JPH09509146A - Ｃｓ−１ペプチド模擬物、組成物およびその使用法 - Google Patents

Ｃｓ−１ペプチド模擬物、組成物およびその使用法

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JPH09509146A
JPH09509146A JP7516254A JP51625495A JPH09509146A JP H09509146 A JPH09509146 A JP H09509146A JP 7516254 A JP7516254 A JP 7516254A JP 51625495 A JP51625495 A JP 51625495A JP H09509146 A JPH09509146 A JP H09509146A
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ジェイ． エリシーズ，マリアノ
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サイテル コーポレイション
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、炎症白血球上で発現したVLA-4レセプターと、免疫炎症疾患状態に関連する内皮細胞上で発現したフィブロネクチンCS-1ペプチドとの間の結合を阻害するペプチドを意図する。意図されるペプチドを含有する薬学的組成物および結合阻害ペプチドを用いた免疫炎症症状を治療するプロセスもまた開示される。

Description

【発明の詳細な説明】 CS-1ペプチド模擬物、組成物およびその使用法技術分野 本発明は、細胞表面にフィブロネクチンのCS-1部分を発現する内皮細胞に炎症 性細胞が結合すること、さらに特定すると、最小限の長さのペプチド模擬性化合 物によるこの結合の阻害に関する。技術背景 免疫応答は、宿主防御の基礎の１つとして、白血球走行(trafficking)および 免疫監視に依存する。この免疫監視は、白血球をリンパ系組織を通って正常に再 循環させるだけでなく、炎症部位での近接組織への急速な白血球の補充および溢 出も可能にする。α４β１(CD49d/CD29、VLA-4)細胞接着レセプターは、これら の白血球走行機能における活性関与体(active participant)である［Hemler Ann . Rev．Immunol. 、８:365-400(1990)；Hemlerら、Immunol．Rev.、114:45-65(19 90)］。 VLA-4インテグリンヘテロダイマーは、３つの研究グループによって独立に発 見され、そしてリンパ球上の表面抗原として同定された［Sanchez-Madridら、Eu r．J．Immunol. 、16:1343-1349(1986)；Claybergerら、J．Immunol.、138:1510- 1514(1987)；Hemlerら、J．Biol．Chem.、262:11478-11485(1987)］。インテグ リンファミリー内では、VLA-4は、以下のいくつかの点において独自性がある： (i)β1サブファミリーの関連するメンバーと対照的に、VLA-4は増血系列細胞上 で優勢に発現し［Hemler、Ann．Rev．Immunol.、８:365-400(1990)］、細胞−細 胞間、および細胞−細胞外マトリックス(ECM)接着相互作用に機能的に関与して いる［Hemler、Ann．Rev．Immunol.、８:365-400(1990)］；(ii)他のインテグリ ンαサブユニットとの配列相同性にもかかわらず、α４サブユニットは、サブユ ニットの２つの主要な構造集団から離れている。なぜならα４サブユニットは、 挿入されるI-ドメインを欠き、そして膜貫通領域付近で翻訳後の切断を受けない からである［Hemler、Ann．Rev．Immunol.、８:365-400(1990)；Hynes、Cell、6 9 :11-25(1992)］；および(iii)α４は、トリプシン様切断部位を有し、その結果 α４-150およびα４-80/70と呼ばれる少なくとも２つの異なる構造変異体の細胞 タイプ特異的表面発現を生じる［Pulidoら、FEBS Lett.、294:121-124(1991)；T eixidoら、J．Biol．Chem.、267:1786-1791(1992)；Rubioら、Eur．J．Immunol. 、22:1099-1102(1992)］。 VLA-4インテグリンは、CD34発現造血幹細胞上で見い出された最も初期の接着 レセプターの１つであるようである［Teixidoら、J．Clin．Invest.、90:358-36 7(1992)］。しかし、VLA-4は成熟ＴおよびＢリンパ球、ナチュラルキラー(NK)細 胞、単球、好塩基球および好酸球上でのみ発現し、赤血球、血小板、および好中 球では発現しない［Hemler、Ann．Rev．Immunol.、８：365-400(1990)；Gismond iら、J．Immunol.、146：384-392(1991)；Walshら、J．Immunol.、146：3419-34 23(1991)；Bochnerら、J．Exp．Med.、173:1553-1556(1992)；Dobrinaら、J．C1 in．Invest. 、88：20-26(1991)；Wellerら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA、88： 7430-7433(1991)］。 今日では、VLA-4によって仲介された大部分の接着機能は、VLA-4インテグリン と、２つの分離したカウンターレセプター構造、すなわち、サイトカイン誘導性 血管細胞接着分子-1(VCAM-1)［Elicesら、Cell、60：577-584(1990)、Riceら、J ．Exp．Med. 、171:1369-1374(1990)；Schwartzら、J．Clin．Invest.、85:2019- 2022(1990)；Carlosら、Blood、76:965-970(1990)］および遍在性ECMタンパク質 であるフィブロネクチンのサブセット［Waynerら、J．Cell Biol.、109:1321-13 30(1989)；Guanら、Cell、60:53-61(1990)；Ferreiraら、J．Exp．Med.、171:35 1-356(1990)；Elicesら、Cell、60:577-584(1990)］のいすれかとの間での直接 的な分子相互作用によって説明され得る。 VCAM-1は、免疫グロブリン(Ig)遺伝子スーパーファミリーのメンバーであって ［Osbornら、Cell、59;1203-1211(1989)；R1ceら、science、246:1303-1306(198 9)］、IL-1、TNFα、およびIL-4のような炎症前の(pro-inflammatory)サイトカ インに応答して、血管内皮細胞中で優勢に発現する［Osbornら、Cell、59:1203- 1211(1989)；Riceら、Science、246:1303-1306(1989)；Thornhillら、J．Immuno l. 、145:865-872(1990)；Masinovskyら、J．Immunol.、145:2886-2895(1990)；T hornhillら、J．Immunol.、146:592-598(1991)、Schleimerら、J．Immunol.、14 8 :1086-1092(1992)；Birdsallら、J．Immunol.、148:2717-2723(1992)；Swerlic kら、J．Immunol.、149:798-705(1992)；Briscoeら、J．Immunol.、149:2954-29 60(1992)］。VCAM-1上のVLA-4結合部位は、６-Ig様ドメインVCAM-1イソ型の最も 外側のＮ末端（第１）Ig様部位［Taichmanら、Cell Regul.、２:347-355(1991) ；Vonderheideら、J．Exp．Med.、175:1433-1442(1992)；Osbornら、J．Exp．Me d. 、176:99-107(1992)］、および７-Ig様ドメインVCAM-1イソ型の第１および第 ４Ｎ末端Ig様部位［Vonderheideら、J．Exp．Med.、175:1433-1442(1992)；Osbo rnら、J．Exp．Med.、176:99-107(1992)］にマッピングされている。VLA-4イン テグリンによって認識されるVCAM-1中の２つの別個のIg様ドメイン内の分離した アミノ酸配列は、まだ定義されていない。 対照的に、フィブロネクチン(FN)内のVLA-4についての高親和性ペプチド認識 配列は同定されている[Waynerら、J．Cell．Biol.、109:1321-1330(1989)；Ferr eiraら、J．Exp．Med.、171:351-356(1990)；Guanら、Cell、60:53-61(1990)；M ouldら、J．Biol．Chem.、265:4020-4024(1990)；Garcia-Pardoら、J．Immunol. 、144:3361-3366(1990)；Komoriyaら、J．Biol．Chem.、266:15075-15079(1991) ]。この配列はCS-1と呼ばれる25アミノ酸残基ストレッチを含有する［Humphries ら、J．Cell Biol.、103:2637-2647(1986)；Humphriesら、J．Biol．Chem.、262 :6886-6892(1987)］。 FN遺伝子は、EIIIA、EIIIBおよびVまたはIIICSと呼ばれる３つの分離したエキ ソンを含有し、これらはオルタナティブスプライシングを受ける［Hynes、「フ ィブロネクチン」、Springer-Verlag、New York(1990)］。IIICS部位内のさらな るアクセプターおよびドナースプライスシグナルの存在が、複数のIIICSポリペ プチド変異体（例えば、ヒトFN中では５種）によるFN中での増大する多様性を生 じさせる［Vibe-Pedersenら、FEBS Lett.、207:287-291(1987)；Hershbergerら 、Mol．Cell．Biol.、10:662-671(1990)］)。結果的に、これらの分子変異体の サブセットの１種のみが、VLA-4によって認識される25アミノ酸CS-1配列を発現 する［Waynerら、J．Cell．Biol.、109:1321-1330(1989)；Guanら、Cell、60:53 -6 1(1990)］。 CS-1の特異的なVLA-4認識のための最小限の必要不可欠な配列は、トリペプチ ドLeu-Asp-Val(LDV)として同定されているが［Komoriyaら、J．Biol．Chem.、26 6 :15075-15079(1991)；Waynerら、J．Cell．Biol.、116:489-497(1992)；1991年 ３月21日に公開されたWayner WO 91/03252；1993年７月８日に公開された Wayne r WO 93/12809；および1992年８月20日に公開された Humphries WO 92/13887］ 、VLA-4は、天然のCS-1 25-merよりも、少なくとも２桁低い親和性でLDVと結合 する。Nowlinら、J．Biol．Chem.、268(1):20352-20359(1993)は近年、記載のシ スチン結合環式ペンタペプチドがフィブロネクチンのArg-Gly-AspおよびCS-1領 域の両者による結合を阻害することを記載した。 VLA-4は、β１インテグリンサブファミリーの他のメンバーと、哺乳動物細胞 への微生物病原体の結合および浸透を促進するする能力を共有する。従って、細 菌タンパク質インベーシン(invasin)とβ１インテグリンとの特異的な相互作用 ［Isbergら、Cell、60:861-871(1990)；Ennisら、J．Exp．Med.、177:207-212(1 993)］および原生動物Trypanosoma cruziとβ１インテグリンとの特異的な相互 作用［Fernandezら、Eur．J．Immunol.、23:552-557(1993)］が記載されている 。 多数のインビトロ研究は、VLA-4とその２つの公知のリガンド（VCAM-1およびC S-1 FN）との相互作用が、強い生物学的な重要性を有することを示唆する。例え ば、VCAM-1へのVLA-4の結合は、リンパ球による［Elicesら、Cell、60:577-584( 1990)：Riceら、J．Exp．Med.、171:1369-1374(1990)；Schwartzら、J．Clin．I nvest. 、85:2019-2022(1990)；Carlosら、Blood、76:965-970(1990)；Shimizuら 、J．Cell Biol.、113:1203-1212(1991)］、単球による［Calrosら、Blood、77: 2266-2271(1991)；Jonjicら、J．Immunol.、148:2080-2083(1992)］、ナチュラ ルキラー(NK)細胞による[Allavanaら、J．Exp．Med.、173:439-448(1991)]、お よび好酸球による［Walshら、J.Immunol.、146:3419-3423(1991)；Bochnerら、J ．Exp．Med. 、173:1553-1556(1992)；Dobrinaら、J．Clin．Invest.、88:20-26( 1991)；Wellerら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA、88:7430-7433(1991)］サイト カイン刺激血管内皮細胞への接着において示されている。白血球-内皮細胞付着 を仲介するその関与のため、VLA-4/VCAM-1相互作用は、炎症における鍵と考えら れている。 次に、VLA-4/CS-1相互作用は、VLA-4を発現する血液前駆細胞［Hemlerら、Imm unol．Rev. 、114:45-65(1990)；Williamsら、Nature、352:438-441(1991)；Rold anら、J．Exp．Med.、175:1739-1747(1992)；Sawadaら、J．Immunol.、149:3517 -3524(1992)；Wadsworthら、J．Immunol.、150:847-857(1993)］と、それらのEC M微環境との間の接着相互作用が、前駆細胞の成熟および分化において重要な役 割を担う造血において広く立証されている。従って、CS-1ペプチドは、(i)マウ ス造血幹細胞の、骨髄ストローマ由来のECMへの付着［Williamsら、Nature、352 :438-441(1991)］、(ii)骨髄由来のＢ細胞前駆細胞による免疫グロブリン分泌［ Roldanら、J．Exp．Med.、175:1739-1747(1992)］、(iii)ニワトリＢ細胞の嚢お よび後嚢の(postbursal)発達［Palojokiら、Eur．J．Immunol.、23:72-726(1993 )］、および(iv)胸腺ストローマ細胞単層により誘導される胸腺細胞の接着およ び分化［Utsumiら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA、88:5685-5689(1991)；Sawada ら、J．Immunol.、149:3517-3524(1992)］を阻害することが示されている。VLA- 4/CS-1はまた、胎児の発生に関与し得る。なぜなら、CS-1ペプチドは、ニワトリ 神経冠細胞の移動を妨げることが示されているからである［Dufourら、EMBO J. 、７:2661-2671(1988)］。 VCAM-1に加えてFNおよびCS-1は、慢性関節リウマチ(RA)の病理にも関係付けら れている［Laffonら、J．Clin．Invest.、88:546-552(1992)］。FNのCS-1スプラ イシング変異体の役割は、VLA-4発現白血球の内皮細胞単層を横切った、好酸球 のような炎症細胞の移動を仲介することにおいて確立している［Kuijpersら、j. Exp．Med. 、178:279-284(1993)］。 VLA-4が白血球走行および炎症における役割を担うことを示唆する大量の研究 は、種々の動物モデルにおいて、抗VLA-4抗体を用いるインビボ研究によって広 く確認されている。本質的に、皮膚、脳、腎臓、肺および腸は、ほとんど単核白 血球および好酸球の補充から生じる多種のVLA-4依存性炎症反応の標的である。 さらに詳細には、これらのインビボ研究は、以下のとおりである：マウスおよ びラットでの接触過敏症(CH)および遅延型過敏症(DTH)［Fergusonら、Proc．Nat l．Acad.Sci．USA 、88:8072-8076(1991)；Issekutz、Cell Immunol.、138:300-3 12(1991)；Issekutz、J．Immunol.、147:4178-4184(1991)；Elicesら、Clin．Ex p．Rheumatol. 、11:S77-80(1993)；Chisholmら、Eur．J．Immunol.、23:682-688 (1993)］；マウスおよびラットでの実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)［Yednockら 、Nature、356:63-66(1992)；Baronら、J．Exp．Med.、177:57-68(1993)］；ラ ットでの腎毒性腎炎［Mulliganら、J．Clin．Invest.、91:577-587(1993)］；モ ルモットでの受動皮膚アナフィラキシー［Wegら、J．Exp．Med.、177:561-566(1 993)］；ラットでの免疫複合体誘導性肺損傷［Mulliganら、J．Immunol.、150:2 401-2406(1993)；Mulliganら、J．Immunol.、150:2407-2417(1993)］、サルでの 自発性大腸炎［Poldlskyら、J．Clin．Invest.、92:372-380(1993)］およびヒツ ジでの喘息［Lobb、1993年７月22日に公開された WO 92/13798］。 従って、インビボ結果からの予備的な結論は、VLA-4が、ヒトの慢性症状に匹 敵する炎症応答へ寄与するということである。マウスの接触過敏症のインビボモ デルにおいては、CS-1ペプチドは、皮膚炎症部位へのＴリンパ球の補充を部分的 に阻害した［Fergusonら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA、88:8072-8076(1991)］ 。FNの細胞接着ドメイン由来のArg-Gly-Aspペプチドも、この動物モデルにおい て阻害的であるので、組織内の抗原チャレンジ部位への免疫Ｔ細胞の移動は、白 血球インテグリンとFNのようなECMタンパク質との相互作用によって促進され得 ると、著者らは結論した［Fergusonら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA、88:8072- 8076(1991)］。 さらに近年の研究では、Elicesおよび共同研究者［Elicesら、Clin．Exp．Rhe umatol. 、11:S77-80(1993)］は、天然CS-1ペプチドを用いた接触過敏症の阻害を 再現できなかった。代わりに、彼らはCS-1ペプチドがタンパク質分解によって血 液循環から急速に消失することを見いだした。 種々の慢性および急性免疫炎症性疾患状態におけるVLA-4およびCS-1ペプチド の役割が確立され、VLA-4-リンパ球相互作用を阻害する、大きくて製造に費用が かかり、そしてまた急速な分解を受ける、それ自体が繰り返し投与での免疫応答 を誘導する抗VLA-4抗体またはCS-1ペプチド以外の化合物が見つけられるかどう かが重要である。以下の開示は、CS-1自体よりもより強力な小さな分子を記載す る。本発明の簡単な要旨 本発明は、CS-1ペプチド模擬物インヒビターペプチド、それらの組成物、およ びそれらのインヒビターペプチドを使用する方法（プロセス）を意図する。 意図されるペプチドは、配列において式Ａに相当する。 X-B-Asp-Z Ａ ここで、 Ｂは側鎖が約２〜約５のメチレン基の長さを有するα-疎水性アミ ノ酸残基であり、好ましくはロイシンであり； ＸはＢのα-アミンの窒素原子にアミド結合する基であり、Ｘ基は０〜約２の メチレン基の長さを有するスペーサーを介してアミド結合のカルボニル炭素に結 合した環構造を有し、Ｘの長さ（スペーサーおよびカルボニル炭素を含む）は3- キノリンカルボニル基とおよそ同じ長さであるかそれよりも短く、環構造は５員 環および６員環または縮合した６,６員環または縮合した６,５員環であり； Ｚは以下の(a)および(b)からなる群から選択され； (a) Xaa-NCy1、ここでXaaはVal、Ile、Leuまたは芳香族アミノ酸残基（すな わち、１または２の縮合した芳香族環を含有する側鎖を有する残基）であり、そ してNCy1はXaaのα-カルボキシル基とアミド結合を形成する環上窒素原子を有す る環含有基(cyclic ring-containing group)であって、その環が上記環上窒素原 子を含めて５または６の原子を含有する環含有基である；および (b) NCy2、ここで窒素(N)は、環基のアミン置換基であって、この環基の窒素 原子が上記のAspのα-カルボキシル基とアミド結合を形成し、そしてこのアミン 置換基は６員環または７員環に、もしくは縮合した６,６員環ラクタム環系また は６,７員環ラクタム環系に結合しており、この環系においてこのアミン置換基 を有する環は飽和され、このラクタムのカルボニル基のα位にアミン置換基を含 有する。 好ましい意図されるペプチドは、配列において以下の式Ｉに相当する。 X-Leu-Asp-Z Ｉ ここで、ＸはLeu α-アミンの窒素原子にアミド結合した基であり、Ｘ基は０ 〜約２のメチレン基の長さを有するスペーサーを介してアミド結合のカルボニル 炭素に結合した環構造を有し、Ｘの長さ（スペーサーおよびカルボニル炭素を含 む）は、3-キノリンカルボニル基とおよそ同じてあるかそれよりも短く、環構造 は５員環および６員環または縮合した６,６員環または６,５員環であり； Ｚは以下の(a)および(b)からなる群から選択され； (a) Xaa-NCy1、ここでXaaはVal、Ile、Leuまたは芳香族アミノ酸残基（すな わち、１または２の縮合した芳香族環を含有する側鎖を有する残基）であり、そ してNCy1はXaaのα-カルボキシル基とアミド結合を形成する環上窒素原子を有す る環含有基であり、その環が上記環上窒素原子を含めて５または６の原子を有す る環含有基である；および (b) NCy2、ここで窒素(N)は環基のアミン置換基であって、この環基の窒素が 上記のAspのα-カルボキシル基とアミド結合を形成し、そしてこのアミン置換基 は６員環または７員環に、もしくは縮合した６,６員環ラクタム環系または６,７ 員環ラクタム環系に結合しており、この環系においてこのアミン置換基を有する 環は飽和され、このラクタムのカルボニル基のα位にアミン置換基を含有する。 式Ｉ、および後述の式IIおよびIIIのペプチドは水溶性であり、7.2〜7.4のpH 値の水性緩衝液中でのインビトロアッセイにおいて、配列番号３のペプチドによ って示される結合における阻害よりも約10倍〜約3000倍の程度に、Jurkat細胞(A TCC TIB 152)の、配列番号１の固相結合ペプチドへの結合を阻害する。 より好ましい実施態様においては、Ｘ基は式 Ar-Y-C(O)-を有し、ペプチドは 配列において、以下の式IIに相当する。 Ar-Y-C(O)-Leu-Asp-Xaa-NCy1 II ここで、Arはピラゾリル、フェニル、ピリジル、または3-キノリニル基であり ； Ｙは存在しない、もしくは-CH2-、-CH(NH)-、-O-または-NH-であるスペーサー であり； もしくはAr-Y-C(O)-は上記Leuの窒素原子と一緒に、フタルイミド、1,2,3,4- テトラヒドロキナゾリン-2,4-ジオン-3-イルまたは5-フェニルダントイン-3-イ ル基を形成し、そして Ar-Y-C(O)-は3-キノリンカルボニルとおよそ同じ長さまたはそれよりも短い長 さを有する。 Xaaは、芳香族アミノ酸残基（すなわち、芳香族側鎖を有するアミノ酸残基） である。 NCy1はアミンを含有する５員環または６員環基であって、その窒素(N)原子が 環内部にあって、前記のようにXaaのα-カルボキシルとアミド結合を形成する。 Ar-Y-C(O)-は、最も好ましくはフェニルアセチルであって、従って最も好まし い実施においては、意図されるペプチドは、配列において、以下の式IIIに相当 する。 N-フェニルアセチル-Leu-Asp-Phe-NCy3 III ここで、NCy3は、最も好ましいNCy1基であって、モルホリンアミド、チオモル ホリンアミド、4-(チアジオキソ)ピペリジンアミド、D-2-(カルボキシアミド(ca rboxamide))-ピロリジンアミド、ピペリジンアミドおよび置換基が4-ヒドロキシ 、4-カルバミルおよび4-カルボキシからなる群から選択される置換ピペリジンア ミド、ピペラジンアミド、置換基が4-N-カルボキシメチル、4-N-カルボキシアミ ドメチル(4-N-carboxamidomethyl)、4-N-(5-ヒドロキシエチレンオキシエチレン )およびピロリジンアミド基からなる群から選択される置換ピペラジンアミドか らなる群から選択される。 上記のインヒビターペプチドを含有する組成物もまた、意図される。そのよう な組成物は、薬学的に受容可能な希釈液であって、好ましくは水性である希釈液 中に溶解または分散したペプチドを含有する。このペプチドは、炎症減少量で組 成物中に存在する。その量はまた、本明細書中でときおりCS-1/VLA-4結合阻害量 と言われる。上記の、より好ましいまたは最も好ましいペプチトは、より好まし いまたは最も好ましい組成物中で利用される。 フィブロネクチン CS-1/VLA-4-仲介炎症を治療するプロセスもまた、意図され る。このプロセスは、炎症を有する、または炎症でなければ予防目的のためにそ のような治療の必要がある哺乳動物に、上記のインヒビターペプチドの炎症減少 量を投与する工程を包含する。より好ましいまたは最も好ましいインヒビターペ プチドの使用は、このプロセスにおいて、より好ましいまたは最も好ましい。 本明細書中で示される全てのペプチド式または配列は、左から右に、およびア ミノ末端からカルボキシ末端の方向に記載される。20個の天然アミノ酸の誘導体 および残基について、本明細書中で用いられる略号を以下の対応表に示す： 本発明はいくつかの利点と長所を有する。 １つの顕著な利点は、本明細書で意図されるインヒビターペプチドが、VLA-4/ CS-1結合相互作用の阻害においてCS-1そのものよりも強力であることである。 本発明の他の利点は、例示的なインヒビターペプチドが、宿主哺乳動物におけ る種々の例示的な免疫炎症疾患状態の減少に有効であることが示されていること である。 本発明の長所は、有害な毒性が、宿主実験哺乳動物における、600mg/kg/日ま でのインビボ濃度で観測されていないことである。 本発明の他の長所は、意図されるインヒビターペプチドが、高収率および高純 度で容易に調製される比較的小さい分子であることである。 本発明のさらなる利点および長所は、以下の開示から当業者にとって自明とな る。 図面の簡単な説明 本開示物の一部分を構成する図面において： 図１は、固相結合CS-Iペプチド（配列番号１）への、そのペプチド自身および CS-1ペプチド配列の部分を有するより短いペプチドによる、VLA-4を有するJurka t細胞のインビトロでの結合阻害を示すグラフである。データは、示された「標 準」（配列番号３）と比較したパーセントとして示される。ペプチドB12（配列 番号２）の「Ｎ末端」に欠失を有するペプチドのデータは、標準の左に示され、 そしてペプチドB12の「Ｃ末端」に欠失を有するペプチドのデータは、標準の右 に示される。ペプチド配列は、一文字表記である。 図２は、図１のデータと同様に得られそして表されたデータのグラフである。 ここで、さらに、いっそうより短い欠失ペプチドによる結合阻害が示されている 。 図３は、図１で述べたようにして得られた結合データの別のグラフである。こ のグラフは、logスケールの縦座標を利用している。これらのデータは、５つの グループに分類され、示された標準ペプチド（配列番号３）と比較して、再び示 され、ここで、D-プロリンを「ｐ」と示す。右側の最大級の２つのグループのデ ータは、１つの示されたペプチドに対する３つの異なるＸ基の効果および３つの Ｚ基（ここで、Ｘはフェニルアセチル（φAc）であり、Ｚはそれぞれ示されると おりである）の効果を示している。 図4Aおよび図4Bとして２つのパネルで示される図４は、ウサギの喘息を処置す る際の企図されるペプチドの効果を示す。図4Aは、誘発された喘息の発作開始直 後６時間にわたる動的コンプライアンス（Cdyn）のパーセント変化を示す。イン ヒビターペプチドのN-フェニルアセチル-Leu-Asp-Phe-モルホリンアミドを含む 霧状にされた組成物によって処理されたウサギのデータは、白丸として示され、 一方未処理のウサギのデータは、黒丸を用いて示される；両方の丸とも、エラー バーを含んでいる。縦座標は、最初の動的コンプライアンス値からのパーセント 変化の単位であり、一方横座標は、チャレンジ後の時間の単位である。 図4Bは、同じ研究からの肺抵抗性（LR）におけるパーセント変化について得ら れた結果を示し、データは図4Aのように示される。縦座標は、始めの肺の抵抗値 からのパーセント変化の単位であり、横座標は、時間である。 図５は、14匹のマウスの耳で測定された遅延型神経過敏性に対するインヒビタ ーペプチドN-フェニルアセチル-Leu-Asp-Phe-D-Pro-NH2の効果の研究結果を示す 。免疫化後、１グループの７匹のマウスが、取り付けたポンプによって与えられ た生理食塩水のみで、24時間にわたって処理され、そしてチャレンジされた。他 の免疫化グループの７匹のマウスが、同様にチャレンジされたが、それぞれは、 上記インヒビターペプチドを含む水性薬学的組成物で、同じく24時間処理され、 取り付けたポンプによってまた与えられた。縦座標は、チャレンジ部位の腫脹の 直 径のインチ単位である。 図６は、実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）の処置の２つの評価において、６ 匹のマウスそれぞれの平均化された臨床スコアを示すグラフである。黒丸は、イ ンヒビターペプチドN-フェニルアセチル-Leu-Asp-Phe-D-Pro-NH2を用いる処置に ついてであり、一方、黒い四角で示される点は、実施例６の寄せ集めた（scramb led）配列のペプチドを用いる処置についてである。縦座標は、各々の研究にお ける６匹のマウスについての平均スコアを示し、一方、横座標は、EAEの開始後 の日数である。 図７は、図4Bに記載されたように示された喘息のヒツジのモデルについての基 線からの肺抵抗性、SRLにおける変化のパーセントを示すグラフである。ここで 、N-フェニルアセチル-Leu-Asp-Phe-D-Pro-NH2を含んだ霧状にされた組成物は、 白丸で、そのペプチドの寄せ集めた配列（実施例６）は、黒丸で示されており、 適切な場所にエラーバーを含む。 発明の詳細な説明 本発明は、インヒビターペプチド、そのようなペプチドを含む組成物、および そのようなペプチドを使用するプロセスを意図する。意図したペプチドは、フィ ブロネクチンのCS-1ペプチドと炎症性細胞VLA-4の表面レセプターとの間の結合 を阻害し、それゆえ、時には、本明細書中ではインヒビターペプチドを意味する 。 Ａ．ペプチド 意図したペプチドを、全体のフィブロネクチン分子の模倣物、または少なくと もVLA-4レセプターに結合するフィブロネクチンの25残基（25-mer）CS-1部分（ 配列番号１）の模倣物として考えられ得る。次の議論から見られ得るように、意 図したペプチドは、フィブロネクチン中に存在するCS-1 25-merペプチドよりも いっそう強くVLA-4レセプターに結合する。 広くは、意図したインヒビターペプチドは、以下の式Ａに対応する構造を有す るように定義され得る。 X-B-Asp-Z A ここで、 Ｂは、α-疎水性アミノ酸残基であり、その側鎖は、約２〜約５のメチレン基 の長さを有する； Ｘは、Ｂのα-アミンの窒素原子にアミド結合した基である。Ｘ基は、０〜約 ２のメチレン基の長さを有するスペーサーによってアミド結合のカルボニル炭素 に結合している環構造を有している。スペーサーおよびカルボニル炭素を含むＸ の長さは、ほぼ、3-キノリンカルボニル基またはそれより小さい基の長さである 。この環構造は、５員環および６員環、あるいは縮合した6,6員環または6,5員環 である； Ｚは、以下からなる群から選択される： （ａ） Xaa-NCy1、ここで、Xaaは、Val、Ile、Leu、または芳香族アミノ酸残 基；すなわち、１つまたは２つの縮合芳香族環を含む側鎖を有する残基であり、 そしてNCy1は、Xaaのα-カルボキシル基とアミド結合を形成する環窒素原子を有 する環含有基であり、その環は、該環窒素原子を含む５原子または６原子を含有 する；および （ｂ） NCy2、ここで、示した窒素は、環状基のアミン置換基であり、その示 した窒素原子は、Aspのα-カルボキシル基とのアミド結合を形成し、そしてその アミン置換基は結合して、６員環または７員環となるか、あるいは縮合6,6また は6,7員ラクタム環系となる。このラクタム環系において、アミン置換基を有す る環は飽和であり、そしてラクタムのカルボニル基に対してαのアミン置換基を 含む。 式Ａのペプチドは、水溶性であり、7.2〜7.4のpH値の水性緩衝液中でのインビ トロアッセイで、Jurkat細胞（ATCC TIB 152）の配列番号１の固相結合ペプチド への結合を、配列番号３のペプチドによって示される結合阻害に等しいかまたは 約3000倍大きい程度まで阻害する。 式Ａのペプチドの配列は、CS-1（配列番号１）およびB12（配列番号３）フィ ブロネクチンペプチドに存在するAsp残基を必要とするようである。このAspのほ かに、その大きさおよび電荷の両方が、Gluとしての結合に必要とされるようで あり、他の残基はほとんど結合を阻害せず、大きさおよび相対的疎水性が、Ｂ残 基の選択に最も重要であるようである。他の残基の必要性は、本明細書中で後述 される。 Ｂ残基側鎖の長さは、約２〜約５のメチレンである。このような長さは、市販 の原子モデルまたはコンピュータープログラムの使用により、標準結合長、ファ ンデルワールス半径から容易に決定され得る。このような長さを用いると、シク ロヘキシルアラニンおよびフェニルアラニンの両方は、約５のメチレンの側鎖長 、すなわち、側鎖内に１つのメチレンそして４つの環炭素を有することがわかる 。メチル、チオ、および２つのメチレンを有するメチオニン側鎖はさらに短い。 アミノ酸として例示的なＢ残基は、ロイシン（Leu）、シクロヘキシルアラニ ン、ノルロイシン（Nle）、メチオニン（Met）、ホモセリン、スレオニン（Thr ）、フェニルアラニン（Phe）、バリン（Val）、ノルバリン（Nva）、およびイ ソロイシン（Ile）からなる群から選択される。Ｂは、最も好ましくはLeuである 。 好ましくは、意図したインヒビターペプチドは、以下の式Ｉに対応する構造を 有する。 X-Leu-Asp-Z Ｉ ここで、 Ｘは、Leuの窒素原子にアミド結合した基であり、０〜約２つのメチレン基の 長さを有するスペーサーによってアミド結合のカルボニル炭素に結合している環 構造を有する基である。スペーサーおよびカルボニル炭素を含むＸの長さは、ほ ぼ、3-キノリンカルボニル基またはそれより小さい基の長さである。環構造は、 ５員環および６員環、あるいは縮合6,6または6,5員環である；および Ｚは、以下からなる群から選択される： （ａ） Xaa-NCy1、ここで、Xaaは、Val、Ile、Leu、または１つまたは２つの 縮合した芳香族環を含む側鎖を有するアミノ酸残基であり、そしてNCy1は、Xaa のα-カルボキシル基とアミド結合を形成する環窒素原子を有する環含有基であ り、その環は、該環窒素原子を含む５つまたは６つの原子を含有する；および （ｂ） NCy2、ここで、示された窒素は、環状基のアミン置換基であり、その 示した窒素原子は、Asp残基のα-カルボキシル基とのアミド結合を形成し、その アミン置換基は結合して、６員環または７員環となるか、あるいは縮合6、6また は6、7員ラクタム環系となる。このラクタム環系において、アミン置換基を有す る環は飽和であり、そしてラクタムのカルボニル基に対してαのアミン置換基を 含む。 式Ｉ、および下記の式IIおよびIIIのペプチドは、水溶性であり、7.2〜7.4のp H値の水性緩衝液中におけるインビトロアッセイでの、Jurkat細胞の配列番号１ の固相結合ペプチドへの結合を、配列番号３のペプチドによって示される前記結 合阻害より約10〜約3000倍の程度まで阻害する。 式Ｉを検討すると、CS-1（配列番号１）およびB12（配列番号２）フィブロネ クチンペプチドの少なくともLeuおよびAspが存在することがわかる。この２つの 残基配列のほかに、意図したインヒビターペプチドおよびCS-1部分またはB12部 分の配列/構造は全く異なっている。 従って、CS-1および天然のタンパク質中のLeu残基のα-アミン基と結合したイ ソロイシン（Ile;I）ペプチド-（アミド-）が存在している一方で、環構造含有 基または部分（moiety）であるＸは、環構造含有基によって寄与されたカルボキ シルを介して、ＢまたはLeu残基のα-アミノ基（それぞれ、式ＡまたはＩ）の窒 素原子とアミド結合する。このアミド結合は、環構造含有基をLeu残基に結合す るカルボキシアミド[-C(O)NH-]、ウレタン[-O-C(O)NH-]または尿素[-NH-C(O)NH- ]含有スペーサー基の一部として存在し得る。 環構造は、広くは、飽和であるか、またはエチレン性不飽和を含む任意の５員 環または６員環であり得る。環構造は、窒素、酸素、または硫黄のような炭素以 外の１つまたはそれ以上の原子を含み得る。環構造はまた、２つの６員環が縮合 した（6,6）または６員環が５員環に縮合した（6,5員）縮合環系であり得る。環 構造の環は、好ましくは芳香族である。 例示的な環構造としては、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロピラニル、シ クロペンチル、シクロヘキシル、フェニル、ピリジル、ピリミジニル、ピラジニ ル、ピラゾリル、ピロリジル、フラニル、ピペリジニル、ナフチル、キノリニル 、デカリニル、キナゾリニル、イミダジル、チオフェニルなどが挙げられる。環 構造のうち、フェニルおよびピリジルは、特に好ましい。 環構造は、ＢまたはLeu残基に結合したアミドのカルボニル基[-C(O)-]に直接 結合し得る。この環はまた、カルボニル基から、約２つのメチレン（-CH2-）基 すなわちエチレン基（-CH2CH2-）の長さまでスペースを開けられ得る。 メチレン基のファンデルワールス半径（約2.0Å）は、オキシ基（-O-；約1.40 Å）またはイミノ基（-NH-；約1.50Å）のファンデルワールス半径よりわずかに 長い。メチレン、オキシおよびイミノの大きさの間には十分な類似性があるので 、-CH2-O-、-CH2-NH-、-NH-NH-、または-O-NH-を含むスペーサー基は、同様な長 さであり、そしてエチレン基-CH2-CH2-の長さ内にある。結合長（距離）を用い る場合でも、同様の結果を得る。意図したスペーサーは、-HC(CH3)-CH2-、-CH2- CH2-、-NH-O-、-HN-NH-、-CH2-O-、および-CH2-NH-を包含し、そして好ましくは 不飽和がない。 例示的な芳香族環構造としてフェニル環を用いると、意図したＸ基は、3-メチ ル-3-フェニルプロピオニル、3-フェニルプロピオニル、フェニルヒドロキシア ミノカルボニル[Ph-NH-O-C(O)-]、フェニルヒドラジドカルボニル[Ph-NH-NH-C(O )-]、ベンジルオキシカルボニル[Ph-CH2-O-C(O)-]、フェノキシアセチル[Ph-O-C H2-C(O)-]、ベンジルアミノカルボニル[Ph-CH2-NH-C(O)-]、およびアニリノアセ チル[Ph-NH-CH2-C(O)-]（ここで、「Ph」はフェニル基である）を包含すること がわかる。 従って、上記の環構造は、０のメチレン基（直接の結合）、１つまたは２つの メチレン基の長さを有するスペーサーによって、ＢまたはLeuに結合したアミド 基のカルボニル炭素に結合することが意図される。言い換えると、このスペーサ ーは、ほぼエチレン基またはそれより小さい基の長さを有する。 ＢまたはLeuのα-アミノ基の窒素に結合するフェニルアセチル、フェノキシカ ルボニルまたはアニリノカルボニル基は、約１つのメチレン基の長さを有するス ペーサーを含む。フェニル（ベンゾイル）、1-または2-ナフチル（1-または2-ナ フタレンカルボニル）、2-、3-または4-ピリジル（2-、3-または4-ピリジンカル ボニル）、2-または3-チオフェニル（2-または3-チエニル；2-または3-チオフェ ンカルボニル）および2-または3-フラニル（2-または3-フランカルボニル）環構 造は、アミドカルボニル炭素に直接結合し、それゆえ、０のメチレン基の長さを 有するスペーサーを利用するＸ基として定義される。約２つのメチレン基の長さ を有するスペーサーは、カルボベンジロキシ[Ph-CH2-O-C(O)-]、カルボベンジル アミノ[Ph-CH2-NH-C(O)-]、カルボフェノキシメチレン[Ph-O-CH2-C(O)-]などの 基であるＸ基によって提供される。 意図した５員環または６員環構造はまた、C1-C2アルキルまたはヒドロキシル 基で置換され得る。従って、例示としてフェニル環を用いる代表的な置換環構造 は、2-、3-または4-エチルフェニル、2,6-、3,4-または2,3-ジメチルフェニル、 2-、3-または4-ヒドロキシフェニル、2,6-、2,4-、3,4-および3,5-ジヒドロキシ フェニルなどを包含する。 Ｘ置換基の環構造は、いくつかの方法で意図したインヒビター内で作用し、イ ンヒビターペプチドをVLA-4レセプターの結合ポケットにフィットし、ＢまたはL euおよびAsp基を適切な立体配置内に配置させると考えられる。ペプチドをその レセプター内にフィットさせるこの推定上の役割のために、スペーサー基の長さ に関して上記に加えて、Ｘの環構造含有部分およびスペーサー部分にいくらかの 大きさの制約がある。従って、ＢまたはLeuに結合したアミドのカルボニル含有 炭素から、環構造の末端またはカルボニル基から最も遠いその置換基までの、Ｘ のスペーサーおよび環構造含有部分の全体の長さは、ほぼ3-キノリンカルボニル 基またはそれより小さい大きさである。 3-キノリンカルボニル基は最も長い意図した環構造含有Ｘ置換基であるので、 3-キノリンカルボニル基には、その長さに加える上述の置換基がない。 上述のように、所定のＸ置換基の長さは容易に決定され得る。例えば、模範的 な環構造含有Ｘ基を空間充填型のモデルを使用して構築し、次いで調製されたモ デルの相対的大きさを比較し得る。また、大きさの２次元描写を調製するために 、公開された結合長および結合角度も使用され得る。3-キノリノイルと長さを比 較するために、模範的なモデルＸ基を調製するのに用いられ得るコンピューター グラフィックプログラムもまた、周知であり、入手可能である。 スペーサー、環構造、カルボニル基、およびＢまたはLeuのαアミノ窒素原子 を含むＸ置換基はまた、芳香族環置換環状イミド基を共に形成し得る。例示的な このような環状イミド基には、フタルイミド（この基は好ましい）、2,3-および 3,4-ピリジンジカルボキシイミドのそれぞれ、ホモフタルイミドおよび1,2,3,4- テトラヒドロキナゾリン-2,4-ジオン-3-イル基（この基において、芳香族環およ び環状イミド基が、共に縮合している）がある。 別の例示的な化合物においては、Ｂまたはロイシンの窒素原子は、5-フェニル ヒダントイン-3-イル基の環内のイミド窒素原子であるので、芳香族フェニル環 が、環状スペーサーの置換基であり、そしてLeu残基と結合したカルボニル基か ら約１つのメチレンの間隔を開ける。同様に構築したイミド窒素含有Ｘ基は、Ｂ またはLeuの窒素原子上に形成される2-フェニルスクシンイミド基内に存在する 。 従って、上記のＸ基の環状イミド含有部分およびヒダントイン含有部分は、環 構造の立体配座の自由度を制限する特殊なスペーサー基として考えられ得る。従 って、例えば、フェニルアセチル基のカルボニル、メチレンおよびフェニル部分 は、それぞれ自由であり、１つまたはそれ以上のいくつかの立体配座が想定され るが、フタルイミドＸ基は、ロイシンの窒素-メチン結合の軸の周りしか回転し 得ない。 Ｘ置換基は上記のように置換され得る環構造を含まなければならないが、Ｘ置 換基がまた、環構造以外にさらなる置換基を含み得ることも注目される。さらな る置換基が存在するとき、Ｘは、好ましくは、環側鎖を有するアミノ酸残鎖であ り、それゆえ、１級または２級アミンを含む。ここで、Ｘは、好ましくは、プロ リル、フェニルアラニル、チロシニルまたはフェニルグリシル残鎖であり、その α-アミノ基の窒素原子は、さらなる置換基に結合される。 このさらなる置換基は、CS-1ポリペプチド配列のＮ末端に向かう残りの部分の １つのアミノ酸残基であり得る。この残りの部分は配列番号１のＮ-末端から19 位のイソロイシンで始まるポリペプチド配列を有する。１つの残基または18個の 別のアミノ酸残基置換基配列は、このさらなる置換基によって定義される。 Ｘのアミン基を介して結合した別の例示的なさらなる置換基は、ビオチンであ る。特定の例において、ε-アミノカプロン酸へのビオチン-アミド結合は、Ｘ基 としてのフェニルアラニン（Phe）のα-アミンへのアミド結合であった。得られ た化合物は、12原子の鎖を介してPheのＸ基にアミド結合したビオチン縮合環を 含んでいた。 環側鎖を有するＸ基のアミノ酸残基はまた、置換基に関して自由であり得るこ ともまた、理解されるべきである。このような残基のα-アミンの窒素原子はま た、ホルミル、アセチル、イソブチル、またはヘキサノイル基のようなC1-C6ア シル基を用いてアシル化され得る。α-アミン基の窒素に結合するC1-C6アシル基 は、その窒素原子でアミド結合を形成し、非置換の遊離のα-アミンによって提 供される正電荷に比較すると、7.2〜7.4のpH値では、ペプチドにイオン電荷を提 供しない。 上記の式のＺ基は、２つの型の群の１つであり得る。１つの実施態様（Ａ）に おけるＺ基は、疎水性アミノ酸残基Xaaであり、このXaaは、Aspカルボキシルと ペプチド結合し、そして環窒素原子（NCy1のＮ）を有する環含有基NCy1に結合し 、この環窒素原子は、Xaaのα-カルボキシル基とアミド結合を形成している。NC y1の環は、５個または６個の原子を含み、示した窒素原子（NCy1のＮ）を含む。 意図した疎水性アミノ酸残基は、バリン、ロイシンおよびイソロイシンのような 脂肪族側鎖を有するアミノ酸残基である。Xaaは、より好ましくは、疎水性芳香 族アミノ酸を含む；すなわち、Xaaは、１つまたは２つの縮合した芳香族環を含 む芳香族側鎖を有するアミノ酸残基である。代表的なこのような芳香族アミノ酸 は、天然に生じる（遺伝的にコードされた）フェニルアラニン、チロシンおよび トリプトファン、ならびにフェニルグリシン、ホモフェニルアラニン、p-ニトロ フェニルアラニン、チオフェニルグリシン（チエニルグリシン）などである。 代表的なNCy1基としては、それぞれのアミドとして、モルホリニル、チオモル ホニリル、チオモルホリニルスルホン[4-(チアジオキソ)ピペリジニル]、ピペリ ジニル、ピペラジニル、ピロリジニル、ピラゾリル、ピラゾリニル、オキサゾリ ジニルなどが挙げられる。NCy1環状環はまた、カルボキシル、カルボキシアミド 、C1-C4アルキレンカルボキシルC1-C4アルキレンカルボキシアミド、ヒドロキシ 、ヒドロキシメチル、(CH2CH2O)nH（ここで、ｎは１、２または３である）、お よびC1-C4アルキルからなる群から選択される１つまたは２つの置換基で置換さ れ得る。ピロリジンの２位でのカルボキシ置換は、アミノ酸プロリンを提供し、 そのＤおよびＬ形の両方ともが本明細書中で意図される。D-プロリル（時には太 字で、下の場合、一文字アミノ酸表記を「ｐ」またはD-Proとして示される）は 、モルホリニル、ピペリジル、ピペラジニルおよび4-ヒドロキシピペリジルと同 様に、そのアミド誘導体(D-Pro-NH2)として特に好ましい。 代表的なC1-C4アルキル基としては、メチル、エチル、イソプロピル、n-ブチ ルおよびt-ブチルが挙げられる。C1-C4アルキル基はまた、ピペラジンのようなN Cy1の第２の窒素原子で４級アンモニウム基を形成し得る。C1-C4アルキル基がメ チル基であり、そしてヨウ化物がアニオンである場合、代表的なNCy1基は、4,4- N,N-ジメチルピペラジニウムヨウ化物である。 代表的なC1-C4アルキレンカルボキシル基およびC1-C4アルキレンカルボキシア ミド基としては、メチレンカルボキシル（-CH2CO2H；カルボキシメチル）および メチレンカルボキシアミド（-CH2CONH2；カルボキシアミドメチル）、エチレン カルボキシル（-CH2CH2CO2H；カルボキシエチル）およびエチレンカルボキシア ミド（-CH2CH2CONH2；カルボキシアミドエチル）、ならびにブチレンカルボキシ ル（-C4H8COH；カルボキシブチル）およびブチレンカルボキシアミド（-C4H8CON H2；カルボキシアミドブチル）が挙げられる。ｎが１、２または３である(CH2CH2 O)nHの代表的な基として、2-ヒドロキシエチル（n＝1）、5-ヒドロキシエチレ ンオキシエチレン（エチレンオキシエタノール；5-ヒドロキシ-3-オキサペンチ ル；ｎ＝2）および8-ヒドロキシ-3,5-ジオキサ-オクチル（n＝3）が挙げられる 。 NCy1がピペラジル基を包含するとき、第２（４位）の窒素原子は、アルキル化 によって４級化され得るだけでなく、アミド化もされ得る。ピペラジニル-4-N- アミドの代表的なアシル部分は、ホルミル、アセチル、プロピオニル、イソブタ ノイル、ヘキサノイルおよびベンゾイルのようなC1-C7アシル基を包含し、それ だけでなく、フェニルスルホンアミド、トルエンスルホンアミド（トシル）、メ タンスルホンアミド（メシル）およびトリフルオロメチルスルホンアミド（トリ フィル）のようなスルホンアミドも包含する。 従って、ＺがXaa-NCy1である場合のこれらの実施態様において、Xaaは、明記 したアミノ酸残基であり、そのアミン基は、示したAsp残基のα-カルボキシルと アミド（ペプチド）結合を形成し、そしてそのカルボキシル基は、NCy1の５員環 または６員環内に存在する窒素原子とアミド結合を形成する。 別の実施例（Ｂ）において、ＺはNCy2であり、示した窒素原子(NCy2のＮ)は、 環状基（Cy2）のアミン置換基であり、その置換基の窒素原子は、示したAsp残基 のα-カルボキシルとアミド結合を形成する。このアミン置換基は、環状基に結 合し、この環状基は、（i）６員環または７員環であり、あるいは（ii）縮合6,6 または6,7員ラクタム環系であり、このラクタム環系において、アミン置換基を 有する環は飽和であり（エチレン不飽和がない）、そしてラクタムのカルボキシ ル基に対してαのアミン置換基を含む。 ここで、環系をペプチドの残り部分と結合する窒素原子は、NCy1におけるよう な環原子であるよりむしろ、環構造の置換基である。さらに、この窒素が置換基 であり得る環は、２つの型、６または７員環あるいは6,6または6,7員環縮合系を 有し、その環の１つはラクタムである。どちらの場合でも、この実施例において 、Xaaアミノ酸残基はない。 この型の代表的なアミン置換基含有６および７員環NCy2基としては、ベンジル アミン基、フェネチルアミン基、2-(N-モルホリニル)-エチルアミン基、N-[1-( カルボキシアミドメチル)-カプロラクタム-3-イル]アミン基、N-(カプロラクタ ム-3-イル)アミン基、およびN-(バレロラクタム-3-イル)アミン基が挙げられ、 これらの基は、Aspのα-カルボキシルと、対応するアミドを形成する。代表的な アミノ置換6,6および6,7縮合環ラクタム含有NCy2基としては、N-[1-(2-N-モルホ リニルエチル)-2-オキソ-テトラヒドロキノリン-3-イル]アミン基、N-(2-オキソ -テトラヒドロキノリン-3-イル)アミン基および表１の脚注７に示された6,7-縮 合環三環式化合物の基が挙げられ、これらの基は、Aspのα-カルボキシルと、対 応するアミドを形成する。 （i）本明細書中で示された式のＸ基が、カルボニルから約１つのメチレン基 の距離に近接またはその距離以内に位置する芳香族環含有部分によって占められ 、（ii）Ｚが芳香族アミノ酸であり、そして（iii）上記のように、NCy1がL-ま たはD-プロリンアミドあるいは５員または６員の窒素含有環であるならば、実質 的に、任意の他の置換基が、得られるペプチドが水溶性である限り、意図したペ プチドの阻害活性をなくさずに、どちらかのペプチド末端に結合して存在し得る ことが、一般に見出されている。 従って、例えば、配列Leu-Asp-Phe-Proに結合するN-末端フェニルアセチル基 を有する配列番号５のペプチドは、Pro残基とアミド結合した置換テトラエチレ ンジアミン基をさらに含み得、その中では、４つのフェニルアセチル-Leu-Asp-P he-Pro基がテトラエチレンジアミン窒素とアミド結合しており、そしてそれでも 配列番号３の標準10-merペプチドより約210倍良かったVLA-4結合阻害を示し得る 。 同様に、ペプチドPheLeuAspPhe-D-Pro-NH2は、そのN-末端に、N-末端Pheの窒 素原子に結合したユウロピウム含有キレートを含んでいた。このペプチドは、配 列番号３のペプチドの結合阻害よりも約120倍良い結合阻害を示した。 配列番号12のペプチド、フェニルアセチル-Leu-Asp-Phe-Pro-NH(CH2)5C(O)NHC18 H37は、良いインヒビターであると予想される。しかし、このペプチドは、水 溶性ではなく、溶液よりもむしろ濁った分散液を形成する。このペプチドは、配 列番号３の標準10-merペプチドによって示される結合阻害に類似の結合阻害を示 す。 当業者は、通常、本明細書中以下に示されるように、一旦十分なデータが手に 入ると、予想されたペプチドの所望の能力に関して正確な予想をするが、本明細 書中で意図した結合現象のような構造-機能関係を含む結合現象は、完全には理 解されない。実際、上記の式によって定義された実質的にすべての化合物は、CS -1ペプチドとVLA-4レセプターとの間の結合を阻害する。それにもかかわらず、 式ＩのLeuおよびAspに直接結合した置換基は、広く変化し得、そしてVLA-4への 結合阻害に影響し得るので、好ましい意図したインヒビターペプチドは、標準で 公知の10-merペプチドインヒビターと比較して、その構造によってだけでなく、 標準のインビトロでのアッセイにおけるインヒビターとしてその能力によっても 定義され、公知の10-merインヒビターより約１またはそれ以上のオーダーの大き さで結合を阻害するこれらのインヒビターペプチドのみを含む。 従って、意図したインヒビターペプチドは、pH7.2〜7.4の水性緩衝液中、VLA- 4レセプターを含む炎症性細胞[Jurkat細胞(American Type Culture Collection 、Rockville、MD 20852、ATCC TIB 152)]の、固相結合CS-1ペプチド（配列番号 １）への結合を、配列番号３の当該分野標準10-merペプチド[１文字表記でGPEIL DVPST]によって示される結合より約10倍〜約1000倍、そしてより好ましくは3000 倍良い程度まで阻害する。より好ましくは、この結合は、約50倍〜約3000倍阻害 され、そして、最も好ましくは、約100倍〜約3000倍阻害される。 結合阻害は、ここでは、標準数のJurkat細胞とマイクロタイタープレートウェ ルの表面に結合した標準量のCS-1ペプチドとの間の結合の1/2を阻害するペプチ ドの濃度として測定される。これらの濃度は、便宜的にIC50値として表され、よ り小さな数は、結合を50％阻害するのに必要なより低い濃度であり、それゆえ、 より大きな能力を示す。このアッセイのさらなる詳細は、本明細書中、以下に提 供される。 要約すると、式ＡまたはＩのペプチドは、フィブロネクチンのCS-1ペプチド領 域とVLA-4レセプターとの間の結合を阻害する。しかし、配列番号３のペプチド より少なくとも10倍良いインヒビターであるインヒビターは、ここでは好ましい 。 なおより好ましいものは、以下の、分子式IIのペプチドである。 Ar-Y-C(O)-Leu-Asp-Xaa-NCy1 II ここで、Arは、ピラゾリル、フェニル、ピリジル（2-、3-、または4-）、また は3-キノリニル基である； Ｙは、存在しないか、-CH2-、-CH(NH)-、-O-、または-NH-であるスペーサーで ある； あるいは、Ar-Y-C(O)は、Leuの窒素原子と共に、フタルイミド、1,2,3,4-テト ラヒドロキナゾリン-2,4-ジオン-3-イルまたは5-フェニルヒダントイン-3-イル 基を形成し、 Ar-Y-C(O)-は、約3-キノリンカルボニルまたはそれより短い長さを有する； Xaaは、芳香族アミノ酸残基；すなわち、フェニルアラニン、チロシン、トリ プトファン、ホモフェニルアラニン、ニトロフェニルアラニン、チエニルグリシ ンおよびフェニルグリシンのような芳香族側鎖を有するアミノ酸残基である；お よび NCy1は、上記のように、アミン含有5-または6-員環基であり、その示した窒素 原子、NCy1のＮは、環内にあり、そしてXaaのα-カルボニルとアミド結合を形成 する。 これまで試験された式IIの水溶性化合物は、配列番号３のペプチドによって示 された結合阻害より少なくとも10倍良い結合活性を示し、従って、このアッセイ は、好ましいインヒビターペプチドのすべてに適用されるが、インビトロでのア ッセイは、それらの完全な定義に必要ではない。 上記の組み合わせの中て、Ar-Y-C(O)である式Ｉのより好ましいＸ基は、好ま しくは、ベンゾイル、フェニルアセチル、4-ピリジンカルボニル（イソニコチノ イル）、3-ピリジンカルボニル（ニコチノイル）、3-ピリジンアセチル、アニリ ノカルボニル、3-キノリノイル、ピラゾールカルボニル、トリプトフィルおよび 3,4-ジヒドロキシベンゾイルであり、そしてフェニルアセチル（ベンジルカルボ ニル）が、最も好ましく、あるいはAr-Y-C(O)は、ロイシン窒素原子と共にフタ ルイミド基を形成する。Xaaは、好ましくは、Phe、TyrまたはTrpであり、Pheが 最も好ましい。NCy1は、好ましくは、モルホリニルのアミド、ピペリジニルまた は置換ピペリジニルであり、ここで、置換基は、ヒドロキシル基、カルボキシル 基、カルボキシアミド基、ピペラジニルまたは4-置換ピペラジニルからなる群か ら選択され、この中で、4-置換基は、C1-C4アルキル、C1-C4アルキレンカルボキ シル、C1-C4アルキレンカルボキシアミド、ｎが１、２または３である(CH2CH2O)n H、チオモルホリニル、L-またはD-プロリニルアミド、ピロリジニル、3,4-ジヒ ドロキシピロリジニル、2-(ヒドロキシメチル)ピロリジニルおよび4-(チアジオ キソ)ピペリジニル基からなる群から選択され、モルホリニルのアミド、D-プロ リニルアミド、ピペリジニル、上記の置換ピペリジニル、ピペラジニル、上記の 置換ピペラジニルおよびピロリジニル基が最も好ましい。 最も好ましいペプチドは、配列において、以下の、式IIIのペプチドに対応す る。 フェニルアセチル-Leu-Asp-Phe-NCy3 III ここで、NCy3は、最も好ましいNCy1基の基であり、モルホリンアミド、チオモ ルホリノ、4-(チアジオキソ)ピペリジンアミド、D-2-(カルボキシアミド)ピロリ ジンアミド、ピペラジンアミド、置換ピペラジンアミドからなる群から選択され 、ここで、置換基は、4-N-カルボキシメチル、4-N-カルボキシアミドメチル、4- N-(5-ヒドロキシエチレンオキシエチレン)および4-N-p-トルエンスルホンアミド 、ピロリジンアミド、ピペリジンアミドおよび置換されたピペリジンアミドから なる群から選択され、ここで、置換基は、4-ヒドロキシ、4-カルバミル、4-カル ボキシル基からなる群から選択される。 代表的なインヒビターペプチドを、配列番号３の標準ペプチドと比較した結合 阻害能とともに以下の表１に示す。 表１のデータを、未作成または他のインヒビターペプチドについての結合阻害 能を予測するために使用し得る。このように、表１の構造物を検討し、そして観 察した相対的な阻害能を用いて、個々の残基または末端基の相対的な寄与度を計 算し得る。そのような計算をもって、次いで約５〜10のファクター(factor)内で 他の意図されるペプチドの能力を予想し得る。 例えば、N-フェニルアセチル-Leu-Asp-Val-D-Pro-NH2およびN-フェニルアセチ ル-Leu-Asp-Phe-D-Pro-NH2によって示されるる阻害を比較すると、PheによるVal の置換が、約３のファクターの阻害の増強を与えることが分かる。その他の類似 のピリジン-3-カルボニル誘導体間の差異も同様に約３であった。 それゆえ、直ぐ上に記載の２つのペプチドのN-ベンゾイル誘導体は、その能力 の差異が同様に約３のファクターであることを予測し得た。表１のデータは、観 察した差異は約3.8のファクターであることを示し、予測を裏付ける。 この有用なしかし簡便化した手順をさらに用いて、ペプチド、N-フェニルアセ チル-Leu-Asp-Phe-D-Pro-NH2およびN-フェニルアセチル-Leu-Asp-Phe-ピペリジ ンアミドから、D-Pro-NH2はピペリジンアミドより約1.3倍強い活性を与えること を計算し得る。後者のペプチドの活性をモルホリンアミド基を有するペプチドの 活性に比較すると、ピペリジンアミド基に比較して、モルホリンアミドについて は約3.6倍の増強が計算される。ペプチド、N-フェニルアセチル-Leu-Asp-Tyr-モ ルホリンアミドおよびN-フェニルアセチル-Leu-Asp-Tyr-D-Pro-NH2を比較すると 、モルホリンアミドのD-Pro-NH2に対する約2.05倍の活性の増強が見出される。 これらの２つの計算を用いて、次いでモルホリンアミド基がピペリジンアミド基 の約7.4倍の増強を与えることを計算し得る(2.05Ｘ3.6)。この予想した増強は、 最初の２つのペプチドで見い出した増強より約5.7倍強い(7.4/1.3)が、前述の予 測可能性の範囲内である。 表１のデータはまた、当該分野の他のペプチドと比較して、本明細書の意図さ れるインヒビターペプチドによって示される予期されなかった結合阻害の増強を 例示している。例えば、WO 93/12809でVLA-4レセプターの結合に必要な最小のペ プチドであるとして記載されるLeu-Asp-Val(LDV)ペプチドは、配列番号３のペプ チドに比較してN-アセチルC-アミド誘導体として約１、N-遊離アミンC-アミド として０の相対的な阻害結合活性を示した。同様の結果を、この出願公開では開 示されていないが本明細書では重要な中核のペプチドであるLeu-Asp-Phe(LDF)で 観察した。反対に、本明細書で定義したＸおよびＺ基をいすれかのペプチドの末 端に添加するとき、約１〜約３桁の結合阻害の増強を観察した。 図１、２および３のデータはまた、他の当該分野のペプチドに比較して予期さ れなかった意図されるペプチドによって示される結合阻害を例示する。ペプチド 配列を１文字コードを用いて表した。 例えば、図１は、相対的なインビトロでの結合阻害研究の結果を例示する。こ の研究は、CS-1(配列番号１)ペプチド、CS-1ペプチドのB12部分(CS-1 B12；配列 番号２)、上記、本明細書中の別の箇所で、および当該分野で標準として使用さ れる10-merペプチド(配列番号３)、およびそれぞれLeu-Asp配列を含有するいく つかのB12ペプチドの欠失アナログを使用して行った。Ｎ末端欠失アナログを標 準10-merの左に示し、一方Ｃ末端欠失を10-merの右に示した。見てのとおり、CS -1ペプチドはB12、10-merまたは10-merの９-mer欠失アナログよりも約３倍の強 力なインヒビターである。後者の３つのペプチドは、すべて他のB12関連ペプチ ドより強力であった。 同様に得た図２のデータは、標準10-merペプチドの欠失アナログを用いて得た 結合阻害結果を例示する。ここで、Ｎ末端およびＣ末端の両方で行った欠失を、 Ｃ末端でのLeu-Asp-Val配列を単離する(isolate)ために標準10-merの左に示し、 一方標準10-merの右に示した欠失は、Asp-Val-Pro配列を単離する。これらのペ プチドおよび図１のペプチドは遊離Ｎ末端アミン基およびＣ末端カルボキシル基 を有した。 図３のデータを同様にして得たが、すべてのデータを調和させるためにログス ケール上で表示した。図３のデータを左から右に５つのグループで示す。 第１のグループはCS-1ペプチドおよび10-mer標準についてのデータを示す。次 の３つの棒は、天然のCS-1ペプチドのLeu-Asp-Valを含有するする配列を有する ペンタマーＣ-アミド、天然のL-プロリンの代わりのD-プロリンの使用による増 強した効果、次いでバリンおよびD-プロリンの代わりにフェニルアラニンおよび D-プロリンを使用することによる増強についてのデータを示す。次の２つの棒は 、 環含有Ｘ基(ここで遊離アミンとしてはフェニルアラニン)が天然配列のイソロイ シンを置換するために使用されたときに得られる３つの以前のペプチドに関して 得られるさらなる増強を例示する。棒の４番目のグループは、フェニルアラニン 基と比較した式Ｉの３つのＸ基の効果を例示する。これには２つの隣接する配列 のうちのより良いペプチド配列を使用した[XLDFp-NH2]。フェニルアセチル(φAc )を最後の３つのペプチド中のＸ基として使用し、ここでは、式ＩのD-プロリン Ｚ基を３つの環状アミン(NCy1)を用いて変化させた。見てのとおり、式ＩのＸと してのフェニルアセチルおよびＸaaとしてのフェニルアラニンとともにＺとして のモルホリンアミド基を使用することは、これらの研究中で最高の能力を与えた 。 従って、図３のデータは、標準10-merペプチドおよび当該分野のペプチドから 、標準に対し約10倍の能力増強を示す意図されるペプチド、約50〜約100倍の能 力増強を示す意図されるペプチドおよび約1000倍までの能力増強を示す意図され るペプチドまでの約３桁にわたる阻害能力を示す。 CS-1または標準10-merペプチドよりも強力であることに加え、意図されるイン ヒビターペプチド、特にN-フェニルアセチルおよびC-モルホリンアミドまたはD- Pro-NH2のような非天然末端基を有するペプチドは、血清中でCS-1ペプチドに比 較して安定である。従って、インヒビターペプチド、N-フェニルアセチル-Leu-A sp-Phe-モルホリンアミドおよびN-フェニルアセチル-Leu-Asp-Phe-D-Pro-NH2は 、10%マウスまたはヒト血清をも含有する7.2〜7.4でのPBS中で24時間後なんらの 能力の低下も示さなかった。反対に、CS-1ペプチドは、同様の条件下で１時間未 満にその能力を失った。 Ｂ.合成 意図されるインヒビターはペプチドまたはペプチド誘導体であり、周知の合成 方法を用いて容易に合成し得る。特定の合成例を以下に提供する。 固相合成をＣ末端アミノ酸アミドまたは遊離酸残基を有する物質に対して使用 した。従って、Ｎ保護したＣ末端残基を、ベンズヒドリルアミン置換基を有する 固体支持体に結合させた。他の固体支持体ではt-Boc、CBZまたは他の保護基も使 用されるが、これらの合成ではFmocアミン保護基を使用した。ピペリジンを用い たFmoc基の脱保護では、他の残基を結合させた。この結合の後、さらに脱保護、 結合、脱保護などの工程を、所望の配列の固相に結合したペプチドが調製される まで続けた。それぞれのペプチドに適切なように、Ｎ末端Ｘ基を、最終Ｎ脱保護 の工程の後に付加し、またはときにはＮ末端残基にあらかじめ結合させた。所望 のペプチドおよび任意の付随する官能基保護基を、トリフルオロ酢酸(TFA)を用 いた反応により固体支持体から除去した。ベンズヒドリルアミン固体支持体を使 用したとき、この手順はＣ末端アミドペプチドを生成した。 意図されるペプチドをまた、t-Boc Ｎ保護基および他の固体支持体、またはp- ヒドロキシメチルフェニルカルボキシル(PAM)基が支持体のアミンとまず反応し てカルボキシアミドを形成するベンジルアミノ置換固体支持体を用いて調製し得 る。次いで、ヒドロキシル基を用いて第１のペプチドにエステル結合を形成し、 その後t-Boc合成技術を続ける。完了した脱保護された固相結合ペプチドとアン モニアの反応は上記のＣ末端アミドペプチドを生じ、一方モルホリンあるいはピ ペリジンあるいは他のNCy1またはNCy2アミンのような他のアミンとの反応は、Ｃ 末端残基がNCy1またはNCy2基にアミド結合したペプチドを生じる。脱保護された 、PAM結合ペプチドと水酸化物の反応は対応するＣ末端カルボキシル基を生じる 。 他の実施態様において、液相ペプチド合成を利用した。例えば、モルホリンま たは他のNCy1またはNCy2基を、カルボジイミドを使用して溶液中で意図されたＣ 末端のt-Boc保護残基に結合させた。t-Boc保護基を酸で除去し、さらにt-Boc保 護残基を付加し、脱保護およびさらなる付加を続けた。フェニル酢酸のようなＮ 末端Ｘ基を最後のt-Bｏc除去工程の後に加え、Asp残基の脱保護を除き合成を完 了した。ベンジルエステル保護基を使用した場合は、この工程を触媒水素化によ り行った。 使用する合成方法にかかわらず、代表的にはインヒビターペプチドを使用前に 回収し精製する。回収および精製技術は周知であり、本明細書には加えない。 Ｃ．組成物およびプロセス 他所で記載されるように、免疫系白血球エフェクターまたは単球、Ｔ細胞およ び好酸球のような炎症細胞は、VLA-4レセプターをその細胞表面に有する。これ らの細胞は、組織の血液からの炎症細胞の遊出(走行)の初期段階で血管内皮細胞 の表面に存在するフィブロネクチンのCS-1部分に、結合する。これらの炎症細胞 はWaynerら、J.Cell.Biol.、109:1321-1330(1989)、Wayner WO 98/12809、Hemle rら、J.Biol.Chem.、262(24):11478-11485(1987)に記載のモノクローナル抗体P4 C2、および1993年7月22日に公開されたLobb WO 93/13798に記載のモノクローナ ル抗体HP1/2と免疫反応する。 組織において、炎症細胞は１つまたはより多くのいくつかの機構を通じて炎症 反応を増強する。１つの機構において、サイトカインおよび化学誘引物質反応物 (chemoattractant reactant)(例えばインターロイキン-1β(IL-1β)、IL-2、腫 瘍壊死因子α(TNFα)およびリンパ球由来走化性因子)が炎症細胞により放出され 、さらなる炎症細胞の領域への遊出を引き起こす。別の機構において、炎症細胞 は、炎症疾患状態の哺乳動物細胞を非自己であると誤認識し、これらの細胞を攻 撃し、死滅させる。免疫炎症反応増強のこれらおよび他の機構は当業者に周知で あり、本明細書中でさらに詳しく記載する必要がない。フェブロネクチンCS-1ペ プチドは従って、血液から組織への炎症増強エフェクター細胞の遊出を補助する ことにより炎症疾患状態を仲介する。 意図されたインヒビターペプチドは、CS-1とVLA-4との結合を阻止し、結果と して生じるVLA-4レセプターを有する炎症細胞の組織への遊出および結果として 生じる炎症症状の悪化を阻害する。炎症細胞の遊出の阻害は、これらの炎症細胞 により引き起こされるフィブロネクチンCS-1/VLA-4仲介炎症応答の減少を生じさ せ、それにより観察される炎症を減少させる。 CS-1およびVAL-4により仲介され、意図されるインヒビターペプチドがその炎 症を減少させ得る特定の炎症疾患状態は非常に多様である。炎症のそれらのタイ プの例示は、喘息、慢性関節リウマチおよび変形性関節炎症状態のような関節炎 症状態、移植片拒絶、種々のタイプの皮膚炎、および中枢神経系脱随疾患である 。 CS-1の発現が関連していることが分かっており、病理学的状態の非存在で（す なわち、正常組織で)そのような発現が観察されない特定の病理学的炎症状態は 、以下を包含する：ヒトならびにSIVに感染したサルの消化管および炎症腸疾患 を有するサルの腸、肺喘息および心臓移植を有するウサギ、マウスの実験的自己 免疫性脳脊髄炎(EAE)の脳および遅延型過敏症(DTH)の皮膚、および誘導性関節炎 を有するラットにおける、慢性関節リウマチ(滑膜)、変形性関節症(滑膜)、肺喘 息 およびリンパ節高内皮性静脈(HEV)。 薬学的に許容可能なキャリアーまたは希釈剤(好ましくは水性である)に溶解ま たは分散した意図されたインヒビターペプチドを含有する薬学的組成物はまた、 上記のようなCS-1/VLA-4仲介炎症疾患症状の処置での使用が意図されている。こ のような組成物は、CS-1/VLA-4結合阻害(炎症減少)量の上記の意図されたインヒ ビターペプチドを含有する。 従って、本発明はまた、１つまたはそれ以上の上記の症状の処置で使用され得 る薬学的組成物を意図している。意図された薬学的組成物は、VLA-4含有白血球 と内皮細胞表面に発現されるフィブロネクチンペプチドのCS-1部分との結合相互 作用を阻害する上記インヒビターペプチドを含有し、ペプチドは、結合阻害(炎 症減少)量で薬学的に許容可能な希釈剤中に溶解または分散する。意図される薬 学的組成物は、種々の薬剤送達システムでの使用に適している。薬剤送達の現在 の方法の簡単な概説についてはLanger、Science、249:1527-1533(1990)を参照さ れたい。 意図された薬学的組成物について、ペプチドの用量は、例えば特定のペプチド 、投与様式、処置される特定の疾患およびその重度、患者の全体的な健康度およ び状態、および規定する医師または獣医の判断に従って変わる。薬学的組成物は 、予防および/または治療処置のための非経口、局部、経口または局所投与(例え ばエアロゾルまたは経皮)のために意図されている。薬学的組成物は投与方法に 依存して種々の単位投薬形態で投与され得る。例えば、経口投与に適する単位投 薬形態は、粉剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、および糖剤を包含する。 好ましくは、薬学的組成物は、静脈内に投与される。従って、薬学的に許容可 能な希釈剤(キャリアー)、好ましくは水性キャリアー中に溶解または分散した意 図されたインヒビターペプチドの溶液を含有する静脈内投与のための組成物が、 特に意図される。種々の水性キャリアーが使用され得る。このようなキャリアー としては、例えば、水、緩衝水、0.9%生理食塩水、緩衝化エタノール水溶液など が挙げられる。これらの組成物は従来の周知の減菌法により減菌され得るか、ま たは減菌濾過され得る。得られる水溶液は使用するためにそのままパッケージさ れ得るか、または凍結乾燥され得る。凍結乾燥調製物は投与の前に減菌水溶液と 混ぜ合わせられる。組成物は、生理的条件に近づけるために、必要に応じて薬学 的に許容可能な補助物質を含有し得る。この補助物質としては、例えば、pH調整 剤および緩衝剤、張度調整剤、加湿剤などであり、例えば酢酸ナトリウム、乳酸 ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、ソルビタンモノ ラウレート、トリエタノールアミンオレエートなどである。 用いられるインヒビターペプチド濃度は通常約0.0001重量%、または少なくと も0.0001重量%から0.1重量%であり、選択された特定の投与形態に従い、主に液 体容量、粘度などにより選択される。 従って、静脈内注入のための代表的な薬学的組成物は、250mlの減菌リンゲル 溶液通常生理食塩水またはPBS、および約0.25mgから約25mgのインヒビターペプ チドを含有するように調製される。非経口投与可能な化合物を調製するための実 際の方法は公知であるか、または当業者には明らかであり、そして例えは、Remi ngton's Pharmaceutical Sciences 、17版、Mack Publishing ComPany、Easton、 PA(1985)(これは本明細書中で参考に援用される)でさらに詳細に記載されている 。 固形組成物について、従来の無毒性固形希釈剤(キャリアー)が使用され得、こ の希釈剤は例えば、製剤用のマンニトール、ラクトース、澱粉、ステアリン酸マ グネシウム、サッカリンナトリウム、タルカム、セルロース、グルコース、スク ロース、炭酸マグネシウムなどを含有する。経口投与のために、薬学的に許容可 能な無毒性の組成物は、上記のこれらのキャリアーのような通常使用される任意 の賦形剤の使用により形成され、一般に10〜95%が活性成分、即ち上記のインヒ ビターペプチド、好ましくは約20%であり(Remington's、前出を参照)、好ましく は固形剤形を胃を通過して腸へ到達させるために腸溶剤皮を用いる。 エアロゾル投与について、意図されたインヒビターペプチドは、好ましくは界 面活性剤またはプロペラントと共にエタノールまたはDMSO水溶液のような溶液で 提供される。代表的なインヒビターペプチドパーセンテージは約0.0001重量%か ら約0.1重量%であり、好ましくは約0.0001重量%から約0.001重量%である。界面 活性剤は当然無毒性でなければならず、そして好ましくはプロペラントに可溶性 である。代表的なこのような薬剤は、６〜22の炭素原子を含有する脂肪酸(例え ば、カプロン酸、オクタン酸、ラウリン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノ ール酸、リノレン酸、オレステリン酸、およびオレイン酸)の脂肪族多価アルコ ールまたはその環状酸無水物(例えばエチレングリコール、グリセロール、エリ トリトール、アラビトール、マンニトール、ソルビトール、ソルビトール由来の ヘキシトール酸無水物)とのエステルまたは部分エステルおよびこれらのエステ ルのポリオキシエチレンおよびポリオキシプロピレン誘導体である。混合グリセ リドまたは天然グリセリドのような混合エステルは使用され得る。界面活性剤は 組成物の約0.1〜約20重量%を構成し得、そして好ましくは約0.25〜約５重量%で ある。組成物の残部(balance)は通常プロペラントである。液化プロペラントは 外気の条件では代表的にガスであり、圧力をかけて凝縮される。適切な液化プロ ペラントは、５つまでの炭素を含有する低級アルカン(例えば、ブタンおよびプ ロパン)である；そして好ましくはフッ化アルカンまたはフッ化塩素アルカンで ある。また、上記の混合物も使用され得る。エアロゾルを生成するにおいて、適 切な弁を備えた容器に、適当なプロペラントを充填し、これは細かく分割された 化合物および界面活性剤を含有する。従って、成分は、弁の作動により放出され るまで高い圧力で維持される。プロペラントとして空気を使用するポンプ作動ス プレー(アトマイザーまたはネブライザー)もまた、意図されている。 例えば、ウサギの喘息の処置について、意図されたペプチドの用量は、２〜３ kgの動物に対し１日約１〜100mgである。ヒトの喘息患者には、この用量は70kg の患者に対し１日約１〜約100mgである。喘息に対する投与は、代表的にはネブ ライザーからのエアロゾルによる。理想的には、治療投与は、発作が始まった後 可能なかぎり早く開始すべきである。 インヒビターペプチドを含有する薬学的組成物は、予防および/または治療処 置のために投与され得る。治療適用において、組成物は、上記のように、VLA-4 発現白血球とCS-1ペプチド部分を発現する内皮細胞との間の結合を阻害するに十 分な量で、疾患を患う患者に投与される；すなわち、炎症を減少させ、それによ り疾患の症状およびその合併症を少なくとも部分的に阻止する。これを達成する に適当な用量が「治療に効果的な用量」、あるいは「結合阻害量」または「炎症 減少量」として定義される。この使用に効果的な量は疾患の重度ならびに患者の 体重および全体的な状態に依存するが、一般的に１日当たりインヒビターペプチ ド約１mg/kg〜約500mg/kgの範囲であり、さらに一般的に使用されるときは１日 当たり約１mg/kg〜約10mg/kgの化合物の投薬量である。 予防適用において、意図されるペプチドを含有する組成物は、特定の疾患に感 受性である、あるいは危険性のある患者に投与される。このような量は「予防的 に効果的な用量」として定義され、また、VLA-4発現白血球とCS-1ペプチド発現 内皮細胞との結合を阻害するのに十分な量である。この用途では、正確な用量は また、患者の健康状態および体重に依存するが、一般的には約１mg/kg/日から約 500mg/kg/日の範囲であり、さらに一般的には約１mg/kg/日から約20mg/kg/日で ある。 意図されたインヒビターペプチドの結合阻害量を評価する別の方法は、インビ トロでの研究で、ペプチドにより示された結合阻害とCS-1または10-mer標準によ り与えられる結合阻害とを比較することである。この比較をなす便利な１つの方 法は、２つの比較する物質のIC50値の使用であり、そして使用される量を、CS-1 または標準10-merペプチドの量およびこの参照化合物に対する多様なIC50値のイ ンヒビターペプチドの量に基づかせる。 代表的には、IC50値が標準10-merの少なくとも約1/10(10倍効力がある)の化合 物は、10-mer標準の量の1/10のモル濃度で使用されるとき、有用な結合阻害量で ある。さらに好ましくは、10-merの量の約1/15である。なおさらに好ましくは、 この量は10-merの量の約1/100に等しい。これらの量が約50%結合を阻害する量で あれば、結合を阻害する濃度はより高い方がなおさらに好ましい。 従って、インビトロでの使用については、最小のCS-1/VLA-4阻害量がIC50値で ある。インビボでの使用については、通常使用されるCS-1/VAL-4阻害量は、IC50 値濃度から始まり、そして必要に応じて減少させ得るか、または用いられる水性 媒体(すなわち、非経口投与が使用される場合、通常生理食塩水、または経口投 与が使用される場合、腸液(intestinal fluid)のような、使用されるpH7.2〜7.4 の水性媒体)でのペプチドの溶解度限界に増加させ得る。 組成物の単回または複数回投与は、治療医師または獣医により選択された投薬 レベルまたは様式で行い得る。いずれにしても、薬学的組成物は、患者を効果的 に処置するに十分な量のインヒビターペプチドを提供するように処方される。 また、フィブロネクチンCS-1/VLA-4仲介炎症の処置のためのプロセスも意図さ れる。このようなプロセスによると、上記の意図されるインヒビターペプチドは 、このような治療を必要とする哺乳動物(例えば、このような炎症を有する哺乳 動物)に投与されるか、または、例えは移植前に予防的に投与される。この投与 は、好ましくは上記の薬学的組成物を用いる。ペプチドは炎症減少(CS-1/VLA-4 結合阻害)量で投与される。哺乳動物(例えば、マウス、ネズミ、ウサギ、サル、 またはヒト)は、ペプチドが自然の身体的プロセスにより取り除かれるまで維持 される。哺乳動物が移植のレシピエントである場合、１日、数日または数週間、 または宿主動物の生涯にわたる複数回の投与が、単回の投与と同様に、意図され る。 CS-1とVLA-4との結合を阻害するための十分な量を決定する方法は、特にイン ビトロでの研究で既に論じられている。インビボ用途については、特定の処置に より炎症が減少したかを測定する多くの公開されたアッセイがある。例えば、リ ウマチ患者における患部関節数、または処置前後の患者の運動性を評価し得る。 喘息発作の影響の減少は、周知のように、実験動物での動的コンプライアンスま たは肺抵抗の測定によりアッセイされ得る。DTHで観察される水腫の量もまた、 移植片拒絶の影響または標準コントロールと比較してそれがないことと同様に、 容易に測定し得る。発明を実施するための最適な態様 実施例１：X-Leu-Asp-Phe-Zの合成 保護アミノ酸であるBoc-Phe-OH、Boc-Asp(OBn)-OH、およびBoc-Leu-OHをNOVA Biochem Co.,La Jolla,CAから購入し、さらに精製することなく使用した。フェ ニル酢酸、モルホリン、ジイソプロピルエチルアミン(DIEA)、および1-ヒドロキ シベンズトリアゾール(HOBt)をAldrich Chemical Co.,Milwaukee,WIから得た。 エチル-3-(3-ジメチルアミノ)-プロピルカルボジイミド・HCL(EDC)をBachem Co. ,Torrance,CAから得た。4規定のHCl(ジオキサン)溶液をPierce Co.,Rockford,IL から得、そのまま使用した。1 HNMRスペクトルをGEQE-300、300 MHz NMRスペクトロメーター上で記録した。 Ａ.Boc-Phe-モルホリンアミドの調製 250mlフラスコに、100ml乾燥ジメチルホルムアミド(DMF)中のBoc-Phe-OH(10g 、38mmol)、モルホリン(3.3g、38mmol)、および1-ヒドロキシベンズトリアゾー ル(5.1g、38mmol)を入れた。この溶液に０℃でジイソプロピルエチルアミン(DIE A)を、pH値が８に達するまで添加し、続けてEDC(8.8g、46mmol)を添加した。溶 液をゆっくりと室温まで暖めた。この混合物を室温(約22℃)で８時間撹拌した。 DMFを減圧エバポレーターにより除去し、酢酸エチルおよび水を添加し、そして 層を分離させた。水性層を酢酸エチル(50ml×2)で抽出し、混和した抽出物を1N HCl、飽和NaHCO3、水、およびブラインで洗浄し、MgSO4で乾燥させ、濾過し、そ して濃縮して、無色の液体(12.8g、37.7mmol；収率99%)を得た。これは、1HNMR によりBoc-Phe-モルホリンとして特徴づけられた。 Ｂ.HCl-Phe-モルホリンアミド塩の調製 Boc-Phe-モルホリンアミド(12.8g、38mmol)を250mlフラスコに入れ、次いで4N HCl(ジオキサン)溶液(30ml)を添加した。混合物を６時間撹拌した。その時点で 、TLC(シリカゲル;CHCl3:MeOH:酢酸が90:8:2)が反応が完了したことを示す。ジ オキサンおよび過剰のHClを除去した。1HNMRによりHCl-Phe-モルホリンアミドと して同定される白色固体を100%の収率で得た(10.3g、38mmol)。 Ｃ.N-フェニルアセチル-Leu-Asp(β-O-ベンジル)-Phe-モルホリンアミドの調 製 Boc-Asp(β-OBn)-OH、Boc-Leu-OH、およびフェニル酢酸を、上記のカップリン グおよび脱保護手順を用いて、連続してHCl-Phe-モルホリンアミドに付加した。 このようにして得た白色固体を酢酸エチルおよびヘキサンから結晶化した。そし て1HNMRにより所望のエステル(収率95%)と同定した。 Ｄ.N-フェニルアセチル-Leu-Asp-(β-O-Bn)-Phe-モルホリンアミドの合成 メタノール(100ml)中の上記ベンジルエステル(10g、15mmol)の溶液に10%パラ ジウム-木炭(2.0g)を添加した。この混合物を含有するフラスコを真空排気し、 次いで３回水素で充填した。次いで、混合物を、TLC(CHCl3:MeOH:酢酸が90:8:2) で示される水素化分解(hydrogenalysis)の完了まで、約５時間水素雰囲気下で強 く撹拌した。反応混合物をセライトで濾過し、メタノールを除去し、白色固体を 収率97%で得、これは、1HNMRによりXLDFZ(8.4g、14.5mmol)として特徴づけられ た。 カルボキシアミド[C(O)-NH2]以外のＣ末端アミド結合Ｚ基を有するペプチドを 同様に調製した。 実施例２： 模範的固相ペプチド合成 Fmoc保護されたアミノ酸、ヒドロキシベンゾトリアゾール（HOBt）、およびRi nkアミドMBHA樹脂を、Nova Biochem，La Jolla，CAから得た。ジイソプロピルカ ルボジイミド（DIC）をChem Impex Inc.，Chicago，ILから得た。ピペリジンをA ldrich Chemical Company，St．Louis，MOから得た。ジメチルホルムアミド（DM F）、イソプロパノール（IPA）、ジクロモメタン（DCM）、およびジメチルアセ トアミド（DMA）をBurdick and Jackson，Muskegon，MIから得た。上の試薬の全 てを、さらに精製することなく、製造業者により提供されたままで用いた。 この合成の間に繰り返される標準的な脱保護／カップリングサイクルを、Rink アミドMBHA樹脂へのFmoc-Proの第一のカップリングの点から記載する： Fmoc-MBHA樹脂（10.6g.，５mmol）を20パーセントピペリジンのDMF（130ml） で３分間処置した。この溶液を濾過により除去し、そして樹脂を、20パーセント ピペリジンのDMF（130ml）で17分間再び処置した。この溶液を濾過により除去し 、そして樹脂をDMF（それぞれ130ml）で５回、IPA（130ml）で２回、そしてDMF （130ml）で２回洗浄した。DMA（50ml）中のFmoc-D-プロリンのHOBtエステル（1 0mmol Fmoc-D-プロリンおよび10mmol HOBtの50ml DMA溶液と12mmol DICとを20分 間室温で反応させることにより形成された）を樹脂に添加し、そして２時間反応 させた。この樹脂をDMF（130ml）で５回、DCM（130ml）で２回洗浄した。樹脂へ のアミノ酸のカップリングを、標準的なKaiserの検定により確認した。 上記のサイクルを引き続くアミノ酸：Fmoc-Phe、Fmoc-Asp（β-OBn）、Fmoc-L eu、およびフェニル酢酸のそれぞれについて繰り返した。この樹脂を、24時間真 空乾燥し、次いで95パーセントTFA／５パーセントH2O（60ml）と、２時間室温で 反応させた。このペプチドのTFA溶液を、濾過により樹脂から分離し、そしてTFA を真空蒸発させた。固体残基を無水エタノールから結晶化し、1.8gの生成物、N- フェニルアセチル-Leu-Asp-Phe-D-Pro-NH2を得た。ペプチドを、HP Amino Quant 1090およびNMRにおけるアミノ酸分析により特徴付けを行い、そしてペプチドの 純度をHPLC（WATER HPLC Systems）により確認した。 実施例３： インビトロ結合アッセイ 51クロムで標識したJurkat細胞（ATCC TIB 152）、ヒトＴリンパ芽球株を用い て、本明細書中で考察される多様なペプチドにより提供されるインビトロ結合阻 害をアッセイした。CosterTM96 ウエル平底マイクロタイタープレート(カタログ 番号9050，Cambridge，MA)が、これらのアッセイにおいて最も良好な結果を提供 することを見出した。 プレートを以下のように調製した 0.5〜１μg/mlで0.1M NaHCO3（pH9.5）の バッファー（このバッファーはまた、10μg/mlのウシ胎児血清（BSA）をも含有 する）に溶かした25マーCS-1ペプチド（配列番号１）、または同一のバッファー に１〜2.5μg/mlで溶解したオボアルブミンに結合したCS-1ペプチドの複合体（C S-1-OVA）を基質として用いた。マイクロタイタープレートのそれぞれのウェル を50μlの基質、またはコントロールのためにバッファー単独で被覆した。ウェ ルを完全に乾燥させ、次いてpH7.4のPBSで２回リンスした。次いでウェルあたり 200μlのRPMI／１パーセントBSAを用いて、それぞれのウェルの非特異的結合部 位を２時間室温でブロックした。両方の固相接着基質とも、同様の結果を提供し た。 Jurkat細胞（3〜5×106細胞）を15ml FalconTM丸底チューブに入れ、蓋をした 。このチューブを遠心分離し、次いで余分な培地を除去した。 200μlの51Cr標識溶液を遠心分離した細胞に添加し、そして90〜120分間温か い部屋の中で細胞と接触させた。この手順は、代表的には、80〜100パーセント の細胞生存度を有する約50,000〜100,000 cpm/ウェルを提供する。接触時間を長 くすると、より大きな量の標識が提供されるが、細胞生存度がより低くなる。 標識した細胞を（i）完全培地、（ii）１mM EDTA/PBS、および次に（iii）血 清成分を含有しないRPMI／１パーセントBSAで洗浄する。それぞれの洗浄後、細 胞を遠心分離する。この細胞を、１×106生存細胞/mlの濃度で無血清RPMI／１パ ーセントBSAに、最後に再懸濁する。これは、アッセイにおいて1/2濃度を提供す る。 インヒビターペプチドを、1.5ml低温ネジ口バイアルにDMSO中に20mg/mlで原液 として調製し、そして-70℃で保存した。FlowTM丸底またはＶ底マイクロタイタ ープレートを用いて、インヒビターペプチドを、60μl/ウェルてRPMI／１パーセ ントBSA中にアッセイ濃度の２倍で調製した。 代表的には、４回の最初の希釈を用いた。配列番号３の標準10-merのような効 力が小さいペプチドについては、最初の希釈は500μg/ml、100μg/ml、20μg/ml 、および４μg/mlであった。N-フェニルアセチル-Leu-Asp-Phe-D-Pro-NH2のよう な効力がより大きいペプチドについては、代表的には、最初の濃度は、10μg/ml 、２μg/ml、0.4μg/ml、および0.08μg/mlであった。 次いで51Cr標識細胞（60μl/ウェルで１×106細胞）を、希釈したペプチド溶 液と混合した。混合物を室温（約22℃）で30分間維持した。 100マイクロリットルのそれぞれのインヒビターペプチド／細胞混合物を、基 質被覆したウェルに移した。これをそれぞれの希釈について３組行った。生じた プレートを30分間37℃でインキュベートし、次いで200μg/ウエルのRPMI／１パ ーセントBSAで３回穏やかに洗浄した。特に２回目の洗浄後に、結合を顕微鏡下 で観察した。 次いで結合した細胞を、100μl/ウェルのドデシル硫酸ナトリウムの0.5パーセ ント水溶液の添加により溶解させた。次いで生じた溶液を、通常の手順に従って IC50値の計数および算定のために処理した。選別アッセイの結果を、基準化し、 そして比較し得るように、適切なポジティブコントロールおよびネガティブコン トロールをそれぞれのプレートとともに用いた。 表１のデータは、そのようにして基準化されている。ペプチドN-フェニルアセ チル-Leu-Asp-Phe-モルホリンアミドについての絶対IC50値は、0.18〜0.30μMで ある。 実施例４： マウスにおける遅延型過感受性 Ａ．初期の研究 Chisholmら、Eur.J.Immunol.，23:682-688(1993)は、ラット抗マウスα-4-抗 体を用いてマウス接触性過感受性モデルにおけるVLA-4相互作用のブロックのイ ンビボの結果を報告した。これらの研究者らは、VLA-4仲介接着を妨害するよう にデザインされた治療薬が、インビボの炎症過程の効果的なブロッカーであり得 ることに気付いた。 養子移入遅延型過感受性マウスモデルは、オキサゾロンに初回刺激される脾臓 Ｔ細胞を用いて開発された。このモデルは、Elicesら、Clin.Exp.Rheum.，11(Su ppl8) :577-580(1993)に記載される。本明細書中では、この手順に従う。 従って、BALB/cマウスの腹部を剪毛し、そして０日目および１日目に、３パー セントオキサゾロンのアセトン/オリーブオイル（4:1）で塗布した（腹部に50μ l、そしてそれぞれの足に５μl）。５日目に、マウスを屠殺し、それらの脾臓を 摘出し、そして脾臓Ｔ細胞を、ナイロンウールカラムを経由して得た。 通常の生理食塩水または25×106/動物のオキサゾロン免疫Ｔ細胞を含有する生 理食塩水を、未処置マウスに別々に注射した。次いでこのマウスのそれぞれの一 方の耳に10μlの２パーセントオキサゾロンを塗布することによりチャレンジし た。全ての手順を無菌条件下で、そして内毒素非含有緩衝液中で行った。 チャレンジまたは生理食塩水注射の前に、マウスに、通常の生理食塩水、ペプ チドN-フェニルアセチル-Leu-Asp-Phe-D-Pro-NH2を含有する通常の生理食塩水、 または寄せ集めの（Scrambled）配列を有するペプチドを含有する通常の生理食 塩水を６mg/kg/日で24時間絶えず皮下投与するポンプを取り付けた。チャレンジ または生理食塩水注射の部位の腫張直径を、24時間後にマイクロカリパスで計測 した。 この研究の結果を、生理食塩水および列挙したインヒビターペプチド処置につ いて図５のグラフに示す。データにおいておそらく非CS-1仲介炎症に起因するわ ずかな重なりが存在するが、意図されたインヒビターペプチドの投与が、未処置 コントロールと比較して、このタイプのCS-1/VLA-4仲介免疫炎症を減少すること は明らかである。寄せ集めペプチドの使用は、炎症の減少を全く提供しなかった 。600mg/kg/日の同じペプチドを用いる別の実験は、ペプチドにより引き起こさ れる毒性を全く示さなかった。 Ｂ．発展させた研究 発展させた研究を、寄せ集めペプチドコントロールを使用せず、より大きな群 のマウスとともに表１のさらなるインヒビターペプチドを使用すること以外は、 上記のように実施した。統計学的な分析を、溶媒単独の注射に対して実施した。 これらの結果を以下の表２に示す。 腫脹のチャレンジ後の減少は、研究した５つのインヒビターペプチドの内の４ つについて顕著であった。この内３つのインヒビターペプチドは、腫脹において 統計学的に有意な減少を示した。阻害を示した４番目のペプチドは再現性は非常 に高かったが、統計学的に有意なレベルではなかった。この４番目の化合物は、 非常に吸湿性である。それゆえ、この吸湿性のために、指定の６mg/kg/日の投与 量よりも実質的に少ない投与量が実際には投与され、そしてこの低下した投与量 が、統計学的に有意な結果の欠如の原因となったと考えられる。 移入されるＴ細胞は、ここで検査される養子免疫応答におけるエフェクター細 胞である。Ｔ細胞は、VLA-4およびVLA-5の両方を発現する。これらは、炎症免疫 応答の間、それぞれ、フィブロネクチンのCS-1含有部分およびRGD含有部分と相 互作用する。Fergusonら、Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，88:8072-8076(1991)は、 約50μg/mlのここで用いられる標準ペプチド（配列番号３）を免疫Ｔ細胞と混合 させた場合、ここで研究される反応のような移入免疫応答を撤廃し得ることを示 した。これらの研究者らはまた、ペプチドおよびＴ細胞の別々の投与は、この撤 廃を導かないことをも教示した。 ここでは、６μg/mlの意図されるインヒビターペプチドの別々の投与が、免疫 応答の実質的な阻害を提供したことが分かる。ここでは、インヒビターペプチド およびＴ細胞を、Fergusonらの結果において要求されたように予め混合する必要 がないことも分かる。 N-フタルイミド誘導体は、溶媒のみにより示される腫脹よりもわずかに大きい 平均腫脹を示した。ここでは１つの濃度のみが利用されたので、この理由は依然 として不明である。さらにN-フタルイミド誘導体は、表１のインビトロアッセイ においてφAc-Leu-Asp-Phe-D-Pro-NH2の活性の約1/5〜1/6を示した。より低い活 性の化合物が、活性範囲の下限において活性を示さないことは、特に予期されな いことではない。 実施例５： 喘息のウサギの処置 ６匹のNew Zealand白ウサギを、生後４ヶ月齢まで、ハウスダストダニ抗原で 免疫した。免疫において、３匹のウサギに、希釈液として50パーセントエタノー ル水溶液中の100mg/kg量のインヒビターペプチドN-フェニルアセチル-Leu-Asp-P he-モルホリンアミドの単回噴霧器投与を与え、そして他の３匹に希釈液のみを 与えた。全てのウサギを、コントロールとして供するペプチドを受けていない動 物とともに、ペプチドの投与後15〜30分間ハウスダストダニ抗原でチャレンジし た。 一旦免疫し、そしてチャレンジすると、炎症状態は、約３週間以内に基底レベ ルに静まった。コントロールとして用いた３匹の動物を、その後インヒビターペ プチドの受容のための被験体として用いた。そして最初にペプチドを受けた３匹 のウサギは、コントロールとして供し得る。 このようなクロスオーバー研究をここでは行った。従って、３匹の最初のコン トロールウサギを、上記の研究から３週間より多い時間がたった後、上記希釈液 中の上記インヒビターペプチドで処置し、そして３匹の以前のペプチド受容者に は希釈液のみを投与した。次いで６匹全てを、再びチャレンジした。 動的コンプライアンス（Cdyn）および肺抵抗（RL）により測定される初期肺関 数、およびエフェクター細胞計数（ここでは、好酸球）を得るための気管支肺胞 洗浄（BAL）を、このクロスオーバー研究の両方の集団について、ペプチドまた は希釈液の投与の前に行った。次いで同様のアッセイを、この研究の両方の集団 について、６時間のチャレンジ後1/2時間（初期相アレルギー反応）およびチャ レンジ後24時間（後期アレルギー反応）に実施した。 これらの研究は、W.J．Metzger、CRC Hnadbook of Late Phase Reactions，W. Dorsch編、Chapter 35，CRC Press，Boca Raton，FL（1990）347〜362頁に記載 のように、East Carolina University，Greenville，N.C.のDr．W．J．Metzger により指揮された。 肺関数パラメーターについてのこの研究の結果を図4Aおよび図4Bに示す。ここ でチャレンジしたインヒビターペプチド処置動物のデータを白丸で示し、そして チャレンジした未処置コントロール動物のデータを黒丸で示す。これらのデータ は、この研究の両方の集団からの平均値である。 図4Aから理解されるように、チャレンジした処置動物についてのCdyn値は、６ 時間全体の間およそ初期値を維持した。チャレンジした未処置動物についてのCd yn は、初期値の約40％に急速に落ち込み、その後６時間全体の間およそその値を 維持した。 図4Bのデータは、チャレンジしたインヒビターペプチド処置動物についてのRL 値は、６時間全体の間、初期値とその値の約200パーセントとの間にとどまり、 この時間の終わりの近くでわずかな上昇があったことを示す。チャレンジしたが 未処置の動物についてのRL値は、チャレンジ後、最初の２時間で約200〜300パー セントに上昇し、残りの４時間で約400〜1200パーセントに上昇した。 この炎症免疫応答の初期（2〜4時間）および後期（24時間）相について、チャ レンジしたコントロール動物と比較した、インヒビター処置し、チャレンジした 動物についての平均データのまとめを、以下の表２に提供する。 これらの研究に由来するBAL計数は、クロスオーバー研究における未処置のチ ャレンジした動物と比較してインヒビターペプチド処置したチャレンジした動物 において24時間後の好酸球において88.1パーセントの減少があることを示す。 上記のデータおよび図4Aおよび4Bのデータから理解され得るように、意図され るペプチドの炎症減少量のエアロゾル投与は、処置を受けていない動物と比較し て、処置した動物において喘息反応を大いに減少させた。 実施例６： ウサギ心臓同種移植モデル New Zealand白ウサギSPF心臓を、同様のウサギの頚部に同種移植し、移植片対 宿主の免疫拒絶モデル、および免疫炎症反応における意図されるペプチドの影響 をアッセイした。これらの研究は、Hospital for Sick Children，Toronto，Ont ario，CanadaのDr．M．Rabinovitchにより実施された。実験動物モデル 3.5kgと４kgとの間のNew Zealand白雌ウサギ（Charles River Lab.，Saint La urent，Quebec）に、以前に記載され[Alonsoら、Am.J.Pathol.，87:415-442(197 7)；Clausellら、Circulation，89:2768-2779(1994)]、そしてThe Hospital for Sick Children，TorontoのAnimal Care Committeeにより認可された実験プ ロトコルに従い、異所性心臓移植を受けさせた。動物は、HLA不適合を与えるた めに任意抽出し、宿主ウサギは、無Pasteurellaであり、そしてドナーは、非近 交系であった。宿主およびドナーの両方のウサギに、Purina 5321-0.5%パーセン トコレステロール食餌（Research Diets Inc.，New Brunswick，NJ）を摂食させ 、これは同種移植片動脈症のプロセスを加速するのに有用てあることが証明され たストラテジーである[Alonsoら、Am．J．Pathol.，87:415-442(1977)]。この給 餌を、移植４日前に始め、そして実験期間の完了まで移植のレシピエントに継続 した。 異所性心臓移植の技術は、以前に記載されている[Clausellら、Circulation, 89 :2768-2779(1994)]。簡単に述べると、垂直切開を、レシピエントウサギの頚 部の前部に実施し、そして左側の総頚動脈および同側の外部頚静脈を分離した。 約30分間のドナー心臓についての虚血の全期間後、大動脈をレシピエントの頚動 脈に端と側を吻合することおよび肺をレシピエントの外部頚静脈に端と側を吻合 することにより、心臓同種移植片を頚部に配置した。手術後看護は、Canadian N ational Society for Medical Researchにより公式化されたPrinciples of Labo ratory Animal Careに従った。 処置は、インヒビターテトラペプチド、N-フェニルアセチル-Leu-Asp-Phe-D-P ro-NH2（処置）（このペプチドは、ロイシン-アスパラギン酸-バリン（LDV）配 列[Komoriyaら、J.Biol.Chem.，266:15075-15079(1991); Waynerら、J.Cell Bio l. ，116:489-497(1992)]に由来し、この配列は、本発明では、インビトロで阻害 を増強する）、および同じ合成テトラペプチドN-フェニルアセチル-Asp-Leu-Phe -D-Pro-NH2（コントロール）の寄せ集め形態（VLA-4の阻害を全く生じない）か ら成る。両ペプチドともCytel Corporation，San Diego，CAで合成した。 移植の日の最初に、動物を無作為化し、そして１mg/kg s.c.の寄せ集めペプチ ド（コントロール群）または１mg/kg s.c.のインヒビターペプチドのいずれかで 処置した。ペプチドの投与量を、表１の、予備的インビトロ研究に基づいてイン ビボモデルに対して経験的に推定した。他の免疫抑制治療は全く与えなかった。 移植片を、触診により日周でモニターし、そして心筋の拒絶反応（傷害性心臓収 縮）およびこのモデルにおける同種移植片動脈症の発症に関係する、以前に記載 された終末点を７〜８日間維持した[Clausellら、Circulation，89;2768-2779(1 994)]。14匹の動物の全てを、コントロール（n=7）群および処置（n=7）群にお いて研究した。心臓の調製 動物を、致死用量のオイタノール（euthanol）(480mg i.v.）(MTC Pharmaceut ical，Cambridge，ON)を用いて屠殺し、宿主およびドナーの心臓を摘出し、そし て大動脈を通して、冠状動脈を生理食塩水で灌流し、続いて２パーセントパラホ ルムアルデヒド（Sigma，St，Louis，MO）を用いた灌流により光固定を行った。 ウサギにおける心臓同種移植動脈症が、冠循環全体に等しく分配されることを示 す以前の記載[Foeghら、Trasplant Proc.，21:3674-3676(1989)]およびDr．Rabi novitchおよび共同研究者らの以前の記載[Clausellら、Circulation，89:2668-2 779(1994)]のために、心臓を、基部から尖部まで横方向に切片化した。心臓の異 なる切片を、光学顕微鏡研究のために10パーセントホルマリン（BDH Inc.，Toro nto，ON）中に保存するか、または特異的免疫組織化学研究のためにO.T.C．Como und Tiussue Tek(Miles Inc.，Elkart，IN)中で迅速に凍結した。拒絶反応の階級づけ ドナー心臓由来の組織標本を、改変されたBillinghamの判断基準[Billingham, Hum．Pathol.，10:367-386(1979)]に従い、拒絶反応の組織学的な階級づけのた めにヘマトキシリン：エオシンで染色した。切片は、Hospital for Sick Childr enで熟練した病理学者の一人（Dr．G.J．Wilson）により、ドナー心臓がコント ロール由来であるか、インヒビターペプチド処置した動物由来であるかを知らず に階級づけた。光学顕微鏡による宿主冠状動脈およびドナー冠状動脈の定量的評価 コントロールおよび処置したウサギの両方に由来する宿主およびドナー心臓由 来の３個の異なるパラフィン包埋組織切片を、光学顕微鏡検査のためにMovatペ ンタクロム染料法により染色した。形態計測分析を、コンピューター生成ビデオ 分析システム（Perceptics Inc.，NuVision software）に取り付けられたzeiss 顕微鏡を用いて、Clausellら、Circulation，89:2768-2779(1994)に記載のよう に実施した。内膜性病変を有する血管の数を、研究したそれぞれの動物由来の３ 個の全ての心臓切片中で計数した。これを全血管数のパーセンテージで表す。 宿主心臓では、コントロール群において999個の血管を、そして処置群におい て1054個の血管を分析した。ドナー心臓では、コントロール群において827個の 血管を、そして処置群において617個の血管を分析した。内膜肥厚の重症度を測 定するために、３個の切片全てにおける見分けられる血管それぞれの直径を計測 し、そして冠状動脈を、小（直径＜100μm）、中（100＜直径＜500μm）、大（ 直径＞500μm）に分類した。次いで内膜肥厚の程度を、Eichら、Circulation, 8 7 :261-269(1993)に以前に記載のように、それぞれの血管サイズカテゴリにおい て定量的に評価した。外部中膜(outer medial layer)（ML）、内弾性膜（IEL） および管腔により取り囲まれる面積を、それぞれの罹患血管中で計測し、そして 血管面積に関係する内膜肥厚（TT）の面積を、公式IT=IEL-管腔面積/ML-管腔面 積×100により計算した。免疫組織化学研究 全ての免疫組織化学分析において、コントロールおよび処置群由来の異なるサ イズの範囲における内膜肥厚を有するおよび有さない宿主およびドナー心臓由来 の冠状動脈を比較した。切片において研究したそれぞれの特異的な抗原の相対的 な豊富さを、Rabinovitch研究室の２人の適任な研究者により、最小（+/-）、わ ずか（+）、中程度に豊富（++）、非常に豊富（+++）として半定量的に階級づけ した。最終的なスコアリングは、90％の一致に達した個々の階級づけに基づいた 。 （１）炎症細胞の特徴付け 研究した両方の群の同種移植冠状動脈における免疫炎症反応の存在を特徴づけ るために、ウサギMHCクラスII抗原およびウサギＴ細胞へのモノクローナル抗体 （Dr．Peter Libby，Brigham and Women's Hospital，Boston，MAからの寄贈） 、およびウサギマクロファージに対するモノクローナル抗体（RAM 11，Dako Cor p.，Carpinteria，CA）をも用いて、免疫ペルオキシダーゼ染色を実施した。切 片を２時間風乾し、20分間アセトンで固定し、そしてD-PBS（Gibco，Burlington ，ON）/0.1パーセントBSA（Boehringer-Mannheim，Mannheim，Germany）でリン スした。内因性ペルオキシダーゼ活性を、切片を30分間PBS/0.1パーセントBSA＋ ３パーセント過酸化水素（BDH）に浸すことによりブロックした。10パーセント 正常ヤギ血清（Sigma）を用いる非特異的ブロックの工程の後、抗体を、１時間 、1:10希釈で、室温で切片に適用した。次いでこの切片をリンスし、1:50希釈で 、室温で45分間、ヤギ抗マウスペルオキシダーゼ結合二次抗体（Bio-Rad，Richm ond，CA）とともにインキュベートし、3,3'-ジアミノベンジジン（DAB）（Sigma ）で、10分間展開した。コントロール切片を正常マウスイソ型IgG（Dako Corp. ）で処理した。 （２）細胞接着分子の免疫検出 同種移植冠状動脈における接着分子の発現における処置の影響を評価するため に、ICA-1およびVCAM-1についての免疫ペルオキシダーゼ染色を、コントロール 群および処置群の宿主心臓およびドナー心臓の両方の凍結切片において実施した 。ICAM-1に対するモノクローナル抗体（mAb Rb2/3）およびVCAM-1に対するモノ クローナル抗体（mAb Rb1/9）は、Dr．Myron Cydulsky（Brigham and Women's H ospital，Boston，MA）により寄贈され、そしてこれらの抗体を、1:10の濃度で １時間室温で使用した。免疫染色についての手順は、上に記載の手順と本質的に 同じである。 （３）フィブロネクチンの評価 コントロール群および処置群由来の宿主心臓およびドナー心臓の冠状動脈での フィブロネクチン発現を、凍結切片を用いる免疫ペルオキシダーゼ染色を実施す ることにより、測定した。モノクローナル抗体抗細胞性フィブロネクチン（Chem icon Int．Inc.，Temecula，CA）を、1:100の希釈で、１時間室温で、使用した 。免疫組織化学手順の残る詳細は、上記の手順と本質的に同じである。この抗体 は、血漿フィブロネクチンを認識しない。統計学的解析 このデータは、平均値+/-SEとして表現した。コントロール群および処置群の 両方に由来する病変の発生率および重症度に関する分析において、Studentのt検 定を用いて、有意性を検定した。免疫組織化学研究に由来するカテゴリーの変数 間の相関（２つの群（コントロールおよび処置）において>+であれば、ポジティ ブであるとみなす）をFicher's exact testを用いて分析した。p<0.05である場 合、差異は有意であるとみなす。 上の研究の結果を、下の表３に要約する。 上記の結果から理解されるように、意図されるインヒビターペプチドの使用は 、同種移植心臓において観察される炎症誘導損傷を大いに減少した。これらの損 傷の減少は、血管内膜肥厚の結果において特に明白であるが、MHCクラスII抗原 、Ｔ細胞およびマクロファージの増加した存在、および全フィブロネクチンによ り示される発現した炎症マーカーに関係する結果にも、やや間接的に見られる。 実施例７： インビトロのブタ同種移植モデル ブタの冠状動脈内皮細胞（EC;IELに存在するような）および平滑筋細胞（SMC; 動脈の中膜に存在するような）を用いて、同様の実験をインビトロで実施した。 M-199培地（Gibco Labs.）中の底面層上でSMCとともに、膜トランスウェルシス テムを用いて、２つのタイプの細胞を培養した。SMCを、100ng/mlのインターロ イキン-1β（IL-1β）で、アッセイ開始前の24時間刺激した。ブタ末梢血リンパ 球を、Ficoll-Hypaqueにより分離し、放射性標識し、そしてEC上で一晩（約18時 間）インキュベートした。 IL-1β刺激SMCにおける経内皮性リンパ球遊走を、非刺激SMCと比較して観測し た（p<0.05）。培地中に10μg/mlで存在する実施例６のインヒビターペプチド、 フェニルアセチル-Leu-Asp-Phe-D-Pro-NH2は、リンパ球遊走を約30パーセント減 少させた（p<0.05）が、その配列が寄せ集められた同量のコントロールペプチド は、遊走を減少させなかった。 ECおよびSMCフィブロネクチンおよびIL-1βの増加した発現は、仔ブタ異所性 心臓移植後の加速された移植片動脈症に関連する免疫炎症応答の特徴である。上 記の結果は、IL-1βが、このインビトロモデルにおいて、フィブロネクチン産生 を誘導し、そして次にこのフィブロネクチン産生は、経内皮性リンパ球遊走に寄 与することを示す。上記の結果はまた、意図されるインヒビターペプチドが、こ の免疫炎症応答を減少するために用いられ得ることをも説明する。 実施例８： マウスにおける実験的自己免疫性脳脊髄炎 実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）は、中枢神経系の脱髄性の疾患であり、こ の疾患は、マウスおよびラットの感受性系統において、ミエリン塩基性タンパク 質、プロテオリピドタンパク質（PLP）、またはこれらの免疫優性Ｔ細胞決定基 による免疫、あるいはこれらの決定基に特異的なCD4ポジティブＴ細胞クローン の注射により誘導され得る。EAEは、ヒト多発性硬化症の動物モデルとして供す る。両方の疾患において、循環白血球（例えばＴ細胞および単球）は、血液脳関 門に浸透し、そしてミエリンを損傷し、麻痺を生じる。 EAEを、０日目に、PBSと完全Freundアジュバント（CFA）の1:1混合物に乳化し たPLPの139〜151位に相当するペプチド50μgで免疫することにより、EAEを雌SJL /Jマウス（８〜14週齢）において誘導した。それぞれのマウスの側腹後部上の２ 部位に、0.2mlのアジュバント乳濁液を皮下（s.c.）注射した。100μl中の107死 滅Bordetella pertussis単位を受容した全てのマウスに、24〜72時間後に静脈注 射した。 マウスを、EAEの臨床的な徴候について、８日目から日周で観測し、そして疾 患を、以下のように０〜５のスケールで得点づけた：０=疾患なし；１＝だらり と垂れた尾部；２=中程度の後肢脱力；３=不全対麻酔；４=中程度の前肢脱力を 有する対麻痺；５=四肢麻痺または瀕死前状態。 インヒビターペプチドN-フェニルアセチル-Leu-Asp-Phe-D-Pro-NH2を、0.2ml の不完全Freundアジュバント中に１mg/マウスで、８日目および９日目に、腹腔 内投与した。寄せ集め配列を有するペプチド[N-フェニルアセチル-Asp-Leu-Phe- D-Pro-NH2]を、同様に投与し、コントロールとして供した。このコントロールペ プチドの相対能を＜１として表１に示す。 臨床的徴候についての合計スコアまたは平均スコアを時間に対してプロットし た。生じる曲線下の面積を、８日目と35日目との間で計算し、インヒビターペプ チドによるEAEのパーセンテージ阻害を計算した。パーセント阻害を以下のよう に計算した： ％阻害＝100−（インヒビターペプチドの面積＋コントロールの面積）×100 31日を通しての２つの模範的なプロットを図６のグラフに示す。ここで、黒丸 は、インヒビターペプチドで処置した６匹のマウスについての平均スコアを示し 、黒四角は、寄せ集め配列コントロールペプチドを与えた６匹のマウスについて の平均スコアを示す。理解され得るように、本明細書で意図されるインヒビター ペプチドで処置した動物は、コントロールペプチドで処置した動物と比較して、 臨床的徴候において顕著な好転を示した。 実施例９： ヒト慢性関節リウマチにおけるCS-1発現 ヒト慢性関節リウマチ（RA）患者から外科的に得られた滑膜標本を、フィブロ ネクチンのCS-1ペプチド部分の発現について顕微鏡検査した。組織の超薄切片を 、抗CS-1抗体を用いて免疫ペルオキシダーゼ技術により染色し、そして透過型電 子顕微鏡を用いて研究した。これらの研究は、CS-1が血管内皮の管腔面、管腔原 形質膜で発現していることを示した。関節腔との界面に位置する滑膜の内膜内層 （synovial intimal lining）における滑膜細胞の原形質膜もまた、染色された 。CS-1ペプチド部分は、正常な滑膜において発現されないことが見出された。 JurkatＴ細胞株および凍結RA滑膜切片を用いて結合研究を実施した。Jurkat細 胞接着は、抗VLA-4抗体、またはここで標準として用いる10-merのCS-1ペプチド （500μg/ml）（配列番号３）により阻害され得るが、VLA-5、VCAM-1-AまたはVC AM-1-Bに対する抗体、あるいは10-merの配列が寄せ集められたペプチドでは、阻 害され得なかった。刺激したMOLT-4細胞も同様に挙動した。これらの結果は、El icesら、J.Clin.Invest.，93:405-416（1994年１月）に報告されている。 ヒトRA滑膜切片へのJurkat細胞の結合の同様の阻害、および正常滑膜切片への 結合は阻害しないことは、インヒビターペプチドN-フェニルアセチル-Leu-Asp-P he-D-Pro-NH2を用いることにより観測した。このペプチドを、標準10-merのIC50 値より約312倍低い、表１に示されるIC50値で用いた。このIC50値の絶対値は、 約0.5μMである。 これらの結果は、ヒト慢性免疫炎症疾患状態、慢性関節リウマチにおけるCS-1 ペプチド部分およびVLA-4の重要性を説明する。これらの結果はまた、意図され るインヒビター細胞が、このヒト免疫炎症疾患状態において炎症細胞の結合を阻 害し得ることをも示す。 実施例10： 喘息のヒツジの処置 ６匹の喘息のヒツジを、Department of Research，Mount Sinai Medical Cent er，4300 Alton Road，Miami Beach，FL 33140のDr．William M．Abrahamによる 二重盲検クロスオーバー研究において処置した。このヒツジは、吸入されたAscu ris suum 抗原に対して早発型および遅発型気管支応答を発症することが示されて いた。この研究をAbrahamら、J.Clin.Invest.，93:776-787(1994)に記載のよう に一般的に実施した。 ここで用いたインヒビターペプチドは、N-フェニルアセチル-Leu-Asp-Phe-D-P ro-NH2であり、寄せ集め配列中の同一の残基を有する以前に記載のペプチドを含 むコントロールペプチドをともに用いた。噴霧されたペプチドのためのベヒクル は、リン酸緩衝生理食塩水であった。これらのペプチドを、それぞれ１mg/kgの 用量で、チャレンジの前の３日間に１日２回、ならびにチャレンジの前0.5時間 、および４日目のチャレンジ後４時間に投与した。これはクロスオーバー研究で あるので、それぞれの動物に、一方または他方の処置、それに続く休息、次いで 他方の処置を与えた。それゆえ、それぞれの動物は、それ自身のコントロールと して供した。 図７のグラフから理解され得るように、インヒビターペプチドで処置した動物 は、コントロールペプチドで処置した動物よりも、チャレンジにおいて基線の比 肺抵抗（SRL）からの変化がより少ないことを示し、次いでより迅速にそれらの 基線肺関数に戻った。さらに、肺関数は、チャレンジ後約3〜4時間からこの試験 の終わり（チャレンジ後８時間）まで、おおよそ基線値のままだったが、コント ロールペプチド処置動物は、その肺関数（SRL）において増加を有した。 チャレンジ後の気道応答性もアッセイした。ここで、比肺抵抗（SRL）は、チ ャレンジ24時間後に基線値まで戻ったが、このヒツジは、このとき、吸入したカ ルバコールに対して過剰応答性であった。チャレンジ前およびチャレンジ後24時 間のカルバコール吸入におけるPC400値の比較は、インヒビターペプチド処置群 に必要とされる量（約27BU）と比較して、非常により少ない用量のカルバコール [約12呼吸単位(BU)]が、コントロールペプチド処置動物のSRL値を生理食塩水コ ントロール値の４倍以上に増加させるために必要とされることを示した。ここで チャレンジ前の値は、約20〜23BUであり、それゆえインヒビターペプチドは、こ の動物のSRLを、チャレンジ前の値よりも大きくした。これは、チャレンジ前応 答よりも減少したカルバコールへの応答を示す。 本発明は、所定の好ましい実施様態に関して記載され、そしてそれに関して例 証されているが、当業者は、様々な修飾、改変、省略、および置換が、本発明の 精神から逸脱することなくなされ得ることを容易に理解する。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 38/00 ＡＤＡ Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＤＡ Ｃ０７Ｋ 5/08 ＡＡＢ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ， ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，Ｇ Ｂ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＵ，ＬＶ ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ， ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＫ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 ガエタ，フェデリコ シー．エイ. アメリカ合衆国 カリフォルニア 92024, オリーベンハイン，リム ロック サーク ル 3226

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １．以下の式Ａのペプチドであって、 X-B-Asp-Z Ａ ここで、Ｂは側鎖が約２〜約５のメチレン基の長さを有するα-疎水性アミノ 酸残基であり； Ｘは該Ｂの窒素原子にアミド結合する基であって、該基は０〜約２のメチレン 基の長さを有するスペーサを介して該アミド結合のカルボニル炭素に結合した環 構造を有し、該Ｘの長さ（該スペーサーおよびカルボニル炭素を含む）は3-キノ リンカルボニルとおよそ同じ長さであるかそれよりも短く、該環構造は５員環お よび６員環または縮合した６,６員環または縮合した６,５員環であって；そして Ｚは以下の(a)および(b)からなる群から選択され； (a) Xaa-NCy1、ここでXaaはVal、Ile、Leuまたは１または２の縮合した芳香 族環を含有する側鎖を有するアミノ酸残基であり、そしてNCy1は該Xaaのα-カル ボキシル基とアミド結合を形成する環上窒素原子を有する環含有基であって、該 環が該環上窒素原子を含めて５または６の原子を含有する環含有基である、Xaa- NCy1；および (b) NCy2、ここで該窒素は環基のアミン置換基であって、該環基の窒素原子 が該Aspのα-カルボキシル基とアミド結合を形成し、該アミン置換基は６員環ま たは７員環に、もしくは縮合した６,６員環ラクタム環系または縮合した６,７員 環ラクタム環系に結合しており、該環系において該アミン置換基を有する環は飽 和され、該ラクタムのカルボニル基のα位に該アミン置換基を含有する、NCy2； 該ペプチドは、7.2〜7.4のpH値の水性緩衝液中でのインビトロアッセイにおい て、配列番号３のペプチドによって示される該結合における阻害と等しいかまた は約3000倍までの程度に、Jurkat細胞(ATCC TIB 152)の配列番号１の固相結合ペ プチドへの結合を阻害する、ペプチド。 ２．前記Ｂが、ロイシン、シクロヘキシルアラニン、ノルロイシン、メチオニ ン、ホモセリン、スレオニン、フェニルアラニン、バリン、ノルバリンおよびイ ソロイシンからなる群から選択される、請求項１に記載のペプチド。 ３．前記Ｘ基の環構造が芳香環を含有する、請求項２に記載のペプチド。 ４．前記ＺがXaa-NCy1である、請求項３に記載のペプチド。 ５．前記Xaaが、１または２の縮合した芳香環を含有する側鎖を有するアミノ 酸残基である、請求項４に記載のペプチド。 ６．前記NCy1の環が１または２の置換基によって置換され、該置換基がカルボ キシル、Ｃ1〜Ｃ4アルキレンカルボキシル、カルボキシアミド、Ｃ1〜Ｃ4アルキ レンカルボキシアミド、ヒドロキシル、ヒドロキシメチル、(CH2CH2O)nH(ここで 、ｎは１、２または３である)、およびＣ1〜Ｃ4アルキルからなる群から選択さ れる、請求項５に記載のペプチド。 ７．以下の式Ｉのペプチドであって、 X-Leu-Asp-Z Ｉ ここで、 Ｘは該Leuの窒素原子にアミド結合する基であって、該基は０〜約２のメチレ ン基の長さを有するスペーサを介して該アミド結合のカルボニル炭素に結合した 環構造を有し、該Ｘの長さ（該スペーサーおよびカルボニル炭素を含む）は3-キ ノリンカルボニルとおよそ同じ長さであるかそれよりも短く、該環構造は５員環 および６員環または縮合した６,６員環または縮合した６,５員環であり；そして Ｚは以下の(a)および(b)からなる群から選択され； (a) Xaa-NCy1、ここでXaaはVal、Ile、Leuまたは１または２の縮合した芳香 族環を含有する側鎖を有するアミノ酸残基であって、そしてNCy1は該Xaaのα-カ ルボキシル基とアミド結合を形成する環上窒素原子を有する環含有基であって、 該環が該環上窒素原子を含めて５または６の原子を含有する環含有基である、Xa a-NCy1；および (b) NCy2、ここで該窒素は環基のアミン置換基であって、該環基の窒素原子 が該Aspのα-カルボキシル基とアミド結合を形成し、該アミン置換基は６員環ま たは７員環に、もしくは縮合した６,６員環ラクタム環系または縮合した６,７員 環ラクタム環系に結合しており、該環系において該アミン置換基を有する環は飽 和され、該ラクタムのカルボニル基のα位に該アミン置換基を含有する、NCy2； 該式Ｉの該ペプチドは、7.2〜7.4のpH値の水性緩衝液中でのインビトロアッセ イにおいて、配列番号３のペプチドによって示される該結合における該阻害より も約10倍〜約3000倍の程度に、Jurkat細胞(ATCC TIB 152)の、配列番号１の固相 結合ペプチドへの結合を阻害する、式Ｉのペプチド。 ８．前記Ｘ基の環構造が芳香環を含有する、請求項７に記載のペプチド。 ９．前記芳香環がＣ1〜Ｃ2アルキル基またはヒドロキシル基で置換される、請 求項８に記載のペプチド。 １０．前記ＺがXaa-NCy1である、請求項８に記載のペプチド。 １１．前記Xaaが１または２の縮合した芳香環を含有する側鎖を有するアミノ 酸残基である、請求項１０に記載のペプチド。 １２．前記ＺがXaa-NCy1であって、そして前記Xaaがその側鎖が１または２の 縮合した芳香環を有するアミノ酸残基である、請求項７に記載のペプチド。 １３．前記NCy1の環が１または２の置換基で置換され、該置換基がカルボキシ ル、Ｃ1〜Ｃ4アルキレンカルボキシル、カルボキシアミド、Ｃ1〜Ｃ4アルキレン カルボキシアミド、ヒドロキシル、ヒドロキシメチル、(CH2CH2O)nH(ここで、ｎ は１、２または３である)、およびＣ1〜Ｃ4アルキルからなる群から選択される 、請求項１２に記載のペプチド。 １４．前記ＺがNCy2である、請求項７に記載のペプチド。 １５．前記NCy2が、ベンジルアミド、フェネチルアミド、2-(N-モルホリニル) エチルアミド、N-カルボキシアミドメチル-N-(3-カプロラクタミル)アミド、N-( 3-カプロラクタミル)アミド、N-(3-バレロラクタミル)アミド、N-2-(4-モルホリ ニル)エチル-N-(2-オキソ-テトラヒドロキノリン-3-イル)アミド、およびN-(2- オキソ-テトラヒドロキノリン-3-イル）アミド基からなる群から選択される、請 求項１２に記載のペプチド。 １６．前記Ｘが環側鎖を有するアミノ酸残基である、請求項７に記載のペプチ ド。 １７．前記Ｘアミノ酸残基のα-アミノ基の窒素原子が、Ｃ1〜Ｃ6アシル基で アシル化される、請求項１６に記載のペプチド。 １８．以下の式のペプチドであって、 Ar-Y-C(O)-Leu-Asp-Xaa-NCy1 ここで、Arはピラゾリル、フェニル、ピリジル、または3-キノリニルであり； Ｙは存在しない、もしくは-CH2-、-CH(NH)-、-O-、または-NH-であるスペーサ ーであり； もしくはAr-Y-C(O)-は該Leuの窒素原子と一緒に、フタルイミド、1,2,3,4-テ トラヒドロキナゾリン-2,4-ジオン-3-イルまたは5-フェニルダントイン-3-イル 基を形成し、そして 該Ar-Y-C(O)-は3-キノリンカルボニルとおよそ同じかそれよりも短い長さを有 し； Xaaは芳香族アミノ酸残基であり； NCy1はアミンを含有する５員環基または６員環基であって、該環基の窒素原子 が、該環内部にあって、該Xaaのα-カルボキシルとアミド結合を形成する、ペプ チト。 １９．前記Ｙが存在しない、請求項１８に記載のペプチド。 ２０．前記Xaaが、フェニルアラニル、トリプトフィルおよびチロシルからな る群から選択される、請求項１８に記載のペプチド。 ２１．前記Ar-Y-C(O)-が、ベンゾイル、フェニルアセチル、3-ピリジンカルボ ニル、4-ピリジンカルボニル、3-ピリジンアセチル、フェノキシカルボニル、ア ニリノカルボニル、ピラゾールカルボニル、トリプトフィル、および3,4-ジヒド ロキシベンゾイル基からなる群から選択される置換基である、請求項１８に記載 のペプチド。 ２２．前記NCy1が、モルホリンアミド、チオモルホリンアミド、4-(チアジオ キソ)ピペリジンアミド、ピペリダミド、置換基がヒドロキシ、カルバミル、お よびカルボキシルからなる群から選択される4-置換ピペリジンアミド、L-2-(カ ルボキシアミド)ピロリジンアミド、D-2-(カルボキシアミド)-ピロリジンアミド 、ピロリジンアミド、3,4-ジヒドロキシ-ピロリジンアミド、2-(ヒドロキシメチ ル)ピロリジンアミド、ピペラジンアミド、ならびに置換基がカルボキシメチル 、カルボキシアミドメチル、(5-ヒドロキシエチレンオキシ-エチレン)およびp- トルエンスルホンアミド基から選択される4-置換ピペラジンアミドからなる群か ら選択される、請求項１８に記載のペプチド。 ２３．前記Ar-Y-C(O)-が前記Leuの窒素原子と一緒にフタルイミド基を形成す る、請求項２２に記載のペプチド。 ２４．以下の式のペプチドであって、 フェニルアセチル-Leu-Asp-Phe-NCy3 ここで、NCy3は、モルホリンアミド、チオモルホリンアミド、4-(チアジオキ ソ)ピペリジンアミド、D-2-(カルボキシアミド)-ピロリジンアミド、ピペリジン アミド、置換基がヒドロキシ、カルバミル、およびカルボキシルからなる群から 選択される4-置換ピペリジンアミド、ピペラジンアミド、ならびに置換基がカル ボキシメチル、カルボキシアミドメチル、(5-ヒドロキシエチレンオキシ-エチレ ン)、p-トルエンスルホンアミドおよびピロリジンアミド基から選択される4-置 換ピペラジンアミドからなる群から選択される、ペプチド。 ２５．フィブロネクチンCS-1/VLA-4仲介炎症を治療するプロセスであって、該 方法が該炎症を有する哺乳動物に以下の式の炎症減少量のペプチドを投与する工 程を含有するプロセスであり、 X-Leu-Asp-Z ここで、 ＸはLeuの窒素原子にアミド結合する基であって、該基は０〜約２のメチレン 基の長さを有するスペーサを介して該アミド結合のカルボニル炭素に結合した環 構造を有し、該Ｘの長さ（該スペーサーおよびカルボニル炭素を含む）は3-キノ リンカルボニルとおよそ同じ長さであるかそれよりも短く、該環構造は５員環お よび６員環または縮合した６,６員環または縮合した６,５員環であり；そして Ｚは以下の(a)および(b)からなる群から選択され； (a) Xaa-NCy1、ここでXaaはVal、Ile、Leuまたは１または２の縮合した芳香 族環を含有する側鎖を有するアミノ酸残基であって、そしてNCy1は該Xaaのα-カ ルボキシル基とアミド結合を形成する環上窒素原子を有する環含有基であって、 該環は該環上窒素原子を含めて５または６の原子を含有する環含有基である、Xa a-NCy1；および (b) NCy2、ここで該窒素は環基のアミン置換基であって、該環基の窒素原子 が該Aspのα-カルボキシル基とアミド結合を形成し、該アミン置換基は６員環ま たは７員環に、もしくは縮合した６,６員環ラクタム環系または縮合した６,７員 環ラクタム環系に結合しており、該環系において該アミン置換基を有する環は飽 和され、該ラクタムのカルボニル基のα位に該アミン置換基を含有する、NCy2； 該式Ｉのペプチドは、7.2〜7.4のpH値の水性緩衝液中でのインビトロアッセイ において、配列番号３のペプチドによって示される該結合における該阻害よりも 約10倍〜約3000倍の程度に、Jurkat細胞(ATCC TIB 152)の、配列番号１の固相結 合ペプチドへの結合を阻害する、プロセス。 ２６．前記CS-1仲介炎症が喘息である、請求項２５に記載のプロセス。 ２７．前記投与が吸入による、請求項２６に記載のプロセス。 ２８．前記投与が非経口である、請求項２５に記載のプロセス。 ２９．前記CS-1仲介炎症が慢性関節リウマチまたは変形性関節症である、請求 項２５に記載のプロセス。 ３０．前記CS-1仲介炎症が移植片拒絶である、請求項２５に記載のプロセス。 ３１．前記CS-1仲介炎症が皮膚炎である、請求項２５に記載のプロセス。 ３２．前記CS-1仲介炎症が中枢神経系脱髄疾患である、請求項２５に記載のプ ロセス。 ３３．薬学的に受容可能な希釈液中で溶解または分散したペプチドの、炎症減 少量を含有する薬学的組成物であって、該ペプチドは以下の式を有し、 X-Leu-Asp-Z ここで、 ＸはLeuの窒素原子にアミド結合する基であって、該基は０〜約２のメチレン 基の長さを有するスペーサを介して該アミド結合のカルボニル炭素に結合した環 構造を有し、該Ｘの長さ（該スペーサーおよびカルボニル炭素を含む）は3-キノ リンカルボニルとおよそ同じ長さであるかそれよりも短く、該環構造は５員環お よび６員環または縮合した６,６員環または縮合した６,５員環であり；そして Ｚは以下の(a)および(b)からなる群から選択され； (a) Xaa-NCy1、ここで該XaaはVal、Ile、Leuまたは１または２の縮合した芳 香族環を含有する側鎖を有する芳香族アミノ酸残基であって、そしてNCy1は該Xa aのα-カルボキシル基とアミド結合を形成する環上窒素原子を有する環含有基で あって、該環が該環上窒素原子を含めて５または６の原子を含有する環含有基で ある、Xaa-NCy1；および (b) NCy2、ここで該窒素は環基のアミン置換基であって、該環基の窒素原子 が該Aspのα-カルボキシル基とアミド結合を形成し、該アミン置換基は６員環ま たは７員環に、もしくは縮合した６,６員環ラクタム環系または縮合した６,７員 環ラクタム環系に結合しており、該環系において該アミン置換基を有する環は飽 和され、該ラクタムのカルボニル基のα位に該アミン置換基を含有する、NCy2； 該式Ｉのペプチドは、7.2〜7.4のpH値の水性緩衝液中でのインビトロアッセイ において、配列番号３のペプチドによって示される該結合における阻害よりも約 10倍〜約3000倍の程度に、Jurkat細胞(ATCC TIB 152)の配列番号１の固相結合ペ プチドへの結合を阻害する、薬学的組成物。 ３４．前記Ｘ基の環構造が芳香環を含有する、請求項３３に記載の薬学的組成 物。 ３５．前記ＺがXaa-NCy1である、請求項３３に記載の薬学的組成物。 ３６．前記Ｚが、Xaa-NCy1であって、そしてXaaがその側鎖が１または２の縮 合した芳香環を有するアミノ酸残基である、請求項３３に記載の薬学的組成物。 ３７．前記Ｘが以下の式を有する、請求項３６に記載の薬学的組成物であって 、 Ar-Y-C(CO)- ここで、 Arは、ピラゾリル、フェニル、ピリジル、または3-キノリニルであり； Ｙは存在しない、もしくは-CH2-、-CH(NH)-、-O-、または-NH-であるスペーサ ーであり； もしくはAr-Y-C(O)-は前記Leuの窒素原子と一緒に、フタルイミド、1,2,3,4- テトラヒドロキナゾリン-2,4-ジオン-3-イルまたは5-フェニルダントイン-3-イ ル基を形成し、そして 該Ar-Y-C(O)-は、3-キノリンカルボニルとおよそ同じかそれよりも短い長さを 有する、薬学的組成物。 ３８．前記Ar-Y-C(O)-がフェニルアセチルであり、前記XaaがPheであり、そし て前記NCy1が、モルホリンアミド、チオモルホリンアミド、4-(チアジオキソ)ピ ペリジンアミド、D-2-(カルボキシアミド)-ピロリジンアミド、ピペリジンアミ ド、置換基がヒドロキシ、カルバミルおよびカルボキシルからなる群から選択さ れる4-置換ピペリジンアミド、ピペラジンアミド、および置換基がカルボキシ メチル、カルボキシアミドメチル、(5-ヒドロキシエチレンオキシ-エチレン)、p -トルエンスルホンアミド、およびピロリジンアミド基から選択される4-置換ピ ペラジンアミドからなる群から選択される、請求項３７に記載の薬学的組成物。
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