JPH09510864A - 新規Ｆａｓタンパク質およびその使用方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、新規な形態のFasタンパク質、このタンパク質をコードするDNA、この組換えDNAを発現する細胞、およびそれらの使用方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】 新規Fasタンパク質およびその使用方法 発明の分野 本発明は、一般に、アポトーシスの分野、詳細には新規Fasタンパク質に関す る。発明の背景 アポトーシスは、個々の細胞死および組織からの細胞の最終的な欠失を決定す る正常な生理学的プロセスである。総説として、Apoptosis the Molecular Basi s of Cell Death 、TomeiおよびCope編、Current Communications in Cell and M olecular Biology 3、Cold Spring Harbor Laboratory Press、NY、1991を参照 のこと。アポトーシスは、種々の正常および病原性の生物学的事象に関連するプ ログラム細胞死のプロセスであり、多くの関連のない刺激により誘導され得る。 アポトーシスの生物学的調節の変化もまた加齢の間に生じ、そして加齢に関連す る多くの症状および疾病の原因となり得る。 アポトーシスの最近の研究は、細胞死に至る通常の代謝経路が、ホルモンレベ ルの変化、血清の成長因子の喪失、化学療法剤、およびイオン化照射を含む種々 のシグナルにより開始され得ることを示している。Wyllie (1980) Nature、284: 555-556；Kanterら (1984) Biochem．Biophys．Res．Commun.、155:324-331；お よびKrumanら (1991) J．Cell．Physiol.、148:267-273。したがって、アポトー シスの生物学的コントロールに影響を与える薬剤は、種々の状態での治療への有 用性を有する。 Fas（APO-1としても知られている）は、腫瘍壊死因子／神経成長因子レセプタ ーファミリーに属する細胞表面タンパク質であり、それらのメンバーのそれぞれ はアポトーシスを仲介し得ることが示されている。Fasのクローニングは、PCT国 際公開第WO 91/10448号および欧州特許出願公開第0510691号に記載されている。 Fasは、推定分子量が34,971であり、そしてグリコシル化のためであり得る見か けの分子量が約45,000である貫膜(TM)タンパク質である。成熟Fas分子は319アミ ノ酸残基からなり、その157は細胞外てあり、17はTMドメインを構成し、そして1 45は細胞内である。種々の細胞タイプがその表面上にFasを発現する。興味深い ことに、Fas発現は、CD4⁺およびCD8⁺細胞を含む活性化Ｔ細胞で増加される。 Fasに特異的な特定の抗体は、アポトーシスのメカニズムにより、細胞表面上 にFasを発現する細胞の死を誘導することが示されている。初期の研究は、Fas特 異的抗体の治療への使用が種々の疾病の処置に有効であることを示した。Itohら (1991)Cell、66:233-243；Krammerら(1991)Apoptosis: The Molecular Basis of Cell Death 、(TomeiおよびCope編)、Cold Spring Harbor Laboratory Press、N Y；Oehmら(1992)J．Biol．Chem.、267:10709-10715；およびRouvierら(1993)J． Exp．Med.、177:195-200。現在、抗Fas抗体の投与が致死的であり得ることが見 出されている。Ogasawaraら(1993)Nature、364:806-809。精製Fasが抗Fasの細胞 致死性効果をブロックすることもまた見出されている。Oehmら(1992)。 Ｔ細胞表面Fasの上昇したレベルはまた、腫瘍細胞およびHIV感染細胞と関連し ている。HIV感染細胞は、抗Fas抗体により感受性であるが、FasのHIV感染との関 連の重要性は未だ決定されていない。 Fasを認識しアポトーシスを誘導することの原因である内因性Fasリガンドは同 定されていないが、数人のAIDS患者は抗Fas自己抗体のレベルが上昇しているこ とが示されている。Oehmら(1991)。さらに、Ｔ細胞仲介細胞傷害性は、Fas仲介 アポトーシスに関連することが示されている。 上記および下記の両方で本明細書に引用された全ての参考文献は、本明細書中 に参考として援用される。発明の要旨 貫膜領域を欠く新規な天然形態のFasタンパク質（以下、FasΔTM）が提供され る。FasΔTMをコードするDNAおよびこのDNAを発現する組換え細胞もまた提供さ れる。FasΔTMを利用する診断および治療方法もまた提供される。図面の簡単な説明 図１は、貫膜(TM)領域のまわりのFasゲノムDNA構造を示す略模式図である。 図２は、FasおよびFasΔTM mRNAを産生するFas RNAのオルタナティブスプライ シングを示す略模式図である。 図３は、FasΔTMのヌクレオチド配列およびアミノ酸残基配列を示す。 図４は、生物学的に重要なFas分子の検出に有用な抗体を惹起するために用い られる合成ペプチドを示す。 図５は、FasΔTMを発現するベクターで形質転換された種々の細胞株あるいは コントロールの非形質転換細胞株の、Fas抗体に曝したときの生存を示す。 図６は、FasΔTMを発現するベクターで形質転換された種々の細胞株あるいは コントロールの非形質転換細胞株の、Fas抗体に曝したときの生存を示す。 図７は、FasΔTMを発現するベクターで形質転換された種々の細胞株の表面、 あるいはコントロールの非形質転換細胞株の表面のFasの量を示す。 図８は、細胞死を誘導する抗Fas抗体を抑制することにおける、組換えFasΔTM の活性を示す。発明の詳細な説明 本発明は、単離した新規な分泌形態のFasタンパク質（以下FasΔTMと命名する ）およびFasΔTMの使用方法に関する。本発明はさらに、FasΔTMをコードするク ローン化DNAおよびこのDNAを発現する組換え細胞を包含する。FasΔTMのヌクレ オチド配列およびアミノ酸残基配列が、図３に示される。 適切な領域におけるFas遺伝子のゲノム構造が図１に示される。イントロンお よびエキソンの位置は、Fasの異なる領域に関連する。FasΔTMのクローニングは 、以下の実施例に詳細に記載されている。 図２は、オルナタティブ形態のFasを生じると考えられるmRNAのオルタナティ ブスプライシングを示すが、本発明は、FasΔTMが産生されるこのメカニズムに よって限定されない。天然のFasΔTMはTM領域を含む21アミノ酸残基を欠いてい る。 本発明は、非膜結合タンパク質を産生するに十分なTM領域部分を欠いている、 FasΔTMの他の組換え変異体を包含する。好適には、このタンパク質は細胞から 分泌される。FasΔTMという用語は、TM領域のアミノ酸残基を欠いている、非膜 結合形態の全ての分子を包含する。図３は、天然のFasΔTMのヌクレオチド配列 およびアミノ酸残基配列を示す。 本発明の１つの実施態様は、FasΔTMをコードするDNAである。FasΔTMをコー ドするDNAには、cDNA、ゲノム由来DNA、および合成または半合成DNAを包含する が、これらに限定されない。FasΔTMをコードするcDNAのヌクレオチド配列を図 ３に示す。このDNAは、特に非コーディング領域において、欠失、置換、および 付加などの改変を含む。このような変化は、クローニングを容易にし、そして遺 伝子発現を改変するために有用である。種々の置換が、コードされるアミノ酸残 基を変えないかあるいは保存的に置換されたアミノ酸残基を生じるかのいずれか のコーディング領域内でなされ得る。コードされるアミノ酸残基を変えないヌク レオチド置換は、種々のシステムでの遺伝子発現を最適化するために有用である 。適切な置換は当業者に公知であり、例えば、特定の発現システムにおける好ま しいコドン使用頻度を反映するように行われる。適切な保存的アミノ酸残基置換 は当該分野で公知であり、以下に述べられている。 本発明の実施に有用な核酸操作の技術は、種々の参考文献に記載されており、Molecular Cloning: A Laboratory Manual 、第2版、1-3巻、Sambrookら編、Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)；およびCurrent Protocols in Molecu lar Biology 、Ausubelら編、Greene Publishing and Wiley-Interscience: NewY ork(1987)および定期刊行物が含まれるが、これらに限定されない。 本発明はさらに、ベクター内にクローン化されているFasΔTMをコードするヌ クレオチド配列を有する種々のDNAベクターを包含する。適切なベクターには当 該分野で公知のものを全て含み、細菌、哺乳動物、および昆虫の発現システムで 使用されるものを含むが、これらに限定されない。特異的ベクターが当該分野で 公知であり、本明細書中に詳細に記載される必要はない。このベクターはまた、 FasΔTMの発現についての誘導性プロモーターを提供し得る。誘導性プロモータ ーは、遺伝子の構成性発現をさせないがある環境下でのみ発現を可能にするもの である。このようなプロモーターは、種々の刺激により誘導され得、刺激はベク ターを含む細胞の、リガンド、化学物質、または温度変化への曝露を含むが、こ れらに限定されない。 これらのプロモーターはまた細胞特異的であり得、すなわち、特定の細胞タイ プにのみ、およびしばしば特定の期間のみ誘導可能であり得る。プロモーターは さらに細胞周期特異的であり得、すなわち、細胞周期の特定の期間のみ誘導され るまたは誘導可能であり得る。プロモーターは細胞タイプ特異的および細胞周期 特異的の両方であり得る。当該分野で公知のいかなる誘導性プロモーターも、本 発明での使用に適切である。 本発明はさらに、ベクターでトランスフェクトされた種々の発現システムを包 含する。適切な発現システムは、細菌、哺乳動物、および昆虫を含むが、これら に限定されない。特異的な発現システムが当該分野で公知であり、本明細書中に 詳細に記載される必要はない。以下に記載のバキュロウイルス発現システムが生 物学的に活性なFasΔTMの発現を提供することが見出されている。しかし、治療 目的でFasΔTMを発現するためには、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞のよ うな哺乳動物発現システムが、適切な翻訳後修飾を確実にするために好適であり 得る。 本発明は、ヒトを含む動物から取り出され、FasΔTMをコードするベクターで トランスフェクトされ、そして動物中に再導入された細胞を包含する。適切なト ランスフェクトされた細胞はまた、患者から取り出され、トランスフェクトされ 、そして患者に再導入される細胞を包含する。任意の細胞を、この方法で処理し 得る。適切な細胞には、心筋細胞およびリンパ球が含まれるが、これらに限定さ れない。例えば、取り出され、組換えDNAでトランスフェクトされ、そしてHIV陽 性患者中に再導入されたリンパ球は、再導入されたＴ細胞の半減期を増加し得る 。 好適には、HIV感染患者の処置については、白血球が取り出され、そしてCD4⁺ 細胞を得るために選別される。次いで、CD4⁺細胞はFasΔTMをコードするベクタ ーでトランスフェクトされ、そして患者中に再導入される。あるいは、非選別リ ンパ球は、CD4⁺細胞のみがFasΔTM遺伝子を発現するような細胞特異的プロモー ターのコントロール下で、FasΔTM遺伝子をコードする組換えベクターでトラン スフェクトされ得る。この場合、理想的なプロモーターはCD4プロモーターであ るが、いかなる適切なCD4⁺T細胞特異的プロモーターも使用し得る。 さらに、本発明は、ベクターによりインビボでトランスフェクトされた細胞を 包含する。インビボトランスフェクションの適切な方法は当該分野で公知であり 、Zhuら(1993)Science、261:209-211に記載されているが、これに限定されない 。インビボトランスフェクションの場合、トランスフェクションが細胞タイプ特 異的であるか、あるいは、プロモーターが細胞特異的であることが好ましい。 組換えDNAベクターを含むトランスジェニック動物もまた本発明に包含される 。トランスジェニック動物の作製方法は当該分野で公知であり、本明細書で詳細 に記載する必要はない。トランスジェニック動物の作製に用いられる方法の総説 については、PCT国際公開第WO 93/04169号を参照のこと。好適には、このような 動物は、細胞特異的、かつ、さらに好ましくは細胞周期特異的なプロモーターの コントロール下で、組換えFasΔTM遺伝子を発現する。 組換えDNAにより発現したかまたは血清のような生物学的ソースからのFasΔTM の精製または単離は、当該分野で公知の任意の方法により達成され得る。天然お よびほとんどの組換えFasΔTMが細胞から分泌されるので、FasΔTMがインビトロ 培養物の上清およびインビボの血清中に現れ、そしてFasの場合のような細胞破 砕を必要としないことにより、精製は簡易化されている。タンパク質精製方法は 当該分野で公知である。一般に、実質的に精製されたタンパク質は、他の混入し ている細胞性物質、特にタンパク質を含まないタンパク質である。好適には、Fa sΔTMは80％以上純粋であり、最も好ましくはFasΔTMは95％以上純粋である。以 下に記載のような臨床使用については、FasΔTMは好ましくは高度に精製され、 少なくとも約99％純粋であり、発熱物質および他の混入物を含まない。 精製の適切な方法は当該分野で公知であり、アフィニティークロマトグラフィ ー、免疫アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、 HPLCおよびFPLCが挙げられるが、これらに限定されない。タンパク質の実質的な 分解を生じない任意の精製スキームが本発明における使用に適切である。 本発明はまた、図３に示すアミノ酸残基配列を有する実質的に精製されたFas ΔTMタンパク質、および、細胞から分泌されるためにTM領域の十分な部分を欠い ているいかなるタンパク質をも包含する。本発明は、その特性に顕著な影響を与 えない、FasΔTMの機能的に等価の変異体を包含する。例えば、アミノ酸残基の 保存的置換、１または少数のアミノ酸の欠失または付加、およびアミノ酸アナロ グによるアミノ酸残基の置換は、本発明の範囲内である。 互いに保存的に置換され得るアミノ酸残基には以下のものが挙げられるが、こ れらに限定されない：グリシン／アラニン；バリン／イソロイシン／ロイシン； アスパラギン／グルタミン；アスパラギン酸／グルタミン酸；セリン／トレオニ ン；リジン／アルギニン；およびフェニルアラニン／チロシン。FasΔTMの特性 に顕著な影響を与えないいかなる保存的アミノ酸置換も本発明の範囲に包含され る。 FasΔTMをコードするmRNAは、種々のヒト器官および組織で検出されている。 これらには、肝臓；心臓；末梢血リンパ球(PBL)、活性化および正常の両方；胎 盤；線維芽細胞、正常およびホルボールエステル処理したおよびSV40感染したの いずれも；ならびに、U937、WIL-2、およびIM9を含むいくつかの細胞株、が含ま れる。FasΔTMはまた、タンパク質の膜結合形態の細胞質領域を保持していても 、膜結合を維持するよりも、むしろ細胞から分泌されることが見出されている。 したがって、FasΔTMは可溶性タンパク質として血清中で検出され得る。Fasを認 識するいかなる抗体もFasΔTMを認識するに使用するために適切である。 他の実施態様では、診断方法が、タンパク質レベルまたはmRNAレベルのいずれ かで、FasΔTMの発現を検出するために提供される。可溶性FasΔTMタンパク質は 、アポトーシス欠陥に関連する疾病を有する患者の血清中に見出されるようであ り、したがって、このようなアポトーシス欠陥に関連する生物学的状態を検出お よびモニターするための診断ツールとして有用である。 FasΔTMは、Fasを認識するポリクローナルまたはモノクローナルのいずれかの 任意の抗体により検出され得る。FasとFasΔTMとの差異は、タンパク質の可溶性 により決定され得る。Fasは膜結合であり、したがって、細胞および／または膜 の除去により可溶性タンパク質から除去され得る。FasΔTMは可溶性のままであ る。あるいは、FasΔTMに特異的であるがFasに特異的ではない抗体が、本発明に 包含される。このような抗体は、抗原としてFasΔTMを、あるいは好ましくはFas とは異なるFasΔTMの領域、すなわちTM領域を包含するペプチドを用いて生成さ れ得る。このようなペプチドの例を図５に示す。抗体を用いてタンパク質を検出 する方法ならびにタンパク質または合成ペプチドを用いて抗体を生成する方法は 、当該分野で公知であり、本明細書で詳細に記載する必要はない。 FasΔTMタンパク質の発現はまた、Fas-ΔTMをコードするmRNAのレベルを測定 することによりモニターされ得る。特異的mRNA種を検出するいかなる方法も、こ の方法に使用するために適切である。これは、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を用 いて容易に達成される。好適には、PCR用に選択されるプライマーは、FasとFas ΔTMとの間のサイズに測定可能な違いのある産物を提供するように、TM領域に隣 接する。あるいは、ノーザンブロットが、サイズによるか、あるいはTM領域をコ ードするmRNAに特異的なプローブによるかのいずれかにより、特異的mRNA種を検 出するために利用され得る。 本発明はまた、FasΔTMでの処置を含む治療方法および組成物を包含する。天 然または組換えのいずれかのFasΔTMがこの組成物に使用するために適切である 。両方とも実質的に純粋でありかつ発熱物質を含まないべきである。組換えFas ΔTMは、適切なグリコシル化を確実にするように、哺乳動物細胞株で産生される ことが好ましい。FasΔTMはまた、昆虫細胞株中で産生され得、そしてグリコシ ル化される。 治療組成物については、治療的有効量の実質的に純粋なFasΔTMが、生理学的 に受容可能な緩衝液（生理食塩液およびリン酸緩衝化生理食塩液(PBS)が挙げら れるがこれらに限定されない）に懸濁され、患者に投与される。好適には、投与 は静脈内である。他の投与方法には、皮下、腹腔内、胃腸管内、および、例えば 、心筋梗塞に関連する細胞死を処置するために、心臓内のような特定の器官に直 接に投与することが挙げられるが、これらには限定されない。 適切な緩衝液および投与方法は当該分野で公知である。FasΔTMの有効濃度は 、経験的に決定される必要があり、疾病のタイプおよび重篤度、疾病の進行、な らびに患者の健康状態に依存している。このような決定は当業者の技術範囲内で ある。さらに、FasΔTMは血清中に正常に見られるヒトタンパク質である；外因 性ヒトFasΔTMの投与は、アナフィラキシーショックまたは抗体の産生のような 反応を誘起しないようである。したがって、治療使用のためのFasΔTMのより高 い 濃度は、これらの生理学的考慮により制限されない。 FasΔTMの投与により、Fasリガンドに競合的に結合するFasΔTMの細胞外濃度 が上昇し、それゆえ、Fasにより細胞に伝達されるアポトーシスのシグナルを抑 制または改良する。したがって、治療方法は、Fas仲介細胞死を阻害することを 包含するが、これに限定されない。例えば、腫瘍壊死因子(TNF)およびFas特異的 抗体は、Fasに結合することにより、アポトーシスならびに動物全体の死でさえ も誘導することが知られている。したがって、アポトーシスを引き起こすように 誘導するFasおよびリガンドのこの相互作用の阻害が、アポトーシスを減少させ る。 FasΔTMの治療使用のための適切な徴候は、Fas仲介細胞死を含むものであり、 FasまたはFasリガンドの不適切な発現あるいはアップレギュレーションが存在す る症状が含まれるがこれに限定されない。このような徴候には、HIV感染、自己 免疫疾患、心筋症、神経障害、肝炎および他の肝臓病、骨粗厭症、および敗血症 を含むがこれに限定されないショック症候群が挙げられるが、これらに限定され ない。 FasΔTMでの処置方法はまた、FasΔTMの細胞外濃度を上昇させる他のメカニズ ムを包含する。これらには、FasΔTMの細胞性発現を上昇させることが含まれる が、これに限定されない。FasΔTMの細胞性発現を上昇させる適切な方法には、 内因性発現を上昇させること、およびFasΔTMをコードするベクターで細胞をト ランスフェクトすることを含むが、これらに限定されない。細胞性トランスフェ クションは上で議論されており、当該技術分野で公知である。FasΔTMの内因性 発現を上昇させることは、FasよりもFasΔTMの発現または特異なプロセシングを 上昇させることによるか、あるいはFasΔTM分解を減少させることによるかのい すれかにより、FasΔTMのレベルを直接的にまたは間接的に上昇させる生物学的 修飾因子(modifier)に細胞を曝すことによって達成され得る。適切な生物学的修 飾因子は、天然のFasプロモーターのコントロール下でFasΔTMを発現する細胞を 、可能性のある生物学的修飾因子に曝すこと、ならびにFasΔTMの発現をモニタ ーすることにより、測定され得る。FasΔTMの発現は、上記のように、タンパク 質またはmRNAのレベルのいずれかによりモニターされ得る。生物学的修飾因子 は、任意の当該分野で公知の治療剤または化学物質であり得る。好適には、適切 な生物学的修飾因子は、実質的な細胞傷害性および発癌性を欠くものである。 同様に、FasΔTMの内因性レベルを低下させる生物学的修飾因子は、FasΔTMの 内因性レベルを減少させることによるFas仲介細胞死の増加方法であるので、本 発明に包含される。適切な生物学的修飾因子を測定する方法は、終点が減少した FasΔTMのレベルであること以外は、上記と同様である。FasΔTMの内因性レベル を減少させる他の方法には、アンチセンスヌクレオチド治療および抗FasΔTM抗 体への曝露が挙げられるが、これらに限定されない。これらの方法は両方とも当 該分野で公知であり、それらの適用は当業者には明らかである。FasΔTMの内因 性レベルを減少させるための適切な徴候は、Fas仲介細胞死が適切である任意の 徴候である。これらには、種々のタイプの悪性腫瘍、および湿疹のようなコント ロールされない細胞成長を生じる他の障害が挙げられるが、これらに限定されな い。 以下の実施例は、例示のために提供されるが、本発明を限定するものではない 。 実施例１ FasΔTMのクローニング FasΔTMをコードする核酸配列を以下のようにクローニングした。他に特定し ていなければ、全てのクローニング技術は、本質的にSambrookら(1989)に記載さ れているとおりであり、そして全ての試薬は製造者の指示に従って用いた。 mRNAをヒトリンパ球から得、そしてPCRを用いてFasΔTM mRNAに特異的なcDNA を作製した。リンパ球を以下のようにして得、そして処理した。35mlの血液を正 常な42歳の男性から静脈穿刺により得、そして直ちに350μlの15％ EDTAを添加 した。35mlのPBSを血液に添加し、そして17mlの血液懸濁液を12.5mlのFicoll Pa que(Pharmacia)上に積層した。次いで、これをスイングバケットローターおよび Dynacll遠心分離機中で、1,800rpmにて30分間遠心分離した。 血漿を吸引し、リンパ球層を収集し、0.9mM Ca²⁺および0.5mM Mg²⁺を含むPBS （PBS/Ca/Mg緩衝液）の２容量に添加した。細胞をPBS/Ca/Mg緩衝液で１回洗浄し 、2g/lグルコースおよび10％ウシ胎児血清(FBS)を含むRPMI (Gibco/BRL)培地 中に2×10⁶細胞/mlで再懸濁した。細胞収量は98％より多くの生存性で3.5×10⁷ であった。コンカナバリンＡ(Sigma)を最終濃度が30μg/mlになるように添加し 、そして細胞を37℃で72時間インキュベートした。 次いで、細胞を以下のようにRNA単離のために処理した。トータルRNAを、「Cu rrent Protocols in Molecular Biology」(1991)に従って、グアニジウムチオシ アネート１工程RNA単離法を用いて３×10⁶細胞から単離した。PCR反応に用いる ファーストストランドcDNAを、Zapfら(1990)J．Biol．Chem.、265:14892-14898 に記載された方法に従って、６.４μgのトータルRNAから合成し、100μlの水に 再懸濁した。FasΔTM cDNAをPCRを用いて合成した。正方向プライマー：5’-GAT TGCTTCTAGACCATGCTGGGCATCTGGACCCTCCTACC-3’は、XbaI制限部位を含み、そして 開始メチオニンコドンおよびFasの最初の８コドンをコードしていた。逆方向プ ライマー：5’-GTTGTTTGTCGACCTAGACCAAGCTTTGGATTTCATTTCTG-3’は、SalI制限 部位を含み、そして終止コドンおよびFasの最後の８コドンをコードしていた。 PCR反応を、1μlのテンプレートcDNA（上記のように、1:100希釈）、100pmol の各プライマー、２.５ユニットのAmplitaq、76.5μlのH₂O、および10μlの緩衝 液を添加することにより行った。反応を、94℃で１分間、55℃で２分間、72℃で ３分間を35サイクル、そして72℃で７分間続行し、そして４℃で保存した。15μ lの反応混合物を１％アガロースゲル上に載せ、そして適切な分子量のバンドを 検出した。残りの反応混合物をフェノール／クロロホルムで抽出し、エタノール 沈澱し、そして80μlのTris-EDTA(TE)中に再懸濁した。 80μlのサンプルに、以下のものを加えた：5μlのSalI；5μlのXbaI；10μlのSal I反応緩衝液。他の反応では、60μlのH₂Oを、0.65mg/mlの20μlのpBluescrip t、5μlのSalI、5μlのXbaI、および10μlのSalI反応緩衝液に添加した。両方の チューブを37℃で２時間インキュベートし、そして反応物を１％調製用アガロー スゲルに流した。消化されたDNAに相当するバンドをゲルから切り出し、そして TE緩衝液中に再懸濁し、pBluescriptを40μlのTE緩衝液中に再懸濁した。 DNAサンプルを、2μlのベクター、8μlのFasΔTM cDNA、2μlの10mM ATP、2μ lの10×ライゲーション緩衝液、２μlのT4 DNAリガーゼ(New England Biolabs) 、 および４μlのH₂Oを含む反応混合物中でライゲートした。コントロール反応はFa sΔTM DNAを含まなかった。14℃で６時間ライゲーションを継続した後、製造者 の指示に従ってDNAを用いてDH5α細胞(Gibco)を形質転換した。簡単にいえば、2 00μlの細胞をライゲーション混合物に添加し、そして45分間氷上に保った。細 胞を42℃で90秒間熱ショックし、次いで氷上に置いた。次いで、3mlのＬブロス を加え、そして細胞を37℃で１時間インキュベートし、そして100mMアンピシリ ン、20μlの４％X-Gal、および50μlの100mMイソプロピル-1-β-D-チオガラクト シド(IPTG)を含むＬブロス寒天プレート上に播種した。細胞を37℃で一晩インキ ュベートすることによりコロニーを形成させた。陽性コロニーをＬブロス＋アン ピシリン中で一晩増殖し、プラスミドをアルカリ溶解手順により得、そして製造 者の指示に従ってSalIおよびXbaIで消化した。適切な挿入物を含む１つのプラス ミドを大規模に調製し、そして挿入物をジデオキシ法により配列決定した。得ら れた配列を図３に示す。FasΔTMをコードする組換えcDNAを含むプラスミドをpBl uescript-FasΔTMと命名した。 実施例２ Fasゲノム構造の分析 Fas TM領域におけるイントロン−エキソン編成をPCRにより決定した。プライ マーを推定イントロン１および２のそれぞれに隣接するように設計した（図２を 参照のこと）。イントロン１に隣接する正方向プライマーおよび逆方向プライマ ーは、それぞれ5’-GATTGCTTCTAGAGGAATCA TCAAGGAATGCACACTC-3’および5’-GT TGTTTGTCGACC CAAACAATTAGTGGAATTGGCAA-3’であり、イントロン２についての正 方向プライマーおよび逆方向プライマーは、それぞれ5’-AGATCTGCGGCCGCATTGGG GTGGCTTTGTCTTCTTCTT-3’および5’-GTTGTTTGTCGACGTTTTCCTTTCTGTGCTTTCTGCA-3 ’であった。XbaIおよびSalI制限酵素部位ならびにNotIおよびSalI制限酵素部位 を、イントロン１および２のプライマーのそれぞれ5’末端に含み、PCR産物のク ローニングを容易にした。PCRを、テンプレートとしてヒトゲノムDNA(Clontech) (5μg)を用いて製造者の指示(Perkin Elmer Cetus)に従って行った。30サイクル のPCRを、Perkin Elmer Cetus DNA Thermal Cyclerにて、94℃、１分の変性工程 、 55℃、２分のアニーリング工程、および72℃、３分の伸長工程からなる各サイク ルで行った。最終サイクルの後、さらに７分の伸長工程を含んでいた。次いで、 PCR産物を、５ユニットのDNAポリメラーゼＩ、クレノウフラグメントとともに37 ℃で30分インキュベートし、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール (1:1:0.04)次いでクロロホルム／イソアミルアルコール(24:1)で抽出し、そして エタノール沈澱により回収した。 イントロン１およびイントロン２PCR産物を、それぞれ、XbaIおよびSalI、な らびにNotIおよびSalIで消化し、アガロースゲル精製し、pBluescript SK(-)に ライゲートし、そして実施例１に記載の方法により、E．coli HB101株に導入し た。プラスミドDNAを、製造者により記載された方法に従ってPromega Magic min iprepキットを用いて単離した。プラスミドDNAを、製造者の指示に従ってSequen ase Version 2.0 DNA Sequencingキット(USB)を用いて、ジデオキシ鎖終止法に より直接的に配列決定した。得られた配列を図３に示す。 実施例３ 組換えFasΔTMの発現 バキュロウイルスシステムで組換えFasΔTMを発現させるために、実施例１で 得たプラスミドを用いて、実施例１に記載のようにPCR法により、pBlueBacIII-F asΔTMと命名した第２のFasΔTMベクターを生成した。正方向プライマーの5’-T TTCCCGGATCCACAACCATGCTGGGCATCTGGACCCTCCTA-3’は、都合のよいBamHI制限部位 、および開始コドンの直前にKozakコンセンサス配列ACAACCを含んでおり、Fasの 最初の７アミノ酸をコードしていた。逆方向プライマーの5’-CCCCATGGCTAGACCA AGCTTTGGATTTCATT-3’は、終止コドン、NcoI部位、およびFasの最後の７アミノ 酸をコードしていた。５つの組換えプラスミドを単離した。これらのうちの２つ を、製造者の指示に従って(USB、Sequenase version 2.0)配列決定キットを用い て、ジデオキシ鎖終止法（Sangerら1977）により配列決定した。DNAを内部プラ イマーを用いて配列決定した。 配列中にいかなるPCRエラーをも含まないクローン３を用いて、pBlueBac III- FasΔTM-3とAcNPV野生型バキュロウイルスとの重複する配列間のインビボ相同組 換えにより、組換えウイルスを生成した。昆虫のSpodoptera frugiperdaクロー ン９(SF)細胞中でのトランスフェクションの48時間後、組換えウイルスを収集し 、PCRにより同定し、そしてさらに精製した。プラスミドクローニングの標準プ ロトコルを用いた（Maniatisら1982）。組換えバキュロウイルスの選択、スクリ ーニング、および増殖の標準手順を、製造者の指示（Invitrogen）に従って行っ た。トランスフェクションの48時間後、組換えウイルスを収集しそして精製した 。ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)での、 バキュロウイルスシステムで産生されたタンパク質の分子量は、アミノ酸配列に より推定したFasΔTMの分子量と一致しており、そして組換えタンパク質はまた 抗Fas抗体（Medical and Biological Laboratories、Nagoya、Japan）により認 識された。 実施例４ 哺乳動物システムにおけるFasΔTMの発現 FasΔTMコーディング配列を、XbaIおよびSalIでpBluescript-FasΔTMから切り 出し、適合可能なNheIおよびXhoI部位でプラスミドpCEP7およびpREP7（Invitrog en）に導入し、それぞれクローンFasΔTM-1およびFasΔTM-7を生成した。pCEP7 を、XbaI/Asp718でpREP7のRSV 3’-LTRを除去し、そしてpCEP4（Invitrogen）由 来のCMVプロモーターを代用することにより生成した。適合可能なXbaI部位を生 成するために、pCEP4を、まずSalIで切断し、外側のSalI部位および内側のNheI 部位を含むオリゴヌクレオチドアダプターにライゲートした。次いで、pCEP4を 、NheIおよびAsp718で切断し、そして精製したCMVプロモーターをpREP7にライゲ ートしてpCEP7を生成した。25μgの各FasΔTM含有プラスミドを、Ｂリンパ芽球 細胞株WIL-2にエレクトロポレートし、そして安定なハイグロマイシン耐性形質 転換体を選択した。 実施例５ 抗Fas抗体は、野生型Ｂリンパ芽球細胞株WI-L2-729 HF2ならびにFasΔTM-1およ びFasΔTM-7により形質転換された野生型細胞の死滅を誘導した ２×10⁵のWIL-2、FasΔTM-1およびFasΔTM-7で形質転換したWIL-2細胞を、10 ％ウシ胎児血清(FBS)を加えたRPMI中で増殖した。新鮮な培地で洗浄した後、細 胞を10％FBSを加えたRPMIに懸濁し、50ngの抗Fas抗体を添加し、そして細胞死の キネティクスをFACScanでのフローサイトメトリーにより分析した。この方法は 、細胞の死後に収縮しそしてプロピジウムヨード(PI)に浸透性である細胞の測定 に基づくものである。コントロールにおいては３つの全ての細胞株の生存には差 はなかった。しかし、抗Fas抗体の添加により、FasΔTMにより形質転換された細 胞は感受性が低下した：処理の26時間までに、野生型WIL-2、FasΔTM-7、および FasΔTM-1形質転換体のそれぞれ約50％、40％、および16％が死滅した（図５） 。 他のシリーズの実験では、細胞を最初に24時間増殖し、次いで、抗Fas抗体を 、FasΔTMが分泌され培地中に蓄積するはずであるとの仮定の下で添加した。こ の場合、形質転換された細胞株の感受性はプレインキュベーションしない場合よ りも低かった：抗体での処理の26時間後、野生型WIL-2、FasΔTM-7、およびFas ΔTM-1形質転換体のそれぞれ約45％、16％、および5％が死滅した（図６）。 形質転換体のより低い感受性がFas発現のダウンレギュレーションにより引き 起こされないことを確証するために、３つの全ての細胞株の表面上のFasの量を 比較した。細胞を、モノクローナルマウス抗Fas抗体、ビオチン標識抗マウスIgM 抗体を用いる標準手順により処理し、そして最終的にFITC標識ストレプトアビジ ンで染色した。FACScanを用いる染色した細胞の分析は、野生型WIL-2および形質 転換体の表面のFasの量に差がないことを示した（図７）。このように、FasΔTM で形質転換したWIL-2は、抗Fas抗体の細胞傷害性効果に対する感受性が低い。こ の効果は、形質転換体によるFasΔTMの分泌により少なくとも一部は説明され得 る。従って、FasΔTMの増加した細胞性発現はFas仲介細胞死の阻害を生じる。 実施例６ 組換えFasΔTMは抗Fas抗体により誘導される細胞死を抑制する バキュロウイルスシステムで産生されるFasΔTMの生物学的活性をチェックす るために、実施例３に記載のように、野生型バキュロウイルスおよびFasΔTMを 含む組換え体でトランスフェクトされた昆虫細胞を、水中でまたは0.05％非イオ ン性界面活性剤Triron X-100を含む緩衝液中でホモジナイズし、そして遠心分離 した。抗Fas抗体を、可溶性および不溶性画分のアリコートとともに室温で２時 間プレインキュベートし、WIL-2に添加し、そして細胞死を上記のようにフロー サイトメトリーにより24時間後に分析した。野生型バキュロウイルスでトランス フェクトした昆虫細胞由来の可溶性および不溶性の画分の両方とも、細胞生存性 に影響はなかった。一方、FasΔTMを含むバキュロウイルス組換え体でトランス フェクトした昆虫細胞由来の可溶性および不溶性画分は、抗Fas抗体により誘導 されるWIL-2の死を阻害した。不溶性画分の活性は、可溶性画分の活性の約10倍 であった（図８）。このように、組換え体FasΔTMは、抗体の結合について細胞 表面のFasと競合し得、そしてFas仲介細胞死を抑制する。 実施例７ RT-PCRによるFasΔTM転写物分析 天然FasΔTM転写物をRT-PCRおよびアクリルアミドゲル電気泳動により同定し た。PCRプライマーを、FasおよびFasΔTM転写物がそれぞれ296bpおよび233bpPCR 産物を生じるように、Fas TM領域のまわりに設計した。正方向プライマーは5’- GACCCAGAATACCAAGTGCAGATGTA-3’であり、そして逆方向プライマーは5’-CTGTTT CAGGATTTAAGGTTGGAGATT-3’であった。cDNAを種々のヒト組織および細胞株から 単離したポリ(A)+またはトータルRNAから合成した。これらには、心臓、肝臓、 活性化されたおよび活性化されていない末梢血リンパ球(PBL)、胎盤、および線 維芽細胞株を包含した。PCRを、テンプレートとしてcDNA(10〜100ng/ml)を用い て実施例１に記載のように行い、そして産物を７％アクリルアミド／TBEゲルで 分析した。 テストした全ての組織および細胞株は、この分析によりFas転写物およびFasΔ TM転写物を含んでいた。これは、これらの組織中の細胞死がFasおよびFasΔTMの 量（および比）により調整され得ることを示唆する。興味深いことには、肝臓は 、最も大量のFasΔTM転写物を含んでいた。これは、FasΔTMが血清中に分泌され 得ることを示唆する。 上記の発明は、理解を明確にする目的のために例示および実施例により詳細に 記載されたが、特定の変更および改変が実施され得ることは当業者には明かであ る。したがって、記載および実施例は、添付の請求の範囲により記載されている 本発明の範囲を限定することを意図するものではない。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ０７Ｈ 21/04 9356−4Ｈ Ｃ０７Ｋ 14/71 Ｃ０７Ｋ 14/71 9356−4Ｈ 16/28 16/28 9284−4Ｃ Ａ６１Ｋ 39/395 Ｄ Ｃ１２Ｎ 5/10 9284−4Ｃ Ｎ // Ａ６１Ｋ 39/395 9637−4Ｂ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ 9637−4Ｂ 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/02 0276−2Ｊ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 21/08 9282−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/53 9051−4Ｃ Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ)，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，Ｃ Ｎ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，Ｎ Ｌ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 キーファー，マイケル シー. アメリカ合衆国 カリフォルニア 94517, クレイトン，ライト コート 401

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．FasΔTMをコードする精製されたヌクレオチド配列を含む組成物。 ２．前記配列がcDNAである、請求項１に記載のヌクレオチド配列。 ３．図３に示されるヌクレオチド配列を有する、請求項１に記載のヌクレオチ ド配列。 ４．請求項１に記載のヌクレオチド配列を含む、組換えDNAベクター。 ５．前記FasΔTMをコードする配列の発現が誘導性プロモーターのコントロー ル下である、請求項４に記載の組換えDNAベクター。 ６．pBlueBACIII-FasΔTM-3、pBluescript-FasΔTM、FasΔTM-1、およびFasΔ TM-7からなる群より選択される、請求項４に記載の組換えDNAベクター。 ７．請求項４に記載の組換えDNAベクターでトランスフェクトされた細胞。 ８．請求項４に記載の組換えDNAベクターを含む、トランスジェニック動物。 ９．図４のアミノ酸配列を含む、実質的に精製されたタンパク質。 １０．Fasアミノ酸配列を含むが、膜結合されていない分泌されるタンパク質 を生じるに十分な貫膜領域の部分を欠く、実質的に精製されたタンパク質。 １１．前記タンパク質が分泌される、請求項１０に記載のタンパク質。 １２．前記タンパク質が組換えDNAにより発現される、請求項１０に記載のタ ンパク質。 １３．前記タンパク質が天然のタンパク質である、請求項１０に記載のタンパ ク質。 １４．FasΔTMを認識するがFasを認識しない、抗体。 １５．ポリクローナルおよびモノクローナルからなる群より選択される、請求 項１４に記載の抗体。 １６．実質的に精製されたFasΔTMおよび生理学的に受容可能な緩衝液を含む 、組成物。 １７．以下の工程を包含する、生物学的サンプル中のFasΔTMの存在を検出す る方法： ａ）該生物学的サンプルを得る工程； ｂ）該生物学的サンプルに抗Fas抗体を加える工程； ｃ）該生物学的サンプルを、該抗Fas抗体をFasΔTMと複合体化させる条件下に 維持する工程；および ｄ）形成される該複合体を検出する工程。 １８．前記生物学的サンプルが血清である、請求項１７に記載の方法。 １９．前記抗Fas抗体がFasΔTMに特異的である、請求項１７に記載の方法。 ２０．生物学的サンプル中のFasΔTMをコードするmRNAの存在を同定する工程 を包含する、該生物学的サンプル中のFasΔTMをコードするDNAの発現を検出する 方法。 ２１．前記FasΔTMmRNAを同定する方法がポリメラーゼ連鎖反応であり、そし てプライマーが貫膜領域をコードするmRNAに隣接する、請求項２０に記載の方法 。 ２２．前記FasΔTM mRNAを同定する方法がノーザンブロッティングである、請 求項２０に記載の方法。 ２３．患者に治療的に有効な量のFasΔTMを投与する工程を包含する、患者のF as仲介細胞死を処置する方法。 ２４．FasΔTMの内因性濃度を上昇させる工程を包含する、Fas仲介細胞死から 細胞を保護する方法。 ２５．前記FasΔTMが外因性である、請求項２４に記載の方法。 ２６．前記FasΔTMが前記細胞により発現される、請求項２４に記載の方法。 ２７．前記FasΔTMが組換え遺伝子により発現される、請求項２６に記載の方 法。 ２８．前記遺伝子の発現が誘導性プロモーターのコントロール下である、請求 項２７に記載の方法。