JPH09509571A

JPH09509571A - クローン原性線維芽細胞を調製する方法、線維芽細胞を遺伝子トランスフェクションする方法及びかくして得られた遺伝子トランスフェクション線維芽細胞

Info

Publication number: JPH09509571A
Application number: JP7522130A
Authority: JP
Inventors: ローゼンタール、フェリシア・エム; リンデマン、アルブレヒト; ベーム、トーマス; マルテルスマン、ローランド; フェールケン、ヘンドリク; クルムブルク、ペーター
Original assignee: クリニクーム・デア・アルベルト−ルドヴィヒス−ウニヴェルジテート・フライブルク
Priority date: 1994-02-24
Filing date: 1995-02-23
Publication date: 1997-09-30
Also published as: US6093393A; WO1995023216A1; AU1811795A; EP0748374A1; CA2183438A1; DE4406073A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、クローン原性線維芽細胞を調製する方法に関するのであって、本方法においては、ドナーから組織を切除・摘出し、該組織から個々の細胞を単離し、得られた細胞懸濁液を濾過し、細胞懸濁液に含まれている細胞を洗浄し、機械的粉砕によって個別の細胞を単離することなく細胞を組織培養物に変換し、次いでコラゲナーゼ単独によって酵素処理を行うのであり、また該線維芽細胞には少なくとも１つの遺伝子をトランスフェクションにより挿入するのであるが、当該遺伝子は生物学的活性タンパク質、好ましくは治療上活性を持つタンパク質、たとえば成長因子、ホルモン、酵素、凝固因子または凝固阻害物質をコードするものである。

Description

【発明の詳細な説明】クローン原性線維芽細胞を調製する方法、線維芽細胞を遺伝子トランスフェクションする方法及びかくして得られた遺伝子トランスフェクション線維芽細胞本発明は、クローン原性線維芽細胞を調製する方法、線維芽細胞を遺伝子トランスフェクションする方法及びかくして得られた遺伝子トランスフェクション線維芽細胞に関する。多種多様な疾患の治療法においては、特に生物学的に活性のある分子で、ヒトの生体でも産生できるものを、医学的に有効な用量で生体に供給することが望ましい。しかしながら、生体外で調製した生物学的活性分子を医学的に供給することは、当該活性化合物を頻繁に而も多くの場合は一日当り数回も非経口投与しなければならず、またその上、単回皮下投与では充分でないことが往々にしてよくあり、そのため一日につき数回に分けて静脈内投与薬量を投与することが必要となる、という短所・欠点を有している。 SU 13 17 021 A1は、ヒト皮膚由来の二倍体幹細胞及びウイルスを培養する目的で単離された胚筋細胞に関する。 SU 15 18 370 A1は、診断薬剤を製造を目的とするヒト皮膚および筋肉の胚幹細胞培養物に関する。 R．Jan Freshneyの著作になるハンドブック“Culture of Animal Cells”第２版（Alan R．Liss Inc.，New York，1988）の第９章には、組織単離および初代（細胞）培養物が記載されている。以下では、ヒト線維芽細胞を調製する方法について述べるが、この方法では、生検においてドナーの皮膚から組織を切除摘出し、その組織から個々の細胞を単離し、細胞懸濁液中に存在する細胞を洗浄して細胞を組織培養に供するのである。但し、この方法は、専ら細胞単離として、コラゲナーゼを用いて酵素的処理を行うことによって細胞を機械的に単離することから成る。本発明の目的は、この種の細胞を生物学的活性を有する分子を産生出来るようにしたものを入手・利用出来る方法を提供することである。本発明は、ヒトクローン原性線維芽細胞を調製する方法及び線維芽細胞を遺伝子トランスフェクションする方法を開示する。り好ましくは皮膚から切除摘出するが、これら試料の大きさは0.5cm²から約２cm² までとする。この種の組織試料は、既知の通常使われている外科的生検方法で摘出することが出来る。生検によって得られた試料は、メスまたは相当する器具を使って直径２mm以下の細片に刻む。これらの細小片は次いで、表皮層を上側にして細胞培養プレート上に広げればよい。好ましくは、10％ウシ胎仔血清を含有するダルベッコ（Dulb ecco）の改良イーグル培地（DMEM）および通常の添加物を培地として用いることができる。本発明においては、組織試料を最初は約0.5cm²の大きさに刻むだけにし、その後この細片を個々の細胞の単離を促進する酵素を含む培地（DMEM）でインキュベートする方がより有利であることが判明したのである。本発明の範囲に於いては、コラゲナーゼ、ジスパーゼ（中性プロテアーゼ）またはヒアルロニダーゼを個々の細胞の単離を促進するような性質を持った酵素として使用するのが好ましく、これらの酵素は個別に又様々に組み合わせて使用することもできる。酵素処理の結果として遊離した細胞は、塩化ナトリウムのリン酸緩衝液で洗浄し、細胞培養瓶にほぼ２×104/cm²の密度で播種する。線維芽細胞培養物には、通常週に２回新しい増殖培地を加える。培養が集密状態に達したならば、細胞をトリプシン/EDTAで処理して集めればよい。細胞を洗浄し、計数し、再び１×10⁴細胞/cm²の密度で播種すると、新たな増殖サイクルの始まりである。本発明においては、直径10cmのペトリ皿に入っている約10²のクローン原性線維芽細胞にいわゆるフィーダー細胞（約５×10⁵細胞）を加えることが推奨され、こうすると平板培養効率が９〜24％にまで高まり、改良される。フィーダー細胞は約50Gyまたは100Gyの強度で照射する。好ましくは、米国基準培養菌株コレクションから入手できるヒト胚WS-1線維芽細胞又はその他のマウスNIH3T3線維芽細胞をこの目的のために使用する。ヒトクローン原性線維芽細胞を調製する特に有効な方法では、生検により得た組織試料をまず最初にすべて0.5cm²以下の小片に刻む。次いでこれらの組織を、 2.5単位/ml濃度で酵素ジスパーゼを使って４℃で16時間消化する。表皮を剥離除去してから、皮膚細胞を大きさが数ミリまでである小片に刻む。こうして得られた物質を、コラゲナーゼ（200単位/ml）とヒアルロニダーゼ（300単位/ml）の混合液を使って振盪水槽中で37℃で３時間さらに消化させる。最後に、細胞をメッシュサイズ70μmの篩で漉し、洗浄してから細胞培養に供する。 60歳未満のドナーからは、平均時間として89（±８）日経過後に約10¹¹の細胞を得ることが可能であることが確認された。図１から、平均倍化時間が約4.3（±0.6）日であることが判る。場合によってはそれ以降の増殖は著しく緩慢になることがあるが極めて多くの場合はプラトーに到達し、それ以上細胞数の増加はなかった。ただし、かなりの数の培養物では、細胞数が10¹⁵以上に達することが可能であり、而も増殖曲線の平坦化は認められなかった。より高齢のドナーから由来する培養物の増殖速度は遅くなり、より早く停滞することがわかった。図２は、細胞調製の方式別に線維芽細胞を比較したものである。酵素的に調製した線維芽細胞は、機械的調製方法により皮膚生検から得ただけのものよりも増殖能力が明らかに大きかった。様々なドナーから由来する細胞培養物は、生検試料から増殖させただけの細胞と比べて、酵素的処理により細胞を調製した場合常に増殖挙動が優れていた。図３から、酵素的調製方法を用いて腹膜細胞から有効に自家線維芽細胞を得ることが可能でありことが判る。。漿膜および皮膚の培養物は、当初は等しい速度で増殖したが、漿膜からの二倍体線維芽細胞は同年齢の皮膚培養よりも早くプラトーに達した。二倍体線維芽細胞の平板培養効率は、永久的にトランスフェクションしたクローンに関しては極めて重要である。図４は、フィーダー細胞が存在しない場合は二倍体線維芽細胞の増殖僅かでしかないことを示している。照射済みヒトWS-1線維芽細胞を加えることによって、平板培養効率は９〜24％にまで増大した。未照射細胞から得た上清液を３日後および８日後に収集し、また20Gyおよび100Gyで照射した細胞から得た上清液を同様に採取した。未照射二倍体線維芽細胞の上清液からは24時間／10⁶個の細胞当り1.2〜20.5ngのインターロイキン-6が見出された。照射を行ってもインターロイキン-6の分泌に有意な変化はなかった。それとは逆に、未照射二倍体線維芽細胞で生成されたGM-CSF（コロニー刺激因子）またはTNFα（腫瘍壊死因子）の量はほんの僅かに過ぎなかったのに対して、照射後の上清液からは24時間／10⁶個の細胞当り最高90pgのGM-CSFおよび50pgのTNFα が測定された。照射によるこれらサイトカイン類の誘導は、その都度個別の培養物によって大きく依存し、異なるものであった。この新規の方法によって調製することが出来る二倍体線維芽細胞は、例えば癌患者から容易に得ることもできる。これらのクローン原性線維芽細胞は、遺伝子トランスフェクションに適した開始物質になる。トランスフェクションされたこの種の線維芽細胞は、自家細胞としてドナーに再び供給することもできる。上記にて詳述した方法で得ることができる線維芽細胞は、トランスフェクションにより遺伝的に操作することもできる。遺伝子トランスフェクションの過程では、治療上有効である遺伝子産物をコードする一つ以上の遺伝子をクローン原性線維芽細胞に挿入する。このような性質の遺伝子産物としては、成長因子、特に造血成長因子、またたとえばインスリンなどのホルモン、第VIII因子などの凝固因子、凝固阻害物質、たとえばリソソーム酵素などの酵素類あるいはアデオノシンデアミナーゼがある。本発明の特に好ましい一つの実施態様においては、G-CSFあるいはエリスロポイエチンなどの造血成長因子をトランスフェクションによって線維芽細胞に挿入する。トランスフェクションには適切なベクターが必要である。本発明の好ましい一つの実施態様においては、レトロウイルスベクターを使用する。レトロウイルス系からの必須遺伝子に加えて、このベクターにはいわゆる自殺遺伝子、たとえば単純ヘルペスウイルスに由来するチミジンキナーゼ遺伝子などを含めることもできる。こうすることによって、ガンシクロビル存在下で細胞を選択的に破壊することができる。更にベクターには遺伝子発現の調節を可能にする誘導プロモーターを含めることができる。ベクターとして使用するのに好ましいのはレトロウイルスベクターN2で、このものは、モロニーマウス白血病ウイルス（MLV）のゲノムに由来し、選択的マーカーとしてネオマイシン耐性用の細菌遺伝子を含有する。ヒトインターロイキン -2、マウスインターフェロン-γおよび単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼプロモーターやその他の遺伝子をコードするDNAフラグメントを得るのに使用したフラグメントおよび制限酵素の由来については、既に記述されている［Gansba cherら、J．Exp．Med．172巻1217〜1224頁（1990年）；Gansbacherら、Cancer R es．50 巻7820〜7825頁（1990年）；Gansbacherら、Blood 80巻2817〜2825頁（1 992年）］。本方法で使用するのが好ましい別のベクターについては、Science 256巻445頁（1992年４月）に記載されている。これは、アデノウイルスの外側エンベロープで、このエンベロープではアデノウイルス遺伝子が欠失されているか又は何等かの方法で不活性化されている。リシン尾部を処理する抗体はウイルスエンベロープに結合し、リシン尾部はトランスフェクションするDNAに結合する。このベクター系では、DNAはウイルスエンベロープ内にパッケージングされているが、外部でウイルスエンベロープに付着している。このベクターは比較的大きなDNAフラグメントをトランスフェクションできるようにする。新しいプロセスに従って得られるヒトクローン原性線維芽細胞は、前記した方法を用いてトランスフェクションすることもできる。安定した遺伝子トランスフェクションのための標的細胞として適しているのは、クローン原性線維芽細胞だけであるので、このようにしで得られた線維芽細胞は外来遺伝子の発現に極めて適している。たとえば、サイトカイン遺伝子でトランスフェクションした線維芽細胞は、腫瘍または感染予防のためのワクチン接種においていわゆる傍観細胞として使用することができる。他の遺伝子をトランスフェクションした線維芽細胞は、ドナーに再導入し、当該疾患で欠落している分子を生体に長期にわたって供給するのに使用することができる。このような場合、そのような分子としては、たとえば血液凝固第VIII因子、プロテインSまたはプロテインC、あるいはインスリン、エリスロポイエチンまたはその他の造血成長因子であってもよい。グルコセレブロシダーゼまたはアデノシンデアミナーゼなどの酵素を供給することも可能である。この新しい線維芽細胞は、自家系でも又他家系でも使用することも出来る。但し、免疫学的観点から可能である場合に限る。好ましい一つの実施態様によれば、遺伝子トランスフェクションされたかかる線維芽細胞は、遺伝子導入という物理的方法によって得られる。このような遺伝子導入なる物理的方法の典型的な例としては、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、粒子衝撃および陰イオンまたは陽イオンリポフェクションがある。エレクトロポレーションは、たとえば次のように行う。４×10⁶の細胞を塩化ナトリウムのリン酸緩衝液で二回洗浄し、エレクトロポレーション緩衝液137mmo l（HEPES 20mmol、塩化ナトリウム137mmol、塩化カリウム５mmol、Na2HPO4 0.7m mol、ショ糖６mmol、ウシ血清アルブミン１mg/ml、pH7.0；（Goldsteinら、Nucl eic Acids Research 17巻3959〜3971頁（1989年））に播種し、0.4cmエレクトロポレーションキュベット（Bio-Rad，Munich，Germany）中で20μgのDNAと氷上で 10分間インキュベートする。次いで細胞を250Vに通電したエレクトロポレーション装置中で960μFの静電容量でエレクトロポレーションする。氷上で10分間インキュベートした後、細胞を通常栄養液が入った50ml細胞培養容器に移す。標準的な陽イオンリポフェクションは、たとえば次のように行う。トランスフェクション前日に、細胞をウェルあたり10⁵の密度で35mmペトリ皿（たとえばFal con製）に適用する。トランスフェクション複合体を得るために、２μgのDNAを異なる比率のリポフェクション剤（DOSPA/DOSPE 3:1）（Gibco，Germanyから入手可能）とともにDMEM 200μlに加え、その全体を室温で30分間インキュベートする。次いで細胞をDMEMで２回洗浄し、トランスフェクション複合体をDMEMで１ mlに希釈してから細胞に加える。１時間後に通常の培地１mlを加え、24時間後に培地を完全に変える。本発明に従って得られる遺伝子トランスフェクションされた線維芽細胞は、特にin vivo治療用の医薬品として使用することができる。この場合、遺伝子トランスフェクションされた線維芽細胞は、長因子遺伝子が存在する限り、例えば造血幹細胞を動員させるのに使用することができる。本発明はさらに、内部人工器官に好ましく使用することが出来而も前記の遺伝子トランスフェクションした線維芽細胞を含有する生体適合性材料で構成される支持体に係わるものである。この場合、遺伝子トランスフェクションした線維芽細胞は、まずin vitroで生体適合性材料と共に共培養し、かくして表面に細胞が増殖した材料が移植されるのである。本発明の一つの好ましい実施態様に従えば、内部人工器官は生体適合性の、好ましくはヒト適合性合成材料、たとえばフルオロポリマーまたはポリエステルで製作される人工容器器官であって、この人工器官を用いて遺伝子トランスフェクションした線維芽細胞をin vivoに移植する。又はその代わりに、人工容器器官の形状を呈する内部人工器官は、天然の生体適合性材料、できればヒト適合性材料、たとえばコラーゲンフリースもしくはウシ心膜由来の材料から構成されるものであり、この人工器官を用いて遺伝子トランスフェクションした線維芽細胞をin vivoに移植する。本発明の一つの好ましい実施態様においては、この新しい方法によって得られる線維芽細胞をコラーゲン被覆したポリビニルピロリドンマトリックスと共培養し、この形状で類器官として腹腔内（i.p.）又は皮下（s.c.）適用される。このような物体は、in vivoでは新生血管増殖を受けることがわかっている。in vivo で必要な遺伝子産物の量は、トランスフェクションする細胞の量によって調節されるのであるが、適切な場合は誘導プロモーターによっても調節される。ポリビニルピロリドンマトリックスの代わりに、フルオロポリマー繊維、特にポリテトラフルオロエチレン繊維などの担体物質も使用することができ、このような物質は次に、にコラーゲンなどの適切な被覆剤をオーバーレイする。これらの繊維はその後、細胞外ゲルマトリックスに埋め込んで、たとえば小外科手術によって腹腔内適用することができる。実施例１ａ）生検通常の外科手術により、癌患に罹患しているドナー50例から約0.5〜２cm²の大きさの皮膚および漿膜の試料を得た。生検試料はダルベッコの改良イーグル培地（EMEM）に保存し、取り出した日にもさらに処理をした。ｂ）機械的処理生検試料はメスで直径２mm以下の細片に切断した。これらの細片を表皮側を上にして細胞培養プレート上に広げた。高濃度のグルコースおよび10％ウシ胎小血清（Boehringer Mannheim）を含有し、L-グルタミンおよびピルビン酸ナトリウムを添加強化したDMEM（Gibco BRL）を増殖培地として使用した。ｃ）酵素的処理生検試料を約0.5cm²以下の細片に切断した後で、これらの試料をコラゲナーゼ（Biochrom，Berlin）、ジスパーゼ（Boehringer Mannheim）またはヒアルロニダーゼ（Sigma，Deisenhofen）を個別にまたは種々の組み合わせで含有するDMEM 培地と共培養した。この酵素処理によって懸濁液中に放出された細胞を塩化ナトリウムのリン酸緩衝液で洗浄し、細胞培養瓶に２×104/cm²の密度で播種した。ｄ）長期培養線維芽細胞培養物を５％CO2含有湿潤大気中で37℃で培養し、一週間に二回新しい増殖培地を加えた。培養基が集蜜状態になったら直ちに、トリプシン/EDTA で処理して細胞を収集し、洗浄してから計数し、再び１×10²細胞/cm²の密度で播種した。各継代において、細胞数および希釈率に基いて細胞数を外挿した。ｅ）平板培養効率直径10cmの培養プレートに100個の細胞を培養した。翌日、５×10⁵個のヒト胚 WS-1線維芽細胞またはNIH3T3マウス線維芽細胞を各培養プレートに加えた。２種類の細胞系（いずれもATCC，Rockville，MDから入手可能）を100Gyで照射してからいわゆるフィーダー細胞として使用した。４週間培養した後、コロニーを50％エタノール中２％メチレンブルー液で染色して計数した。培養期間中、培地は２週間毎に変えた。ｆ）サイトカインの測定栄養培地を全て変えた後24時間して、準集蜜状態の培養物から上清液を収集した。細胞を計数し、上清液中のサイトカイン濃度を市販のELISAテストを使って測定した。実施例２様々な酵素を用い、実施例１に記載した実験条件を使用して（実施例１ｃ）、異なる酵素を用い、実施例１に記載した実験条件を使用して（実施例１ｃ）、二倍体線維芽細胞の長期培養物を確立する際の有効性を確認した。最善の結果は、細片に刻んだ生検試料をまず約2.5U/mlの濃度のジスパーゼで４℃において16 時間消化させた場合に得られた。このように処理した後、細胞フラグメントから表皮は容易に剥離した。次いで、皮膚細胞をさらに細かく数mmの細片に刻んだ。この細胞材料を、いて２回目の酵素処理として、コラゲナーゼ（200U/ml）およびヒアルロニダーゼ（300U/ml）の混合液を用いて振盪水槽中37℃において３時間の第二回目の酵素処理に供した。最後に、これらの細胞を70μmの篩にかけ、洗浄してから細胞培養に供した。図１は、培養日数に対してドナー細胞（数）をプロットした図であるが、曲線の後の数字はドナーの年齢を表わす。この図から、本方法を用いて60歳未満のドナーから得た二倍体線維芽細胞培養物は、一般的に類似した増殖特性を示し、平均倍加時間が4.3±0.6日であることが判る。図２は、異なる年齢のヒトドナーにおける培養日数に対してドナー細胞（数）をプロットしたものである。本図において、□印は、酵素処理による線維芽細胞調製数を、△印は、機械的手段のみによる個々の細胞の単離数を示している。この図から、酵素法を使って調製した線維芽細胞培養物は、単に皮膚生検試料の機械的処理によって得た線維芽細胞培養物に比べて増殖能力が明らかに優れていることが判る。この新規の方法を使用すると、二倍体線維芽細胞培養物は、皮膚細胞からだけでなく腹膜細胞からも得ることができる。漿膜由来の細胞培養物は、当初は皮膚由来の細胞培養物と類似した態様で増殖するが、漿膜由来の二倍体線維芽細胞は、年齢が相応する二倍体皮膚線維芽細胞培養物に比べて細胞数が著しく低い状態でプラトーに達することが見出された。図３は、年齢が45〜59歳のドナーの皮膚（左図）または漿膜（右図）に由来する線維芽細胞培養物の培養日数に対して細胞数をプロットしたものを比較して示し。図４は、二倍体線維芽細胞培養物の平板培養効率に及ぼすいわゆるフィーダー細胞の影響を示す。二倍体皮膚細胞繊維芽細胞培養物は、酵素で処理して調製した。細胞培養瓶に極めて低い密度で細胞を播種して平板培養効率を測定した。二コロニー形成を示さなかったが、WS-1細胞株の照射済みヒト線維芽細胞を添加すると、平板培養効率を９〜24％までに増大させることが可能であった。実施例３自家二倍体線維芽細胞培養物中のサイトカインの産生に特に注目した。この目的のために、未照射二倍体線維芽細胞及び20Gyもしくは100Gyで照射した二倍体線維芽細胞の双方から培養懸濁液を採取した。培養上清液は、照射済み細胞の場合は照射後第３日および第８日に採取した。未照射二倍体線維芽細胞から得た上清液中には、24時間／10⁶個の細胞当り1.2 〜20.5ngのインターロイキン-6が検出した。照射してもIL6の分泌に有意な変化は起こらなかった。培養物の３分の１以上が、測定可能な量のGM-CSF（最高３ng /24時間/10⁶個の細胞）が産生され、照射後も有意な変化はなかった。これとは異なって、未照射二倍体線維芽細胞は、測定可能な量のTNFαは産生しなかったものの、照射後には個別の事例では24時間に10個の細胞当り最高50pgのTNFαが測定された。これらの結果を示したのが図５で、ここでHP-33、KE-58、KP-68なる名称は、異なる細胞株を表わす。実施例４以下でさらに詳述するマウスモデルにおける予備的実験を行って、ヒト線維芽細胞を遺伝子トランスフェクションするための新しい方法の有効性を実証した。マウスモデルで得られた結果は、ヒト線維芽細胞に対して相応して当てはめることができる。ａ）ベクターベーシックレトロウイルスベクターN2は、モロニーマウス白血病ウイルス（ML V）のゲノムに由来し、選択マーカーとしてのネオマイシン耐性細菌遺伝子を含有する。主要即時早期ヒトCMVプロモーター（major immediate early human CMV promoter）、アデノシンデアミナーゼ（ADAプロモーター）、ポリ-Aシグナル、マウスGM-CSFをコードするDNAフラグメントは、N2ベクター中の異なる部位にクローンした。N2ベクターのネオマイシン耐性遺伝子中のXho I 制限部位にCMV-GM -CSF融合生成物をクローンして、N2ベクター／CMVプロモーター／マウスGM-CSF という構築物を作製した（図６上）。レトロウイルスベクターDC/AD/R/GM-CSF（図６下）を作製するために、クレノウフラグメントを使って充填した酵素Mlu I の制限切断部位にADAプロモーターを逆方向にクローンした。マウスGM-CSF cDNAも同様に、制限酵素SnaB Iにより作成しておいた切断部位に逆方向にクローンしたが、ポリ-Aシグナルはクレノウを使って充填した3'LTRポリリンカーのApa I 部位にクローンした。これらのレトロウイルスベクターは、ベクターDNAをヘルパーなしのエコトロープパッケージング細胞カブGP＋E-86）にエレクトロポレーションすることコによって対応するウイルスに変換した。G418（0.7mg/ml genticin，Gibco Laboratory，Grand I sland，NY）上で選択した後に、コロニーを単離し、展開してプロデューサー細胞株を形成せしめた。細胞を含まない上清液をNIH 3T3細胞上で試験して、ウイルスの力価を求めた。図６には、使用したレトロウイルスの構造を示す。ｂ）細胞株及び腫瘍細胞と線維芽細胞の感染 CMS5は、BALB/c遺伝子バックグラウンドからのメチルコラントレン誘発性非転移性線維肉腫である。NIH 3T3は、NIHスイスマウス胚（CRL 1658）から作製された接触阻害性線維芽細胞株である。BALB 3T3クローンA31は、BALB/cマウス胚（C CL 163）から調製された接触阻害性非腫瘍形成性線維芽細胞である。いずれの線維芽細胞株もATCCから入手した。細胞を、10％ウシ胎仔血清、100U/mlのペニシリン、100μg/mlのストレプトマイシンおよび２mmol/lのL-グルタミンを添加したダルベッコの改良イーグル培地で培養した。高力価のウイルスから分泌されるウイルス産生細胞株を使用して、CMS5細胞および線維芽細胞に感染させた。G418 で感染させた後で、クローンまたはバルク感染細胞を株に拡大し、さらに詳しく分析した。ｃ）サイトカイン測定レトロウイルスに感染させたCMS5細胞および線維芽細胞の上清液中へのGM-CSF の分泌及び投与したマウスの血清中のGM-CSF濃度をバイオアッセイで測定し、EL ISAテストを使って確認した。半集密状態の腸管外細胞即ちGM-CSF分泌細胞の上清液を24時間後に採集し、細胞数を測定し、マウスGM-CSF産生の有無について上清液を調べた。 50Gyで照射した10⁶のCMS5細胞またはベクターN2/CMV/GM-CSF/CMS5でトランスフェクションした10⁶の細胞について調べた。照射当日に、細胞を小型の組織培養瓶に入れ、24時間培養上清液中のGM-CSFの量を照射後第３、６、９、12日に測定した。検討対象としたGM-CSFの生物学的活性は、GM-CSFを含有する上清液がGM-CSF依存性マウス32DC13細胞のDNA中に3H-チミジンを組み込ませる能力を確認することによって測定した。GM-CSFなしで細胞を一晩インキュベートした後、96−ウェルの微量定量プレートの各ウェルで10⁴個の細胞を試験液の希釈液とインキュベートし、細胞を６％CO₂存在下で37℃で６時間培養した。その後、１μCiの3H-チミジンを加え、37℃でさらに15時間インキュベートを続行した。洗浄した後、液体シンチレーションカウンタを使って細胞を評価した。GM-CSF活性は、１分あたりの計数（cpm）として表し、また10⁶個の細胞当りの産生量を組換えマウスGM-CSF の標準曲線と比較してng/24時間の単位で算出した。これに加え、ELISAテストでもGM-CSFの産生量を確認した。成長因子産生自家細胞または同種異系細胞の照射は、in vivo注入後の細胞がそれ以上増殖するのを防止するために用いられる可能性がある。このような理由で、GM-CSF分泌細胞をまず50Gyで照射し、それからGM-CSFの分泌を照射後12日まで測定した。図７から、GM-CSFの産生量は照射後当初は増加したことが判る。照射前の測定では約40ng／細胞10⁶個/24時間であったのが、照射後第３日および第６日には約130ng/10⁶個の細胞/24時間となっている。第９日には、この値は照射前に得られた値に戻っており、照射後第12日の24時間あたりのGM-CSF産生量は開始値の約３分の１になっていた。生存細胞の数はすでに第６日には開始値の10分の１に減っていたので、すでに生きていない細胞からもいまだにGM-CSFが放出されることは明らかである。ｄ）遺伝子トランスフェクションした細胞のマウスへの移植この実験には７〜10週齢の雌BALB/cマウスを使用した。第０日および第２日に、全マウスに150mg/kgのシクロホスファミドを腹腔内投与した。第１群のマウスにはそれ以上注入はせず、第２群のマウスには組換えマウスGM-CSF 100ngを第３日に２回皮下注した。第３日に、第２群には合計10⁷個のN2/CMV/GM-CSF-CMS5細胞を投与したが、これらの細胞は事前に50Gyで照射してあり、また細胞は二つの部位に皮下注した。第４日以降は毎日、マウスの尾静脈から血液をヘパリン化Ep pendorf試験管に採取した。赤血球を溶解してからNeubauer細胞チャンバで白血球数を数えた。２日おきに、メイ-グリュンワルド-ギムザ染色してから、血球分画像を求めた。マウスGM-CSFの血清値を、照射済みGM-CSF分泌線維肉腫細胞注入後第１、４、10日に測定した。実施例５雌BALB/cマウスを、実施例４のｄ）に述べたように処置した。第３日以降は、末梢白血球数を毎日確認し、２日毎に白血球分画像を求めた。このマウス系統では、塩基性白血球数は、白血球が9000〜10,000/μlである。シクロホスファミドを投与したところ、白血球数は第３日には約1000〜1500/μlに低下した。シクロホスファミド注射後第６日までは、白血球数に大きな変化は見られなかった。全処置群で、ほぼ同じ値が得られた。第７日以降は、GM-CSF投与マウスとシクロホスファミドのみを注射した対照群マウスの間で白血球数絶対値に差が見られる。 GM-CSF分泌自家細胞を皮下注射または単回注射した後では、処置開始後第７日および第８日に、成長因子投与マウスは対照群マウスの約２倍の値になっている。組み換え成長因子を投与した群は、GM-CSF分泌線維肉腫細胞を投与した動物と同様に、シクロホスファミド注入後第８日には白血球数は正常になっている。それに対して対照群マウスでは、いまだに正常値の半分の値である。図８は、処置群別に見た白血球分像（単球、顆粒球、リンパ球）である。白血球分画像を見ると、投与していないBALB/cマウスでは、単球が１％、顆粒球が15〜30％、リンパ球が70〜85％が存在する。シクロホスファミド投与開始後第５日は絶対的好中球減少相にあるが、この時点ではどの処置群でも白血球分画像では実質的にリンパ球しか見出せない。第７日の白血球分画像にも明らかに差が見られ、組み換えGM-C SF投与マウスおよびGM-CSF分泌細胞投与マウスの白血球数絶対値は、シクロホスファミドのみの投与を受けた動物に比べてほぼ２倍であった。成長因子の投与を受けていない動物では、GM-CSFまたはGM-CSF分泌線維芽細胞を皮下注されてすでに顆粒球の絶対数が正常に達している動物に比べると、単球は約15％、顆粒球は約25％にすぎない。リンパ球数絶対値の差は処置群間では認められない。図８は従って、照射済みの遺伝子トランスフェクションした自家細胞を１回注入しただけでも、化学療法を受けている動物の血液像に生物学的影響を及ぼすことを実証している。実施例６図９には、白血球数の経時変化を示す。いずれのマウスにもシクロホスファミドを投与した。１つの対照群にはGM-CSFをまったく投与しなかった。別の対照群には、組み換えGM-CSFを皮下注した。３番目の群にはGM-CSFを産生する遺伝子トランスフェクションした細胞を皮下投与した。実施例７： in vivoで遺伝子トランスフェクションした細胞の選択的破壊この実施例では、異なる２つの構成物を含有するマウスCMS-線維肉腫細胞を移植した。１．pCMV.GCSF.iresNEOは、CMVプロモーターの調節下でヒトG-CSF遺伝子を含有し、またIRES（内部リボソームエントリー部位）経由してネオマイシン耐性遺伝子を含有する。従ってこの場合は、G-CSFおよびネオマイシンホスホトランスフェラーゼの発現を意図する。２．pCMV.GCSF.iresTK/NEOは、CMVプロモーターの調節下でG-CSF遺伝子を、また IRES経由して単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ／ネオマイシン耐性遺伝子融合を含有する。この場合、G-CSFおよびネオマイシンホスホトランスフェラーゼに加えてTKの発現を意図し、したがって最終的にはプロドラッグであるガンシクロビル投与後にこれをリン酸化し活性化することを意図する。図10aは、前記の構成物１（左側）および構成物２（右側）の未照射CMS-5細胞2.5×10⁵個を３匹のBALB/cの腫瘍に皮下接種した後の経過時間（日）に対してnl当たりの細胞数としての白血球数（n/nl）をプロットしたもの示している。腫瘍接種後の白血球数の経時変化を図の左下および右下に示すが、この場合、プロドラッグのガンシクロビルも１日２回腹腔内投与してある。やはり３匹のBALB-c試験マウスで調べた同一構成物に関する腫瘍の大きさ（mm）の経時変化（日単位）を図10a に示す。各構成物の場合につきBALB-cマウスの２群に、前記のベクターでトランスフェクションしてある未照射CMS-5細胞2.5×10⁵を皮下注した。第７日（d7）以降は、いずれの場合も１群のマウスにガンシクロビル（GCV）を１日２回腹腔内投与した（図10a+bの、それぞれの場合につき下側の図を参照）。白血球値および腫瘍の発育を監視した。GCVを投与し、p.CMV.GCSF.iresTK/NEOでトランスフェクションしたGMS-5細胞を投与した実験群では、白血球数が低下し、腫瘍が退縮した（図10a+bの右下を参照）。これから、TK遺伝子によりトランスフェクションした腫瘍細胞でさえも、「自殺遺伝子」発現機構によってin vivoで選択的にスイッチオフできることがわかる。マウスでは副作用は認められず、GCV投与終了から５週間後の時点でも腫瘍がない。実施例８： GCSF遺伝子でトランスフェクションした線維芽細胞を単回皮下注射した後の造血の再構成（遺伝子移入の物理的方法、この場合はリポフェクションを使用した線維芽細胞のトランスフェクション、ここではヒトG-CSFの例を使って示す）図11は、トランスフェクションした線維芽細胞のある場合とない場合における化学療法およびサイトカイン療法実施後の注入後経過時間（日）に対する白血球数（WBC/μl）を示している。シクロホスファミドのみ投与したときの経時変化は左側に、またシクロホスファミドとともに組み換えヒトG-CSFを１日２回皮下投与したとき（下にrhG-CSFと記す）の経時変化を左から２番目に示す。シクロホスファミド投与および５×10⁶のG-CSF-遺伝子トランスフェクションBALB-3T3 線維芽細胞単回注入の後における白血球数の経時変化は、図の右から２番目に、シクロホスファミド投与および５×10⁶の照射済みG-CSF-遺伝子トランスフェクションBALB/3T3線維芽細胞単回注入の後における白血球数の経時変化はいちばん右に示す。これらのプロットでは、使用した３匹の試験マウスそれぞれの白血球数の変化を□、◇、○で記した曲線で示す。３つの図から、白血球の再生はトランスフェクションした線維芽細胞を単回注入した群（右から２番目および右）では組み換え蛋白を１日２回皮下注した場合（左から２番目）と少なくとも同じくらい迅速に起こることがわかる。その次の表は、G-CSF投与が末梢血中への造血幹細胞移動に及ぼす影響を示している。この表では、試験群の全マウス（各群３匹ずつ）で白血球が3500/μl以上になった日ならびにその翌日の白血球数を比較している。さらに、コロニー形成細胞数即ち造血幹細胞数に関する情報を提供してくれる細胞の数もCFUと略記して示してあり、また４群それぞれのCFUと白血球数の比も記してある。未照射および照射済みのいずれのG-CSF-遺伝子トランスフェクション線維芽細胞でも、単回注入することでrhG-CSFを１日２回皮下注射した場合と同じくらい造血幹細胞の末梢血への動員を可能にすることが判る。これは臨床的に興味深いことである。その理由は、種々の腫瘍を有する患者において高用量化学療法実施後に採用される幹細胞移植では、これらの幹細胞を、たとえば白血球フェレーシスなどの方法で採集しなければならないからである。低用量化学療法実施後には、現在ではこの目的で患者に数日間にわたってG-CSFを皮下注射している（前記の動物モデルとの関連で論じた）。ただし、この型式の非経口投与は、技術的に精巧なばかりでなく極めて費用が高くなり過ぎる。従って、頻繁な皮下注射の反復を単回注射で代替することが望ましいであろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＡ６１Ｋ 38/22 9051−4ＣＡ６１Ｋ 48/00 38/43 8615−4ＣＣ０７Ｈ 21/04 Ｂ 38/55 9282−4ＢＣ１２Ｎ 15/00 Ａ 47/30 9282−4Ｂ 5/00 Ｂ 48/00 9051−4ＣＡ６１Ｋ 37/02 ＡＥＤＣ０７Ｈ 21/04 9051−4Ｃ 37/24 Ｃ１２Ｎ 5/10 9051−4Ｃ 37/48 15/09 9051−4Ｃ 37/465 9051−4Ｃ 37/64 (72)発明者ベーム、トーマスドイツ国、デー−79279、フェルステッテン、ウッツェンガーセ、10番 (72)発明者マルテルスマン、ローランドドイツ国、デー−79104、フライブルク、ゾンハルデ、72番 (72)発明者フェールケン、ヘンドリクドイツ国、デー−79110、フライブルク、シュリッペンホーフ、８番 (72)発明者クルムブルク、ペータードイツ国、デー−79110、フライブルク、ガオバーホーフ、５番

Claims

【特許請求の範囲】１．ドナーから組織を切除して該組織から個々の細胞を単離し、かくして得られた細胞懸濁液を濾過し、該細胞懸濁液に含まれている細胞を洗浄し、機械的粉砕による個々の細胞の単離を行うことなく細胞を組織培養物に変換し、次いでコラゲナーゼ単独で酵素処理を行うことから成るクローン原性線維芽細胞を調製する方法。２．該組織が生検によってドナーの皮膚から切除される、特許請求の範囲第１項に記載された方法。３．該細胞がヒト細胞または異種細胞である、特許請求の範囲前記各項に記載された方法。４．コラゲナーゼ、ジスパーゼ及び／またはヒアルロニダーゼを酵素処理に使用する、特許請求の範囲第１項に記載された方法。５．線維芽細胞をフィーダー細胞として照射済みのヒト線維芽細胞またはマウス線維芽細胞の存在下で培養する、特許請求の範囲前記各項に記載された方法。６．特許請求の範囲第１項乃至第５項に記載された方法によって得ることのできるクローン原性線維芽細胞。７．二倍体線維芽細胞である、特許請求の範囲第６項に記載された線維芽細胞。８．トランスフェクションによって少なくとも１つの遺伝子を線維芽細胞に挿入することから成る線維芽細胞をトランスフェクションする方法において、当該遺伝子が生物学的活性タンパク質、好ましくはたとえば成長因子、ホルモン、酵素、凝固因子または凝固阻害物質など治療上有効なタンパク質をコードするものである前記方法。９．該成長因子が造血成長因子である、特許請求の範囲第８項に記載された方法。 10．たとえば単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子などの自殺遺伝子が治療用遺伝子に付加して挿入される、特許請求の範囲第８項に記載された方法。 11．該治療用遺伝子が誘導プロモーターによって発現される、特許請求の範囲第８項に記載された方法。 12．該トランスフェクションがアデノウイルス起因ベクター即ち受容体媒介遺伝子トランスファーを使用して行われる、特許請求の範囲第８項乃至第11項に記載された方法。 13．該トランスフェクションが遺伝子導入に係わる種々の物理的方法を使用して行われる、特許請求の範囲第８項乃至第11項に記載された方法。 14．遺伝子移入の該物理的方法がエレクトロポレーション、マイクロインジェクション、粒子衝撃またはリポフェクションである、特許請求の範囲第13項に記載された方法。 15．特許請求の範囲第６項または第７項に記載された線維芽細胞を該トランスフェクションにために使用する、特許請求の範囲第８項乃至第14項の内の一項に記載された方法。 16．特許請求の範囲第８項から第15項のいずれか一項によって得ることができる遺伝子トランスフェクションされた線維芽細胞。 17．クローン線維芽細胞である、特許請求の範囲第16項に記載された遺伝子トランスフェクションされた線維芽細胞。 18．照射される、特許請求の範囲第16項または第17項に記載された遺伝子トランスフェクションされた線維芽細胞。 19．特にin vivo治療のための医薬として遺伝子トランスフェクションされた線維芽細胞。 20．特許請求の範囲第19項に記載された遺伝子トランスフェクションされた線維芽細胞を造血幹細胞動員のために使用する用途。 21．体内人工器官として好ましく使用することが出来る生体適合性材料から作成された担体で、当該担体が特許請求の範囲第16項乃至第18項に記載された遺伝子トランスフェクションされた線維芽細胞を含有するものである前記担体。 22．体内人工器官が生体適合性の、好ましくはヒト適合性の合成材料、たとえばテフロン(R)などのフルオロポリマーやダクロン(R)などのポリエステル等で作成された人工容器器官であり且つかかる人工器官を使用して遺伝子トランスフェクションされた芽細胞がin vivoに移植される、特許請求の範囲第21項に記載された担体。 23．体内人工器官が生体適合性の、好ましくは天然由来のヒト適合性材料、たとえばコラーゲンフリースあるいはウシ心膜から得られる材料で作成された人工容器器官であり且つかかる人工器官を使用して遺伝子トランスフェクションされた該線維芽細胞がin vivoで移植される、特許請求の範囲第21項に記載された担体。