JPH09509066A - Ｃｒｆ受容体のクローニングと組換え体産生 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明によると、副腎皮質刺激ホルモン放出因子（ＣＲＦ）に対して、ＣＲＦの≦１０ｎＭの濃度が前記受容体タンパク質の結合部位の≧５０％を占めるほど、充分な結合アフィニティを有することを特徴とする、新規なＧ−タンパク質共役受容体タンパク質（ＣＲＦ−Ｒ）を提供する。このような受容体をコードする核酸配列、同受容体を用いるアッセイ、並びに同受容体に由来する抗体も開示する。本発明のＣＲＦ−Ｒは例えば、それに対する抗体の産生に関するバイオアッセイ、このようなタンパク質及び／又は抗体を含む治療組成物におけるような、種々な方法で使用可能である。

Description

【発明の詳細な説明】 ＣＲＦ受容体のクローニングと組換え体産生 発明の分野 本発明は受容体タンパク質、同タンパク質をコードするＤＮＡ配列、及びそれ の種々な用途に関する。 発明の背景 副腎皮質刺激ホルモン放出因子（ＣＲＦ）は、副腎皮質グルココルチコイド産 生を増加させる、下垂体の副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）の分泌と生合成と を刺激する４１残基視床下部ペプチドである。ＣＲＦは最初、単離され、この視 床下部−下垂体−副腎軸（ＨＰＡ）におけるその役割に基づいて特徴づけられた （Ｖａｌｅ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２１３巻：１３９４〜１３９７（１９８１）） 。しかし、さらに最近では、ＣＲＦが中枢神経系（ＣＮＳ）並びに例えば副腎及 び精巣［Ｓｗａｎｓｏｎ等，Ｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ ３６巻： １６５〜１８６（１９８３）；Ｓｕｄａ等，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏ ｌ．Ｍｅｔａｂ．５８巻，９１９〜９２４（１９８４）；ＦａｂｂｒｉとＤｕｆ ａｕ，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１２７巻，１５４１〜１５４３（１９９０ ）］と炎症部位とのような神経外組織(extra-neural testes)）(この場合には、 パラクリン調節因子又は神経伝達物質としても作用する)内に広く分布している ことが判明している。 ＨＰＡ軸活性化の仲介におけるＣＲＦの重要な役割の他に、ＣＲＦがストレス 反応中に生ずる自律性及び挙動性変化を調節することも判明している。これらの 挙動性変化の多くはデキサメタソン処理及び下垂体切除に不感受性であることか ら、ＨＰＡ活性化とは独立的に生じることが判明している［Ｂｒｉｔｔｏｎ等， Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．３８巻：２１１〜２１６頁（１９８６）；Ｂｒｉｔｔｏｎ等 ，Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．３９巻：１２８１〜１２８６頁（１９８６）；Ｂｅｒｒｉ ｄｇｅとＤｕｎｎ，Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｃｈ．Ｂｅｈａｖ．３４巻：５１７〜５ １９（１９８９）］。さらに、ＣＮＳ中へのＣＲＦの直接注入は、種 種なストレッサーに対する自律性及び挙動性反応を模倣する［Ｓｕｔｔｏｎ等， Ｎａｔｕｒｅ２９７巻：３３１〜３３３（１９８２）；ＢｒｏｗｎとＦｉｓｈｅ ｒ，Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．２８０巻：７５〜７９（１９８３）；Ｓｔｅｐｈｅｎ ｓ等，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，９巻：１０６７〜１０７０（１９８８）；Ｂｕｔｌｅ ｒ等，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１０巻，１７６〜１８３（１９９０）］。さらに 、ＣＲＦ又はＣＲＦアンタゴニスト（α−ヘリカルＣＲＦ９−４１）の末梢投与 はこれらの変化に影響を与えることができず、このような機能におけるＣＲＦの 直接脳作用を支持する。ＣＲＦアンタゴニストは、末梢投与すれば、ＡＣＴＨ分 泌のストレス仲介上昇を弱め、脳室中へ投与した場合には、自律性活性及び挙動 のストレス誘導変化を軽減することができる。 ＣＲＦの広範囲な解剖学的分布と多重な生物学的作用との結果として、この調 節ペプチドが無数の生物学的プロセスの調節に関与すると考えられる。このペプ チドは炎症反応の制御に関係していた。他方では、ＣＲＦがある種の動物モデル において前炎症性役割(proinflammatory role)を果たすが、他の場合には、ＣＲ Ｆが血管透過性の損傷誘導性上昇を減ずることによって炎症を抑制することがで きることが観察されている。 ＣＲＦが生殖腺、胎盤及び副腎によるステロイド産生を修正することができる ことも判明している。ＣＲＦはまた、上腸間膜動脈床の拡張及び冠状動脈の拡張 のような血管効果も有する。ＣＲＦが中枢神経系に作用して、胃腸機能を改良す ること以外に、ＣＲＦが胃腸管に直接作用することも判明している。 内分泌系、胃腸系、生殖系、中枢神経系及び免疫系内におけるＣＲＦの役割並 びにＣＲＦとその同族(cognate)受容体との相互作用をさらに完全に研究するた めに、ＣＲＦ受容体の容易な供給源を入手可能にすることが好ましいと考えられ る。さらに、組換え受容体の入手可能性は、ＣＲＦとＣＲＦ類似(CRF-like)化合 物とを分析するための費用のかからない、より感受性の大きい自動化手段を開発 し、ＣＲＦに基づく治療法を開発することを可能にすると考えられる。 ＣＲＦに対する反応性又は標的組織におけるＣＲＦ受容体の量がアルツハイマ ー病、メランコリー鬱病、神経性食欲不振、クッシング病、アルコール中毒症等 を含む種々な状況に応じて変化することが実証又は（ＣＲＦに対する感受性の変 化から）予測されている。このように、適当な診断アッセイに用いるための特異 的抗ＣＲＦ−Ｒと、ＣＲＦ受容体のための分子プローブとの開発が望ましい。 発明の簡単な説明 本発明によると、副腎皮質刺激ホルモン放出因子（ＣＲＦ）に高い結合アフィ ニティを有する、新規なＧタンパク質共役(coupled)タンパク質を提供する、前 記タンパク質は以下ではＣＲＦ受容体（ＣＲＦ−Ｒ）と呼ぶことにする。本発明 の受容体は視床下部−下垂体−副腎皮質軸の主要な神経性受容体であり、ストレ ス及び免疫チャレンジに対する内分泌反応、自律反応及び挙動反応の調整(coord inating)に重要な役割を果たす。ＣＲＦ−ＲはＣＲＦ刺激細胞内ｃＡＭＰ蓄積の シグナルを変換するので、アデニル酸シクラーゼに機能的に共役する(coupled) 。本発明のＣＲＦ−Ｒは例えばバイオアッセイに、それに対する抗体の産生のた めに、このようなタンパク質及び／又は抗体を含む治療組成物等のような、種々 な形式で用いることができる。 本発明の他の態様によると、いずれの化合物（例えば、アゴニスト及びアンタ ゴニスト）が本発明の受容体に結合することができるかを判定するために多数の 化合物を迅速にスクリーニングするために有用なＣＲＦ−Ｒを用いる結合アッセ イを提供する。本発明の結合アッセイは新規なＣＲＦ類似リガンド（例えば、推 定の(putative)哺乳動物サウバギン又はウロテンシン）を同定するためにも用い ることができる。試験サンプル（例えば、生物学的流体）に対して本発明の結合 アッセイを実施して、ＣＲＦ又はＣＲＦ類似化合物の有無を検出することもでき る。 本発明によると、ＣＲＦ−Ｒをコードする組換えＤＮＡ分子（又はそのフラグ メント）も提供する。ＣＲＦ−Ｒをコードする組換えＤＮＡ分子（又はそのフラ グメント）は、例えば、生物学的サンプル中のＣＲＦ−Ｒをコードする核酸の存 在を検出し、付加的ＣＲＦ受容体タンパク質を同定するためのプローブとして、 本発明の受容体タンパク質（又はその機能的フラグメント）の組換え体発現のた めに使用可能であるコーディング配列等として有用である。組換え体ヒトＣＲＦ −ＲはＣＯＳ細胞に発現されており、ＣＲＦ及びＣＲＦ類似体に高いアフィニテ ィで結合する。ＣＲＦ−Ｒの組換え体製造は上記形式でのそれらの使用を可能に する。ＣＲＦ−Ｒをコードする核酸のフラグメントも、ＰＣＲ増幅のためのプラ イマーとして使用可能である。さらに、ＣＲＦ−Ｒをコードする配列に由来する 配列も、特定種類の細胞への、有用な遺伝子を有するベクターの発現を目標とす る遺伝子療法用途に使用可能である。 本発明の他の態様によると、抗ＣＲＦ−Ｒ抗体も提供する。ＣＲＦ−Ｒと抗Ｃ ＲＦ−Ｒ抗体とは種々な組織サンプル（例えば、腫瘍組織等）におけるＣＲＦ− Ｒのレベルを測定するための診断アッセイに有用である。抗ＣＲＦ−Ｒ抗体はＣ ＲＦ−Ｒタンパク質の精製に用いることもできる。さらに、これらの抗体はイン ビボにおけるＣＲＦ−Ｒの生物学的効果を妨げる又は補助するために治療的に有 用であると考えられる。 種々な組織サンプル（例えば、腫瘍組織等）中のＣＲＦ−Ｒのレベルと、血管 流体サンプル中のＣＲＦ−Ｒペプチドフラグメント及びＣＦＲのレベルを測定す るための方法と診断系も提供する。これらの診断方法は、例えば、治療的有効量 の維持を容易にするために治療的に投与されたＣＲＦ−Ｒ（又はそのフラグメン ト）のレベルの監視に用いることができる。これらの診断方法は、ＣＲＦ又はＣ ＲＦ−Ｒの異常なレベルに起因する生理的障害の診断にも用いることができる。 ＣＲＦ−Ｒ、ＣＲＦを結合するＣＲＦ−Ｒフラグメント、又はこれらの類似体 はＣＲＦの効果を治療的に調節することができる。例えば、ＣＲＦ−Ｒフラグメ ントはＣＲＦ−ＲへのＣＲＦ結合を阻害することができ、下垂体細胞によるイン ビトロにおけるＣＲＦ誘導ＡＣＴＨ放出を阻害することができる。このように、 ＣＲＦ−Ｒを哺乳動物に治療的に投与して、過剰なＣＲＦによって生じる高ＡＣ ＴＨレベルを減じることができる。このような治療法は、例えば、クッシング病 等の治療に用いることができる。これらのＣＲＦ−ＲはＣＲＦを産生する下垂体 腫瘍の抑制(combating)にも有用である。さらに、これらを用いて、下垂体ＡＣ ＴＨ分泌を減ずることができ、このため、例えば神経性食欲不振又はアルコール 中毒症等に罹患した患者における慢性ストレス中のような、コルチゾールレベル が異常に高い状態下のコルチゾールレベルを減ずることができる。静脈内（ＩＶ ）投与したＣＲＦ−ＲはＣＲＦ誘導ＡＣＴＨ放出を防止するために有効である。 さらに、ＣＲＦ−ＲのＩＶ投与が腸通過時間を減じて、過敏性腸症候群を抑制す る ことができると考えられる。 図面の簡単な説明 図１は、ＣＯＳＭ６細胞中に一時的に発現するプラスミドｈｃｔＣＲＦＲ（“ ヒトクッシング腫瘍副腎皮質刺激ホルモン放出因子受容体”；ＣＲＦ受容体サブ タイプｈＣＲＦ−ＲＡ₁をコードする）の薬理学的特徴を説明する。図１は、実 施例３において説明するような、ｈｃｔＣＲＦ受容体（■）又はｒＧｎＲＨＲ（ □）によってトランスフェクトされたＣＯＳＭ６細胞から調製された膜にｏＣＲ Ｆが結合するときに、ｒ／ｈＣＲＦによる¹²⁵Ｉ（Ｎｌｅ²¹，Ｔｙｒ³²）ヒツジ ＣＲＦ（ｏＣＲＦ）の置換の結果を示す。データは、少なくとも４回反復した、 １回の代表的な実験からである。 図２Ａは、実施例４に説明するように、ＣＲＦ、ｈＧＲＦ（１−４０）ＯＨ、 ＶＩＰ、及びサケカルシトニンへの暴露による、ＣＯＳＭ６細胞（ＣＲＦ受容体 サブタイプＣＲＦ−ＲＡ₁をコードする、プラスミドｈｃｔＣＲＦによってトラ ンスフェクトされたもの）の細胞内ｃＡＭＰの刺激を説明する。 図２Ｂは、ホスホジエステラーゼ阻害剤，ＩＢＭＸ（３−イソブチル−１−メ チルキサンチン）によって前処理した（■）又は前処理しない（□）細胞中のＣ ＲＦ濃度を高めることによるＣＯＳＭ６細胞（ＣＲＦ受容体サブタイプＣＲＦ− ＲＡ₁をコードする、プラスミドｈｃｔＣＲＦによってトランスフェクトされた もの）内のｃＡＭＰの用量−反応刺激を説明する。 図２Ｃは、ＣＲＦアンタゴニストα−ヘリカル（９−４１）ＣＲＦによるＣＲ Ｆ刺激細胞内ｃＡＭＰの阻害を説明する。各測定値は、少なくとも２回反復して 、３通りに実施した代表的な実験から測定する。細胞はＩＢＭＸによって前処理 した。ラット／ヒト（ｒ／ｈ）ＣＲＦは、２μＭα−ヘリカル（９−４１）と共 に（実線）又は２μＭα−ヘリカル（９−４１）なしに（白線）加えた。 図３Ａと３ＢはマウスＣＲＦ−ＲＢ（配列番号：１０）とマウスＣＲＦ−ＲＡ （配列番号：１３）との配列比較を示す。ＰＡＭ２５０残基重量表と共にＪｏｔ ｕｎ−Ｈｅｉｎ方法を用いて、配列(alignment)を形成した。推定のトランスメ ンブランドメイン(transmembrane domain)を配列上の実線で示す。可能なグリコ シル化部位は（*）によって示す。 図４はＣＲＦ−ＲＢ₁によってトランスフェクトしたＣＯＳＭ６細胞からの膜 に結合した¹²⁵Ｉ−（Ｎｌｅ２１，Ｔｙｒ３２）ヒツジＣＲＳの競合置換からの 結果を示す。“Ｔ”は“総ホルモン”を意味し、“Ｂ”は“結合ホルモン”を意 味する。独立した３回の実験からのデータをプールする。 図５は、ｒ／ｈＣＲＦ（■）、サウバギン（○）、コバンザメウロテンシン（ △）、ｈＧＲＦ（１−４０）ＯＨ（□）及びＶＩＰ（□）によって刺激された、 ｐＣＲＦ−ＲＢ₁によるトランスフェクト済みＣＯＳＭ６細胞中の細胞内ｃＡＭ Ｐの蓄積を説明する。細胞が１μＭアンタゴニスト（ＤＰｈｅ¹²，Ｎｌｅ²¹，³⁸ ）ｈＣＲＦ（１２−４１）に暴露される場合の刺激の抑制に関するデータ（◆） も示す。データは少なくとも２回反復した、実施例９に記載の実験の代表的１回 からである。誤差範囲(error bar)はＳＥＭを表し、目視不能である場合には、 記号よりも小さい。 発明の詳細な説明 本発明によると、ＣＲＦリガンド若しくはＣＲＦ類似リガンドの≦１０ｎＭ濃 度が前記受容体タンパク質の約０．８ｎＭ（又は約１０〜２０ｐｍｏｌ受容体／ ｍｇ膜タンパク質）の結合部位の≧５０％を占めるように、ＣＲＦリガンド若し くはＣＲＦ類似リガンドに対して充分な結合アフィニティを有することを特徴と する、単離した哺乳動物Ｇタンパク質共役ＣＲＦ−Ｒタンパク質を提供する。 ＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリペプチド又はタンパク質の修飾語としての、本明細書と 請求の範囲とにおけるフレーズ“単離した(isolated)”の使用は、このように指 定されたＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリペプチド又はタンパク質がヒトの手によってこの ような形態で製造されて、それらのネイティブなインビボ細胞環境から分離され ることを意味する。このようなヒトの介入の結果として、本発明の組換え体の、 単離した及び／又は実質的に純粋なＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリペプチド又はタンパク 質は大量生産することができ、例えば特定の薬物又は化合物の同定のような、天 然に生成するＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリペプチド又はタンパク質が用いられないよう な方法に有用である。 本明細書で用いるかぎり、“哺乳動物”なる用語は、本発明のＣＲＦ−Ｒタン パク質が由来する多様な種、例えば、ヒト、ラット、マウス、ウサギ、サル、ヒ ヒ、ウシ、ブタ、ヒツジ、イヌ、ネコ等を意味する。本発明の受容体は例えば下 垂体細胞、胎盤細胞、脾臓細胞、副腎細胞、造血(hematopoietic)細胞、脳細胞 、生殖腺細胞、間葉細胞、腎臓細胞等のような、多様な組織ソースに由来するこ とができる。 本明細書で用いるかぎり、“ＣＲＦ−Ｆ”なる用語はＣＲＦリガンド及びＣＲ Ｆ類似リガンドに対する細胞のＧタンパク質共役反応に関与する単離した及び／ 又は実質的に純粋な受容体タンパク質サブタイプのファミリーを意味する。代表 的なＣＲＦペプチドはｒ／ｈＣＲＦ、ヒツジＣＲＦ（米国特許第４，４１５，５ ５８号を参照）等を含む。本明細書で用いるかぎり、“ＣＲＦ類似リガンド”な るフレーズは、天然生成の哺乳動物のＣＲＦのアミノ酸ソースとの実質的な相同 度（少なくとも２０％相同）を有する物質、並びに哺乳動物ＣＲＦと実質的に同 じ生物学的活性を有する、その対立遺伝子、フラグメント、同族体又は誘導体を 含む。適当なＣＲＦ類似リガンドは種々な脊椎動物種から得ることができ、サウ バギン（例えば、米国特許第４，６０５，６４２号参照）、ウロテンシン（例え ば、米国特許第４，９０８，３５２号、第４，５３３，６５４号、及び第４，５ ２５，１８９号参照）、米国特許第４，４１５，５５８号、第４，４８９，１６ ３号、第４，５９４，３２９号、第４，６０５，６４２号、第５，１０９，１１ １号（これらの特許の各々は参照することにより本明細書に取り込まれるものと する）に記載されたＣＲＦ類似体等のような化合物を含む。 このような受容体サブタイプは、大きな細胞外アミノ末端ドメインによって先 行され、大きな細胞内カルボキシ末端ドメインによって後続される、７個の推定 トランスメンブランドメインを典型的に特徴とする。本発明の典型的なＣＲＦ− Ｒ（配列番号：２，４，６及び１０に記載）のハイドロパシー(hydropathy)分析 は、Ｎ末端の可能なシグナルペプチドに相当する、約２０アミノ酸の８個の疎水 性領域と、それに加えた７個の推定トランスメンブランドメインとを実証する。 シグナルペプチドを除去した後に、典型的な本発明の受容体（例えば、配列番号 ：２に記載）は約４０〜４５キロダルトンの分子量を有する。 典型的なＣＲＦ−Ｒアミノ酸構造は、以下の記載する配列表の配列番号２，４ ，６，８及び１０に示す。配列番号：２に記載のＣＲＦ−Ｒはアミノ酸位置３８ ， ４５，７８，９０及び９８に５個の可能なグリコシル化部位を含む（本明細書で は、ＣＲＦ−ＲＡ₁と呼ぶことにする）。可能なタンパク質キナーゼＣホスホリ ル化部位は第１及び第２細胞内ループ内と、位置１４６、２２２、３８６及び４ ０８におけるＣ−末端尾部内に配置される。可能なカゼインキナーゼ１１及びタ ンパク質キナーゼＡホスホリル化部位は位置３０１と３０２にそれぞれ配置され る。配列番号：２に記載の本発明のＣＲＦ−Ｒの第３細胞内ループはβ₂−アド レナリン作動性受容体の第３細胞内ループ内に見られるＧ_s活性化領域と同様な アミノ酸配列を含む。 配列番号：２に記載の本発明のＣＲＦ−Ｒは適当な薬理学的特異性を有する、 すなわち、ヒト／ラットＣＲＦ、ヒツジＣＲＦ、ＣＲＦアンタゴニストα−ヘリ カル（９−４１）ＣＲＦ、（ＤＰｈｅ¹²，Ｎｌｅ²¹，³⁸）ｈＣＲＦ（１２−４１ ）、ウロテンシン、サウバギンに対する高いアフィニティと、生物学的に重要な 類似体、［Ａｌａ¹⁴］−ｏＣＲＦに対する非常に低いアフィニティとを有する。 非関連ペプチドの系列は、図２Ｃに示すように、不活性であり、例えば、成長ホ ルモン放出因子、サケカルシトニン、血管作動性腸ポリペプチド及びゴナドトロ ピン放出ホルモンのような化合物を含む。 結合アフィニティ（会合定数（Ｋ_a）又は解離定数（Ｋ_d）として表すこともで きる）はリガンドと受容体との相互作用の強度を意味し、受容体の結合部位の１ ／２（５０％）を占めるために必要なリガンドの濃度として表現することができ る。所定リガンドに対して高い結合アフィニティを有する受容体は少なくとも５ ０％結合状態になるために殆どリガンドの存在を必要とせず（それ故、Ｋ_d値は 小さい数である）；これに反して、所定リガンドに対して低い結合アフィニティ を有する受容体は５０％結合状態になるために高レベルのリガンドの存在を必要 とする（それ故、Ｋ_d値は大きい数である）。 前記受容体タンパク質に関する言及“１０ｎＭ以下（すなわち、≦１０ｎＭ） のＣＲＦ又はＣＲＦ類似ペプチドの濃度が前記受容体タンパク質の結合部位の≧ ５０％（すなわち、１／２以上）を占めるような、充分な結合アフィニティ”と は、前記受容体の約０．８ｎＭ（又は約１０〜２０ｐｍｏｌ受容体／ｍｇ膜タン パク質）の活性部位の少なくとも５０％をリガンドが占めるために、約１０ｎＭ 以下のリガンド（すなわち、ＣＲＦ）濃度が必要であるに過ぎず、非常に低いリ ガンド濃度が典型的に必要であることを意味する。現在、好ましい受容体は、受 容体結合部位の少なくとも５０％を占める（又は結合する）ために、僅か約１〜 １０ｎＭの範囲内のリガンド濃度が必要であるに過ぎないような、結合アフィニ ティを有する受容体である。 本発明の受容体ファミリーの要素は特定要素間の類似度に基づいて、種々なサ ブクラスに分割することができる。例えば、同じサブクラスのＣＲＦ受容体をコ ードするゲノム配列は典型的に、実質的に同じ制限マップを有するが、異なるサ ブクラスのＣＲＦ受容体をコードするゲノム配列は典型的に、実質的に異なる制 限マップを有する。さらに、受容体の同じサブクラスの要素をコードする配列は 低緊縮ハイブリッド形成条件下ではハイブリッド形成するが、高緊縮ハイブリッ ド形成条件下ではハイブリッド形成しないと考えられる。 このように、所定サブクラスの各要素は特定要素間の高い相同度（例えば、＞ ８０％総アミノ酸相同度）を有することによって同じサブクラスの他の要素に関 係するが、所定サブクラスの要素は異なるサブクラスの特定要素間の低い相同度 （例えば、約３０％から８０％までの総アミノ酸相同度）を有することによって 異なるサブクラスの要素とは異なる。 上記判断基準に基づいて、本明細書に述べる受容体種はＣＲＦ−ＲＡ又はＣＲ Ｆ−ＲＢサブタイプと名付けることができる。このように、配列番号：２に記載 される受容体はＣＲＦ−ＲＡサブタイプであり、本明細書ではｈＣＲＦ−ＲＡ₁ （ヒトＣＲＦ−Ｒ，サブタイプＡ，変異体１）と呼ばれる。配列番号：４に記載 したインサート配列を含むｈＣＲＦ−ＲＡ₁の修飾形を本明細書ではｈＣＲＦ− ＲＡ₂と呼ぶ。同様に、配列番号：６に記載した受容体を本明細書ではｒＣＲＦ −ＲＡと呼び（ラットＣＲＦ−Ｒ，サブタイプＡ）、配列番号：８と１０に記載 した受容体を本明細書ではｍＣＲＦ−ＲＢ₁（マウスＣＲＦ−Ｒ，サブタイプＢ ，変異形１）と呼ぶ。 マウスＣＲＦ−ＲＡ₁とＣＲＦ−ＲＢ₁受容体とは比較して、ヌクレオチドレベ ルにおいて約７０％相同性であり、アミノ酸レベルにおいて約６８％相同性であ ることが判明している（例えば、図３Ａと３Ｂ参照）。さらに、これらの２種 類の受容体間で維持される、幾つかの基本的構造特徴が存在する。可能なＮ−グ リコシル化部位の数と位置とは、同じである。Ｎ−末端ドメインには６個のシス テインが存在し、これがこの受容体ファミリーの特徴である。しかし、ＣＲＦ− ＲＢ₁受容体には、さらに２個のシステインが、１個はＮ−末端に、他の１個は 第１細胞外ループ（すなわち、ＥＣＬ−１）と第３トランスメンブランドメイン （すなわち、ＴＭＤ−３）との接合点に存在する。Ｎ−末端システインがシグナ ルペプチドによって除去され、後者のシステインがトランスメンブランドメイン 内に存在すると推定するならば、この受容体ファミリーの他の要素の場合と同様 に、ＣＲＦ−ＲＢ₁は細胞外領域中に６個のシステインを有することが考えられ る。 第１細胞内ループは、ＣＲＦ−ＲＡ₁内に存在するアルギニンの代わりにバリ ンが存在すること以外は、ＣＲＦ−ＲＡ₁とＣＲＦ−ＲＢ₁とで実質的に同じであ る。第２細胞内ループは３個のアミノ酸において異なるが、これらの変化は保存 性である。したがって、ＣＲＦ−ＲＢ₁中には、ＣＲＦ−ＲＡ₁中の、それぞれ、 ロイシン、アスパラギン酸及びアルギニンの代わりに、メチオニン、グルタミン 酸及びヒスチジンが存在する。第３細胞内ループはこれらの２種類の受容体の間 で１００％同じである。Ｃ−末端ドメインもこれらの２種類の受容体の間で高度 に保存される。細胞内ループ中の推定ホスホリル化部位もＣＲＦ−ＲＡ₁とＣＲ Ｆ−ＲＢ₁とで殆ど同じであり、唯一の例外はＣ−末端において生じ、この場合 にはＣＲＦ−ＲＡ₁中のＳＥＲ３８６がＣＲＦ−ＲＢ₁中のアラニンとして存在す る。 ＧＴＰ結合タンパク質に対する、続いてアデニル酸シクラーゼに対する本発明 のＣＲＦ受容体のカップリングの主要な決定因子は、第３細胞内ループとＣ−末 端とに在ると考えられる。ＣＲＦ−ＲＡ₁とＣＲＦ−ＲＢ₁との第３細胞内ループ 及びＣ−末端の高度な類似性のために、これらの２種類の受容体のカップリング とシグナル変換性質は非常に類似すると考えられる。実際に、データ（図５）は ＣＲＦ−ＲＡ₁とＣＲＦ−ＲＢ₁とのシグナル変換特性が殆ど同じであることを実 証する。これらの２種類の受容体の脱感作のより詳細な分析は、Ｃ−末端と他の 細胞内ループとにおける変化の結果としての微妙な差異を明らかにすると期 待される。 これらの２種類の受容体の間の主要な差異はＮ−末端ドメインに見られ、ここ にはＣＲＦ−ＲＢ₁では１６個の余分なアミノ酸が存在し、Ｎ−末端の残留部分 には有意な非保存性アミノ酸変化が存在する。マウスＣＲＦ−ＲＡ₁のゲノム配 列に基づいて、これらの２種類の受容体のアミノ酸配列がＮ−末端における第２ イントロン／エキソン接続点に非常に密接して相違し始め、これらの２種類の受 容体の間の相違(divergence)の一部が代替エキソン利用(alternative exon util ization)（すなわち、スプライス変異体）に由来し得るという可能性を高めてい ることは興味深い。実際に、Ｎ−末端プローブを用いる場合に、多重に保護され るＲＮＡ種の存在はこの受容体のスプライス変異体の存在と矛盾しない。 Ｎ−末端ドメインの他に、第１、第２及び第３細胞外ループ（ＥＣＬ−１、− ２及び−３）も有意な差異を含む。例えば、ＣＲＦ−ＲＢ₁における細胞外ルー プ−１はＣＲＦ−ＲＡ₁における対応ループよりも大きく荷電した残基を含む。 ＣＲＦ−ＲＡ₁における細胞外ループ−２は、ＣＲＦ−ＲＢ₁におけるグルタミン 酸の代わりにアルギニンを含む。細胞外ループ−３はこれらの２種類の受容体の 間で最も類似する。この受容体ファミリーにおける主要な結合決定因子はＮ−末 端領域と細胞外ループとであると、現在考えられる。それ故、細胞外ドメインに おける差異の存在は、これらの２種類の受容体の間の結合特異性が当然異なるこ とを示唆する。ウロテンシン（Ｋ_i＝０．７±０．３，ｎ＝３）とサウバギン（ Ｋ_i＝０．６±０．１，ｎ＝３）とは、ＣＲＦ−ＲＢに対してｒ／ｈＣＲＦ（Ｋ_i ＝１．３±０．２，ｎ＝６）よりも大きな効力を有する傾向を示す。 ｉｎ ｓｉｔｕハイブリッド形成研究は、ＣＲＦ−ＲＢに関連したｍＲＮＡが 、ＣＤＦ−ＲＡとはかなり異なる、中枢神経系への制限された分布を示すことを 実証する。したがって、これらの２種類の遺伝子（ＣＲＦ−ＲＡとＣＲＦ−ＲＢ ）に由来する受容体は、特に細胞外ドメインにおけるそれらの明確な組織分布と 構造多様性によって、本質的に異なる生物学的役割に寄与するように思われる。 これらの２種類の受容体のさらに詳細な比較はこれらの２種類の受容体の結合 特性の有意な差異を明らかにすると思われる。異なるＣＲＦ−ＲサブタイプがＣ ＲＦの異なる作用を仲介することも予想される。このように、種々なＣＲＦ−Ｒ サブタイプをコードする入手可能な核酸を有することによって、当業者は各ＣＲ Ｆ−Ｒサブタイプに特異的な特定の類似体を選別し、開発することができていた 。このようにして得られた類似体は各ＣＲＦサブタイプの活性を結合し、修飾す ることにおいてより特異的、強力かつ効果的である。 本発明の１実施態様では、本明細書で“ｈｃｔＣＲＦＲ”（以下で説明）と呼 ばれるクローンによってコードされるＣＲＦ−ＲＡが、ｒ／ｈＣＲＦ［Ｋ_d＝３ ．３±０．４５ｎＭ（ｎ＝４）］、ヒツジＣＲＦ［Ｋ_d＝２．３±０．６６ｎＭ （ｎ＝３）］；及びアンタゴニストαｈｅｌＣＲＦ（９−４１）［Ｋ_d＝１３． ０±５．２ｎＭ（ｎ＝３）］に対する高い結合アフィニティを有する。この受容 体は生物学的に無力な類似体［Ａｌａ¹⁴］−ヒツジＣＲＦに対して低い結合アフ ィニティを有する［Ｋ_d＞３００ｎＭ（ｎ＝２）］。本発明の他の実施態様では 、配列番号：２に記載するＣＲＦ−Ｒはｒ／ｈＣＲＦに対して結合アフィニティ ［Ｋ_d＝３．８±０．２０ｎＭ（ｎ＝１）］を有する。 本発明の現在好ましい受容体タンパク質は、配列番号：２、４、６、８及び１ ０に記載された配列と実質的に同じアミノ酸配列と、受託番号７５４７４でＡＴ ＣＣに寄託されたクローンｈｃｔＣＲＦＲのＣＲＦ−ＲＡ₁コード部分によって コードされるアミノ酸配列と実質的に同じであるアミノ酸配列と、これらの官能 性修飾形とを有する。当業者は、上記配列の無数の残基が、得られる受容体種の 生物学的活性を実質的に変化させることなく、他の化学的、立体的及び／又は電 子的に同様な残基によって置換されることができることを認識するであろう。 ｈｔｃＣＲＦＲクローンは、特許手続き上の微生物の寄託の国際承認に関する ブタベスト条約及びこの条約下で公布された規定の下にＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙ ｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）（１２３０１米国メ リーランド州ロックビル，パークローンドライブ２０８５２）に１９９３年６月 ２日に寄託された。寄託された物質のサンプルは、工業所有権当局とこの条約及 び規定の下に、さもなくば、この出願若しくはこの出願の優先権を主張する出願 が出願されるか又はこのような出願に与えられる特許が付与される、アメリカ合 衆国及び他の全ての国又は国際機関の特許法及び規定の下にそれらを受容する権 利が法律的にある、他の人に現在及び今後も入手可能である。特に、この出 願又はこの出願への優先権を主張する若しくはこの出願を取り込む出願に基づく 米国特許の発行時には、寄託物質の入手可能性に対するあらゆる制限が絶対的に (irrevocably)除かれる。 本明細書で用いるかぎり、“実質的に同じアミノ酸配列”とは、基準アミノ酸 配列に関して少なくとも約７０％の同一性を有し、基準アミノ酸配列によって定 義されるタンパク質に特徴的な、比較できる官能性及び生物学的性質を保有する アミノ酸配列を意味する。“実質的に同じアミノ酸配列”を有するタンパク質は 基準アミノ酸配列に関して好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは９０ ％の同一性を有し、約９５％を越えるアミノ酸同一性を有することが最も好まし い。 組換えＣＲＦ−Ｒタンパク質は、天然生成ＣＲＦ−Ｒよりも有意に高い純度を 有する（例えば、哺乳動物細胞からの粗抽出物中に存在する他のタンパク質を実 質的に含まない）、本発明の下記核酸を用いて、ルーチンに得ることができる。 例えば、技術上周知の組換えＤＮＡ方法を用いて、天然生成膜タンパク質に比べ て、有意に高い純度で異種ＣＲＦ−Ｒタンパク質を産生する有機物又は細胞ライ ンを形成することができる。その後、適当な単離方法を用いて、少なくとも約７ ０％、好ましくは８０％、より好ましくは９０％、最も好ましくは９８％純度（ 総タンパク質の重量基準）であるＣＲＦ−Ｒをルーチンに得ることが可能である 。 本発明の他の実施態様によると、多数の化合物をスクリーニングして、いずれ の化合物（存在するとすれば）が本発明の受容体に結合することができるかを決 定するための、本発明の受容体を用いる結合アッセイを提供する。その後に、最 初に同定した化合物を用いて、このような化合物が本発明の受容体のアゴニスト として作用するのか又はアンタゴニストとして作用するのかをさらに判定するた めのさらに詳細なアッセイを実施することができる。 本発明の結合アッセイの他の用途は、ＣＲＦの有無に関する試験サンプル（例 えば、生物学的流体）のアッセイである。このように、例えば、ＣＲＦの過剰産 生又は産生不足に関係すると考えられる症候群を示す患者からの血清を分析して 、観察された症候群が実際にＣＲＦ（若しくはＣＲＦ受容体）の過剰産生又は産 生 不足のいずれによって惹起されたのかを判定することができる。 本発明によって考えられる結合アッセイは、当業者が容易に同定することがで きるような、種々な方法で実施することができる。例えば、競合結合アッセイを ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ、ＥＲＭＡ等と同様に用いることができる。 本発明のさらに他の実施態様によると、試験化合物が本発明の受容体（又はそ の官能性修飾形）のアゴニスト又はアンタゴニストのいずれとして作用すること ができるのかを評価するためのバイオアッセイを提供する。 本発明のＣＲＦ−ＲはヘテロトリマーＧタンパク質によって、種々な細胞内酵 素、イオンチャンネル及びトランスポーターにカップリングする。Ｇタンパク質 は本発明のＣＲＦ−Ｒタンパク質と形質膜の細胞内面において会合する。ＣＲＦ −Ｒに結合するアゴニストはα−サブユニット上のＧＤＰとＧＴＰの交換を触媒 して（Ｇタンパク質“活性化”）、その解離と、種々なシグナル変換酵素及びチ ャンネルの１つ（又は１つ以上）の刺激とを生じる。異なるＧタンパク質α−サ ブユニットが特定のエフェクターを優先的に刺激する。それ故、シグナル変換の 特異性はＧタンパク質カップリングの特異性によって決定されると考えられる。 本発明のＣＲＦ−Ｒタンパク質はアデニル酸シクラーゼの調節によってシグナ ル変換を仲介する。例えば、ＣＲＦがＣＲＦ−Ｒに結合すると、アデニル酸シク ラーゼが細胞内ｃＡＭＰのレベルを上昇させる。したがって、本発明の１実施態 様では、試験化合物がアゴニスト又はアンタゴニストのいずれとして作用しうる かを判定するためのバイオアッセイは、次の工程： （ａ）ＣＲＦ受容体タンパク質又はその官能性修飾形を発現するＤＮＡを含む細 胞を培養する工程であって、ＣＲＦ受容体タンパク質のシグナル変換活性を調節 するその能力の評価を要求される少なくとも１種の化合物の存在下で培養を実施 する工程と；その後に、 （ｂ）細胞内ｃＡＭＰレベルの増加又は減少に関して前記細胞をモニターする工 程とを含む。 ｃＡＭＰの細胞内レベルを測定する、又はシクラーゼ活性を測定する技術上周 知の方法を本明細書に述べる結合アッセイに用いて、ＣＲＦ−Ｒのアゴニスト及 びアンタゴニストを同定することができる。例えば、一部のＧタンパク質共役受 容体の活性化はｃＡＭＰの減少又は増加を生じるので、細胞内ｃＡＭＰレベルを 測定するアッセイ（例えば、実施例４参照）を用いて、哺乳動物宿主細胞に発現 される組換えＣＲＦ−Ｒを評価することができる。 本明細書で用いるかぎり、“ＣＲＦ受容体タンパク質のシグナル変換活性を調 節する能力”とは、ＣＲＦ受容体タンパク質のシグナル変換活性を誘導又は阻害 する能力を有する化合物を意味する。 本発明の他の実施態様では、試験化合物がアゴニストとして作用しうるかどう かを判定するためのバイオアッセイは、次の工程： （ａ）ＣＲＦ受容体タンパク質又はその官能性修飾形を発現するＤＮＡと、ＣＲ Ｆ−Ｒ反応性転写要素に機能的に結合する、レポータータンパク質をコードする ＤＮＡとを含む細胞を培養する工程であって、ＣＲＦ受容体タンパク質のシグナ ル変換活性を誘導するその能力の評価を要求される少なくとも１種の化合物の存 在下で培養を実施する工程と；その後に、 （ｂ）前記レポータータンパク質の発現に関して前記細胞をモニターする工程と を含む。 本発明の他の実施態様では、試験化合物が本発明の受容体又は前記受容体の官 能性修飾形に対するアンタゴニストとして作用しうるかどうかを判定するための バイオアッセイは、次の工程： （ａ）ＣＲＦ受容体タンパク質又はその官能性修飾形を発現するＤＮＡと、ＣＲ Ｆ−Ｒ反応性転写要素に機能的に結合する、レポータータンパク質をコードする ＤＮＡとを含む細胞を培養する工程であって、ＣＲＦ受容体タンパク質のシグナ ル変換活性を阻害するその能力の評価を要求される少なくとも１種の化合物の増 加する濃度と、ＣＲＦ受容体タンパク質又はその官能性修飾形に対する少なくと も１種のアゴニストの一定濃度との存在下で培養を実施する工程と；その後に、 （ｂ）前記細胞における前記レポータータンパク質の発現レベルを前記化合物の 濃度の関数としてモニターして、それによって、シグナル変換活性を阻害する前 記化合物の能力を実証する工程とを含む。 上記アンタゴニストバイオアッセイの工程（ａ）では、 ＣＲＦ受容体タンパク質のシグナル変換活性を阻害するその能力の評価を要求 される少なくとも１種の化合物の一定濃度と、 ＣＲＦ受容体タンパク質又はその官能性修飾形に対する少なくとも１種のアゴ ニストの増加する濃度と の存在下で培養を実施することもできる。 ＣＲＦ−Ｒの官能性組換え体発現する宿主細胞は内因性又は組換え体グアニン ヌクレオチド結合タンパク質（すなわち、Ｇ−タンパク質）を発現することが好 ましい。Ｇ−タンパク質はα、β及びγサブユニットから成る膜結合(membrane- associated)タンパク質の高度に保存されるファミリーである。異なるＧ−タン パク質では、ＧＤＰ及びＧＴＰを結合するαサブユニットが異なる。βサブユニ ットとγサブユニットとの結合対は特有であってもなくても良く；異なるα鎖が 同一βγ対にも異なるβγ対にも結合することができる［ＬｉｎｄｅｒとＧｉｌ ｍａｎ，Ｓｃｉ．Ａｍ．２６７：５６〜６５（１９９２）］。Ｇタンパク質αサ ブユニットをコードする３０種を越えるｃＤＮＡがクローン化されている［Ｓｉ ｍｏｎ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５２：８０２（１９９１）］。少なくとも４種類 のβポリペプチド配列が知られている［Ｓｉｍｏｎ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５２ ：８０２（１９９１）］。Ｇ−タンパク質はグアニンヌクレオチド交換とＧＴＰ 加水分解とによって活性状態と不活性状態の間で転換する。不活性Ｇ−タンパク 質はリガンド活性化受容体によって刺激されて、ＧＤＰをＧＴＰと交換する。活 性形では、ＧＴＰに結合したαサブユニットはβγ複合体から解離して、このサ ブユニットは次に細胞エフェクター分子と特異的に相互作用して、細胞反応を惹 起する。異なるＧ−タンパク質が異なるエフェクター系（例えば、ホスホリパー ゼＣ、アデニルシクラーゼ系）及び異なる受容体と相互作用することができるの で、異なる組換えＣＲＦ−Ｒ受容体サブタイプの発現に関して異なる宿主細胞を 研究することが有用である。或いは、宿主細胞を異なるＧタンパク質の異種発現 のためにＧ−タンパク質サブユニットエンコーディングＤＮＡによってトランス フェクトすることができる。 本発明のバイオアッセイに用いるために考えられる宿主細胞はＣＶ−１細胞、 ＣＯＳ細胞等を含み；典型的に用いられるレポーターと発現プラスミドとはＳＶ −４０の複製起点をも含み、用いられるレポーターと発現プラスミドとは典型的 に選択可能なマーカーをも含む。 本明細書で用いるかぎり、“ＣＲＦ−Ｒ反応性転写要素”とは、例えば、周知 のＧ−タンパク質仲介シグナル変換機構によって誘導されて、ＣＲＦ−Ｒアゴニ スト（例えば、ＣＲＦ）の結合時に転写を開始する任意のプロモーター領域であ る。好ましいＣＲＦ−Ｒ反応性転写要素はｃＡＭＰ反応性転写要素である。本発 明のバイオアッセイに用いられる環状ＡＭＰ（ｃＡＭＰ）反応性転写要素は当業 者に周知である。ｃＡＭＰ反応要素は、それに機能的に結合したＤＮＡ分子（す なわち、レポーター遺伝子）の転写を開始することによって、細胞内ｃＡＭＰの 上昇に反応する。本明細書に用いるために適した、具体的なｃＡＭＰ反応要素は ヒトＤＮＡβ−ポリメラーゼ遺伝子プロモーターである（Ｍａｍｕｌａ等，ＤＮ Ａ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ ．，１１：６１〜７０，１９９２参照）。 本明細書に用いるために適したレポータータンパク質は技術上周知である。レ ポータータンパク質をコードするレポーター遺伝子の発現レベルに関して、例え ば、比色法（例えば、β−ガラクトシダーゼのような着色レポーター生成物によ る）及び蛍光発光（例えばルシフェラーゼのようなレポーター生成物による）に よる測光手段、酵素活性等によるような、種々な方法で宿主細胞をモニターする ことができる。 本発明のバイオアッセイによるスクリーニングのために考えられる化合物はＣ ＲＦ又はＣＲＦ類似リガンドと、ＣＲＦに対して特定の構造的又は生物学的関連 性を有さない化合物とを含む。適当な化合物は周知のソースから、例えばペプチ ドライブラリー、化学的ライブラリー、細菌及び酵母のブロス(broth)、植物等 から得ることができる。 ＣＲＦに対して特定の構造的又は生物学的関連性を有さないが、本発明のバイ オアッセイによるスクリーニングのために考えられる化合物は、アンタゴニスト （すなわち、本発明の受容体ペプチドの作用をブロックすることができる）又は アゴニスト（すなわち、本発明の受容体ペプチドの作用を促進することができる ）である任意の化合物、例えばアルカロイド、他の複素環式有機化合物等を含む 。 本明細書で用いるかぎり、“非ＣＲＦ類似”なる用語はＣＲＦ（本明細書で広 範囲に定義する）と構造的類似性を本質的に有さない任意有機分子を意味する。 ＣＲＦ−Ｒなる用語には、その種々なサブユニット（例えば、ＣＲＦ−ＲＡ（ 例えば、ｈＣＲＦ−ＲＡ₁及びｈＣＲＦ−ＲＡ₂）、ＣＲＦ−ＲＢ等）、並びにポ リペプチドフラグメント又はその類似体も含まれる。それ故、本発明によって考 えられるＣＲＦ−Ｒは、その使用にある一定の利益を与えるような、種々な変化 、置換、挿入及び欠失を受けることができる。例えば、ペプチドフラグメントは ＣＲＦ−Ｒネイティブ抗原エピトープを免疫学的に模倣することができるか、又 は例えばＣＲＦへの結合若しくはＧ−タンパク質への結合のような、ＣＲＦ−Ｒ に特徴的な、他の生物学的な性質を示すことができる。 有効なシグナル変換のために必要である特定のＣＲＦ−Ｒ残基又は領域は、保 存されるＧ−タンパク質モチーフと相互作用することができる。さらに、Ｇ−タ ンパク質カップリングに必要な、ある一定の短いアミノ酸範囲(amino acid stre tch)もＧ−タンパク質相互作用の特異性を決定する。このように、本発明のＣＲ Ｆ−Ｒのポリペプチドフラグメントは種々なＧ−タンパク質への制御結合が必要 であるアッセイ又は治療方法に有用である。 “類似体”なる用語は、１つ以上の残基が機能的に同じ残基によって保存的に 置換され、本明細書で述べるようなＣＲＦ−Ｒを模倣する能力を表示する、本明 細書に特に示す配列と実質的に同じアミノ酸残基配列を有する任意ポリペプチド を含む。保存的置換の例は例えばイソロイシン、バリン、ロイシン又はメチオニ ンのような非極性（疎水性）残基の１つと他の残基との置換、例えばアルギニン とリシンとの間、グルタミンとアスパラギンとの間、グリシンとセリンとの間の ような、極性（親水性）残基の１つと他の残基との置換、例えばリシン、アルギ ニン若しくはヒスチジンのような塩基性残基の１つと他の残基との置換、又は例 えばアスパラギン酸若しくはグルタミン酸のような酸性残基の１つと他の残基と の置換を含む。 “保存的置換”なるフレーズは、非誘導体化残基の代わりに化学的誘導体化残 基の使用をも含む、但し、このようなポリペプチドは必要な結合活性を示すもの とする。 “化学的誘導体”とは、官能側基の反応によって化学的に誘導体化された１個 以上の残基を有する本発明のポリペプチドを意味する。このような誘導体化分子 は例えば、その遊離アミノ基が誘導体化されて、アミンヒドロクロリド、ｐ−ト ルエンスルホニル基、カルボベンゾキシ基、ｔ−ブチルオキシカルボニル基、ク ロロアセチル基又はホルミル基を形成しているような分子を含む。遊離カルボキ シル基を誘導体化して、塩、メチルエステル、エチルエステル若しくは他の種類 のエステル、又はヒドラジドを形成することができる。遊離ヒドロキシル基を誘 導体化して、Ｏ−アセチル又はＯ−アルキル誘導体を形成することができる。ヒ スチジンのイミダゾール窒素を誘導体化して、Ｎ−イム−ベンジルヒスチジン(N -im-benzylhistidine)を形成する。化学的誘導体として、２０種類の標準アミノ 酸の１種以上の天然生成アミノ酸誘導体を含むようなペプチドも含まれる。例え ば、プロリンの代わりに４−ヒドロキシプロリンを用いることができ；リシンの 代わりに５−ヒドロキシリシンを用いることができ；ヒスチジンの代わりに３− メチルヒスチジンを用いることができ；セリンの代わりにホモセリンを用いるこ とができ；リシンの代わりにオルニチンを用いることができる。本発明のポリペ プチドは本明細書にその配列を示したポリペプチド配列に比べて、残基の１個以 上の添加及び／又は欠失を有する任意のポリペプチドも、必要な活性が維持され るかぎり、含む。本発明のポリペプチドをラベル又は固体マトリックス又はキャ リヤーに便利に固定することができるようにリンカーを形成するためにいずれか の末端に付加的残基を加えた場合には、リンカー残基はＣＲＦ−Ｒエピトープを 形成しない、すなわち、構造においてＣＲＦ−Ｒに類似しない。本発明のポリペ プチドと共に使用可能であるラベル、固体マトリックス及びキャリヤーは以下で 説明する。 アミノ酸残基リンカーは少なくとも１個〜４０個以上までの残基を含み（しば しば、１〜１０個の残基を含む）、ＣＲＦ−Ｒエピトープを形成しない。結合(l inking)のために用いられる典型的なアミノ酸残基はチロシン、システイン、リ シン、グルタミン酸及びアスパラギン酸である。さらに、本発明のポリペプチド は、他に指定しないかぎり、配列において、ＣＲＦ−Ｒの天然配列とは、Ｎ末端 アシル化（例えば、アセチル化若しくはチオグリコール酸アミド化）による及び Ｃ末端アミド化（例えば、アンモニア、メチルアミン等による）による配列の修 飾によって異なることができる。 本発明のＣＲＦ−Ｒポリペプチドは、ＣＲＦ−Ｒと免疫反応する抗体を誘導す ることができる。それ故、免疫交差反応の充分に確立された原理を考慮すると、 本発明はポリペプチドの抗原的に関係する変異体を含む。“抗原的に関係する変 異体”とは、本明細書に記載するＣＲＦ−Ｒポリペプチドと免疫反応する抗体分 子を誘導することができる本発明のポリペプチドである。 本発明のＣＲＦ−Ｒポリペプチドは、組換えＤＮＡ方法を含めた、ポリペプチ ド分野に熟練した人に周知である方法のいずれかによって合成することができる 。例えば固相Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ型合成方法のような合成化学方法が、ポリペ プチドフラグメントの製造のために、純度、抗原的特異性、好ましくない副生成 物を含まないこと、製造の容易さ等の理由から、好ましい。利用可能な多くの方 法の適切な概要は、Ｊ．Ｍ．ＳｔｅｗａｒｄとＪ．Ｄ．Ｙｏｕｎｇ，“固相ペプ チド合成”，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ社，サンフランシスコ，１９６９；Ｍ．Ｂ ｏｄａｎｓｋｙ等，“ペプチド合成”，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， 第２版，１９７６；固相ペプチド合成に関して、Ｊ．Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ，“ Ｈｏｌｍｏｎａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ”，２巻，４ ６頁，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（ニューヨーク），１９８３；典型的な溶 液合成に関して、Ｅ．ＳｃｈｒｏｄｅｒとＫ．Ｋｕｂｋｅ，“Ｔｈｅ Ｐｅｐｔ ｉｄｅｓ”，１巻，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（ニューヨーク），１９６５ （これらの各々は本明細書に援用される）に見い出すことができる。このような 合成に有用な、適当な保護基は上記文献と、Ｊ．Ｆ．Ｗ．ＭｃＯｍｉｅ，“有機 化学における保護基”，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓs，ニューヨーク，１９７３（ これは本明細書に援用される）とに記載される。本明細書に援用される米国特許 第５，０５５，３９６号をも参照のこと。 身体サンプル中に存在するＣＲＦ−Ｒ（又はそのフラグメント）レベルの検出 、身体サンプル中のＣＲＦレベルの検出、又はＣＲＦ−Ｒ上のエピトープと免疫 反応する抗体を製造するための本明細書に記載するような接種剤の製造のための 、本発明による診断方法及び系に、ＣＲＦ−Ｒポリペプチドを特に用いることが できる。ＣＲＦ−Ｒポリペプチドは、種々な細胞内Ｇ−タンパク質とＣＲＦ類似 受容体アゴニスト／アンタゴニスト（例えば、複素環式化合物）等を結合し、検 出 し、精製するために使用可能である。さらに、ＣＲＦ−Ｒポリペプチドは、例え ばＣＲＦ誘導ＡＣＴＨ放出を抑制し、患者におけるＡＣＴＨレベルを低下させる ための、本明細書に記載する治療方法に使用可能である。 本発明のさらに他の実施態様によると、上記受容体タンパク質に対して形成さ れた抗体を提供する。このような抗体は診断用途、治療用途等に使用可能である 。治療用途に用いる抗体はモノクローナル抗体であることが好ましい。 上記抗体は、当業者に周知であるような標準方法によって、抗体産生のための 抗原として本発明の受容体タンパク質又はそのフラグメントを用いて製造するこ とができる。本発明の抗体は、哺乳動物をＣＲＦ−Ｒタンパク質又はそのフラグ メントを含む接種剤によって免疫化して、免疫化剤に対して免疫特異性を有する 抗体分子の産生を誘導することによって、典型的に製造される。 例えば、本発明のタンパク質の合成ペプチドフラグメントに対してウサギにお いて生じた抗体は、合成ペプチドと、等モル基準の本発明の対応ＣＲＦ−Ｒとを 認識して、好ましくは、ネイティブタンパク質の活性を抑制することができる。 ４℃における２時間の反応によってＢＳＡに抗原としてＴｙｒをビスジアゾ化ベ ンジジン（ＢＤＢ）結合によってカップリングさせるために、Ｃ−末端にＴｙｒ を加えた、適当な合成ペプチドフラグメントによって、例えば、生後３か月の雄 及び雌のニュージーランド白ウサギを免疫化することによって、ＣＲＦ−Ｒに対 する抗体を得た。この反応混合物を透析して、低分子量物質を除去し、リテンテ ート(retentate)を液体窒素中で凍結し、−２０℃に保存する。動物をペプチド 抗原１ｍｇ当量によって、Ｖａｕｇｈａｎ等，Ｍｅｔｈ．ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ ｏｇｙ ，３６６：５８８〜６１７（１９８９）の方法に従って免疫化する。４週 間間隔で、抗原２００μｇの注入によって動物をブーストし、１０〜１４日後に 、採血した。第３ブースト後に、クロラミン−Ｔ方法によって調製し、ＣＭＣイ オン交換カラムクロマトグラフィー又はＨＰＬＣによって精製した放射性ヨウ素 化抗原ペプチドを結合するその可能性に関して、抗血清を試験する。次に、抗体 分子を哺乳動物から回収し、例えばＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｄｅｘを用いる方法の ような周知方法によって、所望の程度に単離して、ＩｇＧ画分を得る。 抗体の特異性を強化するために、抗体を固相免疫化ポリペプチドを用いるイム ノアフィニティクロマトグラフィーによって精製することができる。抗体を固相 免疫化ポリペプチドに、ポリペプチドが抗体分子と免疫反応して、固相免疫複合 体を形成するために充分な時間接触させる。結合した抗体を複合体から標準方法 によって分離する。 このように製造した抗体は、特に、哺乳動物（好ましくはヒト）の身体サンプ ル、例えば組織又は血管流体中に存在するＣＲＦ−Ｒレベルを検出するための診 断方法及び系に用いることができる。抗ＣＲＦ−Ｒ抗体はＣＲＦ−Ｒ生物学的物 質のイムノアフィニティ又はアフィニティクロマトグラフィー精製に用いること もできる。さらに、本発明による抗ＣＲＦ−Ｒ抗体を哺乳動物（好ましくはヒト ）の治療方法にＣＲＦ−Ｒアゴニスト又はアンタゴニストとして用いて、ＣＲＦ −Ｒの効果を中和若しくは調節し、遊離ＣＲＦ（例えば、ＣＲＦ−Ｒによって結 合されないＣＲＦ）のレベルを上昇させ、ＣＲＦ誘導ＡＣＴＨ放出を高め、患者 におけるＡＣＴＨ誘導グルココルチコイドのレベルを増加させる等ができる。 本発明のタンパク質と、本発明の抗体とは、例えば腹腔内、筋肉内、静脈内又 は皮下注射等によるような標準方法を用いて、対象に投与することができる。移 植及び経皮投与形式も適当である。さらに、本発明のタンパク質は、本発明のタ ンパク質をコードするウイルス又はレトロウイルスベクターによるトランスフェ クションによって供給することもできる。当業者は用いる投与形式に依存して、 剤形、治療計画等を容易に決定することができる。 本発明の他の実施態様によると、上記受容体タンパク質を上記受容体タンパク 質をコードする単離、精製した核酸分子（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ）を提供す る。本明細書に記載する核酸分子は、このような核酸を当業者に周知の種々なタ ンパク質発現系に組み入れると、本発明のＣＲＦ−Ｒタンパク質を製造するため に有用である。さらに、このような核酸分子（又はそのフラグメント）は容易に 検出可能な置換基によって標識して、所定サンプル中のＣＲＦ−Ｒ遺伝子又はｍ ＲＮＡ転写体の存在及び／又は量を分析するためのハイブリッド形成プローブと して用いることができる。このような核酸分子（又はそのフラグメント）は、容 易に検出可能な置換基によって標識するときに、他のＣＲＦ−Ｒ遺伝子を同定す るためのハイブリッド形成プローブとして用いることもできる。本明細書に記載 する核酸分子とそのフラグメントとは、本明細書に記載するＣＲＦ−Ｒタンパク 質をコードする遺伝子を増幅するためのＰＣＲ反応にプライマー及び／又は鋳型 としても有用である。さらに、本明細書に記載する核酸分子とそのフラグメント とは、本明細書に記載する受容体タンパク質のファミリーの一部である他のＣＲ Ｆ−Ｒタンパク質をコードする遺伝子を同定するためのＰＣＲ反応にプライマー 及び／又は鋳型としても有用である。 上記受容体は多くの核酸分子、例えば、下記配列： 配列番号：１のヌクレオチド８２〜１３２９、 配列番号：１のヌクレオチドの５１６〜５１７間に挿入された配列番号：３の ヌクレオチド１〜８７をさらに含む配列番号：１のヌクレオチド８２〜１３２９ 、 配列番号：５のヌクレオチド８１〜１３２４、 配列番号：７の実質的に全てのヌクレオチド、 配列番号：９のヌクレオチド７９〜１３７１、 受託番号７５４７４でＡＴＣＣに寄託されたクローンｈｃｔＣＲＦＲのＣＲＦ −ＲＡ₁コード部分、 又は、同じアミノ酸配列をコードするが、アミノ酸の一部に対して異なるコド ンを用いる、その変形、 又は、そのスプライス変異ｃＤＮＡ配列 と実質的に同じ連続(contiguous)ヌクレオチド配列を有する核酸分子によってコ ードされることができる。 本明細書で用いるかぎり、“核酸”なるフレーズはリボ核酸（ＲＮＡ）又はデ オキシ核酸（ＤＮＡ）を意味する。ＤＮＡは相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）でもゲノ ムＤＮＡ、例えばＣＲＦ−Ｒをコードする遺伝子でもよい。 本明細書で用いるかぎり、“実質的に同じ連続ヌクレオチド配列”又は“実質 的に同じヌクレオチド配列”なるフレーズは、典型的な中程度の緊縮条件下で基 準ヌクレオチドにハイブリッド形成するような、基準ポリヌクレオチドに充分な 相同性を有するＤＮＡを意味する。１実施態様では、基準ヌクレオチド配列と実 質的に同じヌクレオチド配列を有する核酸分子は、配列番号：２、４、６、８又 は１０のいずれかのアミノ酸配列と実質的に同じアミノ酸配列をコードする。他 の実施態様では、基準ヌクレオチド配列と“実質的に同じヌクレオチド配列”を 有するＤＮＡは、基準ヌクレオチド配列に関して少なくとも６０％相同性を有す る。基準ヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％、より好ましくは８０％、 さらにより好ましくは９０％の相同性を有するＤＮＡが好ましい。 上記受容体をコードするさらに他のＤＮＡは、配列番号：１，３，５，７又は ９に記載される配列又は受託番号７５４７４でＡＴＣＣに寄託されたクローンｈ ｃｔＣＲＦＲのＣＲＦ−ＲＡ₁エンコーディング部分と実質的に同じ連続ヌクレ オチド配列を有するＤＮＡである。 本発明のＣＲＦ−Ｒをコードする“遺伝子”（すなわち、ゲノムＤＮＡ）は典 型的に、少なくとも２つのイントロンを含む。このように、本発明のＣＲＦ−Ｒ をコードする代替スプライスド(alternatively spliced)変異ｃＤＮＡ配列も本 明細書では考慮する（例えば、ＣＲＦ−ＲＡ₂）。例えば、配列番号：３は配列 番号：１に記載されるＣＲＦ−ＲＡ₁コードｃＤＮＡのヌクレオチド位置５１６ 〜５１７間に挿入される８７ｂｐ ｃＤＮＡスプライス変異体インサート配列を 含む（それによって、ＣＲＦ−ＲＡ₂を形成する）。 本明細書で用いるかぎり、“スプライス変異体(splice variant)”又は“代替 スプライスド(alternatively spliced)”なるフレーズは、本発明の受容体をコ ードする特定のヌクレオチド配列を表すために用いる場合に、周知の真核細胞Ｒ ＮＡスプライシングプロセスから生じるｃＤＮＡ配列を意味する。ＲＮＡスプラ イシングプロセスはイントロンの除去と、真核細胞一次ＲＮＡ転写体からのエキ ソンの接続とを含み、細胞質の成熟(mature)ＲＮＡ分子を形成する。 スプライス変異体ヌクレオチド配列の単離方法は技術上周知である。例えば、 当業者は配列番号：１、３、５、７又は９のＣＲＦ−ＲエンコーディングｃＤＮ Ａに由来するヌクレオチドプローブを用いて、実施例に記載するクッシング腫瘍 ｃＤＮＡライブラリー又はＣＲＦ−Ｒを発現すると考えられる細胞、例えば、脳 、心臓、下垂体、免疫、生殖腺、副腎、胎盤、胃腸、肺、副腎皮質刺激性細胞等 に由来する、他のＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることができる。 好ましい実施態様では、本明細書に開示するＣＲＦ−ＲをコードするｃＤＮＡ は、配列番号：１のヌクレオチド８２〜１３２９、配列番号：１のヌクレオチド の５１６〜５１７間に挿入された配列番号：３のヌクレオチド１〜８７をさらに 含む配列番号：１のヌクレオチド８２〜１３２９、配列番号：５、配列番号：７ のヌクレオチド８１〜１３２４、又は配列番号：９のヌクレオチド７９〜１３７ １と実質的に同じヌクレオチド配列を有する。ＣＲＦ−Ｒをコードする現在最も 好ましいｃＤＮＡ分子は配列番号：１のヌクレオチド８２〜１３２９、配列番号 ：１のヌクレオチドの５１６〜５１７間に挿入された配列番号：３のヌクレオチ ド１〜８７をさらに含む配列番号：１のヌクレオチド８２〜１３２９、配列番号 ：５、配列番号：７のヌクレオチド８１〜１３２４、又は配列番号：９のヌクレ オチド７９〜１３７１と同じヌクレオチド配列を有する。 本発明の他の実施態様によると、ＣＲＦ−Ｒをコードする単離、精製した核酸 は、 （ａ）配列番号：２、配列番号：６、配列番号：８若しくは配列番号：１０に 記載されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、又は配列番号：２のアミノ酸１４ ５〜１４６間に挿入された、配列番号：４に記載のアミノ酸配列をさらに含む、 配列番号：２に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ；又は （ｂ）中程度の緊縮条件下で（ａ）のＤＮＡにハイブリッド形成するＤＮＡで あって、生物学的に活性なＣＲＦ−ＲをコードするＤＮＡ；又は （ｃ）上記（ａ）若しくは（ｂ）のいずれかに関して縮重した、生物学的に活 性なＣＲＦ−ＲをコードするＤＮＡ から選択されることができる。 ハイブリッド形成は、染色体ＤＮＡにおいて天然に生じる結合に類似した水素 結合による、核酸の相補的鎖（すなわち、センス：アンチセンス鎖又はプローブ ：標的ＤＮＡ）の相互への結合を意味する。所定プローブを標的ＤＮＡとハイブ リッド形成させるために用いる緊縮レベル(stringency lebel)は当業者によって 容易に変えることができる。 本明細書で用いるかぎり、“中程度の緊縮”ハイブリッド形成なるフレーズは 、標的ＤＮＡと、この標的ＤＮＡに対して約６０％、好ましくは約７５％、より 好ましくは約８５％相同性を有する相補的核酸との結合を可能にする条件を意味 し、 この標的ＤＮＡに対して約９０％より大きい相同性が特に好ましい。中程度の緊 縮条件とは、好ましくは、５０％ホルムアミド、５ＸＤｅｎｈａｒｔ溶液、５Ｘ ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳ中で４２℃においてハイブリッド形成し、その後に ６５℃において０．２Ｘ ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳ中で洗浄することに等しい 条件である。Ｄｅｎｈａｒｔ溶液とＳＳＰＥ［例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等，Ｍ ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ ，１９８９を参照］は、他の適当なハイブリッド形成バッファーと同様に、当業 者に周知である。 “官能性”又は“生物学的活性”なる用語は、本発明の受容体タンパク質の修 飾語として用いる場合に、本明細書に記載する任意のＣＲＦ−Ｒが有する、官能 性特徴（例えば、抗原性(antigenicity)）の１つを生ずることができるポリペプ チドを意味する。他の実施態様では、生物学的活性とは、前記受容体タンパク質 へのＣＲＦ類似リガンド（例えば、ＣＲＦ類似体、ウロテンシン、サウバジン等 ）の結合が受容体のＧ−タンパク質との相互作用を修飾して、これが次に細胞内 第２メッセンジャー（好ましくはｃＡＭＰ）のレベルに影響して、種々な生理学 的効果を生じることを意味する。上記の他の用語(way)“官能性”とは、受容体 タンパク質のアゴニスト活性化の結果としてシグナルが変換されることを意味す る。 本明細書で用いるかぎり、“縮重する”なる用語は、基準核酸（例えば、配列 番号：１）とは少なくとも１つのヌクレオチドにおいて異なるが、基準アミノ酸 と同じアミノ酸をコードするコドンを意味する。例えば、トリプレット“ＵＣＵ ”、“ＵＣＣ”、“ＵＣＡ”及び“ＵＣＧ”によって指定されるコドンは、これ らのコドンの４種類の全てがアミノ酸セリンをコードするので、相互に関して縮 重する。 本発明の核酸は技術上周知の多様な方法（例えば、実施例１及び５に記載する 方法）によって、配列番号：１、３、５、７、９等の種々な領域からのオリゴヌ クレオチドプライマーを用いて、ＰＣＲ増幅を利用して、製造することができる 。 本発明の受容体をコードする核酸の単離及びクローニングに用いる１方法は、 例えばＣＯＳ６細胞のような、適当な宿主細胞中のＣＲＦに反応すると考えられ る任意の細胞種類（例えば、下垂体細胞、胎盤細胞、繊維芽細胞等）から得られ るｃＤＮＡを哺乳動物細胞中に発現することを含む。次に、得られる哺乳動物細 胞が標識受容体リガンド（すなわち、標識ＣＲＦ類似体）を結合できるか否かを 判定する。最後に、哺乳動物細胞に発現されたときに、特定のｃＤＮＡが標識受 容体リガンドの前記細胞への結合を誘導（又は強化）することができるか否かに 基づいて、所望のｃＤＮＡインサートを回収する。 或いは、問題のタンパク質に対して生じる抗体によって、免疫学的発現アッセ イを用いて、ＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることができる。問題のタ ンパク質に対して生じる抗体による発現ライブラリーのスクリーニングは、単独 でもハイブリッド形成プロービング(probing)と組み合わせても、ＤＮＡライブ ラリークローン中の需要の多いＤＮＡ配列の存在を同定又は確認するためにも使 用可能である。このような方法は例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ等，Ｃｏｌｄ Ｓｐ ｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ，Ｃｏｌｄ Ｓ ｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ（ニューヨーク）（１９８２）（以下では、ＣＳＨ） に教示されている。 本発明の他の実施態様によると、任意に標識した受容体−コードｃＤＮＡ又は そのフラグメントを用いて、ライブラリー（例えば、ｃＤＮＡ、ゲノム等）をＣ ＲＦ受容体ファミリーの新規な哺乳動物要素をコードする付加的なヌクレオチド 配列に関して調べることができる。このようなスクリーニングは、約４２．５℃ 未満の温度、約５０％未満のホルムアミド濃度、中程度〜低い塩濃度を含む、低 緊縮(low stringency)条件下で、最初に実施する。現在好ましいスクリーニング 条件は約４２．５℃の温度、約２０％のホルムアミド濃度、約５Ｘ標準生理的食 塩水クエン酸塩（ＳＳＣ；２０ＸＳＳＣは３Ｍ塩化ナトリウム、０．３Ｍクエン 酸ナトリウム、ｐＨ７．５を含む）。このような条件はプローブ配列と実質的な 類似度を有する配列の同定を、安定なハイブリッドの同定のために完全な相同性 を必要とせずに、可能にする。“実質的な類似度”なるフレーズは、少なくとも ５０％の相同性を共有する配列を意味する。プローブとの少なくとも７０％の相 同性を有する配列の同定を可能にし、プローブとの低い相同性を有する配列を区 別するような、ハイブリッド形成条件を選択することが好ましい。 本明細書で用いるかぎり、核酸“プローブ”とは、配列番号：１，３，５，７ 若しくは９、又はクローンｈｃｔＣＲＦＲのＣＲＦ−ＲＡ₁−コード部分のいず れかに記載された１４個以上の連続塩基と同じ（又はその補体）である少なくと も１４個、好ましくは少なくとも２０個、より好ましくは少なくとも５０個の連 続塩基を含むヌクレオチド配列を有する、一本鎖ＤＮＡ若しくはＲＮＡ、又はこ れらの類似体である。それからプローブを構成するために好ましい領域は５’及 び／又は３’コード配列、トランスメンブランドメインをコードすると予想され る配列、細胞質ループをコードすると予想される配列、シグナル配列、リガンド 結合部位等を含む。本発明のＣＲＦ−Ｒをコードする完全ｃＤＮＡ分子はプロー ブとして用いることもできる。プローブを以下で説明するような技術上周知の方 法によって標識して、種々な診断キットに用いることができる。 本発明のさらに他の実施態様によると、上記核酸配列を適当な宿主細胞に発現 することによる、本発明の受容体の組換え体産生方法を提供する。上記ヌクレオ チド配列をさらに取り扱うためにベクターに組み込むことができる。本明細書で 用いるかぎり、ベクター（又はプラスミド）は、異種ＤＮＡ（例えば、配列番号 ：１，３，５，７又は９）をその発現又は複製のために細胞中に導入するために 用いられる個別の要素を意味する。このようなビヒクルの選択と使用とは、充分 に当業者の熟練の範囲内である。 発現ベクターは、このようなＤＮＡフラグメントの発現を調節することができ る調節配列（例えば、プロモーター領域）と機能的に結合するＤＮＡを発現する ことができる要素を含む。このように、発現ベクターは、適当な宿主細胞への導 入時に、クローン化ＤＮＡの発現を生じる、例えばプラスミド、ファージ、組換 えウイルス又は他のベクターのような、組換えＤＮＡ又はＲＮＡ構造を意味する 。適当な発現ベクターは当業者に周知であり、真核細胞及び／又は原核細胞に複 製可能であるような発現ベクター、エピソームに留まるような発現ベクター、又 は宿主細胞ゲノムに組み込まれるような発現ベクターを含む。真核宿主細胞（特 に、哺乳動物細胞）中に本発明のＣＲＦ−Ｒを発現するために現在好ましいプラ スミドは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター含有ベクター、ＳＶ４ ０プロモーター含有ベクター、ＭＭＴＶ ＬＴＲプロモーター含有ベクター等を 含む。 本明細書で用いるかぎり、プロモーター領域とは、それが機能的に結合するＤ ＮＡの転写を制御するＤＮＡのセグメントを意味する。プロモーター領域はＲＮ Ａポリメラーゼの認識、結合及び転写開始のために充分である特異的配列を含む 。プロモーター領域のこの部分はプロモーターと呼ばれる。さらに、プロモータ ー領域は、ＲＮＡポリメラーゼのこの認識、結合及び転写開始活性を調節する配 列を含む。これらの配列はシス作用性であることも、トランス作用因子に反応す ることもできる。調節の性質に依存して、プロモーターは構成されることも調節 されることもできる。本発明の実施に用いるために考えられる典型的なプロモー ターは、ＳＶ４０早期プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモー ター、マウス乳腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）ステロイド誘導プロモーター、Ｍｏｌ ｏｎｅｙネズミ白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）プロモーター等を含む。 本明細書で用いるかぎり、“機能的に結合した”なる用語は、ＤＮＡと、例え ばプロモーター、エンハンサー、転写停止及び翻訳停止部位、その他のシグナル 配列のような、ヌクレオチドの調節及びエフェクター配列との機能的関係を意味 する。例えば、ＤＮＡとプロモーターとの機能的結合は、このようなＤＮＡの転 写がプロモーターから、ＤＮＡを特異的に認識し、ＤＮＡに結合し、ＤＮＡを転 写させるＲＮＡポリメラーゼによって開始されるような、ＤＮＡとプロモーター との間の物理的かつ機能的な関係を意味する。発現及び／又はインビトロ転写を 最適化するために、転写又は翻訳のレベルにおいて発現を妨害するか又は低下さ せる、余分な、恐らく不適切な、代替え(alternative)翻訳開始（すなわち、ス タート）コドン又は他の配列を除去するために、クローンの５’非翻訳部分を除 去するか、加えるか又は変化させることが必要になると考えられる。或いは、コ ンセンサス(consensus)リボソーム結合部位［例えば、Ｋｏｚａｋ（１９９１） ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１９８６７〜１９８７０参照］を出発コド ンの５’に直接挿入して、発現を強化することができる。このような修飾の望ま しさ（又は必要性）は経験的に決定することができる。 本明細書で用いるかぎり、発現とは、ポリ核酸をｍＲＮＡに転写して、ペプチ ド、ポリペプチド又はタンパク質に翻訳するプロセスを意味する。ポリ核酸がゲ ノムＤＮＡに由来する場合に、適当な真核宿主細胞又は生物を選択するならば、 発現はｍＲＮＡのスプライシングを含む。 原核細胞トランスフォーメーションベクターは技術上周知であり、ｐＢｌｕｅ ｓｋｒｉｐｔ及びファージλＺＡＰベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，カリフォ ルニア州，ラジョラ）等を含む。大腸菌（E.coli）細胞のトランスフォーメーシ ョンのために適した、他のベクターはｐＥＴ発現ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ，米 国特許第４，９５２，４９６号参照）、例えばｐＥＴｌｌａ（Ｔ７プロモーター 、Ｔ７ターミネーター、誘導大腸菌ｌａｃオペレーター及びｌａｃリプレッサー 遺伝子を含む）と；ｐＥＴ １２ａ−ｃ（Ｔ７プロモーター、Ｔ７ターミネータ ー、大腸菌ｏｍｐＴ分泌シグナルを含む）とを含む。他の適当なベクターはｐＩ Ｎ−ＩＩＩｏｍｐＡ２［Ｄｕｆｆａｕｄ等，Ｍｅｔｈ．ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏ ｇｙ ，１５３：４９２〜５０７（１９８７）参照］であり、これはｌｐｐプロモ ーター、ｌａｃＵＶプロモーターオペレーター、ｏｍｐＡ分泌シグナル及びｌａ ｃリプレッサー遺伝子を含む。 哺乳動物細胞のトランスフェクションのために特に好ましい塩基ベクターは、 サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターに基づくベクター、例えばｐｃＤ ＮＡ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カリフォルニア州，サンジエゴ）；ＭＭＴＶプ ロモーターに基づくベクター、例えばｐＭＡＭＮｅｏ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，カリ フォルニア州，パロアルト）及びｐＭＳＧ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、ニュージャー シー州，ピスカタウェイからのカタログＮｏ．２７−４５０６−０１）；ＳＶ４ ０プロモーターに基づくベクター、例えばｐＳＶβ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，カリフ ォルニア州，パロアルト）等である。 タンパク質又はその生物学的に活性なフラグメントの組換え体産生のために、 非常に多様な生物の使用が報告されている。当業者は本発明のペプチドの組換え 体産生に用いるための適当な宿主（及び発現条件）を容易に決定することができ ると考えられる。酵母宿主、細菌宿主、哺乳動物宿主等が使用可能である。 本発明の他の実施態様によると、本発明の核酸分子（すなわち、ＤＮＡ又はＲ ＮＡ）を含む“組換え体細胞”を提供する（例えば、配列番号：１，３，５，７ 又は９）。適当な宿主細胞のトランスフォーメーション方法並びに異種タンパク 質をコードする遺伝子を含む前記細胞の培養に適用可能な方法は技術上周知であ る。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈ ａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈ ａｒｂｏｒ（米国，ニューヨーク）（１９８９）を参照のこと。 代表的なトランスフォーション方法は、例えば、プラスミド、ウイルス又は細 菌のファージベクターを用いるトランスフォーション、トランスフェクション、 エレクトロポーレーション、リポフェクション等を含む。異種核酸は任意に、そ の染色体外維持を可能にする配列を含む、又は前記異種核酸は宿主のゲノムに組 み込まれることができる（宿主中の安定な維持を保証するための代替え手段とし て）。 本発明の実施に用いるために考えられる宿主生物は、異種タンパク質の組換え 体産生が実施されるような生物を含む。このような宿主生物の例は細菌（例えば 、大腸菌）、酵母（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａ ｅ 、Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍ ｏｒｐｈａ 及びＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ；例えば、米国特許第４，８８２，２７９ 号、第４，８３７，１４８号、第４，９２９，５５５号及び第４，８５５，２３ １号参照）、哺乳動物細胞（例えば、ＨＥＫ２９３、ＣＨＯ、ＣＶ−１及びＬｔ ｋ細胞）、昆虫細胞等を含む。 本発明はまた、流体又は組織サンプル中のＣＲＦ−Ｒタンパク質、ＣＲＦ−Ｒ ポリペプチドフラグメント若しくは類似体、又はＣＲＦペプチドの存在を分析す るための、好ましくはキット形式の診断系をも提供する。適当な診断系は少なく とも１回の分析のために充分な量で、別々に包装された免疫化学試薬としてＣＲ Ｆ−Ｒタンパク質（又はそのポリペプチドフラグメント）及び／又は本発明の抗 体を含む。 “使用指示”は典型的に、試薬濃度又は少なくとも１回の分析方法パラメータ 、例えば、混合すべき試薬とサンプルとの相対的量、試薬／サンプル混合物の保 存時間、温度、バッファー濃度等を説明する具体的な表現を含む。 １実施態様では、例えば血液、血漿若しくは血清のような血管流体サンプル、 又は組織サンプル中のＣＲＦ−Ｒ（又は、より可能には、ＣＲＦ−Ｒフラグメン ト）の存在又は量を分析するための診断系は、本発明の少なくとも１種のＣＲＦ −Ｒタンパク質又はそのポリペプチドフラグメントを包含するパッケージを含む 。さらに、少なくとも１種のＣＲＦ−Ｒ（又はそのポリペプチドフラグメント） を含む診断系を用いて、血管流体サンプル中に存在するＣＲＦペプチドのレベル を検出する又は細胞内Ｇ−タンパク質の存在を検出することができる。 他の実施態様では、サンプル中のＣＲＦ−Ｒ又はそのフラグメント又はその類 似体の存在又は量を分析するための本発明の診断系は、本発明の抗ＣＲＦ−Ｒ抗 体を含む。 さらに他の実施態様では、サンプル中のＣＲＦ−Ｒ又はＣＲＦ−Ｒポリペプチ ドの存在又は量を分析するための本発明の診断系は、少なくとも１種のＣＲＦ− Ｒ（又はそのポリペプチドフラグメント）と本発明の抗ＣＲＦ−Ｒ抗体組成物と を含む。 好ましい実施態様では、本発明の診断系はさらに、本発明の核酸プローブ、タ ンパク質、ポリペプチド又は抗体分子を含む複合体の形成をシグナル化すること ができるラベル又は表示手段を含む。 ＣＲＦ−Ｒの存在に関して哺乳動物組織サンプルの死後診断を実施するための 、本明細書に記載する抗ＣＲＦ−Ｒ抗体を用いる免疫組織化学診断系も考えられ る。このような診断系の詳細に関しては、例えば、Ｐｏｔｔｅｒ等，ＲＮＡＳ， ８９：４１９２〜４２９６（１９９２）（参照することにより本明細書に取り込 まれる）を参照のこと。 本発明のさらに他の実施態様では、ハイブリッド形成組織化学診断系を提供す る。この診断系はサンプル（例えば、血管流体又は細胞組織）中のＣＲＦ−Ｒを コードする核酸（例えば、ｃＤＮＡ又はｍＤＮＡ）の存在又は量を分析するため に有用である。この診断系は本発明の少なくとも１種のＣＲＦ−Ｒエンコーディ ング核酸プローブを用いる。 本明細書で用いる“複合体”なる用語は、例えば抗体：抗原、受容体：リガン ド、タンパク質：タンパク質、又は核酸−プローブ：核酸標的反応のような、特 異的結合反応の生成物を意味する。典型的な錯体は免疫反応生成物と、ＣＲＦ： ＣＲＦ−Ｒ錯体である。 本明細書で用いるかぎり、“ラベル”及び“表示手段”なる用語は、それらの 種々な文法的形式で、検出可能なシグナルの形成に直接又は間接的に関係する単 一原子及び分子を意味する。ラベル又は表示手段は、本発明の抗体又はモノクロ ーナル抗体組成物の一部である、核酸プローブ、発現タンパク質、ポリペプチド フラグメント又は抗体分子に結合若しくは組み込まれることができるか、又は別 別に用いられることができる。これらの原子又は分子は単独で又は付加的な試薬 と組合せて用いることができる。このようなラベルはそれ自体で、臨床診断化学 の分野において周知である。 標識手段は、抗体又は抗原に変性させずに化学的に結合して、有用な免疫蛍光 トレーサーであるフルオロクロム（染料）を形成する蛍光標識剤であることがで きる。適当な標識剤は、例えば、フルオレセインイソシアネート（ＦＩＣ）、フ ルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、５−ジメチルアミン−１−ナフ タレンスルホニルクロリド（ＤＡＮＳＣ）、テトラメチルローダミンイソシアネ ート（ＴＲＩＴＣ）、リッサミン(lissamine)、ローダミン８２００スルホニル クロリド（ＲＢ−２００−ＳＣ）等のようなフルオロクロムである。免疫蛍光分 析方法についての説明はＤｅＬｕｃａ，“免疫蛍光分析”，Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ａｓ ａ Ｔｏｏｌ ，Ｍａｒｃｈａｌｏｎｉｓ等編集，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ社，１８９〜２３１頁（１９８２）（これは参照することにより本 明細書に取り込まれる）に見い出される。 好ましい実施態様では、表示基は例えばホースラディッシュペルオキシダーゼ （ＨＲＰ）、グルコースオキシダーゼ等のような酵素である。主要な表示基が酵 素である場合には、目視可能なシグナルの形成のために付加的な試薬が必要であ る。ＨＲＰに対するこのような付加的な試薬は、過酸化水素と、例えばジアミノ ベンジジンのような酸化染料前駆物質とを含む。グルコースオキシダーゼと共に 用いられる付加的な試薬は２，２’−アジノ−ジ−（３−エチル−ベンズチアゾ リン−Ｇ−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）である。 他の実施態様では、標識剤として放射性元素を用いる。代表的な放射能標識剤 はγ線放射を生じる放射性元素である。例えば¹²⁴Ｉ、¹²⁵Ｉ、¹²⁶Ｉ、¹³¹Ｉ及び⁵¹ Ｃｒのような、γ線を放射する元素は、放射性元素標識剤の１クラスであ る。¹²⁵Ｉが特に好ましい。有用な標識手段の他のグループは陽電子を放射する 、例えば¹¹Ｃ、¹⁸Ｆ、¹⁵Ｏ及び¹³Ｎのような元素である。このように放射される 陽電子は動物体内に存在する電子と衝突したときにγ線を放射する。例えば³²Ｐ 、¹¹¹インジウム又は³Ｈのようなβ放射体(emitter)も有用である。 基質へのラベルの結合、すなわち、核酸プローブ、抗体、ポリペプチド及びタ ンパク質の標識が技術上周知である。例えば、抗体分子を、培地に加えた放射能 標識アミノ酸の代謝取り込みによって標識することができる。例えばＧａｌｆｒ ｅ等，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．７３：３〜４６（１９８１）を参照。活性化 官能基によるタンパク質共役(conjugation)又はカップリングの通常手段が特に 適用可能である。例えば、Ａｕｒａｍｅａｓ等，Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ ｌ ．８巻，付録，７：７〜２３（１９７８）；Ｒｏｄｗｅｌｌ等，Ｂｉｏｔｅｃ ｈ ．３：８８９〜８９４（１９８４），米国特許第４，４９３，７９５号を参照 のこと。 診断系は、好ましくは分離パッケージとして、特異的結合剤を含むこともでき る。“特異的結合剤”とは、本発明の試薬種若しくはこのような種を含む錯体を 選択的に結合することができる分子状存在であるが、それ自体は本発明のポリペ プチド若しくは抗体分子組成物ではない。代表的な特異的結合剤は第２抗体分子 （例えば、抗−Ｉｇ抗体）、補体タンパク質若しくはそのフラグメント、Ｓ．ａ ｕｒｅｕｓ タンパク質Ａ等である。好ましくは、特異的結合剤は、試薬種が錯体 の一部として存在する場合に、この試薬種と結合する。 好ましい実施態様では、特異的結合剤を標識する。しかし、標識されない特異 的結合剤を診断系が含む場合には、特異的結合剤は典型的に増幅手段又は試薬と して用いられる。これらの実施態様において、標識された特異的結合剤は、増幅 手段が試薬種含有錯体に結合する場合に、増幅手段を特異的に結合することがで きる。 この診断キットは、例えば血液、血清若しくは血漿のような血管流体サンプル 中又は哺乳動物組織サンプル中のＣＲＦ、ＣＲＦ−Ｒ又はＣＲＦ：ＣＲＦ−Ｒ錯 体の量を検出するための“ＥＬＩＳＡ”フォーマットに使用可能である。“ＥＬ ＩＳＡ”は、固相に結合した抗体若しくは抗原と酵素−抗原若しくは酵素−抗体 コンジュゲートを用いて、サンプル中に存在する抗原の量を検出及び定量する酵 素結合イムノソルベントアッセイを意味する。ＥＬＩＳＡ法の説明は、Ｄ．Ｐ． Ｓｉｔｅｓ等によるＢａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏ ｇｙ ，第４版，２２章，Ｌａｎｇｅ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ｓ（カリフォルニア州，ロスアルトス）によって出版（１９８２）、米国特許第 ３，６５４，０９０号、第３，８５０，７５２号及び第４，０１６，０４３号（ これらは全て、参照することにより本明細書に取り込まれる）に見い出される。 このように、好ましい実施態様では、ＣＲＦ−Ｒタンパク質、そのＣＲＦ−Ｒ ポリペプチドフラグメント、ポリクローナル抗ＣＲＦ−Ｒ抗体又はモノクローナ ル抗ＣＲＦ−Ｒ抗体を固体マトリックスに固定して、本発明の診断系にパッケー ジを含む固体サポートを形成する。試薬は典型的に、水性媒質からの吸着によっ て固体マトリックスに固定されるが、当業者に周知の、タンパク質及びポリペプ チドに適用可能な、他の固定形式も使用可能である。 有用な固体マトリックスも技術上周知である。このような物質は水不溶性であ り、架橋デキストラン（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ， ニュージャーシー州，ピスカタウェイ）：アガロース；粒径約１ミクロン〜約５ ｍｍのポリスチレンビーズ（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，イリノ イ州，ノースシカゴから入手可能）；ポリ塩化ビニル；ポリスチレン；架橋ポリ アクリルアミド；ニトロセルロース−若しくはナイロン−ベースドウェブ（例え ば、シート、ストリップ若しくはパドル(paddle)）；又はポリスチレン若しくは ポリ塩化ビニル製のような、管、プレート若しくはマイクロタイタープレートの 孔を含む。 本明細書に記載する診断系の試薬種、標識された特異的結合剤又は増幅試薬は 溶液状態で液体分散系として、又は例えば凍結乾燥形の実質的に乾燥した粉末と して供給することができる。表示手段が酵素である場合に、酵素の基質を系の分 離パッケージとして提供することもできる。例えば、前記マイクロタイタープレ ートのような固体サポートと１種以上のバッファーとを、この診断アッセイ系に 分離パッケージ(packaged)要素として含めることもできる。 診断系に関連して本明細書で考慮するパッケージ用材料は、診断系に伝統的に 用いられる材料である。“パッケージ”なる用語は、本発明の例えばタンパク質 、ポリペプチドフラグメント、抗体又はモノクローナル抗体のような診断試薬を 一定範囲内に保持することができる、例えばガラス、プラスチック（例えば、ポ リエチレン、ポリプロピレン及びポリカーボネート）、紙、ホイル等のような固 体マトリックス又は材料を意味する。したがって、例えば、パッケージは、診断 試薬を含むために用いられるボトル、バイアル、プラスチック若しくはプラスチ ックホイルラミネーテッドエンベロープ(laminated envelope)容器等であること ができる。或いは、用いる容器は、診断試薬のμｇ量が検出すべき抗体又はポリ ペプチドによって免疫学的に結合されるように、機能的に固定された、すなわち 結合されたマイクロタイタープレート孔であることができる。 正常な個体では、ＣＲＦレベルは約１〜２８ｐｇ／ｍｌ血管流体の範囲内で変 化しうる。しかし、妊娠の最後の３か月間中に、ＣＲＦレベルが早期に上昇する 傾向があることが判明している。この上昇は妊娠誘導高血圧に関係すると考えら れる。ＣＲＦレベルの変化のモニターが早産の可能性の予測を容易にすることが でき、早産を適当な処置によって回避することができる。 このように、ＣＲＦレベルの監視によって、妊娠中の可能な病的問題を示す異 常な上昇を早期に検出することができる。通常の高血圧は正常よりも高いＣＲＦ ／“ＣＲＦ結合タンパク質”比によって惹起される（又は付随される）と考えら れるので、ＣＲＦレベルのモニターはこのような疾患の素因を有する特定の患者 の予測を容易にして、例えば、ＣＲＦタンパク質又はそのポリペプチドフラグメ ントの用量を投与することによる治療的介入を可能にする。このような妊娠関連 障害を治療するためのＣＲＦ−Ｒ又はそのフラグメントの投与によって、ＣＲＦ レベルを正常に戻して、胎児の正常な成長を促進することができる。 本発明は、サンプル中のＣＲＦ−Ｒ量に間接的又は直接的に比例する量の免疫 反応生成物を形成するための免疫化学的試薬として、本発明のＣＲＦ−Ｒ、その ポリペプチドフラグメント、抗ＣＲＦ−Ｒポリクローナル若しくはモノクローナ ル抗体を用いて、生物学的流体又は組織サンプル中のＣＲＦ−Ｒ量を測定するた めの種々な免疫アッセイ方法を考慮する。本発明はまた、サンプル中のＣＲＦ量 に間接的又は直接的に比例する量の生成物を形成するための試薬として、ＣＲＦ −Ｒ又はそのポリペプチドフラグメントを用いて、生物学的流体サンプル中のＣ ＲＦペプチド量を測定するための免疫アッセイ方法をも考慮する。 競合的又は非競合的な溶液相又は固相の、種々な周知の異種及び同種プロトコ ールを本発明のアッセイ方法の実施に用いることができる。当業者は、本発明の 免疫化学的試薬を用いて、身体サンプル中に存在するＣＲＦ−Ｒ又はＣＲＦ量に 比例する量の免疫反応生成物を形成することができる、多くの周知の臨床診断化 学手段が存在することを理解するであろう。 １実施態様では、本明細書に開示する治療法によって治療的に投与したＣＲＦ −Ｒタンパク質又はポリペプチドフラグメントの最終結果(fate)をモニターする ための手段として、身体サンプル中のＣＲＦ−Ｒタンパク質又はポリペプチドフ ラグメントの検出を用いる。 ラベルを用いずに免疫反応生成物の形成を検出することができる免疫学的アッ セイも考慮する。このような方法は“検出手段”を用いるが、この検出手段はそ れ自体、臨床診断化学の分野で周知である。典型的な検出手段には、表面の反射 率の変化、光学繊維によるエバネッセント波の吸収の変化、表面音波の伝播の変 化等の検出に基づくバイオセンシング方法を含む。 本発明は、本明細書に開示する治療方法の実施に有用な治療組成物を含む。本 発明の治療組成物は生理的に適合するキャリヤーと、組成物に活性成分として溶 解又は分散した、本明細書に開示するＣＲＦ−Ｒタンパク質、ＣＲＦ−Ｒポリペ プチドフラグメント又は抗ＣＲＦ−Ｒ抗体を含む。好ましい実施態様では、この 治療組成物は、哺乳動物又はヒトの患者に治療目的で投与した場合に、免疫原で はない。 本明細書で用いる“薬剤学的に受容される”、“生理的に適合する”なる用語 及びこれらの文法的変化は、組成物、キャリヤー、希釈剤及び試薬に関するかぎ り、相互交換可能に用いられ、物質が例えば、吐き気、めまい感、胃不快感(gas tric upset)等のような、不快な生理的影響を生じることなく、哺乳動物に投与 されることができることを意味する。 組成物中に溶解又は分散した有効成分を含む薬理学的組成物の製造は技術上周 知である。典型的に、このような組成物は液体溶液若しくは懸濁液のいずれかと しての注射可能物として製造されるが、使用前に液体中の溶液又は懸濁液にする ために適した固体形を調製することもできる。 有効成分は本明細書に記載した治療法に用いるために適した量で、薬剤学的に 受容され、有効成分と適合しうる賦形剤と混合することができる。適当な賦形剤 は例えば水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール等、並び にこれらの任意の２種類以上の組合せである。さらに、必要な場合には、組成物 は、有効成分の効果を強化する、少量の補助物質（例えば、湿潤剤、乳化剤、ｐ Ｈ緩衝剤等）を含むことができる。 本発明の治療組成物はその成分の薬剤学的に受容される塩を含むことができる 。薬剤学的に受容される無毒性塩は、例えば、塩酸、臭化水素酸、過塩素酸、硝 酸、チオシアン酸、硫酸、リン酸のような無機酸、酢酸、プロピオン酸、グリコ ール酸、乳酸、ピルビン酸、蓚酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸 、アントラニル酸、ケイ皮酸、ナフタレンスルホン酸、スルファニル酸等によっ て形成される酸付加塩（ポリペプチドの遊離アミノ基とによって形成）を含む。 遊離カルボキシル基によって形成される塩は、例えば水酸化ナトリウム、水酸 化アンモニウム、水酸化カリウム等のような無機塩基と、例えばモノ−、ジ−及 びトリ−アルキル及び−アリールアミン（例えば、トリエチルアミン、ジイソプ ロピルアミン、メチルアミン、ジメチルアミン等）及び任意に置換したエタノー ルアミン（例えば、エタノールアミン、ジエタノールアミン等）のような有機塩 基に由来することもできる。 生理的に許容されるキャリヤーは技術上周知である。典型的な液体キャリヤー は、有効成分と水以外は物質を含まないか、又は生理的ｐＨのリン酸ナトリウム のようなバッファー、生理的食塩水又はこれらの両方（例えば、リン酸塩緩衝化 生理食塩水）を含む無菌水溶液である。さらに他の水性キャリヤーは２種類以上 のバッファー塩、並びに例えば塩化ナトリウムと塩化カリウムのような塩、デキ ストロース、ポリエチレングリコール及びその他の溶質を含むことができる。 液体組成物は水に加えて、又は水を排除して液相を含むこともできる。典型的 な付加的液相はグリセリン、植物油（例えば、綿実油）、水−油エマルジョンを 含む。 既述したように、ＣＲＦ−Ｒ又はそのポリペプチドフラグメントの投与は、哺 乳動物における血管流体ＣＲＦレベル又は、本明細書において“ＣＲＦ誘導ＡＣ ＴＨ放出”と呼ぶ、過剰なＣＲＦによって惹起される、高いＡＣＴＨレベルを低 下させるために有効である。このようにして、ＣＲＦ−Ｒは高コルチゾル血症、 クッシング病、アルコール中毒、神経性食欲不振及び同様な疾患に関連する、高 いコルチゾル（すなわち、グルココルチコイド）レベルの治療に有効である。同 様に、これらのＣＲＦ−ＲはＣＲＦを産生する下垂体腫瘍の治療に−−特に、こ のような腫瘍が手術によって除去することができるまでの安定性の維持に有用性 を有すると考えられる。 本発明によると、ＣＲＦ−ＲＢ₁は意外にも、心臓に豊富に発現されることが 判明している。単離した潅流済み心臓では、左心房中へのＣＲＦの添加は冠状動 脈へ長期間の拡大効果を及ぼし、正のイオノトロピー効果を一過性に生じ、心房 性のナトリウム排泄増加性ペプチドの分泌を刺激する［Ｓａｉｔｏｈ等，Ｇｅｎ ．Ｐｈａｒｍａｃ．（Ｅｎｇｌａｎｄ）２１：３３７〜３４２（１９９０）；Ｇ ｒｕｎｔ等，Ｈｏｒｍ．Ｍｅｔａｂ．Ｒｅｓ．（Ｇｅｒｍａｎｙ）２４：５６〜 ５９（１９９２）］。心臓の血管におけるＣＲＦ−ＲＢ₁発現の意外な発見は、 ＣＲＦ（又はこの受容体に対する他の天然若しくは薬理学的リガンド）が心臓潅 流を調節する可能性を高める。さらに、ＣＲＦ及び関連リガンドによって拡大さ れると分かっている、例えば上腸間膜のような、他の血管床もＣＲＦ及びその受 容体によって調節されることが判明すると予想される。 したがって、ＣＲＦは心臓において幾つかの生物学的効果を有すると分かって いるので、特に心臓血管に作用して、効力を維持することができるＣＲＦレベル を高める方法において、ＣＲＦ−Ｒタンパク質、そのフラグメント、又はそのア ゴニスト／アンタゴニスト（例えば、抗ＣＲＦ−Ｒ抗体）を効果的に用いて、心 臓に対するＣＲＦの作用を選択的に調節することができる。 本発明によると、ＣＲＦ−ＲＢ遺伝子が例えば十二指腸の粘膜下の深部領域に おけるＣＲＦ−ＲＢ₁ｍＲＮＡの存在によって実証されるように、胃腸管中に発 現されることも判明している。したがって、ＣＲＦ−ＲＢ₁受容体が上述したＧ Ｉ管へのＣＲＦの刺激効果の一部を仲介することが考えられる。例えば、ＣＲＦ はインビトロにおいて腸に作用して、小腸における腸管筋のニューロンを脱分極 する(depolarize)［ＨａｎａｎｉとＷｏｏｄ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ．（Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）２１１：２３〜２７（１９９２）］。静脈内に投 与したＣＲＦ及びＣＲＦアンタゴニストによるインビボ研究は、胃空虚(gastric emptying)及び腸運動性を調節するＣＲＦの直接効果と一致する［Ｗｉｌｌｉａ ｍｓ等，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２５３：Ｇ５８２〜Ｇ５８６（１９８７） ；Ｌｅｎｚ，Ｈ．Ｊ．，Ｈｏｒｍ．Ｍｅｔａｂ．Ｒｅｓ．Ｓｕｐｐｌ．１６：１ ７〜２３（１９８７）；及びＳｈｅｌｄｏｎ等，Ｒｅｇｕｌ．Ｐｅｐｔ．２８： １３７〜１５１（１９９０）］。さらに、ＣＲＦイムノステイニング(immunosta ining)はＧＩ管の多くのレベルに存在する［Ｎｉｅｕｗｅｎｈｕｙｚｅｎ−Ｋｒ ｕｓｅｍａｎ等，Ｌａｎｃｅｔ，２：１２４５〜１２４６（１９８２）；ＰＯｅ ｔｒｕｓｚ等，Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ Ｐｒｏｃ．４４：２２９〜２３５（１９ ８５）；及びＫａｗａｈｉｔｏ等，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，１０６ ：８５９〜８６５（１９９４）］。 このように、ＣＲＦ−Ｒ（例えば、ＣＲＦ−ＲＢ）、そのフラグメント又はそ のアゴニスト／アンタゴニスト（例えば、抗ＣＲＦ−Ｒ抗体）が、例えば過敏性 腸症候群のような胃腸障害の治療に用いるために考えられる。さらに、ＣＲＦ− ＲＢに対して選択的であるＣＲＦアンタゴニストが過敏性腸症候群を治療するた めの治療方法に用いるために考えられる。 さらに、精巣上体中のＣＲＦ−ＲＢの存在は、免疫反応性ＣＲＦを有すると報 告される精子との局所連絡を可能にすると考えられる［Ｖｏｏｎ等，Ｅｎｄｏｃ ｒｉｎｏｌｏｇｙ，１２２：７５９〜７６１（１９８８）］。このように、ＣＲ Ｆ−Ｒは受精能(fertility)障害の治療に用いるためにも考えられる。 ＣＲＦ−Ｒタンパク質とそのフラグメントは、妊娠中に起こる、例えば子かん 前症（妊娠の毒血症）のような異常の治療にも有用である；例えば、これらは妊 娠誘導併発症とＣＲＦレベルの上昇を減ずるために使用可能であり、さもなくば 、ＣＲＦレベルの上昇はＡＣＴＨの過剰な放出を生じる可能性がある。さらに、 ＣＲＦ−Ｒタンパク質とそのフラグメントを投与して、血管流体からＣＲＦを封 鎖 し、それによって、血管流体サンプル中の遊離ＣＲＦのレベルを減ずる（すなわ ち、ＣＲＦがＣＲＦ−ＢＰに結合しない）ことが有利である患者中に存在するＣ ＲＦ／“ＣＲＦ結合タンパク質”の比を減じることができる。ＣＲＦ結合タンパ ク質（ＣＲＦ−ＢＰ）はＰｏｔｔｅｒ等の上記文献に記載される細胞外血清タン パク質である。ＣＲＦ−ＲのＩＶ投与はある一定の場合に利用して、血圧を調節 して、高血圧を治療することもできる。 ＣＲＦは免疫系の周知の調節剤であるので、ＣＲＦ−Ｒ又はそのフラグメント の投与は、局所的に、すなわち、罹患した関節への直接の注入によって、関節炎 又は同様な病気を治療するために有用である。ＣＲＦが下垂体に対して幾つかの 生物学的効果を有することが知られており、したがって、ＣＲＦ−Ｒタンパク質 を用いて、下垂体に対するＣＲＦの作用を調節することができる。さらに、ＣＲ Ｆが脳において幾つかの生物学的効果を有することが周知である；それ故、特に 食欲、生殖、成長、不安、鬱病、熱及び代謝の調節、並びに血圧、心拍数、血液 流動等の調節に関して、脳に対するＣＲＦの作用を調節するためにＣＲＦ−Ｒタ ンパク質を効果的に用いることができると考えられる。 このように、本発明は哺乳動物におけるＣＲＦ作用の調節方法であって、本発 明のＣＲＦ−Ｒタンパク質又はポリペプチドフラグメントを含む生理的に許容さ れる組成物の治療有効量を投与することを含む方法を提供する。さらに、ＣＲＦ によるＡＣＴＨ放出の刺激は、対象を組織特異的ＣＲＦエンコーディング構造体 によってトランスフェクトすることによって強化されることができる。 他の実施態様では、本発明は、哺乳動物における妊娠関連病的障害の治療方法 であって、本発明のＣＲＦ−Ｒタンパク質又はポリペプチドフラグメントを含む 生理的に許容される組成物の治療有効量を投与することを含み、前記量がＣＲＦ を封鎖して、妊娠中の雌の正常範囲内のＣＲＦ／“ＣＲＦ結合タンパク質”の比 を生じるために有効である方法を提供する。 また、前述したように、本明細書に記載する抗ＣＲＦ−Ｒ抗体の投与は、イン ビボで投与する場合にＣＲＦ−Ｒの生物学的効果を調節するために有効である。 例えば、本発明の抗ＣＲＦ−Ｒ抗体を上記哺乳動物治療方法に用いて、対象にお けるＣＲＦ−Ｒの効果を中和し、この効果に拮抗する；遊離ＣＲＦ（例えば、Ｃ ＲＦ−Ｒによって結合されないＣＲＦ）レベルを高める；ＣＲＦ誘導ＡＣＴＨ放 出を減ずる；又はＡＣＴＨ誘導グルココルチコイドレベルを低下させることがで きる。遊離ＣＲＦレベルの上昇はＣＲＦ誘導ＡＣＴＨ放出レベルを増加させ、こ れはグルココルチコイドレベルを上昇させるので、これらの治療方法は、例えば 炎症又はＡｄｄｉｓｏｎ病等の状態のように、患者の血管流体中のグルココルチ コイドレベルの上昇が治療的に有効であるような、ある種の生理的状態の治療に 有用である。 この目的のための抗体の投与はラインに沿って、この分野で一般に知られた量 で実施され、さらに詳しくは、このタンパク質自体の投与に関して本明細書に示 したラインに沿って実施される。 本明細書に記載するように、治療有効量は所望の効果を得るために、例えば、 患者におけるＣＲＦ、ＡＣＴＨの量を低下させ、ＣＲＦ／”ＣＲＦ結合タンパク 質”比を減ずるために算出された所定量である。必要な用量は特定の治療及び所 望の治療期間によって変化するが、約１０μｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ体重／日の用量 が治療のために用いられると、予想される。以下で考察するように、このような 化合物をデポ剤として又は持効性形で投与することが特に有利である。治療有効 量は典型的には、生理的に許容される組成物として投与する場合に、約０．１μ ｇ／ｍｌ〜約１００μｇ／ｍｌ、好ましくは約１．０μｇ／ｍｌ〜約５０μｇ／ ｍｌ、より好ましくは少なくとも約２μｇ／ｍｌ、通常は５〜１０μｇ／ｍｌの 血漿濃度を得るために充分であるような、ＣＲＦ−Ｒタンパク質又はそのポリペ プチドフラグメントの量である。抗体は当該技術分野での周知の実施によって釣 り合った適当な量で投与される。 患者に存在する、特に血漿中に存在するＡＣＴＨレベルはルーチンな臨床分析 によって容易に決定することができる。さらに、投与したＣＲＦ−Ｒタンパク質 又はポリペプチドフラグメントの効果を経時的に測定するために治療計画中のＡ ＣＴＨレベルの変化を監視することができる。 したがって、本発明の治療方法は、高い血清ＡＣＴＨの症状を示し、ＡＣＴＨ レベルを低下させることが有利であるような、血清ＡＣＴＨの存在によって医学 的危険状態にある対象におけるＡＣＴＨレベルを低下させるインビボ手段を提供 する。さらに、本発明の治療方法は、高い血清コルチゾルの症状を示すヒト患者 におけるＡＣＴＨ誘導コルチゾル（例えば、グルココルチコイド）レベルを低下 させるインビボ手段を提供する。 同様に、患者に存在する、特に血漿中に存在するＣＲＦレベルは、本明細書で 提供する診断方法及びキットによって容易に決定することができ、ＣＲＦ−Ｒ、 その類似体又は抗ＣＲＦ−Ｒ抗体の投与によって容易に治療することができる。 したがって、本発明の治療方法は、高い血清ＣＲＦ／ＣＲＦ−ＢＰレベルの症 状を示し、血管流体サンプル中の遊離ＣＲＦ（すなわち、ＣＲＦ−Ｒに結合しな いＣＲＦ）レベルを低下させることが有利であるような、高い血清ＣＲＦ／ＣＲ Ｆ−ＢＰ比の存在によって医学的危険状態にある対象におけるＣＲＦ？ＣＲＦ− ＢＰ比を低下させるインビボ手段を提供する。 ＣＲＦ−Ｒ（又はその官能性フラグメント）は医師の指導の下に投与すべきで ある。薬剤組成物は通常、このタンパク質を慣習的な薬剤学的に受容されるキャ リヤーと共に含む。治療のためには、実質的に純粋な合成ＣＲＦ−Ｒ又はその無 毒性塩を薬剤学的に受容されるキャリヤーと組合せて、薬剤組成物を形成して、 ヒトを含めた哺乳動物に非経口的に、静脈内、皮下、筋肉内、経皮的、例えば鼻 腔内、又は脳室内のいずれかによって好ましくは投与され、適当なキャリヤーに よって経口投与が可能である。 本発明のＣＲＦ−Ｒポリペプチドを含む治療組成物は例えば単位用量の注入に よって静脈内に投与することが好ましい。“単位本発明の治療組成物に関連して 用いる場合に、“単位用量”なる用語は対象への単位投与量として適した、物理 的に個別の単位を意味し、各単位は所望の治療効果を生じるように算出された有 効物質の所定量を必要な希釈剤（すなわち、キャリヤー又はビヒクル）と共に含 む。 組成物は投与形に適した方法において、治療的有効量で投与される。投与量は 治療すべき対象と、有効成分を利用する対象の免疫系の容量と、必要な治療効果 度とに依存する。投与するために必要な、正確な有効成分量は開業医の判断に依 存し、各個体に特有である。しかし、全身投与のために適した投与量範囲を本明 細書では開示し、これは投与経路に依存する。初期投与とブースターショットと のための適当な計画も可変であるが、初期投与と、その後の注入又は他の投与に よる１回以上の反復投与とが典型的である。或いは、血液中の濃度をインビボ治 療法で指定される範囲内に維持するために充分な連続静脈内注入が考えられる。 ＣＲＦ−Ｒポリペプチドの有効量の投与を助けるものとして、対象の血液中の ＣＲＦ−Ｒポリペプチドを検出するための本発明の診断方法が、投与された治療 組成物の最終結果を特徴づけるために有用である。 ＣＲＦ−Ｒを長期間にわたって、例えば単回投与から１週間から１年間までの 期間にわたって投与することも望ましいと考えられ、持続放出、デポ剤又は移植 投与形が使用可能である。例えば、投与形は体液中に低い溶解度を有する、薬剤 学的に受容される化合物の無毒性塩、例えば多塩基酸による酸付加塩；多価金属 カチオンによる塩；又はこれらの２種類の塩の組合せを含むことができる。比較 的不溶な塩もゲル（例えば、ステアリン酸アルミニウムゲル）に配合することが できる。注入のための適当な持続放出デポ剤は、例えば、米国特許第３，７７３ ，９１９号に記載のように、持続分解性の無毒性若しくは非抗原性ポリマー（例 えば、ポリ乳酸／ポリグリコール酸ポリマー）中に分散した又は封入されたＣＲ Ｆ−Ｒ又はその塩を含むこともできる。これらの化合物はシラスチックインプラ ント(silastic implant)に配合することもできる。 本発明の組成物の有用性の付加的な例として、ＣＲＦ依存性腫瘍の診断及び／ 又は治療、脳ニューロンの生残の強化、家畜及び他の家畜化動物の妊娠中絶の誘 導、家畜及び他の家畜化動物の双生児出産の誘導等のような分野に、本発明の核 酸、受容体及び／又は抗体を用いることもできる。 さらに、本明細書に記載する、ＣＲＦをコードする本発明のｃＤＮＡ（例えば 、ＣＲＦ−ＲＡ及びCＲＦ−ＲＢ）を用いて、それぞれのＣＲＦ−Ｒ遺伝子をコ ードするゲノムクローンを単離することができる。単離ＣＲＦ−Ｒ遺伝子の５’ 調節領域を配列決定して、組織特異的転写要素（すなわち、プロモーター）を同 定することができる。得られる組織特異的ＣＲＦ−Ｒプロモーターは種々な遺伝 子を、通常ＣＲＦ−Ｒを発現する細胞に導くために有用である。例えば、細胞毒 性タンパク質と、下垂体副腎皮質刺激性細胞(pituitary corticotropic cell)の 組織特異的ＣＲＦ−ＲプロモーターとをコードするＤＮＡを有するアデノウイル ス ベクターを下垂体副腎皮質刺激性腫瘍細胞を殺すための手段として用いることが できる。 下記非限定的実施例に関連して、本発明をさらに詳細に説明する。 実施例 他に指定しないかぎり、例えばＭａｎｉａｔｉｓ等，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃ ｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉ ｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉ ｎｇ Ｈａｒｂｏｒ（米国，ニューヨーク）（１９８２）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ等 ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕ ａｌ（第２版） ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ ｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ（米国，ニューヨーク ）（１９８９）：Ｄａｖｉｓ等，Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅ ｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉ ｓｈｉｎｇ社（米国，ニューヨーク）（１９８６）：又はＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ：Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉ ｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ，１５２巻，Ｓ．Ｌ．ＢｅｒｇｅｒとＡ．Ｒ．Ｋｉ ｍｍｅｒｌ編集，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ社（米国，サンジエゴ）（１９ ８７）に記載されているような、標準方法を用いて実施した。 二本鎖ＤＮＡはＵＳ ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓからのＳｅｑｕｅｎａｓｅ試 薬を用いるジデオキシチエインターミネーター法によって配列決定した。データ ベースとのＤＮＡ配列の比較はＦＡＳＴＡプログラムを用いて実施した［Ｐｅａ ｓｏｎとＬｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５ ：２４４４〜２４４８（１９８８）］。ヨウ素化に用いたＴｙｒ−ヒツジＣＲＦ はＰｅｎｉｎｓｕｌａから購入した。 実施例１ ヒトＣＲＦ−ＲをコードするｃＤＮＡの単離 ヒト下垂体コルチコトロープアデノーマ（Ｃｕｓｈｉｎｇ腫瘍）細胞からの約 １．５ｘ１０⁶独立クローンのｃＤＮＡライブラリーを哺乳動物発現ベクター， ｐｃＤＮＡ１に構成し、単独トランスフェクト済み細胞の標識¹²⁵Ｉ−Ｔｙｒ− ヒツジＣＲＦを検出可能に結合する能力に基づいて、発現クローニングアプロー チ［Ｇｅａｒｉｎｇ等，ＥＭＢＯ Ｊ．８，３６６７〜３６７６（１９８９）］ を用いてスクリーニングした。チャンバード(chambered)顕微鏡スライド上で直 接、トランスフェクションと結合反応とを実施し、次にスライドを写真乳剤中に 浸漬し、３〜４日間の露出後にスライドを現像し、顕微鏡下でそれらを分析する ことによって、結合を評価した。ＣＲＦ−Ｒに高いアフィニティを有するがＣＲ Ｆ−ＢＰに低いアフィニティを有することが知られるヒツジＣＲＦ関連トレーサ ーを選択することによって、本物のＣＲＦ−Ｒではなく発現ＣＲＦ結合タンパク 質、ＣＲＦ−ＢＰを検出する可能性を最小にした。ＣＲＦ受容体ｃＤＮＡによっ てトランスフェクトされ、その結果、放射性ＣＲＦを結合した細胞は銀グレイン によってカバーされた。 下垂体コルチコトロープアデノーマ細胞からポリアデニル化ＲＮＡを調製した 。対応ｃＤＮＡを合成して、非パリンドロームＢｓｔＸＩリンカーを用いてプラ スミドｐｃＤＮＡ１に連結させて、ＭＣ１０６１／Ｐ３細胞をトランスフォーム させ、約１．５ｘ１０⁶の一次組換え体のライブラリーを得た。未増幅ｃＤＮＡ ライブラリーを約５０００クローン／１００ｍｍプレートでプレーティングした (plated)。次に、細胞をプレートから削り取り、グリセロール中で凍結させ、− ７０℃において保存した。 アルカリ性溶菌方法を用いて、５，０００クローンの各プールからｍｉｎｉ− ｐｒｅｐ ＤＮＡを調製した［Ｍａｎｉａｔｉｓ等，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌ ｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎ ｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８２）］。ｍｉｎ ｉ−ｐｒｅｐからのＤＮＡの約１／１０（１００μｌ中の１０μｌ）をＣＯＳＭ ６細胞にトランスフェクトし、この細胞をヨウ素化ＴｙｒヒツジＣＲＦ結合能力 に関してスクリーニングした。 さらに詳しくは、２ｘ１０⁵ＣＯＳ細胞をポリ−Ｄ−リシン２０μｇ／ｍｌで 被覆したチャンバード顕微鏡スライド（１チャンバーＮｕｎｃ）上にプレーティ ングし、ＤＭＥＭと１０％ウシ胎児血清（完全培地）中で少なくとも３時間結合 させた。細胞に対して下記のようにＤＥＡＥ−デキストラン仲介トランスフェク ションを実施した。１００μＭクロロキン含有無血清Ｄｕｌｂｅｃｃｏ改質イー グル培地（ＤＭＥＭ）１．５ｍｌを細胞に加えた。ＤＥＡＥ−デキストラン５０ ０μｇ／ｍｌを含むＤＭＥＭ／クロロキン２００μｌ中でＤＮＡを沈殿させて、 細胞に加えた。細胞を３７℃において４時間インキュベートし、次に、培地を除 去し、細胞をＨＥＰＥＳ緩衝化生理食塩水中１０％ＤＭＳＯによって２分間処理 した。１０％ＤＭＳＯを除去し、新しい完全培地を加え、２日後に、細胞を結合 に関して分析した。 上記のように調製したトランスフェクト済み細胞を０．１％オバルブミン含有 ＨＥＰＥＳ緩衝化生理食塩水（ＨＤＢ）によって２回洗浄し、１０⁶ｃｐｍ¹²⁵Ｉ −ＴｙｒヒツジＣＲＦ（約１ｎｇ，３００ｐＭ）を含むＨＤＢ０．７ｍｌ、０． １％オバルブミン中で２２℃において９０分間、インキュベートした。細胞を次 に、冷ＨＤＢ、０．１％オバルブミンによって３回洗浄し、冷ＨＤＢによって２ 回洗浄し、次いで、２．５％グルタールアルデヒド／ＨＤＢ中で２２℃において １５分間固定させ、ＨＤＢによって２回洗浄した。チャンバーをスライドから剥 離し、スライドを９５％エタノール中で脱水させ、真空乾燥させ、ＮＴＢ２写真 乳剤（Ｋｏｄａｋ）中に浸漬し、暗室で４℃において３〜４日間露出させた。乳 液の現像後に、スライドを９５％エタノール中で脱水させ、エオシンで染色し、 ＤＰＸマウンタント（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃ ｅｓ）によってカバースリップした。スライドをＬｅｉｔｚ顕微鏡を用いて、暗 視野照明下で分析した。 ポジティブプールの連続的サブディビジョン(subdivision)は、ＣＯＳＭ６細 胞膜中に存在する場合に高アフィニティＣＲＦ結合（Ｋ_d＝３．３±０．４５ｎ Ｍ）を実証した単一クローンを生じた。ＣＲＦ受容体をコードする配列を含むク ローンを本明細書では“ｈｃｔＣＲＦＲ”と呼ぶ、これは受託番号７５４７４で ＡＴＣＣに寄託されており、これによってコードされる受容体を本明細書ではｈ ＣＲＦ−ＲＡ₁と呼ぶ。 上述した同じヒトＣｕｓｈｉｎｇ腫瘍ｃＤＮＡからＮｏｔＩ／ＥｃｏＲＩアダ プターを用いてファージλＺａｐＩＩを合成した。クローン“ｈｃｔＣＲＦＲ” のＣＲＦ−Ｒコーディング領域中の１．２ｋｂ ＰｓｔＩフラグメントを用いて 、標準方法によって高緊縮条件下でλＺａｐＩＩをスクリーニングした。同定さ れたこれらのポジティブクローンの中、２つを配列決定して、イントロンなしで 全長ＣＲＦ−Ｒ ｃＤＮＡを含むことを発見した。これらのクローンは標識“Ｃ ＲＦ−Ｒ１”（本明細書ではｈＣＲＦ−ＲＡ₁とも呼ぶ）と、“ＣＲＦ−Ｒ２” （本明細書ではｈＣＲＦ−ＲＡ₂とも呼ぶ）であり、これらの一部は、それぞれ 、配列番号：１と配列番号：３に記載される。クローンＣＲＦ−Ｒ１（すなわち 、ｈＣＲＦ−ＲＡ₁）は、４１５アミノ酸ＣＲＦ−Ｒタンパク質をコードする１ ２４５ｂｐ読み取り枠を有する２５８４ｂｐインサートを含む。クローンＣＲＦ −Ｒ２（本明細書ではｈＣＲＦ−ＲＡ₂とも呼ぶ）は、ＣＲＦ−Ｒ１（すなわち 、ｈＣＲＦ−ＲＡ₁）の代替えスプライスド変異配列であり、配列番号：２のア ミノ酸１４５〜１４６間に挿入された、配列番号：４に記載の２９アミノ酸を有 する。 実施例２ ＣＲＦ受容体ｍＲＮＡの発現 標識ＣＲＦを種々な凍結組織切片に結合させるための周知のオートラジオグラ フィー方法を用いて、ネイティブＣＲＦを検出し、実験動物及びヒトにおける下 垂体領域及び種々な脳領域において動態的に変化することを実証した、これらの 場合にこの受容体はアルツハイマー病及び重度なメランコリー鬱病を含む病的状 態で変化する。さらに、受容体は末梢において副腎、卵巣、胎盤、胃腸管及び赤 脾髄（脾臓のマクロファージ富化領域）のような器官と、恐らくこれらの組織内 のＣＲＦ作用に対応する炎症性部位で検出されている。 変性ホルムアルデヒドアガロースゲル上でポリ（Ａ）⁺−ＲＮＡ（ラット脳、 ラット下垂体、ラット心臓、マウスＡｔＴ２０副腎皮質刺激性細胞に由来）をサ イズ分画し、ＲＮＡを標準方法を用いてニトロセルロース紙に移すことによって ノーザンブロットアッセイを実施した。このニトロセルロース紙ブロットをＱｕ ｉｋＨｙｂ^TMハイブリダイゼーション溶液（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，カリフォル ニア州，ラジョラ）と１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡとの中で６８℃において １５分間プレハイブリッド形成した。次に、このブロットを６８℃において 同じ溶液中で３０分間、ＣＲＦ−Ｒ１（すなわち、ｈＣＲＦ−ＲＡ₁）のｃＤＮ Ａ領域の大部分を含む“ｈｃｔＣＲＦＲ”誘導ランダムプライムド（Ａｍｅｒｓ ｈａｍ，イリノイ州，アーリントンハイト）１．３Ｋｂ ＰｓｔＩ ｃＤＮＡフ ラグメントにハイブリッド形成させた。このブロットを２Ｘ ＳＳＰＥと０．１ ５％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）中で２１℃において１５分間、２回洗浄 した。次に、このブロットを０．２Ｘ ＳＳＰＥと０．１％ＳＤＳ中で６０℃に おいて３０分間、２回洗浄した。ニトロセルロース紙ブロットのオートラジオグ ラムを標準方法によって現像した。 ノーザンブロットアッセイの結果は、ラット脳、ラット下垂体及びマウスＡｔ Ｔ２０副腎皮質刺激性細胞における２．７Ｋｂ ＣＲＦ−Ｒ ｍＲＮＡ転写体の 存在を明らかにした。心臓組織サンプル中ではＣＲＦ−Ｒ ｍＲＮＡは検出され なかった。 実施例３ ＣＯＳＭ６細胞に一過性に発現されるｈｃｔＣＲＦＲの薬理学的特徴 約１０⁶ＣＯＳＭ６細胞をＤＥＡＥ−デキストラン方法に従ってｈｃｔＣＲＦ Ｒ又はｔＧｎＲＨＲ（ラットゴナドトロピン放出ホルモン受容体）によってトラ ンスフェクトし、１５０ｍｍ組織培養皿中で増殖させた。トランスフェクション 後２日目に、細胞をＨＤＢ １ｍｌによって２回洗浄し、ＨＤＢ中０．５ｍＭ ＥＤＴＡ中で室温において1５分間インキュベートすることによって剥離させた 。ペレット化後に、細胞をＨＤＢで２回洗浄し、次に５％スクロース中で均質化 した（１６ｍｌ／１５０ｍｍ皿）。ホモジネートを６００ｘｇにおいて５分間遠 心分離し、得られた上清を４０，０００ｘｇにおいて２０分間遠心分離した。得 られたペレット（未加工膜を含む）を１０％スクロース中に１〜４ｍｇ／ｍｌで 再懸濁させ、競合ラジオレセプターアッセイに用いて、Ｐｅｒｒｉｎ等，Ｅｎｄ ｏｃ ．１１８：１１７１（１９８６）に記載されるようにＣＲＦ−Ｒへの結合を 測定した。 膜ホモジネート（１０〜２４μg）を１００，０００ｃｐｍ¹²⁵Ｉ（Ｎｌｅ²¹， Ｔｙｒ³²）ヒツジＣＲＦ（ＣＲＦ １μｇをクロラミンＴ酸化によって２，００ ０Ｃｉ／ｍｍｏｌの比活性までにヨウ素化し；ヨウ素化ＣＲＦをＨＰＬＣによっ て精製した）と共に、非標識ラット／ヒト（ｒ／ｈ）ＣＲＦの濃度を高めながら 、室温において９０分間インキュベートした。ヨウ素化ＣＲＦと非標識ラット／ ヒト（ｒ／ｈ）ＣＲＦとの両方を２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．１％ＢＳＡ、１０ ％スクロース、２ｍＭ ＥＧＴＡ中で、２００μｌの最終量において、最終ｐＨ ７．５に、最終濃度１０ｍＭでＭｇＳＯ₄を含むまでに希釈した。１％ＢＳＡ、 １０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）で予め湿潤させたＧＦ／Ｃ（Ｗｈａｔｍａ ｎ）フィルターを通す濾過によって反応を停止させた。フィルターを０．１％Ｂ ＳＡ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）によって４回洗浄した。ＣＲＦ−Ｒ：¹²⁵ Ｉ−（Ｎｌｅ²¹，Ｔｙｒ³²）ヒツジＣＲＦ錯体の存在を示すフィルター結合 放射能をγシンチレーション計数によって測定した。 非標識ヒト／ラットＣＲＦ（ｒ／ｈＣＲＦ）による¹²⁵Ｉ−（Ｎｌｅ²¹，Ｔｙ ｒ³²）ヒツジＣＲＦの置換に関するアッセイからの結果を図１に示す。結果は、 ネイティブｒ／ｈＣＲＦがｈｃｔＣＲＦＲによるトランスフェクト済み細胞から 用量依存式に標識ヒツジＣＲＦを置換できるが、ｒＧｎＲＨＲによるトランスフ ェクト済み細胞からは置換できないことを実証する。このことは、ｈｃｔＣＲＦ Ｒクローンが生理的に適切なＣＲＦ受容体（すなわち、ＣＲＦ−ＲＡ₁）に特徴 的な、薬理学的特異性を示す受容体をコードすることを実証する。 実施例４ 細胞内ｃＡＭＰレベルのＣＲＦ−Ｒ仲介刺激のアッセイ 多重シグナル形成経路(signaling pathway)へのＣＲＦ−Ｒの可能な結合を評 価するために、ＣＲＦ−Ｒ発現ＣＯＳＭ６細胞におけるｃＡＭＰ形成を刺激する ＣＲＦ−Ｒの能力を調べた。ｃＡＭＰレベルの変化がｃＡＭＰホスホジエステラ ーゼの変化によって影響されないことを保証するために、ホスホジエステラーゼ 阻害剤３−イソブチル−１−メチルキサンチン（ＩＢＭＸ）を培地に加えた。１ ５０ｍｍ皿におけるｃｔＣＲＦＲ又はｒＧｎＲＨＲによるトランスフェクション 後２４時間目に、ＣＯＳＭ６細胞をトリプシン化し、２４孔プレート（Ｃｏｓｔ ａｒ）に再プレーティング化、１０％ＦＣＳ、ＤＭＥＭ中でさらに２４時間受容 体を発現させた。 刺激した日に、０．１ｍＭ ＩＢＭＸ又は培地による３０分間プレインキュベ ーションの少なくとも２時間前に、培地を０．１％ＦＣＳ、ＤＭＥＭに交換した 。試験リガンド（すなわち、ｒ／ｈＣＲＦ、サウバギン、サケカルシトニン、血 管活性腸ペプチド（ＶＩＰ）、成長ホルモン放出因子（ＧＲＦ））を０．１％Ｂ ＳＡ、０．１％ＦＣＳ、ＤＭＥＭ中に加え、３７℃、７．５％ＣＯ₂において刺 激を３０分間実施した。培地を除去し、細胞を氷冷９５％ＥｔＯＨ−０．１Ｍ ＨＣｌによって−２０℃ｎｉｏｉｔｅ一晩抽出した。環状ＡＭＰ（ｃＡＭＰ）レ ベルを３通りの孔からＲＩＡキット（Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏ ｇｉｅｓ，マサチューセッツ州，ストートン）によって製造者のプロトコールに 従って二重に測定した。 結果は図２Ａ、２Ｂ及び２Ｃに示す。図２Ａと２Ｂは、クローン化ｈｃｔＣＲ ＦＲによるトランスフェクト済みＣＯＳＭ６細胞が細胞内ｃＡＭＰにおいて基底 ｃＡＭＰレベルの約１０〜２０倍増加を示してＣＲＦに応答することを実証する 。幾つかの非関連ペプチドは受容体トランスフェクト済み細胞における環状ＡＭ Ｐレベルに影響を及ぼさない。図２ＣはＣＲＦアンタゴニスト、αヘリカル（９ −４１）ＣＲＦがｒ／ｈＣＲＦによる環状ＡＭＰの誘導をブロックすることを実 証する。 実施例５ ラットＣＲＦ−ＲをコードするｃＤＮＡの単離 成体Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット全脳ポリ（Ａ）＋二本鎖ｃＤＮＡを ｃＤＮＡライブラリーの合成に用いた。二本鎖ｃＤＮＡをＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩ アダプター（Ｐｈａｒｍａｃｉａ／ＬＫＢ）に連結し、２キロベースペア（ｋｂ ）より大きいｃＤＮＡはλＺＡＰＩＩベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，カリフ ォルニア州，ラジョラ）に結合させた。このライブラリーを１回増幅させ、約７ Ｘ１０⁵クローンを標準方法によってＣＲＦ−Ｒ１（すなわち、ＣＲＦ−ＲＡ₁） の１．２ｋｂ ＰｓｔＩフラグメントとのハイブリッド形成によってスクリーニ ングした。同定されたポジティブクローンの１つを配列決定し、全長ＣＲＦ−Ｒ （ｒｂＣＲＦ−ＲＡ）を含むことを発見した。このポジティブクローンは標識ラ ット脳ＣＲＦ−Ｒ（ｒｂＣＲＦ−ＲＡ）であり、４１５アミノ酸ＣＲＦ−Ｒタン パク質をコードする１２４５ｂｐ読み取り枠を有する約２５００塩基対（ｂｐ） インサートを含む。ｃＤＮＡと、“ｒｂＣＲＦ−ＲＡ”に対応するアミノ酸配列 とはそれぞれ、配列番号：５及び６に記載される。 実施例６ マウスＣＲＦ−ＲＢ₁をコードするゲノムＤＮＡの単離 マウスファージゲノムライブラリーの約７ｘ１０⁶クローン（Ｓｔｒａｔａｇ ｅｎｅ，カリフォルニア州，ラジョラから入手）を、標準方法によって、ラット ＣＲＦ−ＲＡ（配列番号：５参照）のヌクレオチド２０４〜１４０２を含むプロ ーブとのハイブリッド形成によってスクリーニングした。このように、ハイブリ ッド形成を５ｘ ＳＳＰＥ、５Ｘ Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液及び０．５％ＳＤＳ中 で１６時間、６０℃において実施した。フィルターを室温において２ｘ ＳＳＣ 、０．１％ＳＤＳによって２回洗浄し、次に、６０℃において２ｘ ＳＳＣ、０ ．１％ＳＤＳによって２回洗浄した。 同定されたポジティブクローンの１つを配列決定し、ＣＲＦ−ＲＢ₁のトラン スメンブランドメイン３〜４に由来する部分的ＣＲＦ−ＲＢ₁配列をコードする 読み取り枠を含むことを発見した。このポジティブクローンは標識マウスＣＲＦ −ＲＢ₁（ｍＣＲＦ−ＲＢ₁）であり、約４５０ヌクレオチドのイントロンによっ て中断された２個のエキソンを含む。２個のエキソンは結合して、新規なＣＲＦ −ＲＢ₁タンパク質の７０アミノ酸部分をコードする２１０塩基対（ｂｐ）読み 取り枠を形成する。ｃＤＮＡと、“ｍＣＲＦ−ＲＢ₁”に対応するアミノ酸配列 とはそれぞれ、配列番号：７及び８に記載される。 クローンｍＣＲＦ−ＲＢ₁をさらに配列決定すると、クローンｍＣＲＦ−ＲＢ₁ をコードする読み取り枠の付加的７８塩基対（配列番号：９のヌクレオチド８９ ５〜９７２に相当）を含む第３エキソンが明らかにされた。 実施例７ マウスＣＲＦ−ＲＢ₁をコードするｃＤＮＡの単離 新規なマウスＣＲＦ−ＲＢ₁受容体に対応するｃＤＮＡを得るために、マウス 心臓ファージライブラリーをハイブリッド形成によってスクリーニンク化た。λ ｚａｐＩＩベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に置ける増幅オリゴ−ｄｔプライ ムドマウス心臓ｃＤＮＡライブラリーの約１．２ｘ１０⁶ファージプラークを ハイブリッド形成によってスクリーニングした。ＣＲＦ−ＲＢ₁のためのプロー ブは［α³²Ｐ］−ｄＣＴＰと下記プライマー： センス：５’ＣＴＧＣＡＴＣＡＣＣＡＣＣＡＴＣＴＴＣＡＡＣＴ３’（配列番号 ：１１）及びアンチセンス：５’ＡＧＣＣＡＣＴＴＧＣＧＣＡＧＧＴＧＣＴＣ３ ’（配列番号：１２） とを用いるＰＣＲによって、調製した。 このプローブの形成に用いた鋳型は配列番号：１０のアミノ酸２０６〜２４６ に及ぶＣＲＦ−ＲＢ₁の１エキソンに相当するプラスミドＤＮＡであった。ＰＣ Ｒ増幅を３０サイクル（９４℃において１分間変性させ、５５℃において２分間 アニールし、７２℃において３分間延伸した）、実施して、配列番号：９のヌク レオチド６９３〜８１５に相当する１２３ｂｐ生成物を得た。 ハイブリッド形成スクリーニングのために、プラークをナイロン膜上に持ち上 げ、変性させ、中和し、すすぎ洗いした。この膜を４２℃において、０．６Ｍ ＮａＣｌ、６０ｍＭ クエン酸ナトリウム、４ｘＤｅｎｈａｒｄｔ、４０ｍＭ リン酸ナトリウム、ｐＨ６．５、１７０ｍｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡ、０．１％Ｓ ＤＳ、２０％ホルムアミド中で前ハイブリッド形成した。この膜を次に、４２℃ において、同じ溶液プラス５０％硫酸デキストラン中で、溶液１ｍｌにつき約１ ０⁶ｃｐｍ標識プローブによってハイブリッド形成した。ハイブリッド形成後に 、フィルターを０．３Ｍ ＮａＣｌ、３０ｍＭ クエン酸ナトリウム、０．１％ ＳＤＳによって室温において１回、４２℃において２回、５０℃において２回洗 浄した。 ポジティブプラークを単離し、次のラウンドのプラークハイブリッド形成で精 製した。λｚａｐＩＩクローンのインビボ切断のためにヘルパーファージＲ４０ ８（Ｂｉｏｒａｄ）を用いた。クローン化受容体をＳｅｑｕｅｎａｓｅキット（ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）を用いてジデオキシチ ェインターミネーター法によって両鎖に関して配列決定した。マウスＣＲＦ−Ｒ Ｂ₁をコードするクローンは４３１アミノ酸のタンパク質をコードする１２９３ 塩基対（ｂｐ）読み取り枠を含む２．２ｋｂインサートを含有した。全長ＣＲＦ −ＲＢ₁受容体ｃＤＮＡを、ＥｃｏＲＩ制限酵素によって、発現ベクターｐｃ ＤＮＡ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にサブクローン化して、プラスミドｐＣＲＦ −ＲＢ₁を形成した。Ｊｏｔｕｎ−Ｈｅｉｎ重みつき方法とＰＡＭ２５０残基重 量表とをそれぞれ用いて、ヌクレオチドとアミノ酸配列とをアライメントさせた 。ＣＲＦ−ＲＢ₁は、ＣＲＦ−ＲＡ₁に対して、ヌクレオチドレベルにおいて７０ ％相同性を有し、アミノ酸レベルにおいて６８％相同性を有した。図３Ａと図３ ＢはＣＲＦ−ＲＢ₁とＣＲＦ−ＲＡ₁とのアミノ酸配列の比較を示す。アライメン トは類似領域を最大にするように選択した。ＣＲＦ−ＲＢ₁のＮ−末端ドメイン には、ＣＲＦ−ＲＡ₁に存在するような、推定シグナルペプチドと５個の推定Ｎ −グリコシル化部位が存在する。ＣＲＦ−ＲＢ₁とＣＲＦ−ＲＡ₁とを比較する場 合に、７個のトランスメンブランドメイン（ＴＭＤ）には７９％類似性と、細胞 内ループと細胞外尾部に８４％類似性が存在する。細胞外ループ（ＥＣＬ）には 僅か６０％の同一性と、付加的な１６アミノ酸を有するＮ−末端ドメインには４ ０％同一性が存在する。 ＣＲＦ−ＲＡ₁における推定ホスホリル化部位の１つ以外の全てはＣＲＦ−Ｒ Ｂ₁に検出され、欠失する１つはＣ−末端に存在するものである。ＣＲＦ−ＲＢ₁ はまた、切断された推定シグナルペプチド内に存在するＮ−末端領域に余分なシ ステインを有し、細胞外ループ−１とトランスメンブランドメイン−３との接合 部に、残基がこのトランスメンブランドメイン内に入るように、余分なシステイ ンを有する。 実施例８ ＣＯＳＭ６細胞に一過性に発現されるＣＲＦ−ＲＢ₁の薬理学的特徴 実施例３に記載の方法を用いて、ラジオレセプターアッセイを実施した。ｐＣ ＲＦ−ＲＢ₁プラスミドＤＮＡ約１０μｇをＤＥＡＥデキストラン法によってＣ ＯＳＭ６細胞中にトランスフェクトさせた。２日間後に、細胞を剥離し、粗膜画 分を調製し、¹²⁵Ｉ−（Ｎｌｅ²¹，Ｔｙｒ³²）ヒツジＣＲＦの競合置換による結 合評価に用いた。Ｋ_dを算出するために、置換データをＭｕｎｓｏｎとＲｏｄｂ ａｒｄ（１９８０）のリガンド プログラム（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０ ７：２２０〜２３９）によって分析した。 結合リガンドの競合置換によって測定すると、クローン化ＣＲＦ−ＲＢ₁はＣ ＲＦを高いアフィニティで結合する。６回の実験から、解離定数は約Ｋ_d＝１． ３±０．２ｎＭであると算出された（図４参照）。ペプチドＧＲＦとＶＩＰは結 合したラジオリガンドと置換しないので、この結合は特異的である。さらに、Ｃ ＲＦ−Ｒはサウバギン、ウロテンシン及び強力なアンタゴニスト、例えば、［Ｄ Ｐｈｅ¹²，Ｎｌｅ²¹，³⁸］−ｈＣＲＦ（９−４１）に対して高いアフィニティを 有する。 実施例９ 細胞内ｃＡＭＰレベルのＣＲＦ−ＲＢ₁仲介刺激のアッセイ 実施例４に記載の方法を用いて、ＣＲＦ−ＲＢ₁発現ＣＯＳＭ６細胞における ｃＡＭＰ形成を刺激するＣＲＦ−ＲＢ₁の能力を調べた。プラスミドｐＣＲＦ− ＲＢ₁をＣＯＳＭ６細胞にトランスフェクトした。１日後に、細胞をトリプシン 化し、２４孔又は４８孔ＣＯＳＴＡＲ組織培養孔中の１０％ＦＢＳ、ＤＭＥＭに 再プレーティングし、さらに２４時間増殖させた。処理の少なくとも２時間前に 培地を０．１％ＦＢＳ、ＤＭＥＭに交換した。細胞を０．１ｍＭ ３−イソブチ ル−１−メチルキサンチンと共に３０分間、プレインキュベートし、次に、種々 なペプチドに３７℃において３０分間暴露させた。細胞内ｃＡＭＰをＲＩＡキッ ト（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，マサチューセッツ州 ，ストートン）を用いて３通りの孔から二重に測定した。 結果は図５に示す。結果は、ＣＲＦ−ＲＢ₁がＣＯＳＭ６細胞中に一過性にト ランスフェクトされるときに、ＣＲＦが細胞内ｃＡＭＰの蓄積を刺激することを 実証する。ＥＣ₅₀は１〜１０ｎＭにおいて生じ、投与量反応はＣＲＦ−ＲＡ₁の マウス類似体をトランスフェクトする場合に見られる反応と同様である。ＣＲＦ ペプチドファミリーの要素であるウロテンシンとサウバギンは細胞内ｃＡＭＰの 蓄積の刺激においてＣＲＦと等効力である。ペプチドＧＲＦとＶＩＰはｃＡＭＰ 蓄積を刺激しない（図５参照）。クローン化ＣＲＦ−ＲＢ₁受容体によるＣＲＦ シグナル変換は１μＭ ＣＲＦアンタゴニスト，［ＤＰｈｅ¹²，Ｎｌｅ²¹，³⁸］ −ｈＣＲＦ（１２−４１）の存在下で阻害される。 実施例１０ ＣＲＦ−ＲＢ₁の組織分布を評価するためのＲＮアーゼ保護アッセイ ＣＲＦ−ＲＡ₁に相当するマウス受容体のコーディング領域を周知のＲＴ−Ｐ ＣＲ方法によって公開配列に基づくプライマーと、鋳型としての、マウスＡｔＴ −２０細胞（ＡＴＣＣ，Ｎｏ．ＣＣｌ ８９）からのＲＮＡを用いてクローン化 した。マウスＣＲＦ−ＲＡ₁のアミノ酸２６〜１０６（配列番号：１３）をコー ドするプラスミドＤＮＡと、マウスＣＲＦ−ＲＢ₁のアミノ酸１〜１３２（すな わち、配列番号：９のアミノ酸１〜１３２）とを線状形にし、ＳＰ６ ＲＮＡポ リメラーゼと、［α−³²Ｐ］ＵＴＰとを用いて、アンチセンス リボプローブ(r iboprobe)を合成した。グリセルアルデヒド ３−ホスフェートデヒドロゲナー ゼ（ＧＡＰＤＨ）の内部負荷対照(loading control)アンチセンス リボプロー ブをＴ７ＲＮＡポリメラーゼを用いて合成した。 マウス心臓と脳組織とからの総ＲＮＡ（３０μｇ）を標識リボプローブ５ｘ１ ０⁵ｃｍｐに６５℃において１８時間、ハイブリッド形成することによって、Ｒ Ｎアーゼ保護アッセイを実施した。この後に、ＲＮアーゼ消化（ＲＮアーゼＡ １８０μｇ／ｍｌとＲＮアーゼＴ１ ３５０Ｕ／ｍｌ）を２３℃において６０分 間実施し、この後にサンプルを５％ポリアクリルアミド、８Ｍ尿素ゲル上でラン した。 ＲＮアーゼ保護分析を用いて、マウス脳と心臓におけるＣＲＦ−ＲＡ₁とＣＲ Ｆ−ＲＢ₁との相対的発現を調べた。両受容体が脳と心臓において検出されたが 、心臓は主としてＣＲＦ−ＲＢ₁を発現するように思われる（ＣＲＦ−ｍＲＮＡ を発現することも報告されている）。心臓には多数の保護フラグメントが見られ る。さらに、５’ＣＲＦ−ＲＢ₁プローブを用いると、脳における主要な保護フ ラグメントは心臓におけるよりも小さく、クローン化ＣＲＦ−ＲＢ₁から形成さ れると予想されるものよりも小さい。 実施例１１ ＣＲＦ−ＲＢ₁の組織分布を調べるための ｉｎ−ｓｉｔｕハイブリッド形成アッセイ ³⁵Ｓ標識アンチセンスｃＲＮＡプローブを用いて，ｉｎ−ｓｉｔｕハイブリッ ド形成組織化学によって、ＣＲＦ−ＲＢ₁ｍＲＮＡの組織分布をさらに特徴づけ た。生後６週間の雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスを０．１Ｍホウ酸塩バッファー中４％ パラホルムアミドによって心臓を通して潅流し、脳、心臓、十二指腸、精巣／精 巣上体からの２０〜３０μｍ厚さ凍結切片の規則的間隔をおいたシリーズを既述 されているように採取した［Ｓｉｍｍｏｎ等，Ｊ．Ｈｉｓｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏ ｇｙ １２：１６９〜１８１（１９８９）］。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ｋｓベ クター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，カリフォルニア州，ラジョラ）にサブクローン 化した、８０ｂｐの５’非翻訳領域と９２６ｂｐのＣＲＦ−ＲＢ₁コーディング 配列とを含む、ＣＲＦ−ＲＢ₁ｃＤＮＡの１．０ｋｂ ＢａｍＨＩダイジェスト から、放射性標識アンチセンス及びセンス（対照）ｃＲＮＡコピーを合成した。 プローブ合成のための放射性同位体として³²Ｓ−ＵＴＰを用いて、ｉｎ−ｓｉｔ ｕハイブリッド形成を既述されているように実施した［Ｓｉｍｍｏｎｓ等，上記 文献；Ｉｍａｋｉ等，Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．４９６：３５〜４４（１９８９）］ 。プローブを１〜３ｘ１０⁹ｄｐｍ／μｇの比活性まで標識し、ハイブリッド形 成を高緊縮条件（７０℃における０．２ｘＳＳＣ中での最終洗浄によって５０％ ホルムアミド）下で実施した。 同様な比活性まで標識したセンス鎖ｃＲＮＡは、アンチセンスプローブがロブ スト(robust)シグナルを明らかにしたような配列に隣接する組織切片に施用した 場合に、ポジティブ局在性を示唆することができなかった。クローン化とＲＮア ーゼ保護アッセイとのデータと一致して、ＣＲＦ−ＲＢ₁転写体は心臓において 検出され、心臓では血管周囲の細胞上並びに心外膜中に標識が最も顕著に出現し た。雄生殖腺では、ＣＲＦ−ＲＢ₁ｍＲＮＡが精巣上体の基質組織(stromal tiss ue)中に主として局在したが、精巣中の標識はバックグラウンドレベルであるか 又はこのレベルに近かった。十二指腸上のＣＲＦ−ＲＢ₁ｍＲＮＡシグナルは粘 膜下層上と、付加的に、絨毛の基部の単離された上皮細胞上との銀粒子の緻密な 帯として出現した。 脳では、ＣＲＦ−ＲＢ₁ｍＲＮＡがかなり制限された分布を示し、これはラッ トにおけるＣＲＦ−ＲＡ₁ｍＲＮＡの分布とは程度とトポグラフィーとにおいて 対照的である。中隔領域(septal region)では、ＣＲＦ−ＲＢ₁ｍＲＮＡが外側中 隔核(lateral septal nucleu)の限局面(circumscribed aspect)に発現されるが 、ＣＲＦ−ＲＡ₁ｍＲＮＡ転写体は内側中隔結合(medial septal complex)上 に見られる。前脳におけるＣＲＦ−ＲＢ₁ｍＲＮＡ発現の他の主要な部位は嗅球 、視索前領域、視床下部及び扁桃の限局面を含む。 これらの領域の各々では、ＣＲＦ−ＲＢ₁発現のパターンがラット脳における ＣＲＦ−ＲＡ₁の発現パターンとは異なることが見られる。この場合に用いられ るマウスＣＲＦ−ＲＢ₁プローブはマウスとラットの脳におけるハイブリッド形 成と同様なパターンを生じたので、ＣＲＦ−Ｒ分布の主要な種差が関係するとは 思われない。 本発明をそのある一定の好ましい実施態様に関連して詳細に説明したが、改良 及び変更が、開示し、特許請求する発明の要旨及び範囲に含まれることは理解さ れるであろう。 配列の概要 配列番号：１は、本発明のヒト誘導ＣＲＦ受容体（すなわち、ｈＣＲＦ−ＲＡ₁ ）をコードするｃＤＮＡの核酸配列（及び演繹されたアミノ酸配列）である。 配列番号：２は、配列番号：１に記載されるヒト誘導ＣＲＦ受容体の演繹され たアミノ酸配列である。 配列番号：３は、本発明のヒト誘導ＣＲＦ受容体の２９アミノ酸インサート部 分をコードするスプライス変異ｃＤＮＡインサートの核酸配列（及び演繹された アミノ酸配列）である。スプライス変異ｃＤＮＡインサートは配列番号：１のヌ クレオチド５１６〜５１７間に配置される（それによって、ＣＲＦ−ＲＡ₂を生 じる）。 配列番号：４は、配列番号：３に記載されるヒト誘導ＣＲＦ受容体スプライス 変異ｃＤＮＡインサートの演繹されたアミノ酸配列である。スプライス変異アミ ノ酸インサートは配列番号：２のヌクレオチド１４５〜１４６間に配置される。 配列番号：５は、本発明のラット誘導ＣＲＦ受容体（すなわち、ｒＣＲＦ−Ｒ Ａ）のｃＤＮＡエンコーディング領域の核酸配列（及び演繹されたアミノ酸配列 ）である。 配列番号：６は、配列番号：５に記載されるラット誘導ＣＲＦ受容体の演繹さ れたアミノ酸配列である。 配列番号：７は、本発明のマウス誘導ＣＲＦ受容体（すなわち、ｍＣＲＦ−Ｒ Ｂ₁）をコードする部分的ゲノムクローンの２エキソン（介在イントロン配列を 除く）の核酸配列（及び演繹されたアミノ酸配列）である。 配列番号：８は、配列番号：７に記載されるヒト誘導ＣＲＦ受容体の演繹され たアミノ酸配列である。 配列番号：９は、本発明のＢ型マウス誘導ＣＲＦ受容体（すなわち、ｍＣＲＦ −ＲＢ₁）をコードするｃＤＮＡの核酸配列（及び演繹されたアミノ酸配列）で ある。 配列番号：１０は、配列番号：９に記載されるマウス誘導ＣＲＦ−ＲＢ受容体 の演繹されたアミノ酸配列である。 配列番号：１１は、実施例７に記載する“センス”プローブである。 配列番号：１２は、実施例７に記載する“アンチセンス”プローブである。 配列番号：１３は、マウス誘導ＣＲＦ−ＲＡ₁受容体のアミノ酸配列である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/53 0276−2Ｊ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 33/566 0276−2Ｊ 33/566 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，ＪＰ (72)発明者 チェン，ルオピング アメリカ合衆国 92130 カリフォルニア 州サン ディエゴ，カミニト カルメル ランディング 3623 (72)発明者 ルイス，キャシー エイ. アメリカ合衆国 92103 カリフォルニア 州サン ディエゴ，モンテシト ウエイ 1760 (72)発明者 ベイル，ウィリー ダブリュ．，ジュニア アメリカ合衆国 92037 カリフォルニア 州ラ ジョラ，バルデズ 1643 (72)発明者 ドナルドソン，シンシア ジェイ. アメリカ合衆国 92110 カリフォルニア 州サン ディエゴ，リンウッド ストリー ト 1767 (72)発明者 ソーチェンコ，ポール アメリカ合衆国 92024 カリフォルニア 州エンシニタス，オータムン プレイス 1820

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．単離した哺乳動物Ｇタンパク質共役副腎皮質刺激ホルモン放出因子（ＣＲ Ｆ）受容体タンパク質又はそのフラグメント。 ２．１０ナノモル以下の濃度のＣＲＦが前記受容体タンパク質の結合部位の５ ０％以上を占めるように、ＣＲＦに対する充分な結合アフィニティを有する、請 求項１記載のタンパク質。 ３．配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号： １０に記載されるアミノ酸配列と実質的に同じアミノ酸配列と、受託番号７５４ ７４でＡＴＣＣに寄託されたクローンｈｃｔＣＲＦＲのＣＲＦ−Ｒコード部分に よってコードされるアミノ酸配列と実質的に同じアミノ酸配列とを有する、請求 項１記載のタンパク質。 ４．請求項１記載のタンパク質をコードする単離された核酸。 ５．請求項３記載のタンパク質をコードする単離された核酸。 ６．配列番号：１のヌクレオチド８２〜１３２９、配列番号：３、配列番号： ５のヌクレオチド８１〜１３２４、配列番号：７の実質的に全配列、配列番号： ９のヌクレオチド７９〜１３７１、又は受託番号７５４７４でＡＴＣＣに寄託さ れたクローンｈｃｔＣＲＦＲのＣＲＦ−Ｒコード部分、若しくは同じアミノ酸配 列をコードするが、アミノ酸の一部に対して異なるコドンを用いるその変異体、 若しくはそのスプライス変異ヌクレオチド配列 と実質的に同じ連続ヌクレオチド配列を有する、請求項４記載の単離された核酸 。 ７．請求項１記載のタンパク質をコードする、単離精製した核酸又はその機能 的フラグメントであって、 （ａ）配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号 ：１０に記載されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ； （ｂ）中程度の緊縮条件下で（ａ）のＤＮＡとハイブリッド形成する、生物学 的に活性なＣＲＦ−ＲをコードするＤＮＡ；及び （ｃ）生物学的に活性なＣＲＦ−Ｒをコードする、上記（ａ）又は（ｂ）に関 する縮重したＤＮＡ から選択される前記核酸。 ８．配列番号：１、３、５、７又は９に記載される配列と実質的に同じ連続ヌ クレオチド配列を有する、請求項４記載の単離された核酸。 ９．ＣＲＦ受容体の組換え体産生方法であって、請求項４記載の核酸を適当な 宿主細胞中で発現することを含む前記方法。 10．ハイブリッド形成プローブとして有用な単離された核酸フラグメントであ って、請求項４記載の核酸の少なくとも１４個の連続ヌクレオチドを含み、検出 可能な置換基によって標識される前記フラグメント。 11．前記容易に検出可能な置換基が放射性標識分子、蛍光性分子、酵素又はリ ガントから選択される、請求項１０記載の単離された核酸フラグメント。 12．ＣＲＦ受容体をコードするクローンの同定方法であって、 低緊縮ハイブリッド形成条件下で請求項１０記載の核酸フラグメントによって ゲノム又はｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、 前記フラグメントに対して実質的なハイブリッド形成度を示すようなクローン を同定すること を含む前記方法。 13．ＣＲＦ受容体に結合するような化合物を決定するために、化合物群をスク リーニングする方法であって、結合アッセイに請求項１記載の受容体を用いるこ とを含む前記方法。 14．試験化合物が請求項１記載の受容体タンパク質又は前記受容体タンパク質 の官能性修飾形に関してアゴニスト又はアンタゴニストのいずれとして作用する ことができるかどうかを評価するためのバイオアッセイであって、次の工程： （ａ）ＣＲＦ受容体タンパク質又はその官能性修飾形を発現するＤＮＡを含む 細胞を培養する工程であって、ＣＲＦ受容体タンパク質のシグナル変換活性を調 節するその能力の評価を要求される少なくとも１種の化合物の存在下で培養を実 施する工程と；その後に、 （ｂ）細胞内ｃＡＭＰレベルの増加又は減少に関して前記細胞をモニターする 工程とを含む前記バイオアッセイ。 15．化合物が請求項１記載の受容体タンパク質又は前記受容体タンパク質の官 能性修飾形に対してアゴニストであるかどうかを評価するためのバイオアッセイ であって、次の工程： （ａ）前記受容体タンパク質又は前記受容体タンパク質の官能性修飾形を発現 するＤＮＡと、ＣＲＦ−Ｒ反応性転写要素に機能的に結合する、レポータータン パク質をコードするＤＮＡとを含む細胞を培養する工程であって、前記受容体タ ンパク質のシグナル変換活性を誘導するその能力の評価を要求される少なくとも １種の化合物の存在下で培養を実施する工程と；その後に、 （ｂ）前記レポータータンパク質の発現に関して前記細胞をモニターする工程 と を含む前記バイオアッセイ。 16．化合物が請求項１記載の受容体タンパク質又は前記受容体タンパク質の官 能性修飾形に対するアンタゴニストであるかどうかを評価するためのバイオアッ セイであって、次の工程： （ａ）前記受容体タンパク質又は前記受容体タンパク質の官能性修飾形を発現 するＤＮＡと、ＣＲＦ−Ｒ反応性転写要素に機能的に結合する、レポータータン パク質をコードするＤＮＡとを含む細胞を培養する工程であって、前記受容体タ ンパク質のシグナル変換活性を阻害するその能力の評価を要求される少なくとも １種の化合物の増加する濃度と、前記受容体タンパク質又は前記受容体タンパク 質の官能性修飾形に対する少なくとも１種のアゴニストの一定濃度との存在下で 培養を実施する工程と；その後に、 （ｂ）前記細胞における前記レポータータンパク質の発現レベルを前記化合物 の濃度の関数としてモニターして、それによって、転写活性化を阻害する前記化 合物の能力を実証する工程と を含む前記バイオアッセイ。 17．請求項１記載のタンパク質に対して形成される抗体。 18．前記抗体がモノクローナル抗体である請求項１７記載の抗体。 19．ＣＲＦ受容体によって仲介されるシグナル変換活性を調節する方法であっ て、前記受容体を請求項１５によって同定される前記アゴニストの調節有効量と 接触させる工程を含む前記方法。 20．ＣＲＦ受容体によって仲介されるシグナル変換活性を調節する方法であっ て、前記受容体を請求項１６によって同定される前記アンタゴニストの調節有効 量と接触させることを含む前記方法。 21．ＣＲＦ受容体によって仲介されるシグナル変換活性を調節する方法であっ て、前記受容体を請求項１７記載の前記抗体の調節有効量と接触させることを含 む前記方法。 22．請求項１２記載の方法によって産生されるＣＲＦ受容体をコードする核酸 のスプライス変異体核酸。