JPH09509050A

JPH09509050A - 放射標識したアネキシン

Info

Publication number: JPH09509050A
Application number: JP7519734A
Authority: JP
Inventors: サダカーカシーナ; ティモシーエイデュハースト; ジョンエムレノ; ジョナサンタイト; ジョンストラットン
Original assignee: ネオルクスコーポレイション
Priority date: 1994-01-24
Filing date: 1995-01-23
Publication date: 1997-09-16
Anticipated expiration: 2020-06-29
Also published as: CA2180555A1; DE69530375D1; WO1995019791A1; DE69530375T2; EP0743861A1; EP0743861A4; ATE237366T1; JP3664727B2; CA2180555C; EP0743861B1

Abstract

(57)【要約】血管血栓を画像化するのに有用な放射標識したアネキシンを開示する。また、このような放射標識したアネキシンの製造方法を開示する。

Description

【発明の詳細な説明】放射標識したアネキシン関連出願本出願は、Kasina等により１９９４年１月２４日に出願されたＵＳＳＮ０８／１８５，６６０号、発明の名称「放射標識したアネキシン(Radiolabeled Anne xins）」の一部継続出願である。技術分野本発明は、放射標識した(radiolabeled)アネキシンに関する。また、本発明は放射標識したアネキシンの投与を伴う画像化プロトコルに関する。結合体のアネキシン成分は、結合体の放射標識活性成分を、血管血栓標的部位に送達する作用を有する。発明の背景患者が、胸痛、動悸または心臓障害または心臓病の他のあらゆる症状を患っている際には、心臓中の血管の血栓の存在が、治療を潜在的に顕著に複雑にする要因でる。開業医が、１つ以上の血管血栓が存在するか否か、存在する場合にはこれらの血管血栓の位置を、健康な組織を侵すことなく決定することができたなら、治療の選択を一層良好に評価することができるであろう。さらに、開業医が、血管血栓が存在しないことを決定することができ、これにより治療における潜在的な複雑さを解消することができたなら、心臓病状態は一層安全かつ効果的に治療することができるであろう。血管血栓の存在を決定するためのほとんどの現行の手法は、健康な組織を侵し、および／または厄介であり、および／またはこのような血栓を良好な感受性および特異性で検出することができない。従って、健康な組織を侵さない血管血栓画像化に有用な画像化剤が望ましい。アネキシンは、陰イオン性リン脂質への結合がカルシウムで媒介されることを特徴とするタンパク質の群である。陰イオン性リン脂質は、活性化されていない血小板よりも、活性化されている血小板と２０倍高い程度で会合し、活性化された血小板は血管血栓と関連する。ヨウ素化アネキシンＶは、インビボで血管血栓に局在することが示されているが、血栓巨大分子または非標的組織中への再導入による代謝的分解および／または可能なトランスヨーディネーション(transiodination)により血液クリアランスの顕著なβ相により、画像化特性は最適に及ばない。遊離の放射活性ヨウ素または代謝分解生成物を含むヨウ素は、非標的組織、特に甲状腺を放射活性にする。さらに、用いられるヨウ素放射標識は、得るのが困難であり、従って広く用いられるのに実用的でない。従って、優れた放射標識したアネキシン化合物が望ましい。発明の要約本発明は、放射標識したアネキシン並びにその製造および使用方法を提供する。本発明の好ましいアネキシン含有結合体は、診断学的画像化剤と共に放射標識するのに適するものであり、これは: アネキシン; およびアネキシンに共有結合したＮ₂Ｓ₂キレートを含む。また、本発明は、血管血栓を画像化するのに適する放射標識したアネキシンを提供し、この放射標識したアネキシンは：アネキシン；アネキシンに共有結合したＮ₂Ｓ₂キレート；キレートによりキレート化された診断学的放射性核種を含む。本発明において用いるのに好ましいアネキシンはアネキシンＶである。本発明おいて用いるのに好ましい放射標識したアネキシンは、次式：で表されることを特徴とする。本発明を実施するのに用いるのに好ましい診断学的放射性核種は、Ｔｃ−９９ｍ，Ｒｅ−１８６およびＲｅ−１８８であり、Ｔｃ −９９ｍが特に好ましい。心臓内または心臓付近に位置する血管血栓は、特に本発明の画像化に基づいて分析可能である。図面の簡単な説明図１は、アネキシンＶを放射標識する方法の図式図である。図２は、ｐＥＴ−１２ａプラスミドマップの図式図である。図３は、ｐＥＴ−１２ａ−ＰＡＰＩ、３／７／９４、クローン１の図式図である。発明の詳細な説明本発明を記載する前に、本明細書中の開示において用いられる若干の用語を定義するのが有用である。アネキシン：ミリモル濃度のカルシウムの存在下で膜脂質と高い親和性で結合することができることを特徴とする一群の化合物。アネキシンは、アネキシンの、負に帯電した表面リン脂質（例えば活性化された血小板）により媒介された抗凝血効果を示すことが示されている。このアネキシン−リン脂質結合は、血液凝固因子の活性化を、このように負に帯電した表面リン脂質により遮断すると考えられている。アネキシン群の分子を認識する前に、これらの構成要素は、また、文献中で、胎盤抗凝血タンパク質（例えばＰＡＰ−１，２，３および４）、リポコルチン、カルパクチン、血管抗凝血物質(coagulant)（αおよびβ）、カルホビンジン(calphobindin)Ｉ、胎盤タンパク質４（ＰＰ４）、エンドネキシンII、アンコリン(anchorin)ＣＩＩ、カルシウム依存性リン脂質結合タンパク質等と呼ばれている。Crumpton等、「Nature」345: 212，1990参照。アネキシンＶは本発明の記載において用いられる原型のアネキシン分子である。Ｎ_xＳ_yキレート：ここで定義するように、「Ｎ_xＳ_yキレート」は、（ｉ）金属または放射性金属と配位結合することができ、（ｉｉ）アネキシン分子に共有結合することができる、二官能価キレーター(chelator)を含む。特に好ましいＮ_xＳ_y キレートは、Ｎ₂Ｓ₂およびＮ₃Ｓ核を有する。例示的なＮ_xＳ_yキレートは、Fritz berg等、「Proc．Natl．Acad．Sci．USA」８５：４０２４−２９，１９８８；weber等、「Bioconj Chem．」１：４３１−３７、１９９０；および例えばこれらの中に引用されている文献中に記載されている。この記載に関して、原型のＮ_xＳ_yキレートは、Ｎ₂Ｓ₂キレートである。Ｎ₂Ｓ₂キレート：適切な位置にある２個の窒素原子および２個の硫黄原子により放射性核種と安定にキレート化することができるＮ_xＳ_y族のジアミド、ジメルカプチド二官能価キレーター。好ましいＮ₂Ｓ₂キレートは、例えば米国特許第４，８９７，２２５号明細書に記載されている。Ｎ₃Ｓキレート：適切な位置にある３個の窒素原子と１個の硫黄原子により放射性核種と安定にキレート化することができるＮ_xＳ_y族のトリアミド、メルカプチド二官能価キレーター。好ましいＮ₃Ｓキレーターは、例えば米国特許第４，９６５，３９２号明細書に記載されている。結合体：結合体は、化学的結合体（共有または非共有結合）、融合タンパク質(f usion protein)等を含む。本発明は、アネキシン含有結合体、放射標識したアネキシンおよびこれらの診断学的画像化用途での使用に関する。本発明の放射標識したアネキシンは、以下のことを特徴とする：陰イオン性リン脂質により特徴づけられた標的細胞部位への迅速な癒着；短い循環半減期；代謝的分解または放射性核種のキレートからの分離に対するインビボ耐性；および低温キットフォーマット(cold kit format) 中のパッケージングに基づいて分析可能であること。本発明の例は、診断学的画像化剤と共に放射標識するのに適するアネキシン含有結合体に関し、これは、アネキシン; およびアネキシンに共有結合したＮ_xＳ_yキレートを含む。受容体の至る所（しかし特に心臓内または心臓付近）における血管血栓を画像化するのに適する放射標識したアネキシンにも関し、この放射標識したアネキシンはアネキシン、Ｎ_xＳ_yキレートおよびさらにキレートによりキレート化された診断学的放射性核種を含む。本発明の好適例は、診断学的画像化剤と共に放射標識するのに適するアネキシン含有結合体に関し、これは、アネキシン; およびアネキシンに共有結合したＮ₂Ｓ₂キレートを含む。血管血栓を画像化するのに適する放射標識したアネキシンにも関し、この放射標識したアネキシンは、アネキシン、Ｎ₂Ｓ₂キレートおよびさらにキレートによりキレート化された診断学的放射性核種を含む。多くの病的状態と関連する血管血栓の視覚化に関して、画像化放射性核種、例えばＴｃ−９９ｍとキレート化したキレートとアネキシンとの結合体を、このような診断が望ましい受容者に投与する。結合体のアネキシン部分は、負に帯電した表面リン脂質例えば血管血栓により特徴づけられる標的部位に迅速に局在する。放射性核種は、その種々の手法の１つ、例えばガンマカメラ画像化によって視覚化する能力に関して選択される。アネキシンが標的部位に迅速に癒着し、アネキシンの血清半減期が短い（一般に３０分以内）（これは放射標識によっては顕著に延長されない）ため、これらの標的部位の画像化は、非標的部位がほとんど放射活性とならずに進行する。アネキシンは一般的には単鎖(single chain)であり（最も顕著な例外はアネキシンＩＩである）、分子量が約３３〜７２キロダルトンである非グリコシル化タンパク質である。アネキシンは、カルシウムイオン媒介結合と関連する多くのバイオロジカル(biological)を有する。試験により、アネキシンが、陰イオン性膜脂質と、ミリモル濃度のカルシウムの存在下で高い親和性で結合することが示されている。カルシウムの存在下では、これらのタンパク質は、負に帯電したリン脂質、例えばホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸またはホスファチジルイノシトールと、特に高い親和性を有する。例えば、Funakoshi等、「Biochem.」26：5 572−78，１９８７；およびTait等、「Biochem.」27：6268−76，１９８８参照。このような負に帯電したリン脂質は、血管血栓と会合する（例えば活性化されたヒト血小板の表面上に局在する）。アネキシンは、抗凝血効果を奏する。凝血の阻害は、アネキシンが負に帯電した表面リン脂質（例えば活性化された血小板の表面上に存在するもの）に結合することにより媒介される。この結合は、血液凝固因子の活性化を、このような負に帯電した表面リン脂質により遮断すると考えられる。アネキシンは、陰イオン性リン脂質を有する標的部位に、迅速、即ちその循環レベルに依存して５〜３０分の間に局在するが、血清中を、若干長い時間にわたり循環しつづける（循環半減期＜３０分）。以下の実施例ＩＩＩでは、画像化実験の結果を記載しており、ここでは、血管血栓は、８２分の平均時間（アネキシン投与後）で平面画像に視覚化された。これらの特性により、アネキシンあるいは診断または治療剤と結合したアネキシンを、多くの適応症、例えばＤＶＴ（深静脈血栓症）、ＰＥ（肺塞栓）、心筋梗塞、心房細動、人工心血管材料に関する問題、発作等に関連する血管血栓のインビボ診断または治療のプロトコルにおいて用いることができる。本発明のアネキシン結合体が有用である活性化された血小板の蓄積に関連する他の適応症には以下のものが含まれる：膿瘍画像化、再狭窄ポストバルーン(post balloon)血管形成（ＰＣＴＡ）、関節の炎症（即ち慢性関節リウマチ）、損傷を受けた内皮細胞（即ちアルツハイマー症）、大脳動脈における血液凝固の画像化、末梢動脈における閉塞、心房血栓症の画像化並びに冠動脈および頸動脈血栓の画像化。また、血小板集団を臨床的、インビトロ診断、および基礎的研究技術において特徴づけすることも重要である。現在血小板を特徴づけすることができる細胞表面マーカーの中で、多くは種の間で交差反応性ではなく、活性化された血小板集団とは対象的にすべての血小板を認識する。アネキシンは、多くの種の活性化した血小板に選択的に結合すると考えられる。従って、本発明のアネキシン結合体は、研究および診断技術、例えば免疫組織化学およびフローサイトメトリーにおいて代用細胞マーカーとして用いることができる。例えば、本発明の結合体を用いて、固定組織／腫瘍、血液塗沫標本、凝固障害を有する動物および種々の化学的または感染性刺激に応答する血小板活性化アッセイにおいて活性化された血小板を検出することができ、血液、細胞培養アッセイおよび血小板応答アッセイにおいて活性化された血小板を検出することができる。放射標識したアネキシンを用いる例示的診断ブロトコルおよび実験を、以下に記載して、本発明の概念をさらに説明する。本発明を実施するのに有用な好ましいアネキシンの一例はアネキシンＶであり、これは、１９７９年にBohnにより、アネキシンの豊富な源であるヒト胎盤から分離され、プラセンタプロテイン(Placenta Protein)４（ＰＰ４）と命名された。アネキシンＶは、Ｅ．coliにおいて発現した。また、アネキシンＶの全長ｃＤＮＡクローンが得られ、発現ベクターにおいてサブクローン化され(subcloned) 、これによりアネキシンＶを含む融合タンパク質の生成が促進された。アネキシンＶは４つの領域（４つのタンデム、約７５個のアミノ酸残基の不完全なくり返し、Funakoshi等、「Biochem.」26：8087−92、１９８７）から成り、ここで各領域は、５個のα−ヘリックスから構成されている。横からは、アネキシンＶ分子は、その凸面上に少なくとも４つのカルシウム結合部位を有する王冠状の外見を有し、これにより、アネキシン−リン脂質相互作用が媒介される。また、他のアネキシン分子が本発明を実施するのに有用であり、本明細書中でのアネキシンＶに関する記載は、一般的にアネキシン分子にあてはまる。アネキシンＶは複数のカルシウム結合部位を有するため、およびアネキシンＶの負に帯電したリン脂質への結合がカルシムウにより媒介されるため、１個以上の個別のアネキシンＶ領域から成る加工した分子を、本発明の画像化プロトコルに用いることができる。また、アネキシン分子は、領域の境界とは異なる位置で分割して、陰イオン性リン脂質のカルシウム媒介結合が可能な加工した分子を提供することができる。また、陰イオン性リン脂質へのアネキシンＶの親和性が顕著に損なわれない限りは、アネキシンＶを、１個以上のアミノ酸残基において変化させることができる。例えば、アネキシンＶのシステイン（位置３１６）アミノ酸残基を、除去するかまたは業界において知られているアラニンまたは他の硫黄非含有アミノ酸で置換することができる；ここで標識により、モノマー的に(m onomerically)放射標識したアネキシンＶが形成する。アネキシンのリン脂質への結合の程度はTait等、「J．Biol．Chem.」264：7944−49，１９８９により記載されたように、蛍光消失により定量することができる。アネキシンの中では、アネキシンＶが、血漿および細胞外流体（１．２ｍＭのイオン化カルシウム、０．１５モルのイオン強度）に相当する条件の下で、８０％のホスファチジルコリンと２０％のホスホチジルセリンとを含むリン脂質小胞に対する親和性が最も強い（Ｋ_d＜１０^-10Ｍ）。この結合は可逆的であり、カルシウム依存性である。アネキシンＶは、本発明において用いるための画像化放射性核種で放射標識される。本発明において用いるのに有用な放射性核種には、γ線エミッター、陽電子エミッター、オージェ電子エミッター、Ｘ線エミッター、蛍光エミッター等が含まれる。本発明において用いるのに適する放射性核種は業界で知られており、等が含まれる。Ｔｃ−９９ｍは、本発明を実施するのに好ましい放射性核種である。Ｔｃ−９９ｍは、低いおよび高い比活性の両方において（０．５３μＣｉ／μｇ〜１０１．２μＣｉ／μｇ）、本発明のアネキシンＶに安定に結合した。適切な放射線化学収量および良好な放射線化学純度が得られた。活性化された血小板への結合試験もまた実施し、放射標識したアネキシンＶ結合体は、活性化された血小板に良好に結合した。Ｎ₂Ｓ₂およびＮ₃Ｓキレートは、業界において知られている。例えば、好ましいＮ₂Ｓ₂キレートは、米国特許第４，８９７，２２５号明細書に記載されており、好ましいＮ₃Ｓキレートは、米国特許第４，９６５，３９２号明細書に記載されている。本発明は、この安定なキレート化技術を、アネキシン分子の血栓症標的能力を示し、これにより血管血栓をインビボで迅速に視覚化することができる画像化剤を提供するのに用いた。本発明の放射標識したアネキシンを用いて、代謝的に分解された放射標識した結合体から生じる高レベルの背景放射活性を低減または除去する血栓症画像を得ることができる。また、放射標識したアネキシンは、非標的細胞部位への臨床的に受入れられない毒性を回避する。Ｔｃ−９９ｍで放射標識したアネキシンＶは本明細書中の実施例ＩＩＩで述べたブタにおける実験において、Ｉ−１２３より良好な性能を示した。Ｎ₂Ｓ₂またはＮ₃Ｓキレートを用いてアネキシンＶを放射性核種で放射標識することは、プレフォームド(pre-formed)またはポストフォームド(post-formed) 方法により実施することができる。即ち、放射性核種は、アネキシンＶへのキレートの結合の前（プレフォームド）または後（ポストフォームド）にキレート内にキレート化される。プレフォームド方法が好ましく、実施例ＩおよびＩＩにおいてこれらの適切な方法を述べる。他の実験により、プレフォームド放射標識方法で、２つの放射分析ピークが、ＨＰＬＣ分析により得られることが示された。２つのピークの出現は、システイン結合アネキシンＶおよびリシン結合アネキシンＶの結果である。従って、アネキシンＶのシステインアミノ酸を、除去するかまたは硫黄非含有アミノ酸で置換してモノマー的に標識したアネキシンＶを生じる。実施例Ｖ参照。アネキシン分子は、約２〜約６個の末端アミノ酸残基を加えることにより変性させて、アネキシン分子とキレートとの間の結合反応を促進することができる。この変性は、タンパク質化学的方法によりまたは適切な融合タンパク質の生成により行うかまたは有用な他の方法により行う。本発明の放射標識したアネキシンは、更に、前に製造されたＩ−１２３で標識したアネキシンよりも、低温キット中のパッケージングにより分析可能である点で利点を提供する。即ち、アネキシンおよびキレート成分は、個別にガラスビンに入れ、Ｔｃ−９９ｍ成分（および場合によっては、互いに別のガラスビンに入れられた）から個別に得られる。血栓画像化が必要である患者を識別する際には、低温キットを順に並べるかまたは貯蔵から取り出すことができる；Ｔｃ−９９ｍは放射性医薬品または他の源から得られる；プレフォームドまたはポストフォームドキレート化方法を実施することができる；放射標識したアネキシンを患者に投与する；患者は次に画像化される。結合体成分の無菌のパイロゲンのない環境での凍結乾燥およびガラスビン入れは、当業者に知られている方法により、良好な製造実際、特に生体物質に関する実際で行う。本発明の放射標識したアネキシンは、診断的に有効な量の放射性核種を標的部位に放出する量で投与する。適切な投与量は、大いに患者特異性である種々の要因に依存する。また、放射標識したアネキシンの成分は、当業者に知られているかまたは慣用されている方法により投与量を与える。一般的に、放射標識したアネキシンを、大きい動物に、患者の生理学的特性および伴われるまたは疑われる慢性病気に依存して、受容者の体重１ｋｇあたり約０．３〜３００μｇの範囲内の投与量で投与し、約３〜１０μｇ／ｋｇが好ましい。当業者は、所与の受容者に対して、所与の照準で、適切な投与量および投与経路を同定することができる。本発明の放射標識したアネキシンを、任意の好都合な方法により投与することができる。例えば、静脈内注入を用いて放射標識したアネキシンを投与することができる。他の投与経路もまた、本発明を実施するのに有用である。例示的な付加的な投与経路は、動脈（例えば冠動脈）、冠動脈内、リンパ球内、膜内または他の腔内経路等による注射である。放射性核種を投与した後、放射性核種の性質および投与目的に依存して、受容者は、放射性核種が局在する部位からの放射活性発光の検出のための種々の手順をうけることができる。例えば、Ｔｃ−９９ｍを含む結合体は、ガンマカメラにより画像化することができる。本発明を以下の実施例によりさらに説明する。これらの実施例は例示のためのものであり、本発明を限定するもではない。実施例Ｉアネキシン−Ｎ₂Ｓ₂キレート結合体を放射標識する手順アネキシンＶは、種々の組織抽出物、例えば肝臓、肺および胎盤から、例えば Funakoshi等、「Biochem.」26：8087−92、１９８７）；Tait等、「Biochem.」2 7 ：6268−76、１９８８；および米国特許第４，９３７，３２４号明細書に記載されたように分離することができる。さらに、アネキシンＶを、Ｅ．coli中で、 Tait等、「Archives of Biochemistry and Biophysics」288 ：141−44、１９９１に記載されたよう発現させることができる。アネキシンＶを、Ｔｃ−９９ｍで、ジアミドジメルカプチドＮ₂Ｓ₂キレートを用いることにより、「J．Nucl．Med．」32：1445−51、１９９１に記載されたようにオンコトラック(OncoTrac)(登録商標)スモールセルラングキャンサーイメージングキット(Small Cell Lung Cancer Imaging Kit)標識方法で放射標識した。アネキシンＶをＴｃ−９９ｍで放射標識する好ましい方法は、Ｃ−１８ベーカー(Baker)で精製したＴｃ−９９ｍ−Ｎ₂Ｓ₂−ＴＦＰを用いる改良されたオンコトラック（登録商標）キット方法を構成する。この方法において、酸性化された活性エステル溶液を、０．１６ｍｌの０．２Ｍ塩酸：氷酢酸（１４：２の比率）を０．６ｍｌの２，３，５，６−テトラフルオロフェニル４，５ビス−（Ｓ− １−エトキシエチルメルカプトアセトアミド）ペンタノエート（０．３ｍｇ、０．０００５モル、０．９ｍｌのイソプロピアルコール中に新たに溶解した）に溶解させた溶液を加えることにより調製した。次に、この溶液０．５ｍｌを、１．１ｍｌのＴｃ−９９ｍ−グルコネート（０．１２ｍｇのＳｎＣｌ₂・２Ｈ₂Ｏ、５．０ｍｇのグルコン酸ナトリウムおよび１００ｍＣｉ／ｍｌの〔Ｔｃ−９９ｍ〕過テクネチウム酸塩から、即ちオンコトラック（登録商標）キット標識手順の第１段階でｐＨ６．１〜６．３で調製した）に加えた。反応混合物を７５℃で１５分間加熱し、次に氷上で冷却した。形成したＴｃ−９９ｍ−４，５−ビス（チオアセトアミド）ペンタノエートのＴｃ−９９ｍトランスキレート化テトラフルオロフェニル活性エステル誘導体を、反応混合物を特定の条件に調整したＣ−１８カートリッジ(Ｊ．Ｔ．Baker)に装填し、２．０ｍｌの水で８回洗浄し、次にカラムで５分間乾燥し、１００％アセトニトリルで溶出させることにより精製した。溶媒をＮ₂の定常流中で蒸発させた。次に、０．１５ｍｌのリン酸緩衝液（ＰＢＳ）、０．１５ｍｌのアネキシンＶ（２．３５ｍｇ／ｍｌ）および０．２ｍｌの０．２Ｍ重炭酸塩（ｐＨ１０．０）を加えてＴｃ−９９ｍ−Ｎ₂Ｓ₂に結合させた。室温で２０分後、Ｔｃ−９９ｍ−Ｎ₂Ｓ₂−アネキシンＶ結合体を、ＰＢＳで平衡にしたＧ−２５セファデックス（Sephadex）（ＰＤ−１０）カラム(Pharmac iaから市場で入手できる)を通すことにより精製した。フラクション（１．０ｍｌ）を採集し、アネキシンＶを含むフラクションをプールした。タンパク質濃度を２８０ｎｍにおける紫外線吸収により測定した。Ｔｃ−９９ｍ−アネキシンＶ（３００〜３５０ｍｇ）結合体溶液を希釈し、注射前にウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を１５〜２０ｍｇＢＳＡ／ｍｌＰＢＳの最終濃度で含むＰＢＳ中に貯蔵した。実施例ＩＩアネキシン−Ｎ₃Ｓキレート結合体を放射標識する手順Ｓ−ベンゾイルメルカプトアセチルグリシルグリシルグリシン（Ｓ−ベンゾイルＭＡＧ₃）を、米国特許第４，９６５，３９２号明細書に記載された手順により調製した。次に、２５μｇのＳ−ベンゾイルメルカプトアセチルグリシルグリシルグリシンを、０．１０ｍｌの１．０Ｍ炭酸塩緩衝液（ｐＨ１２）中に溶解した。次に、７５ｍＣｉのＴｃ−９９ｍ過テクネチウム酸塩を、約１．０ｍｌ、次に１．０ｍｇの新たに溶解したジチオン酸ナトリウム（１０ｍｇ／ｍｌ）に加えた。この混合物を１００±４℃で３分間加熱し、次に氷浴中で５分間冷却して、ＩＴＬＣ（ＣＨ₃ＣＮ溶媒）；陰イオン交換ＨＰＬＣ（ベックマン(Bechman)ＡＸ、１０ミクロン０．０１ＭＮａ₂ＳＯ₄／０．０１ＭＮａ₃ＰＯ₄，ｐＨ７．０；および逆相ＨＰＬＣ（ベックマンＯＤＳ，５ミクロン２％ＣＨ₃ＣＮ／０．０１ＭＮａ₃ＰＯ₄，ｐＨ７．０）により決定されたように、Ｔｃ−９９ｍ−ＭＡＧ₃が得られた。カルボン酸形態でのＴｃ−９９ｍ−ＭＡＧ₃錯体を次にエステル化した；０．２０ｍｌの１ＮＨＣｌ，０．３０ｍｌの０．２Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ６．０，１０．０ｍｇの２，３，５，６−テトラフルオロフェノール（ＴＦＰ）を０．０１ｍｌの９０％、ＣＨ₃ＣＮに溶解した溶液および１２．５ｍｇのＥＤＣ（１− （３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩）を０．１０ｍｌの９０％ＣＨ₃ＣＮに溶解した溶液を一緒にし、反応体を室温（２５±２ ℃）で１時間混合した。この時点で、Ｔｃ−９９ｍ−ＭＡＧ₃−ＴＦＰエステルの収率を、ＩＴＬＣ（ＣＨ₃ＣＮ溶媒）；陰イオン交換ＨＰＬＣ（ベックマンＡＸ、１０ミクロン０．０１ＭＮａ₂ＳＯ₄／０．０１ＭＮａ₃ＰＯ₄，ｐＨ７．０）；および逆相ＨＰＬＣ（ベックマンＯＤＳ，５ミクロン３４％ＣＨ₃ＣＮ／０．０１ＭＮａ₃ＰＯ₄，ｐＨ７．０）で測定した。この生成物を、Ｃ−１８ベーカーカラムを用いて精製した。反応混合物をカラム中に装填し、水で２回、次に１０％Ｃ₂Ｈ₅ＯＨ／０．０１ＭＮａ₃ＰＯ₄，ｐＨ７．０で８回洗浄した。生成物をＣＨ₃ＣＮで溶出し、アネキシンＶと結合させる前に溶媒を除去した。活性エステルのアネキシンＶへの結合を、アネキシンＶをリン酸緩衝液、ｐＨ９．５に溶解した溶液をＴｃ−９９ｍ−ＭＡＧ₃−ＴＦＰエステルに加えることにより実施した。反応を少なくとも３０分間実施し、所望の放射標識したアネキシン生成物を、ＰＤ−１０ゲル濾過カラムを通すことにより得た。実施例ＩＩＩ放射標識したアネキシンを用いた血栓画像化Ａ．動物の準備−ＬＡ血管血栓絶食させた２５〜３０ｋｇのヨークシャーブタ(Yorkshire swine)に、筋肉内投与テラゾール(Telazol)（５〜１０ｍｇ／ｋｇ）（ＡＶＥＣＯＣｏ．から市場で入手できる）および市場で入手できるアトロピン（１ｍｇ、米国ニュージャージー州チエリーヒル所在のElkins Sinn Inc.）を用いて鎮静剤を投与した。スリタル（Surital）（２００ｍｇ）（Abott Laboratoriesから市場で入手できる）麻酔を静脈内投与した。動物に挿管し、１．５〜２％のハロタン(Abott Lab oratoriesから市場で入手できる）並びに深いレベルの麻酔および生理的動脈血液ガスを得るのに十分な量のＯ₂で吸入麻酔した。連続的心電図モニタリングを、ワニ口クリップ電極を用いて設けた。頸部の切り落としを行い８フレンチカテーテル（French catheter）（ＵＳＣＩＣｏ．米国マサチューセッツ州ビレリカ所在）を右側総頸動脈中に配置して血圧および動脈血液ガスをモニタリングし、血液サンプリングを行った。ブタを右側横方向臥床位置に配置し、横方向の開胸を実施して心臓を露出させた。切開部を、開胸開創器により開放したままとした。心膜を開き、左心房付属体を左心房から血管クロスクランプ(cross-clamp)により分離した。ゴム栓をした鉗子を用いて、付属体をおだやかに押しつぶした。５分後、リシノール酸塩（１ｍｇ，ＩＣＮ Pharmaceuticals,米国カリフォルニア州コスタメサ所在）およびトロンビン（５０ｍｇ，Johnson and Johnson Co.，米国テキサス州アーリントン所在）をＬＡＡ（左心房付属体）中に２７Ｇａニードルを用いて注入した。１０分後にクロスクランプを除去した。つぶして損傷させてから１時間後、前記実施例Ｉに従って調製したＴｃ−９９ｍ−アネキシンＶを、耳静脈中に静脈内巨丸剤投与として投与した。次に静脈内ラインを生理的食塩水で洗浄した。７匹の動物において、Ｉ−１２５で標識したオボアルブミンを非特異性対照プレパラブル(preparable)として、例えばＦｒａｋｅｒ等、「Biochem．Biophys.Res.Commun.」80：８４９−５７，1978に記載された方法により投与した。要するに、Ｉ−１２５で標識したオボアルブミンをヨードゲン(Jodogen)法で、６００ｍｇのオボアルブミン(Sigma Chemical Co.，米国ミズーリ州セントルイス所在）およびＮａＩ−１２５（２ｍＣｉ，０．９２ナノモル）を用いて調製した。画像の取得を下記のようにして実施した。実験手順の終了時において（一般的に約１５０分）、動物を、８０ｍＥｑのＫＣｌの静脈内巨丸投与により絶命させ、この間動物は尚通常の麻酔下にあった。最終的な血液試料を採取して十分にカウントした。心臓を迅速に摘出し、洗浄して血液を除去し解剖して試料とし十分にカウントした。頸動脈、肺、肝臓、膵臓、筋肉および腎臓の付加的な試料を、若干の動物において得た。Ｂ．対照５種の異なるタイプの対照を用いた：オープンチェストシャム(open chest sham)：クローズチェストシャム(closed chest sham)；オボアルブミン；インジウム血小板；および非特異性Ｔｃ−９９ｍ標識抗体。１．オープンチェストシャム３匹の動物において、前記のようにして心臓を露出させたが、左心房を分離せず、つぶさず、リシノール酸塩／トロンビンを注入しなかった。コバルトマーカーを用いたマーカー画像化を前記のようにして実施し、ＬＡＡ暴露の３０〜６０分後にＴｃ−９９ｍ−アネキシンＶを注入した。画像化および試料取得は、前記Ａに記載したものと同様にした。２．クローズチェストシャム７匹の動物において、耳静脈ラインを確立した。開胸は実施しなかった。鎮静剤投与および麻酔は前記Ａと同様にした。Ｔｃ−９９ｍ−アネキシンＶ（＋／−他の対照放射性核種、例えばＩ−１２５オボアルブミンまたはＩｎ−１１１−血小板）を投与し、画像取得を実施した。３．オボアルブミンＩ−１２５オボアルブミンを、負の対照タンパク質として７匹の動物に投与した。オボアルブミンはアネキシンと類似する分子の大きさを有し、わずかに遅い血液クリアランスを示す。４．インジウム血小板Ｉｎ−１１１血小板標識を、７匹の動物に、正の十分にカウントするレベルとして実施した。Ｉｎ−１１１で放射標識した血小板を、st ratton等、「Am．J．Cardiol．」47：８７４，１９８１およびStratton等、「Ci rculation」69：５６１，１９８４に記載された方法に従って調製した。Ｉｎ− １１１−血小板の血清半減期が長いため、画像化は実施しなかった。５．非特異性Ｔｃ標識抗体単一の実験において、左心房（ＬＡ）血栓を前記方法により形成したが、Ｔｃ−９９ｍアネキシンＶを投与しなかった。代わりに、ＮＲ−ＬＵ−１０と呼ばれるＴｃ−９９ｍ−Ｆａｂフラグメントを投与した。ＮＲ−ＬＵ−１０は、分子量が１５０キロダルトンのＩｇＧ２ｂモノクローナル抗体であり、これは、ほとんどの腫瘍上に発現する約４０キロダルトンの糖タンパク質抗原を認識する。ＮＲ−ＬＵ−１０は、ヒト臨床試験において５６５人を超える患者に安全に投与された十分に特徴づけられたパンカルシノーマ(pancarcin oma)抗体である。ＮＲ−ＬＵ−１０−Ｆａｂを、既知の手法により調製し、「J ．Nncl．Med．」32：１４４５−５１，１９９１に記載された手順および実施例Ｉに記載された改良Ｃ−１８ベーカー精製Ｔｃ−９９ｍ−Ｎ₂Ｓ₂−ＴＦＰ方法に従って放射標識して放射標識したアネキシンＶを調製した。このＴｃ−９９ｍ− Ｆａｂ結合体を、十分なカウンティングおよび画像化の両方に関する負の対照とした。Ｃ．画像化コバルトマーカーをＬＡＡの露出面上に配置し、開胸開創器に固定した手術テープで一定の位置に保持した。このテープを、マーカーが各心臓サイクルと共にＬＡＡと共に一般に移動するように調整した。マーカー画像化を各平面画像に関して１０秒間および各断層撮影スライスに関して１０秒間得た。次にコバルトマーカーを除去した。一般的用途のコリメーターを有するゼネラルエレクトリックスターポートカメラ(General Electric Starport Camera)を用いて、Ｔｃ−９９ｍ画像を得た。５分間の平面画像を左側の横方向、４５ＬＡＯ，および前面において連続的に得た。これらに続いて断層撮影の取得を１０分間行った。３回の平面および１回の断層撮影のこれらの完全なセットの取得を、全部で５セットくりかえした。一連の画像化手順の全体にわたりブタまたは画像化構台が動かないように注意した。画像を、ＶＡＸメインフレームシステムに従属して作動するマイクロデルタ(M icrodelta)コンピュータに記録した。画像をテープまたはＶＡＸハードドライブに記憶させた。平面画像分析は、第１に画像をマーカーで観察し、観察末端スクリーンにおけるマーカー位置を記録することから成っていた。Ｔｃ−９９ｍ−アネキシンＶ注入の後に得られた第１の画像を用いて、心臓血液プールを決定した。その後の画像各々を、マーカーおよび参照として初期血液プールを用いて観察し、分析した。各画像を陽性、中間または陰性として記録した。１３匹の動物は、左心房血栓が形成しており、これを前記のようにして画像化した。１２匹の動物に画像化のためにＴｃ−９９ｍ−アネキシンＶを注入し、１匹の動物には、対照として、非特異性Ｔｃ−９９ｍ−Ｆａｂを注入した。クロースチェスト画像化を７匹の動物において心房を損傷させることなく実施し、オープンチェストシャム実験を３匹の動物において実施した。心房血栓を有する動物において、Ｔｃ−９９ｍ−アネキシンＶの投与後３５分以内に撮影したすべての平面画像を陰性であった。７０分以上において撮影した９つの心房血栓平面画像は陽性であり、１つは中間であり、２つは陰性であった。心房血栓の断層撮影はすべて、注入から２時間を超える画像化時間において、陽性（ｎ＝１０）または中間（ｎ＝２）のいずれかであった。Ｔｃ−９９ｍ−アネキシンＶを投与してから平面画像が陽性になるまでの平均時間は、８２分（３５〜１３５分）であった。クローズチェスト対照の動物はいずれも、陽性の画像を示さなかった。３匹のオープンチェストシャムのうち１匹は、８５分後において陽性の画像を示した。この偽りの陽性は、手術により誘発された血栓の形成の結果であると考えられる。これらの結果は、Ｔｃ−９９ｍ−アネキシンＶの静脈内投与により、結合体の投与から短時間のうちに、心房血管血栓を識別する診断的画像が得られたことを示す。Ｄ．試料採集前記した試料（血液試料と組織試料と両方）を秤量し、ガラスビン中に入れ、直ちにＴｃ−９９ｍをカウントした。Ｔｃ−９９ｍが崩壊した後（代表的には５〜７日後）、試料を再びアッセイしてＩ−１２５カウントを得た。各ガラスビン中の試料を１分間カウントした。このカウントを崩壊、次に重量に関して補正しカウント／分／ｇとして記録した。各試料に関するカウント／分／ｇの値を次に最終血液標本のカウント／分／ｇの値を除することにより標準化した。従って、各試料に関する結果を最後の血液試料に対する比率で計算し、動物間で有意の比較ができるようにした。この手順を、所与の実験においてすべての放射性核種に関して実施した。表Ｉは、種々の組織試料に関する十分にカウントした比率を示す。損傷を受けた組織および血栓に関しては、通常複数の標本を同一の動物から採取した。これらの場合において、任意の１つの標本に関する最大比率を、採取したすべての標本の平均と共に記録する。各動物の最大値を、すべての動物に関して平均し、最大Ａnx−Ｖ比率(Maximum Anx-V Ratio)として記録する。これらの結果は、Tc-99m-アネキシンＶが心房血栓および損傷を受けた左心房に選択的に局在し、最高の非標的局在は腎臓において発生したことを示す。腎臓におけるレベルは、Ｔｃ−９９ｍ−アネキシンＶの腎臓経路を通っての排出を少なくとも部分的に示す。実施例ＩＶアネキシンＶの細胞発現クローンを生成する方法親クローン、λＨＰＡＰ１．６は、Funakoshi等、「Primary Structure of Hu man Placental Anticoagulant Protein」、Biochemistry，第２６巻、第８０８７−８０９２頁（１９８７）に記載されている。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて、アネキシン遺伝子をλＨＰＡＰ１．６親クローンから増幅した。センスプライマー（ＣＡＴＡＴＧＧＣＡＣＡＧＣＴＴＣＴＣＡ）はＮｄｅＩ制限部位（下線）を含んでおり、アネキシンリーダー配列の最初の１６個のヌクレオチドは、ＡＴＧ開始コドンで始まっている。アンチセンスプライマー（ＧＣＡＴＣＣＴＴＡＧＴＣＡＴＣＴＴＣＴＣＣＡＣＡ）は暗号配列の末端、終結コドン（太字）およびＢａｍＨＩ制限部位（下線）を暗号化していた。ノーバゲン(Novagen)(米国カリフォルニア州パロアルト所在)から得られたＰＣＲ生成物およびプラスミドｐＥＴ−１２ａ（図２）をそれぞれＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩで消化し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼと共につないだ。結合溶液の一部をＥ．Ｃｏｌｉホスト菌株に形質転換し、アンピシリンを含む普通寒天プレート上に選択した。形成したクローンからのプラスミドをｐＥＴ−１２ａ− ＰＡＰＩ−Ｅ２８７Ｇ、７／１６／９３、クローン１と表示した。ディデオキシＤＮＡ配列分析により、このプラスミドは、２つの突然変異〔８５５Ｇ→Ａ（サイレント）：８６０Ａ→Ｇ（Ｇｌｕ−２８７をＧｌｙ−２８７に転化）〕を除いて、野性型のアネキシン配列と一致するＤＮＡを含むことが示された。ｐＥＴ−１２ａ−ＰＡＰ−Ｅ２８７Ｇ、７／１６／９３、クローン１中に存在する配列の変化は、以下のようにして補正した。プラスミドを、両方の突然変異体を含む約２４０の塩基対のフラグメントを切り取る制限酵素ＳｆｕｌおよびＢａｍＨＩで消化した。このフラグメントを、２４０の塩基対フラグメントで、野性型配列を含むことが知られている独立したクローンから置き換えた。このＤＮＡをつなぎ、Ｅ．Ｃｏｌｉホスト菌株に形質転換した。プラスミドＤＮＡを含むＥ．Ｃｏｌｉコロニーを、普通寒天プレートを含むアンピシリン上で選択した。形成したクローンは、プラスミドｐＥＴ−１２ａ−ＰＡＰ１、３／７／９４、クローン１（図３）を収容していた。ＤＮＡ配列決定により、プラスミドにおけるアネキシン暗号化配列が野性型配列と正確に一致することが確認された。ノーバゲンから得られたホスト菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）をプラスミドｐＥＴ− １２ａ−ＰＡＰ１、３／７／９４、クローン１で形質転換した。グリセロールストックを、形成した形質転換細胞ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＥＴ−１２ａ−ＰＡＰ１、３／７／９４、クローン１）で製造し、≦−６５℃で貯蔵した。液体培養液中での３７℃におけるＥ．ＣｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＥＴ −１２ａ−ＰＡＰ１、３／７／９４、クローン１）の成長の結果、Ｅ．Ｃｏｌｉ細胞周辺腔にアネキシンＶタンパク質が蓄積した。実施例ＶアネキシンＶを変性させる手順プラスミドｐＥＴ−１２ａは、前記実施例ＩＶに記載した。アネキシンアミノ酸突然変異体遺伝子をｐＥＴ−１２ａプラスミド上のＮｄｅＩとＢａｍＨＩ制限部位との間に配置した。アネキシンＶの独立した変性を、ＰＣＲ増幅を用いて、部位特異的なアミノ酸変化により発生させた。この変化を達成するために、アネキシンの３′末端のアンチセンス方向においてアニル化したオリゴヌクレオチドを作成した。本明細書中に記載したアネキシンＶの特定の変化は、システイン残基（３１６の位置）のアラニンでの置換である。この変化を達成するために、ヌクレオチド配列をＴＧＴからＧＣＡに変化させた。このオリゴヌクレオチドは、ＢａｍＨＩ制限酵素部位および終結コドンを含んでいる。センスオリゴヌクレオチドは、ＮｄｅＩ制限部位またはアネキシンＶの５′末端のすぐ上流のｐＥＴ−１２ａのＴ７プロモーター領域内でアニル化する。以下にアンチセンスおよびセンスオリゴヌクレオチド配列をそれぞれ示す： (Nx168 Cys−Ala アンチセンス）５′GTACCTGGATCCTTAGTCATCTTCTCCGCGAGCAGCAGAAGAGCTTTCTT ３′；および(T7 センス) ５′CGAAATTAATACGACTCACTATAGGG３′ Ｎｘ１６８およびＴ７オリゴヌクレオチドを、ＤＮＡシンセサイザー、モデル３８１Ａ（アプライドバイオシステムインコーポレイテッド(Applied Biosy stem Inc.)、モデル３８１Ａ）を用いて合成した。合成が完了した後、両方のオリゴヌクレオチドを前記製造者のプロトコルの付録(appendix)５に関して脱保護 (deprotected)した。精製を、セファデックス(Sephadex)（登録商標）Ｇ−２５カラム（ファーマシア(Pharmacia)、スウェーデン国アップサラ所在）を用いて行った。ＰＣＲ反応を、ウルトマ（ＵｌＴｍａ）（登録商標）ポリメラーゼ（パーキンエルマー(Perkin Elmer)、米国コネティカット州ノーウォーク所在）を用いて行った。反応を、約１０ｎｇのｐＥＴ１２ａ−アネキシンＶ鋳型、３０ピコモルのＴ７およびＮｘ１６８オリゴヌクレオチドおよび０．４ｍＭの各ヌクレオチドを用いて行った。鉱油オーバーレイを含ませた。反応をコイ(Coy)温度循環器(te mperature cycler)、モデル１１０Ｐ中に配置し、９４℃で５分間インキュベートした。インキュベーション約２分で、０．５ユニットのポリメラーゼを加えた。次に、９４℃で３０秒間、５５℃で１分間、７４℃で１分間、反応を３０回くりかえした。次に反応を５分間７４℃でインキュベートし、次に１５℃で浸漬した。形成したアネキシン−ａｌａ置換遺伝子を次に、製造者のプロトコルに従って、ＤＮＡ精製キット(Promega Magic^TMPCR Preps DNA Purification System、米国ウイスコンシン州マジソン所在）を用いて精製した。次に、アネキシン−ａｌａおよびｐＥＴ−１２ａをＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩ（ギブコ(Gibco)／ＢＲＬ、米国メリーランド州ガイサーブルグ所在）制限酵素で消化した。次に、消化生成物を、アガロースゲル電気泳動により精製した。適切なバンドを切り取り、製造者のプロトコルに従って、ジーンクリーン(Gene Cl ean)ＩＩ（登録商標）キットを用いて精製した。次に、アネキシン−ａｌａとＰＥＴ−１２ａとを、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（プロメガ）で１２〜１８時間４℃でつないだ。アネキシン−ａｌａ−ＰＥＴ−１２ａをＥ．Ｃｏｌｉ菌株ＤＨ５αマックス効率的相補細胞（ギブコ／ＢＲＬ）に形質転換した。ｐＥＴ−１２ａプラスミドに関する任意の他の適切なホスト菌株を用いた。Ｅ．Ｃｏｌｉ形質転換細胞をＬＢアガー（ギブコ／ＢＲＬ）上に配置し、１００μｇ／ｍＬのアンピシリン（米国コネティカット州ニューハーベン所在のインターナショナルバイオテクノロジースインコーポレイテッド(International Biotechnologies Inc.)を加え、３７℃で１２〜１８時間インキュベートした。当業者に明らかな適切なコロニーを次に、テリフィックブロス(Terrific Broth)（ギブコ／ＢＲＬ）中に配置するために選択し、これに１００μｇ／ｍＬのアンピシリン（インターナショナルバイオテクノロジーズインコーポレイテッド）を加えた。ＬＢ寒天−プレートからの若干のコロニーを選択し、増殖させた。プラスミドＤＮＡを、プロメガスウィザードミニプレップ(Promega's Wizard miniprep )精製キットを用いて精製した。ＤＮＡプラスミドを精製した後、コロニーを配列分析によりスクリーニングして、特定の選択したクローンが、アミノ酸変性または変化を受けたことを確認した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者レノジョンエムアメリカ合衆国ワシントン州 98036 ブライアーエルムドライブ 2452 (72)発明者タイトジョナサンアメリカ合衆国ワシントン州 98125 シアトルサーティナインスアヴェニューノースイースト 13716 (72)発明者ストラットンジョンアメリカ合衆国ワシントン州 98119 シアトルエイスアヴェニューウエスト 1411

Claims

【特許請求の範囲】１．診断学的画像化剤と共に放射標識するのに適するアネキシン含有結合体において；アネキシン；およびアネキシンに共有結合したＮ₂Ｓ₂キレートを含むことを特徴とするアネキシン含有結合体。２．アネキシンがアネキシンＶであることを特徴とする請求の範囲１記載のアネキシン含有結合体。３．アネキシンが変性され、変性がシステインアミノ酸の除去を含むことを特徴とする請求の範囲１記載のアネキシン含有結合体。４．変性がシステインアミノ酸の硫黄非含有アミノ酸での置換を含むことを特徴とする請求の範囲１記載のアネキシン含有結合体。５．硫黄非含有アミノ酸がアラニンを含むことを特徴とする請求の範囲４記載のアネキシン含有結合体。６．次式：で表わされることを特徴とする請求の範囲１記載のアネキシン含有結合体。７．血管血栓を画像化するのに適する放射標識したアネキシンにおいて、この放射標識したアネキシンが：アネキシン：アネキシンに共有結合したＮ₂Ｓ₂キレート；キレートによりキレート化された診断学的放射性核種を含むことを特徴とする放射標識したアネキシン。８．アネキシンがアネキテンＶであることを特徴とする請求の範囲７記載の放射標識したアネキシン。９．アネキシンが変性されており、変性がシステインアミノ酸の除去を含むことを特徴とする請求の範囲７記載の放射標識したアネキシン。 10．変性が、システインアミノ酸の硫黄非含有アミノ酸での置換を含むことを特徴とする請求の範囲７記載の放射標識したアネキシン。 11．硫黄非含有アミノ酸がアラニンを含むことを特徴とする請求の範囲１０記載の放射標識したアネキシン。 12．次式：で表されることを特徴とする請求の範囲７記載の放射標識したアネキシン。 13．放射性核種がTc-99m，Re-186，Re-188，Pd-100，Bi-212，Pb-212，Pd-109およびCu-67から成る群から選択されていることを特徴とする請求の範囲７記載の放射標識したアネキシン。 14．放射性核種がTc-99mであることを特徴とする請求の範囲７記載の放射標識したアネキシン。