JPH09509562A

JPH09509562A - 新規なタンパク質／ポリペプチド及びコトランスフェクションプラスミド並びにその組換え生キャリヤー

Info

Publication number: JPH09509562A
Application number: JP7508961A
Authority: JP
Inventors: ミッシェルビューブロ; ワナメイカーカテリーヌド; ディディエールコロー; サランビアンフィリップルー
Original assignee: ソルヴェイ
Priority date: 1993-09-16
Filing date: 1994-09-07
Publication date: 1997-09-30
Also published as: GB2282601A; BR9407507A; EP0720654A1; WO1995007987A2; GB2316681A; ZA946887B; WO1995007987A3; AU7615894A; NO961086L; GB2282601B; GB2316681B; GB9319212D0; CA2171869A1; NO961086D0; KR960705047A; GB9722558D0

Abstract

(57)【要約】コロナウイルス用のワクチン中の製剤化に有益である抗原活性タンパク質が開示される。抗原活性タンパク質はＳタンパク質及びSMタンパク質と称されるコロナウイルスタンパク質である。Ｓタンパク質は、ADE を誘発することを避けるように、そのA1抗原領域、A2抗原領域及び／またはＤ抗原領域が修飾され、それから欠失され、または不在である。また、Ｓタンパク質のシグナルペプチドが修飾または欠失されていてもよい。これらの抗原活性タンパク質をコードするＤＮＡコード配列の調製方法、並びにコロナウイルス感染に対し哺乳類を保護するための組換え生キャリヤーを含む医薬上許されるキャリヤー中のタンパク質またはそれをコードするＤＮＡ配列の製剤化方法が開示される。本明細書に開示された抗原活性タンパク質及びワクチンは特にFIP に関するものであり、FIPV感染に対しネコ科を保護する。

Description

【発明の詳細な説明】新規なタンパク質／ポリペプチド及びコトランスフェクションプラスミド並びにその組換え生キャリヤー本発明はコロナウイルス、特に、ネコの感染性腹膜炎ウイルスに対しネコ（ネコ科）の免疫を刺激することができるように抗原活性であるタンパク質／ポリペプチド、このような抗原活性タンパク質／ポリペプチドをコードする塩基配列の調製及びクローニング、このような抗原活性タンパク質／ポリペプチドをコードする塩基配列を有するコトランスフェクションベクター、このような抗原活性タンパク質／ペプチドを発現するための組換え生キャリヤー、並びにこのような組換え生キャリヤーを有するワクチンに関する。ネコ科の感染性腹膜炎(FIP)は通常致死性の感染性ネコ科疾患である。FIP はネコ科の感染性腹膜炎ウイルス(FIPV)として知られているコロナウイルスによりひき起こされる。感染は二つの経路、即ち、子宮内伝染、及び経口／鼻口摂取の一つにより起こる。 FIPVはウイルスのコロナウイルス科ファミリーに属する。コロナウイルス科ファミリーのゲノムプラスストランドＲＮＡは約27〜31キロ塩基対(kbp)であり、それをＲＮＡウイルスの中で最大にする。ファミリーのその他の員の中で、ネコ科の腸炎コロナウイルス(FECV)が最も密接に関係する。コロナウイルスは脂質含有エンベロープにより包まれるらせん状ヌクレオキャプシドを有する球形粒子である。これらのウイルスは、ここに関係する４種のタンパク質を含む。これらのタンパク質はヌクレオキャプシド(N)タンパク質（これはサイズが約40〜50K(キロダルトン)である）；スパイク(S)タンパク質として知られている膜タンパク質（これはサイズが約180 〜200Kである）；マトリックス(M)タンパク質として知られている膜タンパク質（これはサイズが約25〜30K である）；及び小膜(SM)タンパク質として知られているその他の膜タンパク質（これはサイズが約10K である）である。コロナウイルス、特にFIP に対するワクチンを開発するのに試みられた古典的アプローチとして、弱毒化生FIPV及び異種生コロナウイルスによる予防接種が挙げられる。しかしながら、このようなワクチンの使用により得られた体液性抗体は殆ど有効ではないことが判明した。実際に、初期感染の結果としてFIPVに対し抗体を発生したネコ科はしばしば臨床上の現象及び病変を極めて早く発生し、こうして治療されなかったネコ科よりも（“早死に”症候群として知られている現象において）極めて短い期間にわたって感染の発症を乗り切るであろう。 “早死に”症候群は、おそらく、抗体依存性強化(ADE)として知られている現象の結果である。この現象はヘルペスウイルス科、ポックスウイルス科、ラブドウイルス科、フラビウイルス科、アルファウイルス科、レオウイルス科及びバンヤウイルス科中のカウンターパートを見出す。この現象はマクロファージのFc受容体へのウイルス抗体複合体の結合に基いていると考えられる。試験管内で、ネコ科マクロファージ感染性のADE は３成分複合体：ウイルス／抗ウイルス抗体／マクロファージフラグメントｃ受容体(FcR)の形成を伴うことが実証された。このような結合は抗体の仲介なしにマクロファージとウイルスの結合よりも有効であると言われている。その結果は、ウイルスが複合体形成されていない形態で結合する時よりもウイルスが複合体形成された形態で結合する時に、感染が更に迅速かつ有効に起こることである。この複合体はマクロファージによるウイルスの摂取及びその更なる複製を強化し、FIP のADE の生体内の媒介を示唆する。その後、これらのマクロファージはネコ科中のウイルスの播種のベクターのように挙動する。デュファー・インターナショナル・リサーチ名義の欧州特許出願第411,684 号明細書は、抗原がFIPVのＭタンパク質またはＮタンパク質により構成される組換えワクチンを開示している。ワクチンはタンパク質を適当なキャリヤーにカップリングすることにより調製される。種々の好適な組換え生キャリヤーの使用がまたその中に開示されている。デュファー・インターナショナル・リサーチ名義の欧州特許出願第264,979 号明細書は、抗原がＳタンパク質またはその或る種のフラグメントにより構成されるFIPV用の組換えワクチンを開示している。ワクチンは適当なキャリヤーにカップリングされているＳタンパク質またはそのフラグメントで調製される。組換え生キャリヤーの使用がまた開示されている。 PCT 特許出願第92/08487号明細書はこのウイルスにより導入された組換えワクチン中のFIPV Sタンパク質の使用を開示している。欧州特許出願第510,773 号明細書は、イヌのコロナウイルスのＳタンパク質の少なくとも一種の抗原決定基を有するポリペプチドをその中に含むイヌのコロナウイルス用のワクチンを開示している。そのイヌのコロナウイルスワクチンがまた感染性腹膜炎に対しネコを保護することがその中に記載されている。欧州特許出願第310,362 号明細書は、温度感受性FIP ウイルス、そのウイルスを含むワクチン及びFIP 感染に対しネコ科を免疫感作することにおけるその使用を開示している。そのワクチンは特定の無病原体のネコに部分的な保護を与える。不運なことに、コロナウイルス科ファミリーにおける高率の突然変異及び自然組換えはワクチンとしてのこのような突然変異FIVP株の使用のリスクに相当する。コロナウイルス、特にFIVPに対しネコ（ネコ科）の免疫を刺激するタンパク質／ポリペプチドの如き新規な抗原活性薬剤に対する要望がある。更に、その疾患に対し哺乳類（例えば、ネコ科）を保護することができるとともに抗体依存性強化の現象を避けるワクチン（組換え生キャリヤーを有するワクチンを含む）中のこのようなタンパク質／ポリペプチドを提供することにつき要望がある。本発明の主目的は、コロナウイルス、特にFIPVに対し抗原活性である新規なタンパク質／ポリペプチドを同定し、提供することである。本発明の別の主目的は、抗体依存性強化を生じることができるその領域がADE 不活性であり、それにより抗体依存性強化を避けるように修飾され、またはそれから欠失されるように修飾されたこのようなタンパク質／ポリペプチドを提供することである。本発明の別の主目的は、新規な抗原活性タンパク質／ポリペプチドをコードする塩基配列を決定し、提供し、かつこれをクローン化して抗原活性タンパク質／ポリペプチドを提供することである。本発明の更に別の主目的は、本発明のタンパク質／ポリペプチドを含む抗原活性タンパク質／ポリペプチドの発現に有益なプラスミド（コトランスフェクション及び発現プラスミド）を調製し、提供することである。本発明の更に別の主目的は、組換え生キャリヤー(LRC)の調製に有益なプラスミド（コトランスフェクションプラスミド）を調製し、提供することである。本発明の更に別の主目的は、本発明の新規な抗原活性タンパク質／ポリペプチドを含む抗原活性タンパク質／ポリペプチドをコードする塩基配列を含むコトランスフェクションプラスミドを提供することであり、そのコトランスフェクションプラスミドは標的動物中で生体内で抗原活性タンパク質／ポリペプチドを発現することができる組換え生キャリヤーを生成するようにFHV-1 DNA の如きウイルスＤＮＡによるコトランスフェクションに使用し得る。本発明の更に別の目的は、標的動物中で生体内で本発明の抗原活性タンパク質／ポリペプチドを含む種々の抗原活性タンパク質／ポリペプチドを発現ための組換え生キャリヤーを提供することである。本発明の更に別の主目的は、コロナウイルスに対する哺乳類の保護、特にFIPV に対するネコ科の保護のためのワクチンにこのような抗原活性タンパク質／ポリペプチドを製剤化することである。本発明の特別な目的は、その一部として組換え生キャリヤーを含む、コロナウイルスに対する哺乳類の保護、特にFIPVに対するネコ科の保護のためのこのようなワクチンを提供することである。本発明の教示によれば、新規なタンパク質／ポリペプチドが本明細書に開示される。これらのタンパク質／ポリペプチドは、ADE を誘発しないでコロナウイルス（例えば、FIPV）に対し哺乳類（例えば、ネコ科）を保護するために抗原活性である。本明細書に開示されたタンパク質として、修飾コロナウイルスＳタンパク質［本発明者らがADE を誘発すると考える領域（フラグメント）を含み得るその或る領域（フラグメント）が修飾され、かつ／またはそれから欠失されて不在であるタンパク質］が挙げられる。種々のこれらの修飾コロナウイルスＳタンパク質は、A1抗原領域、A2抗原領域またはＤ抗原領域の少なくとも一つが修飾され（ADE 不活性であるように）、またはそれから除去（欠失）され、その結果、前記領域はADE 不活性である。一つの実施態様において、修飾コロナウイルスＳタンパク質は、A1抗原領域またはA2抗原領域が修飾され、またはそれから除去され、その結果、前記領域はADE 不活性である。別の実施態様において、修飾コロナウイルスＳタンパク質は、A1抗原領域及びＤ抗原領域が修飾され、またはそれから除去され、その結果、前記領域はADE 不活性である。更に別の実施態様において、修飾コロナウイルスＳタンパク質は、A2抗原領域及びＤ抗原領域が修飾され、またはそれから除去され、その結果、前記領域はADE 不活性である。本発明の修飾コロナウイルスＳタンパク質は、A1抗原領域、A2抗原領域及びＤ抗原領域が修飾され、またはそれから除去されていることが最も好ましく、その結果、前記領域はADE 不活性である。このようなタンパク質／ポリペプチドは本明細書中で時々一般に“ADE-エピトープ欠失Ｓタンパク質”と称される。本発明の修飾コロナウイルスタンパク質は修飾Ｓタンパク質であることが好ましい。これに関して、修飾FIPV Sタンパク質が最も好ましく、この場合、A1抗原領域、A2抗原領域またはＤ抗原領域の少なくとも一つが修飾され、またはそれから除去されており、その結果、前記修飾領域はADE 不活性である。 “抗原活性”という用語は、言及される物質または物体（例えば、タンパク質及び／またはポリペプチド、及び／またはその部分（これは一種以上のエピトープを含む）が宿主の免疫系を誘導または刺激して体液性及び／または細胞性の抗原特異性応答（例えば、FIPVまたはFHV-1 に対する）を生じることを意味する。 “一つ以上の抗原領域”という用語は、例えば、宿主の免疫系を誘導または刺激して体液性及び／または細胞性の抗原特異性応答（例えば、FIPVまたはFHV-1 に対する）を生じるタンパク質／ポリペプチドのアミノ酸配列（一種以上のエピトープを含む）を意味する。 “抗原”という用語は、宿主の免疫系を刺激して体液性及び／または細胞性の抗原特異性応答を生じる一種以上のエピトープを有する分子（例えば、タンパク質／ポリペプチド）を意味する。 “ADE 不活性”という用語は、言及される物質または物体（例えば、修飾タンパク質及び／またはポリペプチド及び／または修飾タンパク質及び／またはポリペプチドの領域）が抗体依存性強化(ADE)を誘発しないことを意味する。本明細書に使用されるこの用語は、依然として抗原活性であってもよく、またそうでなくてもよい物質または物体を表し得る。本明細書に使用されるこの用語は、ADE- エピトープ（A1抗原領域及び／またはA2抗原領域及び／またはＤ抗原領域の）が修飾され、またはそれから除去されており、その結果、このような領域がADE を誘発しないＳタンパク質の一つ以上の領域を特に表す。 “エピトープ”という用語は、特定の抗体分子が結合する抗原の部位を表す。また、本発明の新規な抗原活性タンパク質として、Ｓタンパク質がそのシグナルペプチドをそれから（例えば、開裂により）除去された修飾コロナウイルスＳタンパク質が挙げられる。このようなタンパク質／ポリペプチドは本明細書中“ 欠失Ｓタンパク質”及び“del S タンパク質”と種々に称される。このような修飾コロナウイルスＳタンパク質は修飾FIPV Sタンパク質であることが好ましい。更に、本発明の新規な抗原活性タンパク質として、図１のアミノ酸配列と実質的に相同であるアミノ酸配列を有する実質的に純粋なコロナウイルスSMタンパク質が挙げられる。特に、新規な抗原活性タンパク質として、実質的に純粋なFIPV SM タンパク質が挙げられる。本発明の組換え生キャリヤー及びワクチンに使用される好ましい抗原活性タンパク質（先に説明した修飾コロナウイルスＳタンパク質及びコロナウイルスSMタンパク質に加えて、コロナウイルスＳタンパク質及びコロナウイルスＭタンパク質を含む）は全てFIPVの核酸配列から誘導される。本発明のSMタンパク質及びＭタンパク質はプラスミドB12 のFIPV核酸配列から誘導され、またＳ（スパイク）タンパク質はpUCE2 のFIPV核酸配列から誘導されることが好ましい。本明細書に使用される“から誘導される”という用語は、タンパク質／ポリペプチドのアミノ酸配列及びそれらをコードする核酸配列に関して使用される時に、言及されるアミノ酸配列及びヌクレオチド配列（その修飾の前）がそれらが誘導されると同定される特別なタンパク質／ポリペプチド及び／または微生物（例えば、FIPV及び／またはFHV-1)に自生であることを意味する。本明細書に使用される“Ｍタンパク質”という用語は、欧州特許出願第411,68 4号明細書においてＭタンパク質と称される同タンパク質を表すのに使用される。完全アミノ酸配列だけでなく、それをコードする完全ヌクレオチド配列がまた欧州特許出願第411,684 号明細書に開示されており、その開示の全てが参考として本明細書に含まれる。本明細書に使用される“SMタンパク質”という用語は、その単離クローニング及び構造が本明細書に記載されているFIPVの新規な小膜タンパク質を表す。この SMタンパク質の完全アミノ酸配列（配列番号３）、それをコードする完全ヌクレオチド配列（配列番号１）、及びアミノ酸（配列番号２）へのその核酸配列の翻訳が図１に示される。本明細書に使用される“Ｓタンパク質”という用語は、欧州特許出願第264,97 9 号明細書においてＳタンパク質と称される同タンパク質を表すのに使用される。完全アミノ酸配列だけでなく、それをコードする完全ヌクレオチド配列がまた欧州特許出願第264,979 号明細書に記載されている。Ｓ遺伝子のコード配列はその中に表示されたような位置367-369 のATG コドンで開始し、その中に表示されたような位置4723-4725 の終止コドンで終止する。こうして、Ｓ遺伝子のコード部分は4356塩基対を含み、かつ1452アミノ酸のタンパク質をコードする。その欧州特許出願の全てが参考として本明細書に含まれる。本明細書に使用される“A1抗原領域”という用語は、位置1963-1965 のGCT コドン〜位置2029-2031 のCTA コドンで開始する欧州特許出願第264,979 号明細書に表示されたようなFIPV Sタンパク質の塩基配列によりコードされたアミノ酸残基を表すのに使用される。本明細書に使用される“A2抗原領域”という用語は、位置2116-2118 のACT コドン〜位置2176-2178 のGCT コドンで開始する欧州特許出願第264,979 号明細書に表示されたようなFIPV Sタンパク質の塩基配列によりコードされたアミノ酸残基を表すのに使用される。本明細書に使用される“Ｄ抗原領域”という用語は、位置1489-1491 のTCA コドン〜位置1570-1572 のTAC コドンで開始する欧州特許出願第264,979 号明細書に表示されたようなFIPV Sタンパク質の塩基配列によりコードされたアミノ酸残基を表すのに使用される。本明細書に使用される“ADE-エピトープ欠失Ｓタンパク質”という用語は、そのA1抗原領域、A2抗原領域及び／またはＤ抗原領域の少なくとも一つが修飾、欠失またはそれから不在であり、その結果、このような領域がADE 不活性であるようなＳタンパク質を表すのに使用される。本明細書に使用される“delSタンパク質”という用語は、欧州特許出願第264, 979 号明細書に表示されたようなFIPV Sタンパク質の塩基配列（その中に表示されたように位置367-369 のATG コドンで開始し、そしてその中に表示されたように位置4723-4725 の終止コドンで終止する）によりコードされるが、位置370-37 2 のATT コドン〜位置421-423 のAGT コドン（を含む）で開始するアミノ酸配列がそれから欠失されたアミノ酸残基を表すのに使用される。これに関して、delS タンパク質はＳタンパク質と同じであるが、そのシグナル配列を含まないことが注目される。本明細書に使用される“ADE-エピトープ欠失”という用語は一般に抗体依存性強化(ADE)を生じ得るその少なくとも一つのエピトープが修飾され、またはそれから欠失され、その結果、前記エピトープがADE 不活性であるタンパク質（ADE- エピトープ欠失Ｓタンパク質を含む）を表すのに使用される。本発明が関するタンパク質は夫々抗原活性であるが、ADE を誘発しない少なくとも一つの領域を更に有する。本発明のタンパク質／ポリペプチドは、ペプチド及びタンパク質の調製につき知られている通常の方法に従って調製し得る。このような方法として、個々のアミノ酸または小さいペプチドフラグメントから開始する既知の技術によるその合成調製が挙げられる。また、抗原活性の一種以上のタンパク質／一種以上のポリペプチドは、例えば、 a)本発明の抗原活性タンパク質／ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する適当な（即ち、発現）ベクターによる宿主細胞の形質転換； b)抗原活性タンパク質／ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を発現し； c)細胞培養物を回収し、そして d)発現された抗原活性タンパク質／ポリペプチドを単離することにより組換えＤＮＡ技術及び発現系を使用して生合成により得られてもよい。それ故また、本発明は本発明の抗原活性（コロナウイルスに対し）の一種以上の修飾Ｓタンパク質／ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子の調製方法に関する。このような方法は、 a)所望のコロナウイルスＳタンパク質（例えば、FIPV Sタンパク質）をコードする発現カセットを単離する工程； b)修飾または欠失されることが所望されるＳタンパク質の関係する一つ以上の領域（即ち、少なくとも一つの抗原領域）をコードするヌクレオチド塩基配列の位置を決定する工程；及び c)関係する少なくとも一つの領域をコードするヌクレオチド塩基配列を修飾または欠失する工程を含む。好ましい実施態様において、関係する一つ以上の領域はＳタンパク質のシグナルペプチド配列である。その実施態様において、シグナルペプチド配列をコードするヌクレオチド塩基配列がそれから欠失され、その結果、シグナルペプチドはヌクレオチド配列によりコードされない。別の好ましい実施態様において、関係する一つ以上の領域は抗原領域の少なくとも一つである。これらの実施態様において、関係する抗原領域の少なくとも一つをコードするヌクレオチド塩基配列は修飾され、またはそれから欠失されており、その結果、それによりコードされたタンパク質の相当する領域はADE 不活性である。関係する一つ以上のこれらの抗原活性領域はA1抗原領域、A2抗原領域及びＤ抗原領域の少なくとも一つであることが好ましい。抗原活性領域はA1抗原領域、A2抗原領域及びＤ抗原領域の全部であることが最も好ましい。本明細書に使用される“関係するタンパク質”という用語は、場合によって発現され、かつ／または修飾され、かつ／または欠失されることが所望されるタンパク質を表す。本明細書に使用される“関係する抗原領域”という用語は、修飾され、かつ／または発現すべきタンパク質／ポリペプチドから欠失されることが所望されるこれらの抗原領域を表す。更に、本発明の教示に従って、ADE の不在下で（ADE を誘発することを避けて、またはそれを誘発しないで）コロナウイルス（例えは、FIPV）に対し哺乳類（例えば、ネコ科）を保護するのに有効であるコロナウイルスワクチン（例えば、 FIPVワクチン）が本明細書に開示される。好ましい実施態様において、ワクチンは適当なキャリヤー中に新規な抗原活性の一種以上のコロナウイルスタンパク質／一種以上のポリペプチド（コロナウイルスに対して）を含む。これらの抗原活性の一種以上のタンパク質／一種以上のポリペプチドはFIPVから誘導されることが好ましい。フラグメントが全タンパク質に代えて使用される場合、それらは当業者に公知の様式で適当な既知キャリヤーにカップリングされて使用し得る。このようなキャリヤーの例はKLH またはBS A である。ワクチンはコロナウイルスＳタンパク質を含むことが好ましい。最も好ましい実施態様において、コロナウイルスＳタンパク質は修飾コロナウイルスＳタンパク質である。これに関して、修飾コロナウイルスＳタンパク質は、ADE 不活性であるようにそのA1抗原領域、A2抗原領域またはＤ抗原領域が修飾され、またはそれから欠失されるように修飾されることが更に好ましい。また、修飾コロナウイルスＳタンパク質はシグナルペプチド配列がそれから欠失されるように修飾されることが好ましい。別の好ましい実施態様において、ワクチンは本発明の新規なコロナウイルスSM タンパク質またはコロナウイルスＭタンパク質を含む。所望により、ワクチンは上記の抗原活性コロナウイルスタンパク質／ポリペプチドの２種以上のあらゆる組み合わせを含んでいてもよい。別の好ましい実施態様において、ワクチンは組換え生キャリヤーを含むように製剤化され、それによりそれを必要とする宿主生物中の生体内の抗原活性の一種以上のタンパク質／一種以上のポリペプチドの発現が得られる。これに関して、上記のようにして得られたＤＮＡ分子が発現ベクターにそれ自体既知の様式で挿入されてもよく、その結果、組換え発現ベクターが生成される。次いでこのベクターが、例えば、形質転換またはコトランスフェクションにより適当な宿主細胞に挿入し得る。本明細書に開示されたワクチンは、生き残る宿主細胞及び／または宿主生物中で前記の一種以上のペプチドまたは一種以上のタンパク質を発現することができるワクチンを生産する目的で組換え生キャリヤー(LRC)にとり込まれた本発明の抗原活性の一種以上のタンパク質／一種以上のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列（分子）を含むことが特に好ましい。このようにして、本発明の抗原活性の一種以上のタンパク質／一種以上のポリペプチドが標的動物中で生体内で発現される。この目的のために、SMタンパク質及び／または修飾Ｓタンパク質（またはその部分）をコードするヌクレオチド塩基配列が組換え生キャリヤー(LRC)にとり込まれてもよい。このような適当なLRC の例はワクシニアLRC、ヘルペスLRC、アデノLRC、アデノ関連LRC、シンドビス(sindbis)LRC、コロナLRC 及び細菌LRC である。本発明の更に別の教示に従って、FHV-1 を含む組換え生キャリヤーが本明細書に開示され、そのゲノムは修飾コロナウイルスＳタンパク質をコードするＤＮＡ配列を有し、A1抗原領域、A2抗原領域またはＤ抗原領域をコードする少なくとも一つのＤＮＡ配列は修飾され、またはそれから除去され、その結果、それによりコードされたタンパク質の前記領域はADE 不活性である。この組換え生キャリヤーにおいて、A1抗原領域、A2抗原領域及びＤ抗原領域をコードするＤＮＡ配列は全て修飾され、またはそれから除去されていることが好ましく、その結果、それによりコードされた修飾Ｓタンパク質の前記A1抗原領域、A2抗原領域及びＤ抗原領域は全てADE 不活性である。修飾コロナウイルスＳタンパク質は修飾FIPVS タンパク質であることが更に好ましい。本発明の教示に更に従って、ゲノムが修飾コロナウイルスＳタンパク質、更に好ましくは、シグナルペプチドが修飾され、またはそれから除去された修飾FIPV S タンパク質をコードするＤＮＡ配列を有するFHV-1 を含む組換え生キャリヤーがまた本明細書に開示される。本発明の教示に更に従って、ゲノムがコロナウイルスSMタンパク質、更に特別にはFIPV SM タンパク質をコードするＤＮＡ配列を有するFHV-1 を含む組換え生キャリヤーがまた本明細書に開示される。この様式において、組換え生キャリヤーはコロナウイルスSMタンパク質を発現する。本発明の更に別の教示に更に従って、ゲノムがコロナウイルスＭタンパク質、更に好ましくはFIPV Mタンパク質をコードするＤＮＡ配列を有するFHV-1 を含む組換え生キャリヤーが本明細書に開示される。この様式において、組換え生キャリヤーはコロナウイルスSMタンパク質を発現する。本発明の別の局面において、標的哺乳類中の関係する少なくとも一種のタンパク質／ポリペプチドの生体内発現のための組換え生キャリヤーが開示される。この組換え生キャリヤーはウイルス株を含む。この組換え生キャリヤーは、ウイルス株のゲノムにとり込まれたRSV またはHCMV及びSV40から誘導されたＤＮＡ発現配列（シグナル）を更に有する。最後に、この組換え生キャリヤーは、関係するタンパク質が組換え生キャリヤーにより発現されるために、ウイルス株のゲノムにまたとり込まれた関係するタンパク質（例えば、コロナウイルスタンパク質）をコードするヌクレオチドコード配列を更に有する。ウイルス株はFHV-1 であることが好ましく、またヌクレオチドコード配列が抗原活性コロナウイルスタンパク質をコードすることが好ましい。これに関して、更に本発明は生き残りの宿主細胞及び／または宿主生物（動物）中で関係するタンパク質／ポリペプチドを発現することができる組換え生キャリヤーの生産のためのウイルスＤＮＡ（例えば、FHV-1 のＤＮＡ）によるコトランスフェクションに有益なコトランスフェクションベクターを含む。本発明の教示に更に従って、ウイルスＤＮＡによるコトランスフェクションのためのコトランスフェクションプラスミドが本明細書に開示される。このコトランスフェクションプラスミドはウイルスゲノム中で挿入部位に隣接するＤＮＡ配列（隣接配列）の部分を少なくとも含む。更に、このコトランスフェクションプラスミドはRSV またはHCMV及びSV40から誘導された発現配列（シグナル）を含む。最後に、このコトランスフェクションプラスミドは、このコトランスフェクションプラスミドを使用して生産される組換え生キャリヤーにより発現される関係するタンパク質のコード配列を有する。関係するタンパク質はFIPVタンパク質であることが好ましい。これらの発現配列（シグナル）及びコード配列は互いに操作により結合されることが好ましい。 “挿入部位”という用語は、関係するタンパク質／ポリペプチド（例えば、コロナウイルスタンパク質）をコードするヌクレオチド配列を少なくとも含むヌクレオチド配列が挿入されるウイルスゲノムのその部位を意味する。 “隣接配列”という用語は、挿入部位に隣接して下流及び上流に配置されるヌクレオチド配列の部分を表す。隣接配列のとり込みは、コトランスフェクションプラスミドがそれでコトランスフェクトされるウイルスＤＮＡ(FHV-1)と成功して組換えることを可能にする。これに関して、ウイルスＤＮＡ（コトランスフェクトされる）及びコトランスフェクションプラスミドの隣接配列がFHV-1 ＤＮＡから誘導されることが更に好ましい。隣接配列は、それでトランスフェクトされるウイルス株(即ち、FHV-1)のチミジンキナーゼ遺伝子から誘導されたヌクレオチド配列を含むことが最も好ましい。関係するタンパク質／ポリペプチドは抗原活性コロナウイルスタンパク質／ポリペプチド、更に特別には抗原活性FIPVタンパク質／ポリペプチドであることが好ましい。好ましいコトランスフェクションプラスミドにおいて、関係するタンパク質のコード配列は修飾コロナウイルスＳタンパク質、更に特別には修飾FIPV Sタンパク質をコードすることが好ましい。一つの好ましい実施態様において、修飾コロナウイルスＳタンパク質（関係するタンパク質）のコード配列は、シグナルペプチドがそれから欠失された修飾コロナウイルスＳタンパク質をコードする。このような場合において、コトランスフェクションプラスミドpdTKHCMVSIG 及びpdTKSIGLAC及びpdTKRSVSSIG 並びにpd TKRSVSSIGLACが特に好ましい。別の好ましい実施態様において、修飾コロナウイルスＳタンパク質（関係するタンパク質）のコード配列は、その抗原領域の少なくとも一つが修飾され、またはそれから欠失された修飾コロナウイルスＳタンパク質をコードし、その結果、それによりコードされたタンパク質の前記領域はADE 不活性である。これに関して、関係する好ましい抗原領域は修飾され、またはそれから欠失されたA1抗原領域、A2抗原領域またはＤ抗原領域の少なくとも一つであり、その結果、前記領域はADE 不活性である。このような場合において、コトランスフェクションプラスミドpdTKHCMVSDAD及びpdTKSDADLAC 及びpdTKRSVSDAD 並びにpdTKRSVSDADLACが特に好ましい。更に別の好ましい実施態様において、関係するタンパク質のコード配列はコロナウイルスＳタンパク質、更に好ましくはFIPV Sタンパク質をコードする。このような場合において、コトランスフェクションプラスミドpdTKHCMVS 及びpdTKSL AC及びpdTKRSMVS 並びにpdTKRSVSLAC が特に好ましい。更に別の好ましい実施態様において、関係するタンパク質のコード配列はコロナウイルスSMタンパク質、更に好ましくはFIPV SM タンパク質をコードする。このような場合において、コトランスフェクションプラスミドpdTKHCMVMS及びpdTK SMLAC 及びpdTKRSVMS 並びにpdTKRSVMSLACが特に好ましい。更に別の好ましい実施態様において、関係するタンパク質のコード配列はコロナウイルスＭタンパク質、更に好ましくはFIPV Mタンパク質をコードする。このような場合において、コトランスフェクションプラスミドpdTKHCMVM 及びpdTKML AC及びpdTKRSVM並びにpdTKRSVMLAC が特に好ましい。本発明の新規な抗原活性の一種以上のタンパク質／一種以上のポリペプチドを含む抗原活性の一種以上のタンパク質／一種以上のポリペプチドを単離、精製し、次いで精製された一種以上のタンパク質／一種以上のポリペプチドを医薬上許されるキャリヤー中で製剤化することによる本発明のワクチンの調製方法が本明細書に更に開示されている。本発明の抗原活性の一種以上のタンパク質／一種以上のポリペプチドを含む所望の抗原活性の一種以上のタンパク質／一種以上のポリペプチドをコードするＤＮＡヌクレオチド塩基配列を単離、精製し、次いで前記ヌクレオチド塩基配列を生キャリヤーの生産のためにウイルスＤＮＡにとり込むことを特徴とする本発明のワクチンの調製方法が本明細書に更に開示される。上記に関して、 a)抗原活性コロナウイルスタンパク質をコードするＤＮＡ配列を単離、精製する工程； b)抗原活性コロナウイルスタンパク質をコードするＤＮＡ配列を有するコトランスフェクションプラスミドを生成する工程； c)標的動物中で生体内で抗原活性コロナウイルスタンパク質を発現するために抗原活性コロナウイルスタンパク質をコードすることができる組換え生キャリヤーを生成するように、コトランスフェクションプラスミド及びFHV-1 ウイルスＤＮＡをコトランスフェクトする工程；及び d)組換え生キャリヤーを医薬上許されるキャリヤーと合わせる工程を含むコロナウイルスワクチンの調製方法が本明細書に開示される。更に、上記に関して、 a)抗原活性であるFIPV Sタンパク質をコードするＤＮＡ配列を単離する工程； b)FIPV Sタンパク質のA1抗原領域、A2抗原領域またはＤ抗原領域をコードするＤＮＡ配列を修飾する工程（その結果、それによりコードされたタンパク質の前記の修飾抗原領域の少なくとも一つはADE 不活性である）； c)修飾FIPV Sタンパク質をコードするＤＮＡ配列を有するコトランスフェクションプラスミドを生成する工程； d)標的動物中で生体内で抗原活性修飾FIPV Sタンパク質を発現するために抗原活性修飾FIPV Sタンパク質をコードすることができる組換え生キャリヤーを生成するように、FHV-1 ウイルスＤＮＡをコトランスフェクションプラスミドでコトランスフェクトする工程；及び e)組換え生キャリヤーを医薬上許されるキャリヤーと合わせる工程を含むFIPVワクチンの調製方法が本明細書に更に開示される。本明細書に使用される場合、“クローン化される”、“サブクローン化される ”、“導入される”、“つながれる”、“挿入される”等の用語は、ＤＮＡフラグメントにつき言及される時に、必要な場合に、ドナー及び／または受容体ＤＮＡ配列の消化（制限）、その突出3'付着末端及び5'付着末端の処理（必要とされ、かつ／または所望される場合）、サイズ（またはヌクレオチド配列）によるこのようなフラグメントの分離及び／またはこのようなフラグメントの抽出(単離) (必要とされ、かつ／または所望される場合)、直線状にされたベクターを含むこのようなフラグメントの脱リン酸化（必要とされ、かつ／または所望される場合）及び組換え分子を生成するためのこのようなフラグメントの互いの連結反応を意味する。このような定義はこのような組換え分子による宿主細胞の形質転換、このような形質転換体の選択並びにこのような宿主細胞からの組換えＤＮＡ分子（例えば、プラスミド）の単離及び精製を更に含む。本明細書に使用される“発現カセット”という用語は、宿主中の構造遺伝子によりコードされたタンパク質／ポリペプチドの転写及び翻訳に必要とされる構造遺伝子及び発現配列を含む、ＤＮＡのこれらの領域（ヌクレオチド配列）を含む別個のＤＮＡ配列を表す。本明細書に使用される“発現配列”という用語は、宿主細胞中でコード配列の転写及び翻訳を集約的に与えるプロモーター配列、リボソーム結合部位及びポリアデニル化シグナルを集約して表す。 “プロモーター配列”という用語は、ＲＮＡポリメラーゼの結合及びコード配列の転写が起こることを可能にする構造遺伝子のコード配列（関係するタンパク質／ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列）の上流の配列を意味する。 “構造遺伝子”という用語は、ＲＮＡの合成の鋳型として利用でき、かつその宿主による関係するタンパク質の合成を可能にするヌクレオチド配列を意味する。本発明の別の局面において、本発明のコロナウイルスワクチンを調製し、それを必要とする哺乳類、特に、ネコ科に治療有効量のワクチンを投与することを特徴とするコロナウイルス感染、特に、FIPVに対する哺乳類、特に、ネコ科の免疫感作方法が本明細書に開示される。本発明の更に別の局面において、本明細書に開示されたFIPVワクチンを調製する工程、及びそれを必要とするネコ科に治療有効量のワクチンを投与する工程を含むFIPVからのネコ科の保護方法が本明細書に開示される。組換え生キャリヤーを含む本発明のワクチンの標的動物への投与は、全ての感染細胞中の本発明のSMタンパク質及び／または修飾Ｓタンパク質、及び／またはＭタンパク質及び／またはＳタンパク質を含む挿入遺伝子の発現をもたらす。図１はSMタンパク質のアミノ酸配列及びSMタンパク質をコードする相当するヌクレオチド塩基配列である。図２はpdTKの制限地図である。図３はpSV40 ポリAEの制限地図である。図４はpSV40 ポリALの制限地図である。図５はpHCMV ポリAEの制限地図である。図６はpHCMV ポリALの制限地図である。図７はpRSVポリALの制限地図である。図８はpRSVポリAEの制限地図である。図９はpSVLACE の制限地図である。図10はpHCMVLACE の制限地図である。図11はpdTKSVLAC の制限地図である。図12はpdTKCMVLACの制限地図である。図13はpHCMVMS の制限地図である。図14はpHCMVMの制限地図である。図15はpRSVMSの制限地図である。図16はpRSVM の制限地図である。図17はpdTKHCMVM の制限地図である。図18はpdTKHCMVMSの制限地図である。図19はpdTKMLACの制限地図である。図20はpdTKMSLAC の制限地図である。図21はpdTKRSVMの制限地図である。図22はpdTKRSVMS の制限地図である。図23はpdTKRSVMLAC の制限地図である。図24はpdTKRSVMSLACの制限地図である。図25はpHCMVSの制限地図である。図26はpRSVS の制限地図である。図27はpdTKHCMVS の制限地図である。図28はpdTKSLACの制限地図である。図29はpdTKRSVSの制限地図である。図30はpdTKRSVSLAC の制限地図である。図31はpHCMVSIGの制限地図である。図32はpRSVSIG の制限地図である。図33はpdTKHCMVSIG の制限地図である。図34はpdTKSIGLACの制限地図である。図35はpdTKRSVSIGの制限地図である。図36はpdTKRSVSIGLAC の制限地図である。図37はpHCMVSDAD の制限地図である。図38はpRSVSDADの制限地図である。図39はpdTKHCMVSDADの制限地図である。図40はpdTKSDADLAC の制限地図である。図41はpdTKRSVSDAD の制限地図である。図42はpdTKRSVSDADLACの制限地図である。本発明に使用されるＤＮＡクローニング及び配列決定技術及び操作は、分子クローニング--実験マニュアル、第二編、コールドスプリングハーバーラボラトリープレス(1989)においてSambrookらにより記載される技術及び操作である。本発明に使用される細胞及び組織の培養技術及び操作は、細胞及び組織の培養：実験操作、ジョンウィリイパブリッシング(1993)においてDoyle らにより記載される技術及び操作である。本発明が下記の特別な実施例を参考にして更に詳しく説明されるであろう。実施例１−ネコ科のヘルペスウイルス１(FHV-1)の増殖使用したFHV-1 ウイルス株は、(1)に記載された方法、及び(1)により開示されたパラメーターを使用してトレードマークドハイバックCHとしてソルベイデュファーにより販売された鼻内投与用の二価ネコカリチヘルペスウイルスネコ科ワクチンから単離された弱毒生ワクチン株であった。そのウイルスをクランデルネコ科腎臓(CRFK)細胞（受理番号CCL 94としてATCC に寄託された）で増殖させた。細胞を３％のCO₂を有する雰囲気中で(1)アール塩、2.2 g/l のNaHCO₃及びＬ−グルタミン（ギブコ）を含む培地199 500 ml、(2) Ｌ−グルタミン（ギブコ）を含むハムF12 500 ml、(3)ラクトアルブミン加水分解産物（ギブコ）25ml、ウシ胎児血清（ギブコ）25ml、及びフラクトース溶液(2 00g のフラクトース/lの濃度)５mlの培地中で37℃で増殖させた。次いで細胞を目視観察して約50％〜80％の細胞集密度（本明細書の実施例で使用される100％の集密度は10⁵の細胞／１cm²のプレートと定義される）で約0.01のウイルス粒子／細胞で感染させた。次いで感染されたCRFK細胞を３％のCO₂を有する雰囲気中で上記と同じ組成を有する培地中で37℃で２〜３日インキュベートした。実施例２−FHV-1 ウイルスＤＮＡの精製実施例１に上記されたようにして標本から得られたFHV-1 で感染させたCRFK細胞の上澄みを、その後、目視観察により測定して、細胞変性効果がほぼ完全である時に回収した。上澄みを最初に500G（重力）で10分間の遠心分離により清澄にした。次いで清澄にした上澄みを25000RPM（SW28ベックマンローター）で４℃で１時間にわたって遠心分離し、ウイルス粒子を含むペレットを生じた。次いでウイルス粒子を含むペレットを10mMのトリスpH7.5、１mMのEDTA、0.1％ (v/v)のノニデットP-40（シグマ）中で再度懸濁させた。次いでこの懸濁液をトリス10mM pH7.5、EDTA１mM中30％(w/v)の蔗糖のクッションに添加し、25000 RP M（SW28 ローター）で４℃で２時間にわたって遠心分離し、キャプシドペレットを生じた。次いでキャプシドペレットをトリス10mM pH8.3 、EDTA１mM、１％(w /v)のSDS(ドデシル硫酸ナトリウム)、500 μg のプロテイナーゼＫ（ベーリンガー）／懸濁液１ml中で再度懸濁させ、50℃で２時間インキュベートした。次いでウイルスＤＮＡを連続のフェノール／クロロホルム抽出及びエタノール沈殿により精製した。実施例３−FHV-1 TK領域の配列を有するpdTK中間移入プラスミドの構築 FHV-1 SalI Aフラグメントはチミジンキナーゼ(TK)遺伝子を含むことが既に報告されていた(2)。このFHV-1 SalI Aフラグメント及びそのチミジンキナーゼ遺伝子が(2)に詳細に記載されている。実施例２に上記されたようにして得られた精製FHV-1 ウイルスＤＮＡをSalIにより消化し、得られたフラグメントをコスミドpHC79(ベーリンガーカタログ番号 567795)中でクローン化した。19キロ塩基対(kbp)SalI A フラグメントを含むこのクローニングからの一種のコスミドを制限分析により同定し、その後の構築に使用した。次いで19kbp SalI Aフラグメントを含むコスミドをSalI及びBamHI で二重消化にかけ、チミジンキナーゼ遺伝子を有するSalI Aフラグメントの5.6 kbp SalI-B amHI 中間部フラグメントを単離した。次いでこの5.6 kbp SalI-BamHIフラグメントをpHC79 中でサブクローン化してコスミドpFHVA1を得た。次いでpFHVA1をSalI及びHindIII で消化にかけ、3.8 kbp SalI-HindIIIフラグメントをそれから単離した。その他のpFHVA-1 コスミドをHindIII 及びBamHI で消化にかけてpFHVA1の1.8kbp HindIII-BamHIフラグメントをそれから単離した。そのTK遺伝子を前記の3.8 kbp SalI-HindIIIフラグメントと1.8kbp HindIII-Bam HIフラグメントの間で分断した。次いで3.8 kbp SalI-HindIIIフラグメント及び 1.8kbp Hind III-BamHIフラグメントを夫々のpBSLK2プラスミド（欧州特許出願第517,292 号明細書に記載されている）中でサブクローン化して、プラスミドpT KN1(3.8kbp SalI-HindIIIフラグメントを有する）及びプラスミドpTKC1(1.8kbp HindIII-BamHI フラグメントを有する）を夫々得た。 pBSLK1（欧州特許出願第517,292 号明細書にまた記載されている）をBclIで消化し、T4 DNAポリメラーゼで処理し、次いでXbaIで消化した。次いでpTKN1 の1.5 kbp XbaI-EcoRVフラグメントを得、上記のようにして処理されたpBSLK1中でクローン化した。得られたプラスミドはpTKN2 であった。次いでpTKC1 をSmaI及びFspIで二重消化にかけて、１Kbp SmaI-FspI フラグメントをそれから単離した。次いでpdTK移入プラスミドをpTKN2(これはSmaIで既に消化されていた）のSmaI 部位への1 Kbp SmaI-FspI フラグメントの挿入により得た。pdTKの制限地図が図２を参照して見られる。 pTKN2への1 Kbp SmaI-FspI フラグメントの挿入は得られた移入プラスミドpdT Kのチミジンキナーゼ遺伝子中の約0.4 kbp 〜0.5 kbp(456 bp)中間部EcoRV-SmaI 欠失を生じた。また、pdTKはチミジンキナーゼコード配列中に導入された特異な BamHI 部位を含む。この部位を外来遺伝子の挿入に使用する。挿入部位付近の配列（配列番号４）は、である。太字のヌクレオチドはチミジンキナーゼ遺伝子配列から誘導される。ヌクレオチド座標352 及び808 は(2)により公表された配列中に記載されたのと同じヌクレオチド座標を表す。実施例４−FHV-1 gG領域の配列を有するpdgG中間移入プラスミドの構築実施例２に上記されたようにして得られた精製FHV-1 ウイルスＤＮＡをEcoRI で消化し、4.3 kbp EcoRI M フラグメント((5)により表示されている)を含む得られたフラグメントをコスミドpHC79(ベーリンガー)中でクローン化した。次いで4.3 kbp EcoRI M フラグメントを含むコスミドを制限酵素分析により同定し、その後の構築に使用した。単純ヘルペスウイルス型１(HSV-1)及びウマヘルペスウイルス-1(EHV-1)(ヌクレオチド配列はHSV-1 につき受理番号X14112、D00317及びD00374、またEHV-1 につきM86664としてゲンバンク核酸配列データバンクで入手し得る)中のgG（糖タンパク質Ｇ）相同遺伝子の位置との類似性により、FHV- １gG（FHV-1 糖タンパク質Ｇ）コード配列はこのEcoRI M フラグメントに位置されるものと推測された。次いでEcoRI M フラグメントを含むコスミドをEcoRI で消化し、4.3 kbp EcoR I-EcoRI フラグメントをそれから単離した。次いでこの4.3 kbp EcoRI-EcoRI フラグメントをpBSLK2（その構築が欧州特許出願第517,292 号明細書に記載されている）のEcoRI 部位にサブクローン化して、プラスミドpECOM を得た。次いでpE COMをEcoRI 及びSacIで二重消化にかけ、EcoRI M フラグメントの一部を含む1 k bp EcoRI-SacIフラグメントをそれから単離した。次いでこのEcoRI-SacIフラグメントを、EcoRI 及びSacIで既に消化されたプラスミドpBSLK1（実施例３を参照のこと）中でサブクローン化した。pECOMd1 と称される得られたプラスミドはEc oRI M フラグメントの一部を含んでいた。移入プラスミドpdgGを以下のようにして得た。pECOM をSacI及びAvaIで消化し、T4 DNAポリメラーゼで処理し、次いでBamHI で消化した。次いで1.1 kbp SacI -BamHI pECOM フラグメントをそれから単離した。次いでこの1.1 kbp SacI- Bam HIフラグメントをBamHI で既に消化されたプラスミドpECOMd1 中でクローン化し、T4 DNAポリメラーゼで処理し、次いでBgIII で消化した。得られたpdgG移入プラスミドは外来遺伝子の挿入のための特異なBamHI 部位を含む。この部位は、pd gGプラスミドの部分配列決定及びその他のヘルペスウイルスの公表されたgG遺伝子配列（例えば、HSV-1 につき受理番号X14112、D00317及びD00374、またEHV-1 につきM86664としてゲンバンク核酸配列データバンクで入手し得るヌクレオチド配列）との比較から演繹されるように、gG遺伝子中に配置される。実施例５−外来遺伝子の発現遺伝子を有する中間プラスミドの構築発現シグナルを有する６種の異なるプラスミド：pSV40 ポリAE、pSV40 ポリAL 、pHCMV ポリAE、pHCMV ポリAL、pRSVポリAE及びpRSVポリALを構築した。 pSV40 ポリAE及びpSV40 ポリALはシミアンウイルス40(SV40)初期プロモーター配列を含む。ポリアデニル化シグナル配列として、pSV40 ポリAEはSV40初期転写ポリアデニル化配列を含み、またpSV40 ポリALはSV40後期転写ポリアデニル化配列を含む。 pHCMV ポリAE及びpHCMV ポリALはヒトサイトメガロウイルス主要即時初期遺伝子プロモーター(HCMVIE)配列並びに夫々、SV40初期ポリアデニル化シグナル及び SV40後期ポリアデニル化シグナルを含む。 pRSVポリAE及びpRSVポリALはラウス肉腫レトロウイルス(RSV)長末端リピート( LTR)プロモーター並びに夫々、SV40初期及び後期の転写及びポリアデニル化配列を含む。 SV40配列を市販のプラスミドpSVK3(ファーマシア、カタログ番号274511)から得た。 HCMVIE配列を市販のプラスミドpOG44(ストラタゲン、カタログ番号218401)から得た。 RSV プロモーター配列を市販のプラスミドpOPI3CAT（ストラタゲン、LAC スイッチ（商標）誘導哺乳類発現系、カタログ番号217450）から得た。発現シグナルを有するプラスミドは、前記発現シグナルの制御のもとに発現されるべきである外来ペプチドをコードするコード配列のその中のその後の挿入を可能にするために、プロモーターとポリアデニル化配列の間に配置された特異な BgIII 部位を含む。これらの発現シグナル及びペプチドコード配列の両方を有する遺伝子発現カセットを、その後、BcI-BamHI フラグメントで単離し、pdTKまたはpdgGのBamHI 部位に挿入できる。 pSV40 ポリAEの詳細な説明 pSV40 ポリAEを、供給業者の推奨（バイオラドムタ−ジーンファージミド試験管内突然変異誘発キット、カタログ番号170-3581）に従って、pSVK3 ウラシル化一本鎖ＤＮＡにつき行った部位誘導突然変異誘発により構築した。下記の４種の合成プライマー（ユーロゲンテック）を使用して突然変異誘発を行った。得られたプラスミドはpSVK3mutであった。次いでpSVK3mutをBgIII で消化し、中間部の約1 kbp BgIII フラグメントをそれから除去するために自己連結して、 pSV40 ポリAEを生じた（図３を参照のこと）。プラスミド座標配列の性質及び起源 1-22 SV40配列；pSVK3 からのヌクレオチド１〜22 23-28 TGATCAリンカー配列 29-350 SV40起源及び初期プロモーター（プラスミドpSVK3 からのヌクレオチド23〜344） 351-356 AGATCTリンカー配列 357-468 SV40初期転写ポリアデニル化配列（pSVK3 からのヌクレオチド1295〜1406） 469-2981 pSVK3 からのベクター配列（ヌクレオチド1407〜3919を含む） pSV40 ポリALの詳細な説明 pSVK3mutをBgIII で消化し、中間部の約1 kbp BgIII フラグメントを反転するために自己連結して、pSVK3muti を生じた。次いでpSVK3muti をBamHI で消化し、自己連結して中間部の1 kbp 及び0.2 kbp のBamHI フラグメントをそれから除去した。得られたプラスミドはpSV40 ポリALである（図４を参照のこと）。プラスミド座標配列の性質及び起源 1-22 SV40配列（pSVK3 からのヌクレオチド１〜22） 23-28 TGATCAリンカー配列 29-350 SV40起源及び初期プロモーター（プラスミドpSVK3 からのヌクレオチド23〜344） 351-356 AGATCTリンカー配列 357-450 SV40後期転写ポリアデニル化配列（pSVK3 からのヌクレオチド1294〜1201） 451-2969 pSVK3 からのベクター配列（ヌクレオチド1401〜3919を含む） pHCMV ポリAEの詳細な説明最初に、pOG44 をAvaIで消化し、T4 DNAポリメラーゼで処理し、最後にXbaIで消化した。次いで、HCMVIE配列を含む約0.9 kbp XbaI-AvaI フラグメントを同定し、それから単離した。次いでこの0.9 kbp XbaI-AvaI フラグメントをpBSLK2（欧州特許出願第517,292 号明細書に記載されたようにして得た）のSmaI-XbaI部位にクローン化して、pHCMV を生じた。次いでウラシル化一本鎖ＤＮＡをpHCMV から調製し、下記の合成プライマーを用いる部位誘導突然変異誘発のための鋳型として使用した。得られたプラスミドはpHCMVmutであった。次いでpHCMVmutをBclI及びBgIII で消化し、約0.6 kbp BclI-BgIIIフラグメントを同定し、それから単離した。次いで0.6 kbp BclI-BgIIIフラグメントをpSV40 ポリAEからの2.6 kbp BclI-BgIIIフラグメント中でクローン化して、pHCMV ポリAEを生じた（図５を参照のこと）。プラスミド座標配列の性質及び起源 1-22 pSVK3 からのベクター配列（ヌクレオチド１〜22を含む） 23-28 TGATCAリンカー配列 29-616 ヒトサイトメガロウイルス即時初期遺伝子プロモーター配列（pOG44 からのヌクレオチド361〜948） 617-630 ヒトサイトメガロウイルス即時初期遺伝子配列（ヌクレオチド1129〜1142を含む）から得られたGTTTAGTGAACCGT（配列番号11） 631-636 AGATCTリンカー配列 637-748 SV40初期転写ポリアデニル化配列（pSVK3 からのヌクレオチド1295〜1406） 749-3261 pSVK3 からのベクター配列（ヌクレオチド1407〜3919を含む）ヒトサイトメガロウイルス即時初期遺伝子プロモーターに関する座標はEMBL核酸配列データバンクで入手できる配列、受理番号X03922を表す。 pHCMV ポリALの詳細な説明 pHCMVmutをBclI及びBgIII で消化することによりpHCMV ポリALを調製し、約0. 6 kbp BclI-BgIIIフラグメントを同定し、それから単離した。次いで0.6 kbp Bc lI-BgIIIフラグメントをpSV40 ポリALからの2.6 kbp BclI-BgIIIフラグメント中でクローン化して、pHCMV ポリALを生じた（図６を参照のこと）。プラスミド座標配列の性質及び起源 1-22 pSVK3 からのベクター配列（ヌクレオチド１〜22を含む） 23-28 TGATCAリンカー配列 29-616 ヒトサイトメガロウイルス即時初期遺伝子プロモーター配列（pOG44 からのヌクレオチド361〜948） 617-630 ヒトサイトメガロウイルス即時初期遺伝子配列（ヌクレオチド1129〜1142を含む）からのGTTTAGTGAACCGT配列 631-636 AGATCTリンカー配列 637-730 SV40後期転写ポリアデニル化配列（pSVK3 からのヌクレオチド1294〜1201） 731-3249 pSVK3 からのベクター配列（ヌクレオチド1401〜3919を含む）ヒトサイトメガロウイルス即時初期遺伝子プロモーターに関する座標はEMBL核酸配列データバンクで入手できる配列、受理番号X03922を表す。 pRSVポリALの詳細な説明 pOPI3CAT（ストラタゲン、カタログ番号217450）をBstXI で消化し、T4 DNAポリメラーゼで処理し、続いてBgIII で消化し、RSV LTR プロモーター配列を含む約0.6 kbp フラグメントを同定し、それから単離した。次いでこの0.6 kbp フラグメントを、SpeIで既に消化されたpHCMVLACE(実施例６に以下に記載されたようにして得られた)の約5.7 kbp フラグメント中にクローン化し、T4 DNAポリメラーゼで処理し、最後にBgIII で消化した。得られたプラスミドはpRSVLACEである。次いでpRSVLACEをBgIII 及びScaIで消化し、約2.2 kbp BgIII-ScaIフラグメントを同定し、それから単離した。次いでこの2.2 kbp BgIII-ScaIフラグメントを pSV40 ポリALの約1.1 kbp BgIII-ScaIフラグメント中にクローン化して、pRSVポリALを生じた（図７を参照のこと）。プラスミド座標配列の性質及び起源 1-22 SV40配列（pSVK3 からのヌクレオチド１〜22を含む） 23-28 TGATCAリンカー配列 29-50 ヒトサイトメガロウイルス即時初期遺伝子プロモーター配列（pOG44 からのヌクレオチド541 〜562を含む） 51-621 RSV プロモーター配列(pOPI3CAT からのBstXI-BgIII フラグメント） 622-715 SV40後期転写ポリアデニル化配列（pSVK3 からのヌクレオチド1294〜1201） 716-3234 pSVK3 からのベクター配列（ヌクレオチド1407〜3919を含む）ヒトサイトメガロウイルス即時初期遺伝子プロモーターに関する座標はEMBL核酸配列データバンクで入手できる配列、受理番号X03922を表す。 pRSVポリAEの詳細な説明 pRSVLACEをBgIII 及びScaIで消化し、約2.2 kbp BgIII-ScaIフラグメントを同定し、それから単離した。次いでこの2.2 kbp BgIII-ScaIフラグメントをpSV40 ポリAEの約1.1 kbp BgIII-ScaIフラグメント中にクローン化して、pRSVポリAEを生じた（図８を参照のこと）。プラスミド座標配列の性質及び起源 1-22 SV40配列（pSVK3 からのヌクレオチド1〜22を含む） 23-28 TGATCAリンカー配列 29-50 ヒトサイトメガロウイルス即時初期遺伝子プロモーター配列（pOG44 からのヌクレオチド541 〜562 を含む） 51-621 RSV プロモーター配列(pOPI3CAT からのBstXI-BgIII フラグメント） 622-733 SV40初期転写ポリアデニル化配列（pSVK3 からのヌクレオチド1295〜1406） 734-3246 pSVK3 からのベクター配列（ヌクレオチド1407〜3919を含む）ヒトサイトメガロウイルス即時初期遺伝子プロモーターに関する座標はEMBL核酸配列データバンクで入手できる配列、受理番号X03922を表す。実施例６−LacZ発現カセットを有するpSVLACE 及びpHCMVLACE 中間プラスミドの構築 FHV-1 ゲノムへのFIPV遺伝子（以下に詳しく説明される）のペプチドコード配列の発現カセットと共にLacZ発現カセットの同時挿入は組換えウイルスのスクリーニングを促進する。 LacZ発現カセットを有する２種の中間プラスミド：pSVLACE(図９を参照のこと )及びpHCMVLACE(図10を参照のこと)を、スクリーニングを促進するために構築した。これらのプラスミドを、pSV40 ポリAE（pSVLACE を得るため）及びpHCMV ポリAE（pHCMVLACE を得るため）の特異なBgIII 部位へのLacZコード配列の一部を含む約3.1 kbp BgIII-BamHI フラグメント（BgIII 及びBamHI によるpBSMUTLACZ ２の二重消化及びそれからの単離により得られた）の挿入により得た。プラスミドpBSMUTLACZ2 は、LacZ遺伝子中に配置されたBclI部位が部位誘導突然変異誘発により除去されたプラスミドpBSMUTLACZ1 の誘導体（欧州特許出願第 517,292 号明細書に記載されている）である。実施例７−pdTKSVLAC 、pdTKCMVLAC、pdgGSVLAC 及びpdgGCMVLACコトランスフェクションプラスミドの構築４種のLacZコトランスフェクションプラスミドを、以下に説明される予防接種研究における対照としての使用のためのFHV-1 ウイルスＤＮＡによるコトランスフェクションのために構築した。これらのLacZコトランスフェクションプラスミドはpdTKSVLAC(図11を参照のこと)、pdTKCMVLAC（図12を参照のこと）、pdgGSVL AC 及びpdgGCMVLACである。 pdTKSVLAC 及びpdgGSVLAC を、夫々、pdTK（実施例３に上記されたようにして得られた）及びpdgG（実施例４に上記されたようにして得られた）の特異なBamH I部位への約3.5 kbp BclI-BamHI LacZ 発現カセット（pSVLACE からBclI及びBam HIによるその二重消化により誘導された）の挿入により得た。 pdTKCMVLAC及びpdgGCMVLACを、夫々、pdTK（実施例３に上記されたようにして得られた）及びpdgG（実施例４に上記されたようにして得られた）の特異なBamH I部位への約3.8 kbp BclI-BamHI LacZ 発現カセット（実施例６に上記されたようにして得られたpHCMVLACE からBclI及びBamHI によるその二重消化により誘導された）の挿入により得た。実施例８−SMまたはＭ発現カセットを有するpHCMVM、pHCMVMS 、pRSVM 及びpR SVMS中間プラスミドの構築 FIPV SM タンパク質及びFIPV Mタンパク質をコードする配列をプラスミドB12 （(3)及び欧州特許出願第441684号明細書により記載されている）から得、単離した。次いでこれらのSMコード配列及びＭコード配列を、SM発現カセットまたはＭ発現カセットを有する中間プラスミドpHCMVM、pHCMVMS 、pRSVM 及びpRSVMSを生じるためにpHCMV ポリALまたはpRSVポリAL中でサブクローン化した。 SMコード配列及びＭコード配列を含むプラスミドB12 からのフラグメントを、 1.3 kbp HincII-HindIIIフラグメントを生じるHincII及びHindIII によるプラスミドB12 の二重消化及びその単離により得た。次いでこの1.3 kbp HincII-HindI II フラグメントをpBSLK2（欧州特許出願第517,292 号明細書を参照のこと）のH incII-HindIII部位中でクローン化して、プラスミドB12 からのSMコード配列及びＭコード配列をまた有するpBSMを生じた。 SM遺伝子またはＭ遺伝子を含むＤＮＡフラグメントを、以下に説明されるようにしてpBSMにつき行ったポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により生産した。PCR に使用したプライマー（ユーロゲンテック、ベルギー）は、Ｍフラグメント SMフラグメントであった。増幅後に、PCR 産物をBamHI 及びBgIII で消化して、下記のフラグメント（発現プラスミドのBgIII 部位におけるそれらのその後のクローニングを促進するためにその端に制限部位を有する）を生じ、次いでこれらをアガロースゲルで単離し、精製した。クローン化フラグメントの5'末端及び3'末端の配列は以下のとおりである。SMフラグメント(0.3 kbp) Ｍフラグメント(0.8 kbp) 次いで以下のようにして上記のSMコード配列及びＭ配列を使用してpHCMVMS 、 pHCMVM、pRSVMS及びpRSVM を構築した。 pHCMVMS(図13を参照のこと)を実施例５に上記されたpHCMV ポリALのBgIII 部位への約0.3 kbp BgIII-BamHI SMフラグメントの挿入により構築した。 pHCMVM（図14を参照のこと）を実施例５に上記されたpHCMV ポリALのBgIII 部位への約0.8 kbp BamHI-BamHI Ｍフラグメントの挿入により構築した。 pRSVMS（図15を参照のこと）を実施例５に上記されたpRSVポリALのBgIII 部位への約0.3 kbp BgIII-BamHI SMフラグメントの挿入により構築した。 pRSVM(図16を参照のこと)を実施例５に上記されたpRSVポリALのBgIII 部位への約0.8 kbp BamHI-BamHI Ｍフラグメントの挿入により構築した。実施例９−pdTKMLAC、pdTKMSLAC 、pdTKRSVMLAC 及びpdTKRSVMSLACコトランスフェクションプラスミドの構築Ｍ発現カセットを含む約1.5 kbp BclI-BamHIフラグメントをpHCMVM（実施例８に上記されたようにして得られた）から単離した。同様に、SM発現カセットを含む約0.9 kbp BclI-BamHIフラグメントをpHCMVMS(実施例８に上記されたようにして得られた)から単離した。次いでＭ発現カセット及びSM発現カセットの夫々を夫々のpdTKプラスミド（実施例３に上記されたようにして得られた）のBamHI 部位でクローン化し、夫々、 pdTKHCMVM(図17を参照のこと)及びpdTKHCMVMS（図18を参照のこと）を得た。所望により、これらのプラスミドの夫々を、組換えウイルスベクターを生産するためにFHV-1 ウイルスＤＮＡによるコトランスフェクションに使用し得る。これらのプラスミド及びFHV-1 ウイルスＤＮＡによるコトランスフェクション後の組換えウイルスのスクリーニングを促進するためのマーカーを得るために、 3.5 kbp BclI-BamHI LacZ 発現カセットをBclI及びBamHI によるpSVLACE(実施例６に上記されたようにして得られた)の二重消化により得、それから単離した。次いで夫々の3.5 kbp BclI-BamHI LacZ 発現カセットをpdTKHCMVM 及びpdTKHCMV MSの特異なBamHI 部位にクローン化して、夫々、コトランスフェクションプラスミドpdTKMLAC（図19を参照のこと）及びpdTKMSLAC(図20を参照のこと)を得た。Ｍ発現カセットを含む約1.5 kbp BclI-BamHIフラグメント及びSM発現カセットを含む約0.9 kbp BclI-BamHIフラグメントをpRSVM 及びpRSVM(実施例８に上記されたようにして得られた)から夫々単離した。次いでこれらのカセットを夫々のp dTKプラスミド（実施例３に上記されたようにして得られた）のBamHI 部位中でクローン化して、夫々pdTKRSVM（図21を参照のこと）及びpdTKRSVMS(図22を参照のこと)を生じた。所望により、これらのプラスミドの夫々は、組換えウイルスベクターを生産するためにFHV-1 ウイルスＤＮＡによるコトランスフェクションに使用し得る。これらのプラスミド及びFHV-1 ウイルスＤＮＡによるコトランスフェクション後の組換えウイルスのスクリーニングを促進するためのマーカーを得るために、 3.8 kbp BclI-BamHI LacZ 発現カセットをBclI及びBamHI によるpHCMVLACE(実施例６に上記されたようにして得られた)の二重消化により得、それから単離した。次いで夫々の3.8 kbp BclI-BamHI LacZ 発現カセットをpdTKRSVM及びpdTKRSVM Sの特異なBamHI 部位にクローン化して、夫々、コトランスフェクションプラスミドpdTKRSVMLAC(図23を参照のこと)及びpdTKRSVMSLAC(図24を参照のこと)を生じた。実施例10−pdgGMLAC及びpdgGMSLAC コトランスフェクションプラスミドの構築Ｍ発現カセットを含む約1.5 kbp BclI-BamHIフラグメントをpHCMVM（実施例８に上記されたようにして得られた）から単離した。同様に、SM発現カセットを含む約0.9 kbp BclI-BamHIフラグメントをpHCMVMS(実施例８に上記されたようにして得られた)から単離した。次いでＭ発現カセット及びSM発現カセットの夫々を夫々のpdgGプラスミド（実施例４に上記されたようにして得られた）のBamHI 部位中でクローン化して、夫々、pdgGHCMVM 及びpdgGHCMVMSを生じた。所望により、これらのプラスミドの夫々は、組換えウイルスベクターを生産するためにFHV-1 ウイルスＤＮＡによるコトランスフェクションに使用し得る。これらのプラスミド及びFHV-1 ウイルスＤＮＡによるコトランスフェクション後の組換えウイルスのスクリーニングを促進するためのマーカーを得るために、 BclI-BamHI LacZ 発現カセットを含む約3.5 kbp BclI-BamHIフラグメントをBclI 及びBamHI によるpSVLACE(実施例６に上記されたようにして得られた)の二重消化により得、それから単離した。次いで夫々の3.5 kbp BclI-BamHIフラグメントをpdgGHCMVM 及びpdgGHCMVMSのBamHI 部位にクローン化して、夫々、コトランスフェクションプラスミドpdgGMLAC及びpdgGMSLAC を生じた。実施例11−Ｓ発現カセットを有するpHCMVS及びpRSVS 中間プラスミドの構築 FIPVスパイク(S)コード配列（(4)及び欧州特許出願第264,979 号明細書の両方に記載されている）を含むpUCE2((4)に記載されている)をBamHI で消化し、全Ｓコード配列を有する約4.3-4.4 kbp BamHI フラグメントをそれから単離した。次いでこの4.3-4.4 kbp BamHI フラグメントをpHCMV ポリAL（実施例５に上記されたようにして得られた）のBgIII 部位中でクローン化して、pHCMVS（図25を参照のこと）を生じた。同様にまた、この4.3-4.4 BamHI フラグメント（pUCE2 から）をpRSVポリAL（実施例５に上記されたようにして得られた）のBgIII 部位中でクローン化してpR SVS(図26を参照のこと)を生じた。実施例12−pdTKSLAC、pdgGSLAC及びpdTKRSVSLAC コトランスフェクションプラスミドの構築約5.2 kbp のBclI-BamHI S発現カセットをBclI及びBamHI によるpHCMVS（実施例11に上記されたようにして得られた）の二重消化により得、それから単離した。次いでこれらの5.2 kbp BclI-BamHI発現カセットをpdTK（実施例３に上記されたようにして得られた）のBamHI 部位、またpdgG（実施例４に上記されたようにして得られた）のBamHI 部位に挿入して、夫々、pdTKHCMVS(図27を参照のこと) 及びpdgGHCMVS を得た。所望により、これらのプラスミドの夫々は、組換えウイルスベクターを生産するためにFHV-1 ウイルスＤＮＡによるコトランスフェクションに使用し得る。これらのプラスミド及びFHV-1 ウイルスＤＮＡによるコトランスフェクション後の組換えウイルスのスクリーニングを促進するためのマーカーを得るために、 pSVLACE(実施例６に上記されたようにして得られた)から単離された夫々の3.5 k bp BclI-BamHI LacZ 発現カセットを、その後、pdTKHCMVS 及びpdgGHCMVS のBam HI 部位に挿入して、夫々、コトランスフェクションプラスミドpdTKSLAC（図28 を参照のこと）及びpdgGSLACを生じた。別のコトランスフェクションプラスミドを、最初にpRSVS(実施例11に上記されたようにして得られた)から単離された5.2 kbp BclI-BamHI S発現カセットをプラスミドpdTKのBamHI 部位に挿入して、pdTKRSVS（図29を参照のこと）を生じることにより構築した。所望により、このプラスミドは、組換えウイルスベクターを生産するためにFHV-1 ウイルスＤＮＡによるコトランスフェクションに使用し得る。このプラスミド及びFHV-1 ウイルスＤＮＡによるコトランスフェクション後の組換えウイルスのスクリーニングを促進するためのマーカーを得るために、pHCM VLACE(実施例６に上記されたようにして得られた)から単離された3.8 kbp BclI- BamHI LacZ 発現カセットを、その後、pdTKRSVSのBamHI 部位に挿入して、コトランスフェクションプラスミドpdTKRSVSLAC(図30を参照のこと)を生じた。実施例13−delS発現カセットを有するpHCMVSIG及びpRSVSIG 中間プラスミドの構築次いでpHCMVSIGを、シグナルペプチドがそれから欠失されたFIPV Sタンパク質（シグナル配列欠失Ｓ遺伝子）の発現のために、下記のようにして調製し、その結果、Ｓタンパク質はそのＮ末端シグナル配列を含まないでそれにより生産される。最初に、FIPVスパイク(S)タンパク質のコード配列を含むpHMCMVS(実施例11に上記されたようにして得られた)を鋳型として使用して下記のプライマーFIPSIG1 及びFIPSIG2(ユーロゲンテック、ベルギー)を用いるPCR 増幅を行った。これらのプライマーから開始して、約0.5 kbp ＤＮＡフラグメントをPCR(パーキンエルマー)により増幅した。増幅した約0.5 kbp フラグメントをpBSLK1（欧州特許出願第517,292 号明細書に記載されている）のSmaI部位中でクローン化してpBSMUTS を生じた。次いでプラスミドpHCMVSの約0.5 kbp SacII-EcoRI フラグメントをpBSMUTS からの約0.4 kbp Sac II-EcoRIフラグメントと交換して、Ｓタンパク質のシグナルペプチドが欠失されているpHCMVSIG（図31を参照のこと）を生じた。次いでまた、RSV プロモーターの制御下のシグナルペプチド欠失Ｓタンパク質の発現のためのプラスミドを構築した。pHCMVSIGをSacII 及びBamHI による二重消化にかけて、約4.5 kbp SacII-BamHI フラグメントをそれから単離した。また、pRSVS(実施例11に上記されたようにして得られた)をSacII 及びBamHI による二重消化にかけて、pRSVS の約3.2 kbp SacII-BamHI フラグメントをそれから単離した。次いで4.5 kbp SacII-BamHI フラグメントを3.2 kbp SacII-BamHI フラグメントとつないで、pRSVSIG(図32を参照のこと)を生じた。実施例14−pdTKSIGLAC、pdTKRSVSIGLAC 及びpdgGSIGLACコトランスフェクションプラスミドの構築シグナル配列欠失Ｓ遺伝子の３種のコトランスフェクションプラスミドを構築した。 FHV-1 チミジンキナーゼ中の挿入のための第一コトランスフェクションプラスミドを以下のようにして構築した。約5.1 kbp BclI-BamHIシグナル配列欠失Ｓ遺伝子発現カセットをpHCMVSIG（実施例13に上記されたようにして得られた）から単離し、pdTK（実施例３に上記されたようにして得られた）のBamHI 部位にクローン化して、pdTKHCMVSIG(図33を参照のこと)を生じた。所望により、このプラスミドは、組換えウイルスベクターを生産するためにFHV-1 ウイルスＤＮＡによるコトランスフェクションに使用し得る。このプラスミド及びFHV-1 ウイルスＤＮＡによるコトランスフェクション後の組換えウイルスのスクリーニングを促進するためのマーカーを得るために、pSVL ACE(実施例６に上記されたようにして得られた)からの3.5 kbp BclI-BamHI LacZ 発現カセットを、その後に得て、pdTKHCMVSIG のBamHI 部位に挿入して、コトランスフェクションプラスミドpdTKSIGLAC（図34を参照のこと）を得た。 FHV-1 チミジンキナーゼ遺伝子中の挿入のための第二コトランスフェクションプラスミドを以下のようにして構築した。約5.1 kbp BclI-BamHIシグナル配列欠失Ｓ遺伝子発現カセットをpRSVSIG(実施例13に上記されたようにして得られた) から単離し、pdTK（実施例３に上記されたようにして得られた）のBamHI 部位にクローン化して、pdTKRSVSIG（図35を参照のこと）を生じた。所望により、このプラスミドは、組換えウイルスベクターを生産するためにFHV-1 ウイルスＤＮＡによるコトランスフェクションに使用し得る。このプラスミド及びFHV-1 ウイルスＤＮＡによるコトランスフェクション後の組換えウイルスのスクリーニングを促進するためのマーカーを得るために、pHCM VLACE(実施例６に上記されたようにして得られた)からの3.8 kbp BclI-BamHI La cZ発現カセットをその後pdTKRSVSIGのBamHI 部位に挿入して、コトランスフェクションプラスミドpdTKRSVSIGLAC(図36を参照のこと)を生じた。 FHV-1 gG遺伝子中の挿入のための第三コトランスフェクションプラスミドを以下のようにして構築した。約5.1 kbp BclI-BamHIシグナル配列欠失Ｓ遺伝子発現カセットをpHCMVSIG（実施例13に上記されたようにして得られた）から単離し、 pdgG（実施例４に上記されたようにして得られた）のBamHI 部位にクローン化して、pdgGHCMVSIG を生じた。所望により、このプラスミドは、組換えウイルスベクターを生産するためにFHV-1 ウイルスＤＮＡによるコトランスフェクションに使用し得る。このプラスミド及びFHV-1 ウイルスＤＮＡによるコトランスフェクション後の組換えウイルスのスクリーニングを促進するためのマーカーを得るために、pSVL ACE(実施例６に上記されたようにして得られた)からの3.5 kbp BclI-BamHI LacZ 発現カセットをその後pdgGHCMVSIG のBamHI 部位に挿入して、コトランスフェクションプラスミドpdgGSIGLACを生じた。実施例15−ADEエピトープ欠失Ｓ発現カセットを有するpHCMVSDAD 及びpRSVSDA D中間プラスミドの構築本発明者らがＳタンパク質の抗体依存性強化(ADE)エピトープコード配列であると考えるものの欠失を、供給業者の推奨（バイオラドムタ−ジーンファージミド試験管内突然変異誘発キット、カタログ番号170-3581）に従って、ウラシル化一本鎖pHCMVS（実施例11に上記されたようにして得られた）ＤＮＡに対する部位誘導突然変異誘発により直接行った。下記の４種の合成プライマー（ユーロゲンテック）を使用して突然変異誘発を行った。生じたプラスミド、pHCMVSDAD(図37を参照のこと)は、Ｓタンパク質のＤエピトープ、A1エピトープ及びA2エピトープがそれから欠失されていた。また、RSV プロモーターの制御下のADE エピトープ欠失Ｓタンパク質の発現のためのその他のプラスミド、pRSVSDAD（図38を参照のこと）を、PstI及びBamHI によるpHCMVSDAD(実施例15に上記されたようにして得られた)の二重消化及びそれからの単離により約3.5 kbp PstI-BamHIフラグメント（Ｓ発現カセットを有する）を得ることにより構築した。約4.2 kbp PstI-BamHIフラグメントをPstI及び BamHI によるpRSVS(実施例11に上記されたようにして得られた)の二重消化及びそれからの単離により得た。次いで3.5 kbp PstI-BamHIフラグメントをpRSVS の4.2 kbp PstI-BamHIフラグメントでクローン化して、ADE エピトープ欠失Ｓ発現カセットを含むpRSVSDADを生じた。実施例16−pdTKSDADLAC 、pdgGSDADLAC 及びpdTKRSVSDADLACコトランスフェクションプラスミドの構築夫々のADE エピトープ欠失Ｓ発現カセットを含む約5.1 kbp BclI-BamHIフラグメントをBclI及びBamHI によるpHCMVSDAD 及びpRSVSDAD（これらの両方が実施例 15に上記されたようにして得られた）の夫々の二重消化及びそれからのフラグメントの単離により得た。次いでpHCMVDADからの夫々の5.1 kbp BclI-BamHIフラグメントを、pdTK（実施例３に上記されたようにして得られた）のBamHI 部位及びpdgG（実施例４に上記されたようにして得られた）のBamHI 部位に挿入して、夫々、pdTKHCMVSDAD（図 39を参照のこと）及びpdgGHCMVSDADを生じた。所望により、これらのプラスミドは、組換えウイルスベクターを生産するためにFHV-1 ウイルスＤＮＡによるコトランスフェクションに使用し得る。これらのプラスミド及びFHV-1 ウイルスＤＮＡによるコトランスフェクション後の組換えウイルスのスクリーニングを促進するためのマーカーを得るために、夫々の約3.5 kbp BclI-BamHI LacZ 発現カセットをその後pSVLACE(実施例６に上記されたようにして得られた)から単離し、続いてpdTKHCMVSDAD及びpdgGHCMVSDA DのBamHI 部位中でクローン化して、夫々、コトランスフェクションプラスミドp dTKSDADLAC(図40を参照のこと)及びpdgGSDADLAC を得た。 pRSVSDADからの夫々の5.1 kbp BclI-BamHIフラグメントをpdTK（実施例３に上記されたようにして得られた）のBamHI 部位でクローン化して、pdTKRSVSDAD(図 41を参照のこと)を生じた。所望により、このプラスミドは、組換えウイルスベクターを生産するためにFHV-1 ウイルスＤＮＡによるコトランスフェクションに使用し得る。このプラスミド及びFHV-1 ウイルスＤＮＡによるコトランスフェクション後の組換えウイルスのスクリーニングを促進するためのマーカーを得るために、pHCM VLACE(実施例６に上記されたようにして得られた)からの3.8 kbp BclI-BamHI La cZ発現カセットをpdTKRSVSDAD のBamHI 部位に挿入して、コトランスフェクションプラスミドpdTKRSVSDADLAC（図42を参照のこと）を生じた。実施例17−FHV-1 組換え生キャリヤーの生産次いで組換え生キャリヤーを精製FHV-1 DNA(実施例２に記載されたようにして得られた)及びコトランスフェクションプラスミドpdTKCMVLAC(図42を参照のこと)(これは実施例７に上記されたようにして得られた)によるCRFK細胞（実施例１を参照のこと）のコトランスフェクション（以下に記載されるような）により得た。トランスフェクションを供給業者の推奨に従ってリポフェクチン試薬(ギブコB RL)を用いて行った。クランデルネコ科腎臓(CRFK)細胞を、血清が省かれ、リポフェクチン20〜25μg 、ウイルスＤＮＡ１〜15μg 及びプラスミド／ウイルスＤＮＡモル比１〜20を与えるのに必要な量のプラスミドＤＮＡを添加した実施例１に上記された培地中で25cm²のフラスコ中で、50％〜80％の集密度（目視測定した）でトランスフェクトした。製造業者の仕様に従って、全容積は培地約1.8 ml であった。トランスフェクションの期間は５〜24時間であった。トランスフェクション後に、夫々の試料のトランスフェクション培地を除去し、CRFK培地約５mlと交換した。次いで細胞を37℃で48時間インキュベートした。続いて細胞をトリプシン処理後に75cm²のフラスコに通し、細胞変性効果が目視観察されるまで37℃で再度インキュベートした。次いで細胞及び培地を凍結−解凍の１サイクル後に回収した。このウイルス株をトランスフェクション株と称する。組換えFHV-1 ウイルスの存在に関するトランスフェクション株のスクリーニングはLacZ遺伝子の発現に基いていた。組換えウイルスを含むプラークを以下のようにして簡単なプラークアッセイにより視覚化した。 CRFK細胞を25cm²のペトリ皿中で約50％の集密度（目視測定した）で増殖培地（実施例１を参照のこと）中に接種し、次いでトランスフェクション株（上記された）の約10³〜10⁴の感染性ウイルス粒子で感染させた。 37℃で約５〜８時間にわたる３％のCO₂と一緒のインキュベーション後に、液体増殖培地を除去し、水に融解した２％(w/v)のアガロース(シー・プラーク（商標）アガロース、FMC バイオプロダクツ、USA)１容積と50％(v/v)の培地199 2x( ギブコBRL)、2.5 ％(v/v)のラクトアルブミン加水分解産物(ギブコBRL)、５％(v /v)のウシ胎児血清(ギブコBRL)及び15mMのHEPES pH7.2 １容積の混合物５mlと交換した。次いでウイルスプラークが発生するまで、ペトリ皿を約48時間にわたって37℃で３％のCO₂と一緒にインキュベートした。次いでペトリ皿を、１％(w/v)の融解アガロース及び0.3 mg/ml のX-gal(５−ブロモ−４−クロロ−３インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド、ベーリンガー・マンハイム)を含むPBS 溶液(ギブコBRL)２mlでオーバーレイした。 LacZコードされたβ−ガラクトシダーゼ酵素を発現するプラークは青色に変化した。次いで青色のプラークをパスツールピペットでつついて、新しいCRFK細胞に移し、均一性が得られるまで連続の青色のプラーク分離により精製した。次いで組換えウイルスの大きい株を50％〜80％の集密度（目視観察した）及び0.01の多重感染度におけるCRFK細胞の感染により生産した。 48〜72時間後に、細胞変性効果が殆ど完全であった時に、細胞及び増殖培地を凍結及び解凍の１サイクルにかけた。次いで細胞懸濁液を500Gで10分間遠心分離し、次いでウイルスを含む上澄みを回収した。次いでこの株をその後の予防接種実験に使用した。以上から、pdTKCMVLACを上記の様式で使用して、TKLAC と称される組換えFHV- 1 生キャリヤーが生成されたことがわかる。本発明の抗原活性タンパク質／ポリペプチドを発現するその他の種々の組換え生キャリヤーの生産のために、実施例１に上記されたようにして得られたFHV-1 ウイルスＤＮＡを実施例７、９、10、 12、14及び16に上記された種々の上記のコトランスフェクションプラスミドで、この実施例に丁度記載された様式でコトランスフェクトすることのみが単に必要とされ、この場合、関係する抗原活性タンパク質／ポリペプチド（本発明のものを含む）はLacZ遺伝子を含むコトランスフェクションプラスミドにとり込まれ、または関係する抗原活性タンパク質／ペプチド（本発明のものを含む）はLacZ遺伝子に代えてコトランスフェクションプラスミドにとり込まれる。実施例18−対照によるネコの予防接種この実施例は、基準として、ネコ科の鼻気管炎に対する保護及びβ−ガラクトシダーゼに対する免疫応答を使用してFHV/LACZ組換え体の予防接種力を評価するために設計された。これに関して、HCMVプロモーターの制御下にLacZ遺伝子を有する、実施例17に上記されたようにして得られた組換えFHV-1 株（TKLAC と称される）を、ネコ予防接種試験で評価し、親株と比較した。生後約10週の特定の病原体を含まない(SPF)ネコを、夫々の鼻孔にウイルス懸濁液0.5 mlを適用することにより、実施例17に上記されたようにして得られたTK LAC FHV-1 組換え体(LacZ グループ、５匹のネコ)、または実施例１に上記されたようにして得られた親株（親グループ、５匹のネコ）の投薬量当たり約10^5.5T CID₅₀で３週間間隔で２回口鼻に予防接種した。第三グループ（対照グループ、５匹のネコ）を、対照としてアール塩を含む最小必須培地(ギブコBRL 、カタログ番号21090-010)からなるワクチン希釈液0.5 mlで夫々の鼻孔に接種した。次いで三つのグループの夫々の標本の全てに第二予防接種の２週後に口鼻に抗原投与した。これらの抗原投与を、夫々の鼻孔にウイルス懸濁液0.5 mlを適用することにより、毒性FHV-1 株B927（これは単離され、(6)及び(7)により記載された）の約10⁷TCID₅₀で接種により行った。平均直腸温度及び鼻気管炎の臨床上の兆候（食欲、鬱病、くしゃみ、眼鼻の排泄物、潰瘍、過流涎、結膜炎、呼吸困難、歯肉炎、神経病の兆候、下痢）の発生を抗原投与後２週間の期間にわたって監視した。夫々の臨床上の兆候を０（臨床上の兆候の不在）〜５（非常にひどい臨床上の兆候）のスケールで任意にスコアーをつけた。結果ワクチンの二つのグループは抗原投与後の最初の２〜４日で軽度の発熱（本明細書に使用される“発熱”という用語は39.2℃以上の温度と定義される）を示した（表１を参照のこと）。対照的に、対照グループは抗原投与後の３〜４日目及び７〜８日目にひどい発熱を生じた。抗原投与後のネコの臨床上のスコアリングの結果を表２に示す。対照は予想された広範囲の臨床上の兆候を示し、337 の高い合計スコアーを生じた。二つの予防接種されたグループは対照グループと比較してスコアーの同じ強い低下を示し、非常に軽度の臨床上の兆候はくしゃみ及び結膜炎を含んでいた。臨床上の観察は、対照標本と比較して予防接種した標本において鼻気管炎の有意な兆候を検出しなかった。これらの結果は、TKLAC 組換え体が野生型ウイルスによる苛酷な抗原投与に対しSPF ネコをかなり保護すること、そしてその保護が親ワクチン株で得られたのと同じ位に良好であることを示す。血液試料を実験の終了まで最初の予防接種の直前に採取した。血清をFHV-1 に対する血清中和力価並びにFHV-1 及びβ−ガラクトシダーゼに特異性のIgG につき分析した。表３は血清中和力価の発生を要約する。これらの値は全ての個々のネコ血清に関する最高の血清中和希釈の逆に相当する。全ての予防接種されなかったネコは抗原投与の前に血清反応陰性のままであった。全ての予防接種されたネコは最初の予防接種後に血清変換し、その大半が第二予防接種後そして再度抗原投与後に力価の小さい上昇を示した。表４は血清IgA のELISA 分析を要約する。これらの値は平均光学密度x1000 を表す。血清を全IgA 並びにFHV-1 及びβ−ガラクトシダーゼ（β-GAL）に特異性のIgA につき試験した。特異性抗β-GAL IgAはTKLAC 組換え体で予防接種したグループ中でかなりの増加（β−ガラクトシダーゼに対する血清力価）を示し、La cZインサートが生体内で発現されることを示した。本明細書に記載された（そして関係するタンパク質のコード配列を有する本発明のコトランスフェクションプラスミドでFHV-1 ウイルスＤＮＡによるコトランスフェクションにより形成された）組換え生キャリヤーは生体内で関係するタンパク質を発現することができることが上記の結果から明らかである。それ故、この組換え生キャリヤーは、生体内で発現されることが所望され得るその他のタンパク質／ポリペプチドではなく本明細書に記載されたタンパク質／ポリペプチドとの使用に丁度適しないであろう。実施例19−組換え生キャリヤーによるネコの予防接種この実験は毒性FIPVによる抗原投与後にネコを保護する際の実施例17からのFI PV/FHV組換え生キャリヤーの効力を評価するために設計される。生後９〜10週の特定の病原体を含まないネコを予防接種する。別の予防接種を最初の予防接種の３週間後に投与する。全ての予防接種を実施例17に上記されたようにして得られた株からの組換えFIPV/FHVウイルスの10⁵〜10⁷TCID50/ネコで鼻経路により行う。予防接種されなかったネコのグループは対照として利用できるであろう。最後の予防接種の２〜４週間後に、ネコに毒性FIPV株の10²〜10⁵TC ID50/ ネコで抗原経口投与する。 FIP の臨床上の兆候を抗原投与後の連続８週にわたって評価する。血液試料を実験の終了まで最初の予防接種の時点から毎週採取する。血清をFHV-1 に対する血清中和力価及びβ−ガラクトシダーゼ特異性抗体につき分析する。臨床上の観察は、予防接種された標本中のFIP の臨床上有意な兆候が存在しないか、または対照標本と比較して改善されることを示す。β−ガラクトシダーゼに対する血清力価を、対照の予防接種されなかった標本と比較して予防接種された標本中で評価する。上記の結果は、予防接種された標本が免疫保護応答を示したことを示す。本明細書に記載された全ての刊行物及び特許出願明細書は、夫々の個々の刊行物または特許出願明細書が参考として含まれるように詳細かつ個々に示されたのと同じ程度に参考として本明細書に含まれる。本発明が充分に説明されたので、請求の範囲の精神及び／または範囲から逸脱しないで、変化及び改良が本発明になし得ることは当業者に明らかであろう。図面中に使用した略号のリスト下記のものは図面中（出願明細書中）に使用された略号のリストである。 ori プラスミド複製開始点(ColE1) ori F1 f1複製開始点 bla アンピシリン耐性を与えるβ−ラクタマーゼ遺伝子 LacZ E.coliβ−ガラクトシダーゼコード配列 HCMVp ヒトサイトメガロウイルス即時初期遺伝子プロモーター配列 RSVp ラウス肉腫ウイルス長末端リピートプロモーター配列 SV40p SV40初期プロモーター配列 Ae SV40初期転写ポリアデニル化シグナル A1 SV40後期転写ポリアデニル化シグナル M FIPVマトリックスタンパク質コード配列 MS FIPV小膜タンパク質コード配列 S FIPVスパイクタンパク質コード配列 SDAD FIPV抗体依存性強化エピトープ欠失スパイクタンパク質コード配列 SIG FIPVシグナル配列欠失スパイクタンパク質コード配列 FSu 5'上流挿入部位隣接配列 FSd 3'下流挿入部位隣接配列

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ１２Ｐ 21/02 9637−4ＢＣ１２Ｐ 21/02 Ｃ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:92） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:92） (72)発明者コローディディエールベルギーベー1390 グレーズドワソーリュードペティサール 48 (72)発明者ルーサランビアンフィリップフランスエフ‐75020 パリリュープランシャ 42ビス

Claims

【特許請求の範囲】１．A1抗原領域、A2抗原領域またはＤ抗原領域の少なくとも一つが修飾され、またはそれから除去され、その結果、前記修飾領域がADE 不活性であることを特徴とする修飾コロナウイルスＳタンパク質。２．A1抗原領域及びA2抗原領域が修飾され、またはそれから除去され、その結果、前記修飾領域がADE 不活性である請求の範囲第１項に記載の修飾コロナウイルスＳタンパク質。３．A1抗原領域及びＤ抗原領域が修飾され、またはそれから除去され、その結果、前記修飾領域がADE 不活性である請求の範囲第１項に記載の修飾コロナウイルスＳタンパク質。４．A2抗原領域及びＤ抗原領域が修飾され、またはそれから除去され、その結果、前記修飾領域がADE 不活性である請求の範囲第１項に記載の修飾コロナウイルスＳタンパク質。５．A1抗原領域、A2抗原領域及びＤ抗原領域が修飾され、またはそれから除去され、その結果、前記修飾領域がADE 不活性である請求の範囲第１項に記載の修飾コロナウイルスＳタンパク質。６．コロナウイルスＳタンパク質が修飾FIPV Sタンパク質である請求の範囲第１項に記載の修飾コロナウイルスＳタンパク質。７．シグナルペプチドがそれから欠失されている修飾コロナウイルスＳタンパク質。８．図１のアミノ酸配列に実質的に相同であるアミノ酸配列を有する実質的に純粋なコロナウイルスSMタンパク質。９．実質的に純粋なFIPV SM タンパク質。 10．コロナウイルスに抗原活性である修飾コロナウイルスＳタンパク質をコードするＤＮＡ分子の調製方法であって、前記方法が a)コロナウイルスＳタンパク質をコードする発現カセットを単離する工程、 b)Ｓタンパク質の関係する少なくとも一つの領域をコードするヌクレオチド塩基配列の位置を決定する工程、及び c)関係する少なくとも一つの領域をコードするヌクレオチド塩基配列を修飾または欠失する工程を含むことを特徴とする前記ＤＮＡ分子の調製方法。 11．関係する領域がＳタンパク質のシグナルペプチド配列であり、更にシグナルペプチドをコードするヌクレオチド塩基配列がそれから欠失されており、その結果、シグナルペプチドがヌクレオチド配列によりコードされない請求の範囲第10 項に記載の方法。 12．関係する領域が抗原領域であり、かつ関係する領域をコードするヌクレオチド塩基配列が修飾され、またはそれから欠失されており、その結果、それによりコードされるタンパク質の領域がADE 不活性である請求の範囲第10項に記載の方法。 13．関係する領域がA1抗原領域、A2抗原領域及びＤ抗原領域の少なくとも一つである請求の範囲第12項に記載の方法。 14．コロナウイルスＳタンパク質がFIPV Sタンパク質である請求の範囲第10項に記載の方法。 15．ウイルスＤＮＡによるコトランスフェクションのためのコトランスフェクションプラスミドであって、前記コトランスフェクションプラスミドがそれでトランスフェクトされるウイルスゲノム中の挿入部位の隣接配列の一部、RSV または HCMV及びSV40から誘導された発現シグナル並びにこのようなコトランスフェクションにより生産された組換え生キャリヤーにより発現される関係するタンパク質のコード配列を少なくとも含むことを特徴とするコトランスフェクションプラスミド。 16．関係するタンパク質がFIPVタンパク質である請求の範囲第15項に記載のコトランスフェクションプラスミド。 17．コトランスフェクトされるウイルス株がFHV-1 であり、更に隣接配列がFHV- 1 から誘導される請求の範囲第15項に記載のコトランスフェクションプラスミド。 18．関係するタンパク質のコード配列がコロナウイルスＳタンパク質をコードする請求の範囲第15項に記載のコトランスフェクションプラスミド。 19．関係するタンパク質のコード配列が、シグナルペプチドがそれから欠失されたコロナウイルスＳタンパク質をコードする請求の範囲第18項に記載のコトランスフェクションプラスミド。 20．関係するタンパク質のコード配列が、その抗原領域の少なくとも一つが修飾され、またはそれから欠失されたコロナウイルスＳタンパク質をコードし、その結果、それによりコードされるタンパク質の前記修飾領域がADE 不活性である請求の範囲第18項に記載のコトランスフェクションプラスミド。 21．関係するタンパク質のコード配列がコロナウイルスSMタンパク質をコードする請求の範囲第15項に記載のコトランスフェクションプラスミド。 22．標的タンパク質がコロナウイルスＭタンパク質である請求の範囲第15項に記載のコトランスフェクションプラスミド。 23．ゲノムが修飾コロナウイルスＳタンパク質をコードするＤＮＡ配列を有する FHV-1 を含む組換え生キャリヤーであって、A1抗原領域、A2抗原領域またはＤ抗原領域をコードするＤＮＡ配列の少なくとも一つが修飾され、またはそれから除去され、その結果、それによりコードされるタンパク質の前記領域がADE 不活性であることを特徴とする組換え生キャリヤー。 24．A1抗原領域、A2抗原領域及びＤ抗原領域をコードするＤＮＡ配列が全て修飾され、またはそれから除去され、その結果、それによりコードされるタンパク質の前記A1領域、A2領域及びＤ領域が全てADE 不活性である請求の範囲第23項に記載の組換え生キャリヤー。 25．修飾コロナウイルスＳタンパク質が修飾FIPV Sタンパク質である請求の範囲第23項に記載の組換え生キャリヤー。 26．ゲノムが修飾コロナウイルスＳタンパク質をコードするＤＮＡ配列を有する FHV-1 を含む組換え生キャリヤーであって、それによりコードされる修飾コロナウイルスＳタンパク質のシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列が修飾され、またはそれから除去されていることを特徴とする組換え生キャリヤー。 27．修飾コロナウイルスＳタンパク質が修飾FIPV Sタンパク質である請求の範囲第26項に記載の組換え生キャリヤー。 28．ゲノムが修飾コロナウイルスSMタンパク質をコードするＤＮＡ配列を有する FHV-1 を含み、その結果、組換え生キャリヤーがコロナウイルスSMタンパク質を発現することを特徴とする組換え生キャリヤー。 29．コロナウイルスSMタンパク質がFIPV SM タンパク質である請求の範囲第28項に記載の組換え生キャリヤー。 30．ゲノムが修飾コロナウイルスＭタンパク質をコードするＤＮＡ配列を有する FHV-1 を含み、その結果、組換え生キャリヤーがコロナウイルスＭタンパク質を発現することを特徴とする組換え生キャリヤー。 31．コロナウイルスＭタンパク質がFIPV Mタンパク質である請求の範囲第30項に記載の組換え生キャリヤー。 32．標的哺乳類中の関係する少なくとも一つのタンパク質／ポリペプチドの生体内発現のための組換え生キャリヤーであって、前記組換え生キャリヤーが、ゲノムがRSV またはHCMV及びSV40から誘導された発現シグナルを有するウイルス株並びに組換え生キャリヤーにより発現される関係するタンパク質のヌクレオチドコード配列を含むことを特徴とする組換え生キャリヤー。 33．ウイルス株がFHV-1 である請求の範囲第32項に記載の組換え生キャリヤー。 34．ヌクレオチドコード配列が抗原活性コロナウイルスタンパク質をコードする請求の範囲第32項に記載の組換え生キャリヤー。 35．ADE を誘発しないでコロナウイルスに対し哺乳類を保護するのに有効なコロナウイルスワクチン。 36．ワクチンが適当なキャリヤー中に抗原活性コロナウイルスタンパク質を含む請求の範囲第35項に記載のコロナウイルスワクチン。 37．コロナウイルスタンパク質がコロナウイルスＳタンパク質である請求の範囲第36項に記載のワクチン。 38．コロナウイルスタンパク質が修飾コロナウイルスＳタンパク質である請求の範囲第36項に記載のワクチン。 39．修飾コロナウイルスＳタンパク質が、ADE 不活性であるようにそのA1抗原領域、A2抗原領域またはＤ抗原領域の少なくとも一つが修飾され、またはそれから欠失されている請求の範囲第38項に記載のワクチン。 40．修飾コロナウイルスＳタンパク質が、シグナルペプチドがそれから欠失されている請求の範囲第38項に記載のワクチン。 41．コロナウイルスタンパク質がコロナウイルスSMタンパク質である請求の範囲第36項に記載のワクチン。 42．コロナウイルスタンパク質がコロナウイルスＭタンパク質である請求の範囲第36項に記載のワクチン。 43．ワクチンがネコ科をFIP に対して保護するためのFIPVワクチンであり、更にタンパク質がFIPVタンパク質である請求の範囲第36項に記載のワクチン。 44．組換え生キャリヤーを更に含み、それによりそれを必要とする宿主生物中のタンパク質の発現が得られる請求の範囲第36項に記載のワクチン。 45.a）抗原活性コロナウイルスタンパク質をコードするＤＮＡ配列を単離し、精製する工程、 b)抗原活性コロナウイルスタンパク質をコードするＤＮＡ配列を有するコトランスフェクションプラスミドを生成する工程、 c)標的動物中で生体内で抗原活性コロナウイルスタンパク質を発現するための抗原活性コロナウイルスタンパク質をコードすることができる組換え生キャリヤーを生成するように、FHV-1 ウイルスＤＮＡをコトランスフェクションプラスミドでコトランスフェクトする工程、及び d)組換え生キャリヤーを医薬上許されるキャリヤーと合わせる工程を含むことを特徴とするコロナウイルスワクチンの調製方法。 46.a）抗原活性であるFIPV Sタンパク質をコードするＤＮＡ配列を単離する工程、 b)A1抗原領域、A2抗原領域またはＤ抗原領域の少なくとも一つをコードするFI PV Sタンパク質のＤＮＡ配列を修飾する工程（その結果、それによりコードされるタンパク質の修飾抗原領域はADE 不活性である）、及び c)修飾FIPV Sタンパク質をコードするＤＮＡ配列を有するコトランスフェクションプラスミドを生成する工程、 d)標的動物中で生体内で抗原活性修飾FIPV Sタンパク質を発現するための抗原活性修飾FIPV Sタンパク質をコードすることができる組換え生キャリヤーを生成するように、FHV-1 ウイルスＤＮＡをコトランスフェクションプラスミドでコトランスフェクトする工程、及び e)組換え生キャリヤーを医薬上許されるキャリヤーと合わせる工程を含むことを特徴とするFIPVワクチンの調製方法。 47．請求の範囲第45項に記載の方法に従ってコロナウイルスワクチンを調製する工程及び治療有効量のワクチンをそれを必要とする哺乳類に投与する工程を含むことを特徴とする哺乳類をコロナウイルス感染から保護する方法。 48．請求の範囲第46項に記載の方法に従ってFIPVワクチンを調製する工程、及び治療有効量のワクチンをそれを必要とするネコ科に投与する工程を含むことを特徴とするネコ科をFIPVから保護する方法。