになる遺伝子を含むことを表すとは限らず、また ポリヌクレオチドが完全な構造遺伝子配列を含むことを表すとも限らない。本技 術分野で用いている”標的構築物”なる用語は、本明細書で用いている”標的ト ランスジーン”なる用語と同義である。

本明細書中で用いる”相同領域”及び”相同クランプ”は、その遺伝子に隣接す る配列を含みうる所定の内在性遺伝子配列に、実質的に一致するか又は実質的に 相補的である配列を有する標的構築物のセグメント（即ち、一部）である。相同 領域は、一般に、少なくとも約１００ヌクレオチド長、好ましくは少なくとも約 ２５０〜５００ヌクレオチド長、典型的には少なくとも約１０００ヌクレオチド 長或いはれ以上である。相同組み換えを仲介する相同クランプのための理論的な 最小の長さは示されていないが、相同組み換えの効率は、一般に相同クランプの 長さに伴って増加すると信じられている。同様に、相同組み換え効率は、標的構 築物相同領域及び内在性標的配列間の配列相同の程度に伴い増加し、相同クラン プが内在性標的配列と同質であるときに最適組み換え効率となる。”相同クラン プ”及び”相同領域”なる用語とは、本明細書中で互換的に用いられ、そして本 技術分野における似ている言葉の一貫性のない使用を考慮して、明快にすべく代 替的は用語法が提案される。相同クランプは、必ずしも内在性配列と塩基が対合 した７％イブリッド構造の形成を意味するとは限らない。トランスジーン相同領 域に実質的に一致するか又は実質的に相補的である内在性遺伝子配列は、本明細 書中では、”交差標的配列”又は”内在性標的配列”と表される。

本明細書中で用いる、”　ミニジーン”又は”　ミニ遺伝子座”なる用語は、遺 伝子の１以上の必須でない遺伝子のセグメントが自然存在する遺伝子との関係で 欠失されているところの非相同遺伝子構築物を意味する。典型的には、欠失され たセグメントは、少なくとも約１００塩基対から数キロベースのイントロン配列 であり、数十キロベース以上にまで及びうる。大きな（即ち、約５０キロベース 以上）の標的構築物の単離及び操作は、しばしば困難であり、標的構築物の宿主 細胞中への移入の効率を減少しうる。従って、しばしば、遺伝子の１以上の必須 でない部分を欠失させることによって標的構築物の大きさを減少させることが望 ましい。典型的には、必須の調節因子を含まないイントロン配列が欠失されうる 。例えば、ヒト免疫グロブリン重鎮ミニジーンは、ヒト重鎮免疫グロブリン遺伝 子遺伝子座のＪ遺伝子セグメント及びμ定常領域エキソン間のイントロンセグメ ントの欠失を含みうる。もし慣用の制限部位がクローン化された遺伝子配列の必 須でないイントロン配列に結合していれば、しばしば、イントロン配列の欠失は 、（１）クローン化されたＤＮＡを適当な制限酵素で消化する、（２）制限フラ グメントを（例えば、電気泳動により）分離する、（３）必須のエキラン及び調 節因子を含む制限フラグメントを単離する、及び（４）単離された制限フラグメ ントを連結して、エキランが、自然存在する遺伝子の生殖細胞系列のコピー中に 存在するのと同じ直線配列であるところのミニジーンを形成する、ことにより製 造されうる。ミニジーンを製造するための別の方法は、本発明の技術分野の当業 者にとって明白である（例えば、必須のエキランを含むがイントロン配列のいく つかの部分を欠いている部分的ゲノムクローンの連結）。更に典型的には、ミニ ジーンを含む遺伝子セグメントは、生殖細胞系列遺伝子中に存在するのと同じ直 線配列で配列される。しかしながら、常にそうだと言う訳ではない。いくつかの 望まし調節因子（例えば、エンハンサ−、サイレンサー）は、比較的位置非感受 性である。従って、調節因子は、対応する生殖細胞系列の遺伝子中における場合 と異なってミニジーン中に位置された場合でさえ正しく機能する。例えば、エン ハンサ−はプロモ−ターから異なった距離で、異なった方向に、及び／又は異な った直線配列で配置されつる。例えば、生殖細胞系列の立体配置においてプロモ ーターに対して３′に配置されているエンハンサ−は、ミニジーンにおいてプロ モーターに対して５°に配置されつる。同様に、いくつかの遺伝子は、ＲＮＡレ ベルにおいて交互的に（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｌｙ）スプライスされるエキラ ンを含みうる。従って、ミニジーンは、対応する生殖細胞系列の遺伝子より少な いエキラン及び／又は異なった直線配列のエキランを含むことができ、依然とし て、機能的遺伝子生成物をエンコードできうる。遺伝子生成物をエンコードする ｃ　ＤＮＡはまたミニジーンを構築するために用いられうる。しかしながら、一 般には、非相同ミニジーンが同族の自然存在する非ヒト遺伝子と同様に発現され るのが望ましいので、ｃ　ＤＮＡミニジーンの転写は、典型的には、自然存在す る遺伝子からの連結された遺伝子プロモーター及びエンハンサ−によって誘導さ れる。

本明細書中で用いる”大きいトランスジーン”又は７大きい相同標的構築物”と は、一般に５０ｋｂより大きい、通常は１００ｋｂより大きい、しばしば２６０ ｋｂより大きい、場合により５００ｋｂ程度の大きさの、時々は１０００ｋｂ以 上の大きさのポリヌクレオチドを意味する。

本明細書中で用いる、”転写単位”又は”転写複合体”なる用語とは、構造遺伝 子（エキラン）、シス作用する連結されたプロモーター及び構造遺伝子の効率的 な転写のために必須の他のシス作用配列、構造配列の適当な組織特異的及び発生 的な転写のために必須の遠位調節因子、及び効率的な転写及び翻訳のために重要 な付加的シス配列（例えば、ポリアデニル化部位、ｍＲＮＡ安定性制御配列）を 含むポリヌクレオチド配列を意味する。

本明細書中で用いる１連結された２とは、ポリヌクレオチド連結（すなわち、ホ スホジエステル連結）を意味する。

”連結されていない”とは、他のポリヌクレオチド配列に連結されていないこと を意味する。従って、もしそれぞれの配列が遊離の５゛末端及び遊離の３゛末端 を有すれば、２つの配列は連結されいない。

本発明の詳細な説明 一般に、以下で用いた命名法、細胞培養、分子遺伝学及び核酸化学の実験方法及 び以下に記したハイブリダイゼーションは、本技術分野において当業者に公知の ものでありかつ通常用いられるものである。核酸組み換え法、ポリヌクレオチド 合成、細胞培養及びトランスジーンの取り込み（例えば、リポフエクション法） のために、標準方法を用いた。一般に、酵素反応、オリゴヌクレオチド合成及び 精製工程は、製品仕様書に従って行った。方法及び手順は、一般に、本技術分野 における慣用の方法及び本明細書を通して示された種々の一般の引用に従って行 った。そこに示された手順は、本技術分野においてよく知られており、そして読 者の利便のために示されるものであると信じられる。

そこに含まれる全ての情報は、引用することにより本明細書の一部である。

キメラ標的マウスは、Ｂｏｇａｎら、Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎ　ｔｈｅ　Ｍｏｕ ｓｅ　Ｅｍｂｒｙｏ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　、Ｃｏ１ｄ 　Ｓｐｒｉｎｇ　ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、　１９８８年　及び　Ｔ ｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ　ａｎｄ　Ｅｍｂｒｙｏｎｊｃ　５ｔｅｌＩＣ ｅｌｌｓ：＾Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ　、　Ｅ、Ｊ、　Ｒｏｂｅ ｒｔｓｏｎ編、ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、　Ｄ、Ｃ，，１９ ８７年（これらは引用することにより本明細書の一部である）に従って作製され た。

胚幹細胞は、発表された方法（Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ　ａｎｄ　Ｅ Ｉｌｂｒｙｏｎｉｃ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅ１ｌｓ：　Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐ ｐｒｏａｃｈ　、　Ｅ、Ｊ、　Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ編、ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ、ｆ ａｓｈｉｎｇｔｏｎ、Ｄ、Ｃ，，１９８７年、Ｚｊｉｌｓｔｒａら、Ｎａｔｕｒ ｅ、　第３４２巻、第４３５−４３８頁、１９９８年、Ｓｃｈｖａｒｔｚｂｅｒ ｇら、５ｃｉｅｎｃｅ　ｓ第２４６巻、第７９９〜８０３頁、１９８９年（これ らは引用することによ明細書の一部である）に従って操作された。

オリゴヌクレオチドは、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏ　Ｓｙｓｔｅｍ社のオリゴヌク レオチドシンセサイザーにより、製品仕様書に従い合成されうる。

ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａに基ついたトランスジーンは、発現が悪く又は不適当に調節され るということがしばしば観察された。自然存在する遺伝子座の成分及び編成を実 質的に残しているゲノムＤＮＡに基づいたトランスジーン（即ち、クローン化さ れたゲノムＤＮＡ配列から構築された）は、正確に発現される可能性がより高い が、バクテリオファージ及びプラスミド／コスミドベクターのクローニング容量 によって大きさが限定される。酵母人工染色体（ＹＡＣ）は、約２メガベース（ 輩Ｂ）の容量を持つ最近開発されたクローニング伝達体である（　Ｂｕｒｋｅら 、１９８７年、５ｃｉｅｎｃｅ　、第２３６巻、８０６頁）。再現性よくかつ効 率的にＹＡＣをトランスジェニックマウス中に導入する能力は、最近のトランス ジーンの大きさの制限を著しく凌ぐことができる。

概して、本発明は、大きな（即ち、約５０ｋｂより大きい）クローン化されたポ リヌクレオチドが効率的に哺乳動物細胞例えばＥＳ細胞中に移入されることがで き、かつ少なくとも一つの染色体の位置中に取り込まれることができそして染色 体のセグメントとして安定に複製されることができるという予期されない発見に 基づいたものである。更に、完全な転写単位を含む大きなりローン化されたポリ ヌクレオチドは、哺乳動物細胞（例えば、ＥＳ細胞）中に移入され、染色体の位 置中に取り込まれそして転写されて、検出できる濃度の構造遺伝子配列のＲＮ、 Ａ転写物を製造できることが判った。ＹＡＣ中にクローン化された再配列されて いない免疫グロブリン遺伝子が、ＥＳ細胞中に導入され、有効なＶＤＪ再配列が 起こりかつ免疫グロブリン鎖の発現もまた起こるところのトランスジェニック動 物を形成するために発生分化されつるといことも判った。大きなトランスジーン はＹＡＣ中にクローン化されることができ、そして宿主酵母細胞から単離後に、 所望のトランスジーン配列を酵母由来ＹＡＣ配列から前もって分離することなく 哺乳動物細胞（例えば、ＥＳ細胞）中に効率的に移入されうるということ、及び 、このような酵母由来ＹＡＣ配列の存在は、不干渉でありうる（即ち、効果的な トランスジーンの組み込み及びトランスジーン転写単位の転写と共存できる）と いうことも判った。意外なことに、大きなトランスジーンは、連結された酵母由 来のＹＡＣ配列と共に又はなしで、効率的に哺乳動物細胞（例えば、ＥＳ細胞） 中に、選択マーカー例えばｎｅｏＲ発現カセットを含む連結されていないポリヌ クレオチドと共にコトランスフエクトされることができ、そして選択マーカー遺 伝子を有し選択マーカーを発現している細胞を選択することは、コトランスフエ クトされた大きなトランスジーン種をも有する可能性が高く、従って選択マーカ ー遺伝子を前もって連結（及びクローニング）する必要なしに大きなトランスジ ーンＤＮＡ配列を効率的に選択できる、ということがまた判った。大きなりＮＡ 上セグメント例えばＹＡＣクローンとして）を選択マーカー遺伝子と共に効率的 にコリボフエクシ３ンできるという発見は、典型的に操作が困難であった大きな 異種ＤＮＡセグメントを有するトランスジェニック補乳動物細胞及びトランスジ ェニック非ヒト動物の構築を初めて可能とした。従って、大きなポリヌクレオチ ド、典型的には５０〜１００ｋｂの大きさ、しばしば２５０ｋｂを超える大きさ 、場合により約５００ｋｂを超える大きさ、時々１０００ｋｂ以上の大きさのポ リヌクレオチドが、哺乳動物細胞中に効率的に導入されうる。哺乳動物細胞は、 ＥＳ細胞、例えばネズミＥＳ細胞（例えば、ＡＢ−１系統）でありうる。従って 得られたトランスジェニック細胞は胚盤胞中に注入されることができ、好ましく は非ヒトトランスジェニック動物中で発現される大きなりＮＡトランスジーンを 有するトランスジェニック非ヒト動物例えばトランスジェニックマウス又はトラ ンスジェニックラットを作りうる。本発明の方法はまた、体細胞例えば上皮細胞 （例えばケラチン細胞）、内皮細胞、造血細胞及びミオサイトでも行われつる。

胚幹細胞 胚幹（ＥＳ）細胞をトランスジーン宿主として用いれば、組み込まれた標的とさ れたトランスジーンを含む標的とされた遺伝子を有するトランスジェニック動物 を発生させることが可能である。要約すれば、この技術は、非相同組み込み又は 相同組み換えによって、遺伝子を生殖細胞組織に分化できる多能性細胞系列（例 えば、ネズミＥＳ細胞系統）中に導入することを含む。

大きなトランスジーンは、宿主ゲノムの染色体の位置中に非相同的に組み込まれ うる。或いは、生殖細胞系列遺伝子又は異種同族遺伝子（非相同遺伝子を含む） の一部の少な（とも一つの変化したコピーを含む相同標的構築物（これはトラン スジーンを含みうる）は、胚幹細胞のゲノム中に導入されうる。細胞の一部にお いて、導入されたＤＮＡは、非相同的に染色体の位置中に組み込まれるか又はマ ウス遺伝子の内在性（即ち、自然存在する）コピーと相同組み換えをおこして、 それを変化した構築物で置き換える。

新しく設計された遺伝子配列を含む細胞を宿主マウス胚盤胞中に注入し、該胚盤 胞を宿主雌牛に再着床させる。これらの胚のいくつかは、部分的に変異細胞系統 由来である生殖細胞の集団を有するキメラマウスへと発生する。それ故、キメラ マウスを繁殖することにより、導入された遺伝的損傷を含むマウスの新しい系統 を得ることができる（　Ｃａｐｅｃｃｈｌ　ら、１９８９年、５ｃｉｅｎｃｅ　 ％第２４４巻、第１２８８頁によってレビューされている。この文献は引用する ことにより本明細書の一部である）。

相同標的構築物のための標的効率は、一般に、標的ＤＮＡ（即ち交差標的配列） 中に存在する参照配列に実質的に相補的な標的トランスジーン部分（即ち、相同 領域）の長さに伴って増加する。あるＥＳ細胞クローン中でのリコンビナーゼの 存在は効率的な組み換えに要求される配列の同一性の程度を減少しうると認識さ れているが、一般には、標的効率は同質ＤＮＡの相同領域を用いることで最適化 される。

本発明はまた、非ヒト宿主種に対して異種（例えば、非相同）である遺伝子生成 物をエンコードするトランスジーンを提供する。このようなトランスジーンは典 型的には、構造遺伝子配列発現カセット（そこでは、連結されたプロモーター及 び好ましくはエンハンサ−が異種（例えば、非相同）タンパク質をエンコードす る構造配列の発現を誘導する）を含む。例えば、本発明は、哺乳動物エンハンサ −及びヒ１−ＡＰＰタンパク質をエンコードする構造配列に連結された少なくと も一つのヒトＡＰＰプロモーターを含むトランスジーンを提供する。このような トランスジーンを有するトランスジェニックマウスは、ヒトＡＰＰのｍＲＮＡを 発現する。好ましくは、異種（例えば、非相同）タンパク質をエンコードするポ リヌクレオチド配列は、シス作用転写調節領域（例えば、プロモーター、エンハ ンサ−）に作動可能に連結されて、非相同タンパク質が自然存在する非ヒト動物 中の同族内在性遺伝子の発現と同様の様式で発現される。従って、一般に、トラ ンスジーンの構成的なエンコードする配列を、同族内在性遺伝子中或いは近くに 自然に存在する転写調節因子に作動可能に連結するのが好ましい。しかしながら 、非相同タンパク質をエンコードするトランスジーンは、内在性転写調節配列に 隣接する標的とされる相同遺伝子標的構築物を用いることにより標的とされるこ とができ、調節配列への作動可能な連結は、ＥＳ細胞の標的とされる内在性染色 体の位置中へのトランスジーンの組み込み後に起きる。

選択マーカー遺伝子 選択マーカー遺伝子発現カセットは、典型的には、標的とされる宿主細胞に選択 表現型を与えるタンパク質又はポリペプチドをエンコードする構造配列に連結し た標的とされる宿主細胞（例えば、ＥＳ細胞）中で作動できるプロモーター、及 びポリアデニル化シグナルを含む。発現カセット中に含まれるプロモーターは、 構成要素であり、細胞タイプ特異的であり、段階特異的であり、及び／又は調節 できる（例えば、ホルモン例えばグルココルチコイドによる、即ち、ＭＭＴＶプ ロモーター）ものでありうるが、選択に先だって及び／又は選択中に発現される 。発現カセットは、場合により１以上のエンハンサ−（典型的には、プロモータ ーの上流の約３〜１０キロベース以内に連結される）を含みうる。しかしながら 、選択マーカーが相同標的構築物中に含まれる場合は、標的とされる内在性部位 の相同組み換えは、機能的内在性プロモーターの下流に選択マーカー構造配列を 置くように選ばれうる。そして標的構築物置換領域は、選択マーカーをエンコー ドするたった一つの構造配列を含み、転写を導く内在性プロモーターを当てにす るこより本明細書の一部である）。同様に、標的とされる内在性部位の近くに配 置されている内在性エンハンサ−を、エンハンサ−のない構築物中の選択マーカ ー遺伝子配列の転写を増強させるために当てにすることができる。好ましい本発 明の発現カセットは、選択薬剤耐性マーカー及び／又はＨ３Ｖチミジンキナーゼ 酵素をエンコードしかつ発現する。適当な薬剤耐性遺伝子は、例えば、ｇｐｔ　 （キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、これはマイコフェ ノール酸で選択されうる）、ｎｅｏ（ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ、 これはＧ４１８、ヒグロマイシン、又はビューロマイシンで選択されつる）、及 びＤＦＨＲ（ジヒドロ葉酸レダクターゼ、これはメトトレキセートにより選択さ れうる（ＭｕｌｌｉｇａｎとＢｅｒｇ、　１９８１年、肱旦−Ｎａｔ１．　Ａｃ ａｄ、Ｓｃｉ、（Ｕ、Ｓ、＾、）、第７８巻、第２０７２頁、５ｏｕｔｈｅｒ頁 、これらは引用することより本明細書の一部である）を含む。他の適当な選択マ ーカーも本技術分野において明らかである。

正しくコリボフエクションされた組み換え体の選択は、一般に、選択マーカー遺 伝子発現カセットが、内在的に組み込まれた発現カセットを有する標的とされた 細胞に選択表現型を与える機能的タンパク質（例えば、ｎｅｏ又はｇｐｔ　）を エンコードし、発現するところの、少なくとも正の選択を用い、従って、選択剤 （たとえばＧ　４１８、ビューロマイシンまたはマイコフェノール酸）を添加す ることにより、このような標的とされた細胞は組み込まれた発現カセットを有し ない細胞に比べ有利に成長し又は生存できる。選択マーカー遺伝子に関する更な る案内は、Ｓｍｊ、ｔｈとＢｅｒｇ、　１９８４年、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　 Ｈａｒｂｏｒ　Ｓｙｍｐ、　Ｑｕａｎｔ、　Ｂｉｏｌ、　、第４９巻、第１７１ 頁、３ｅｄｉｖｙと５ｈａｒｐ　、　１９８９年、Ｐｒｏｃ　、Ｎａｔｌ、Ａｃ ａｄ。

Ｓｃｉ、　（Ｕ、Ｓ、＾、）、第８６巻、第２２７頁、ＴｈｏｍａｓとＣａｐｅ ｃｃｈｉＳ１９８７年、既に引用（これらは引用することにより本明細書の一部 である）を含むい（つかの文献により可能である。

大きな異種ポリヌクレオチド 大きなポリヌクレオチドは、通常、ＹＡＣベクター中にクローン化される。例え ば、ＹＡＣクローニングベクター中のヒトゲノムＤＮＡライブラリーが、目的の 完全な遺伝子（例えば、ヒトＡＰＰ遺伝子、ヒト免疫グロブリン重鎮遺伝子座又 は軽鎖遺伝子座）又は完全な転写単位を含むこのような遺伝子の大部分に及ぶＹ ＡＣクローンを単離するために（例えば、ＰＣＲ又は標識ポリヌクレオチドプロ ーブハイブリダイゼーションによって）スクリーニングされつる。ＹＡＣライブ ラリーを作り、所望のＹＡＣを単離し、モしてＹＡＣＤＮＡを精製するための方 法は、技術文献（米国特許第４８８９８０６号明細書、Ｂｕｒｋｅら、１９８７ 年、５ｃｉｅ二、第２３６巻、第８０６頁、１ｕｒｒｙら、１９８６年、囲、第 ４５巻、第５２９頁、これらは引用することにより本明細書の一部である）に記 載されている。

いったん所望のＹＡＣクローンが単離され及び好ましくは脱タンパク質化されれ ば、酵母由来のＹＡＣ配列は、場合により、所望のクローン化された大きなトラ ンスジーン配列の外側で切断する１以上の制限酵素で消化することによって完全 に又は部分的に除かれうる。つまり、酵母由来の配列は、例えば、パルスゲル電 気泳動によりクローン化された挿入配列から分離される。好ましくは、本発明の 方法において、完全な再配列されていないＹＡＣクローンが大きなトランスシー ン又は大きな相同標的構築物として用いられる。

一つの観点において、好ましいＹＡＣクローンは、ヒトＡＰＰ遺伝子、ヒト免疫 グロブリン重鎮遺伝子座、ヒト免疫グロブリン軽鎖遺伝子座、ヒトα１抗トリプ シン遺伝子、デュシエンヌ筋ジストロフィー遺伝子、ハンチントン舞踏症関連遺 伝子、及び他の大きな構造遺伝子好ましくはヒト遺伝子からなる群より選ばれる 構造遺伝子配列に完全に又は部分的に及ぶクローンである。

好ましいＹＡＣクローニングベクターは、修飾されたｐＹ＾Ｃ３ベクター（Ｂｕ ｒｋｅら、１９８７年、既に引用、これは引用することにより本明細書の一部で ある）　、ｐＹＡＣｎｅｏ　（Ｔｒａｖｅｒら、１９８９年、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ ｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、（Ｕ、Ｓ、＾、）、第８６巻、第５８９８頁、これは 引用することにより本明細書の一部であにより本明細書の一部である）である。

カチオン性脂質 リボフエクション及びその基礎方法論での種々の変法は、公知の技術文献（米国 特許第５０４９３８６．４９４６７８７及び４８９７３５５号明細書）に記載さ れており、リポフエション剤は、現在市販されている（例えば、”Ｔｒａｎｓｆ ｅｃｔａｍ″及び”Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ“）。

ＤＮＡの効率的リボフエクシタンに適したカチオン性及び中性脂質は、技術文献 に記載されている。リボフエクションは、Ｆｅｌｇｎｅｒ　（Ｙ０９１／１７４ ２４、これは引用することにより本明細書の一部である）及び／又はカチオン性 脂質化（、１０９１／１６０２４、これは引用することにより本明細書の一部で ある）に従って作られたＤＮＡとの脂質複合体を形成することにより達成されつ る。技術文献に記載されている種々のりボフエクション方法は、本発明に従った コリポフェクションに適用されうる。例えば（限定されるものではないが）、一 般的なりポフェクション方法は以下の文献に記載されている：　Ｂｅｈｒら（１ ９８９）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　（Ｕ。

Ｓ、Ａ、）　８６：　６９８２；　Ｄｅｍｅｎｅｉｘら（１９９１）　Ｉｎｔ、 Ｊ、Ｄｅｖ、Ｂｉｏｌ。

３５＋　４８１；　Ｌｏｅｆｆｌｅｒら（１９９０）　Ｊ、Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ 、５４；　１８１２；　Ｂｅｎｎｅｔｔら（１９９２）Ｍｏ１．　Ｐｈａｒｍａ ｃｏｌ、４１：　１０２３；　Ｂｅｒｔｌｉｎｇら（１９９１）　Ｂｉｏｔｅｃ ｈｎｏｌ、＾ｐｐ１．　Ｂｉｏｃｈｅｉ、１３：　３９０；　Ｆｅｌｇｎｅｒら （１９８７）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　（Ｕ、Ｓ、Ａ 、）　８４：　７４１３；　ＦｅｌｇｎｅｒとＲｉｎｇｏｌｄ（１９８９）　Ｎ ａｔｕｒｅ　３３１：　３８７；　Ｇａｒｅｉｓら（１９９１）　Ｃｅ１１、Ｍ ｏ１．　Ｂｉｏｌ、３７．：　１９１；　Ｊａｒｎａｇｉｎら（１９９２）　Ｎ ｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ」胚、翻：　４２０５；　Ｊｉａｏら（１９９２）塾 上エエ駐μ■１月、５：　４００；Ｌｉｍら（１９９１）　Ｃ１ｒｃｕｌａｔｉ ｏｎ　８３：　２００７；　Ｍａｌｏｎｅら（１９８９）　Ｐｒ。

本明細書の一部である。

最近判ったポリカチオン性リポスペルミン化合物は、広範囲の細胞に見られ（Ｂ ｅｈｒら、１９８９年、既に引用）、ＤＮＡはこれらの化合物によって覆われて いる。更に、中性及びカチオン性脂質の組み合わせは、動物細胞のトランスフェ クションにおいて高い効率であることが示され、そして多くの細胞系統において 広範囲の効果が示されている（Ｒ。

ｓｅら、１９９１年、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　、第１０巻、第５２０頁） 。

リポフエクション複合体（又は、カチオン性の脂質化されたＤＮＡ複合体）は、 適当なカチオン性脂質組成物を１以上のポリヌクレオチド種例えば大きなトラン スジーン及び選択マーカー遺伝子発現カセットと混合することによって作られる 生成物と定義される。このようなコリポフエクション複合体は、適当な条件（例 えば、生理食塩緩衝液又は血清の入っている或いは入っていないＥＳ細胞培地、 ２０〜４５℃）下で哺乳動物細胞と接触させたときに哺乳動物細胞（好ましくは 哺乳動物細胞は、ＥＳ細胞例えばネズミＥＳ細胞である）中へのポリヌクレオチ ドの取り込みを引き起こすコリボフエクション複合体の形成をもたらす、ポリヌ クレオチドと脂質成分の相互作用によって特徴づけられる。

種々の適当なカチオン性脂質は、単独で又は１以上の他のカチオン性脂質種或い は中性脂質種と組み合わせて用いられうる。一般に、適当なカチオン性脂質は正 に荷電した頭部基（１以上の荷電）及び共有結合的に結合された脂肪酸尾からな る。適当なカチオン性脂質組成物は、カチオン性脂質−ポリアミンジオクタデシ ルアミドグリシルスペルミジン（ＤＯＧＳ）を含む”Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ” 　（ＰｒｏＭｅｇａ、　Ｍａｄｉｓｏｎ。

ＴＩ）である。ＤＯＴＭＡは、Ｎ−（２，３−ジ（９−（Ｚ）−オクタデセニル オキシ））−プロブ−１−Ｎ、Ｎ、Ｎ−トリメチルアンモニウムクロライドとし て知られている好ましい脂質である。Ｄ　Ｎ　Ａ　−ＤＯＴＭＡ複合体は、本質 的にはＤＯＴＭＡ及ＤＮＡから作られる。好ましいカチオン性脂質の他の具体例 は、ジオレオイルフォスファチジルエタノールアミン（ＰｔｄＥｔｎ、　ＤＯＰ Ｅ）　、ジオクタデシルアミドグリシル、Ｎ−トリメチルアンモニウムクロライ ド、Ｎ−トリメチルアンモニウムメチルサルフェート、ＤＯＲＩ及びＤＯＲＩ− エーテル（ＤＯＲＩＥ　）である。ＤＯＲＩは、Ｎ−［１−（２，３−ジオレオ イル）プロピル］−Ｎ、Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウムアセ テートであり、ＤＯＲＩＥはＮ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル ］−Ｎ、Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウムアセテートである。

ＤＯＴＡＰはＮ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ、Ｎ、 Ｎ−トリメチルアンモニウムメチルサルフェートであり、この脂質はエーテル結 合ではなくエステル結合を有し、細胞によって代謝されつる。

場合により、１以上のコリビド（ｃｏ−１ｉｐｉｄ）を適当なカチオン性脂質と 組み合わせることができる。場合により用いるコリビドとは、単独でも或いは他 の脂質成分と組み合わせてＤＮＡと安定なりＮＡ−脂質複合体を作りうる構造体 として理解されるべきであり、それは正にも負にも荷電されつるが、好ましくは 中性である。場合により用いられるコリピドの具体例は、ホスホリピド関連物質 例えばレシチン、ホスファチジルエタノールアミン、リゾレシチン、リゾホスフ ァチジンエタノールアミン、ホスファチジルセリン、フォスファチジルイノシト ール、スフィンゴミエリン、セファリン、カルシオリピン、ホスファチジル酸、 セレブロシド、ジセチルホスフエート、ジオレオイルフォスファチジルコリン（ ＤＯＰＣ）　、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）　、ジオレオ イルフォスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルフォスファチ ジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジオレイルフオスファチジルエタノールアミン （ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルフォスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、 パルミトイルオレオイルフオスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）及びジ オレオイルフオスファチジルエタノールアミン４−・（Ｎ−マレイミドメチル） −シクロヘキサン−１−カルボキシレーｔ−（ＤＯＰＥ−１１ａｌ）である。追 加的なリンを含まない脂質は、例えば、ステアリルアミン、ドデシルアミン、ヘ キサデシルアミン、アセチルパルミテート、グリセロールリシノーレート、ヘキ サデシルステアレート、イソプロピルミリステート、両性アクリルポリマー、ト リエタノールアミンラウリルスルフェート、アルキルアリールスルフェートポリ エチルオキシル化脂肪酸アミド、ジオクタデシルジメチル臭化アンモニウムなど である。

一般に、リボフエクション複合体を形成するために、−又は複数のポリヌクレオ チドを、文献及び本明細書の技術に従って、適当なカチオン性脂質と、１以上の コリピドの存在下又は不存在下で、約ｐｎ７．４〜？、８．２０〜３０℃で、組 み合わせる。２以上のポリヌクレオチド種をリボフエクション複合体中に組み入 れる場合は、本明細書中ではコリボフエクション複合体と呼ばれる。一般に、コ リボフエクション複合体は、大きなポリヌクレオチド（トランスジーン又は相同 標的構築物）及び選択マーカー遺伝子発現カセットを含む。コリボフエクション 複合体は、技術文献又は本明細書に記したりボフエクション条件下で、細胞培養 物、好ましくはＥＳ細胞に投与される。

一般的方法 本発明の好ましい方法は、大きな非相同トランスジーンを含む実質的に無傷のＹ ＡＣクローンを、トランスジェニック非ヒト動物を作るために用いられうる多能 性幹細胞系統中に移入し、次に宿主杯盤中に注入することである。本発明の特に 好ましい実施例は、連結されていない正の（例えば、ｎｅｏ　）選択発現カセッ トと共にコリボフエクションされたヒトＡＰＰ遺伝子標的構築物である。ヒトＡ ＰＰトランスジーンは、コリボフエクションされたＥＳ細胞が引き続き生存する のに適した条件下でマウスＥＳ細胞中に移入される（例えば、ｎｅｏと共にコリ ポフエクションにより）０リポフエクシヨンされたＥＳ細胞は、正の選択の選択 条件（例えば、Ｇ４１８の選択濃度）下で培養される。次いで、選択された細胞 は、本技術分野で公知の標準ＰＣＨに従ったＰＣＲ分析又はサザンプロテイング 法（米国特許第４６８３２０２号明細書、Ｅｒ１ｉｃｈら、１９９１年、５ｃｉ ｅｎｃｅ　、第２５２、第１６４３頁、これらは引用することにより本明細書の 一部である）により、正しく標的されたトランスジーン組み換えを有しているこ とが確かめられる。

次いで、正しく標的されたＥＳ細胞は、本技術分野で公知の方法（Ｃａｐｅｃｃ ｈｉ、　Ｍ、　、１９８９年、丁ＩＧ　、第５巻、第７０頁、Ｃａｐｅｃｃｈｉ 、　Ｍ、、１９８９年、５ｃｉｅｎｃｅ　、第２４４巻、第１２８８頁、これら は引用することにより本明細書の一部である）に従いキメラトランスジェニック 動物を作製するために適当な胚盤胞宿主へと移入される。いくつかの研究は既に 、所望のトランスフェクションされた細胞系統を成功裡に同定するためにＰＣＲ を用いている（　ＺｉｉｍｅｒとＧｒｕｓｓ　、　１９８９８８巻、第４２９４ 頁、これらは引用することにより本明細書の一部である）。この方法は、外来性 の標的トランスジーンを受け取った細胞数が大きいとき（即ち、エレクトロポレ ーシヨン又はリボフエクションを用いたとき）及び処理された細胞集団が大きく なれる場合は、非常に効果的である（　Ｃａｐｅｃｃｈｉ、　Ｍ、、１９８９年 、既に引用、これは引用することにより本明細書の一部である）。

トランスジェニック非ヒト動物（これは、相同的に標的とされる非ヒト動物を含 む）を作るためには、胚幹細胞（ＥＳ細胞）が好ましい。有糸分裂できない５Ｎ Ｌ７６／７細胞の支持細胞層（ＭｃＭａｈｏｎとＢｒａｄｌｅｙ　、　Ｃｅ１ｌ 、第６２巻、第１０７３〜１０８５頁、１９９０年）上で生育されたネズミＥＳ 細胞例えばＡＢ−１系統（実質的には（Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ、　Ｅ、Ｊ、、１９ ８ｅＳＳ　ｓ第７１〜１１２頁）に述べらている）は、相同遺伝子標的のために 用いられうる。他の適当なＥＳ系統は、８１４頁、Ｄ３系統（ＤｏｅｔｓｌＡｎ ａｎら、１９８５年、１．　Ｅｍｂｒｙｏｌ、　Ｅｘ　。

含むが、これには限定されない。う・ノド、）＼ムスター、ウシ及びブタのＥＳ 細胞も、ヒトＡＰＰ遺伝子配列を有する非相同トランスジーン・ンク非ヒト動物 を製造するための技術分野において入手可能である。大きなトランスジーン又は 特に標的とされた遺伝的交代を有するＥＳ細胞力）らのマウス系統の作製の成功 は、ＥＳ細胞の多能性（即ち、宿主胚盤胞に注入された後に、胚形成に参加し、 得られる動物の生殖細胞系統に対する寄与する、それらの能力）ｌこ依存する。

注入されたＥＳ細胞を含む胚盤胞は、擬妊娠ｌμヒト雌の子宮中で発生を許され 、そしてキメラマウスとして生まれる。得られたトランスジーン・ンクマウス（ ヨ、大きなトランスジーン／相同標的構築物を有する細胞］こつ０てキメラであ り、そして戻し交雑され、子孫の尾の生検でのＤＮＡのＰＣＲ又はサザンプロテ イング分析（こよってトランスジーン及び／又はＹＡＣ配列の存在ｌこつ（１て スフ１ノーニングされて、トランスジーン／相同標的構築物ｌこつ（旭てのトラ ンスジェニックマウスへテロ接合体を同定する。適当な交雑を行うことにより、 複数の大きなトランスジーン／相同組み換え構築物、及び場合により異なったＩ Ｄ相同タンパク質をエンコードするトランスジーン１こつ（１てトランスジェニ ック非ヒト動物ホモ接合体力（製造できる。このようなトランスジェニックヒト 動物は、移入されたトランスジーンと関連した種々の疾患の満足できる実験モデ ルである。

ある種の研究を行うためには、ヒトＡＰＰ配列を有しかつ発現するトランスジェ ニックラットが好ましいであろう。

毒性レベル、最適ＤＮＡ　：脂質比等を決定するための試行実験を、ｐＵＣ中の ２ｋｂ　ＰＧＫｎｅｏカセットを用いて、及びｐＹＰＰＮ　（無動原体腕中の５ Ｖ４０−ｎｅｏカセットの代りにＰ　Ｇ　Ｋ　ｎ　ｅ○カセ・ノドを含んで０る 修飾されたｐＹＡＣｎｅｏ）を用いて行なった。

これらの検量実験に用いたＹＡＣは、８５ｋｂのヒトＴｇＨ遺伝子フラグメント が、修飾されたｐＹＡＣｎｅｏベクター（クローニング部位をＥｃｏＲＩ　−＞ Ｎｏ　ｔｌに変更）中にクローン化されたものであった。従って、ＹＡＣｌｉ、 ベクター腕を含む１００ｋｂ長であった。

Ｄ　ＯＴ　ＭＡ　（ＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎＳＢ　ＲＬ、　ＢｅｔｈｅｓｄａＳＭ Ｄ）及びＤ　ＯＧ　Ｓ　（Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ、　ＰｒｏＭｅｇａ、　）ｌ ａｄｉｓｏｎ、　Ｗ　Ｉ　）をカチオン性脂質としてテストした。図１に、コリ ポフエクション複合体を形成するために用いることができる代表的な、カチオン 性脂質の化学構造を示す。ＥＳ細胞毒性カーブ１よ、それぞれについて行なわれ た。毒性効果は、ＤＯＴＭＡでは、３０ｇｇ／ｍｌのレベルで見られた。ＤＯＧ Ｓは、６０ｊｇ／ｍｌのレベルで毒性効果を示さなかった。

最適ＤＮＡ　：脂質比は、受容体としてｐＧＫｎｅｏを用いて両方の脂質につい て決定した。ＤＯＴＭＡ及びＤＯＧＳの最適値は、それぞれ１：１０及び１：５ ０（ＤＮＡ：脂質、重量二重量）であった。

それぞれの脂質について最適ＥＳ細胞数を決定した。最適温置時間及び条件を決 定した（どれ位の長さ及びいかなる緩衝液中が、両方のＤＮＡ　：脂質複合体に ついて最高のトランスフェクションを与えるか）。試行実験によると、無血清Ｄ ＭＥＭ中に、３７℃にて、３〜４時間ＤＮＡ　：　Ｄ。

ＧＳの１：５０の混合液とともに、温室した３〜５ＸＩＱ６のＥＳ細胞が、トラ ンスフェクシントの最大数を生じることが示された。これらの条件を、日常実験 的に、ＹＡＣリボフエクション実験のために用いた。

コリボフエクション手順において、ＰＧＫｎｅｏカセット、ｅｅｍ又はｐＹＰＮ Ｎのいずれかを有する連結されていないプラスミドにより、ｎｅｏ　が提供され た。ＤＮＡ　ニブラスミドモル比は、１４〜１：２０の間を変化した。キャリア ーＤＮＡ　（剪断されたニシン精子）の等重量をまた添加した。

酵母ブロックを、０．６７％低融点アガロース中にて、３，５×１０９細胞／ｍ ｌに調製した。ＹＡＣをＰＦＧＥによって単離した。外側のレーンをＥｔＢｒを 用いて染色し、染色されていない部分と並べた。ＹＡＣを含む薄い切片を、プレ イン（ｂｒａｉｎ）ナイフを用いて分離した。約１ｐｇのＹＡＣが、約１０ｍ１ のゲルから回収された。ゲルを、多量のゲラーゼ緩衝液（４０℃１Ｍ　ｂｉｓ４ ｒｉｓ　ｐＨ６，０，１＠麗ＥＤＴ＾、４０ｍＭ　ＮａＣ１）中で洗い、７０℃ で溶融し、４０℃に冷却し、そして、ＩＯＵのゲラーゼ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ　 Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、　Ｍａｄｉｓｏｎ、　ＷＩ）とともに１晩温置した 。

消化後、ｐＹＰＮＮ又はピセンター（ｐｉｃｅｎｔｅｒ）を、典型的なモル比１ ：４（ＹＡＣニブラスミド）で加えた。当重量の剪断されたニシン精子ＤＮＡを キャリアーとして添加した。約１１００ＩＩのＹＡＣを含んでいるアガロース消 化混合物を、すぐに、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍを用いて、最適ＤＮＡ　：脂質比 にて、３０分間、室温で温室した。ポリアミンは、添加しなかった。

ＥＳ細胞を洗浄し、トリプシン処理し、そして無血清ＤＭＥＭ中に再懸濁した。

３Ｘ１０６のＥＳ細胞（及び約１０５の支持細胞）を含んでいる９ｍＭの細胞懸 濁液を、６０ｎｍペトリ皿（組織培養プラスチックではない）上に塗布した。約 １ｍｌのＤＮＡ−脂質混合物をＤＭＥＭ中の細胞に加えて、３７℃で３〜４時間 温置した。次いで細胞をＤＭＥＭ＋ＦＢＳ中に集め、１００ｍｍ組織培養皿当た り１０６で塗布した。０４１８選択を２４時間後に行い、約１０日後にコロニー をつった。

典型的には、１〜２１１ｇのＹＡＣを実験毎に用いた。従って、約１０〜２０の 別々のりボフエクションを、１回の日程で行った。一般に、数百の６４１８耐性 クローンがつりあげられ、それらの少なくとも１〜２％は特定のＹＡＣ由未配列 を含んでいた。これらのうち、約１０％が、全ＹＡＣ挿入をカバーしているプロ ーブを用いた微細構造サザンブロツティング、ＰＦＧＥサザン分析及びＰＣＲ分 析によると、無傷のＹＡＣを有していた。

実施例２ ヒトアミロイド前駆タンパク質をエンコードするＹＡＣを有するマウスの製造 ＡＰＰ　ＹＡＣＤＮＡの調製、完全な長さのＡＰＰ遺伝子を含む６５０ｋｂのヒ トゲノムフラグメントを、Ｙａｓｈｉｎｇｔ。

ｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｙ　Ａ　Ｃライブライ−（Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　 Ｇｅｎｅｔｉｃｓｉｎ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　Ｌｉｂｒａｒｉａｎ、　Ｙａｓｈｉ ｒ＋ｇｔｏｎ　Ｌｌｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　５ｃｈｏｏｌｏｆ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ 、　Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ、　Ｍｉｓｓｏｕｒｉから入手）から酵母宿主株（クロ ーン＃Ｂ１４２Ｆ９）中の酵母人工染色体（ＹＡＣ）として単離した。酵母株を 、ＡＨＣ培地中で後期対数期まで生育し、０．６７％の低融点アガロース（Ｓｅ ａＰｌａｑｕｅ、　ＦＭＣＣｏｒｐ、　）中に３．５ｘ　１０”　ｃｅｌｌｓ／ ｉｌｌ：　テ懸１５Ｌ、ソシテ、フロック形成器（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）中にて冷却 した。無傷の酵母染色体ＤＮＡを以下のようにして調製した。３０の２５ｈｌの Ｂ１４２Ｆ９細胞のブロックを、５０ｍ１のＹ　Ｓ　Ｓ　（Ｙ　Ｓ　Ｓ　；　４ ｍｇ／ｍｌ　Ｎｏｖｏｚｙｍｅ　２３４（Ｎｏｖｏ　Ｎｏｒｄｉｓｋ）、Ｉ　Ｍ ソルビトール、１００ｍ１ｌ　ＥＤＴＡ、　５０ｍＭ　リン酸カリウム、ｐＨ１ ５，５）を含む１５０ｍ１のペトリ皿中で、３７℃で、３０分間ぐるぐるかき混 ぜた。ブロックを、Ｔ　Ｅ　（ＩＯＭ　Ｔｒｉｓ　ｐＨ７，５，１ｍＭ　ＥＤＴ Ａ）中で１回洗い、５０ｍ１のＬＤＳ　（ＬＤＳ・１％リチウムドデシルスルフ ェート、１％サルコンル、１００ｍＭ　ＥＤＴＡ）中で、３０〜６０分間、３７ ℃でぐるぐるかき混ぜた。ＬＤＳを５０ｍ１の滅菌ピペットで除き、そしてブロ ックを、新鮮な、ＬＤＳ５０１１１中で、１晩ぐるぐるかき混ぜた。ブロックを 数回５０１Ｍ　ＥＤＴＡ中でさっと洗い、５０ｍＭ　ＥＤＴＡ中に４℃で保存し た。調製したブロックの１００μｌの部分を、０．２５倍のＴＢＥ中の１％低融 点アガロースの各ウェル（１４Ｘ　２５ｃｍＣＨＥ　Ｆゲル、１０ウエルゲル櫛 、Ｂｉｏ・［ｉ。

ｄ）にのせた。酵母染色体をパルス場ゲル電気泳動（ＣＨＥ　Ｆ　−Ｄ　ＲＩ　 ＬＳＢｉｏＲａｄ）によってスイッチ時間６０分、２００Ｖ、　１４℃、４８時 間の条件にて、分離した。ゲルの先端のレーンを除き、０．５ｐｇ／ｍｌの臭化 エチジウム中にて２時間染色し、ＵＶｌ−ランスミツターで分離された染色体を 見えるようにした。これらの条件下で、６５０ｋｂのＹＡＣが、最も近い内在性 酵母染色体から３〜５＋Ｉｎの距離で分離された。

ゲルの部分に刻み目をつけて、６５０ｋｂのＹＡＣの位置を示し、そして、それ らの部分をゲルの残りと再び並べた。６５０ｋｂのＹＡＣを含んでいるゲルの２ ｍＭ巾のスライスを、プレインナイフ（Ｒｏｂｏｚ　Ｓｕｒｇｉｃａｌ　Ｉｎ５ ｔｒｕｉｎｅｔ　Ｃｏ）を用いて単離し、５０ｎ＋ｊｌ　ＥＤＴＡ中にて４℃に て保存した。約５μｇのＹＡＣＤＮＡが、約１０＋ａｌのゲル中に単離された。

ＹＡＣＤＮＡを含むアガローススライスを、ゲラーゼ緩衝液（４０ｍＭ　ｂｉｓ −Ｔｒｉｓ　ｐＨ６，０，１ｍＭ　ＥＤＴＡ、　４（ｌｎＭ　ＮａＣ１）中にて 平衡化し、完全に溶液となるまで７０℃で２０分間溶融し、そして４５℃まで冷 却した。ゲラーゼ（２５Ｕ　５Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ 、　Ｍａｄｉｓｏｎ、　ＩＩＩ　）を加え、溶融されたアガロース混合液を４５ ℃で９０分間温温置て、ＤＮＡ−アガロース混合物を液化した。

ＡＰＰ　ＹＡＣのＥＳ細胞中への導入 胚幹細胞（ＡＢ−１）をＰＢＳで洗浄し、トリプシン処理し、そして無血清ＥＳ 培地（ＤＭＥＭ、　１倍量のグルタミン、ペニシリン／ストレプトマイシン、１ １１Ｍ２−メルカプトエタノール、１倍量のＮＥＡＡ）中に懸濁した。９ｍｌの 無血清ＥＳ細胞懸濁液中の約５Ｘ１０６細胞を６０％ｍのペトリ（組織培養処理 をしていない）皿のそれぞれに塗布した。選択マーカー　（Ｐ（ＪｎｅｏＡ＋Ｒ 、ネオマイシン耐性遺伝子に融合したＰ（Ｊプロモーターを含む、Ｒｕｄｎｉｃ ｋｉら、１９８８年、Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、、第８巻、第４０６頁 、Ｒｕｄｎｉｃｋｉら、１９８９年、Ｂｉｏｃｈｅｍ。

Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、、第６７巻、第５９０頁、これらは引用することにより 本明細書の一部である）を含む直線化したプラスミドを、１ｍｌのゲラーゼ処理 したＹＡＣＤＮＡに、２．１（プラスミド・ＹＡＣ）のモルにて加えた。カチオ ン性脂質（丁ｒａｎｓｆｅｃｔａｎ、　ＰｒｏＭｅｇａ、　Ｍａｄｉｓｏｎ、　 ＴＩ　）を、５０：１　（Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ　：　Ｄ　Ｎ　Ａ　）の重量 １重量比にて加え、混合液を穏やかに一回ひっくり返して混合し、そして室温に て約３０分間温室した。次いでＤＮＡ　：脂質混合液のｌｌ１ｌを、それぞれＥ Ｓ細胞の６０ｍｍの皿に加え、３７℃の００２インキユベーター中にて４時間温 室した。次いで、細胞を滅菌した２５０１１１のボトルに移し、等体積のＥＳ培 地（上記と同じ、但し１５％のウシ胎児血清を含んでいる）を加えた。細胞を穏 やかなピペッティングで皿から取り出し、１５％のウシ胎児血清を含む等体積の ＥＳ培地と合わせた。この細胞懸濁液を、１５１１１ずつ、有糸分裂活性を有さ ない５ＮＬ７６／７繊維芽細胞の支持細胞（ｌｌｃＭａｈｏｎ　（！：　Ｂｒａ ｄｌｅｙ　、１９９０年、囲、第６２巻、第１０７３頁、これは引用することに より本明細書の一部である）を含んだ１００■の組織培養プレートに移し、そし て組織培養インキュベーターに戻し２４時間装いた。２４時間後、培地を、１０ ％ウシ胎児血清及び４００μｇ／ｍｌのＧ４１８を含むＥＳ培地に代えた。４８ 時間ごとに培地を代えた。

７日後に、全部で３６６の０４１８耐性コロニーが測定された。２４０コロニー のそれぞれを、別々に、０．２５％のトリプシンの入った、カルシウム無し一マ グネシウム無しＰＢＳの５０μｌを含む９６ウエルマイクロタイターデイシユの ウェルに移した。１５分後、血清を含む培地を５０μｌ加え、粉砕によりコロニ ーを解離した。そして、細胞懸濁液を、培地及び支持細胞（上記）を含む９６ウ エルプレートに重複して移した。４〜５日後、１連のディシュを慣用の方法に従 って凍結した（　Ｒａｍ１ｒｅｚ−３ｏｉ　ｌｉｓら、Ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　Ｔｅ ｃｈｎｉｑｕｅｓ　ｉｎ　Ｍｏｕｓｅ　Ｄｅｖｅｌｏｐｅｎｅｎｔ　、　１９９ ２年、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｊ、ｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ。

これは引用することによ本明細書の一部である）。細胞を、５０μｌのトリプシ ン中で解離し、５０μｌの凍培地（２０％ＤＭＳｏ、　２０％ウシ飴児血清を含 むＤＭＥＭ）と混合した。１００μｍの滅菌シリコーン油を、それぞれのウェル 中の細胞懸濁液の上に重層し、そしてプレートを、５ｔｙｒｏｆｏａｎコンテナ 中に置き、−８０℃で凍結した。

ＡＰＰ配列を含むＥＳクローンの同定 リボフェクタントＥＳクローンを含む他の一連のマイクロタイターディシュを、 ＰＣＲ分析のためのＤＮＡを調製するために用いた。５０μｌの溶解緩衝液（５ ０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　ｐＨ８゜０、２００ｍＭ　ＮａＣ１，２５ｍＭ　ＥＤＴＡ、 　０．２％ＳＤＳ、１ｍｇ／ｍｌ　プロティンキナーゼＫ）をそれぞれのウェル に加えた（　Ｒａｍ１ｒｅｚ−３゜ｌｉｓ　ら、１９９２年、Ａｎａｌ、　Ｂｉ ｏｃｈｅｍ、、第２０１巻、第３３１頁、これは引用することにより本明細書の 一部である）。−晩５５℃で温室後、それぞれのウェルに５μｌの２．５Ｍ　Ｎ ａＣ１及び９５μｍの１００％エタノールを加えた。ディシュを穏やかに室温で ６０分間ぐるぐると回してＤＮＡを沈降させた。次いで、ウェルを５回、７０％ エタノールでさっと洗い、そして３７℃で乾燥させた。ＤＮＡを、加湿インキュ ベーター中で、３７℃にて、１００　μｍのＨ２０に、−晩かけて、再び懸濁し た。

個々のＤＮＡ試料を、ＰＣＲのために、縦及び横について集め（図２）、そして 集めたもの（プール）を、以下のプライマーを用いてＰＣＲによりＡＰＰ配列に ついて分析した（　Ｆｉｄａｎｉら、Ｈｕｍａｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｇｅｎ ｅｔｉｃｓ、第１巻、第１６５〜１６８頁、１９９２年の方法を改変した）。

ＡＰ　Ｐ−ＰＡ　：　５’−ＧＣＴ　ＴＴＴ　ＧＡＣＧＴＴ　ＧＧＧ　ＧＧＴ　 ＴＡ−３’ＡＰＰ−ＰＢ２・　５°−ＴＴＣＧＴＧ　ＡＡＣＡＧＴ　ＧＧＧ　Ａ ＧＧ　ＧＡ−３’ＡＰＰ−１７Ａ：　５°−ＡＴＡ　ＡＣＣＴＣＡ　ＴＣＣＡＡ Ａ　ＴＧＴ　ＣＣＣＣ−３′ ＡＰＰ−１７８：　５’−ＧＴＡ　ＡＣＣＣＡＡ　ＧＣＡ　ＴＣＡ　ＴＧＧ　Ａ ＡＧ　Ｃ−３゜ ＡＰＰ−ＰＡ／ＰＢ２は、ヒトＡＰＰ遺伝子のプロモーター領域に特異的なプラ イマーを表し、ＡＰＰ７Ａ／７Ｂは、エキラン７に特異的であり、ＡＰＰ１７Ａ ／１７Ｂはエキラン１７に特異的である。

−ｊ−ルのＰｃＲ分析は、４２クローンがプロモーター及びエキフン１フ配列を 共に有している可能性を示した（図３）。４２クロ一ン個々のＰＣＲ分析により 、６クローン（番号２３．２４．１７６、２１３．２１９．２３０　）がプロモ ーター及びエキフン１フ配列を共に有していることが示された（図４）。

これらのクローンは培養により増やされ、そしてバイアル中にて液体窒素中で凍 結された。これらの細胞を、ＰＦＧＥ分析のためにアガロースブロック中に充填 し、そしてＲＮＡ単離のために収集した。

ＡＰＰ配列を含むＥＳクローンの構造分析ＥＳクローンにより運ばれたＡＰＰ　 ＹＡＣの組み込み率は、まず以下に示すレアカッター（ｒａｒｅ　ｃｕｔｔｅｒ 　）フィンガープリント技術を用いて推定された。ヒトＤＮＡを鍼灸に切断しな い制限酵素をヒトａｌｕフラグメントプローブに対合するフラグメントのパター ンを決定するために用いた。レアカッターは、しばしば、ジヌクレオチドＣｐＧ を含んでおり、哺乳動物細胞はしばしばＣｐＧジヌクレオチドをメチル化するこ とにより、それらを含む殆どの制限部位を消化に対して耐性にする。しかしなが ら、酵母細胞は、ＣｐＧをメチル化できない。従って、所与のフラグメント中の ＣｐＧを含む制限部位のパターンは、酵母中又は哺乳動物細胞中のいずれかでフ ラグメントがＹＡＣとして増殖されるかに依存する。従って、認識配列中にＣｐ Ｇがないレアカッターのみが、ＹＡＣからのａｌｕ含有フラグメントの消化パタ ーンを作るために用いられる。

Ｂ１４２Ｆ９アガロースブロツクを、制限酵素Ｓｆｉ　Ｉ　、Ｐａｃ　Ｉ、Ｓｖ ａ　Ｉ　、　Ｐｉｅ　Ｉ及びＡｐａ　Ｉを用いて完全に消化し、Ａｌｕフラグメ ントに対するプローブとして全ヒトＤＮＡを用いてＰＦＧＥサザンブロッティン グにより分析した（図５）。

Ｓｆｉ　Ｉ消化によって生じたバンドのパターンは、３０ｋｂ〜２２０ｋｂの間 に均一に分布するバンドを生じるので、参照パターンとして用いた。もしＹＡＣ が、ＥＳ細胞中に無傷で組み込まれていれば、Ｓｆｉ　Ｉ消化は、末端フラグメ ントを除いて、同様のバンドのパターンを生じると期待される。末端フラグメン トは、Ｓｆｉ　Ｉ消化物をｐＢＲ３２２をプローブとして再び調べることにより 容易に同定されつる。この場合は、フラグメントの完全なセットが部分的消化マ ツピングにより配列される。要約すれば、Ｂ１４２Ｆ９ブロツクは、一連の範囲 のＳｆｉ　Ｉ濃度で消化され、ＰＦＧＥで分離され、そしてｐＢＲ３２２の２． ５ｋｂ　（ｔｒｐ腕特異的）又は１．６ｋｂ　（ｕｒａ腕特異的）　ＢａｍＥ　 Ｉ−Ｐｖｕｎラグメントでプローブして探査される。

従って、部分的消化の特定のレベルにおいて、バンドの梯子が生じた。それぞれ のバンドは、隣接するＳｆｉ　Ｉ部位への距離により、最近傍のものと異なる。

６のＥＳ細胞系統を、Ｓｆｉ　Ｉにより完全に消化し、非常に厳しい条件下で、 全ヒトＤＮＡをプローブとして探査した。６の系統の内、たった３つ（２４，１ ７６，２３０）が、ＡＰＰ　ＹＡＣからの参照パターンに一致するバンドのパタ ーンを示した。レアカッターフィンガープリント方法は、ＹＡＣ中にクローン化 されたフラグメントの配列が判らな（とも良いので、ヒトＤＮＡを含むいずれの ＹＡＣの分析にも適用できる。更に、標的哺乳動物細胞系統中に見いだされない 他の種からの繰り返し因子を探査するのであれば、この方法は他の哺乳動物細胞 系統中に他の外来ＤＮＡを含んだＹＡＣの構造を分析するために用いられうる。

ＡＰＰ　ＹＡＣを含んだＥＳクローンの転写分析６のＥＳ系統を、ＰＣＨにより 転写について分析した。

全ＲＮＡを標準グアニジンイソチオシアネート／塩化リチウム法（５ａｎｂｒＯ Ｏｋら、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　）により、それぞれの細胞系統 から調製した。相補的ＤＮＡをオリゴ−ｄＴプライマーを用いて調製し、そして ｃ　ＤＮＡを、ＰＣＲにより、以下に描いたエキタン６及びエキラン９由来のＰ ＣＲプライマーを用いてヒトＡＰＰ遺伝子のスプライス生成物について分析した （Ｇｏｌｄｅら、Ｎｅｕｒｏｎ、第４巻、第２５３〜２６７頁、１９９０を改変 ）。マウスＡＰＰ　ｃＤＮＡの不適当な増幅を排除するために、それぞれのオリ ゴマーの３′末端ヌクレオチドを、ヒトｃＤＮＡ配列に特異的であるが、マウス のｃＤＮＡ配列には一致しないように選択した。マウスＡＰＰ　ｃＤＮＡに特異 的なＰＣＲオリゴマーもまた、調製した。

ヒトＡＰＰ特異的オリゴマー ＡＰＰ−ＨＡＳＩ・　５’　−ＣＡＧ　ＧＡＡ　ＴＴＣＣＡＣＣＡＣＡＧＡ　Ｇ ＴＣＴＧＴ　ＧＧＡ　Ａ−３゜ ＡＰＰ−ＨＡＳ２：　５°−ＣＡＧ　ＧＡＴ　ＣＣＧ　ＴＧＴ　ＣＴＣＧＡＧ　 ＡＴＡ　ＣＴＴ　ＧＴＣＡ−３’ マウスＡＰＰ特異的オリゴマー ＡＰＰ−ＭＡＳＩ・　５’　−ＣＡＧ　ＧＡＡ　ＴＴＣＣＡＣＣＡＣＴＧＡ　Ｇ ＴＣＣＧＴ　ＧＧＡ　Ｇ−３゜ ＡＰＰ−ＭＡＳ２・　５’　−ＣＡＧ　ＧＡＴ　ＣＣＧ　ＴＧＴ　ＣＴＣＣＡＧ 　ＧＴＡ　ＣＴＴ　ＧＴＣＧ−３’ クローン２４．１７６及び２３０においては、タン／＜り質の７７０．７５１及 び６９５アミノ酸の形をエンコードする交互的；こスプライスされたヒトＡＰＰ 転写物を示す予期されたＰＣＲ／＜ンドを示した（図７）。クローン２３．２１ ３及び２１９（よ、ＰＣＲで検出できる転写物を含んでいなかったので、ヒトＡ ＰＰ特異的オリゴマーがＥＳ細胞系統に対して内在性のマウスＡＰＰ転写物から のバンドを増幅しな（１ことを示す負の対照として用いられる。更に、ＲＴ−Ｐ ＣＲ分析（よ、クローン２４．１７６及び２３０が無傷のＹＡＣを含んでおり一 方クローン２３．２１３及び２１９が含まないと予測したレア力・ツタ−フィン ガープリント分析の結果を確認し、証明した。

ＥＳ細胞中のＡＰＰ転写物の定量分析 ＲＴ−ＰＣＲ分析は定量的であるので、ＲＮａｓｅ防護は分析がＥＳ系統中の交 互的にスプライスされたヒトＡＰＰ転写物の定量のために用いられる。ＲＮａｓ ｅプローブは、ベクターｐｓＰ７２中に３１０ｋｂＲＴ　−Ｐ　ＣＲ生成物をＥ ｃｏＲｌ　−ＢａｍＢ　Ｉフラメントとしてクローニングすること（こよって作 られた（図８）。得られたプラスミド、ｐＨ１ＡＰＰ　ｉｔ、ＵｐａＩ部位で直 線化され、そしてアンチセンス転写物力＜ＳＰ６ブモーターから作られた。ＲＮ ａｓｅ防護分析は、標準方法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌ ｏｎｉｎｇ）に従って行われた。

或いは、Ｓ１ヌクレア一ゼ防護分析を、転写物の定量のために用いた。ｐＨ１Ａ ＰＰは、Ｘｈｏ　Ｉ及び１ｌｐａ　Ｉで消化され、４４６ｔ）ｐのフラグメント を遊離する。二本鎖ラグメントはフレノウを用いて末端標識され、変性され、ヒ トＡＰＰ配列を有するＥＳ系統からのＲＮＡ試料に対合され、そして８１分析を 標準方法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　）に従 って行われた。

更に、ヒトＡＰＰタンパク質の発現は、ＥＳ細胞系統及びトランスジェニック動 物の組織からのヒトＡＰＰタンパク質に特異的な抗体を用いたヒトＡＰＰの免疫 沈降により決定されつる。このような抗体は、標準的な組織切片の免疫組織化学 分析により直接にヒトＡＰＰを検出できる。

トランスジェニックマウス中でのヒトＡＰＰ発現の分析上記の定量及び定性分析 はまた、これらのＥＳ系統由来のトランスジェニックマウスの組織中のヒトＡＰ Ｐ遺伝子の分析にも適用できる。

クローン２３．２１３及び２１９は、（Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ編、Ｔｅｒａｔｏｃ ａｒｃｉｎｏｍａｓ　ａｎｄ　Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅ１ｌｓ）に 記載の通りにしてキメラ始祖を作るために胚盤胞中へ注入された。始祖は、野生 型マウスへと繁殖され、ＡＰＰ　ＹＡＣを有するＦ１動物を生み出す。

アルツハイマー病のマウスモデル 野生型ヒト（又はマウス）ＡＰＰタンパク質の過発現は、神経細繊維の絡み形成 、斑形成及び神経系の機能不全を含むアルツハイマー病の表現型の特徴をもたら しつる。その目的に向かって、ＡＰＰ　ＹＡＣを発現する種々のマウス系統が、 ヒトＡＰＰ遺伝子の数及びその結果の発現を増やすために交配される。

或いは、家族制アルツハイマー病（コドン　７１７：Ｖ−Ｉ、Ｆ又はＧ）及び／ 又は遺伝性のアミロイド−シスに伴う脳出血、Ｄｕｔｃｈタイプ（ｎｃｎｖ＾− Ｄ１コドン　６９３：ｇｌｕ　−ｇｉｎ　）に関連すると同定された変異は、標 準の酵母分子遺伝学技術例えば変異を含むＡＰＰ遺伝子のサブクローン化された フラグメントを有するプラスミドの挿入／取り出しを用いて、又は酵母のオリゴ ヌクレオチド指揮形質転換（ＧｕｔｈｒｉｅとＦｉｎｋＳＧｕｉｄｅ　ｔｏ　Ｙ ｅａｓｔ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　ａｎｄ　１ｉｏｌｅｃｕｌ ａ　Ｂｉｏｌｏｇｙ）により、ＹＡＣ上に含まれるヒトＡＰＰ遺伝子に導入され つる。これらの変異したＡＰＰ遺伝子を有するＹＡＣは、上記の方法を用いてト ランスジェニックマウス中に導入されつる。他の自然存在するヒトＡＰＰ病の対 立遺伝子配列もまた用いられつる。これらは、コドン６９２　（Ａｌａ　→Ｇｌ ｙ　）　、：Ｉトン６９２　（Ｇｌｕ　→Ｇｌｎ又はＧｌｙ　）　、及びコドン ７１３　（Ａｌａ　−Ｖａｌ　）及び頁、ｉｌｕ　ｌ　Ｌａｎら、１９９２年、 Ｎａｔｕｒｅ　Ｇｅｎｅｔ、　、第１巻、第５０５頁、Ｌｅｖｙら、１９９０年 、５ｃｉｅｎｃｅ、第２４８巻、第１１２４頁、これらは引用することにより本 明細書の一部である）に記載されているその他を含むが、これらには限定されな い。

実施例３ 酵母人工染色体中にクローン化されたヒト免疫グロブリン遺伝子を発現するトラ ンスジェニックマウスヒト重鎮免疫グロブリン遺伝子の８５ｋｂフラグメントが 、ＹＡＣとしてクローン化され、実質的に無傷の組込まれたＹＡＣを有する胚幹 細胞系列がＹＡＣ及び連結されていない選択マーカーのコリボフエクションによ り誘導された。

キメラ祖先動物は、胚盤胞インジェクションにより作られ、ＹＡＣクローンにつ いてトランスジェニックな子孫が得られた。これら子孫からの血清の、ヒト重鎮 の存在についての分析は、ＹＡＣに運ばれる免疫プロプリン遺伝子フラグメント の発現を示した。酵母スフェロプラストと哺乳動物細胞との融合と違って、酵母 染色体ＤＮＡは、コリボフエクンヨン法によって導入される必要がない。なぜな ら、ＹＡＣは典型的にはまず、パルス場（フィールド）ゲル電気泳動（Ｐ　Ｆ　 Ｇ　Ｅ）のような分離法により酵母染色体から分離されるからである。ＹＡＣは 、連結されていない選択マーカープラスミドと共にコボリフエクションによりＥ Ｓ細胞中に導入された。このコボリフエクション戦略は、レトロフイテイング（ ｒｅｔｒｏｆｉｔｔｉｎｇ）ベクターが再構築される又はＹＡＣ中に組み換えら れる必要がなく、組み換え欠陥宿主中に有されるＹＡＣを用いつる点で、修飾さ れたＹＡＣのリポフェクトンと異なる。マイクロインジェクションによるアプロ ーチと対照的に、無傷のＹＡＣＤＮＡの精製における技術的ハードの故に及びマ イクロインジェクションの間にＤＮＡに与えられる高剪断力の故に、マイクロイ ンジェクションに比べてコリポフエクションによって、より大きなＹＡＣを導入 できる。更に、酵母スフェロプラストと哺乳動物細胞の融合（そこでは酵母染色 体のいくつかがＹＡＣ５°６と一体化する）と違って、酵母染色体ＤＮＡはコリ ボフエクション中で導入されない。なぜなら、ＹＡＣは初めに、パルス場ゲル電 気泳動により単離されるからである。

無傷のＹＡＣを有するＥＳ細胞の胚盤胞インジェクションにより、トランスジェ ニックマウスが作られた。ＹＡＣは、生殖細胞系列を通して無傷のまま保たれ、 ヒト重鎖抗体サブユニットがトランスジェニック子孫の血清中で検出再配置され ていないヒト免疫グロブリン重鎮座の８５ｋｂＳｐｅ！フラグメントが単離され た。ヒト重鎮免疫グロブリン（Ｈ）鎖遺伝子の８５ｋｂＳｐｅ　Ｉフラグメント は、ヒトＩｇＭ重鎖分子の正しい再配置及び発現のために必要な各因子の少なヒ ト重鎮免疫グロブリン遺伝子の８５ｋｂＳｐｅｌ制限フラグメントは、ｖ６、機 能多様性（Ｄ）セグメント、６つすべての結合（Ｊ）セグメント、及びＣμ定常 領域セグメントを５ｈｉｎら（１９９１）ＥＭＢＯＪ、第１０巻第３６４１頁） 。新鮮なヒト精液を採取し、ゲノムＤＮＡが５ｔｒａｕｓｓら（１９９２）Ｍａ ｉｍ、　Ｇｅｎｏｍｅ第２巻第１５０頁）に記載されるようにアガロースブロッ ク中に調製された。サイズ選択された（５０〜１００ｋｂ）　５ｐｅｌ完全消化 物ＹＡＣライブラリーが、クローニング部位として動原体近くのＳｐｅ　１部位 を用いて、酵母宿主株ＡＢ１３８０において、ｐＹＡＣｎｅＯＲ中に調製された 。サイズ選択された（５０〜１００ｋｂ）　５ｐｅｌ完全消化物ＹＡＣライブラ リーが、ＹＡＣベクターｐＹＡＣｎｅｏＲ中に作られ、ヒトＣμに対し特異的な プローブとのコロニーハイブリダイゼーション（コロニ一対合）によりスクリー ンされた（　Ｔｒａｖｅｒら（１９８９）Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃ ｉ、（Ｕ、Ｓ、Ａ））第８６巻第５８９８頁）。

約１８．０００の主たる形質転換体のうち、１つの陽性クローン（Ｊｌ）が同定 された。酵母ミトコンドリアＤＮＡがしばしば、パルス場ゲル電気泳動において ＹＡＣをおおいに隠すので、ミトコンドリアＤＮＡを欠（ｒ’　ブチシト突然変 異体がＥｔＢｒ処理により選択され、Ｊｌ、３Ｐと名付けられた。１つのサブク ローン、Ｊｌ、３Ｐが３．５Ｘ１０９細胞／１でアガロースブロック中に乗せら れ、無傷の酵母染色体ＤＮＡが調製された（　Ｓｍ１ｔｈら（１９９０）Ｐｒｏ ｃ、　Ｎａｔｌ、人ｃａｄ、　Ｓｃｉ。

（Ｕ、　Ｓ、　Ａ、　）第８７巻第８２４２頁）。ＹＡＣＤＮＡが、低融点の準 備したＣＨＥＦゲル（Ｂｉｏｒａｄ）から３〜４　ｍｕ輻幅ゲルスライス中単離 された。ゲルスライスは、ｂ−アガロース緩衝液中で平衡化され、７０℃で２０ 分間溶融され、４５℃に冷却され、１０単位のアガラーゼにより４５℃で一夜消 化された。

ＹＡＣＪｌ、３Ｐの特性づけ Ｊｌ、３Ｐインサートの信憑性が、制限マツピング及びサザン分析により決定さ れた。ｐＹＡＣｎｅｏの動原体及び無動原体腕（アーム）におけるバクテリア選 択マーカーを用いて、インサートの端をサブクーロン化した。末端フラグメント の微細構造制限分析は、領域の発表されているマツプ及び配列と完全に一致しく 　Ｆａｘら、酵母ミトコンドリア遺伝子の分析と操作、酵母遺伝学及び分子生物 学へのガイド（１９９１）Ｇｕｔｈｒｉｅ　ＣとＦｉｎｋ　Ｇ編、Ａｃａｄｅｍ ｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、サンジエゴ、カリフォールニアＨＴｏｒｄら（１９８９）　 Ｉｎｔ、　Ｉ＋ｉ＋ａｕｎｏｌ。

第１巻第２９６頁）、ベクターアームに対するインサートのオリエンテーション を定義した。該オリエンテーションは更に、ｖＦｉ６配列のための無動原体イン サートのＰＣＲ分析、及び動原体インサートのＣμプローブとのハイブリダイゼ ーシヨン（対合）によって検証された。Ｃμ領領域サザン分析は、発表されてい るマツプ及び制限分析と一致した（　Ｈｏｆｋｅｒら、（１９８９）ＰｒｏＣ， Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、（Ｕ、Ｓ、Ａ、）第８６巻第５５８７頁）。ヒト 重鎮の機能多様性セグメントは、Ｄセグメントの４倍の多形繰返しを含む３５ｋ ｂスパン中に含まれている。Ｊｌ、３ＰＹＡＣのサザン分析は、Ｄ領域の「制限 フラグメント指紋」を作り、その中でＹＡＣ中のＤ特異的バンドのすべてがヒト ゲノムＤＮＡ中に存在した。

ＥＳ細胞中へのＪｌ、３Ｐ　ＹＡＣのコリポフエクションＪ１．３Ｐ　ＹＡＣが 、マウスＰＧＫプロモーターにより作動されるｎｅｏｒ遺伝子を有する連結され て０なｌ、１線形化されたプラスミドと共にコリポフエクションされた（Ｓｏｒ ｉａｎｏら（１９９１）Ｃｅｌｌ第６４巻第８９３頁）。

選択マーカープラスミド プラスミドは、マウスホスホグリセラードキナーゼ−１プロモーター、及びＰＧ Ｋ−１ポリ（Ａ）部位の転写コントロール下のｎｅｏ遺伝子より成る発現カセ・ シトを含む５ｋｂプラスミドである（Ｔｙｂｕｌｅｗｉｃｚら（１９９１）Ｃｅ １１第４０巻第２７１頁）。プラスミドｐＹＰＮＮは、ＳＶ４０プロモーター− ｎｅｏｒカセットの代りにＰＧＫｎ　ｅ　ｏカセ・シトを含むｐＹＡＣｎｅｏの 突然変異体であり、ＹＡＣｎ　ｅ　ｏの４．５ｋｂ　Ｓａ１１Ａｐａ１７ラグメ ントを、ＰＧＫプロモーター、ｎｅ。

コーディング領域及びＰ　Ｇ　Ｋ　ｐ　（Ａ）シグナルを含む１．５ｋｂｓａｌ １人ｐａｌフラグメントで交換して構築される。プラスミドは、５ａｉｌ（ａ） 又はＮｏｔｌ（ｐＹＰＮＮ）により線形化された。

ＥＳ細胞中へのＹＡＣＤＮＡのリボフエクション消化されたアガロース／ＤＮＡ 混合物は、ポリスチレン管（Ｆａｌｃｏｎ）中の１ｍ１（約１０１００ｎ部分へ と分けられ、１１００ｎ又は２０ｎｇのｐＹＰＮＮ、及び１μｇの剪断されたニ シン精子Ｄ　Ｎ　Ａ（Ｓｉｇｍａ）を容管に加え、次にカチオン性月旨質（Ｔｒ ａｎｓｆｅｃｔａｍ、　ＰｒｏＭｅｇａ）を１０．１の比（重量比）で加え、お たやかにＤＮＡ溶液中に混合した。混合物を室温で３０分間温買置てＤ　Ｎ　Ａ −脂質複合体の形成を許した。分裂的薯こ不活性化されたＳ　Ｎ　Ｌ　７６／７ 線維芽支持細胞層上のＡＢ−１胚幹（Ｅ　Ｓ）細胞の迅速に成長する密集する培 養物をト１ノブシン処理して、単一の細胞懸物を得て、血清含有培地で洗い、そ して無血清Ｄ　Ｍ　Ｅ　Ｍ　（Ｇｉｂｃｏ）中に再懸濁した。

各リポフェクションに対して、３　Ｘ　１０６Ｅ　Ｓ細胞及び約１×１０５支持 細胞を含む細胞懸濁物９ｍｌをＤＮＡ−脂質混合物１ａ＋１と６０ｍｒＡペトリ 皿（Ｆａｌｃｏｎ　１００７；　Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）中で混合 し、加湿した５％Ｃｏ２雰囲気中で３７℃で４時間温室した。細胞付着を最小に するために、部属の間、皿をゆっくりと回転させた。温室の後、細胞を血清含有 ＥＳ細胞培地で希釈し、ゆっくりと分散させ、そして支持層を含む１００ｍｍ培 養皿上に１×１０６で塗布した。細胞を、塗布の２４時間後から始めて９〜１２ 日間、Ｇ　４１８　（４００ａｇ／ｍｌパワー、Ｇｉｂｃｏ）中で選択した。２ つの異なるプラスミド、すなわちｐＹＰＮＮ　（ＳＶ４０−　ｎ　ｅ　ｏカセッ トの代りにＰＧＫｎｅＯカセットを有するｐＹＡＣｎｅｏの１２ｋｂ突然変異体 ）及び１ｃｋｅｎｓｉａｎ　（同じＰＧＫｎｅｏカセットを有する５ｋｂプラス ミド）をテストした。ＹＡＣニブラスミドのモル比は、ｐＹＰＮＮの場合には１ ８．１ｃｋｅｎｓｉａｎの場合には１：４であった。２つのカチオン性脂質処方 、すなわちＤＯＧＳ　（Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ、　ＰｒｏＭｅｇａ）及びＤ　 ＯＴ　Ｍ　Ａ　（Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ。

ＢＲＬ）をテストした。類似のトランスフェクション効率が、線形化プラスミド を用いてＤＯＧＳ及びＤＯＴＭＡに対して得られたが、結局はＤＯＧＳがＹＡＣ 実験のために選択された。これは、そのカチオン性部はスペルミンであり、ＤＮ Ａ保護体としてスペルミンを外から加える必要性をなくすこと、及びＤＯＧＳは 用いられた濃度でＥＳ細胞に対して毒性でないことの故である。トランスフェク ション効率に対してＤＮＡ：脂質比が重要であると見い出され、そしてＹＡＣＤ ＮＡ濃度の正確な測定が困難である故に、ＤＮＡの基本濃度を与えるために各リ ポフェクシジンは、推定１０倍過剰（１μｇ）の剪断されたニシン精子キャリア ーＤＮＡを含んだ。

ＥＳクローンの分析 Ｇ４１８耐性クローンがトリプシンにより分散され、各クローンからの細胞が９ ６ウエル（くぼみ）のプレートの一つのウェルに分けられ凍結され、第２の９６ ウエル又は２４ウエルのプレートがサザン分析によるスクリーニングのためのＤ ＮＡの調製のためのために用いられた。陽性のクローンが解凍され、皿なる分析 のために増殖された。

サザンブロットハイプリダイゼーション及びＰＣＲゲノムＤＮＡが、ＥＳ細胞及 び迅速調製法（Ｌａｉｒｄら（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ 、第１９巻第４２９３頁）による尾生体組織鏡検から調製され、標孕法によるサ ザン分析に付された。

パルス場ゲル電気泳動のために、ＥＳ細胞が１０７細胞／ｍｌでアガロースブロ ック中に埋め込まれ、制限消化のために準備され、そして５ｐｅｌにより１夜消 化された。パルス場ゲルのサザン分析のために、ＤＮＡは酸−ニックされ、次に 変性化溶液（０，４Ｎ　ＮａＯＨ，１，５Ｍ　ＮａＣＩ）中のＧｅｎｅＳｃｒｅ ｅｎ　Ｐｌｕｓ（Ｄｕ　Ｐｏｎｔ）に移された。ｖＢ６領域のＰＣＲ増幅に適す るオリゴヌクレオチドは、発表されている配列から調製された。用いられたプラ イマーは、５’　ＣＡＧＧＴＡＣＡＧＣＴＧＣＡＧＣＡＧＴＣＡ３′及び ５’　ＴＣＣＧＧＡＧＴＣＡＣＡＧＡＧＴＴＣＡＧＣ３’であり、これらは診断 の２７５ｂ生成物を増幅した。

トランスジェニックマウスの製造及び分析キメラ祖先動物を作るために無傷のＹ ＡＣ配列を含むクローンが胚盤胞中にインジェクトされ、これはＣ５７ＢＬ／６ 野生タイプマウス及びＪ「マウス（マウス重鎮遺伝子の両コピーの標的とされる 不活性化を有する）で繁殖された。トランスジェニック子孫からの胸腺細胞が、 無傷のＹＡＣの伝達を確認するために、パルス場ゲル電気泳動及びサザン分析の ためにアガロースブロック中に置かれた。

ＥＬＩＳＡ分析 ヒトμ鎖が、２部位ＥＬＩＳＡアッセイにより検出された。ポリ塩化ビニルマイ クロタイタープレートが１００ｊｌＰＢＳ中の１．２５μｇ／１１のマウスモノ クローナル抗ヒトＩｇＭクローンＣＨ６（Ｔｈｅ　Ｂｉｎｄｉｎｇ　５ｉｔｅ、 サンジエゴ、カリフォールニア）により、４℃での１夜温置によって被覆された 。プレートを、ＰＢＳ中５％チキン血ｆｆ１（ＪＲＨ，レキサナ、カンサス）と の１時間温置によりブロックした。ＰＢＳで６回洗った後、０．５％Ｔｖｅｅｎ ２０ｓ血清サンプル及ヒ標準ヲ、１１０ｐｌＰＢＳ、０．５％Ｔｗｅｅｍ２０ｓ 　５％チキン血清（ＰＴＣ３）中に希釈し、ウェル中で室温で１時間温置した。

標準として、精製されたヒトミニローマ由来ＩｇＭｆｉ度（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅ ｍ。

ラ　ジヨウ、カリフォールニア）を用いた。次にプレートを、ＰＢＳ、０．５％ Ｔｗｅｅ１２ｏテロ回洗い、１００ＩＩＩＰ　Ｔ　ＣＳ　’Ｔ：１０００倍希釈 された、ベルオキシダーゼとコンジュゲートされたラビット抗ヒトＩｇＭ、　Ｆ ｃ５ｕフラグメント特異性抗体を加えた。室温でさらに１時間温置の後、ウェル を６回洗い、１００１１１ＡＢＴＳ基質（Ｓｉｇｍａ）で０．５時間発育した。

アッセイプレートを、ｖ　ｍ　ａＸ　？イクロプレートリーダー上（Ｍｏｌｅｃ ｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓ、メン口　パーク、カリフォールニア）で４１５〜４ ９０ｎｍで読み、ＩｇＭｆｉ度は標準値の４パラメ一タロジステイタ曲線適合か ら決定された。血清サンプル中の４．８９ｎｇ／ｍｌのレベルがこのアッセイい において、ルーチン的に検出され、少な（とも３標準偏差により背景とは区別さ れる。

結果 約８μｇのＪｌ、３ＰＹＡＣＤＮＡが、８つの別々の実験においてリポフエクト された（表１）。スクリーンされた１２２１のＧ４１８耐性クローンのうち、１ ５が２つの診断のＥｃｏＲＩ　Ｃμフラグメントを含んだ（表２）。クローンの ２つの（＃　１９５及び５５３）が２つのＣμバンドの１つのみを含み、これは 失われたＥｃｏＲＩフラグメント中におけるＹＡＣのフラグメント化から生じた かもしれない（表２）。

２つの選択マーカプラスミド（ｐＹＰＮＮとａｃｅ）は夫々、１０の被トランス フェクション細胞当り０．５及び１３．５のＧ４１８耐性クローンの頻度を作っ た。ｐＹＰＮＮ選択の効率は、それがａＣｅの２倍のモル１度で用いられたにも がかわらず、はるかに低かった。なぜプラスミドは異なったのか不明である。な ぜなら、それらは共に、同じｎｅｏ’カセットを含んでいたからである。しかし 、それは、プラスミドとベクターアームとの間の配列相同性の程度又は２つのプ ラスミドからのｎｅｏ　発現の効率の違いの結果であるかも知れない。

表ＩＪ１．３ＰＹＡＣリボフエクションのまとめ実験番号　選択　ＹＡＣ：ｎｅ ｏ　リボフェクンヨン　Ｇ４１８ｒ　ａＣｅ　クローノ番号プラス、ド　モル比 　の番号　クローン＃　陽　性１　ｐＹＰＮＮ　１：８　８　２４　３　１４， １８．２１２　ｐＹＰＮＮ　１：８　９　１９　１　１２３　ｐＹＰＮＮ　１： ８　９　１２　０４　ｐＹＰＮＮ　１：８　９　８　０ ５　ｐＹＰＮＮ　１：８　９　１０　０６　ｍｐｔ　１：４　４　４４　０ ７　ａｔ　１：４　１６　４８０　３　８６，２６６．４８０８　ａｔ　１：４ 　１８　６２４　１０　２５．３５．１６４゜表１．Ｊ１．３ＰＹＡＣＤＮＡの 、選択マーカープラスミドとのコリボフエクション。約１１００ｎのＹＡＣＪｌ 、３がＰＧＫｎ　ｅ　ｏ含有プラスミドｐＹＰＮＮ又はａｔ及びキャリアーＤＮ Ａと一緒にされた。各実験は、ＤＮＡ／脂質複合体の同じ溶液を用いて、夫々１ ０１００ｎ　Ａ　ＣＤ　Ｎ　Ａの４〜１８回の別々のりポフエクションより成っ た。ヒトＣａプローブが、クローンの初めのスクリーニングのために用いられた 。

マ　ｃ８１：＋Ｉ：Ｉ： 表２において、Ｃμプローブに対し陽性であったＥＳクローンが、ｖ■６配列に ついてＰＣＲで、Ｄ領域組込みについてサザンプロットで、そして３′末端組込 みについてサザンプロットにより分析された。ｖＨ６分析における「＋」は、ｖ Ｂ６特異性プライマーを用いる、診断の２７５ｂｐＰ　ＣＲ生成物の増幅を示す 。Ｄ領域フィンガープリントにおける「＋」は、完全に親のバンドパターンを示 す。Ｃμ分析における「＋」は、プローブとハイブリッドされたとき、２つの診 断のバンドが存在したことを示し、一方、「−」は単一のバンドの存在を示す。

３′末端分析における「＋」は、Ｘｈｏｌ／５ｐｅｌ二重消化物におけるフラン キングＸｈｏ　ｌバンドのサイズの４．　ｌｋｂへの減少ならびに画情化物にお ける４、５ｋｂ内部Ｘｈｏ　ｌバンドの存在を示す。パルス場ゲル電気泳動分析 における「＋」は、Ｄ領域プローブで調べられたとき、単一の８５ｋｂＳｐｅｌ バンドの存在を示す。ｒｎｄＪは測定されなかったことを示す。無傷のＹＡＣイ ンサートを有するクローンは、太線で印される。　クローン１２．１４．１８及 び２１は、プローブとして２７５ｋｂＰ　ＣＲ生成物ＤＮＡを用いてＡｐａｌ及 びＥｃｏＲｌ消化物を調べることによってＶｎ６について分析された。クローン １８のみが、診断のｖＢ６バンドについて陽性であった。

ＥＳ細胞中のＹＡＣ構造の分析 ｐＹＰＮＮコポリフエクションからの４つのＣμ　クローン（番号１２．１４． １８．２１）を、上記の制限フラグメント指紋アッセイによりＤ領域構造につい て分析した。クローンのうち、クロン１８のみが親ＹＡＣの指紋を保持した。ク ローン１４と２１は、親よりも少ないバンドを含んだ。これは、ＹＡＣ配列が失 われたことを示唆する。一方、クローン１２は、い（つかの追加バンドを含み、 このＥＳ系列におけるＹＡＣの１より多いコピーの組込みと符合ｒる。

４つのＥＳ系列におけるインサート領域の３′末端の組込みは、プローブとして ベクター再環化により単離された１０．５ｋｂ　ＮｄｅｉＳｐｅｌ末端フラグメ ントを用いるサザン分析により評価された。３つのバンドが、親ＹＡＣのＸｈｏ 　ｌ消化物から予期される。すなわち、非常に大きいＤ−Ｊ−Ｃμバンド（＞　 ３０ｋｂ）　、４．５ｋｂＣμｍＣδバンド、及び８．９ｋｂＣδ−ベクターバ ンドである。Ｘｈｏｌ及びＳｐｅ　Ｉによる二重消化は、８、９ｋｂバンドのサ イズを４．　ｌｋｂに減少すると予期される。４゜５ｋｂ及び８．９ｋｂバント がＸｈｏ　ｌ消化物中に存在し、一方、４，５ｋｂ及び４．１ｋｂバントが親Ｙ ＡＣのＸｈｏ　ｌ　Ｓｐｅ　ｌ消化物中に存在する。４つのＥＳ系列のうち、系 列１８のみが、無傷の３′末端の指標である親ＹＡＣバンドパターンを含んだ。

８，９ｋｂバンドの存在は、ＥＳ系列におけるベクターアームＸｈｏ　１部位の 保持と符号し、テロマー領域の非常に少しがこのクローンにおいて失われている ことを示唆する。ＹＡＣ末端配列の喪失は、異常なＸｈｏ　ｌバンドを結果する と予期されるであろう。他の３つのＥＳ系列のうち、クローン１４は４，５ｋｂ Ｘｈｏ　ｌバンドを欠き、一方、クローン１２及び２１は異常に短いＸｈｏ　ｌ バンドを含み、これらＥＳクローンにおける再配置された又は除去された３′末 端領域を示している。５′末端組込みの同様な分析は、領域における繰返す因子 の故に可能でなかった。しかし、ＰＣＲ分析及びプローブとしてＶＢ６ＰＣＲ生 成物を用いるサザン分析は、クローン１８がｖＨ６配列を含み、一方、クローン １４．１２及び２１は含まないことを示した（表２）。

ｄコリポフエクションからの１３のＣμ　ＥＳ細胞系列のうち、１つがクローン 増大の間に失われ、１つ（＃２６６）がｖＨ６配列を欠く故に除去された。残り は、Ｄ領域構造、３′末端組込み及び／またはＶ　ｎ　５配列について分析され た（表２）。Ｄ領域指紋について分析された１１系列のうち、６つ（番号８６． １９１．２２０．３７１．４６３．５６７）が無傷のＤ領域を示し、５つが異常 なパターンを有した。無傷のＤ領域を持つ６つの系列のうち５つの３′末端分析 は、１つ（番号２２ｏ）を除くすべてが無傷の３′末端を含んだことを示した。

ＰＣＲ分析は、無傷のＤ領域を持つ６つの系列のうち５つ（番号８６．２２０． ３７１．４６３．５６７）がｖＨ６配列を含み、無傷（７）Ｄ領域を持たない５ 系列のうち１つのみ（番号５５）がｖＨ６配列を持ったことを示した。

１０のＥＳ細胞系列が、Ｄ領域又はＣμプローブを用いるパルス場すザン分析に より、全長インサートについて調べられた（表２）。クローン１８．３７１及び ４６３のみが、全長インサートを示す８５ｋｂ　５ｐｅｌフラグメントを含んだ 。他のクローンのすべては、より小さいＳｐｅ　Ｉフラグメントを持った。

クローン１８のＳｐｅ　ｌ消化物は、Ｄ及びＣμプローブ、及びＶ■６のための プローブによりスクリーンされた。３つのすべてのプローブが、８５ｋｂの単一 バンドにハイブリダイズした。

パルス場すザン分析をＤ領域、３′末端及びＶ８６詳細構造分析と併せ考えると 、ＹＡＣインサートが３つの系列、番号１８．３７１及び４６３において無傷で 移入されたことを示している。高程度の内部再配置、除去又はフラグメント化が 、破壊されたＹＡＣ配列を有するＥＳ系列において一般に見られ、しかし構造の わずかの変化もまた検出された（たとえば番号５６７）。総じて、無傷のＹＡＣ 移入の頻度は低く、４００の６４１８クローンのうち１つ（３／１２２１）であ る。しかし、クローンＤＮＡの単離及びＣμ配列のための一次的スクリーン（１ ２２１のクローンのうち１２０６を更なる分析から除く）は、方法論に記載され るマイクロタイタープレートプロトコールを用いて迅速に行われた。すなわち、 ゎずが１５のクローンが、徹底的分析を必要とした（表２）。

ＥＳ細胞中のＹＡＣ構造の分子分析は、ＹＡＣの小さい、好ましくは単一のコピ ーにより大いに容易にされる。ＥＳ系列のＤ領域、パルス場ゲル分析及び３′末 端分析は、ＹＡＣの少ない又は単一コピ１組込みと符合する。診断の３′末端フ ランキングバンドについてのクローン１８．３７１及び４６３の分析は、クロー ン１８及び３７１がＹＡＣインサートの単一コピーを有し、一方、４６３は追加 の無傷の又は部分的に無傷のコピーを有するかも知れないことを示した。

キメラの製造及びＹＡＣの生殖細胞系列伝達胚盤胞が、ＥＳ系統１８．３７１及 び４６３を用いてインジエク浄誓（内容に変更なし） トされた。色を覆うために１０〜９５％のＥＳ細胞寄与の範囲であるキメラ先祖 動物が、３つすべての系統から導かれた。

最も高齢の動物（ＥＳ系統１８から導かれた４０％キメラオス）は、７３の子の うち２０にＥＳ細胞遺伝子型を伝達した。２０のアゲ−ティの子のうち１１が無 傷り領域指紋について陽性であり、これは単価接合体ＹＡＣｈランスジーン対立 遺伝子のメンプリアン分離と符合する。加えて、Ｄ領域プローブを用いたパルス 場すザン分析は、トランスジェニック子における単一の８５ｋｂＳｐｅｌバンド を示し、これはＹＡＣが生殖細胞系列を通して安定に維持されたことを示す。す なわち、ＥＳ細胞中へのＹＡＣのコリボフエクンヨンは、ＥＳ細胞の全型発育能 を駄目にしない。

コリポフェクンヨンされた選択マーカーについての組込み部位のサザン分析は、 ２〜１０のプラスミドコピーの組込みを示した。マーカープラスミドが複数座で インサートされたなら、それらは突然変異の原因でありうるので、プラスミドの 組込み部位が、プラスミド配列のサザン分析により追跡された。ｐＹＰＮＮ及び ＹＡＣベクターアームはＥｃｏＲＩ部位を欠き、ｐ　Ｂ　Ｒ３２２配列を含むの で、ＰＢＲ３２２プローブにハイブリダイズされた夫々のＥｃｏＲＩバンドは、 ｐＹＰＮＮ又はＹＡＣベクターアームの別々の無傷の又はフラグメント化された コピーの組込みを示す。ＥＳ細胞クローン１８Ｄ　Ｎ　Ａの分析は、５．５〜２ ０ＫＢの大きさの８つのＥｃｏＲＩバンドを現し、非トランスジェニック配偶体 で繁殖された単価接合体トランスジェニック動物の子は、浄書（内容に変更なし ） ＥｃｏＲＩバンドの分離について分析された。１４の子のうチスべて８のＥｃｏ ＲＩバンドが９つのトランスジェニック子の尾ＤＮＡ中で検出され、５つの非ト ランスジェニック子の尾ＤＮＡでは何も検出されなかった。すなわち、すべての 検出しうるマーカープラスミドがＹＡＣを用いて分離され、このことは、それら がＹＡＣ組込み部位に又は近傍に挿入されたことを示す。種々のＤ　Ｎ　Ａのコ リボフエクンヨンが、接合子のマイクロインジェクションにより作られたトラン スジェニックマウスにおいて観察され、プラスミドＤＮＡの共組込みは、接合子 マイクロインジェクションよりもコリボフエクションについて、より突然変異源 性であることはないことが予期される。ニシン精子キャリアＤＮＡもまたＹＡＣ と共組込みされた。おそらくサザン分析におけるＥｃｏＲＩ部位の源でありうる 。共組込みされたキャリアーＤＮＡは、ＹＡＣＩ−ランスシーン機能に潜在的に 悪影響しうるので、キャリアーＤＮＡを排除することがしばしば望ましい。６５ ０ｋｂＹ　Ａ　Ｃを用いる予備実験は、ＥＳ細胞中への無傷のＹＡＣの効率的リ ボフエクションのためにキャリアーＤＮＡは必要でないことを示す。この予備的 実験はまた、ＥＳ細胞中に成功裡にコリボフエクンヨンされることができるＹＡ Ｃのサイズの制限は、少なくとも６５０ｋｂであることを示唆する。

系統１８のトランスジェニックマウスが、血清中における浄書（内容に変更ない ヒトμ鎖についてＥＬＩＳＡにより検定された。ヒトμ重鎖は、トランスジェニ ックな子の血清中で検出された（表３）。トランスジェニック体におけるヒトμ 血清レベルは、検出範囲内に明らかにあったが、それらは内在性マウスＩｇＭの 血清レベルに比べて非常に低かった。トランスジーン発現の低いレベルは、内在 性重鎮遺伝子からの競争に部分的に起因する。トランスジーンが、内在性重鎮対 立遺伝子が不活性化されているパックグララウンド中に導入され、そしてこのマ ウスにおいてヒトμ血清レベルは約１０倍高められた（表３）。

浄書（内容に変更なし） 表３　ＥＬＩＳＡによる血清ヒトＩｇＭの検出ゲッタイブ　性　検定時の齢（週 ）　ヒトＩｇＭＹＡＣ１８＋　Ｆ　３，９．２０　＜５　ｎｇ／ｍ１ＹＡＣ１８ ＋　Ｍ　１？　１２．２ｎｇ／ｍ１ＹＡＣ１８十　Ｆ　１０　２７．０ｎｇ／ｍ １ＹＡＣ１８＋　Ｆ　６．１７　＜５　ｎｇ／ｍ１ＹＡＣ１８＋　Ｆ　４　５． ８ｎｇ／ｍ１ＹＡＣ１８＋　Ｆ　６　１０．５ｎｇ／ｍ１ＹＡＣ１８＋Ｍ６　１ ０．４ｎｇ／ｍ１ＹＡＣ１８＋／ＪＨ−Ｍ　５，８　１６５　ｎｇ／ｍｌ野生タ イプ　Ｆ　６　＜５　ｎｇ／ｍ１野生タイプ　Ｆ　６　＜５　ｎｇ／ｍｌ野生タ イプ　Ｆ　６　＜５　ｎｇ／＠ｌ野生タイプ　Ｍ　６　＜５ｎｇ／ｍｌ 野生タイプ　Ｆ　３４　＜５　ｎｇ／ｍｌ野生タイプ　Ｆ　３４　＜５　ｎｇ／ ｍｌ野生タイプ　Ｍ　３４　＜５ｎｇ／ａｌ野生タイプ　Ｍ　３４　＜５ｎｇ／ ｍ１表３．トランスジェニック動物及び対照からの血サンプルを、表示した齢に おいてヒトＩｇＭについてＥＬＩＳＡにより分析した。トランスジェニック動物 のすべては、単一クローン１８の祖先キメラに由来し、ＹＡＣについて単価接合 体であった（ＹＡＣ１Ｂ＋）。野生タイプノ＜・ツクグランド浄ＩＦ（内容に変 更なし） における７つの動物のうち５つは、その血清中に検出しつるヒトＩｇＭを有した 。ＥＬＩＳＡの検出のレベルは、５ｎｇヒトＩｇ）ｌ／ｍｌ血清であった。ＹＡ Ｃトランスジーンが、機能的内在性マウス重鎮遺伝子を欠くバックグラウンド（ ＹＡは約１０倍高められた。

蛍光活性化された細胞のソーティング（ＦＡＣ３）分析が、８５ｋｂ重鎖遺伝子 フラグメントを含むＹＡＣについて陽性であり、かつ相同遺伝子標的（ターゲテ ィング）によるＪｎ領域の破壊によって機能的に破壊された（ノックアウトされ た）内在性マウス免疫グロブリン重鎮遺伝子について同型接合であるマウスにお いて実施された。マウスは、ＹＡＣトランスジーンの単一コピーを有し、機能的 マウス重鎮対立遺伝子を欠いた。ＦＡＣ３分析は、とりわけヒトＵ　＠を検出す るための抗体を使用し、マウスからの合計１０゜０００の末梢リンパ細胞当り約 ６０の細胞がヒトμ鎖免疫グロブリンを発現したことを示した。このレベルは、 野生タイプ（非トランスジェニック／非ノツクアウト）マウス牌臓においてマウ スμ鎖を発現する細胞の数の約１〜２％である。

ＦＡＣ３は、ＹＡＣ＋／Ｊ　−マウスの牌臓及び腹膜腔か■ ら得られた細胞におけるヒトμ鎖発現を検出した。

上述の本発明は、理解の明瞭のために例示及び実施例により詳しく説明されてい るが、本発明の請求の範囲内にお浄書（内容に変更なし） いて変更及び修飾が行われうろこと（よ明白であろう。

ＩＧ　ｌ くの口０ＬＬＩ―■＝　−−３に一χｚＯ乙○○Ｏ○○○○○　○○○○○○０ Ｏ ＱＱＱＯＯ■００　ＱＯ００００００ ○○○○００００　００００００００ ＦＩＧ、５゜ ＡＰＰ　了了Ｏｎ丁ニテ：ゴ］Ｄ　−３１０ｂｐＡＰＰ　７５１　ｒ口＝エコ　 −２５５　ｂ。

ＡＰＰ　７１４０１コ　□１４４　ｂｐアローフパ ＦＩＧ　８゜ 手続補正書 平成７年２月２日

Claims (31)

【特許請求の範囲】
1. １．カチオン性脂質、第一のポリヌクレオチド、及び選択マーカー遺伝子発現カ セットを含む連結されていない第二のポリヌクレオチドを含むコリポフェクショ ン複合体を形成する工程、 該第一のポリヌクレオチド及び咳第二のポリヌクレオチドが同一の細胞中に導入 されそしてゲノム中に組み込まれる条件下で、哺乳動物細胞を該コリボフェクシ ョン複合体と接触させる工程、 を含む、取り込まれた複数の非相同ＤＮＡ種を有するコリポフェクションされた 哺乳動物細胞を製造する方法。
2. ２．該カチオン性脂質が、Ｎ［１−（２、３−ジオレオイルオキシル）プロピル ］−Ｎ、Ｎ、Ｎ−トリメチルアンモニウムクロライド、Ｎ［１−（２、３−ジオ レオイルオキシル）プロピル］−Ｎ、Ｎ、Ｎ−トリメチルアンモニウムメチルス ルフェート、Ｎ−（２、３−ジ（９−（Ｚ）−オクタデセニルオキシ））−プロ プ−１−Ｎ、Ｎ、Ｎ−トリメチルァンモニウムクロライド、ジオレオイルフォス ファチジルエタノールアミン（ＰｔｄＥｔｎ、ＤＯＰＥ）及びジオクタデシルア ミドグリシルスペルミジンからなる群より選ばれる請求の範囲第１項の方法。
3. ３．第一のポリヌクレオチドが、少なくとも５００ｋｂである請求の範囲第１項 の方法。
4. ４．該選択マーカーの少なくとも一つが薬剤耐性遺伝子である請求の範囲第１項 の方法。
5. ５．咳選択マーカーがネオマイシン耐性をエンコードする遺伝子である請求の範 囲第４項の方法。
6. ６．咳選択性マーカーを有する細胞の選択工程を更に含む請求の範囲第１項の方 法。
7. ７．該哺乳動物細胞が非ヒト肺幹細胞である請求の範囲第１項の方法。
8. ８．該非ヒト胚幹細胞がマウスＥＳ細胞である請求の範囲第７項の方法。
9. ９．該カチオン性脂質がジオクタデシルアミドグリシルスペルミジン（ＤＯＧＳ ）であり、該第一のポリヌクレオチドがヒトＡＰＰ遺伝子配列を含み、かつ咳連 結されていない第二のポリヌクレオチドがネオマイシン耐性遺伝子を含む、請求 の範囲第８項の方法。
10. １０．咳第一のポリヌクレオチドが酵母由来ＹＡＣ配列を含む、請求の範囲第１ 項の方法。
11. １１．ＹＡＣクローンＤＮＡを含む第一のＤＮＡ及び選択マーカーをエンコード する遺伝子を含む第二のＤＮＡに、非共有結合的に結合されたカチオン性脂質を 含むコリポフェクション複合体。
12. １２．カチオン性脂質が、Ｎ［１−（２、３−ジオレオイルオキシル）プロピル ］−Ｎ、Ｎ、Ｎ−トリメチルアンモニウムクロライド、Ｎ［１−（２、３−ジオ レオイルオキシル）プロピル］−Ｎ、Ｎ、Ｎ−トリメチルアンモニウムメチルス ルフェート及びジオクタデシルアミドグリシルスペルミジンからなる群より選ば れる、請求の範囲第１１項のコリポフェクション複合体。
13. １３．ＹＡＣＤＮＡがヒトＡＰＰ遺伝子配列又はヒト免疫グロブリン遺伝子配列 を含む、請求の範囲第１１項のコリポフェクション複合体。
14. １４．該カチオン性脂質がジオクタデシルアミドグリシルスペルミジンである、 請求の範囲第１３項のコリポフェクション複合体。 Ｒ
15. １５．該選択マーカー選任子がｎｅｏＲである請求の範囲第１４項のコリポフェ クション複合体。
16. １６．少なくとも５０ｋｂのポリヌクレオチド、連結されていない選択マーカー 遺伝子発現カセット、及びＮ［１−（２、３−ジオレオイルオキシル）プロピル ］−Ｎ、Ｎ、Ｎ−トリメチルァンモニウムクロライド、Ｎ［１−（２、３−ジオ レオイルオキシル）プロピル］−Ｎ、Ｎ、Ｎ−トリメチルアンモニウムメチルス ルフェート及びジオクタデシルアミドグリシルスペルミジンからなる群より選ば れるカチオン性脂質を含むコリポフェクション複合体。
17. １７．哺乳動物細胞及び請求の範囲第１６項のコリポフェクション複合体を含む 組成物。
18. １８．哺乳動物細胞が非ヒト胚幹細胞である請求の範囲第１７項の組成物。
19. １９．非ヒト胚幹細胞がマウスＥＳ細胞である請求の範囲第１７項の組成物。
20. ２０．請求の範囲第１項の方法によって製造されたコトランスフェクトされた置 市乳動物細胞。
21. ２１．請求の範囲第１０項の方法によって製造されたコトランスフェクトされた 哺乳動物細胞。
22. ２２．請求の範囲第１項の方法によって製造されたキメラトランスジェニック非 ヒト動物。
23. ２３．請求の範囲第９項の方法によって製造されたトランスジェニック非ヒト動 物。
24. ２４．酵母由来ＹＡＣ配列に連結された少なくとも５０ｋｂの異種ポリヌクレオ チド配列を含む生殖細胞系列ゲノムを含むトランスジェニックマウス。
25. ２５．異種ポリヌクレオチドが少なくとも約５００ｋｂである、請求の範囲第２ ４項のトランスジェニックマウス。
26. ２６．異種ポリヌクレオチド配列がヒトＡＰＰタンパク質又はヒト免疫グロブリ ンをエンコードする、請求の範囲第２５項のトランスジェニックマウス。
27. ２７．更にｎｅｏＲ遺伝子発現カセットを含む請求の範囲第２６項のトランスジ ェニックマウス。
28. ２８．８５ｋｂのＳｐｅＩフラグメントを含む再配列されていないヒト免疫グロ ブリン遺伝子、選択マーカー及びカチオン性脂質を含むＹＡＣを含むコリポフェ クション複合体。
29. ２９．少なくとも一つのＶ領域遺伝子、少なくとも一つのＪ領域遺伝子及び少な くとも一つの定常領域遺伝子を有する再配列されていないヒト免疫グロブリン遺 伝子を含むＹＡＣを含むトランスジェニックマウス。
30. ３０．トランスジェニックマウスがヒト免疫グロブリン鎖を発現する、請求の範 囲第２９項のトランスジェニックマウス。
31. ３１．ＹＡＣがヒト重鎖の遺伝子座の８５ｋｂのＳｐｅＩフラグメントを含む、 請求の範囲第２９項のトランスジェニックマウス。