JPH09509663A - 新規ホスホルアミデートおよびホスホロチオアミデートオリゴマー化合物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 構造（Ｉ）を有する化合物が提供される；式中Ｌ基は主鎖セグメントであり、ＹおよびＴ基は問題とする標的分子と相互作用するための官能基であり、Ｘは酸素または硫黄であり、およびＥ基はＨ、コンジュゲート基または化合物の合成の間に使用される中間体基であり、Ｈホスホネート型化学を使用して製造され、そこで官能基は酸化工程の間またはカップリング工程の間に付加される。

Description

【発明の詳細な説明】 新規ホスホルアミデートおよびホスホロチオアミデートオリゴマー化合物関連出願 本発明は１９９４年２月２３日に出願された米国特許出願第０８／２００，６ ３８号の一部継続出願である。前記特許出願の内容は本明細書に引用して含まれ ている。発明の技術分野 本発明はホスホルアミデートまたはホスホロチオアミデート部分に共有結合で 結合された主鎖セグメントを有する単量体ユニットを含むオリゴマー化合物に関 する。官能基は独立して主鎖セグメント、ホスホルアミデートまたはホスホロチ オアミデート部分または両方に結合されている。置換は随意のテザー基を通して 達成できる。オリゴマーは単量体のランダムなまたは前もって決められた配列を 有するように合成される。ランダム化は主鎖セグメントで、またはホスホルアミ デートまたはホスホロチオアミデート部分において、多様な官能基の共有結合を 通して独立して達成される。単量体ユニット上の官能基または複数の官能基は、 なかんずく蛋白質、核酸、脂質およびその他の生物学的標的に対するオリゴマー 構造物の結合を可能にする。好適な態様において、本発明の化合物はホスホリパ ーゼＡ₂のような酵素の阻害剤として；ウイルス、ミコバクテリア、バクテリア （グラム陽性およびグラム陰性）、原生動物および寄生虫のような病原体の阻害 剤として；ＰＤＧＦ（血小板由来増殖因子）、ＬＴＢ４（ロイコトリエンＢ４） 、ＩＬ−６および補体Ｃ５_Aのようなリガンドーレセプター相互作用の阻害剤と して；ｐ５０（ＮＦ_kappaＢ蛋白質）およびｆｏｓ／ｊｕｎのような転写因子を 含む蛋白質／蛋白質の相互作用の阻害剤として；およびＩＣＡＭ誘導（ＩＬ−１ β、ＴＮＦおよびＬＰＳのような誘導剤を用いて）を含む細胞に基づく相互作用 の阻害に働く。別の好適な態様において、本発明の化合物は診断試薬として（上 に示した系の各々のための試験における診断試薬として）、およびアッセイにお ける試薬として、およびプローブとして使用される。発明の背景 伝統的な薬物発見法には所望の生物学的活性についての複雑な発酵ブロスおよ び植物抽出物のスクリーニング、または潜在的薬剤を評価するために多くの新規 化合物の化学合成が含まれる。生物起源の混合物をスクリーニングする利点は多 量の化合物を同時にスクリーニングできることであり、ある場合には予期できな かった活性を有する新規で複雑な天然の生成物の発見を導くことがある。欠点は 多くの異なった試料をスクリーニングせねばならないこと、およびしばしば痕跡 量しか存在しない活性化合物の同定に多くの精製過程を実施しなければならない ことである。一方、実験室合成は明白な生成物を与えるが、各々の新規構造の製 造には著しい量の資源を必要とする。一般的に、酵素構造の高度な解析に基づい て初めから活性化合物を設計することは成功していない。 各々の古典的方法の利点を最大にするために、いくつかのグループにより組み 合わせ非ランダム化のための新しい方法を開発された。選択技術がペプチド（Ｇ ｅｙｓｅｎ，Ｈ．Ｍ．，Ｒｏｄｄａ，Ｓ．Ｊ．，Ｍａｓｏｎ，Ｔ．Ｊ．，Ｔｒｉ ｂｂｉｃｋ，Ｇ．＆ Ｓｃｈｏｏｆｓ，Ｐ．Ｇ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．Ｍｅｔｈ． １９８７，１０２，２５９−２７４；Ｈｏｕｇｈｔｅｎ，Ｒ．Ａ．，Ｐｉｎｉｌ ｌａ，Ｃ．，Ｂｌｏｎｄｅｌｌｅ，Ｓ．Ｅ．，Ａｐｐｅｌ，Ｊ．Ｒ．，Ｄｏｏｌ ｅｙ，Ｃ．Ｔ．＆ Ｃｕｅｒｖｏ，Ｊ．Ｈ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９９１，３５４ ，８４−８６；Ｏｗｅｎｓ，Ｒ．Ａ．，Ｇｅｓｅｌｌｃｈｅｎ，Ｐ．Ｄ．，Ｈｏ ｕｃｈｉｎｓ，Ｂ．Ｊ．＆ ＤｉＭａｒｃｈｉ，Ｒ．Ｄ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂ ｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ． ，１９９１，１８１，４０２−４０８参 照）および核酸（Ｗｙａｔｔ，Ｊ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ，（印刷中）：Ｅｃｋｅｒ，Ｄ．Ｊ．，Ｖｉｃｋｅｒ ｓ，Ｔ．Ａ．，Ｈａｎｅｃａｋ，Ｒ．，Ｄｒｉｖｅｒ，Ｖ．＆ Ａｎｄｅｒｓｏ ｎ，Ｋ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９３，２１，１８５３ −１８５６参照）および非ペプチド（Ｓｉｍｏｎ，Ｒ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐ ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ，１９９２，８９，９３６７−９ ３７１；Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎ，Ｒ．Ｎ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈ ｅｍ． Ｓｏｃ． ，１９９２，１１４，１０６４６−１０６４７；Ｂａｒｔｌｅｔｔ，Ｓ ａｎｔｉ，Ｓｉｍｏｎ，ＰＣＴ ＷＯ９１／１９７３５；およびＯｈｌｍｅｙｅ ｒ，Ｍ．Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ，１９９３，９０，１０９２２−１０９２６参照）のライブラリーに使用された 。これらの選択技術は反復合成およびだんだん単純化されたオリゴマーのサブセ ットのスクリーニングが含まれる。使用された単量体またはサブ単量体にはアミ ノ酸およびヌクレオチドが含まれ、これらの両方とも二機能性である。これらの 選択技術を用いると、細胞に基づいて、または精製された蛋白質標的との結合ま たは阻害に対してサブセットの活性がアッセイされる。 ＳＵＲＦ（ランダム化された断片の合成的非ランダム化）と称される一つの技 術では、一つの固定された位置に既知の残基およびすべての他の位置に等モルの 残基の混合物を含むオリゴマーのサブセットが合成される。三つの単量体を含む （Ａ、Ｂ、Ｃ）四残基長のオリゴマーのライブラリーに対して、三つのサブセッ トが合成されるであろう（ＮＮＡＮ、ＮＮＢＮ、ＮＮＣＮ、式中Ｎは三つの単量 体の各々の等しい取り込みを表している）。各々のサブセットは次に機能性アッ セイでスクリーニングされ、最良のサブセットが同定される（例えば、ＮＮＡＮ ）。ライブラリーの第二の組が合成されスクリーニングされるが、ここで各々は 前ラウンドからの固定残基および第二の固定残基を含む（例えば、ＡＮＡＮ、Ｂ ＮＡＮ、ＣＮＡＮ）。スクリーニングおよび合成の連続的ラウンドを通して、ア ッセイで活性を有する特異的配列が同定できる。ＳＵＲＦ技術はＥｃｋｅｒ，Ｄ ．Ｊ．，Ｖｉｃｋｅｒｓ，Ｔ．Ａ．，Ｈａｎｅｃａｋ，Ｒ．，Ｄｒｉｖｅｒ，Ｖ ．＆ Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｋ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９ ９３，２１，１８５３−１８５６に記載されている。ＳＵＲＦ法はさらにＰＣＴ 特許出願ＷＯ ９３／０４２０４に開示されており、その全開示はここに引用し て含まれている。 ホスホルアミデートはＯｈｔｓｕｋａ，Ｅ．，ｅｔ．ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ，１９７６，３，６５３によりリボオリゴヌク レオチド合成のための保護基としての使用が示されている。５’末端にホスホル アミデート連結アミノ基を有するオリゴヌクレオチドはＣｈｕ，Ｂ．Ｃ．Ｆ．， ｅ ｔ．ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９８３，１１ ，６５１３により記述されている。ヌクレオチド間ホスホルアミデート結合を含 むオリゴデオキシヌクレオチド（ＤＮＡ）はいくつかのグループにより合成され ている。しかしながら、各々のそのような合成において、ホスホルアミデート結 合は隣接するヌクレオシドの結合（即ち、ヌクレオチド間結合）のみに利用され てきた。これらの合成の一つはＦｒｏｅｈｌｅｒ，Ｂ．，ｅｔ．ａｌ．，Ｎｕｃ ｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ，１９８８，１６，４８３１−４８３ ８により報告されている。Ｆｒｏｅｈｌｅｒ，ｅｔ ａｌ．により報告されてい るように、二量体から十五量体の範囲のデュープレックスの安定度を研究して、 相補的ジエステルオリゴヌクレオチドへハイブリダイズするオリゴヌクレオチド の能力が決定された。熱変性は、二量体および三量体では安定度が増加すること を示したが、より長い配列では安定度が悪くなることが示された。オリゴヌクレ オチドを含む他のホスホルアミダイトはＥｒｉｔｊａ，Ｒ．ｅｔ．ａｌ．，Ｔｅ ｔｒａｈｅｄｒｏｎ ，１９９０，４５，７２１：およびＪａｇｅｒ，Ａ．，ｅｔ ．ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９８８，２７，７２３７により記載さ れている。 １９９３年１２月２１日に発行された米国特許第５，２７２，２５０号にはホ ウ素化ホスホルアミデート化合物が開示されている。開示された化合物にはホス ホルアミデートの窒素へのテザー基を通して結合されたホウ素部分が含まれてい る。ホウ素化化合物は単量体としてかまたはヌクレオシドへ結合されて存在して いる。 ヒト免疫不全ウイルス１（ＨＩＶ−１）のＲＮＡに相補的な修飾オリゴデオキ シヌクレオチドがＡｇｒａｗａｌ，Ｓ．，ｅｔ．ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ．，１９８８，８５，７０７９−７０８３により合成 された。この文献に記載されている中にホスホルアミデートオリゴヌクレオチド がある。これらのホスホルアミデートに結合されている基にはブチルアミン、ピ ペラジジンおよびモルホリンが含まれている。これらの化合物のその標的（即ち ＲＮＡ）との相互作用は正常ワトソン／クリック水素結合を利用したアンチセン ス機構を通して行われた。ホスホルアミデートを含む同様のオリゴヌクレオチド はさらにＤａｇｌｅ，ｅｔ．ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａ ｒｃｈ ，１９９０，１８，４７５１により記載されている。 ホスホルアミデートオリゴヌクレオチドはまた１９８６年１０月１４日に出願 された欧州特許出願第８６３０７９２６．５号にも開示されている。この特許に おいては、ホスホルアミデート窒素上の置換に多くの官能基が使用されている。 前に参照した開示と同じように、この特許においてもホスホルアミデートを連結 している基はオリゴヌクレオチドのヌクレオシドである。 Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ，Ｒ．Ｌ．らにより（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ ｃｉ．ＵＳＡ ，１９８９，８６，６５５３−６５５６）ヌクレオシド間リン原子 へホスホルアミデート結合で繋がれたコレステロール基またはフェナントリジニ ウム基を含む異なった長さのオリゴヌクレオチドの一群が合成され、ＨＩＶ−１ アッセイでの活性が試験された。二つの対応する米国特許Ｕ．Ｓ．４，５４７， ５６９および４，９５８，０１３は本質的に同一の構造を開示している。 １９９３年６月８日に発行された米国特許第５，２１８，１０３号において、 ホスホロチオアミデート オリゴヌクレオチドが開示されている。この特許で開 示されているホスホロチオアミデート オリゴヌクレオチドはホスホロチオアミ デート窒素が種々の基で置換されている。 １９９４年１１月８日に発行された米国特許第５，３６２，８９９号において は、アルファ−アミノホスホン酸およびそれらの誘導体の立体特異的製造法が開 示されている。 前記の各々の開示において、オリゴヌクレオチドのヌクレオシド残基以外の基 の間のホスホルアミデート結合の使用は知られていない。発明の目的 新規ホスホルアミデートオリゴマー化合物を提供するのが本発明の目的である 。 新規ホスホロチオアミデートオリゴマー化合物を提供するのが本発明のさらな る目的である。 固定配列された官能基を有する新規ホスホルアミデートおよびホスホロチオア ミデートオリゴマー化合物を提供するのが本発明のさらに別の目的である。 ランダム配列された官能基を有する新規ホスホルアミデートおよびホスホロチ オアミデートオリゴマー化合物を提供するのが本発明のさらに別の目的である。 高度に多様な化学ライブラリーを提供するのが本発明の別の目的である。発明の簡単な説明 本発明は構造Ｉの単量体化合物を提供する： 構造Ｉ 式中： 各々のＸは独立してＯまたはＳであり； 各々のＹは［Ｑ₂］_j−Ｚ₂であり； 各々のＴは独立して［Ｑ₁］_k−Ｚ₁であるか、またはＹおよびＴが一緒に窒素 へテロ環に組み込まれ； Ｑ₁、Ｑ₂および各々のＬは独立してＣ₂−Ｃ₁₀ルキル、Ｃ₂−Ｃ₁₀アルケニル、 Ｃ₂−Ｃ₁₀アルキニル、Ｃ₄−Ｃ₇炭素環−アルキルまたは−アルケニル、ヘテロ 環、２から１０の炭素原子を有しおよび１から４の酸素または硫黄原子を有する エーテル、ポリアルキレングリコール、またはＣ₇−Ｃ₁₄ラルキルであり、Ｌが ヘテロ環である場合は少なくとも一つのＬは置換ピロリジンまたは天然の核塩基 ではなく、およびＬがアルキルの場合は少なくとも一つのＬは置換グリコールで はな い； Ｅ₁およびＥ₂は独立してＨ、ヒドロキシル保護基、活性化固体支持体、コンジュ ゲート基、レポーター基、ポリエチレングリコール、アルキル、オリゴヌクレオ チド、ペプチド核酸、ホスフェート、ホスファイト、活性化ホスフェートまたは 活性化ホスファイトであり＋ ｊおよびｋは独立して０または１であり； ｍは２から約５０であり； Ｚ₁およびＺ₂は独立して、Ｈ、Ｃ₁−Ｃ₂アルキル、Ｃ₂−Ｃ₂₀アルケニル、Ｃ₂ −Ｃ₂₀アルキニル、Ｃ₆−Ｃ₁₄アリール、Ｃ₇−Ｃ₁₅アラルキル、ハロゲン、ＣＨ ＝Ｏ、ＯＲ₁、ＳＲ₂、ＮＲ₃Ｒ₄、Ｃ（＝ＮＨ）ＮＲ₃Ｒ₄、ＣＨ（ＮＲ₃Ｒ₄）、Ｎ ＨＣ（＝ＮＨ）ＮＲ₃Ｒ₄、ＣＨ（ＮＨ₂）Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ₃Ｒ₄ 、Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ₅、金属配位基、レポーター基、窒素含有ヘテロ環、プリン、 ピリミジン、ホスフェート基、ポリエーテル基、またはポリエチレングリコール 基であり； ＡはＬ₁、Ｌ₁−Ｇ₁、Ｌ₂、Ｌ₂−Ｇ₂、ＮＲ₃Ｒ₄、Ｈ、窒素含有ヘテロ環、プリ ン、ピリミジン、ホスフェート基、ポリエーテル基、またはポリエチレングリコ ール基であり； ＪはＬ₁、Ｇ₃、Ｌ₁−Ｇ₃、またはＧ₃−Ｌ₁−Ｇ₃であり； Ｌ₁は１から約２０の炭素原子を有するアルキル、２から約２０の炭素原子を 有するアルケニル、または２から約２０の炭素原子を有するアルキニルであり； Ｌ₂は６から約１４の炭素原子を有するアリールまたは７から１５の炭素原子 を有するアラルキルであり； Ｇ₁はハロゲン、ＯＲ₁、ＳＲ₂、ＮＲ₃Ｒ₄、Ｃ（＝ＮＨ）ＮＲ₃Ｒ₄、ＮＨＣ（ ＝ＮＨ）ＮＲ₃Ｒ₄、ＣＨ＝Ｏ、Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ₅、ＣＨ（ＮＲ₃Ｒ₄）（Ｃ（＝Ｏ ）ＯＲ₅）、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ₃Ｒ₄、金属配位基、またはホスフェート基であり； Ｇ₂はハロゲン、ＯＨ、ＳＨ、ＳＣＨ₃、またはＮＲ₃Ｒ₄であり； Ｇ₃はＣ（＝Ｏ）、Ｃ（＝Ｓ）、Ｃ（Ｏ）−Ｏ、Ｃ（Ｏ）−ＮＨ、Ｃ（Ｓ）− Ｏ、Ｃ（Ｓ）−ＮＨまたはＳ（Ｏ）₂であり； 各々のｄ１は独立して０または１であり； 各々のｄ２は独立して０から６であり： 各々のｄ３は独立して１から６であり； Ｒ₁はＨ、１から約６の炭素原子を有するアルキル、またはヒドロキシル保護 基であり； Ｒ₂はＨ、１から約６の炭素原子を有するアルキル、またはチオール保護基で あり； Ｒ₃およびＲ₄は独立してＨ、１から約６の炭素原子を有するアルキル、または アミン保護基であり；および Ｒ₅はＨ、１から約６の炭素原子を有するアルキル、または酸保護基である。 本発明はさらにホスホジエステルまたはホスホロチオエートオリゴヌクレオチ ドを含む第一の領域および上記構造Ｉ領域を含む第二の領域を有するキメラオリ ゴマー化合物も含み、ここでキメラ化合物の構造Ｉ領域のＥ₁およびＥ₂の一つは ホスホジエステルまたはホスホロチオエートオリゴヌクレオチドであり、Ｅ₁お よびＥ₂の他方はＨである。別のキメラオリゴマー化合物においては、キメラ化 合物のホスホジエステルまたはホスホロチオエート領域は、各々が上記構造Ｉを 有する二つの領域の間に位置している。発明の詳細な説明 本発明の化合物は上記構造Ｉにより示されている。構造Ｉにおいて、括弧で囲 まれた部分が本明細書で単量体ユニットと称される。単量体ユニットはホスホル アミデートまたはホスホロチオアミデートが結合された主鎖セグメントからなる 。本発明の化合物は少なくとも二つのこれらの単量体ユニットからなっている。 単量体ユニットに含まれているものは官能基を有することができるホスホルアミ デートまたはホスホロチオアミデート部分である。ホスホルアミデートまたはホ スホロチオアミデート部分は、また種々の官能基を共有結合で結合できるであろ う主鎖セグメントに共有結合で結合されている。官能基は主鎖セグメントおよび ホスホルアミデートまたはホスホロチオアミデートに直接的にまたは随意のテザ ー基を通して共有結合で結合されている。 主鎖セグメントおよびホスホルアミデートまたはホスホロチオアミデート部分 は本発明のオリゴマー化合物へ”機能性”特性を与えるある種の他の基を連結す るための部位としても働いている。これらの官能基を変化させることにより本発 明の化合物内へ多様性が組み込まれる。 本発明の好適な態様において、官能基は好適にはＨ−ホスホネートまたはＨ− ホスホロチオアミデート中間体を利用してホスホルアミデートまたはホスホロチ オアミデート部分へ連結される。官能基はこれらの中間体へ酸化機構により連結 される。即ち、Ｈ−ホスホネートまたはＨ−ホスホロチオアミデート中間体を酸 化して最終的なホスホルアミデートまたはホスホロチオアミデート状態とする。 本明細書の目的のためには、上記構造Ｉに関する文脈においてアルキル、アル ケニルおよびアルキニル基にはメチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、 ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、トリ デシル、テトラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシル、ヘプタデシル、オクタデ シル、ノナデシル、エイコシルおよびその他の高級炭素アルキル基を含む置換お よび無置換直鎖、分岐鎖および脂環式炭化水素が含まれるがそれらに制限される わけではない。さらなる例としては２−メチルプロピル、２−メチル−４−エチ ルブチル、２，４−ジエチルプロピル、３−プロピルブチル、２，８−ジブチル デシル、６，６−ジメチルオクチル、６−プロピル−６−ブチルオクチル、２− メチルブチル、２−メチルペンチル、３−メチルペンチル、２−エチルヘキシル および他の分岐鎖基、アリル、クロチル、プロパルギル、２−ペンテニルおよび その他の不飽和基、シクロヘキサン、シクロペンタン、アダマンタンならびに他 の脂環式基、３−ペンタン−２−オン、３−メチル−２−ブタノール、２−シア ノオクチル、３−メトキシ−４−ヘプタナール、３−ニトロブチル、４−イソプ ロポキシドデシル、４−アジド−２−ニトロデシル、５−メルカプトノニル、４ −アミノ−１−ペンテニルならびに他の置換基が挙げられる。 さらに、本発明の文脈において、直鎖化合物とはアルキル、アルケニルまたは アルキニル化合物を含む脂肪族化合物のような鎖状化合物を意味している；本明 細書で使用される低級アルキル、アルケニルまたはアルキニルには、約１から約 ６の炭素原子の炭化水素化合物が含まれるが、それらに制限されるわけではない 。本明細書で使用される分岐鎖化合物には、直鎖の炭素原子へさらに直鎖または 分 岐鎖が結合されたアルキル、アルケニルまたはアルキニルのような直鎖化合物が 含まれる。本明細書で使用される環状化合物は閉鎖式化合物、即ち、脂環式また は芳香族化合物のような炭素原子の環を意味している。直鎖、分岐鎖または環状 化合物は内部で中断されていてもよい（即ち、アルキルアルコキシまたはヘテロ 環式化合物）。本発明の文脈において、内部で中断されているとは炭素鎖がＯ、 ＮまたはＳのようなヘテロ原子で中断されていてもよいことを意味している；し かしながら、所望されるなら炭素鎖はヘテロ原子を含まなくてもよい。 上に示したそのような化合物は置換されていてもまたは無置換でもよい。本発 明の文脈において置換または無置換とは、例えば化合物中の一つまたはそれ以上 の水素原子の代わりに種々の置換基の一つを化合物が有するかまたは置換基を有 していないことを意味している。本発明に従った置換基にはハロゲン（Ｃｌ、Ｂ ｒ、Ｆ）、ヒドロキシル（ＯＨ）、チオール（ＳＨ）、ケト（Ｃ＝Ｏ）、カルボ キシル（ＣＯＯＨ）、エーテル、チオエーテル、アミジン（Ｃ（＝ＮＨ）ＮＲ₃ Ｒ₄）、グアニジン（ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＲ₃Ｒ₄）、グルタミル（ＣＨ（ＮＲ₃Ｒ₄ ）（Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ₅）、ニトレート（ＯＮＯ₂）、ニトロ（ＮＯ₂）、ニトリル （ＣＮ）、トリフルオロメチル（ＣＦ₃）、トリフルオロメトキシ（ＯＣＦ₃）、 Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキル、ＮＨ−アルキル、Ｎ−ジアルキル、Ｏ−アラルキ ル、Ｓ−アラルキル、ＮＨ−アラルキル、アミノ（ＮＨ₂）、アジド（Ｎ₃）、ヒ ドラジノ（ＮＨＮＨ₂）、ヒドロキシルアミノ（ＯＮＨ₂）、スルホキシド（ＳＯ ）、スルホン（ＳＯ₂）スルフィド（Ｓ−）、ジスルフィド（Ｓ−Ｓ）、シリル 、ヘテロ環式、脂環式および炭素環式基が含まれるがそれらに制限されるわけで はない。好適な置換基にはハロゲン、アルコールおよびエーテル（ＯＲ₁）、チ オールおよびチオエーテル（ＳＲ₂）、アミン（ＮＲ₃Ｒ₄）、アミジン（Ｃ（＝ ＮＨ）ＮＲ₃Ｒ₄）、グアニジン（ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＲ₃Ｒ₄）、アルデヒド（Ｃ Ｈ＝Ｏ）、酸（Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ）、エステル（Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ₅）、アミド（Ｃ （＝Ｏ）ＮＲ₃Ｒ₄）およびグリシン（ＣＨ（ＮＨ₂）（Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ）が含ま れる。 官能基を表す上記の基Ｙ、ＴおよびＡは”レター（ｌｅｔｔｅｒ）”として示 すことができる。そのような用語の使用は、主鎖セグメントおよびホスホルアミ デート部分またはホスホロチオアミデート部分上の異なった官能基が配列中にア ルファベットの文字のように位置している（前もって決定されたようにかまたは 無作為に選択されて）という事実を反映している−−従って用語”レター”。こ れらのレターは”反応性”または”非反応性”でありうる。反応性とは、それら が何らかの様式で（その必要はないが前もって定義できる）標的分子と相互作用 するであろうことを意味している。非反応性とは、実際には標的分子と相互作用 するかもしれないが、本来標的分子と相互作用するようには設計されていないこ とを意味しており、非反応性部分の本来の目的は分子に取り込み、分布、代謝ま たは同定に（それらに制限されるわけではない）影響を及ぼす他の特性を与える ことである。 本発明の実施に使用するのに適し、レターとして使用される官能基にはハロゲ ン；置換または無置換ヘテロ環式アルキルのような置換または無置換ヘテロ環式 化合物；ヘテロ環式アルキルアミン、ポリアルキルアミン、イミダゾール、イミ ダゾールアミド、アルキルイミダゾールのようなアミノ含有基；置換または無置 換アルデヒド；置換または無置換ケトン；置換または無置換エーテル；置換また は無置換エステル；約６から約２０の炭素原子を有するアラルキルアミノ、約６ から約２０の炭素原子を有するアミノアラルキルアミノのような約６から約２０ の炭素原子を有する置換または無置換アリール化合物、アルキルオキシアリール 化合物またはアリルオキシアリール化合物が含まれるが、それらに制限されるわ けではない。 官能基は主鎖セグメントおよびホスホルアミデート部分またはホスホロチオア ミデート部分へ介在するテザー基とまたはテザー基なしで結合される。本発明の 文脈において、テザーとは”レター”を結合できる第二の官能基と一緒に本発明 のＨホスホネート、Ｈホスホロチオエートまたは主鎖セグメントと反応するため の一級または二級アミンまたは他の適した基を有する二価または多価の基である 。そのようなテザーは合成されるオリゴマー化合物の直線状主鎖に関して間隔を 取って”レター”を位置させる、またはレター固有の部分にアミン基（ホスホル アミデート結合の形成に必要）をそれ自身含まないレターを結合するために使用 できる。必要な場合に適当なアミン官能基で置換されている場合、テザーとして 有用な化合物の特に好適な基としてはＣ₂−Ｃ₁₀アルキル、Ｃ₂−Ｃ₁₀アルケニル 、 Ｃ₂−Ｃ₁₀アルキニル、Ｃ₄−Ｃ₇炭素環−アルキルまたは−アルケニル、ヘテロ 環、２から１０の炭素原子を有しおよび１から４の酸素または硫黄原子を有する エーテル、ポリアルキレングリコール、およびＣ₇−Ｃ₁₄アラルキル基が含まれ るが、それらに制限されるわけではない。本発明の実施に有用な他の代表的なテ ザー基は”チオール誘導化ヌクレオシドおよびオリゴヌクレオシド”と題して１ ９９３年９月３日に出願された米国特許出願第０８／１１６，８０１号、および ”アミン誘導化ヌクレオシドおよびオリゴヌクレオシド”と題して１９９３年９ 月３日に出願された米国特許出願第１１７，３６３号に開示されており、その開 示はここに引用して含まれている。 アミンには一級および二級アミンおよびフタールイミドのような”マスクされ たアミン”を含む上記のアルキル、アルケニルおよびアリール基のすべてのアミ ンが含まれる。本発明のアミンにはまたポリアルキルアミノ化合物、アミノプロ ピルアミンのようなアミノアルキルアミンおよびさらにイミダゾール−１，２ま たは４−イループロピルアミンのようなヘテロ環式アルキルアミンも含まれてい ることを意味している。 本発明の実施に適した他の反応性官能基にはチオール（ＳＨ）、アルデヒド（ Ｃ＝Ｏ）またはアルコール（ＯＨ）官能性を有する化合物が含まれるが、それら に制限されるわけではない。 官能基としての使用に適した窒素含有ヘテロ環を含むヘテロ環にはイミダゾー ル、ピロール、ピラゾール、インドール、１Ｈ−インダゾール、α−カルボリン 、カルバゾール、フェノチアジン、フェノキサジン、テトラゾール、トリアゾー ル、ピロリジン、ピペリジン、ピペラジンおよびモルホリン基が含まれるが、そ れらに制限されるわけではない。窒素ヘテロ環のより好適な群にはイミダゾール 、ピロールまたはカルバゾールが含まれる。イミダゾールが特に好適である。 官能基としての使用に適したプリンおよびピリミジンにはアデニン、グアニン 、シトシン、ウリジンおよびチミン、ならびにキサンチン、ヒポキサンチン、２ −アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６−メチルおよび他のアルキル誘 導体、アデニンおよびグアニンの２−プロピルおよび他のアルキル誘導体、５− ハロウラシルおよびシトシン、６−アザウラシル、シトシンおよびチミン、５− ウ ラシル（プソイドウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、アミノ、チオール 、チオアルキル、ヒドロキシルおよび他の８置換アデニンおよびグアニン、５− トリフルオロメチルおよび他の５置換ウラシルおよびシトシンおよび７−メチル グアニンのような他の合成および天然の核塩基が含まれる。別のプリンおよびピ リミジンとしては米国特許第３，６８７，８０８号、Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｅｎｃｙ ｃｌｏｐｅｄｉａ Ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｅｎｇｉ ｎｅｅｒｉｎｇ ，Ｊ．Ｉ．Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ，Ｅｄ．Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，１９９０，ページ８５８−８５９およびＥｎｇｌｉｓｃｈ，ｅ ｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａ ｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ １９９１，３０，６１３に記載されているようなものも含 まれる。 本発明に従ったアリール基にはフェニルおよびナフチル基のような置換および 無置換芳香族炭化水素基が含まれるがそれらに制限されるわけではない。アラル キル基にはベンジルおよびキシリル基のようなアリールおよびアルキル官能性の 両方を有する基が含まれるがそれらに制限されるわけではない。 本発明に従った金属配位基にはヒドロキサム酸、カテコールアミド、アセチル アセトン、２，２’−ビピリジン、１，１０−フェナントロリン、二酢酸、ピリ ジン−２−カルボキサミド、イソアルキルジアミン、チオカルバメート、オキザ レート、グリシル、ヒスチジルおよびテルピリジルが含まれるがそれらに制限さ れるわけではない。他の金属配位基も知られている；例えば、Ｍｅｌｌｏｒ，Ｄ ．Ｐ．，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｃｈｅｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈｅｌａ ｔｉｎｇ Ａｇｅｎｔｓ ｉｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｎｃｙｃｌｏ ｐｅｄｉａ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉ ｃｓ ，Ｓｅｃｔｉｏｎ ７０，Ｔｈｅ Ｃｈｅｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｅａｖｙ Ｍｅｔａｌｓ，Ｌｅｖｉｎｅ，Ｗ．Ｇ．Ｅｄ．，Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓ ｓ，Ｅｌｍｆｏｒｄ，Ｎ．Ｙ．，１９７９を参照されたい。 レターとして使用される非反応性官能基（薬力学特性を増強させる基のような ）としては取り込みを改良し、分解に対する耐性を促進し、および／または標的 分子との配列特異性相互作用を強くするような基が含まれる。本発明の文脈にお い て、非反応性官能基はまた薬動学特性も増強し、そのような基は取り込み、分布 、代謝または排泄を改良する。非反応性官能基には上記のようなアルキル鎖、ポ リアミン、エチレングリコール、ポリアミド、アミノアルキル鎖、両親媒性部分 、レポーター基結合点および結合のための任意の好適な部位に結合されたインタ ーカレーターが含まれるが、それらに制限されるわけではない。 本発明に従った固体支持体には制御細孔ガラス（ＣＰＧ）、オキザリル制御細 孔ガラス（例えば、Ａｌｕｌ， ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １９９１，１９，１５２７を参照されたい）、ＴｅｎｔａＧ ｅｌ支持体−−アミノポリエチレングリコール誘導化支持体（例えば、Ｗｒｉｇ ｈｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ １９９３，３ ４，３３７３を参照されたい）またはＰｏｒｏｓ−−ポリスチレン／ジビニルベ ンゼンの共重合体が含まれる。 多くの置換基が本発明の化合物内へ保護された形で導入でき、後で脱保護され て最終的な所望の化合物を生成する。一般に、保護基は特定の反応条件に対して 化学官能性を不活性にし、分子の残りの部分には実質的に損傷を与えることなく 付加でき、分子中のそのような官能性から除去できる。例えば、Ｇｒｅｅｎ ａ ｎｄ Ｗｕｔｓ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｏｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｖｎｔｈｅｓｉｓ ，２ｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓ ｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９１を参照されたい。例えば、アミノ基はフタ ルイミド基としてまたは９−フルオレニルメトキシカルボニル（ＦＭＯＣ）基と して保護でき、カルボキシル基はフルオレニルメチル基として保護できる。代表 的ヒドロキシル保護基はＢｅａｕｃａｇｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒ ｏｎ １９９２，４８，２２２３に記載されている。好適なヒドロキシル保護基 はトリチル、モノメトキシトリチル、ジメトキシトリチル、トリメトキシトリチ ル、９−フェニルキサンチン−９−イル（Ｐｉｘｙｌ）および９−（ｐ−メトキ シフェニル）キサンチン−９−イル（ＭＯＸ）のような酸不安定性基である。 上に示したように、本発明の化合物においてある態様ではＥ₁およびＥ₂はコン ジュゲート基として選択される。本発明のコンジュゲート基としてはレポーター 酵素、レポーター分子、ステロイド、炭水化物、テルペン、ペプチド、蛋白質、 芳香族親油性分子、非芳香族親油性分子、リン脂質、インターカレーター、細胞 受容体結合分子、架橋剤、水溶性ビタミン、脂溶性ビタミン、ＲＮＡ切断複合体 、金属キレート剤、ポルフィリン、アルキル化剤、高分子アミン、高分子グリコ ールおよびポリエーテルなどの高分子化合物が含まれる。典型的なコンジュゲー ト基にはコレステロール、リン脂質、ビオチン、フェナントロリン、フェナジン 、フェナントリジン、アントラキノン、アクリジン、フルオレヤイン、ローダミ ン、クマリンおよび色素が含まれる。本発明の文脈において薬力学的特性を促進 する基には、オリゴマー取り込みを促進し、オリゴマーの分解に対する耐性を改 良しおよび／またはＲＮＡとの配列特異性ハイブリッド形成を強くする基が含ま れる。本発明の文脈において薬動学的特性を促進する基には、オリゴマー取り込 み、分布、代謝または排泄を改良する基が含まれる。代表的コンジュゲート基は １９９２年１０月２３日に出願された国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９２／０９１９ ６、１９９３年９月３日に出願された米国特許出願第１１６，８０１号および米 国特許第５，２１８，１０５号に開示されている。上記の各々は本出願と共通し て譲渡されている。各々の全開示はここに引用して含まれている。 本発明の別の態様において、ＤＭＴ除去に使用されるトリクロロ酢酸処理に安 定である酸不安定性基が使用され、ＢＯＣ型保護基が好適に使用できる。それら は拡大ＴＣＡ処理にも安定であるが、トリフルオロ酢酸溶液（例えば、ＣＨ₂Ｃ ｌ₂溶液中５％）では除去される。本方法論に一致する別の保護基のタイプはア リルタイプである。このタイプの保護基は、オリゴマーが固体支持体に依然とし て結合されている間に特定の官能基の選択的脱保護が望まれる場合に特に有用で あり、新しい反応部位のカバーをはずすことを可能にしている。別の保護基の方 策もまた可能である：例えば光不安定性保護基もまたこの方法論と矛盾しない。 構造Ｉにおいて、Ｅ₁およびＥ₂はｍ単量体ユニット長であるオリゴマーの末端 に存在する。合成の間、末端は実際に作用末端であり、例えば構造の固体支持体 への結合などに使用でき、およびオリゴマー構造の伸長にも使用できる。 好適な固相合成において、Ｅ₁は活性化固体支持体であるように選択され、お よびＥ₂は合成が進むにつれ保護基またはＨが交互になるように選択される。上 に示したようにＬは、ホスホルアミデートまたはホスホロチオアミデート部分（ 官能 基Ａがまた結合できる）へ直接的またはメチレンまたは他の基を通して結合され た主鎖セグメントである。前に示したように、官能基Ａは、構造ＩにおいてＪと 称される随意のテザー基を含んでいてもよい。Ｙは典型的には水素であるが、テ ザー基を有するまたは有しない官能基であってもよい。Ｔは水素、テザー基を有 するまたは有しない官能基であるか、またはＹと一緒に窒素含有ヘテロ環を形成 する。Ａ、ＴおよびＹは前に定義された”レター”である。 Ｘは酸素かまたは硫黄である。ＸがＯの場合、本発明の化合物はホスホルアミ デートと同定される。ＸがＳである場合、化合物はホスホロチオアミデートと同 定される。ある態様において、各々のＸはＯであろう。ある態様において、各々 のＸはＳであろう。別の態様において、本発明の化合物にはＯおよびＳの混合物 が両方とも含まれている。 本発明のオリゴマー化合物は、前もって決められたまたはランダムなレターの 配列を有するように合成できる。従って、ある好適な態様においては、レターの 配列は前もって決められた配列である。別の好適な態様においては、レターの配 列はランダムである。さらに別の態様においては、配列は固定およびランダムの 間で調節される。このことは、例えば、前に参照したＳＵＲＦ法のようなある種 の組み合わせ法で特に有用である。 本発明のさらなる利点はレターの配列の変化性に加えてまたは代わりに非対称 配列の主鎖セグメントを有するオリゴマー化合物を合成する能力である。別の言 葉でいうと、主鎖セグメントをまたオリゴマー構造内で変化させることができる 。これは最終的に主鎖セグメントとして取り込まれる異なったデヒドラーゼ化合 物を使用することにより容易に達成される。 本発明の化合物を合成する好適な方法は固相合成である。代表的固相技術は標 準ホスホルアミダイト化学を利用したＤＮＡおよびＲＮＡ合成に用いられるよう なものである（例えば、Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｆｏｒ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏ ｔｉｄｅｓ Ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｓ ，Ａｇｒａｗａｌ，Ｓ．，ｅｄ．，Ｈｕｍ ａｎａ Ｐｒｅｓs，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，１９９３参照）。 好適な固相合成は活性化ホスファイトとしてＨホスホネートおよびＨホスホノ チオエートを利用する。ＨホスホネートおよびＨホスホノチオエートのリン原子 の化学はＰ（III）である。中間体化合物は続いて、レターに結合された一級ま たは二級アミンの存在下でＰ（Ｖ）状態に酸化される。レターは一級または二級 アミンにテザーでまたはテザーなしで結合されている。ある種の窒素含有ヘテロ 環は結合部分として使用され、そこでは窒素はリンに共有結合で結合されている 。固相合成に加えて、液相合成もまた本発明の化合物の合成に利用できる。液相 化学は、例えばＦＭＯＣ、ＴＢＤＭＳまたはＴＰＤＭＳのような塩基不安定性保 護基をＥ₁への結合させることにより適応する。 ホスホネート水素化学は、オリゴマー内へ導入されるべき追加の化学修飾を可 能にする利点を有する。オリゴヌクレオチドホスホジエステルおよびホスホロチ オエート（Ｆｒｏｅｈｌｅｒ，Ｂ．Ｃ．，Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ，Ｍ．Ｄ．Ｔｅｔ ｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ ．１９８６，２７，４６９−４７２参照）、ならび にオリゴヌクレオチドホスホルアミデート（Ｆｒｏｅｈｌｅｒ，Ｂ．Ｃ．Ｔｅｔ ｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ ．１９８６，２７，５５７５−５５７９；Ｌｅｔｓ ｉｎｇｅｒ，Ｒ．Ｌ．，Ｓｉｎｇｍａｎ，Ｃ．Ｎ．，Ｈｉｓｔａｎｄ，Ｇ．，Ｓ ａｌｕｎｋｈｅ，Ｍ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９８８，１１０，４４７ ０−４４７１参照）はこの方法を用いて製造されている。ホスホジエステルおよ びホスホルアミデートの両方を含むオリゴマーの合成ならびにホスホルアミデー トの合成に関連してのホスホルアミダイト化学の使用が報告されている（Ｊｕｎ ｇ，Ｐ．Ｍ．，Ｈｉｓｔａｎｄ，Ｇ．，Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ，Ｒ．Ｌ．Ｎｕｃｌ ｅｏｓｉｄｅｓ ＆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ，１９９４，１３，１５９７−１ ６０５参照）。この後者の研究において、伸長しつつあるオリゴマーへホスホル アミダイトおよびＨ−ホスホネートを結合させ、続いて適当な酸化工程を行うこ とによりホスホジエステルおよびホスホルアミデートが交互にあるオリゴマーが 製造された。しかしながら、一般的に前に記載したすべての例において、オリゴ マーのすべてのホスホルアミデート結合に同一のアミン置換基が取り込まれてい る。 しかしながら、これらの研究は多様な官能基の取り込みのための追加の部位と してのホスホルアミデート結合を使用する適合性を示している。広範囲の種々の アミンが酸化工程で使用でき、本発明の単量体は必要な化学的性質を有する。す なわち、ホスホルアミデート結合を取り込む組み合わせライブラリーの製造のた め、本発明の単量体は対応するＨ−ホスホネートモノエステルへ変換される。本 発明の一つの態様においてこのことはホスファイト化試薬としてＰＣｌ₃および イミダゾールを用いることにより達成された（Ｇａｒｅｇｇ，Ｐ．Ｊ．，Ｒｅｇ ｂｅｒｇ，Ｔ．，Ｓｔａｗｉｎｓｋｉ，Ｊ．，Ｓｔｒｏｍｂｅｒｇ，Ｒ．Ｃｈｅ ｍ．Ｓｃｒ ．１９８６，２６，５９−６２参照）。これらのＨ−ホスホネート単 量体は塩化ピバロイル、塩化アダマントイルまたは他の適当な活性化剤により活 性化することにより固体支持体上でオリゴマー化される。中間体Ｈ−ホスホネー トジエステルは、例えば水性ピリジン中でヨウ素を用いて高収率でリン酸ジエス テルへ酸化できる。このことによりＨ−ホスホネートおよびホスホルアミダイト 法の結合効率の比較が可能である。両方の方法論で本質的に同じ結合効率が達成 された。Ｈ−ホスホネートジエステルはピリジン/ＣＣｌ₄（１：１）中で適当な アミンの１０％溶液を用いることによりホスホルアミデートに変換される。これ らの条件下、Ｈ−ホスホネートジエステルはＡｒｂｕｚｏｖ反応を経て塩化ホス ホリルに酸化され、続いて一級または二級アミンにより塩素が置換される。第二 の工程は非常に一般的であることが証明されており、広範囲のアミンで満足すべ き収率が得られる。さらに、ホスホルアミデートの収率はホスホジエステルの収 率と同程度であった。 いくつかの型のライブラリーがこの方法論により得られる。最も単純な種類の ライブラリーは、リンが単一のアミンで置換されている２から１０またはそれ以 上の単量体ユニットの長さの本発明の単量体の組（４から１６またはそれ以上の 主鎖セグメントの組が典型的には使用された）から作製され、主鎖位置で単一の レターで置換することができる（（Ｊ）_d1およびＡ）。レターは随意のテザー基 を含んでいてもよい。これらのライブラリーはスプリットビーズ合成により製造 され、ホスホルアミダイト化学というよりもむしろＨ−ホスホネート合成プロト コールに従っている。中間体Ｈ−ホスホネートジエステルは最終工程までそのま ま残される。その時点でオリゴマーライブラリープールは適当な一級または二級 アミンを１０％含むＣＣｌ₄／ピリジンで酸化される。これによりすべての残基 間結合がホスホルアミデートへ変換される。 最終オリゴヌクレオチドがまた主鎖上に（例えば、（Ｊ）_d1およびＡ位）”レ ター”を有する場合、ランダム化されるべき位置上の保護基は通常の試薬により 除去できる。個々のプールは通常の溶媒中で”レター”により処理される。高収 率を容易にするため、結合剤がしばしば使用されるであろう。いくつかの市販品 として入手可能な結合剤はベンゾトリアゾール−１−イルオキシ−トリス（ジメ チル−アミノ）ホスホニウム ヘキサフルオロホスフェート、［Ｏ−（７−アザ ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３，−テトラメチル］ウロニウ ム ヘキサフルオロホスフェート、ＨｏＢｔおよびＰｙＢＯＰである。従って、 このライブラリーは一定のホスホルアミダイト結合によって一緒に結合され、固 定された位置で特有のサブセットに分離された単量体のすべての可能な配列から 構成されている。ライブラリーの最終的性質は酸化工程で使用されるアミンの選 択、およびもし存在するなら主鎖へ結合されたレターによっても決定されるであ ろうことは明かである。従って、ライブラリー成分の水溶解性、薬動学および薬 力学は、アミンおよびレターの選択により変えることができる。 中間の酸化工程を行うことにより混合された結合を有するオリゴマーライブラ リーを製造することも可能である（Ｇｒｙａｚｎｏｖ，Ｓ．Ｍ．，Ｓｏｋｏｌｏ ｖａ，Ｎ．Ｉ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．１９９０，３１，３２０５ −３２０８；Ｇｒｙａｚｎｏｖ，Ｓ．Ｍ．，Ｐｏｔａｐｏｖ，Ｖ．Ｋ．Ｔｅｔｒ ａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ ．１９９１，３２，３７１５−３７１８；Ｆａｒｏｏ ｑｕｉ，Ｆ．，Ｓａｒｉｎ，Ｐ．Ｓ．，Ｓｕｎ，Ｄ．，Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ，Ｒ ．Ｌ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．，１９９１，２，４２２−４２６ ；Ｉｓｏ，Ｙ．，Ｙｏｎｅｄａ，Ｆ．，Ｉｋｅｄａ，Ｈ．，Ｔａｎａｋａ，Ｋ． ，Ｆｕｊｉ，Ｋ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．１９９２，３３，５０３ −５０６参照）。従って、オリゴマーライブラリーの一部はＨ−ホスホネート化 学により合成され、それはＲ₂ＮＨ、ＣＣｌ₄／ＰｙまたはＳ８、ＣＳ₂／ＴＥＡ またはＨ₂Ｏ、ＣＣｌ₄／Ｐｙで酸化でき、およびライブラリーの第二の部分が合 成され、試薬の第二の組で酸化される。これによりキメラライブラリーが創造さ れ、ここで各々のサブセット中のランダムオリゴマーのセグメントは分子の残り の部分と異なった結合を有する。この方法論を拡張し、各々の単量体結合後に異 なっ た酸化工程を行うことによりオリゴマーライブラリーの各々の位置に異なった結 合を取り込ませることが可能である。各々の酸化工程に続いて脱保護工程および 結合工程を加えることにより各々の主鎖セグメントに異なったレターを取り込ま せることも可能である。Ｈ−ホスホネートジエステル結合固体支持体の一部へ別 々の酸化を実施し、続いて単量体位置がランダム化されるのと同一の方法でサブ セットをプールすることにより結合が組み合わせ化できる。従って、各々の単量 体およびそれらの間の結合はスプリット合成法によりランダム化できる。 ”レター”はその各々のアミノ基に結合されており、それはさらにホスファイ ト基に結合され本発明のホスホルアミデートおよびホスホロチオアミデートを形 成する。この結合を達成できる一つの好適な方法は酸化による方法である。テザ ーでまたはテザーなしで一級または二級アミンへ結合された官能基の存在下、本 発明のＨ−ホスホネートまたはＨ−ホスホノチオエート中間体の酸化によりホス ホルアミデートまたはホスホロチオアミデートが形成されるであろう。従ってこ れらの官能基は生じるオリゴマー化合物に多様な性質（”多様性”）を提供する 。官能基には水素結合供与体および受容体、イオン性部分、極性部分、疎水性部 分、芳香族中心および電子供与体および受容体が含まれる。個々の反復単量体ユ ニットの性質は一緒になって、それらが見いだされるオリゴマーの性質に寄与す る。従って、そのようなオリゴマーのライブラリーは無数の性質を有するであろ う、即ち”多様性”。集合的に、オリゴマーを形成する単量体ユニットの性質は 、そのようなオリゴマーの性質に寄与しており、細胞、酵素または核酸標的部位 との相互作用にある種の特性を与えるであろう。 広い範囲の化学的多様性を有する組み合わせライブラリーを合成することが本 発明の重要な点である。化学的多様性はリン結合の性質を変化させることにより 一つのレベルで導入される。本発明に従うリン結合にはホスホルアミデート（Ｏ ＰＮ）およびホスホロチオアミデート（ＳＰＮ）が含まれる。組み合わせライブ ラリーは単一の型のリン結合でも、またはオリゴマーの各々の位置でのＳＰＮお よびＯＰＮの混合物でも製造できる。例えば、単−ＯＰＮ結合がＳＰＮオリゴマ ーの任意の位置に選択的に導入できる。実際、ＳＰＮおよびＯＰＮ結合のすべて の可能な組み合わせが本発明のオリゴマー内に選択的に導入できる。オリゴマー の特定の位置での結合の型の存在または不在は分子の性質に絶大な影響を有する ことができる。 ＳＵＲＦライブラリーにいくつかのレベルで化学的多様性を発生させることが できる。以下に単量体の製造について説明した。これらの単量体は化学的多様性 の二つの特色を研究するために製造された：第一に化学的性質の範囲をカバーす る多くの官能基が利用できる。第二に、これらの官能基は、異なった様式でこれ らを提示し、または間隔をおいて存在させるように設計された異なったテザーに 結合することができ、種々の柔軟性が可能となる。以下の節では多様性の第三の レベル、すなわち残基間結合それ自体について説明する。適当な条件を使用する ことにより、オリゴマーの配列に関係なく、オリゴマーの任意の位置にホスホル アミデートまたはホスホロチオアミデート結合を導入することが可能である。 ホスホルアミデート結合の場合、誘導体化固体支持体のまたは結合された最後 の単量体ユニットのヒドロキシルからＤＭＴ基または他の適した保護基を除去し 、続いて標準条件下で遊離ヒドロキシルをホスホン酸誘導体化主鎖セグメントで 処理するとＨ−ホスホネートジエステルが得られるであろう。ピリジン／ＣＣｌ₄ （１：１）中、適当なアミンの１０％溶液を用いるようなＨ−ホスホネートの 酸化によりホスホルアミデートが得られるであろう。 ホスホロチオアミデート結合の場合、誘導体化固体支持体のまたは結合された 最後の単量体ユニットのヒドロキシルからＤＭＴ基または他の適した保護基を除 去し、続いて米国特許第５，２１８，１０３号の実施例IIIのような条件下で遊 離ヒドロキシルをホスホロジアミダイト誘導体化主鎖セグメントで処理すると二 置換ホスホルアミダイトが得られるであろう。得られた二置換ホスホルアミダイ トを米国特許第５，２１８，１０３号の実施例IIIのような条件下でＨ₂Ｓおよび テトラゾールでさらに処理するとＨ−ホスホノチオエートが得られるであろう。 米国特許第５，２１８，１０３号の実施例IVによるようなアミン”レター”存在 下でのＨ−ホスホノチオエートの酸化によりホスホロチオアミデートが得られる であろう。 本発明のオリゴマー化合物は前もって決定された配列または組み合わせ法を経 て決定された配列を有するように製造できる。一つの有用な組み合わせ法は上記 のＳＵＲＦ法であり、それは１９９１年８月２３日に出願された米国特許出願第 ７４９，０００号および１９９２年８月２１日に出願されたＰＣＴ特許出願ＵＳ ９２／０７１２１（両方とも本出願と共通して譲渡されている）に開示および特 許請求されている。これらの出願の全開示はここに引用して含まれている。 ＳＵＲＦ法の例は下記の表Ｉに示されている２’−Ｏ−メチルオリゴヌクレ オチドライブラリーである（Ｅｃｋｅｒ ｅｔ．ａｌ．、上記文献）。表ＩはＲ ＮＡヘアピンに対する結合での２’−Ｏ−メチルオリゴヌクレオチドの選択が記 載されている。Ｋ_D’すなわち結合定数はゲルシフトにより決定された。”Ｘ” は変化している位置を示すのに用いられ、下線はＳＵＲＦ法の連続的な反復の間 に固定された位置を示すのに用いられている。 このＳＵＲＦ法は単量体ユニットとして、ホスホジエステルまたはホスホロチオ エートとして天然に存在するヌクレオチドを用いるライブラリーを除いてライブ ラリーに対しては用いられていない。他の組み合わせ法は従来単量体ユニットと してアミノ酸を用いるライブラリーだけにのみ用いられてきた。 本発明の一つの態様は、構造Ｉを有する単量体化合物を上記ＳＵＲＦ法または 他の組み合わせ法に包含させることである。自動化ホスホルアミダイトオリゴマ ー合成の利点は保持しつつ、これらのオリゴマー構造に付加された官能基をライ ブラリー内へ取り込ませることができる。本発明の一つの態様において、これら の官能基により達成される相互作用は以下の型である：水素結合供与体および受 容体、イオン性、極性、疎水性、芳香族性および電子供与体および受容体。好適 な官能基にはアミノエチル、カルボキシエチル、アデニルメチル、チミニルメチ ル、イミダゾリルメチル、ベンジル、ミリスチル、イソプロピルおよびテトラエ チレングリコール基が含まれる。 本発明の一つの利点は、本発明の単量体化合物の簡単な設計で何千もの化合物 に対するスクリーニング機構を有する合理的薬剤設計の合併を可能にすることで ある。このことは本発明の化合物をＳＵＲＦ法のような組み合わせ技術で使用す ることにより達成できる。そのような組み合わせ技術を利用するための好適な標 的分子はホスホリパーゼＡ₂ファミリーである。 ホスホリパーゼＡ₂（ＰＬＡ₂）は膜リン脂質のｓｎ−２エステル結合を加水分 解する酵素のファミリーであり、遊離脂肪酸およびリゾリン脂質の放出を起こす （Ｄｅｎｎｉｓ，Ｅ．Λ．，Ｔｈｅ Ｅｎｚｙｍｅｓ，Ｖｏｌ．１６，ｐｐ３０ ７−３５３，Ｂｏｙｅｒ，Ｐ．Ｄ．，ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ ｙｏｒｋ，１９８３参照）。タイプIIＰＬＡ₂レベルの上昇は多くのヒ ト 炎症性疾患と関連している。ＰＬＡ₂触媒反応は多くのプロ炎症性仲介物の放出 の律速段階である。アラキドン酸（ｓｎ−２位に共通して結合されている脂肪酸 ）はロイコトリエン、プロスタグランジン、リポキシンおよびトロンボキサンの 前駆体として働いている。リゾリン脂質は血小板活性化因子の前駆体でありうる 。ＰＬＡ₂はプロ炎症性サイトカインにより制御されており、炎症カスケードの 中心的位置を占めている（例えば、Ｄｅｎｎｉｓ，上記文献；Ｇｌａｓｅｒ，ｅ ｔ ａｌ．，Ｔｉｏｓ Ｒｅｖｉｅｗｓ １９９２，１４，９２；およびＰｒｕ ｚａｎｓｋｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ １９９２，１６，４ ５１を参照されたい）。 これまで評価されたすべての哺乳類組織はＰＬＡ₂活性を示した。少なくとも 三つの異なった型のＰＬＡ₂がヒトにおいて観察されている：膵臓性（タイプＩ ）、滑液性（タイプII）および細胞質性。さらなるイソ酵素が存在していること が研究により示唆されている。タイプＩおよびタイプII（ＰＬＡ₂の分泌型）は 蛇毒から単離されたホスホリパーゼと強い類似性を共有している。ＰＬＡ₂酵素 は消化、細胞膜リモデリングおよび修復、および炎症性応答の仲介を含む正常な 機能のために重要である。細胞質性およびタイプII酵素の両方とも治療的標的と して興味をひかれる。タイプIIＰＬＡ₂レベルの上昇は慢性関節リュウマチ、骨 関節炎、炎症性腸疾患および敗血病性ショックを含む種々の炎症性障害と関連し ており、この酵素の阻害剤は治療的有用性を有するようであることを示唆してい る。ある種の慢性炎症性障害で病理生理学的に観察されたＰＬＡ₂の役割をさら に支持する観察とは、ラットの足しょ内へ（Ｖｉｓｈｗａｎａｔｈ，ｅｔ ａｌ ．，Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ １９８８，１２，５４９）またはウサギの関節 空間へ（Ｂｏｍａｌａｓｋｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９１，１４６ ，３９０４）タイプIIＰＬＡ₂を注射すると炎症性応答が得られたことで ある。注射前に蛋白質を変性させた場合は炎症性応答は得られなかった。 滑液からのタイプIIＰＬＡ₂酵素は比較的小さな分子であり（約１４ｋＤ）、 配列およびそのジスルフィド結合のパターンによりタイプＩ酵素（例えば膵臓性 ）と区別できる。酵素の両方の型とも活性にカルシウムを必要とする。蛇毒およ び膵臓性ＰＬＡ₂からの分泌ＰＬＡ₂酵素の結晶構造（阻害剤とおよび阻害剤なし で） が報告されている（Ｓｃｏｔｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９０，２ ５０ ，１５４１）。最近、ヒト滑液からのＰＬＡ₂の結晶構造が解読された（Ｗ ｅｒｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ １９９１，３５２，７９）。その構造は 触媒におけるカルシウムおよびアミノ酸残基の役割を明らかにした。カルシウム はルイス酸として働いて切れ易いエステルカルボニルを活性化し、脂質を結合し 、Ｈｉｓ−Ａｓｐ側鎖の二個群が一般塩基触媒として働いて水分子を求核試薬に 活性化する。このことはアシル酵素中間体が存在しないことと一致し、セリンプ ロテアーゼの触媒機構にも匹敵する。触媒残基およびカルシウムイオンは酵素中 の深い裂け目（約１４Å）の末端に存在する。この裂け目の壁はリン脂質の炭化 水素と接触し、疎水性および芳香族性残基からなっている。陽性に荷電したアミ ノ末端ヘリックスは疎水性裂け目の開口部に位置している。いくつかの証拠の系 列はＮ−末端ヘリックスは界面結合部位であることを示唆している（例えば、Ａ ｃｈａｒｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ ．１９８７，５２，４４１；Ｃｈｏ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ．１９８８，２６３，１１２３７；Ｙａｎｇ，ｅｔ ａｌ ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１９８９，２６２，８５５；およびＮｏｅｌｅｔ ａ ｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９０，１１２，３７０４を参照された い）。 近年、ＰＬＡ₂触媒によるリン脂質の加水分解の機構および特性の研究につい て多くの仕事が報告されている。インビトロアッセイにおいて、酵素が基質二重 層に吸着する間に遅延状態を示し、界面活性化と称される過程が起こっている。 この活性化には酵素／脂質の脱溶媒和が含まれるか、または裂け目開口部の周辺 の脂質の物理的状態が変化しているのであろう。この仮説が好まれる証拠はＰＬ Ａ₂活性の急速な変化が膜プローブの蛍光の変化と同時に起こることを明らかに した研究からきている（Ｂｕｒａｃｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ ｙ １９９３，３２，５８３）。このことは界面活性化過程の間に脂質の再配置 が起こっていることを示唆している。ＰＬＡ₂活性は脂質の融解温度周辺（ゲル および液晶脂質が共存している領域）で最大である。このことはまたＰＬＡ₂活 性が温度および基質の組成（両方とも境界領域により分離されている構造的に明 瞭な脂質配置を導く）に感受性があることとも矛盾しない。触媒反応中の脂質の 物理的状 態および酵素の位置を同時に同定するために蛍光顕微鏡が使用された（Ｇｒａｉ ｎｇｅｒ，ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．１９８９，２５２，７３）。こ れらの研究はＰＬＡ₂は液相および固相脂質の間の境界領域のみに結合している ことを明瞭に示している。 酵素により触媒される１，２−ジアシルグリセロリン脂質の二級エステル結合 の加水分解が比較的単純である一方、機構的および動力学的な様子は酵素−基質 相互作用が複雑であるためはっきりしない。ＰＬＡ₂の顕著な特徴は、最大の触 媒活性は凝集している基質（すなわち、その臨界ミヤル濃度より高い濃度のリン 脂質）に対して観察され、一方、単量体基質に対しては低いレベルの活性しか観 察されないことである。その結果、ＰＬＡ₂の競合阻害剤は酵素が基質二重層に 結合するまたは膜内へ分配される前に酵素の活性部位に対する高い親和性を有し 、およびリン脂質と活性部位を競合している。多くの阻害剤が生化学的アッセイ においてＰＬＡ₂の阻害を約束しているようにみえるが（例えば、Ｙｕａｎ，ｅ ｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９８７，１０９，８０７１；Ｌｏ ｍｂａｒｄｏ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９８５，２６０，７ ２３４；Ｃａｍｐｂｅｌｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｃｈｅｍ ．Ｃｏｍｍｕｎ ．１９８８，１５６０；およびＤａｖｉｄｓｏｎ，ｅｔ ａｌ． ，Ｂｉｏｃｈｅ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９８６，１３７， ５８７参照）、インビボ活性を記載している報告は少ない（例えば、Ｍｉｙａｋ ｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．１９９２，２ ６３ ，１３０２参照）。 一つの好適な実施態様において、本発明の単量体化合物に付加された官能基は 酵素ＰＬＡ₂との相互作用の能力（好適には阻害）で選択される。従って、本発 明の化合物はアトピー性皮膚炎および炎症性腸疾患を含む炎症性疾患の局所的お よび／または全身的処置に使用できる。 官能基の選択において、ＰＬＡ₂が両性イオンベシクルより陰性イオンベシク ルを好むことが利用できる。さらに、ＰＬＡ₂の天然の基質がホスフェート基を 含むため、ホスフェート基を有する本発明の化合物は利点を有する。 本発明のある種の化合物はＰＬＡ₂酵素の裂け目への結合を容易にするために 芳 香族官能基を含む（Ｏｉｎｕｍａ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９ ９１，３４，２２６０；Ｍａｒｋｉ，ｅｔ ａｌ．，Ａｇｅｎｔｓ Ａｃｔｉｏ ｎｓ １９９３，３８，２０２；およびＴａｎａｋａ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｎ ｔｉｂｉｏｔｉｃｓ １９９２，４５，１０７１参照）。ベンジルおよび４−ヘ キシルベンジル基が好適な芳香族基である。本発明の化合物はさらにテトラエチ レングリコール基のような疎水性官能基を含むことができる。ＰＬＡ₂酵素は疎 水性チャンネルを有するため、疎水性はこの酵素の阻害剤の重要な性質と信じら れている。 ＰＬＡ₂アッセイはＳＵＲＦ法のような組み合わせスクリーニング法を用いて 達成できる。このアッセイでは、オリゴマーライブラリーはヒトII型ＰＬＡ₂酵 素活性の阻害でスクリーニングされた。典型的には、これらのライブラリーは約 ８０００の異なった化合物を含む。ＳＵＲＦ技術の連続的反復がライブラリーか ら特異的オリゴマーを選択するために行われる。ライブラリーは阻害のさらなる 機構を決定するために他のインビトロアッセイでもさらにスクリーニングできる 。 組み合わせ法によるＰＬＡ₂の強い結合オリゴマー阻害剤の同定を最大にする ため、ランダム化ライブラリーには典型的には官能基のアレイが含まれる。単量 体、Ｈホスホネートおよびホスホロジアミダイト誘導体化主鎖セグメントが相互 に作用する結合によりオリゴマーはオリゴヌクレオチド合成と同様の様式で組み 立てられ、好適にはホスホルアミダイト誘導体化主鎖セグメントの場合に前に記 載されたような適当な処理が続き、次にホスホルアミデートまたはホスホロチオ アミデート（結合された官能基を有するであろう）への変換を達成するために酸 化工程が続く。 本発明の一つの態様においては、さらなる官能基が主鎖セグメントへ結合され る。本発明のある別の態様において、普通は核塩基のみで占められる空間の領域 は、核塩基に加えて、核塩基により提供されるものと異なったリガンドーリガン ド相互作用を提供するために選択された他の官能基により占められているであろ う。この方法論は、広範囲の官能基を有する多数のモノマーの収斂的製造を提供 する。必要ならば、合成完了後のオリゴマーの一工程脱保護を可能にするため、 官能基は塩基不安定性保護基で保護できる。 本発明のある態様では、単量体ユニットはオリゴマー化合物のライブラリー内 へ取り込まれる。上記のＳＵＲＦ技術のような組み合わせスクリーニング技術の 、スクリーニングの連続するラウンドにおいて、複雑さの減少していくオリゴマ ーのサブセットが同定できる。本発明の一つの好適な態様では、主鎖セグメント は固定したまま保たれ、官能基がランダム化される。本発明の別の好適な態様で は、官能基は固定したまま保たれ、主鎖セグメントがランダム化される。本発明 の別の好適な態様では、官能基および主鎖セグメントが同時にランダム化される 。本発明のより好適な態様において、主鎖セグメントが固定したまま保たれ、官 能基がランダム化されている組み合わせライブラリーが製造される。 スクリーニングの第一段階で活性オリゴマーが同定された後、最も活性なオリ ゴマーのレターは好適にはさらに修飾される。例えば、もしスクリーニングの第 一段階でベンジル基を”レター”として含む活性化合物が得られたら、続いての スクリーニングの第二段階ではこの化合物の活性がこの芳香環への修飾（例えば 、置換）を含む化合物の活性と比較される。スクリーニングの第三段階では、ラ ンダム化主鎖セグメントの効果が研究される。この方法により、構造活性が段階 的に同定でき、次第により強力な酵素活性の阻害剤が決定できる。 組み合わせ技術により発生された活性配列を検出するため、選択された活性分 子の濃度は選ばれたアッセイの感度内で分子が検出できるように十分濃くなけれ ばならない。認識されるように、組み合わせ技術により生成されたサブセット内 の特異的オリゴマーの数は、オリゴマーの長さおよび使用された異なった単量体 ユニットの数に依存している。配列の数は、単量体の数をランダムな位置の数に 等しい数だけ累乗することにより決定できる。このことは表IIに示されている。 表IIはまた、サブセット濃度が１００μＭ（典型的な高試験濃度）である場合の 各々の配列の濃度も示している。最初の概算として、単量体ユニットの数および その長さが、最終的なオリゴマー化合物に望まれる期待ＩＣ₅₀（すなわち、５０ ％の酵素活性が阻害される濃度）の見積に基づくことができる。１００ｎＭの期 待ＩＣ₅₀に対しては、表IIに示された複雑さは受容可能であり、すなわち、表II に示されたライブラリーは約１００ｎＭまたはそれ未満のＩＣ₅₀で特異的配列が 検出可能であろう複雑さを有する。 均一な主鎖セグメント長からなるライブラリーのために５つのレターを選択す る場合、ライブラリーは五つの単量体ユニットおよび一つの主鎖セグメントを有 するであろう。ライブラリーは単量体ユニットのホスホルアミデート位がレター ＸＮＮＮＮ（式中、Ｎはレターの等モル混合物であり、Ｘは五つの各々異なった レターである）で置換されているであろうし、各々の主鎖セグメントへ結合され たレターを有しないか、または各々の主鎖セグメントで単一のレターで均一に置 換されているであろう。合成を容易にするため、固定位置を分子の”右”端に都 合よく選択できる。下記のようにＰＬＡ₂活性のような活性の阻害をアッセイし た後、位置Ｘを最も大きな阻害を与える残基で固定し、続いて次のサブセットを 合成しスクリーニングする。非ランダム化が進むにつれ、固定位置をオリゴマー の”左”端に向かって移行させる。ユニークな阻害剤を決定するには５回の合成 およびスクリーニングが普通である。前に説明したように、ユニークな阻害剤は 主鎖セグメントのランダム化の影響および主鎖セグメントへ結合されたレターの 影響についてさらに研究できる。 本発明の単量体ユニットは標準Ｈホスホネート化学および同様なオリゴヌクレ オチドの合成に使用されてきたＨホスホノチオエート化学を用いて連結されオリ ゴマー化合物を形成する。レターの結合速度は異なっているので、本発明の一つ の態様においては各々のランダム化された位置での各々のレターの取り込みが等 モルになるようにホスホルアミデートまたはホスホロチオアミデートへ結合され る個々のレターの反応性が調節される。そのような反応性の調整の最適化は１９ ９４年１月１１日に出願され”ランダムオリゴヌクレオチドライブラリーおよび 同一のものを作製する方法”と題された米国特許出願第１７９，９７２号に開示 されている（また代理人ドケット番号ＩＳＩＳ−１００９としても特定される） 。前記特許出願はこの出願と共通して譲渡されており、ここに引用して包含され ている。 ＳＵＲＦスクリーニング法において、オリゴマーの量は最初の回のスクリー ニングでの各々のサブセットの濃度が比較的高くなるように（約１００μＭ）選 択される。現在のところＤＮＡ合成機を使用してオリゴマーを合成するのが好適 である。そのような合成機では、オリゴマーは１から４μｍｏｌのスケールで最 も都合よく合成される。ライブラリーのサブセットの濃度を約１００μＭとする と、アッセイは約２００μＬ未満の少容量で好適に実施される。 上に示した構造Ｉにおいて、単量体ユニット（括弧内）は互いに連結させてホ モ高分子構造を形成するか、またはヌクレオシドおよび／または他の部分と連結 させてヘテロ高分子構造を形成することができる。例えば、天然に存在するまた は合成のオリゴヌクレオチドまたはペプチド、ペプトイド、ペブチド核酸、オリ ゴおよび／またはポリサッカライドのような他の合成または天然のオリゴマー化 合物の一つまたはそれ以上の領域または”ストレッチ”と連結された本発明の単 量体ユニットの一つまたはそれ以上の領域または”ストレッチ”を含むキメラ構 造が形成できる。さらに、構造Ｉを有するオリゴマー化合物は、”単量体ジオー ルおよびそれらから形成されるリン酸結合オリゴマー”と題され１９９４年１月 １１日に出願された第１７９，９７０号の特許出願（また代理人ドケット番号Ｉ ＳＩＳ−０８６８としても特定される）および”窒素含有結合を有するオリゴヌ クレオチド模倣物”と題され１９９４年１月１１日に出願された第１８０，１２ ４号の特許出願（また代理人ドケット番号ＩＳＩＳ−１０１４としても特定され る）に開示されている化合物とともにキメラ構造内へ取り込ませることができる 。前記特許出願は本出願と同時に出願されており、共通して譲渡されており、お よび本明細書に引用して含まれている。 本発明の一つの態様において、構造Ｉに示したオリゴマー化合物は固定され、 前もって決められた”レター”の配列を有するように合成される。本発明の別の 態様において、構造Ｉに示したオリゴマー化合物はランダム配列を有するように 合成される。さらに、そのようなランダムに配列した化合物のライブラリーが製 造できる。この合成法は可変主鎖セグメントまたは可変ホスホルアミデートまた はホスホロチオアミデート位へ異なった官能基の結合によるライブラリーの構成 物の形成を強調している。 本発明の一つの態様において、官能基はホスホルアミデートまたはホスホロチ オアミデートジエステルオリゴマーへ付加される。二つのヒドロキシル基を有す る主鎖セグメントが標準条件（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅ ｓｉｓ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ ，Ｇａｉｔ．Ｍ，Ｊ．，Ｅ ｄ．，ＩＬ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ．，１９８４，Ｃｈａｐｔｅｒ １）を用い、ジ メトキシトリチル基または他の適した保護基でヒドロキシルの一つが保護される 。この保護主鎖セグメントをさらに無水コハク酸と反応させて保護主鎖セグメン トスクシニル モノエステルを形成させる。このモノエステルを脱離基（例えば 、ペンタフルオロフェノールまたはパラニトロフェノール）で活性化し、標準法 （Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，上記文献，Ｍａｓａｄ Ｊ．Ｄａｍｈａ，ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ ，１９９０，１８，３８１３−３８２１）に従 って固体支持体（例えば、ＬＣＡＡ ＣＰＧ）に誘導体化する。残った反応活性 部位を塞ぐために無水酢酸または他の適したキャップ形成剤を用いるキャップ形 成工程を実施する。ＤＭＴ保護基を例えばジクロロ酢酸またはトリクロロ酢酸の 希薄溶液で除去し、固体支持体に結合した脱保護主鎖セグメントを形成させる。 Ｈ ホスホネート モノエステル−保護主鎖セグメントは標準法（Ｎｕｃｌｅ ｉｃ Ａｃｉｄｓ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｖ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ ；Ｂｌ ａｃｋｂｕｒｎ，Ｇ．Ｍ．，Ｇａｉｔ Ｍ．Ｊ．，Ｅｄｓ．Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ；ＩＬ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９０，Ｃｈａｐｔｅｒ ３ ，ｐ．９８）に従って保護主鎖セグメントをイミダゾールまたは他の適した塩基 の存在下でＰＣｌ₃と反応させて製造し、保護Ｈホスホネートを形成させる。保 護Ｈホスホネートは例えばトリエチルアンモニウムまたはＤＢＵ塩として単離さ れる（Ｆｒｏｅｈｌｅｒ，Ｂ．，ｅｔ．ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ，１９８８，１６，４８３１−４８３８）。得られた保護Ｈホ スホネート単量体ユニット（塩として）は固体支持体に結合された脱保護主鎖セ グメントと縮合させ、固体支持体に一つの主鎖セグメントで結合されおよび他の 主鎖セグメントが保護されているＨホスホネートジエステルを形成させる。 本発明の一つの態様において、Ｈホスホノチオエートジエステルは、１９９３ 年６月８日付の米国特許第５，２１８，１０３号に含まれている方法に従って上 記のように製造された固体支持体に結合されている脱保護主鎖セグメントを、ト リエチルアミンまたは他の適した塩基の存在下でビス（ジイソプロピルアミノ） クロロホスフィンと反応させることにより製造される。得られた中間体は保護主 鎖セグメントと反応させ、続いて硫化水素で処理すると、固体支持体に結合され た一つの主鎖セグメントおよび他の保護主鎖セグメントに結合されているＨホス ホノチオエートジエステルが形成される。 ”レター”は、既知の方法および技術を用いて随意のテザー基とアミノ基に共 有結合で結合され、単一レターの場合は一級アミンを、二つのレターが共有結合 で結合されている場合は二級アミンを形成する。一級または二級アミンは酸化を 通してＨホスホネートジエステルまたはＨホスホノチオエートジエステルへ結合 され、それによりホスホルアミデートまたはホスホロチオアミデートが形成され る。上記工程を反復することにより前もって決められた配列のレターを有するホ スホルアミデートまたはホスホロチオアミデート主鎖オリゴマー構造が製造でき る。さらに、異なった長さおよび化学的複雑さの主鎖セグメントを用いると、最 終化合物の多様性に第二の次元を加えることができるであろう。 得られたオリゴマー化合物は標準条件（例えば水酸化アンモニウム）を用いて 固体支持体から切断される。希酸による脱トリチル化により最終オリゴマー化合 物が得られるであろう。 上記工程を修正すると、ホスホルアミデートまたはホスホロチオアミデートに 共有結合で結合されているレターの固定／ランダム配列を有する本発明のオリゴ マー構造の合成が可能である。典型的には、一つまたはそれ以上の位置が固定さ れ、その他の位置がランダムであるオリゴマー構造が合成される。試験が進行す るにつれて、特異的化合物が同定されるまでより多くの位置が固定され、ランダ ムな位置は減少する。上記工程の順列はこれを可能にする。 最初の位置または任意の数の位置を固定するため、化合物の固体支持体側から 出発して、上記の工程に従い所望のアミンレターが合成が進むにつれて所望の位 置内へ連続的に酸化された。二つまたはそれ以上のアミンレターで単一の位置を ランダム化するために、選択されたレターが一緒に混合され、化合物はこの混合 物で酸化された。二つまたはそれ以上の位置をランダム化するには合成のその部 分の間の酸化工程を省略し、これらの位置は一つの位置のためと同様の方法でア ミンレターの混合物を用いて一工程で酸化する（例えば、一つ以上の位置が同時 に酸化できる）。 酸化工程で使用される混合物中の個々のアミン”レター”の濃度は、最終オリ ゴマーで等しいモル濃度になるように反応性に関して調節される。オリゴマー構 造中の個々のアミンレターのパーセントを計算するには、等しいモル量の前もつ て決定されているアミンレターを用いて試験オリゴマー化合物を合成する必要が ある。５０−７０℃、１０％ギ酸によりレターをこのオリゴマーから切断し、Ｈ ＰＬＣにより分析する。個々のレターの濃度はそれらの既知のモル吸光係数から 評価できる。もしくは、オリゴマー構造とフタルアルデヒドおよび２−チオ酢酸 との反応により高い吸光係数を有するインドール誘導体が得られる（Ｂｒｕｃｋ ｎｅｒ，Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｏｈｙ，１９８９， ４７６，７３）。この方法はアミンレターがＵＶ−発色団でない場合に非常に有 用である。 ランダム化の別法ではオリゴマー化合物の合成の間に同時に一つの位置のラン ダム化が達成される。固体支持体を、ランダム化に使用されているアミンレター の数と一致する数に等しく分割する。固体支持体の各々の部分を異なったレター で別々に処理する。固体支持体を再合併させ、別の単量体ユニットを加え、すべ ての選択された部分がランダム化されるまで本方法を繰り返す。さらなる合成の ため固体支持体を再合併させる。この方法はビーズスプリッティングまたは樹脂 スプリッティングと称される。 ある種の組み合わせ法（例えばＳＵＲＦ、上記文献）において、一つのレター が固定して保たれ、残りの位置がランダム化される。もし所望のオリゴマーが６ ｍｅｒ（六つのユニット長のオリゴマー化合物）であるならば、六つのオリゴマ ーが合成される。オリゴマーはＤＮＡ合成機にて別々に６回合成される。各々の オリゴマーは六つのレターの一つでオリゴマーの最初の位置が固定して保たれお よび残りの位置は他の五つのレターの混合物ですべて一度に処理される。上述し たように混合物中の個々のレターの濃度はオリゴマーの各々の位置で等しいモル 比になるように反応性に関して前もって調整してある。もしくは、ビーズスプリ ッティング用い、固体支持体はレターの混合物中のレターの数と等しい量に分割 でき、別々に各々のレターで処理される。これを製造される６つのライブラリー の各々に対して行う。すべての部分がランダム化されたら、得られた６つのオリ ゴマーのライブラリーについて問題とするアッセイ（例えば上述のＰＬＡ₂アッ セイ）で試験し、最も活性なものを決定する。最初のラウンドで最大の活性を示 すオリゴマーを第二ラウンドのために選ぶ。第二ラウンドにおいてはすべてのオ リゴの最初の位置はラウンド１で最大の活性を示した特定のレターで固定されて いる。最初の実験のように第二の位置がここで６つのレターで固定され同じ技術 が反復される。結局、最終ラウンドで化合物が同定され、そこではただ６つの異 な ったオリゴマーが６つのアッセイで試験される。 レターのランダム化に加えて、本発明はまた主鎖セグメント内を変化させるこ とも可能である。主鎖セグメントは構造Ｉに見られるように本発明のホスホルア ミデートまたはホスホロチオアミデート部分を連結するのに使用されている。従 って主鎖セグメントは本発明のホスホルアミデートまたはホスホロチオアミデー トに”隣接（ｆｌａｎｋ）”している。本発明の好適な態様において、主鎖セグ メントへの前駆体はポリオール化合物（最も単純であるのはエチレングリコール である）である。オリゴマー合成の間に異なった主鎖セグメント前駆体（例えば プロピレングリコール、ブチレングリコールまたはより高級な同族体）を用いる と、ホスホルアミデートまたはホスホロチオアミデート部分間の距離が変化し、 本発明の化合物の多様性のレベルがより高くなる。環式構造およびヘテロ環の使 用により主鎖の剛性を改変することもできる。 主鎖セグメントはまた薬理学的およびその他の性質を促進する官能基を含むこ とができる。より精巧なユニットは本明細書の範囲内であると考えられる。この 変化性は本分野の現在の状態と比較した場合、ランダム化の項に新しい次元を加 えている。活性化合物が同定され、官能基が活性が最大になるように改良された 場合、次に所望の特性をさらに促進させるために主鎖セグメント改良が試験され る。このことは単に異なった主鎖セグメント前駆体を用いてホスホルアミデート またはホスホロチオアミデートの合成を改変することにより達成できるであろう 。 本発明の別の態様において、官能基はホスホルアミデートまたはホスホロチオ アミデート基およびオリゴマーを占める単量体ユニットの少なくとも一つの主鎖 セグメントの両方に結合されている。フルオレニルメチルカルボニル（ｆｍｏｃ ）基と共有結合で結合されている窒素のような保護された反応性部位を有する主 鎖セグメントが上記のように固体支持体へ共有結合で結合される。反応性部位は Ｆｍｏｃに対するピペリジンのＤＭＦ溶液のような通常の試薬で脱保護され、結 合剤を用いて”レター”が反応性部位へ結合される。固体支持体結合主鎖セグメ ント上の保護基が除去され、それに保護された反応性部位を有する主鎖セグメン トへ共有結合で結合されたＨホスホネートまたはホスホロジアミダイトが上記の ように共有結合で結合される。 上記のようなホスホルアミダイトの処理によりＨホスホノチオエートが得られ るであろう。ＨホスホネートまたはＨホスホノチオエートをアミン”レター”の 存在下で酸化するとホスホロチオアミデートまたはホスホルアミデートが得られ る。反応性部位をＦｍｏｃに対するピペリジンのＤＭＦ溶液のような適当な試薬 で脱保護し、結合剤を用いて”レター”が反応性部位へ結合される。保護された 反応性部位を有する主鎖セグメントへ共有結合で結合されたＨホスホネートまた はホスホロジアミダイトを、レターの結合を介して脱保護反応性部位へ付加する 過程を繰り返すと、所望の長さおよび主鎖セグメント、アミン官能基、主鎖官能 基および結合の型（例えばホスホルアミデートまたはホスホロチオアミデート） の配列のオリゴマー化合物の合成が達成されるであろう。得られたオリゴマー化 合物は標準条件（例えば水酸化アンモニウム）を用いて固体支持体から切断され る。希酸による脱トリチル化により最終オリゴマー化合物が得られるであろう。 前述の方法により均一またはランダム化された主鎖セグメント、主鎖レター、 アミンレターおよび結合型を有する本発明のオリゴマー構造を製造することが当 業者には可能である。本発明の一つの態様において、実質的にすべての主鎖ヤグ メント、主鎖レター、アミンレターおよび結合型は単量体ユニットの適切な部分 のためのシントンのプールからランダム化されたものである。本発明のさらに別 の態様において、構造Ｉの単量体ユニットからなるオリゴマー化合物は主鎖セグ メント、主鎖レター、アミンレターおよび結合型の前もって決定された配列を有 するように製造される。本発明の別の態様において、主鎖セグメント、主鎖レタ ー、アミンレターおよび結合型の少なくとも一つが固定して保たれ、一方残りの 主鎖セグメント、主鎖レター、アミンレターおよび結合型はランダム化されてい る。 官能基を有するオリゴマーユニットは以下の実施例に記載された方法により製 造される。必要な場合、反応性官能基は保護基により適切に保護される。保護基 はオリゴマー化合物の合成が完了したら除去される。通常、塩基不安定性保護基 が使用され、オリゴマーが樹脂から取り除かれるときに切断される。 実施例１ ２−Ｏ−（ジメトキシトリチル）エタノール エチレングリコール（２．４５ｍｌ，４４ｍｍｏｌ）の乾燥ピリジン（２５ｍ ｌ）溶液を氷浴で０℃に冷却した。過剰のトリエチルアミン（７ｍｌ）および４ −ジメチルアミノピリジン触媒（１２０ｍｇ，１ｍｍｏｌ）を加え、続いて３０ 分以上かけて塩化ジメトキシトリチル（７．４２ｇ，２１．９ｍｍｏｌ）を徐々 に加えた。混合物は０℃で１時間、次に室温で１時間撹拌した。得られた溶液は メタノールで反応を停止させ、減圧下蒸発乾固した。残渣は飽和ＮａＨＣＯ₃に 溶解し、ＥｔＯＡｃで抽出した。ＥｔＯＡｃ抽出物は冷飽和炭酸水素ナトリウム および食塩水で洗浄した。有機相を分離し、硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過して 減圧下蒸発させた。得られた残渣は酢酸エチルーヘキサン（１０から２０％への 濃度勾配）を用いるシリカゲルでのフラッシュカラムクロマトグラフィーにより 精製した。表記化合物が単離され、５．５３ｇ（７０％）が得られた。¹Ｈ Ｎ ＭＲ：（ＣＤＣｌ₃）δ ７．５０−７．２０，６．９０−６．８０（ｍ，１３ Ｈ，ＡｒＨ），３．８０（ｓ，６Ｈ，ＯＣＨ₃），３．７５（ｔ，２Ｈ，ＣＨ₂Ｏ Ｈ），３．２５（ｔ，２Ｈ，ＤＭＴＯＣＨ₂）。 実施例２ ２−Ｏ−（ジメトキシトリチル）エトキシホスホン酸 イミダゾール（４．２９ｇ，６３ｍｍｏｌ）の乾燥アセトニトリル（１００ｍ ｌ）溶液に０℃でＰＣｌ₃（１．７７ｍｌ，２０．３ｍｍｏｌ）を３０分以上か けて滴加した。得られた溶液はさらにトリエチルアミン（９．０６ｍｌ，６５ｍ ｍｏｌ）で処理する。濃厚なスラリーに２−Ｏ−（ジメトキシトリチル）エタノ ール（２．１０ｇ，５．８１ｍｍｏｌ）の無水アセトニトリル（１５０ｍｌ）溶 液を３０分以上かけて徐々に加えた。混合物は放置して室温まで暖め、１５分間 撹拌した。１Ｍ ＴＥＡＢで混合物の反応を停止させ、混合物を真空下、最少容 量にまで蒸発させてジクロロメタンで抽出した（２ｘ１５０ｍｌ）。ジクロロメ タン抽出物はＴＥＡＢで洗浄し、真空下蒸発させた。残渣はジクロロメタン／１ ％トリエチルアミン中０％から５％メタノールの濃度勾配を用いるシリカゲルで のフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製すると、１．３ｇの純粋な物 質が得られた（４３％）。¹Ｈ ＮＭＲ：（ＣＤＣｌ₃）δ ７．５０−７．２０ ，６．９０−６．８０（ｍ，１３Ｈ，ＡｒＨ），６．９６（ｄ，１Ｈ，Ｊ_PH＝６ ２４Ｈｚ，ＰＨ），４．０６（ｍ，２Ｈ，ＣＨ₂ＯＰ），３．８０（ｓ，６Ｈ， ＯＣＨ₃），３．２５（ｔ，２Ｈ，ＤＭＴＯＣＨ₂），３．０５（ｑ，６Ｈ，Ｎ（ ＣＨ₂ＣＨ₃）₃），１．２５（ｔ，９Ｈ，Ｎ（ＣＨ₂ＣＨ₃）₃）。³¹Ｐ ＮＭＲ： （ＣＤＣｌ₃）５．８９。 実施例３ ２−Ｏ−（ジメトキシトリチル）エチルスクシネート半エステルの合成 ２−Ｏ−（ジメトキシトリチル）エタノール（１．０ｇ，２．７７ｍｍｏｌ） 、トリエチルアミン（０．４ｍｌ，３ｍｍｏｌ）および４−ジメチルアミノピリ ジン触媒（１２０ｍｇ，１ｍｍｏｌ）の乾燥ジクロロメタン溶液に無水コハク酸 （４１０ｍｇ，０．４１ｍｍｏｌ）を加えた。混合物は５０℃に１．５時間加熱 した後室温まで冷却した。混合物は室温に１６時間保たれた。混合物を濾過し、 次に濾液をクロロホルム−メタノール−トリエチルアミンを用いるシリカゲルフ ラッシュカラムクロマトグラフィーで精製すると表記化合物をトリエチルアンモ ニウム塩として得た。¹Ｈ ＮＭＲ：（ＣＤＣｌ₃）δ７．５０−７．２０，６． ９０−６．８０（ｍ，１３Ｈ，ＡｒＨ），４．２６（ｔ，２Ｈ，ＣＨ₂ＯＣＯ） ，３．８０（ｓ，６Ｈ，ＯＣＨ₃），３．２５（ｔ，２Ｈ，ＤＭＴＯＣＨ₂），３ ．０５（ｑ，６Ｈ，Ｎ（ＣＨ₂ＣＨ₃）₃），２．７０（ｍ，４Ｈ，ＯＯＣＣＨ₂Ｃ Ｈ₂ＣＯＯ），１．２５（ｔ，９Ｈ，Ｎ（ＣＨ₂ＣＨ₃）₃）。 実施例４ ２−Ｏ−（ジメトキシトリチル）エチルスクシネート半エステルによるＬＣＡＡ ＣＰＧの誘導体化 ２−Ｏ−（ジメトキシトリチル）エチルスクシネート半エステルのトリエチル アンモニウム塩（１３５ｍｇ）をジクロロメタン（５ｍｌ）に溶解した。４−ジ メチルアミノビリジン触媒（４０ｍｇ，０．２ｍｍｏｌ）、続いてトルエン ジ イソシアネート（．０２９ｍｌ，０．２ｍｍｏｌ）を加えた。長鎖アルキルアミ ン制御細孔ガラス（ＬＣＡＡ ＣＰＧ）（１．０ｇ）を加え、混合物は遮光して １６時間振とうした。混合物を濾過し、ジクロロメタン続いてジエチルエーテル で洗浄した（各々３ｘ１０ｍｌ）。ＣＰＧは１６時間、ピリジン／水（４：１） 中で振とうし、濾過してピリジン（５ｘ５ｍｌ）で洗浄した。乾燥ＣＰＧの試料 １０ｍｇを３％トリクロロ酢酸のジクロロメタン溶液で処理した。トリチルイオ ンの存在は誘導体化を定量的に実証している。ジメトキシトリチル陽イオンの吸 光度を測定することにより誘導体化は３０μｍｏｌ／ｇであることが測定された 。 実施例５ 実施例４の誘導体化ＣＰＧへの２−Ｏ−（ジメトキシトリチル）エトキシ−ホス ホン酸の連続的結合によるオリゴマー合成 実施例４の誘導体化樹脂のジメトキシトリチル保護基を２％ジクロロ酢酸で処 理することにより除去し、乾燥アセトニトリルで洗浄した。次に樹脂をアセトニ トリル−ピリジン（４：１）で洗浄し、続いて２０−３０当量の２−Ｏ−（ジメ トキシトリチル）エトキシ−ホスホン酸および２０−３０当量のアダマンタンカ ルボニルクロライドのアセトニトリル−ピリジン溶液で同時に処理した。混合物 は合成容器中で試薬を循環させることにより１０−１５分間混合した。ＣＰＧは 次にアセトニトリル−ピリジンで簡単に洗浄し、すべての未反応ヒドロキシル基 を蓋するためにジイソプロピルホスファイト アダマンタンカルボニルクロライ ドで処理した。最後に、ＣＰＧをアセトニトリル−ピリジン、続いてアセトニト リルで洗浄した。結合効率の評価は、オリゴマーをアセトニトリル中ジクロロ酢 酸で処理し、続いてその一部の吸光度を４９８ｎｍで測定することにより求めた 。 ＣＰＧは２％ジクロロ酢酸のアセトニトリル溶液で処理し、乾燥アセトニトリ ルで洗浄した。次にＣＰＧをアセトニトリル−ピリジン（４：１）で洗浄し、続 いて２０−３０当量の２−Ｏ−（ジメトキシトリチル）エトキシ−ホスホン酸お よび２０−３０当量のアダマンタンカルボニルクロライドのアセトニトリル−ピ リジン溶液で同時に処理した。混合物は合成容器中で試薬を循環させることによ り１０−１５分間混合した。ＣＰＧは次にアセトニトリル−ピリジンで簡単に洗 浄し、ジイソプロピルホスファイト アダマンタンカルボニルクロライドで処理 した。最後に、ＣＰＧをアセトニトリル−ピリジン、続いてアセトニトリルで洗 浄すると誘導体化ＣＰＧが得られた。第二の結合効率の評価は前記のように行わ れるであろう。ｎ回上記の方法を繰り返すと、ｎ＋１の主鎖セグメントおよび上 記のようにスクシネート基によりＬＣＡＡ樹脂に繋がれたｎのＨ−ホスホネート 結合を有するオリゴマーが得られるであろう。 実施例６ １０−Ｏ−（ジメトキシトリチル）−１−デカノールの合成 過剰のトリエチルアミンを含むデカン−１，１０−ジオールの乾燥ピリジン溶 液に６時間以上かけて１当量の塩化ジメトキシトリチルを添加した。得られた溶 液は減圧下蒸発乾固させ、残渣を塩化メチレンに再溶解し、冷飽和炭酸水素ナト リウム、水および食塩水で洗浄した。有機相を分離して硫酸ナトリウムで乾燥し 、濾過後再び減圧下蒸発させた。得られた残渣は酢酸エチル−ヘキサンを用いる シリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィーを行うと純粋な生成物が単離され る。Ｈ−ＮＭＲにより確認するとＤＭＴ基（マルチプレット、８．０−７．０ｐ ｐｍ）、デカン基（マルチプレット、１．２−４．０ｐｐｍ）およびアルコール （可変）のシグナルが得られた。 実施例７ １０−Ｏ−（ジメトキシトリチル）デシルオキシ−ホスホン酸の合成 ３当量のイミダゾールの乾燥アセトニトリル溶液に１当量のＰＣｌ₃を３０分 以上かけて滴加する。得られた溶液にさらに過剰のトリエチルアミンを加えて反 応を完全にする。１時間後、混合物に１当量の１０−Ｏ−（ジメトキシトリチル ）デカン−１，１０−ジオールの乾燥アセトニトリル溶液を加え、混合物は室温 でさらに１時間撹拌した。この混合物を過剰の炭酸水素トリエチルアンモニウム 溶液（ｐＨ８）で処理すると表記化合物が得られた。本化合物は炭酸水素溶液を 酢酸エチルで繰り返し抽出することにより精製される。抽出物をプールし、炭酸 水素ナトリウムで乾燥させ、減圧下溶媒を蒸発させると化合物が得られ、それは さらに精製することなくそのままで使用される。³¹Ｐ ＮＭＲ（ダブレット、６ ｐ ｐｍ、Ｊ_P-H＝６００Ｈｚ）および¹Ｈ ＮＭＲによる確認によりＤＭＴおよび１ ０−Ｏ−（ジメトキシトリチル）デカンジオールのデカン基のシグナルおよびト リエチルアンモニウム基（ダブレット、トリプレット、３．２−２．２ｐｐｍ） のシグナルが得られた。 実施例8 １０−Ｏ−（ジメトキシトリチル）デシルスクシネート半エステルの合成 １０−Ｏ−（ジメトキシトリチル）デカン−１，１０−ジオールの乾燥ジクロ ロメタン溶液に１当量の無水コハク酸、過剰のトリエチルアミンおよび５モル％ の４−ジメチルアミノピリジン触媒を加えた。混合物は無水条件下一夜撹拌した 後、ジクロロメタンで希釈した。この溶液は冷飽和炭酸水素ナトリウムおよび食 塩水で洗浄した。次に溶液を硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過後減圧下で蒸発 乾固させた。得られた固形物は酢酸エチル−メタノール−トリエチルアミンを用 いるシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製すると表記化合 物をトリエチルアンモニウム塩として得た。遊離酸はこの物質を水を含むメタノ ールと繰り返し共沸させることにより得られる。¹Ｈ ＮＭＲによる確認により ＤＭＴおよび１０−Ｏ−（ジメトキシトリチル）デカン−１，１０−ジオールの デカン基のシグナルおよびクエン酸基（二つの非常に近接したダブレットのダブ レット、２．５−３．０ｐｐｍ）のシグナルが得られた。 実施例９ １０−Ｏ−（ジメトキシトリチル）デシルスクシネート半エステルによるＬＣＡ Ａ ＣＰＧの誘導体化 市販品として得られた長鎖アルキルアミン基で誘導体化した制御細孔ガラス（ ＬＣＡＡ ＣＰＧ）の試料を乾燥アセトニトリルに懸濁する。別の乾燥容器にて 、１０−Ｏ−（ジメトキシトリチル）デシルスクシネート半エステルを２当量の ペンタフルオロフェノール、過剰のトリエチルアミンおよび２当量のジシクロヘ キシル カルボジイミドで処理する。活性化１０−Ｏ−（ジメトキシトリチル） デシルスクシネート半エステルを含む混合物はアルゴン下で１時間撹拌した後、 無水条件を保ちながらＣＰＧの懸濁液に加える。混合物は６時間穏やかに振とう し、上澄み液を分離してさらに２回この過程を繰り返す。各々の処理に使用され た１０−Ｏ−（ジメトキシトリチル）デシルスクシネート半エステルの量はＬＣ ＡＡ ＣＰＧのグラム当たりの利用可能なアミン基の濃度に基づいており、一般 的に２５−４０ミリモル／グラムであることが観察された。ＣＰＧは次に無水酢 酸の希薄ピリジン溶液で１時間処理してすべての未反応アミン官能性を塞ぎ、数 回アセトニトリルで洗浄した。このＣＰＧの誘導体化の程度は、正確に秤量した 生成ＣＰＧの試料を２％のジクロロ酢酸を含むアセトニトリルで処理し、上澄み 液の一部の吸光度を４９８ｎｍで測定することにより決定された。 実施例１０ 誘導体化ＣＰＧへの１０−Ｏ−（ジメトキシトリチル）デシル−ホスホン酸の連 続的結合によるオリゴマー合成 実施例９の誘導体化ＣＰＧのジメトキシトリチル保護基を２％ジクロロ酢酸で 処理することにより除去し、乾燥アセトニトリルで洗浄した。ＣＰＧをアセトニ トリル−ピリジン（１：１）で洗浄し、続いて１０から３０当量のトリエチルア ンモニウム塩としての１０−Ｏ−（ジメトキシトリチル）デシル−ホスホン酸、 ２０−３０当量のアダマンタンカルボニルクロライドのアセトニトリル−ピリジ ン溶液で同時に処理した。ＣＰＧは次にアセトニトリル−ピリジンで洗浄し、す べての未反応ヒドロキシル基を塞ぐためにジイソプロピルホスファイト アダマ ンタンカルボニルクロライド（０．２Ｍ）で処理した。最後に、ＣＰＧをアセト ニトリル−ピリジン（１：１）、続いてアセトニトリルで洗浄した。結合効率の 評価は、ＣＰＧをアセトニトリル中ジクロロ酢酸で処理し、続いてその一部の吸 光度を４９８ｎｍで測定することにより求めた。ｎ回上記の方法を繰り返すと、 ｎ＋１のデカンユニットおよびｎのＨ−ホスホネート結合を有するオリゴマーが 得られるであろう。上記のようにオリゴマーはスクシネート基によりＬＣＡＡ ＣＰＧに繋がれる。 実施例１１ （Ｎ１−チミン）−２−酢酸 ブロモ酢酸メチル（２５．５ｇ，１５．２ｍｌ，１６０ｍｍｏｌ）をＫ₂ＣＯ₃ （４４．２ｇ，３２０ｍｍｏｌ）およびチミン（２０．２ｇ，１６０ｍｍｏｌ） の乾燥ＤＭＦ（５００ｍｌ）懸濁液に加え、一夜撹拌した。懸濁液を濾過し、溶 媒は減圧下除去した。残渣を１２０ｍｌのＨ₂Ｏおよび３０ｍｌの４Ｎ ＨＣｌ に懸濁し、３０分撹拌した後再び濾過した。固形物を２５０ｍｌのＨ₂Ｏに懸濁 し、１００ｍｌの２．５Ｍ ＮａＯＨを加えた。この溶液は加熱して沸騰させ、 冷却して濃ＨＣｌでｐＨ１の酸性とした。沈殿物を真空下で乾燥させると１３． ６ｇの純生成物（７３．６ｍｍｏｌ，４６％）が得られた。¹Ｈ ＮＭＲ：（Ｄ ＭＳＯ−ｄ６，２００ＭＨｚ）δ ７．４８（ｓ，１Ｈ，Ｈ６），４．３７（ｓ ，２Ｈ，ＣＨ₂），１．７６（s，３Ｈ，ＣＨ₃）。 実施例１２ Ｎ−４−ベンゾイル−１−シトシン−２−酢酸 シトシン半水和物（１２．０ｇ，１００ｍｍｏｌ）をピリジンと共沸させ、２ ５０ｍｌの乾燥ピリジンに再懸濁した。塩化ベンゾイル（５８ｍｌ，７０．３ｇ ，５００ｍｍｏｌ）を滴加した（発熱）。溶液はＲＴで一夜撹拌し、水（５０ｍ ｌ）を注意して加えた。溶媒を蒸発させ、残渣は５５ｇのＮａＯＨを含む７００ ｍｌの水に溶解させた。溶液は物質が完全に溶解するまで１時間撹拌した。次に 濃ＨＣｌを加えてｐＨ４．０とし、白色沈殿を集めて１リットルのＥｔＯＨ中で 沸騰させ、ＲＴまで冷却して濾過すると１６．１ｇの生成物が得られた（７５％ ）。 Ｎ−４−ベンゾイル−１−シトシン（１５．０ｇ，６９．７ｍｍｏｌ）および Ｋ₂ＣＯ₃（９．７ｇ，７０ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（５００ｍｌ）懸濁液にブロモ酢 酸メチル（６．６ｍｌ，１０．７ｇ，７０ｍｍｏｌ）を加えた。懸濁液は激しく ３日間撹拌した後濾過し、蒸発させた。残渣を水（１２０ｍｌ）および１０ｍｌ の４Ｎ ＨＣｌで１５分間処理し、固形物を濾過して集めた。残渣は１２０ｍｌ の水に再懸濁し、６０ｍｌの２Ｎ ＮａＯＨを加えた。懸濁液はすべての固形物 が溶解するまでＲＴで４５分間撹拌した。濃ＨＣｌで溶液をｐＨ２ｎ酸性に調整 し、固形物を真空下６０℃で乾燥させると１１．６ｇの生成物が得られた（６１ ％）。 実施例１３ （Ｎ６−ベンゾイル−９−アデニン）−２−酢酸 アデニン（２５．０ｇ，１８５ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（５００ｍｌ）懸濁液に水 素化ナトリウム（８．２０ｇ，６０％油溶液、２０５ｍｍｏｌ）を加えた。撹拌 機を用いて２時間激しく撹拌すると、Ｈ₂の発生が止み濃厚なスラリーが得られ た。ブロモ酢酸エチル（５５．６ｇ，３６．９ｍｌ，３３３ｍｍｏｌ）３時間以 上かけて滴加し、撹拌をさらに１時間続けた。水（１０ｍｌ）およびＨ₂ＳＯ₄を ｐＨ４になるまで加えた。溶媒を蒸発させ残渣は５００ｍｌのＨ₂Ｏに懸濁し、 濾過して水で洗浄した。残渣を４００ｍｌのＥｔＯＨから再結晶すると２３．８ ｇ（１０８ｍｍｏｌ，５８％）の純粋な生成物が得られた。 （９−アデニリル）−２−酢酸エチルエステル（６．０６ｇ，２７．４ｍｍｏ ｌ）の乾燥ピリジン（２５０ｍｌ）懸濁液に塩化ベンゾイル（９．６０ｍｌ，１ １．６ｇ，８２ｍｍｏｌ）を加え、溶液を室温で４時間撹拌した。さらにメタノ ール（２５ｍｌ）を加えて溶媒を蒸発させた。残渣を酢酸エチル（２ｘ２５０ｍ ｌ）に溶解し、０．１Ｎ ＨＣｌ、Ｈ₂Ｏ、飽和ＮａＨＣＯ₃、食塩水で洗浄し、 Ｎａ₂ＳＯ₄で乾燥した。有機抽出物を蒸発させ、固形残渣を０℃で２５０ｍｌの ＴＨＦに再溶解し、１００ｍｌの１Ｍ ＮａＯＨを加えた。溶液は０℃で１時間 撹拌し、濃ＨＣｌでｐＨ１の酸性にし、水性部分をエーテルで抽出した。ほとん どすぐに結晶化を始めた生成物を濾過して集めると、４．９６ｇ（６１％）の生 成物が得られた。¹Ｈ ＮＭＲ：（ＤＭＳＯ−ｄ６，２００ＭＨｚ）δ ８．８ ６，８．８４（ｄ，Ｈ₂，Ｈ８），８．１（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，ＡｒＨ ），７．６９−７．５８（ｍ，３Ｈ，Ａｒ−Ｈ），５．２２（ｓ，２Ｈ，ＣＨ₂ ）。 実施例１４ Ｎ−２−イソブチロイル−９−グアニリル−２−酢酸 ２−アミノ−６−クロロプリン（１０ｍｍｏｌ）およびＫ₂ＣＯ₃（１５ｍｍｏ ｌ）のＤＭＦ（２５ｍｌ）懸濁液にブロモ酢酸エチル（１０ｍｍｏｌ）を加えた 。 混合物は２４時間激しく撹拌し、濾過して溶媒を蒸発させた。残渣を２５ｍｌの ピリジンに再懸濁し、塩化イソブチロイル（２０ｍｍｏｌ）を加えた。１８時間 撹拌後、水を加えて溶媒を除去した。残渣を１Ｎ ＨＣｌに懸濁し、１時間加熱 還流した。懸濁液は次に０℃に冷却し、ｐＨ１２までＮａＯＨを加え１時間撹拌 した。溶液は次にｐＨ３の酸性とし、生成物を濾過により集めた。 実施例１５ ２−Ｎ−Ｆｍｏｃ−２−アミノ−１，３−プロパンジオール ２−アミノール−１，３−プロパンジオール（３．４８ｇ，３８．２ｍｍｏｌ ）およびＮａＨＣＯ₃（８．００ｇ，９５．２ｍｍｏｌ）を１５０ｍｌのＨ₂Ｏ／ ジオキサン（１：１）に懸濁させた。フルオレニルメチル クロロホルメート（ １１．４ｇ，４４．０ｍｍｏｌ）のトルエン（２５ｍｌ）を滴加する。滴加中の 反応液の温度は２５℃以下に保たれた。混合物は一夜激しく撹拌した後、５０ｍ ｌの飽和ＮａＨＣＯ₃溶液および５０ｍｌの水を加えて反応を停止させた。溶液 は１００ｍｌのジエチルエーテルで抽出する。水層を濃ＨＣｌでｐＨ１の酸性と して２回酢酸エチルで抽出し、有機抽出物は食塩水で洗浄する。溶液はＭｇＳＯ ４で乾燥して濾過し、溶媒を真空下除去する。粗物質はシリカゲルカラムクロマ トグラフィーで精製すると表記化合物が得られる。 実施例１６ １−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ−Ｆｍｏｃ−２−アミノ−１，３−プロパンジ オール Ｎ−Ｆｍｏｃ−２−アミノ−１，３−プロパンジオール（１３．７９ｇ，４４ ｍｍｏｌ）の乾燥ピリジン（２５０ｍｌ）溶液を氷浴で０℃に冷却する。過剰の トリエチルアミン（７ｍｌ）および４−ジメチルアミノピリジン触媒（１２０ｍ ｇ，１ｍｍｏｌ）を加え、続いて３０分以上かけて塩化ジメトキシトリチル（１ ４．８ｇ，４４ｍｍｏｌ）を加えた。混合物は反応が完了するまで０℃で撹拌す る。生じた溶液はメタノールで反応を停止させ、減圧下蒸発乾固させる。残渣は 飽和ＮａＨＣＯ₃に溶解してＥｔＯＡｃで抽出する。ＥｔＯＡｃ抽出物は冷飽和 炭 酸水素ナトリウムおよび食塩水で洗浄する。有機層を分離して硫酸ナトリウムで 乾燥し、濾過して減圧下蒸発させた。得られた残渣はシリカゲルによるフラッシ ュカラムクロマトグラフィーにより精製すると表記化合物が得られる。 実施例１７ １−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ−Ｆｍｏｃ−２−アミノ−３−Ｏ−ホスホン酸 −１，３−プロパンジオール イミダゾール（４．２９ｇ，６３ｍｍｏｌ）の乾燥アセトニトリル（３００ｍ ｌ）溶液に０℃にて３０分以上かけてＰＣｌ₃（１．７７ｍｌ，２０．３ｍｍｏ ｌ）を滴加する。得られた溶液はさらにトリエチルアミン（９．０６ｍｌ，６５ ｍｍｏｌ）で処理する。濃厚なスラリーに１−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ−Ｆ ｍｏｃ−２−アミノ−１，３−プロパンジオール（３．５８ｇ，５．８１ｍｍｏ ｌ）の無水アセトニトリル（１５０ｍｌ）溶液を３０分以上かけてゆっくりと加 えた。混合物は放置して室温まで暖め、１５分間撹拌した。混合物にピリジン／ 水９：１（１００ｍｌ）を加えて反応を停止させ、真空下混合物を最少容量まで 蒸発させてジクロロメタンで抽出した（２ｘ１５０ｍｌ）。ジクロロメタン抽出 液は水で洗浄し、真空下で蒸発させた。残渣をジクロロメタン／ＭｅＯＨ／ピリ ジンを用いるシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製すると表記化合物 が得られる。 実施例１８ １−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ−Ｆｍｏｃ−２−アミノ−１，３−プロパンジ オール スクシネート半エステル １−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ−Ｆｍｏｃ−２−アミノ−１，３−プロパン ジオールを実施例３の方法により無水コハク酸で処理すると表記化合物が得られ る。 実施例１９ １−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ−Ｆｍｏｃ−２−アミノ−１，３−プロパンジ オール スクシネート半エステルによるＬＣＡＡ ＣＰＧの誘導体化 実施例４の方法によりＬＣＡＡ ＣＰＧが１−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ− Ｆｍｏｃ−２−アミノ−１，３−プロパンジオール スクシネート半エステルに より誘導体化され誘導体化樹脂が得られる。 実施例２０ １−Ｏ−ジメトキシトリチル−２−アミノ−１，３−プロパンジオール スクシ ネート誘導体化樹脂 １−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ−Ｆｍｏｃ−２−アミノ−１，３−プロパン ジオール スクシネート誘導体化ＣＰＧのＦｍｏｃ保護基はジメチルホルムアミ ド（ＤＭＦ）中でピペリジンで処理することにより除去される。ＣＰＧ結合１− Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ−Ｆｍｏｃ−２−アミノ−１，３−プロパンジオー ルはＤＭＦ中、２当量のピペリジンで処理される。ＣＰＧは次にアセトニトリル ／ピリジン１：１で洗浄された後、ＤＭＦ中２当量のピベリジンで２回目の処理 が行われる。最後に、ＣＰＧをアセトニトリル／ピリジン、次にアセトニトリル で洗浄すると脱保護物質が得られる。 実施例２１ １−Ｏ−ジメトキシトリチル−２−Ｎ−（アセチルチミン）アミノ−１，３−プ ロパンジオール スクシネート誘導体化樹脂 方法Ａ １−Ｏ−ジメトキシトリチル−２−アミノ−１，３−プロパンジオール スク シネート誘導体化樹脂（２．０ｇ，１．０ｍｍｏ１／ｇｍ負荷，１％架橋）をジ クロロメタン（２００ｍＬ）中で膨潤させ、１−カルボキシメチル チミン（２ ．０ｇ，１０ｍｍｏｌ）、［Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）− １，１，３−テトラメチルウロニウム ヘキサフルオロホスフェート（３．８ｇ ，１０ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（２．０ｇ，２０ｍｍｏｌ）を加えた 。反応混合物は４０℃に１８時間加熱し、冷却後、樹脂を５回ジクロロメタン（ ５０ｍＬ）次に３回ジエチルエーテル（１００ｍＬ）で洗浄し、低真空下４０℃ で１ ８時間乾燥する。遊離流動性樹脂粉末はそのまま使用される。 方法Ｂ １−Ｏ−ジメトキシトリチル−２−アミノ−１，３−プロパンジオール スク シネート誘導体化樹脂（２．０ｇ，１．０ｍｍｏｌ／ｇｍ負荷，１％架橋）をジ クロロメタン（２００ｍＬ）中で膨潤させ、ＨＯＢｔ（０．１Ｍ）、ＰｙＢＯＰ （０．１Ｍ）、Ｎ−メチルモルホリン（０．１５Ｍ）をＤＭＦ溶液として加え、 続いて１−カルボキシメチル チミン（２．０ｇ，１０ｍｍｏｌ）を加え、２− ３時間または一夜結合反応を進行させた。樹脂は５回ジクロロメタン（５０ｍＬ ）次に３回ジエチルエーテル（１００ｍｌ）で洗浄し、低真空下４０℃で１８時 間乾燥する。遊離流動性樹脂粉末はそのまま使用される。 実施例２２ ｎ主鎖セグメントの連続的付加および官能化 誘導体化樹脂のジメトキシトリチル保護基を２％ジクロロ酢酸で処理すること により除去し、乾燥アセトニトリルで洗浄した。次に樹脂をアセトニトリル−ピ リジン（４：１）で洗浄し、続いて１０当量の１−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ −Ｆｍｏｃ−２−アミノ−３−Ｏ−ホスホン酸−１，３−プロパンジオールおよ び３０当量のアダマンタンカルボニルクロライドのアセトニトリル−ピリジン溶 液で同時にＣＰＧを処理した。混合物は合成容器中で試薬を循環させることによ り２分間混合した。ＣＰＧは次にアセトニトリル−ピリジンで簡単に洗浄し、す べての未反応ヒドロキシル基を蓋するためにジイソプロピルホスファイト アダ マンタンカルボニルクロライドで処理した。ＣＰＧはアセトニトリル−ピリジン 、続いてアセトニトリルで洗浄した。得られたホスホン酸ジエステルは四塩化炭 素／ピリジン中、大過剰モルのジエチルアミン（アミンレター）と反応させた。 固体支持体は１５分間振とうし、上澄みは濾過して除去する。固体支持体はピリ ジンで洗浄する。四塩化炭素／ピリジン中、大過剰モルのジエチルアミンで２回 目の処理を行い、続いて振とうさせるとホスホルアミデートへの効率的酸化が確 実になるであろう。Ｆｍｏｃ保護基は実施例２０の方法により除去される。得ら れた遊離アミン基は実施例２１の方法により１−カルボキシメチル チミンで処 理 する。この過程を２回繰り返すと、レターに対応するアセチルチミン基および主 鎖セグメント内の炭素に結合されたアミン基へ共有結合で結合されたテザーを有 する２ｍｅｒが得られる。ホスホルアミデート窒素に結合されている官能基はエ チル基である。この過程をｎ回繰り返すとｎ＋１主鎖セグメント長の完全に官能 基化されたオリゴマーが得られるであろう。 オリゴマー配列の所望の長さおよびコンフィグレーションの最後の付加が完了 後、固体支持体をピリジン／アセトニトリルで洗浄し、濃水酸化アンモニウムを 用いて室温で３時間処理することにより樹脂からホスホルアミデートを切断する 。上澄み液を蒸発させ、ホスホルアミデートをＲＰ−１８ ＨＰＬＣカラムで精 製すると最終オリゴマーが得られる。 実施例２３ Ｎ−Ｆｍｏｃ−アスパラギン酸−β−ベンジルエステル ２−アミノアスパラギン酸−β−ベンジルエステル（１５０ｍｍｏｌ）および ジイソプロピルエチルアミン（６６．３ｍｌ，４９．１ｇ，３８０ｍｍｏｌ）を １５０ｍｌＨ₂Ｏ＋３００ｍｌジオキサンに懸濁する。フルオレニルメチル ク ロロホルメート（４３．２５ｇ，１．１当量）のジオキサン（１００ｍｌ）溶液 を滴加した。滴加の間、反応液の温度は１０℃を超えないようにする。混合物は 一夜激しく撹拌し、溶媒のほとんどを真空下除去する。水および飽和炭酸水素塩 溶液を加え（各々２５０ｍｌ）、溶液を２５０ｍｌのジエチルエーテルで抽出し 、その液は廃棄する。水層は濃ＨＣｌでｐＨ１の酸性とし、２回酢酸エチルで抽 出して（２ｘ３００ｍｌ）有機抽出液は食塩水で洗浄する。溶液はＭｇＳＯ₄で 乾燥し、濾過後、真空下で溶媒を除去すると表記化合物が得られる。 実施例２４ ４−ヒドロキシ−２−Ｎ−Ｆｍｏｃ−アミノブタン酸 ２−Ｎ−Ｆｍｏｃ−アスパラギン酸−β−ベンジルエステル（１０ｍｍｏｌ） を乾燥ＴＨＦ（１００ｍｌ）に溶解し、０℃に冷却して水素化ホウ素リチウム（ １５ｍｍｏｌ）を加えた。溶液は０℃で撹拌し、その後出発物質が完全に消失 するまで室温で撹拌する。過剰の酢酸エチルを加え、溶液を０．１Ｍクエン酸溶 液、食塩水で洗浄しＭｇＳＯ₄で乾燥する。粗物質はフラッシュクロマトグラフ ィーにより精製すると表記化合物が得られる。 実施例２５ ４−Ｏ−ジメトキシトリチル-２−Ｎ−Ｆｍｏｃ−アミノブタン酸 ４−ヒドロキシ−２−Ｎ−Ｆｍｏｃ−アミノブタン酸（３０ｍｍｏｌ）を乾燥 ピリジン（２ｘ５０ｍｌ）と共沸し、２００ｍｌの乾燥ピリジンに再溶解して氷 浴で冷却した。塩化ジメトキシトリチル（２２．０ｇ，６５ｍｍｏｌ）を３０分 以上かけて少しづつ加え、その溶液はＲＴで一夜撹拌した。次に水（１０ｍｌ） を加え、トリチルエステルが完全に加水分解されるまで溶液を撹拌した。減圧下 溶媒を除去する。残渣をＣＨ₂Ｃｌ₂（３００ｍｌ）に溶解し、１５０ｍｌの０． １Ｍクエン酸溶液、１５０ｍｌの飽和ＮａＨＣＯ₃、食塩水で洗浄し、ＭｇＳＯ₄ で乾燥して蒸発させる。残渣はフラッシュクロマトグラフィーにより精製する。 実施例２６ ４−Ｏ−ジメトキシトリチル−２−Ｎ−Ｆｍｏｃ−アミノブタン−１−オール ４−Ｏ−ジメトキシトリチル−２−Ｎ−Ｆｍｏｃ−アミノブタン酸（１４０ｍ ｍｏｌ）のＴＨＦ（５００ｍｌ）溶液を撹拌し、ＲＴでボラン−メチルスルフィ ド（２９０ｍｌ，２１．８ｇ，２７．３ｍｌ）を滴加した。反応が完了するまで 撹拌が続けられる。メタノールを注意して加え（激しいＨ₂発生）、得られた溶 液はさらに１５分撹拌する。溶媒を減圧下で蒸発させ、得られたゴム状物は２ｘ ３００ｍｌＭｅＯＨと共沸する。生成物はフラッシュクロマトグラフィーにより 精製する。 実施例２７ １−Ｏ−ジメトキシトリチル−２−Ｎ−Ｆｍｏｃ−２−アミノ−４−Ｏ−ホスホ ン酸−１，４−ブタンジオール １−Ｏ−ジメトキシトリチル−２−Ｎ−Ｆｍｏｃ−２−アミノブタン−１−オ ールを実施例１７の方法により処理すると表記化合物が得られる。 実施例２８ １−Ｏ−ジメトキシトリチル−２−Ｎ−Ｆｍｏｃ−２−アミノブタン−１−オー ル−コハク酸半エステル １−Ｏ−ジメトキシトリチル−２−Ｎ−Ｆｍｏｃ−２−アミノブタン−１−オ ールを実施例１８の方法により処理すると表記化合物が得られる。 実施例２９ １−Ｏ−ジメトキシトリチル−２−Ｎ−Ｆｍｏｃ−２−アミノ−４−ホスホン酸 −１，４−ブタンジオール−コハク酸半エステルによるＬＣＡＡ ＣＰＧの１− 誘導体化 １−Ｏ−ジメトキシトリチル−２−Ｎ−Ｆｍｏｃ−２−アミノブタン−１−オ ール−コハク酸半エステルを実施例１９の方法に従って処理すると誘導体化樹脂 が得られる。 実施例３０ １−Ｏ−ジメトキシトリチル−２−アミノ−４−ホスホン酸−１，４−ブタンジ オール誘導体化樹脂 実施例２９の誘導体化樹脂を実施例２０の方法により処理するとＦｍｏｃ保護 基が除去されて表記化合物が結合された樹脂が得られる。 実施例３１ １−Ｏ−ジメトキシトリチル−２−（２−Ｎ−アヤチルチミン）−アミノ−４− ホスホン酸−1，４−ブタンジオール誘導体化樹脂 実施例３０の誘導体化樹脂を実施例２１の方法によりＮ−１−チミン−２−酢 酸で処理すると表記化合物が結合された樹脂が得られる。 実施例３２ ２−アミノ−１，４−ブタンジオール主鎖セグメントを有する３−ｍｅｒの合成 実施例２２の方法により１−Ｏ−ジメトキシトリチル−２−（２−Ｎ−アセチ ルチミン）−アミノ−４−ホスホン酸−１，４−ブタンジオール誘導体化樹脂を １−Ｏ−ジメトキシトリチル−２−Ｎ−Ｆｍｏｃ−２−アミノ−４−ホスホン酸 −１，４−ブタンジオール、モルホリンおよびＮ−１−チミン酢酸で処理すると ホスホルアミデート置換基としてアミノ基およびモルホリン基に結合された２− Ｎ−アセチルチミンを有する３ｍｅｒが得られる。 実施例３３ ４−（Ｎ−Ｆｍｏｃ）−アミノ−グルタミン酸−γ−メチルエステル グルタミン酸−γ−メチルエステル（１５０ｍｍｏｌ）およびジイソプロピル エチルアミン（６６．３ｍｌ，４９．１ｇ，３８０ｍｍｏｌ）を１５０ｍｌＨ₂ Ｏ＋３００ｍｌジオキサンに懸濁する。フルオレニルメチル クロロホルメート （４３．２５ｇ，１．１当量）のジオキサン（１００ｍｌ）溶液を滴加した。滴 加の間、反応液の温度は１０℃を超えないようにする。混合物は一夜激しく撹拌 し、溶媒のほとんどを真空下除去する。水および飽和炭酸水素塩溶液を加え（各 々２５０ｍｌ）、溶液を２５０ｍｌのジエチルエーテルで抽出し、その液は廃棄 する。水層は濃ＨＣｌでｐＨ１の酸性とし、２回酢酸エチルで抽出して（２ｘ３ ００ｍｌ）有機抽出液は食塩水で洗浄する。溶液はＭｇＳＯ₄で乾燥し、濾過後 、真空下で溶媒を除去すると表記化合物が得られる。 実施例３４ ５−ヒドロキシ−４−Ｎ−Ｆｍｏｃ−アミノペンタン酸メチルエステル ４−（Ｎ−Ｆｍｏｃ）−アミノ−グルタミン酸−γ−メチルエステル（１４０ ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（５００ｍｌ）溶液にボラン−メチルスルファイド（２９０ ｍｍｏｌ，２１．８ｇ，２７．３ｍｌ）をＲＴで滴加する（３頚フラスコ、スタ ーラー、凝縮器、滴下ロート）。Ｈ₂の発生が止まったら、激しく撹拌しながら 溶液を加熱環流する。１時間後、白色沈殿が生成する。メタノールを注意して加 え（激しいＨ₂の発生）、得られた溶液はさらに１５分環流する。溶液をＲＴま で冷 却し、溶媒は減圧下で蒸発させ、残ったゴム状物は２ｘ３００ｍｌのメタノール と共沸する。生成物はフラッシュクロマトグラフィーにより精製する。 実施例３５ ５−Ｏ−ジメトキシトリチル−４−Ｆｍｏｃ−アミノペンタン酸メチルエステル ５−ヒドロキシ−４−Ｆｍｏｃ−アミノペンタン酸メチルエステル（３０ｍｍ ｏｌ）を乾燥ピリジン（２ｘ５０ｍｌ）と共沸し、２００ｍｌの乾燥ピリジンに 再溶解して氷浴で冷却した。塩化ジメトキシトリチル（１１．０ｇ，３２．５ｍ ｍｏｌ）を３０分以上かけて少しづつ加え、その溶液は０℃で一夜撹拌した。次 にメタノール（１０ｍｌ）を加え、減圧下溶媒を除去する。得られたゴム状物は トルエン（１００ｍｌ）に再溶解し、濾過して塩酸ピリジニウムを除去し、再び 乾固する。残渣はＣＨ₂Ｃｌ₂（３００ｍｌ）に溶解し、１５０ｍｌの０．１Ｍク エン酸溶液、１５０ｍｌの飽和ＮａＨＣＯ₃、食塩水で洗浄し、ＭｇＳＯ₄で乾燥 して蒸発させる。生成物はフラッシュクロマトグラフィーにより精製する。 実施例３６ ５−Ｏ−ジメトキシトリチル−４−Ｆｍｏｃ−アミノペンタン−１−オール ５−Ｏ−ジメトキシトリチル−４−Ｆｍｏｃ−アミノペンタン酸メチルエステ ル（１０ｍｍｏｌ）を乾燥ＴＨＦ（１００ｍｌ）に溶解し、０℃に冷却して水素 化ホウ素リチウム（１０ｍｍｏｌ）を加えた。溶液は０℃で撹拌し、その後出発 物質が完全に消失するまで室温で撹拌する。過剰の酢酸エチルを加え、溶液を０ ．１Ｍクエン酸溶液、食塩水で洗浄しＭｇＳＯ₄で乾燥する。生成物をフラッシ ュクロマトグラフィーにより精製する。 実施例３７ ５−Ｏ−ジメトキシトリチル−４−Ｆｍｏｃ−アミノペンタン−１−オール ホ スホン酸水素塩 イミダゾール（６．８１ｇ，１００ｍｍｏｌ）を４００ｍｌの乾燥ＣＨ₃ＣＮ に溶解して０℃に冷却する。三塩化リン（２．６２ｍｌ，４．１２ｇ，３０ｍｍ ｏ ｌ）、続いてトリエチルアミン（２１ｍｌ，１５．２ｇ，１５０ｍｍｏｌ）を滴 加する。濃厚なスラリーに変わり、それに５−Ｏ−ジメトキシトリチル−４−Ｆ ｍｏｃ−２−アミノ−１，５−ペンタンジオール（１０ｍｍｏｌ）のＣＨ₃ＣＮ （５０ｍｌ）溶液を１５分以上かけて加えた。加え終わったら氷浴を除き、溶液 はＲＴで３０分撹拌する。１００ｍｌのピリジン／水（９：１）を加えることに より反応を停止させる。溶媒を除去し、残渣をＣＨ₂Ｃｌ₂で抽出し（３ｘ２００ ｍｌ）、水で洗浄する。有機相はＭｇＳＯ₄で乾燥して減圧下濃縮する。生成物 は、ＣＨ₂Ｃｌ₂＋１％ピリジン中のＭｅＯＨ濃度勾配（１−１０％）を用いるフ ラッシュクロマトグラフィーによりさらに精製する。 実施例３８ ５−Ｏ−ジメトキシトリチル−４−Ｎ−Ｆｍｏｃ−２−アミノ−１，５−ペンタ ンジオール−コハク酸半エステル ５−Ｏ−ジメトキシトリチル−４−Ｎ−Ｆｍｏｃ−２−アミノ−１，５−ペン タンジオールを実施例１８の方法により処理すると表記化合物が得られる。 実施例３９ １−Ｏ−ジメトキシトリチル−２−Ｎ−Ｆｍｏｃ−２−アミノ−５−ホスホン酸 −１，５−ペンタンジオール−コハク酸半エステルによるＬＣＡＡ ＣＰＧの１ −誘導体化 １−Ｏ−ジメトキシトリチル−２−Ｎ−Ｆｍｏｃ−２−アミノ−１，５−ペン タンジオール−コハク酸半エステルを実施例１９の方法に従って処理すると誘導 体化樹脂が得られる。 実施例４０ １−Ｏ−ジメトキシトリチル−２−アミノ−４−ホスホン酸−１，５−ペンタン ジオール誘導体化樹脂 実施例２８の誘導体化樹脂を実施例２０の方法により処理するとＦｍｏｃ保護 基が除去されて表記化合物が結合された樹脂が得られる。 実施例４１ １−Ｏ−ジメトキシトリチル−２（フェニルアセチル）−アミノ−５−ホスホン 酸−１，５−ペンタンジオール誘導体化樹脂 実施例２９の誘導体化樹脂を実施例２１の方法によりフェニル酢酸で処理する と表記化合物が結合された樹脂が得られる。 実施例４２ ２−アミノ−１，５−ペンタンジオール主鎖セグメントを有する３−ｍｅｒの合 成 実施例２２の方法により１−Ｏ−ジメトキシトリチル−２（フェニルアセチル ）−アミノ−５−ホスホン酸−１，５−ペンタンジオール誘導体化樹脂を１−Ｏ −ジメトキシトリチル−２−Ｎ−Ｆｍｏｃ−２−アミノ−５−ホスホン酸−１， ５−ペンタンジオール、モルホリンおよびフェニル酢酸で処理するとホスホルア ミデート置換基としてアミノ基およびモルホリン基に結合されたフェニルアセチ ルを有する３ｍｅｒが得られる。 実施例４３Ａ ホスホルアミデートにレターを有するオリゴマー化合物のためのＨ−ホスホネー ト結合におけるレターの酸化的取り込み 方法Ａ：前もって決定されている配列でのレターの取り込み 固体支持体（例えばＬＣＡＡ ＣＰＧ）はエチレン主鎖セグメントのための実 施例４またはデシル主鎖セグメントのための実施例９の方法により第一の主鎖セ グメントで誘導体化される。次に、実施例５および１０の方法により誘導体化固 体支持体上に所望のホスポン酸モノエステルが縮合される。得られたホスホン酸 ジエステルは大過剰モルの配列の次のアミンレターと反応させる。アミンレター は四塩化炭素／ピリジン溶液として加えられる。オリゴマー構造内の二つの隣接 した同様のレターの付加には、すべてのこれらのレターを支持するための主鎖が 合成されるまで酸化工程を遅らせ、このレターを有するであろうすべてのＨホス ホネート部位が同時に酸化される。（ホスホルアミデートまたはホスホロチオア ミデート内へのレターの取り込みの効率を改良するため、結合剤、即ち１−（３ −ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）また はジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）またはトリフェニルホスフィンが 加えられる。）固体支持体は１５分間振とうし、上澄みを濾過して除く。固体支 持体はピリジンで洗浄する。四塩化炭素／ピリジン中で大過剰モルのアミンレタ ーによる２回目の処理を行い続いて振とうするとホスホルアミデートへの効率的 な酸化が確かになる。上記の工程をオリゴマーのすべてのレターが付加されるま で繰り返す。オリゴマー配列の所望の長さおよびコンフィグレーションの最後の 付加が完了後、固体支持体をピリジン／アセトニトリルで洗浄し、濃水酸化アン モニウムを用いて室温で３時間処理することにより樹脂からホスホルアミデート を切断する。上澄み液を蒸発させ、ＲＰ−１８ ＨＰＬＣカラムでホスホルアミ デートを精製すると最終オリゴマーが得られる。 方法Ｂ：ランダム配列でのレターの取り込み 所望の長さのオリゴマーを合成するために実施例５および１０に記載したオリ ゴマー合成法を繰り返す。オリゴマー上のアミンレターをランダム化するため、 上記方法１に記載したようなレター付加法に従うが、ただしランダム化のために 四塩化炭素中のアミンレターおよび適した共溶媒が混合物として添加される（好 適には相対的反応性を規格化されたもの）。アミンレターのこの混合物からのア ミンレターのランダムな分布は、アミンレターの混合物で前に処理し続いて後処 理して精製したオリゴマーをアミンレターを放出させるため１０％ギ酸水溶液中 ５０−７０℃で処理することにより実験的に実証できる。個々のアミンレターの 取り込みの実際のパーセントは反応混合物のＨＰＬＣ分析により決定され、相対 的な個々の速度が計算される。相対的速度が一度決定されたら、さらなる配列の 反復において、これらの速度の相違を反映させるため混合物内のアミンレターの 濃度が調整される。 このランダム化法の変法において、そのすべての部位がランダム化されるべき ５ｍｅｒで酸化は同時に達成される。５ｍｅｒ主鎖は上記のように合成され、レ ターの混合物が添加される。主鎖合成完了後、アミンレターの酸化はすべての５ つの部位上で単一の工程のように達成される。 このランダム化法の別の変法において、第一の主鎖断片の合成完了後、樹脂は ５つの部分に分割され、各々の部分はアミンレターの一つで個々に酸化される。 樹脂の個々の部分は再結合され、主鎖は次のユニットで伸張される。樹脂は次に 再び分割され、個々の部分は各々アミンレターの一つで酸化される。このサイク ルを合成が完了するまで繰り返す。 方法Ｃ：固定／ランダム配列でのアミンレターの取り込み 上記１および２を結合させた方法が、オリゴマー構造を合成する時にある部分 を固定し、一方他の部分をランダム化するために使用できる。この方法はさらに ＳＵＲＦ結合法と組み合わせて使用される。 実施例４３Ｂ ホスホロチオアミデートにレターを有するオリゴマー化合物のためのＨ−ホスホ ノチオエート結合におけるレターの酸化的取り込み レターをホスホロチオアミデートに有する化合物のためのＨ−ホスホノチオエ ート結合でのレターの酸化的取り込みは以下のことを除き実施例４３の方法を使 用して達成される。主鎖セグメントは固体支持体に結合される。主鎖セグメント 上の保護ヒドロキシル基が脱保護され、１９９３年６月８日に発行された米国特 許第５，２１８，１０３号に含まれている方法に従ってトリエチルアミンまたは 他の適当な塩基の存在下ビス（ジイソプロピルアミノ）クロロホスフィンで処理 される。得られた中間体は保護された主鎖セグメントと反応させ、続いて硫化水 素で処理してＨホスホノチオエートジエステルを形成させる。上記実施例２２に よりアミンレターで酸化的に処理するとホスホロチオアミデートが得られる。上 記実施例４３の方法を改良すると、ホスホロチオアミデート結合を有する前もっ て決められた、ランダムな、または混合されたオリゴマー化合物の製造が可能で あろう。 実施例４４Ａ レターを有するオリゴマー化合物のためのＨ−ホスホネート結合におけるレター の酸化的取り込み 方法Ａ：前もって決定されている配列でのレターの取り込み 固体支持体（例えばＬＣＡＡ ＣＰＧ）は１−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ− Ｆｍｏｃ−２−アミノ１，３−プロパンジオール主鎖のための実施例１９の方法 により第一の主鎖セグメントが誘導体化される。２−アミノ基が脱保護され、実 施例２０および２１に方法により随意のテザーを有するレターで官能化される。 次に、実施例２２の方法により誘導体化固体支持体上に所望のホスホン酸モノエ ステルが縮合される。得られたホスホン酸ジエステルは大過剰モルの配列の次の アミンレターと反応させる。アミンレターは四塩化炭素／ピリジン溶液として加 えられる。（ホスホルアミデート内へのレターの取り込みの効率を改良するため 、結合剤、即ち１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミ ド塩酸塩（ＥＤＣ）またはジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）またはト リフェニルホスフィンが加えられる。）固体支持体は１５分間振とうし、上澄み を濾過して除く。固体支持体はピリジンで洗浄する。四塩化炭素／ピリジン中で 大過剰モルのアミンレターによる２回目の処理を行い続いて振とうするとホスホ ルアミデートへの効率的な酸化が確かになる。固体支持体はピリジン続いてアセ トニトリルで洗浄する。主鎖セグメントの２−アミノ基が脱保護され、実施例２ ０および２１に方法により随意のテザーを有するレターで官能化される。上記の 工程をオリゴマーのすべてのレターが主鎖セグメントおよびホスホルアミデート 部位に付加されるまで繰り返される。この合成方法においては、すべてのレター は前もって形成されている。オリゴマー配列の所望の長さおよびコンフィグレー ションの最後の付加が完了後、固体支持体をピリジン／アセトニトリルで洗浄し 、濃水酸化アンモニウムを用いて室温で３時間処理することにより樹脂からホス ホルアミデートを切断する。上澄み液を蒸発させ、ＲＰ−１８ ＨＰＬＣカラム でホスホルアミデートを精製すると最終オリゴマーが得られる。 方法Ｂ：ランダム配列でのレターの取り込み 固体支持体（例えばＬＣＡＡ ＣＰＧ）は１−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ− Ｆｍｏｃ−２−アミノ１，３−プロパンジオール主鎖のための実施例１９の方法 により第一の主鎖セグメントが誘導体化され、Ｆｍｏｃ保護基は適当な試薬で除 去される。樹脂を５つの部分に分け、各々の部分を別々に実施例２０および２１ の方法により随意のテザーを有する特定のレターで２−アミノ基で官能化する。 樹脂を合併し、実施例２２の方法により誘導体化固体支持体上に所望のホスホン 酸モノエステルを縮合する。樹脂を５つの部分に分け、各々の部分を別々にアミ ンレターの１つで酸化する。個々の樹脂を再び合併して上記のようにＦｍｏｃ基 を除去し、樹脂は再び５つの部分に分割して各々の部分は方法１の方法により随 意のテザーを有する５つのレターの１つで別々に処理する。このサイクルを合成 が完了するまで繰り返す。 方法Ｃ：固定／ランダム配列でのアミンレターの取り込み 上記１および２を結合させた方法が、オリゴマー構造を合成する時にある部分 を固定し、一方他の部分をランダム化するために使用できる。この方法はさらに ＳＵＲＦ結合法と組み合わせて使用される。 実施例４４Ｂ レターをホスホノチオエートおよび主鎖セグメントに有するオリゴマー化合物の ためのＨ−ホスホノチオエート結合でのレターの酸化的取り込み レターをホスホロチオアミデート結合および主鎖セグメントに有するオリゴマ ー化合物のためのＨ−ホスホノチオエート結合でのレターの酸化的取り込みは下 記のことを除いて実施例４４Ａの方法を用いて達成される。主鎖セグメントは固 体支持体上に結合される。保護活性部位を脱保護し、実施例２０および２１の方 法に従って随意のテザーを有するレターで官能化する。もしこの部分がランダム 化されるべきであるならば実施例４４Ａ方法Ｂのビーズ分割が実施される。主鎖 セグメント上の保護ヒドロキシル基が脱保護され、１９９３年６月８日に発行さ れた米国特許第５，２１８，１０３号に含まれている方法に従ってトリエチルア ミンまたは他の適当な塩基の存在下ビス（ジイソプロピルアミノ）クロロホスフ ィンで処理される。得られた中間体は保護された主鎖セグメントと反応させ、続 いて硫化水素で処理してＨホスホノチオエートジエステルを形成させる。上記実 施例４４Ａ（方法Ａ、ＢまたはＣ）によりアミンレターで酸化的に処理するとホ スホロチオアミデートが得られる。上記実施例４４Ａの方法を改良すると、ホス ホロチオアミデート結合を有する前もって決められた、ランダムな、または混合 されたオリゴマー化合物の製造が可能であろう。 実施例４５ ベンジルアミンホスホルアミデートオリゴマー合成 固体支持体を実施例４のように２−Ｏ−（ジメトキシトリチル）エチルスクシ ネート半エステルで誘導体化する。実施例５にように誘導体化樹脂上に２−Ｏ− （ジメトキシトリチル）エチルーホスホン酸を縮合する。６つの上記ホスホン酸 残基が取り込まれるまで実施例５の方法を繰り返す。得られた６ｍｅｒは実施例 ２２、方法１を用いて大過剰モルのベンジルアミンと四塩化炭素／ピリジン中で 処理する。固体支持体は１５分間振とうして上澄みを濾過し、ピリジンで洗浄す る。四塩化炭素／ピリジン中で大過剰モルのベンジルアミンによる２回目の処理 を行い続いて振とうするとホスホルアミデートへの効率的な酸化が確かになる。 樹脂はピリジン／アセトニトリルで洗浄し、濃水酸化アンモニウムを用いて室温 で３時間処理することにより樹脂からホスホルアミデートを切断する。上澄み液 を蒸発させ、ＲＰ−１８ ＨＰＬＣカラムでホスホルアミデートを精製すると最 終オリゴマーが得られる。段階的Ｈホスホネート結合効率は実施例９に記載した ようにトリチルイオンの吸光度を測定することにより決定する。 実施例４６ ランダムレターホスホルアミデートオリゴマー合成 樹脂を実施例４のように２−Ｏ−（ジメトキシトリチル）エチルスクシネート 半エステルで誘導体化し、実施例５にように誘導体化樹脂上に２−Ｏ−（ジメト キシトリチル）エチル−ホスホン酸を縮合する。６つの上記ホスホン酸残基が取 り込まれるまで実施例５の方法を繰り返す。得られた６ｍｅｒは実施例４３Ａ、 方法Ｂを用いて四塩化炭素／ピリジン中、大過剰モルのベンジルアミン、２−（ ２−アミノエチル）−１−メチルピロリジンおよびピペロニルアミンの等モル混 合物で処理する。樹脂は１５分間振とうして上澄みを濾過し、ピリジンで洗浄す る。四塩化炭素／ピリジン中で大過剰モルのベンジルアミンによる２回目の処理 を行い続いて振とうするとホスホルアミデートへの効率的な酸化が確かになる。 樹脂はピリジン／アセトニトリルで洗浄し、濃水酸化アンモニウムを用いて室温 で３時間処理することにより樹脂からホスホルアミデートを切断する。上澄み液 を蒸発させ、ＲＰ−１８ ＨＰＬＣカラムでホスホルアミデートを精製すると最 終オリゴマーが得られる。段階的Ｈホスホネート結合効率は上記のようにトリチ ルイオンの吸光度を測定することにより決定されるであろう。 実施例４７ ランダムレター／固定レターホスホルアミデートオリゴマー合成 樹脂を実施例４のように２−Ｏ−（ジメトキシトリチル）エチルスクシネート 半エステルで誘導体化し、実施例５にように誘導体化樹脂上に２−Ｏ−（ジメト キシトリチル）エチル−ホスホン酸を縮合する。３つの上記ホスホン酸残基が取 り込まれるまで実施例５の方法を繰り返す。得られたトライマーは実施例４３Ａ 、方法Ｂに例示したように四塩化炭素／ピリジン中、大過剰モルのベンジルアミ ン、２−（２−アミノエチル）−１−メチルピロリジンおよびピペロニルアミン の混合物で処理する。樹脂をトリクロロ酢酸で脱トリチル化する。樹脂を実施例 ５のように２−Ｏ−（ジメトキシトリチル）エチル−ホスホン酸で処理し、実施 例４３Ｂ、方法Ａによりベンジルアミンでさらに処理してオリゴマーの位置４を 固定する。樹脂はピリジン／アセトニトリルで洗浄し、濃水酸化アンモニウムを 用いて室温で３時間処理することにより樹脂からホスホルアミデートを切断する 。上澄み液を蒸発させ、ＲＰ−１８ ＨＰＬＣカラムでホスホルアミデートを精 製すると最終ランダム／固定オリゴマーが得られる。結合効率は実施例９のよう にトリチルイオンの吸光度を測定することにより決定される。 実施例４８ 固定または固定／ランダムレターを有し、さらに非対称テザー長を含むホスホル アミデートオリゴマー化合物の合成 実施例１の方法によりエチレングリコールを塩化ジメトキシトリチルで保護し 、実施例３の方法によりさらに無水コハク酸と反応させる。得られた２−Ｏ−（ ジメトキシトリチル）エチルスクシネート半エステルを活性化し、実施例４の方 法によりＬＣＡＡ ＣＰＧ上に誘導体化する。１，３−プロパンジオールを実施 例１の方法により塩化ジメトキシトリチルで保護し、実施例２の方法によりＰＣ ｌ₃と反応させると３−Ｏ−（ジメトキシトリチル）プロピル−ホスホン酸が得 られる。３−Ｏ−（ジメトキシトリチル）プロピル−ホスホン酸を２−Ｏ−（ジ メトキシトリチル）エチルスクシネート誘導体化ＬＣＡＡ ＣＰＧと実施例５の 方法により反応させると３−Ｏ−（ジメトキシトリチル）プロポキシ−［２−Ｏ −スクシニル−ＬＣＡＡ−ＣＰＧ）−エトキシ］−Ｈホスホネートが得られる。 ３−Ｏ−（ジメトキシトリチル）プロポキシ−［２−Ｏ−スクシニル−ＬＣＡ Ａ−ＣＰＧ）−エトキシ］−Ｈホスホネートは次に実施例４３Ａの方法により（ ただし、化合物は樹脂に結合されたままになっている）Ｎ−ブチルアミンで処理 すると３−Ｏ−（ジメトキシトリチル）プロポキシ−［２−Ｏ−スクシニル−Ｌ ＣＡＡ−ＣＰＧ）−エトキシ］−Ｎ−ブチル−ホスホルアミデートが得られる。 １，４−ブタンジオールを実施例１の方法により塩化ジメトキシトリチルで保護 し、実施例２の方法によりＰＣｌ₃と反応させると４−Ｏ−（ジメトキシトリチ ル）ブチル−ホスホン酸が得られる。３−Ｏ−（ジメトキシトリチル）プロポキ シ−［２−Ｏ−スクシニル−ＬＣＡＡ−ＣＰＧ）−エトキシ］−Ｎ−ブチル−ホ スホルアミデートを脱トリチル化し、実施例５の方法により４−Ｏ−（ジメトキ シトリチル）ブチル−ホスホン酸と反応させ、さらに実施例４３Ａの方法により Ｎ−プロピルアミンで処理する。得られたダイマーは実施例４３Ａの方法を用い て固体支持体から切断し、ＨＰＬＣにより精製する。得られたオリゴマーダイマ ーは２つのホスホルアミデート窒素が左から右へＮ−ブタンおよびＮ−プロパン で置換されている。ホスホルアミデートユニットはプロパン主鎖セグメントによ り分離されており、エチル主鎖セグメントが左におよびブチル主鎖セグメントが 右に隣接している。上記Ｎ−プロピルアミンをＮ−ブチルアミンおよびＮ−プロ ピル アミンの混合物に変えると、１つの位置がＮ−ブタンで置換されおよび第２の位 置がＮ−ブタンおよびＮ−プロパンの両方でランダムに置換されている２ｍｅｒ が得られる。 実施例４９ ビス（ジイソプロピルアミノ）ホスフィン−２−Ｏ−エチルスクシニル−ＬＣＡ Ａ−ＣＰＧ 実施例４からの２−Ｏ−（ジメトキシトリチル）エチルスクシネート 半エス テル誘導体化固体支持体を標準法（例えば３％トリクロロ酢酸）を用いて脱トリ チル化し、さらに１９９３年６月８日付の米国特許第５，２１８，１０３号の実 施例IIIによりビス（ジイソプロピルアミノ）クロロホスフィンで処理すると固 体支持体結合ジアミダイトが生成する。 実施例５０ ２−Ｏ−ジメトキシトリチルエトキシ−ビス（ジイソプロピルアミノ）ホスフィ ン−２−Ｏ−エチルスクシニル−ＬＣＡＡ−ＣＰＧ 実施例２４からのビス（ジイソプロピルアミノ）ホスフィン−２−Ｏ−エチル スクシニル−ＬＣＡＡ−ＣＰＧは次に米国特許第５，２１８，１０３号の実施例 IIIにより実施例１からの２−Ｏ−（ジメトキシトリチル）エタノールで処理す ると表記化合物が得られる。 実施例５１ ２−Ｏ−ジメトキシトリチルエトキシ−水素ホスホノチオエート−２−Ｏ−エチ ルスクシニル−ＬＣＡＡ−ＣＰＧ 実施例２５からの２−Ｏ−ジメトキシトリチルエトキシ−ビス（ジイソプロピ ルアミノ）ホスフィン−２−Ｏ−エチルスクシニル−ＬＣＡＡ−ＣＰＧを米国特 許第５，２１８，１０３号の実施例IIIにより硫化水素およびテトラゾールで処 理すると表記化合物が得られる。 実施例５２ ２−Ｏ−ジメトキシトリチルエトキシ−Ｎ−ブチルホスホロチオアミデート−２ −Ｏ−エチルスクシニル−ＬＣＡＡ−ＣＰＧ 実施例２６からの２−Ｏ−ジメトキシトリチルエトキシ−水素ホスホノチオエ ート−２−Ｏ−エチルスクシニル−ＬＣＡＡ−ＣＰＧを米国特許第５，２１８， １０３号の実施例VIを利用し選択されたアミンレター（例えばＮ−ブチルアミン ）存在下でＩ₂で酸化すると表記化合物が得られる。 実施例５３ 水素ホスホノチオエートへのレターの酸化的取り込み（レターのランダム配列） 一般法 実施例１の方法によりエチレングリコールを塩化ジメトキシトリチルで保護し 、実施例３の方法によりさらに無水コハク酸と反応させる。得られた２−Ｏ−（ ジメトキシトリチル）エチルスクシネート半エステルを活性化し、実施例４の方 法によりＬＣＡＡ ＣＰＧ上に誘導体化する。実施例１６の方法によりビス（ジ イソプロピルアミノ）クロロホスフィンで処理すると固体支持体結合エトキシ− ビス（ジイソプロピルアミノ）ホスフィンが得られる。固体支持体結合エトキシ −ビス（ジイソプロピルアミノ）ホスフィンを実施例１の方法により製造された ３−Ｏ−（ジメトキシトリチル）プロパノールと反応させると３−Ｏ−（ジメト キシトリチル）プロポキシ−［（２−Ｏ−スクシニル−ＬＣＡＡ−ＣＰＧ）−エ トキシ］−ジイソプロピルアミノホスホルアミダイトが得られる。３−Ｏ−（ジ メトキシトリチル）プロポキシ−［（２−Ｏ−スクシニル−ＬＣＡＡ−ＣＰＧ） −エトキシ］−ジイソプロピルアミノホスホルアミダイトを実施例４３Ｂの方法 により硫化水素で処理すると３−Ｏ−（ジメトキシトリチル）プロポキシ−［（ ２−Ｏ−スクシニル−ＬＣＡＡ−ＣＰＧ）−エトキシ］−ジイソプロピルアミノ Ｈ ホスホノチオエートが得られる。 ３−Ｏ−（ジメトキシトリチル）プロポキシ−［２−Ｏ−スクシニル−ＬＣＡ Ａ−ＣＰＧ）−エトキシ］ジイソプロピルアミノ Ｈ ホスホノチオエートは実 施例４３Ａの方法によりＮ−ブチルアミンおよびＮ−プロピルアミンの等モル混 合物で処理すると３−Ｏ−（ジメトキシトリチル）プロポキシ／ブトキシ−［２ −Ｏ−スクシニル−ＬＣＡＡ−ＣＰＧ）−エトキシ］−Ｎ−（Ｎ−ブチル）−ホ スホロチオアミデートが得られる。１，４−ブタンジオールを実施例１の方法に より塩化ジメトキシトリチルで保護し、さらに実施例４３Ｂの方法によりビス（ ジイソプロピルアミノ）クロロホスフィンと反応させると４−Ｏ−（ジメトキシ トリチル）ブトキシ−ビス（ジイソプロピルアミノ）−ホスフィンが得られる。 ３−Ｏ−（ジメトキシトリチル）プロポキシ−［２−Ｏ−スクシニル−ＬＣＡＡ −ＣＰＧ）−エトキシ］−Ｎ−（Ｎ−ブチル）−ホスホロチオアミデートは実施 例５の方法により脱トリチル化し、さらに４−Ｏ−（ジメトキシトリチル）ブト キシ−ビス（ジイソプロピルアミノ）−ホスフィンと反応させる。実施例４３Ｂ の方法に従って硫化水素で処理すると一置換ダイマーが得られる。一置換ダイマ ーを実施例４３Ａの方法によりＮ−ブチルアミンおよびＮ−プロピルアミンの等 モル混合物で処理すると二置換／ランダム化２ｍｅｒが得られる。これは実施例 ２０の方法に従って処理すると固体支持体からオリゴマー化合物が切断される。 それはさらにＨＰＬＣにより精製される。得られたオリゴマーダイマーは二つの ホスホロチオアミデート窒素が等モルランダム分布のＮ−ブタンおよびＮ−プロ パンにより置換されている。 実施例５４ 固定または固定／ランダムレターを有しおよび対称的テザー長を含むホスホロチ オアミデートオリゴマー化合物 実施例１の方法によりエチレングリコールを塩化ジメトキシトリチルで保護し 、実施例３の方法によりさらに無水コハク酸と反応させる。得られた２−Ｏ−（ ジメトキシトリチル）エチルスクシネート半エステルを活性化し、実施例４の方 法によりＬＣＡＡ ＣＰＧ上に誘導体化する。実施例４３Ｂの方法によりビス（ ジイソプロピルアミノ）クロロホスフィンで処理すると固体支持体結合エトキシ −ビス（ジイソプロピルアミノ）ホスフィンが得られる。固体支持体結合エトキ シ−ビス（ジイソプロピルアミノ）ホスフィンを実施例１の方法により製造した ３−Ｏ−（ジメトキシトリチル）プロパノールと反応させると３−Ｏ−（ジメト キ シトリチル）プロポキシ−［（２−Ｏ−セコナール−ＬＣＡＡ−ＣＰＧ）−エト キシ］−ジイソプロピルアミノホスホルアミダイトが得られる。３−Ｏ−（ジメ トキシトリチル）プロポキシ−［（２−Ｏ−スクシニル−ＬＣＡＡ−ＣＰＧ）− エトキシ］−ジイソプロピルアミノホスホルアミダイトを実施例４３Ｂの方法に より硫化水素で処理すると３−Ｏ−（ジメトキシトリチル）プロポキシ−［（２ −Ｏ−ヤコナール−ＬＣＡＡ−ＣＰＧ）−エトキシ］−ジイソプロピルアミノ Ｈ ホスホノチオエートが得られる。 ３−Ｏ−（ジメトキシトリチル）プロポキシ−［２−Ｏ−スクシニル−ＬＣＡ Ａ−ＣＰＧ）−エトキシ］ジイソプロビルアミノ Ｈ ホスホノチオエートは実 施例４３Ａの方法によりＮ−ブチルアミンで処理すると３−Ｏ−（ジメトキシト リチル）プロポキシ−［２−Ｏ−セコナール−ＬＣＡＡ−ＣＰＧ）−エトキシ］ −Ｎ−（Ｎ−ブチル）−ホスホロチオアミデートが得られる。１，４−ブタンジ オールを実施例１の方法により塩化ジメトキシトリチルで保護し、さらに実施例 ４３Ｂの方法によりビス（ジイソプロピルアミノ）クロロホスフィンと反応させ ると４−Ｏ−（ジメトキシトリチル）ブトキシ−ビス（ジイソプロピルアミノ） −ホスフィンが得られる。３−Ｏ−（ジメトキシトリチル）プロポキシ−［２− Ｏ−スクシニル−ＬＣＡＡ−ＣＰＧ）−エトキシ］−Ｎ−（Ｎ−ブチル）−ホス ホロチオアミデートは実施例５の方法により脱トリチル化し、さらに４−Ｏ−（ ジメトキシトリチル）ブトキシ−ビス（ジイソプロピルアミノ）−ホスフィンと 反応させる。実施例４３Ｂの方法に従って硫化水素で処理すると一置換２ｍｅｒ が得られる。 一置換２ｍｅｒを実施例４３Ａの方法によりＮ−ブチルアミンで処理すると二 置換２ｍｅｒが得られる。実施例４３Ａの方法を利用し固体支持体からオリゴマ ー化合物が切断され、ＨＰＬＣにより精製される。得られたオリゴマー２ｍｅｒ は二つのホスホロチオアミデート窒素が左から右へＮ−ブタンおよびＮ−プロパ ンにより置換されている。ホスホルアミデートユニットはプロパン主鎖セグメン トにより離されており、左はエチル主鎖セグメントおよび右はブチル主鎖セグメ ントが隣接している。上記Ｎ−プロピルアミンをＮ−ブチルアミンおよびＮ−プ ロピルアミンの混合物で置換すると位置１がＮ−ブタンで置換されおよび位置２ がＮ−ブタンおよびＮ−プロパンの両方でランダムに置換されている２ｍｅｒが 得られる。 実施例５５ キメラオリゴマー構造 １５ｍｅｒホスホロチオエート−ホスホルアミデート−ホスホロチオエートキ メラ化合物が自動化ＤＮＡ合成機（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ モ デル３８０Ｂ）により、市販品として入手可能なオリゴヌクレオチド試薬および 本発明の化合物から標準ホスホルアミダイトおよびホスホロチオエート化学（Ｏ ｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ．，ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅ ｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９０）を利用して合成される 。キメラ化合物は標準の３’から５’方向で合成された（３’が固体支持体に結 合されている）。オリゴマーのホスホロチオエート部分を発生させるためのホス ファイト結合の段階的チオ化は３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン １ ，１−ジオキシドの０．２Ｍアセトニトリル溶液を用いて達成される。５ｍｅｒ オリゴヌクレオチドホスホロチオエートは標準固相化学を用いて合成され、固体 支持体に結合されたオリゴヌクレオチド配列ＴＴＴＴＴが得られる。５ｍｅｒは さらに実施例５の方法により２−Ｏ−ジメトキシトリチル−エチル−ホスホン酸 （実施例２）と反応させる。６番目にある得られたＨホスホネートを実施例４３ の方法によりベンジルアミンで酸化する。７位から１０位は２−Ｏ−ジメトキシ トリチル−エチル−ホスホン酸とのカップリング、続いてのベンジルアミン存在 下での酸化による段階的様式で同様に置換される。末端ホスホルアミデートへ結 合された末端主鎖セグメントのジメトキシトリチル基は実施例５のような標準法 を用いて除去し、残りの５ヌクレオチドは上記標準法を用いて取り込まれた。固 体支持体から１５ｍｅｒを切断し、１５位のＤＭＴ基を脱保護すると１５ｍｅｒ が得られる。 実施例５６ ＰＬＡ₂アッセイ オリゴマーライブラリーは基質として³Ｈ−オレイン酸標識大腸菌（Ｆｒａｎ ｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．１９７４，１５，３８０；お よびＤａｖｉｄｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９８７，２ ６２，１６９８参照）を用いるアッセイでＰＬＡ₂の阻害でスクリーニングされ る。バキュロウイルス系で発現され、部分的に精製されたタイプIIＰＬＡ₂（最 初は滑液から単離された）が酵素源である。各々のオリゴマープールが水に連続 的に希釈される：各々のオリゴマーの１０μｌが１０μｌのＰＬＡ₂、２０μｌ の５ｘＰＬＡ₂緩衝液（５００ｍＭトリス、７．０−７．５、５ｍＭ ＣａＣｌ₂ ）および５０μｌの水と混合され室温で５分間インキュベートされた。各々のオ リゴマー試料は二重に試験される。この時点で１０μｌの³Ｈ大腸菌細胞が添加 される。この混合物は３７℃で１５分間インキュベートされた。 酵素反応は５０μｌの２Ｍ ＨＣｌおよび５０μｌの脂肪酸を含まないＢＳＡ （２０ｍｇ／ｍｌ ＰＢＳ）を添加して停止させ、５秒間ボルテックスを行い５ 分間高速で遠心分離する。各々の上澄みの１６５μｌを６ｍｌのシンチラント（ ＳｃｉｎｔｉＶｅｒｓｅ）を含むシンチレーションバイアル内へ入れ、Ｂｅｃｋ ｍａｎ 液体シンチレーションカウンターでｃｐｍを測定する。対照としてオリ ゴマーなしの反応が、他の反応ならびにオリゴならびにＰＬＡ₂を含まないベー スライン反応と並んで行われる。 実施例５７ アッセイの確認 実施例５６のＰＬＡ₂試験系がグアノシンヌクレオチドの一つまたはそれ以上 の列を有するホスホロチオエートオリゴヌクレオチド（少なくとも列当たり３） を用いて確認された。これらのオリゴヌクレオチドのライブラリーはＳＵＲＦス クリーニング法を用いてデコンボリュートされ、およびＰＬＡ₂酵素に阻害効果 を有することが示された。いくらかの配列特異性でホスホロチオエートオリゴヌ クレオチドがＰＬＡ₂を阻害することが解ったので、四つの天然の塩基を含む８ ヌクレオチドホスホロチオエートのライブラリーを用いて、ＳＵＲＦスクリーン として の適性についてアッセイ系が試験された。このライブラリーは他の系で使用する ために合成されており、すべてのサブセットはもはや利用可能ではない（下記、 表IIIにおいてダッシュで示されている）。ＳＵＲＦ法を用い、ホスホロチオエ ートオリゴヌクレオチドによるＰＬＡ₂活性の阻害にグアノシンの列が必要であ ることが確認された（下記、表III）。 アッセイはオリゴマーのサブセット間を区別するのに十分感度がよくおよび正 確であり阻害配列が選択できた。選択の最初の三つのラウンドの各々において、 最も活性なサブセットは容易に決定された。５ラウンド以降、少なくとも列に５ つのＧを有するサブセットの活性はほとんど差がなく、末端の位置は阻害活性に は決定的ではないことを示唆している。より多くの位置が固定されるにつれ”勝 者”のＩＣ₅₀は良くなる（酵素活性が減少する）。アッセイの再現性の試験とし て単一配列（ＴＴＧＧＧＧＴＴ）の８ヌクレオチドホスホロチオエートオリゴヌ クレオチドが試験の各々のラウンドでアッセイされた。このオリゴヌクレオチド はアッセイの正確さの内部対照として働いた；各々のアッセイにおいてＩＣ₅₀は ８μＭであった。 実施例５８ ＰＬＡ₂に対するホスホルアミデートおよびホスホロチオアミデートオリゴマー 化合物のライブラリーのアッセイ ホスホルアミデートオリゴマー化合物を含む第一のライブラリー、およびホス ホロチオアミデートを含む第二のライブラリーがタイプIIＰＬＡ₂の阻害剤同定 のためのＰＬＡ₂アッセイで試験された。オリゴマーが基質よりは酵素に結合し ていることおよび選択されたオリゴマーの阻害がタイプIIＰＬＡ₂に特異的であ ることを確認するために”勝者”の確認が行われた。基質として¹⁴Ｃ−ホスファ チジルエタノールアミン（¹⁴Ｃ−ＰＥ）（大腸菌膜ではなく）を用いるアッセイ は、基質ではなく酵素特異的であることを保証するために使用される。¹⁴Ｃ−Ｐ Ｅおよびデオキシコレートのミセルが酵素およびオリゴマーとインキュベートさ れる。 ＰＬＡ₂−触媒加水分解の結果として放出される¹⁴Ｃ−標識アラキドン酸は薄 層クロマトグラフィーにより基質から分離され、放射活性生成物が定量される。 ”勝者”はその活性を確認するためにホスファチジルエタノールアミン（ヒトタ イプIIＰＬＡ₂の好適な基質）と比較される。他起源のＰＬＡ₂（蛇毒、膵臓、蜂 毒）およびホスホリパーゼＣ、ホスホリパーゼＤおよびリゾホスホリパーゼは阻 害がヒトタイプIIＰＬＡ₂に対して特異的であることをさらに確認するために使 用でき る。 実施例５９ 生物試料中の特異的ｍＲＮＡの検出のためのハイブリダイゼーションプローブ 他の細胞成分からｍＲＮＡを精製する必要なしに生物試料中の多くの種類のｍ ＲＮＡを確かに、迅速に、同時に定量するために、適した生物試料（すなわち、 血液運搬ウイルス、大便中の細菌病原体生成物、尿などの生物試料）から問題と するｍＲＮＡが標準微生物学的技術を用いて同定される。このｍＲＮＡの核酸配 列に相補的な”核塩基”官能基（アデニン、グアニン、チミンおよびシトシン） を有する本発明のオリゴマー化合物が上記実施例に従って製造される。オリゴマ ー化合物は、Ｐｏｎ，Ｒ．Ｔ．，Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｆｏｒ Ｏｌｉｇｏｎｕ ｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｓ ，Ａｇｒａｌ，Ｓ．，Ｅｄ．，Ｈ ｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，１９９３，ｐ４６５−４９６の 方法を利用して不溶性ＣＰＧ固体支持体上に固定化される。 検査中の生物試料の既知の一部を、ｍＲＮＡをオリゴマーへ一度にハイブリダ イズするのに十分なオリゴマーを有する不溶性ＣＰＧ支持体とインキュベートし 、それによりｍＲＮＡをオリゴマーを通して固体支持体へ結合させる。これによ り、試料中に存在するｍＲＮＡをＣＰＧ支持体へ固定化する。他の非固定化物質 および成分は次に生物試料での使用に適した洗浄媒質でＣＰＧから洗い流される 。生物試料中に存在するｍＲＮＡの量を示すため、支持体上のｍＲＮＡはエチジ ウムブロミド、ビオチンまたは市販の放射性ヌクレオチドで標識され、ＣＰＧ支 持体上の固定化された標識の量が測定される。 当業者は本発明の好適な態様に対してなされるであろう多くの変更および変形 を理解するであろうし、そのような変更および変形は本発明の精神から離れるこ となく行えるであろう。従って、付随する請求の範囲は本発明の真の精神および 範囲内にあるすべてのそのような均等な変更を含む。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 31/70 ＡＥＤ 9051−4Ｃ Ａ６１Ｋ 31/70 ＡＥＤ Ｃ１２Ｎ 9/99 9152−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 9/99 Ｃ１２Ｑ 1/68 7823−4Ｂ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｚ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)， ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｈ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ， ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，Ｎ Ｌ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 ハーバート，ノーマンド アメリカ合衆国カリフォルニア州92007, カーディフ，モンゴメリー・アベニュー 1861

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 下記の構造の化合物： ［式中 各々のＸは独立してＯまたはＳであり； 各々のＹは［Ｑ₂］_j−Ｚ₂であり； 各々のＴは独立して［Ｑ₁］_k−Ｚ₁であるか、またはＹおよびＴが一緒に窒素 へテロ環に組み込まれ； Ｑ₁、Ｑ₂および各々のＬは独立してＣ₂−Ｃ₁₀アルキル、Ｃ₂−Ｃ₁₀アルケニル 、Ｃ₂−Ｃ₁₀アルキニル、Ｃ₄−Ｃ₇炭素環−アルキルまたは−アルケニル、ヘテ ロ環、２から１０の炭素原子を有しおよび１から４の酸素または硫黄原子を有す るエーテル、ポリアルキレングリコール、またはＣ₇−Ｃ₁₄アラルキルであり、 Ｌがヘテロ環である場合は少なくとも一つのＬは置換ピロリジンまたは天然の核 塩基ではなく、およびＬがアルキルの場合は少なくとも一つのＬは置換グリコー ルではない； Ｅ₁およびＥ₂は独立してＨ、ヒドロキシル保護基、活性化固体支持体、コンジ ュゲート基、レポーター基、ポリエチレングリコール、アルキル、オリゴヌクレ オチド、ペプチド核酸、ホスフェート、ホスファイト、活性化ホスフェートまた は活性化ホスファイトであり； ｊおよびｋは独立して０または１であり； ｍは２から約５０であり； Ｚ₁およびＺ₂は独立して、Ｈ、Ｃ₁−Ｃ₂アルキル、Ｃ₂−Ｃ₂₀アルケニル、Ｃ₂ −Ｃ₂₀アルキニル、Ｃ₆−Ｃ₁₄アリール、Ｃ₇−Ｃ₁₅アラルキル、ハロゲン、ＣＨ ＝Ｏ、ＯＲ₁、ＳＲ₂、ＮＲ₃Ｒ₄、Ｃ（＝ＮＨ）ＮＲ₃Ｒ₄、ＣＨ（ＮＲ₃Ｒ₄）、Ｎ ＨＣ（＝ＮＨ）ＮＲ₃Ｒ₄、ＣＨ（ＮＨ₂）Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ₃Ｒ₄ 、Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ₅、金属配位基、レポーター基、窒素含有ヘテロ環、プリン、 ピリミジン、ホスフェート基、ポリエーテル基、またはポリエチレングリコール 基であり； ＡはＬ₁、Ｌ₁−Ｇ₁、Ｌ₂、Ｌ₂−Ｇ₂、ＮＲ₃Ｒ₄、Ｈ、窒素含有ヘテロ環、プリ ン、ピリミジン、ホスフェート基、ポリエーテル基、またはポリエチレングリコ ール基であり； ＪはＬ₁、Ｇ₃、Ｌ₁−Ｇ₃、またはＧ₃−Ｌ₁−Ｇ₃であり； Ｌ₁は１から約２０の炭素原子を有するアルキル、２から約２０の炭素原子を 有するアルケニル、または２から約２０の炭素原子を有するアルキニルであり； Ｌ₂は６から約１４の炭素原子を有するアリールまたは７から１５の炭素原子 を有するアラルキルであり； Ｇ₁はハロゲン、ＯＲ₁、ＳＲ₂、ＮＲ₃Ｒ₄、Ｃ（＝ＮＨ）ＮＲ₃Ｒ₄、ＮＨＣ（ ＝ＮＨ）ＮＲ₃Ｒ₄、ＣＨ＝Ｏ、Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ₅、ＣＨ（ＮＲ₃Ｒ₄）（Ｃ（＝Ｏ ）ＯＲ₅）、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ₃Ｒ₄、金属配位基、またはホスフェート基であり； Ｇ₂はハロゲン、ＯＨ、ＳＨ、ＳＣＨ₃、またはＮＲ₃Ｒ₄であり； Ｇ₃はＣ（＝Ｏ）、Ｃ（＝Ｓ）、Ｃ（Ｏ）−Ｏ、Ｃ（Ｏ）−ＮＨ、Ｃ（Ｓ）− Ｏ、Ｃ（Ｓ）−ＮＨまたはＳ（Ｏ）₂であり； 各々のｄ１は独立して０または１であり； 各々のｄ２は独立して０から６であり； 各々のｄ３は独立して１から６であり； Ｒ₁はＨ、１から約６の炭素原子を有するアルキル、またはヒドロキシル保護 基であり； Ｒ₂はＨ、１から約６の炭素原子を有するアルキル、またはチオール保護基で あ り； Ｒ₃およびＲ₄は独立してＨ、１から約６の炭素原子を有するアルキル、または アミン保護基であり；および Ｒ₅はＨ、１から約６の炭素原子を有するアルキル、または酸保護基である］ 。 ２． Ｌが約２から約１０の炭素を有するアルキルである請求項１に記載の化 合物。 ３． ＹおよびＴが一緒に窒素ヘテロ環に組み込まれている請求項１に記載の 化合物。 ４． 前記ヘテロ環がピペリジンまたはビロリジンである請求項３に記載の化 合物。 ５． Ｅ₁がＨ、ヒドロキシル保護基、または活性化固体支持体である請求項 １に記載の化合物。 ６． Ｅ₂がトリチル、メトキシトリチル、ジメトキシトリチルまたはトリメ トキシトリチルである請求項１に記載の化合物。 ７． Ｅ₂がＨまたはヒドロキシル保護基である請求項１に記載の化合物。 ８． Ｚ₂がＨである請求項１に記載の化合物。 ９． Ｚ₁がプリンまたはピリミジンである請求項１に記載の化合物。 １０． Ｚ₁がアデニン、グアニン、シトシン、ウリジンまたはチミンである請 求項９に記載の化合物。 １１． Ｚ₁が１から約２０の炭素原子を有するアルキルである請求項１に記載 の化合物。 １２． Ｚ₁が６から約１４の炭素原子を有するアリールまたは７から約１５の 炭素原子を有するアラルキルである請求項１に記載の化合物。 １３． Ｚ₁がフルオレニルメチル、フェニル、またはベンジルである請求項１ に記載の化合物。 １４． Ｚ₁がポリエチレングリコールまたはグルタミルである請求項１に記載 の化合物。 １５． ｍが約２から約２５である請求項１に記載の化合物。 １６． ＸがＯである請求項１に記載の化合物。 １７． ＸがＳである請求項１に記載の化合物。 の化合物。 ２０． 少なくとも一つの前記Ｌ基が他の前記Ｌ基と異なっている請求項１に記 載の化合物。 ２１． ホスホジエステルまたはホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを含む 第一の領域および下記の構造を有する第二の領域を有するキメラオリゴマー化合 物： ［式中 各々のＸは独立してＯまたはＳであり； 各々のＹは［Ｑ₂］_j−Ｚ₂であり； 各々のＴは独立して［Ｑ₁］_k−Ｚ₁であるか、またはＹおよびＴが一緒に窒素 へテロ環に組み込まれ； Ｑ₁、Ｑ₂および各々のＬは独立してＣ₂−Ｃ₁₀アルキル、Ｃ₂−Ｃ₁₀アルケニル 、 Ｃ₂−Ｃ₁₀アルキニル、Ｃ₄−Ｃ₇炭素環−アルキルまたは−アルケニル、ヘテロ 環、２から１０の炭素原子を有しおよび１から４の酸素または硫黄原子を有する エーテル、ポリアルキレングリコール、またはＣ₇−Ｃ₁₄アラルキルであり、Ｌ がヘテロ環である場合は少なくとも一つのＬは置換ピロリジンまたは天然の核塩 基ではなく、およびＬがアルキルの場合は少なくとも一つのＬは置換グリコール ではない； Ｅ₁およびＥ₂の一つがホスホジエステルまたはホスホロチオエートオリゴヌク レオチドを含む前記第一の領域であり、および前記Ｅ₁およびＥ₂の他方がＨ、ヒ ドロキシル保護基、活性化固体支持体、コンジュゲート基、レポーター基、ポリ エチレングリコール、アルキル、オリゴヌクレオチド、ペプチド核酸、ホスフェ ート、ホスファイト、活性化ホスフェートまたは活性化ホスファイトであり； ｊおよびｋは独立して０または１であり； ｍは２から約５０であり； Ｚ₁およびＺ₂は独立して、Ｈ、Ｃ₁−Ｃ₂アルキル、Ｃ₂−Ｃ₂₀アルケニル、Ｃ₂ −Ｃ₂₀アルキニル、Ｃ₆−Ｃ₁₄アリール、Ｃ₇−Ｃ₁₅アラルキル、ハロゲン、ＣＨ ＝Ｏ、ＯＲ₁、ＳＲ₂、ＮＲ₃Ｒ₄、Ｃ（＝ＮＨ）ＮＲ₃Ｒ₄、ＣＨ（ＮＲ₃Ｒ₄）、Ｎ ＨＣ（＝ＮＨ）ＮＲ₃Ｒ₄、ＣＨ（ＮＨ₂）Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ₃Ｒ₄ 、Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ₅、金属配位基、レポーター基、窒素含有ヘテロ環、プリン、 ピリミジン、ホスフェート基、ポリエーテル基、またはポリエチレングリコール 基であり； ＡはＬ₁、Ｌ₁−Ｇ₁、Ｌ₂、Ｌ₂−Ｇ₂、ＮＲ₃Ｒ₄、Ｈ、窒素含有ヘテロ環、プリ ン、ピリミジン、ホスフェート基、ポリエーテル基、またはポリエチレングリコ ール基であり： ＪはＬ₁、Ｇ₃、Ｌ₁−Ｇ₃、またはＧ₃−Ｌ₁−Ｇ₃であり； Ｌ₁は１から約２０の炭素原子を有するアルキル、２から約２０の炭素原子を 有するアルケニル、または２から約２０の炭素原子を有するアルキニルであり； Ｌ₂は６から約１４の炭素原子を有するアリールまたは７から１５の炭素原子 を有するアラルキルであり； Ｇ₁はハロゲン、ＯＲ₁、ＳＲ₂、ＮＲ₃Ｒ₄、Ｃ（＝ＮＨ）ＮＲ₃Ｒ₄、ＮＨＣ（ ＝ ＮＨ）ＮＲ₃Ｒ₄、ＣＨ＝Ｏ、Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ₅、ＣＨ（ＮＲ₃Ｒ₄）（Ｃ（＝Ｏ） ＯＲ₅）、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ₃Ｒ₄、金属配位基、またはホスフェート基であり； Ｇ₂はハロゲン、ＯＨ、ＳＨ、ＳＣＨ₃、またはＮＲ₃Ｒ₄であり； Ｇ₃はＣ（＝Ｏ）、Ｃ（＝Ｓ）、Ｃ（Ｏ）−Ｏ、Ｃ（Ｏ）−ＮＨ、Ｃ（Ｓ）− Ｏ、Ｃ（Ｓ）−ＮＨまたはＳ（Ｏ）₂であり； 各々のｄ１は独立して０または１であり； 各々のｄ２は独立して０から６であり； 各々のｄ３は独立して１から６であり； Ｒ₁はＨ、１から約６の炭素原子を有するアルキル、またはヒドロキシル保護 基であり； Ｒ₂はＨ、１から約６の炭素原子を有するアルキル、またはチオール保護基で あり； Ｒ₃およびＲ₄は独立してＨ、１から約６の炭素原子を有するアルキル、または アミン保護基であり； Ｒ₅はＨ、１から約６の炭素原子を有するアルキル、または酸保護基であり； および Ｅ₁およびＥ₂の一つは前記ホスホジエステルまたはホスホロチオエートオリゴ ヌクレオチドを含み、および前記Ｅ₁およびＥ₂の他方がＨ、ヒドロキシル保護基 またはコンジュゲート基である］。 ２２． Ｌが約２から約１０の炭素を有するアルキルである請求項２１に記載の 化合物。 ２３． ＹおよびＴが一緒に窒素ヘテロ環に組み込まれている請求項２１に記載 の化合物。 ２４． 前記ヘテロ環がピペリジンまたはピロリジンである請求項２３に記載の 化合物。 ２５． Ｅ₁がＨ、ヒドロキシル保護基、または活性化固体支持体である請求項 ２１に記載の化合物。 ２６． Ｅ₂がトリチル、メトキシトリチル、ジメトキシトリチルまたはトリメ トキシトリチルである請求項２１に記載の化合物。 ２７． Ｅ₂がＨまたはヒドロキシル保護基である請求項２１に記載の化合物。 ２８． Ｚ₂がＨである請求項２１に記載の化合物。 ２９． Ｚ₁がプリンまたはピリミジンである請求項２１に記載の化合物。 ３０． Ｚ₁がアデニン、グアニン、シトシン、ウリジンまたはチミンである請 求項２９に記載の化合物。 ３１． Ｚ₁が１から約２０の炭素原子を有するアルキルである請求項１に記載 の化合物。 ３２． Ｚ₁が６から約１４の炭素原子を有するアリールまたは７から約１５の 炭素原子を有するアラルキルである請求項２１に記載の化合物。 ３３． Ｚ₁がフルオレニルメチル、フェニル、またはベンジルである請求項２ １に記載の化合物。 ３４． Ｚ₁がポリエチレングリコールまたはグルタミルである請求項２１に記 載の化合物。 ３５． ｍが約２から約２５である請求項２１に記載の化合物。 ３６． ＸがＯである請求項２１に記載の化合物。 ３７． ＸがＳである請求項２１に記載の化合物。 記載の化合物。 ４０． 少なくとも一つの前記Ｌ基が他の前記Ｌ基と異なっている請求項２１に 記載の化合物。