JPH09511121A

JPH09511121A - トマトキシログルカンエンドトランスグリコシラーゼ

Info

Publication number: JPH09511121A
Application number: JP7513686A
Authority: JP
Inventors: デ・シルヴァ、ジャックライン; ホワイトマン、サリー‐アン; ヘルヤー、スーザン・アマンダ; アロースミス、デヴィッド・アンドリュー
Original assignee: ユニリーバー・ナームローゼ・ベンノートシャープ
Priority date: 1993-11-10
Filing date: 1994-11-10
Publication date: 1997-11-11
Also published as: ATE236256T1; PT728208E; CZ136196A3; GB9323225D0; DK0728208T3; SK57696A3; US6215044B1; PL317046A1; AU698844B2; WO1995013384A1; HU9601232D0; HUT74598A; DE69432427T2; ES2196048T3; EP0728208B1; AU8112994A; EP0728208A1; CA2176133A1; DE69432427D1

Abstract

(57)【要約】キシログルカンエンドトランスグルコシラーゼ（ＸＥＴ）活性を有し、図１（配列番号２）に示したアミノ酸配列の２１〜２８９残基を本質的に含有し、又はこれと機能的に同等であるポリペプチド、これと同じポリペプチドをコードするヌクレオチド配列及びこのポリペプチドの多様な使用を開示する。

Description

【発明の詳細な説明】トマトキシログルカンエンドトランスグリコシラーゼ発明の分野本発明は植物酵素をコードするヌクレオチド配列、前記ヌクレオチド配列を含むベクター、前記ヌクレオチド配列を含む宿主、前記ヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列、酵素を生産する組換えＤＮＡ技術、及び植物の性質の改変方法に関する。発明の背景果実及び野菜の細胞壁は大部分がポリサッカライドであり、その主成分はペクチン、セルロース及びキシログルカンである（Selvendran & Robertson，IFR Re port 1989）。強さ及び柔軟性といった本質的な性質の組み込みを試みた、多数の細胞壁モデルが提案されている（例えば、Albersheim，1975 Sci．Am．232,81 -95; Albersheim，1976“The primary cell wall”,lant Biochemistry，3rd Ed ition，Academic Press; 及びHayashi，1989 Ann．Rev．Plant Physiol．& Plan t Mol．Biol．40，139−168）。キシログルカンはα−１，６−キシロシル側鎖で伸長的に置換された１，４− β−グルカンであり、１，２−β−ガラクトシル化されているものもある。キシログルカンは双子葉植物の初代細胞壁の大部分に見られるが、ある種の種子にも見られ、種子においてはキシログルカンは異なる役割をしている。初代細胞壁キシログルカンはセルロースミクロフィブリルと堅固に水素結合しており、これを分離させるには濃縮したアルカリ又は強力な膨脹剤が必要である。キシログルカンはセルロースミクロフィブリルとの間に架橋を形成し、セルロース／キシログルカン網が壁の主要な負荷耐久／弾性網を形成していると考えられている。ＤＣＢ変異懸濁培養細胞（セルロースを欠く細胞壁）は培地中にキシログルカンを遊離させており、キシログルカンが通常堅固にセルロースに結合していることが示唆される。初代細胞壁の加水分解はＩＡＡ誘導育成中に、生長した押しつぶし胚軸の暗部で実施されている（Wakabayashiら，1991 Plant Physiol．95．1070-1076）。壁キシログルカンのエンド加水分解は細胞の拡張を伴う壁の緩解に関与していると考えられている（Ｈａｙａｓｈｉ，先に引用）。キシログルカンの平均分子量はトマトの実が成熟する間に減少することもまた示されており、これは成熟過程に付随した組織の軟化に関与し得る（Huber,1983 J．Amer．Soc．Hort．Sci．108, 405−409）。例えば、キンレンカのようなある種の種子は、重量の３０％までキシログルカンを含有し、厚みのある子葉の細胞壁に貯蔵し、保存ポリサッカライドとして貯蓄し、発芽中に迅速に脱重合する。キシログルカンに特異的に作用するエンド１，４−β−Ｄグルカナーゼ（すなわちキシログルカナーゼ）は発芽中のキンレンカ（Tropaeolum majus L.）の種子より分離され、見掛けが同一になるまで精製されている（Edwardsら1986 J．B iol．Chem．261，9494）。精製されたキシログルカンはＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動において一つのポリペプチドのバンド（見かけの分子量、２９〜３１ｋＤａ）及び当電収束（当電点、５．０）を与える。酵素はキシログルカン及びエンド方式作用に対し絶対的な特異性を示し、これはタマリンド種子キシログルカンの加水分解による最終生成物の分析により測定された（Ｗａｋａｂａｙａｓｈｉら、先に引用）。酵素の天然基質はキンレンカ子葉保存キシログルカンであるが、インビトロにおいて初代細胞壁キシログルカンの加水分解も又見られる（Edwardsら、先に引用）。高基質濃度において、キシログルカンエンドトランスグリコシラーゼ（ＸＥＴ）活性が示されている（Fanuttiら、1993 ThePlant Journal 3，691−700）。このキンレンカキシログルカナーゼ／ＸＥＴ酵素のヌクレオチド配列はde Sil vaらによって国際特許出願WO 93/17101に示され、開示されている（1993 The Pl ant Journal 3，701−711）。類似した酵素活性は他の植物組織に検出され、エンドウの茎の異なる部分における生長の割合と正の相関を示す（Fryら、1992 Biochem．J．282,821−829）。ＸＥＴはミクロフィブリル内のキシログルカン鎖の切断及び再結合に応じ、これが植物細胞の膨脹の要求に対する壁の緩解を生じさせると提案されている。ＸＥＴ活性は又、トマトの実において示されており（キシログルカンオリゴサッカライドによる、キシログルカナーゼの見かけの活性化性）、成熟の“破壊（br eaker）”段階の２日後が最大であると報告されており（Machlachlan & Brady、 1992 Aust．J．Plant Physiol．19、137−146）、軟化の過程に関与し得る。本出願はＸＥＴ活性をコードするヌクレオチド配列のトマト植物からの単離を記述する。発明の概要第一の観点において、本発明は、図１（配列番号２）に示した実質的に２１〜２８９残基のアミノ酸配列、又はこの機能同等配列からなる、キシログルカンエンドトランスグリコシラーゼ（ＸＥＴ）活性をもつポリペプチドを供する。ここにおいて使用し、アミノ酸配列において適用する“機能同等配列”という語は、本発明の配列と同じ機能特性をもつが、わずかに異なる配列を持つアミノ酸配列の言及を意図する。一般に、例えば、“保存的”置換（ポリペプチドの機能には全く影響のない、配列中の一つのアミノ酸残基を非常に類似した性質をもつ他の残基に交換すること）がなされ得ることはよく知られている。機能同等なポリペプチド配列の例を図５（配列番号８）に示す。アミノ酸配列は図１に示され、図５は直接図６と比較される。さらに、一つ以上のアミノ酸残基は重要で有害な影響なしに削除及び添加され得る。そのような改変を進化論的に保存されていない配列の部分において特に作り得ることは、当業者には明らかであり得る。酵素前駆体も又“機能同等配列” の意味内に含まれ、成熟し、処理された、シグナル配列を欠く酵素も同様である。本発明の場合、図１の１〜２０アミノ酸残基はシグナル配列を構成し、そのため、酵素活性に本質的でないと考えられている。同様に、図５に示したアミノ酸残基１〜１８の配列は本質的でないシグナル配列を構成すると考えられている。そのため、特定の実施様態において、本発明は、ＸＥＴ活性を持ち、図１に示した１〜２８９残基の配列；図５に示した１９〜２８７残基のアミノ酸配列；又は図５に示した１〜２８７残基のアミノ酸配列を含むポリペプチドを供し得る。このような機能同等配列は、好ましくは本発明のアミノ酸配列の少なくとも８０％相同性、より好ましくは少なくとも８５％相同性、最も好ましくは少なくとも９０％相同性を示し得る。アミノ酸配列データー分析より、本発明者らは、本発明の配列の機能同等配列を比較的保存していると考えられる、多くのペプチド配列を識別した。好ましくは、機能同等配列は、実質的に以下に示す一つ以上のペプチド配列からなり得る（一般に完全に保存され得るが、一つまで、多くとも二つのアミノ酸の違いを含有し得る）： DEIDFEFLGN；SLWNADDWAT；FYSKNEYLFG；及びGTVTTFYLSS（各々、配列番号３〜６）望ましくは、ポリペプチドは、実質上、他の植物の誘導体より単離される。第二の観点において、本発明は、図１のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（配列番号１）及びその機能同等配列を供する。好ましくは、ヌクレオチド配列は図１に示したヌクレオチド配列又はトマト植物より入手可能な他の機能的に同等な配列よりなる。ここにおいて使用し、ヌクレオチド配列に適用する“機能同等配列”という語は、第１の観点におけるアミノ酸配列と同じ機能特性を持つポリペプチドをコードするヌクレオチド配列及び標準条件の下（Sambrookら，1989、Molecular Cloning: A Loboratory Manualに記載）に図１のヌクレオチド配列の相補的配列相補体とハイブリッド形成され得る相補的なヌクレオチド配列を言及することを意図する。好ましくは機能同等なヌクレオチド配列は図１のヌクレオチド配列と少なくとも７０％相同性、より好ましくは８０％相同性、及び最も好ましくは少なくとも８５％相同性を示す。機能同等なヌクレオチド配列の特定な例を図５（配列番号７）に示す。本明細書の目的のために、“機能同等配列”という語は、図１のヌクレオチド配列と標準条件下でハイブリッド形成する“アンチセンス”配列を又言及する。このような配列は本発明のヌクレオチド配列の発現のダウンレギュレーションに使用される。好ましくはこのようなアンチセンスの機能同等配列は図１のヌクレオチド配列の相補的配列と少なくとも７０％相同性、より好ましくは少なくとも８０％相同性、最も好ましくは少なくとも９０％相同性を示し得る。一般に、アンチセンスの機能同等配列はセンスの同等配列よりもより高い比率の相同性を示すことが好ましい。これは、センス構造は、機能的に保存されたアミノ酸の代用となり、保存されたアミノ酸の代用を含有し得るポリペプチドに翻訳され得るからである。これに対し、アンチセンス構造は、多くの場合、ポリペプチドよりむしろヌクレオチドレベルで機能するため、塩基配列の違いはいずれも作成の有用さを低減させる傾向にある。当業者は、本発明のヌクレオチド及びアミノ酸配列に関する、ここにおける開示の利益について、本発明のヌクレオチド配列と機能的に同等な他のヌクレオチド配列を検出し、単離し、クローン（例えばＰＣＲによる）することは簡単であると理解するであろう。適した方法には、例えば、Sambrookらによる教示がある。このような常法の特に有用な点は上記に開示したペプチド配列であり得る。又、本発明のポリペプチド（又はそれらより誘導されるポリペプチド）は推定される機能的に同等な配列の免疫学的スクリーニングにおける使用のための抗体を生成するのに使用され得る。本発明の第二の観点の配列は、さらに、宿主細胞での発現が可能な、適したプロモーターを含有する５′非翻訳部位を含むことが好ましい。本発明は又、本発明の第二の観点のヌクレオチド配列を含むベクター及び本発明のヌクレオチド配列を含む宿主細胞を供し得る。一つの実施様態において、ベクターはヌクレオチド配列を発現可能であり、そのため、本発明のポリペプチドを生産し得る（他のベクターはアンチセンスの機能的に同等なヌクレオチド配列を含み得る）。そのため、更なる観点において、本発明はＸＥＴ活性を持つポリペプチドを生成する方法を供し、以下の段階よりなる：上記のポリペプチドの発現を管理することが可能なベクターを適した宿主細胞に導入し、ポリペプチドを発現させるために、適した培養条件において宿主細胞及び／又は宿主細胞の後代を生長させ、次に、培地及び／又は宿主細胞よりポリペプチドを得ること。本質的ではないが、宿主細胞は真核生物が好ましいが、これは真核宿主は十分に機能的な形態において、より酵素を発現しやすいからである。好ましいベクターは、植物において、本発明の配列を導入し、発現するのに使用され得るベクターとして知られている。更なる観点において、本発明は、本発明の第二の観点の塩基配列の宿主細胞の導入を含む、宿主細胞の形質転換の方法を供する。宿主細胞は植物細胞が好ましい。形質転換した植物細胞は植物の部分よりなることが好ましい。当業者には明らかであるが、本発明のヌクレオチド配列を植物又は植物の部分へ導入することは植物又は植物の部分の特徴を変えることを期待し得る。なお、更なる観点において、本発明は、植物又は植物の部分におけるＸＥＴ活性レベルを変えるために、本発明のヌクレオチド配列又はその機能同等配列の有効な部分を植物又は植物の部分に導入することを含む、植物又は植物の部分の特徴を変える方法を供する。このような方法は植物又は植物の部分におけるＸＥＴ活性レベルを減少させ、典型的にはアンチセンス配列を導入することによることが好ましい。効率的な部分は、好ましくは本発明のヌクレオチド配列の少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも７０％、最も好ましくは少なくとも９０％含有し得る。他の観点において、本発明は、上記の方法により改変された特徴を持つ遺伝学的に操作された植物、又はそのような植物の後代を供する。改変された植物は、本発明の方法を実施するのに十分な知識があり、又、キシログルカンが構造的な機能を有している（すなわち、双子葉植物及びイネ科でない単子葉植物）商業的に重要な植物（果物又は野菜植物を含む）のいずれかであることが好ましい。このような植物を含有する：アルファルファ、リンゴ、ブロッコリー、キャベツ、ニンジン、カリフラワー、セロリ、綿、クランベリー、キュウリ、ナス、アマ、ブドウ、セイヨウワサビ、キウイ、レタス、マンゴ、メロン、脂肪種子ナタネ（oilseed rape）、パパイヤ、エンドウ、モモ、コショウ、プラム、ポプラ、ジャガイモ、ラズベリー、大豆、トウヒ、イチゴ、サトウダイコン、サツマイモ、タバコ、トマト及びクルミ。植物全体の特徴を改変する必要はないことを認識し得る。植物の部分（例えば、種子、果実）の特性の改変は望ましい。これは、例えば、導入した配列の翻訳を調節するために、組織特異的プロモーターの使用によりなし得る。本発明の方法はＸＥＴ活性のレベルの変更を期待するものであり、そのため、細胞壁の架橋（キシログルカン分子よりなる）の破壊及び再形成の頻度により細胞を膨脹させ得る壁の緩解をもたらす。更に、キシログルカンの重要な構造的役割の観点より、大きさ、生長の速度、及び、テクスチャー、とりわけ成熟期間のテクスチャーを含む、改変され得る性質を期待し得る。本発明は次に図示した例及び図の参考例によってさらに説明される：図１は本発明のアミノ酸及びヌクレオチド配列（クローンＢ１）を示している。図２は本発明のポリペプチドの部分的なアミノ酸配列及びそれらの機能同等配列を、２つの従来技術のアミノ酸配列と比較し、示したものである。図３は図１に示した配列を決定するのに使用した配列戦略を示している（E＝E coRI，P＝Pst，H＝HindIII）；図４は本発明のヌクレオチド配列（クローンＢ２）を決定するのに使用した配列戦略を示している（E＝EcoRI，P＝Pst）；図５は本発明のヌクレオチド配列（クローンＢ２）及びアミノ酸配列を示している；図６は２つの機能的同等なアミノ酸配列の比較を示したものである（点は同一アミノ酸；三角は予想される切断部位）；及び図７及び図８は多種のプラスミド構造の概略図である。実施例実施例１キンレンカ種子ＸＥＴをコードするｃＤＮＡの完全な配列にしたがって（係属中の国際特許出願WO 93/17101に記載されている）、トマトの類似の遺伝子フラグメントのＰＣＲ増幅を試みるために、プライマーを設計した。プライマーの内、２つ（ＮＸＧ２Ｈ及びＮＸＧ２Ｂ、以下に示す）はBacillus maceransのβ− １，３−１，４−グルカナーゼ（アミノ酸配列ＤＥＩＤＩＥＦＬＧを持つ領域）と相同性の、ある領域と部分的に一致していた。他のプライマーはヒスチジン残基に近接又は囲んだ領域に相当した；（これらはしばしば加水分解酵素の活性部位に存在し、類似の機能の酵素の活性部位はしばしば一次配列相同性を持つ）。これらはアミノ酸配列ＰＮＨＮＲＶＤ（プライマーＮＸＧ１Ｈ）、ＨＤＥＩＤＩＥ（プライマーＮＸＧＨ２Ｈ及びＮＸＧ２Ｂ）、ＨＬＷＦＤＰＴ（プライマーＮＸＧ３Ｈ及びＮＸＧ３Ｂ）及びＴＲＤＨＴＬＴ（プライマーＮＸＧ４Ｂ）に相当する。ＮＸＧ１Ｈ５′ＡＡＧＣＴＴＣＣＴＣＡＡＣＡＴＣＡＡＡＧＧＧＴＡＧＡ３′ （センス）ＮＸＧ２ＨＡＡＧＣＴＴＣＡＴＧＡＴＧＡＡＡＴＣＧＡＴＡＴＴＧＡ（センス）ＮＸＧ２ＢＧＧＡＴＣＣＴＣＡＡＴＡＴＣＧＡＴＴＴＣＡＴＣＡＴＧ（アンチセンス）ＮＸＧ３ＨＡＡＧＣＴＴＣＡＴＴＴＡＴＧＧＴＴＴＧＡＴＣＣＡＡＣ（センス）ＮＸＧ３ＢＧＧＡＴＣＣＧＴＴＧＧＡＴＣＡＡＡＣＣＡＴＡＡＡＴＧ（アンチセンス）ＮＸＧ４ＢＧＧＡＴＣＣＧＴＴＡＡＣＧＴＧＴＧＧＴＣＴＣＧＴＧＴ（アンチセンス）（各々、配列番号９〜１４）これらのプライマーは完全にキンレンカの配列に関して保存しており、ＰＣＲ生成物のクローニングを促進するために５′末端の制限酵素認識部位を組み込んだ。しかし、上記プライマーの組み合わせのいずれを使用しても、ＰＣＲによるトマトＤＮＡの増幅の試みは全て失敗に終わった。推測されたキンレンカ種子ＸＥＴのアミノ酸配列は、遺伝子クローン及びArab idopsis thalianaのｃＤＮＡ（medfordら、1991 the plant Cell 3，359−370）により推測された配列とある程度相同性のある領域を占めた（１５１アミノ酸重複部分のうち４２％相同性）。遺伝子クローンによりコードされているポリペプチドはmeri−５と定義され、その機能は現在のところ不明である。キンレンカＸＥＴ及びmeri−５の間に保存されている、これらの二つの領域に相当する変性したオリゴヌクレオチド（ＸＧ１１７及びＸＧ１６２、以下に示す）の混合物を用いて、トマトＤＮＡのＰＣＲの増幅を試みることを決定したが、先の失敗及びmeri−５の機能に関する知識の欠如（もしあったとしても）の見地より、成功の期待はほとんどなかった。驚くべきことに、ＰＣＲはmeri−５及びキンレンカＸＥＴ両方に重要な配列相同性を持つ１２２ｂｐのトマト遺伝子ＤＮＡフラグメントの増幅に成功した。実験は以下の記載のとおりに行った。遺伝子ＤＮＡは若いトマト葉組織（ＶＦ１４３Ｂ−７８７９品種、Tomato Genetics Stock Centre，Department of Vegetable Corps，University of Cali fornia，Davis，CA95616より入手）からDellaportaら（1983，Plant Mol．Bio． 1、19−21）により記載された方法により分離した。変性したオリゴヌクレオチド混合物は保存された領域ＤＥＩＤ（Ｉ／Ｆ）ＥＦＬＧ（ＸＧ１１７）及びＨＬＷＦＤＰＴ（ＸＧ１６２）（以下に示す）に相当するように設計された。ＸＧ１１７５′ＧＡ（Ｃ／Ｔ）ＧＡ（Ａ／Ｇ）ＡＴＩＧＡ（Ｃ／Ｔ）（Ａ／Ｔ）Ｔ（Ａ／Ｃ／Ｔ）ＧＡ（Ａ／Ｇ）ＴＴ３′（センス）ＸＧ１６２３′ＧＴ（Ｇ／Ａ）（Ｇ／Ａ）Ａ（Ｇ／Ａ／Ｔ／Ｃ）ＡＣＣＡＡ（Ｇ／Ａ）ＣＴ（Ｇ／Ａ）ＧＧＩＴＧ５′（アンチセンス）（各々、配列番号１５及び１６）変性したオリゴヌクレオチドは次に以下の反応においてプライマーとして使用された（各反応は総反応容量１００μｌ）：１〜２μｇの遺伝子ＤＮＡ；各１００ピコモルのＸＧ１１７及びＸＧ１６２；ｄＧＴＰ，ｄＡＴＰ，ｄＴＴＰ及びｄＣＴＰを全て０．２ｍＭ；１０ｍＭトリス−塩酸ｐＨ８．３；５０ｍＭ塩化カリウム；１．５ｍＭ塩化マグネシウム；０．０１％（Ｗ／Ｖ）ゼラチン；２．５単位ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Stratagene）。熱サイクルはMJ Researchプログラム化熱制御器において、９４℃、２分間の初めの変性段階、次に９４℃、１分を３５サイクル、４０℃、２分及び７２℃、２分で実施した。増幅生成物は０．５μｇ／ｍｌ臭化エチジウムを含む２％アガロース／ＴＢＥゲル上で分取し、ＵＶ透過器により観察した。ＤＮＡフラグメントは、Sambrookら（Molecular Cloning：実験室用マニュアル）により記載された方法により、ＤＥＡＥ紙を使用したゲルにより精製した。ＰＣＲ主生成物は１２２ｂｐの大きさであることが分かった。これをpT7Blue （AMS Biotechnologyより入手）に連結させ、ＤＮＡ配列分析に使用した。４つの配列決定されたクローンのうち、３つは同一のＤＮＡ配列（ＰＸ３）を持ち、１つはＤＮＡ及び推測されたアミノ酸配列（ＰＸＩ）（図２に示す）の両方において異なった。図２において、meri−５及びキンレンカＸＥＴの比較により、Ｔｏｍ３及びＴｏｍ１は各々ＰＸ３及びＰＸ１の推測されたアミノ酸配列に相当した。より広範な配列情報を得るために、トマトｃＤＮＡ５′伸張ライブラリーをCl ontech Laboratories Inc.より入手した。（トマトＶＦＮ８品種の“Ailsacra ig”の成熟したの果実の“破壊”段階より得たｍＲＮＡを使用して調製された）；これをオリゴ−（ｄＴ）及びｃＤＮＡを合成するランダムプライマーにより反応を開始させ、ファージラムダｇｔ１１中に入れた。１２２ｂｐＰＣＲフラグメントを、放射能標識したプローブとして使用し、このライブラリーより約２００，０００ｃＤＮＡクローンがスクリーニングされた。簡潔に、２５〜３０ｎｇのゲル精製された１２２ｂｐの増幅生成物を９μｌの水中で１００℃、５分に加熱して変性し、次に氷冷した。フラグメントは、Unit ed States Biochemicals Inc．（シークエナーゼｖ２．０）により供されたキットを用い、³²Ｐ−ｄＣＴＰ（Amersham International plc）で放射能標識した。組み込まれなかったヌクレオチドをＳｅｐｈａｄｅｘＧ−５０カラムを通し、クロマトグラフィーにより除去した。このプローブを使用し、反応陽性の多くのクローンをｃＤＮＡライブラリーに検出した。これらは上層アガロースより０．１〜１ｍlのＳＭ（５０ｍＭトリス−塩酸ｐＨ７．５，１０ｍＭ硫酸マグネシウム，１００ｍＭ塩化ナトリウム，０．０１％ｗ／ｖゼラチン）中に溶出され、さらにスクリーニングの過程により精製された。挿入物はストック懸濁液の直接ＰＣＲ又は分離したＤＮＡの消化のいずれかによりバクテリオファージより分離した。ストック懸濁液のＰＣＲのために、精製したバクテリオファージストック（５ μｌ、１０⁵〜１０⁶ｐｆｕ）を１００℃で、５分間加熱し、２０ｐｍｏｌの各ｇｔ１１５′及び３′オリゴヌクレオチド（Clontech）を、変性させたオリゴヌクレオチドの代わりに用いたのを除き、先に示したのと同様の溶液に添加した。熱サイクルは以下のとおりであった：９４℃において２分、９４℃において１分を２５サイクル、５５℃において１分及び７２℃において２分、次に最終段階として７２℃において５分。増幅生成物は上記のように１％アガロースゲルによりゲル精製した。ゲル精製したＰＣＲ増幅生成物をｐＴ７ＢｌｕｅＰＣＲクローニングベクター（AMS Biotechnology Limited）に連結し、製造者説明書にしたがって、コンピテントＥｃｏｌｉ中へ形質転換した。組換えプラスミドを含むコロニーは５０μｇ／ｍｌアンピシリン及び１２．５ μｇ／ｍｌテトラサイクリンを含む３０ｍｌＬｅｎｎｏｘ肉汁に接種するために使用した；３７℃で一晩生長させた後、Qiaggen Inc.より供された“Plasmidm idi”キットを用いて培養体より精製したプラスミドＤＮＡを得た。クローン生成物の制限分析はAmersham International plcより供された酵素及び緩衝液を使用して実行し、続いてアガロースゲル電気泳動により行った。ＤＮＡはUnited States Biochemicals Inc．(シークエナーゼｖ２．０)により供給されたキット及び手順を使用して配列決定した。組換えプラスミド（Qiag enの供給）を直接的に配列決定するか又は一本鎖の鋳型を生成するために制限フラグメントをＭ１３にサブクローンさせた。反応生成物は３０ｃｍ×４０ｃｍ× ０．４ｍｍポリアクリルアミドゲル上でＢＲＬ６％アクリルアミド溶液を使用して分取した。ＩＢＭコンピューターのＤＮＡｓｔａｒソフトウエアを用い、合成された配列の分析を行った。クローンは５００乃至１４００ｂｐの大きさで変化することが分かった。ｔＸＥＴ−Ｂ１（又は単に“Ｂ１”）と定義された一つのクローンは、Ｍ１３へのサブクローニングを容易にする内部ＨｉｎｄIIIＩＩＩ及びＳａｃＩ認識部位をもつことが分かった。内部プライマーも又、クローンを十分にそして両方向に配列決定するために、使用された（図３）。これらの内部プライマー（８−ＴＨ，８ −ＨＳセンスプライマー及び８−ＴＢ，８−ＨＴアンチセンスプライマー）の配列は次の通りである：８−ＴＨ：５′ＣＧＡＴＧＣＡＧＣＴＧＧＡＡＴＴＴＣＡ３′ ８−ＴＢ：５′ＡＧＴＴＴＧＡＧＣＴＧＣＡＴＡＴＣＧＡＡ３′ ８−ＨＳ：５′ＴＴＴＧＡＴＣＣＣＡＣＣＴＣＧＣＣＧＴＴ３′ ８−ＨＴ：５′ＣＡＧＣＴＧＡＣＣＡＡＡＣＡＣＡＡＧＣＡ３′ （各々、配列番号１７〜２０）他のプライマーの配列は：Ｔ３：５′ＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧＧＧＡ３′ Ｔ７：５′ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ３′ Ｕ１９：５′ＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣＧＴ３′ （各々、配列番号２１〜２３）ＵはＭ１３（−４０）プライマーを意味する。初めに、２つの配列が分かったが、各々ラムダのストックの異なるＰＣＲ増幅により得られた。それらは推定のコード領域内において２塩基異なった。これらの違いは恐らくＰＣＲに使用した熱安定ＤＮＡポリメラーゼの不正確さによるものであるため、完全な配列データを得るために、ラムダＤＮＡを調製し、ｃＤＮＡをpBluescript SK+に連結した（図１）。クローンＢ１の完全なヌクレオチド配列を推測されたアミノ酸配列とともに図１に示した。クローンＢ１の推測される解読開始フレームは分子量が３２．７ｋＤａと予測される２８９アミノ酸ポリペプチドをコードしている。これはキンレンカＸＥＴと重複する２７０アミノ酸の３９％同一であり、meri−５の重複する１８６のアミノ酸の５９％同一であった。シグナルペプチドは１〜２５位のアミノ酸の疎水性をもとに予測され、アミノ酸配列の統計的な分析により前駆体が２０位及び２１位のアラニン及びアスパルテート残基の間で切断されることが予測された（Von Heijne，1983 Eur．J．Bio chem.113,17−21）。遺伝子ＰＣＲフラグメント（１０３〜１２９アミノ酸）に相当するクローンＢ１領域は双方のゲノムフラグメント配列を比較したとき、推測されたアミノ酸配列の違いを示す。これはクローンＢ１がトマトの多遺伝子ファミリーの一部であることを示唆する。推測されたＮ−グリゴシレーション部位（Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ；１０５−１０７アミノ酸）が認識され、これはmeri−５及び遺伝子フラグメントにも存在するが、キンレンカＸＥＴには存在しない。２番目に得られた、ｔＸＥＴ−Ｂ２（“Ｂ２”と省略）と定義されたクローンは、クローンＢ１よりも大きく、しかしサブクローニングに有用な制限部位を持たなかったため、完全なＤＮＡ配列決定のためにいくつかの内部プライマーを使用した。クローンＢ２の配列決定のために使用した戦略を図４に概略として示す。図４において、Ｅ＝ＥｃｏＲＩ部位、Ｐ＝ＰｓｔＩ部位；（ａ）は使用したベクタープライマーの配列を示し、（ｂ）及び（ｃ）は内部プライマーの配列を示す。以下のプライマーを含む、多くのプライマーを使用した：１６−１：５′ＡＡＴＡＴＣＡＧＣＧＧＡＡＡＣＡＧＧＧ３′ １６−１Ｒ：５′ＣＣＣＴＧＴＴＴＣＣＧＣＴＧＡＴＡＡＴＴ３′ １６−２：５′ＣＴＡＴＴＡＧＣＡＴＣＴＧＣＡＣＡＧＴＡ３′ １６−２Ｒ：５′ＴＡＣＴＧＴＧＣＡＧＡＴＧＣＴＡＡＴＡＧ３′ １６−３Ｒ：５′ＧＧＡＧＧＡＣＧＧＧＴＧＡＡＧＡＣＡＧＡ３′ １６−４：５′ＧＴＧＴＡＡＧＧＴＡＧＴＣＣＴＧＡＴＧＡ３′ １６−４Ｒ：５′ＴＣＡＴＣＡＧＧＡＣＴＡＣＣＴＴＡＣＡＣ３′ （各々、配列番号２４〜３０）２８７アミノ酸の推測された解読開始フレームが明らかにされた。クローンＢ２の決定されたヌクレオチド配列及び推測されたアミノ酸配列を図５に示す。図６はクローンＢ１のｃＤＮＡ配列及びその推測されたアミノ酸配列を示したものであり、クローンＢ２の推測されたアミノ酸配列と直接比較している（図６において、点は明らかにされたアミノ酸を、矢印は予測されたシグナルペプチド切断部位を意味する）。クローンＢ２の予測されたシグナルペプチドはクローンＢ１のシグナルペブチドよりも２アミノ酸短く、２６９アミノ酸からなる成熟ポリペプチドが残った。推測されるＮ−グルコシレーション部位はクローンＢ１と同じ位置に見つけられた。予測された成熟ポリペプチドのクローン８及び１６の間に１６アミノ酸の違いが認められたが、その内１４は保存されていた。疎水性クラスター分析（Hydrophobic Cluster Analysis）（HCA，Gaboriaudら、1987 FEBS Letters 224,149−155及びHenrissatら、1988 Biochem．J．255，9 01−905）はクローンＢ１によりコードされているポリペプチドと他の既知のタンパク質との可能性のある配座相同性を観察するために行われた。ＨＣＡプロットは、WordPerfect^TM５．１マクロを使用し、α−ヘリクスの改良した２Ｄ表示を用い、キンレンカＸＥＴ、meri−５及びトマトクローンＢ１の推測されるアミノ酸配列より得られた（Henrissatら、先に引用）。疎水性クラスターを手動で取り囲み、手動で整列し、ＨＣＡ相同性スコアを算出した。類似の折りたたみは、（ａ）配列の長さのほとんどにわたる、“保存されたクラスターの連続した存在”及び（ｂ）全ての３つの比較についてＨＣＡ相同性スコアすべてにわたり７５％より大きい（meri−５とトマトＸＥＴクローンＢ１，８６％；キンレンカＸＥＴとトマトＸＥＴクローンＢ１、８０％；meri−５とキンレンカＸＥＴ、７８％）ことをもとに、３つのタンパク質全てに予測された。これは、１次配列相同性及び２次構造予測（Kyte & Doolittle 1982，J Mol B iol 157,105−132）のデータを支持するものであり、そのデータはこれら３つのタンパク質は広く類似した折れを持ち、そのため、詳細は異なるが、類似の機能を持つ傾向にあることを示唆している。クローンＢ２をE．coliに発現させる試みを決定した。これは以下の実施例２に記載する。実施例２クローンＢ２をＥ．ｃｏｌｉに発現させるための操作ＢａｍＨＩ認識配列を、突然変異誘発性プライマー（１６−１Ｂ：ＣＣＣＴＴＧＧＡＴＣＣＧＣＴＡＴＡＡＴＴ配列番号３１）及びｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプライマー（Ｔ３；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用し、ＰＣＲにより推定の成熟タンパク質のＮ−末端コード配列の近くに導入した。反応条件：ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ＋中、１ｎｇＸＥＴクローンＢ２、各々０．４ｍＭｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ、２５ｐｍｏｌの各プライマー、１倍のＶＥＮＴポリメラーゼ緩衝液及び０．２５単位ＶＥＮＴＤＮＡポリメラーゼ（ New England Biolabs Inc.）。熱サイクルは９３℃において２分、９３℃において１分を２５サイクル、５５℃において３０秒及び７℃において１分であった。Ｅ．ｃｏｌｉにおける組換えトマトＸＥＴの過発現（over-expression）Ｅ．ｃｏｌｉにおけるトマトＸＥＴの発現はＱＩＡＧＥＮＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓ^TMシステムを使用し、行われた。突然変異を起こさせたＰＣＲ生成物のＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄIIIフラグメントを発現ベクターｐＱＥ３０に連結し、ｐＲＥＰ４抑制プラスミドを含有するＥ．ｃｏｌｉＭ１５細胞に形質転換した。発現ベクターはＱＩＡＧＥＮより供されたＮｉ−ＮＴＡ（Ｎｉ−ＮＴＡはニッケル−ニトリロトリ−酢酸である）樹脂に高い親和性を有する、６個のヒスチジンを付けたＮ−末端を取り込むことができる。細胞は適当な抗生物質を含むＬｅｎｎｏｘ肉汁で生長させ、６００ｎｍにおける光学濃度が０．７〜０．８のとき２ｍＭのＩＰＴＧで誘導した。その後、生長を３〜５時間続けた。分析のために、０．５ｍｌの培養体より細胞をペレットにし、サンプル緩衝液中で沸騰させ（Laemmli 1970 Nature 227，680−685）、次にＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（１０％）に泳動させた；分離したタンパク質をクーマシーブルーで染色した。染色されたタンパク質の分離は“The QIAexpressionist”第２版（1992;QIAGEN Inc.）の手順４に従い行った。組換えトマトＸＥＴ蛋白の精製及び再生組換えトマトＸＥＴを“The QIAexpressionist”手順７に記載されたＮｉ−ＮＴＡ樹脂の変性条件の下、精製したが、最終的な洗浄の後、タンパク質が結合したカラムを６Ｍ尿素、０．５Ｍ塩化ナトリウム、２０％グリセロール、４０ｍＭトリス−塩酸ｐＨ７．４で平衡させた点は異なった。上記の溶液のＦＰＬＣ−媒介６Ｍ−１Ｍ尿素グラジエント（０．２５ｍｌ／分の割合で２４ｍｌ）を次に使用し、結合タンパク質を再生し、１０ｍｌ中１Ｍ尿素、０．５Ｍ塩化ナトリウム、２０％グリセロール、４０ｍＭトリス−塩酸ｐＨ７．４、２５０ｍＭイミダゾールで溶出した。ＸＥＴ活性の測定方法 ³Ｈ−標識したＸＧオリゴサッカライドはS C Fry，(University of Edinburgh )より入手し、重合ＸＧへの結合はＦｒｙら（1992 Biochem．J．261，9489−949 4）により記載された方法で測定した。タンパク濃度はＢｉｏｒａｄにより供されたキットを使用して測定した。Ｎ−末端アミノ酸配列精製した組換えタンパク質は、高品質の試薬を用い、上記の電気泳動を行った。次にそれらをＰｒｏｂｌｏｔｔ^TM膜（ＰＶＤＦｍａｔｅｒｉａｌに由来し、ＡＢＩより供された）上で電気ブロット（０．５Ａ，２時間）し、１％クーマシーブリリアントブルー，５０％メタノールで染色した。ブロットしたタンパク質は、Cottinghamら（1988 Biochim．Biophys．Acta 956，201−207）により記載された方法で、ＡＢＩガス相シークエンサー７４０型により、液体更新パルスにより連続エドマン分解を行った。組換えトマトＸＥＴの発現及び特徴トマトＸＥＴは精製を促進するためにＮ−末端に６個のヒスチジン標識を持ち、Ｅ．ｃｏｌｉに発現された。予想される分子量（３２ｋＤａ）の標識されたタンパク質は不溶分画に見いだされた；発現培養体の位相差顕微鏡検査により各々の細胞において強力な反射体が示され、不溶性の含有物の存在を示唆するものであった（データ非表示）。変性条件下での大規模な精製の後で、標識されたタンパク質はＮ−末端アミノ酸配列決定に付された。得られた配列（ＭＲＧＳＨＨＨＨＨＨＧＳＡＤＮＦＹＱＤＡ配列番号３２）は組換えトマトＸＥＴとしてのタンパク質の識別及びＮ−末端に６個のヒスチジン標識が存在することの両方を確信した。組換えトマトＸＥＴは逆の尿素グラジエントによりＮｉ−ＮＴＡアガロース樹脂に結合している間、再生された。次にカラムからの溶出液１５μｌを³Ｈ−ＸＧオリゴサッカライド（ＸＧＯｓ）の重合ＸＧへの組み込みのために検定した：約４００Ｂｑの³Ｈ−ＸＧＯｓがｋＢｑあたり、時間あたり、μｇタンパク質あたり組み込まれた。０．５Ｍ塩化ナトリウム、５０ｍＭトリス−塩酸ｐＨ７．２、２０％グリセロールにより透析した後、特異的活性が約７００Ｂｑ／ｋＢｑ時 μｇに増大した。クローンＢ２は精製を促進するため、見かけのＮ−末端シグナルペプチドが６個のヒスチジン標識で置換され、Ｅ．ｃｏｌｉに過発現された。次に精製及び再生し、組換えタンパク質は放射線標識されたＸＧオリゴサッカライドの重合ＸＧへの組み込みの触媒を可能にし、組換えタンパク質がＸＥＴであることを確信した。再生されたＸＥＴの特異的活性は比較的低かった；再生ＸＥＴが７００Ｂｑ／ｋＢｑμｇであるのと比較して、生長したトマト植物からの茎粗抽出物はＸＥＴ特異的活性が約１００Ｂｑ／ｋＢｑ時μｇであった。組換えタンパク質は９０％よりも大きい純度であるので、これは、タンパク質のほとんどが正確に再生されていないことによるものであると仮定できる。キンレンカ種子ＸＥＴとは異なり、推定のＮ−グリコシレーション部位は両方のクローンのアミノ酸配列に存在する。書き留めるべき興味深いことに、グリコシレートタンパク質でない、Ｅ．ｃｏｌｉに組換え発現されたものが活性のあるＸＥＴであった。このことはグリコシレーションはインビトロのＸＥＴ活性には必要ではなく、インビボでのその役割についての問題を生じることを示している。キンレンカ種子ＸＥＴのグリコシレーションの欠損は貯蔵保留の流動性におけるその専門的な役割を反映し得る。植物におけるＸＥＴの機能の証明は急速に増大している。ＸＥＴが植物の生長に役割を果たしているという仮定はエンドウの茎の長さ（FryらBiochem．J．282 ，821−828）及びメイズの根（Pritchard 1993 J Exp．Bot．44 1281−1289）の生長との相関により支持される。細胞を膨脹させるために細胞壁を緩める作用をすると考えられている。ＸＥＴは又、実の熟成に関与するるらしく、トマト、エンドウ（発明者らの非公開所見）及びキウイ（Fry 1993 Current Biology，3（番号６），355−357）のような様々な実においてそのレベルの変化によって示唆されている。ここで、ＸＥＴは堅固に包まれた細胞壁の網と他の酵素との接触を改善し得る。これは小さく、かさばらないＸＥＴの性質により支持され得る（Edwardsら、1986 J．Bio l．Chem．261，9489−9494）。代わりになるものとして、ＸＥＴは果物が成熟する間に生じるキシロクルカンの脱重合にて（おそらく他の細胞壁の加水分解酵素との結合において）関与し得る。実施例３上記の組換えＤＮＡの作業に加えて、トマト植物からＸＥＴ活性を持つポリペプチドの単離及び精製の試みを行った。段階１：ＸＥＴ活性の測定方法様々な粗トマトの実の抽出物のＸＥＴ活性は³Ｈ−標識したキシログルカンオリゴサッカライドのキシログルカンポリマーへの組み込みによって測定した。この方法はトランスグルコシラーゼ活性の測定である。各測定は以下の成分を含有した：１０μｌ０．２ＭＮａ−Ｍｅｓ，ｐＨ６．０（Ｎａ−Ｍｅｓとは２−［Ｎ−モルフォリノ］エタンスルホン酸ナトリウムである）、１０μｌ８ｍｇ／ｍｌキシログルカン及び５μｌ［³Ｈ］ＸＧＯ（０．７ＫＢｑ）。分析物を２５℃で１時間インキュベーションし、次に１００μｌの２０％ギ酸を添加した。測定混合物を次に５×５ｃｍ円状セルロース濾紙の上に点下した（Whatmam 3MM Chromatography paper）。これはキシログルカンポリマー（［³ Ｈ］ＸＧＯ標識又は非標識のどちらか）がセルロース濾紙に結合し、［³Ｈ］ＸＧＯオリゴサッカロイドが結合し得ないことに基づいている。濾紙を乾燥させ、結合していない［³Ｈ］ＸＧＯを、３０分間水道水を流すことにより洗浄して除去した。濾紙を再び６０℃で乾燥させ、次に丸め、表面を外にし、シリンダーにいれ、２２ｍｌのシンチレーションバイアルに移した。シンチラント（２ｍｌの Betamax ES）を添加し、濾紙の³Ｈをカウントした。この方法は本質的に上記のＦｒｙら（１９９２）により記述された方法である。段階２：トマト果皮からのＸＥＴの抽出様々な抽出緩衝液を使用し、それらの効果を評価した。ＸＥＴは０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．２により効率的に抽出されることが分かった。また、ＸＥＴ活性の保持はイオン強度に高く影響されることがわかり、活性はクロマトグラフィー緩衝液などのイオン強度が０．２Ｍより小さくなると失われた。段階３：精製開始物質の選択生長及び成熟の全ての段階より採取したトマト果皮（Lycopersicumesculentum ，var.Moneymaker）組織より粗抽出物を作った（０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．２中）。全ての活性又は、特異的な活性を発現させていても、小さい青い果実（直径３５ｍｍより小さい）が最も高いＸＥＴ活性を有することが（いくつかの実験から）一貫して明らかにされた。そのため、小さい青い果実の果皮を精製の開始物質として用いた。段階４：硫酸アンモニウムの沈殿直径が３５ｍｍ未満の、小さい青い果実の果皮組織（１００ｇ）を採取し、液体窒素で冷凍し、−２０℃又は−７０℃で保存した。この組織を配合機の中で１ｇに対し、１．０％（ｗ／ｖ）不溶性ＰＶＰ（ポリビニルピロリドン）とともに１．５容の０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．２で均質化した。均質化させたものを、細胞壁酵素を拡散させるために１時間４℃で撹拌した。不溶性の物質をＳｏｒｖａｌｌＲＣ５Ｂ遠心器とＳＳ３４ローターを使用し２０，０００ｇ、３０分間、４℃において遠心することにより除去した。上清はガラスウールを通し、硫酸アンモニウム（６０．３ｇ／１００ｍｌ）溶液を添加することにより、９０％まで硫酸アンモニウム飽和させた。混合物を４０分、４℃で撹拌し、沈殿したタンパク質を遠心分離により回収した（３８０００ｇ、３０分、４℃）。硫酸アンモニウムで沈殿されたタンパク質は、再懸濁しないで−２０℃で保存した。段階５：Ｓ−セファロース陽イオン交換クロマトグラフィー０〜９０％硫酸アンモニウムで沈殿されたタンパク質を、１ｍＭＥＤＴＡ、２０μｇ／ｍｌキモスタチン、１ｍＭＰＭＳＦを含む０．２Ｍ塩化ナトリウム（緩衝液Ａ）を含む１０ｍｌの５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５．３で再懸濁した。再懸濁したペレットを２．５ｌの緩衝液Ａで３，５００Ｍ^Γ分離透析管を使用し、２時間透析した。サンプルを５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５．３、１ｍＭＥＤＴＡで希釈し、Ｓ−セファロースカラムに注入するのに適した値へ伝導性を下げた。サンプルを３８，０００ｇ、１５分間、４℃で遠心し、次に７ｍｌを、緩衝液Ａで平衡させたＳ−セファロース高速カラム(S-Sepharose Fast Flow column)（Pharmacia）に注入した。非結合タンパク質が全て除去されるまで、カラムを緩衝液Ａで洗浄した（流速１ｍｌ／分）。結合したタンパク質をカラムの１０容量の緩衝液Ｂ（緩衝液Ａと同様であるが、１Ｍ塩化ナトリウム）の０〜１００％グラジエントにより溶出した。画分（２ｍｌ）を回収し、ＸＥＴ活性を測定した。段階６：コンカナバリンＡ親和性クロマトグラフィー高いＸＥＴ活性をもつＳ−セファロースイオン交換クロマトグラフィーによる画分をプールし、−２０℃で貯蔵した。コンカナバリンクロマトグラフィーの前に、画分を１ｍＭ塩化マグネシウム及び塩化マンガンに入れた。Ｓ−セファロースのプールを遠心し、上清を０．２Ｍ塩化ナトリウム、１ｍＭ塩化マグネシウム、１ｍＭ塩化カルシウム及び１ｍＭ塩化マンガンを含む５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５．７（緩衝液Ｃ）で平衡させたコンカナバリンＡカラムに注入した。結合したタンパク質を緩衝液Ｄ（緩衝液Ｃに０．５メチルα−Ｄ−マンノピラノシドを加えたもの）で一つの段階によりカラムより溶出した。回収した画分をＸＥＴ活性の測定をした。段階７：Ｎ−末端アミノ酸配列決定高いＸＥＴ活性をもつコンカナバリンＡカラムによるサンプルは１５％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で見かけの分子量によって分離した。電気泳動後、タンパク質をＰｒｏｂｌｏｔｔ^TM膜上で転写した（転写緩衝液：１０％メタノール中１０ｍＭＣＡＰＳｐＨ１１）。Ｐｒｏｂｌｏｔｔ^TM膜を，１％酢酸、４０％メタノール中０．１％クーマシーブリリアントブルーＲ２５０で染色し、５０％メタノールで脱色した。Ｍ^Γ３６，０００に近い一本のバンド（すなわち、タンパク質を均質に精製するのに成功した）が見られた；これを摘出し、ＡＢＩ４７５型タンパク質シークエンサーによるＮ−末端アミノ酸配列決定を行った。配列はＧＹＰＲＲＰＶＤＶＰＦＷＫＮＹ（配列番号３３）と決定された。配列のレベルは染色されたタンパク質のバンドの強度と一致した。そのため、他の観点から、本発明はＳＤＳ−ＰＡＧＥにより判定される、３６ｋＤａの見掛けの分子量をもつキシログルカンエンドトランスグリコシラーゼ（ＸＥＴ）活性を持つ十分に純粋なポリペプチドを提供する。好ましくは酵素はトマト植物より入手可能であり、最も好ましくは青いトマトの果実の果皮より、又好ましくは実質上ＧＹＰＲＲＰＶＤＶＰＦＷＫＮＹのＮ− 末端アミノ酸配列をもつ。酵素は好ましくは硫酸アンモニウム沈殿、イオン交換クロマトグラフィー及び／又はコンカナバリンＡ親和性クロマトグラフィーの一つ以上により精製される。実施例４トマトにおけるＸＥＴの発現上記のＸＥＴ測定方法はトマト植物（var．Moneymaker）を通じ、ＸＥＴ活性を測定するものを使用した。抽出物（０．２Ｍリン酸）は生長の４段階及び成熟の３段階における生長する植物及び果実の異なる部位より分離した根、葉及び葉柄部分から調製した。最もＸＥＴ活性が高かったのは、生長の植物の頭頂及び生長している（小さい青い）果実から分離した葉柄から調製した抽出物が記録し、植物の生長とＸＥＴ含量が一致した。総ＲＮＡはＱｉａｇｅｎ抽出処置を使用し、トマト植物の異なる部分より抽出された。ｔＸＥＴ−Ｂ１（トマトＸＥＴクローンＢ１）転写レベルはＲＮＡアーゼ保護分析により決定した。アンチセンスｔＸＥＴ−Ｂ１特異的プローブは、ＨｉｎｄＩＩＩ直線化ｐｔＸＥＴ−Ｂ１プラスミドをＴ３ＲＮＡポリメラーゼと０．５ｍＭｒＡＴＰ／ｒＧＴＰ／ｒＣＴＰ、５ｎＭＵＴＰ、５０μＣｉ³²Ｐ−ＵＴＰ（８００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）、１μｌＲＮアーゼ阻害剤及び２μｌ反応緩衝液（Ａｍｂｉｏｎプローブ合成キット）の存在下で最終反応容量２０μｌで１時間、２５℃でインキュベーションさせた。次に、ＤＮアーゼの消化及びフェノール／クロロホルム抽出をし、プローブはエタノール沈殿により回収した。１０⁵ｃｐｍ標識したプローブを５μｇの総ＲＮＡとインキュベーションし、ＲＮアーゼ保護分析をＡｍｂｉｏｎにより供給されたＲＰＡIIキットを使用し、実行した。保護プローブをMolecular Dynamics Phoshorlmagerの分析の後、変性ゲル電気泳動により定量した。最も高いｔＸＥＴ−Ｂ１転写レベルは実の果皮で検出され、成熟から桃色の実の最も熟れる間、そのレベルは増大した。茎の最大のレベル（成熟した緑の実に見られるレベルに相当）は、３０ｃｍの植物の頭頂からおよそ１０ｃｍに認められた。ｔＸＥＴ−Ｂ１転写ののより低いレベルは、葉で検出され、根では無視し得るレベルであった。活性の型及び転写レベルの違いは、総ＸＥＴ活性が異なって発現された遺伝子の一組にコードされるか又は０．２Ｍリン酸のとき、イソフォーム（isoform）の選択的な単離がおきているかのいずれかを示唆する。ｔＸＥＴ−Ｂ１の発現の型はこのイソフォームを実の成熟中に含有していることを示唆する。実施例５トランスジェニックトマト植物におけるＸＥＴ酵素レベルの減少本質的な２′マンノピン合成酸素プロモーターは、プラスミドｐＳＬＪ２′ＬｎｏｓからのＢｇｌIIフラグメントを上に再生されており、プラスミドｐｔＸＥＴ−Ｂ１に連結している。（ｐＳＬＪ２′Ｌｎｏｓは、ポリリンカー配列を有するβ−グルクロニダーゼ酵素をコードするＤＮＡ配列を置換することにより、ｐＳＬＪ１００６［Jonesら、1992 transgenic Research 1，285-297］より誘導される）。これは２′プロモーターに管してアクセス配向におけるそしてプロモーターの下流にｔＸＥＴ−Ｂ１がコードする配列が置かれている（図７）。Ｘｂａ −Ｓｓｔフラグメントはプロモーターを含み、ｔＸＥＴ−Ｂ１の７９８ｂｐ（ヌクレオチド１８７から９８４）配列はそのため植物形質転換ベクター、ｐＧＰＴＶ−ｋａｎ（Becker D.ら、1992、Plant Molecular Biology 20，1195 −1197及び図８）にクローンされる。生成したプラスミド、ｐＧＰＴＶ−ｋａｎ −２′ｔＸＥＴ−Ｂ１はＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍＬＢＡ４４０４の形質転換に使用され、又、組換えａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種はトマトの子葉部分の感染に使用される（variety Moneymaker）。形質転換した植物はカナマイシンの存在により選択的に再生された。変換ＤＮＡの存在はプライマーＮＰＴIIｂ（５ ′ＡＴＣＧＧＧＡＧＣＧＧＣＧＡＴＡＣＣＧＴＡ３′ 配列番号Ｎｏ．３４）及び８−ＨＳ（上記）間のＤＮＡ部分のＰＣＲ増幅により確信された。ＸＥＴ活性は上記の方法により桃色の実（１５植物）より調製された抽出物で測定された。アンチセンスｔＸＥＴ構造をもつ形質転換した植物において約８０％までそのレベルは減少した。

【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９５年４月６日【補正内容】請求の範囲１．キシログルカンエンドトランスグリコシラーゼ（ＸＥＴ）活性をもつポリペプチドであって、図１（配列番号２）に示したアミノ酸配列の実質的に２１〜２８９の残基を含むポリペプチド、又はそのポリペプチドと少なくとも８０％アミノ酸同一性を有する機能的同等物。２．図１に示したアミノ酸配列の実質的に１〜２８９の残基を含む、請求項１に記載のポリペプチド。３．図５（配列番号８）に示したアミノ酸配列の実質的に１９〜２８７の残基を含む、請求項１に記載のポリペプチド。４．図１に示したアミノ酸配列の実質的に１〜２８７の残基を含む、請求項１に記載のポリペプチド。５．図１に示した配列の２１〜２８９の残基の配列と少なくとも８５％アミノ酸同一性を持つ、請求項１乃至請求項４のいずれか１請求項に記載のポリペプチド。６．図１に示した配列の２１〜２８９の残基の配列と少なくとも９０％アミノ酸同一性を持つ、請求項１乃至請求項５のいずれか１請求項に記載のポリペプチド。７．請求項１乃至請求項６のいずれか１請求項に記載のポリペプチドであって、以下のペプチドの一つ以上を含むペプチド（各ペプチドにおいて一つまで、多くとも二つまで、アミノ酸の変更は可能）：DEIDFEFLGN；SLWNADDWAT；FYSKNEYLFG 及びGTVTTFYLSS。８．請求項１乃至請求項７のいずれか１請求項に記載のポリペプチドであって、実質的に他の植物誘導物質より単離されるペプチド。９．図１に示したアミノ酸配列の２１〜２８９の残基の実質的なアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、又はこのようなヌクレオチド配列の＋又は−の要素を持つ、少なくとも７０％同一性を有する機能的同等物。 10．図１（配列番号１）に示したＤＮＡ配列を実質的に含む、請求項９に記載の配列。 11．図５に示したアミノ酸配列の１９〜２８７残基のアミノ酸配列を実質的にコードする、請求項９に記載のヌクレオチド配列。 12．図５（配列番号７）に示したＤＮＡ配列を実質的に含む、請求項１１に記載のヌクレオチド配列。 13．宿主細胞において発現可能なプロモーターを含有する、請求項９又は請求項１１に記載のヌクレオチド配列。 14．配列が本来植物において結合しているプロモーターではない、プロモーターを含む、請求項１３に記載の配列。 15．図１のヌクレオチド配列の＋又は−の要素を持つ、少なくとも８０％同一性を有する、請求項９に記載のヌクレオチド配列。 16．図１のヌクレオチド配列の＋又は−の要素を持つ、少なくとも８５％同一性を有する、請求項１５に記載のヌクレオチド配列。 17．請求項１乃至請求項８のいずれか１請求項に記載のポリペプチドをコードする、請求項９乃至請求項１６のいずれか１請求項に記載のヌクレオチド配列。 18．請求項９乃至請求項１７のいずれか１請求項に記載の配列を含有するＤＮＡベクター。 19．適した宿主に導入したとき、請求項１乃至請求項８のいずれか１請求項に記載のポリペプチドの発現をさせることが可能である、請求項１８に記載のベクター。 20．請求項９乃至請求項１７のいずれか１請求項に記載のヌクレオチド配列を導入した宿主細胞、又はその後代。 21．請求項１８又は請求項１９に記載のベクターを含有する、請求項２０に記載の宿主細胞。 22．キシログルカンエンドトランスグリコシラーゼ（ＸＥＴ）活性を持つポリペプチドの製造方法であり、請求項１９に記載のベクターを適した宿主細胞に導入する工程、宿主細胞及び／又はその後代を、ポリペプチドを発現させるのに適した培養条件で生育する工程、及び培地及び／又は宿主細胞よりポリペプチドを得る工程を含む方法。 23．宿主細胞が植物細胞又は微生物である、請求項２２に記載の方法。 24．宿主細胞が酵母細胞である、請求項２２又は請求項２３に記載の方法。 25．植物又は植物の部分の性質を変える方法であり、請求項９乃至請求項１７のいずれか１請求項に記載のヌクレオチド配列の有効な部分を植物又は植物の部分に導入し、植物又は植物部分のＸＥＴ活性のレベルを変えることを含む、方法。 26．植物又は植物部分のＸＥＴ活性のレベルを減少させる、請求項２５に記載の方法。 27．大きさ、生長速度、テクスチャー、熟成の一つ以上の性質を変える、請求項２５又は請求項２６に記載の方法。 28．請求項２５、請求項２６、又は請求項２７に記載の方法により製造された、遺伝子操作された植物、又はそのような植物の後代。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ１２Ｎ 1/19 9282−4ＢＣ１２Ｎ 1/19 5/10 9359−4Ｂ 9/10 9/10 8827−4Ｂ 9/24 9/24 9637−4ＢＣ１２Ｐ 21/02 ＣＣ１２Ｐ 21/02 9282−4ＢＣ１２Ｎ 5/00 Ｃ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ホワイトマン、サリー‐アン英国、エムケイ41・７ワイジェイ、ベッドフォードシャー、ブリックヒル、ハインドバーン・クローズ 14 (72)発明者ヘルヤー、スーザン・アマンダ英国、ピーイー18・０エヌイー、ケンブリッジシャー、ハンティンドン、アッパー・ディーン、チャーチ・レーン、ジ・オールド・モルティングス（番地なし) (72)発明者アロースミス、デヴィッド・アンドリュー英国、エヌエヌ10・０エイワイ、ノーザンプトンシャー、ラシュデン、クイーンズ・ストリート 59

Claims

【特許請求の範囲】１．キシログルカンエンドトランスグリコシラーゼ（ＸＥＴ）活性をもつポリペプチドであって、図１（配列番号２）に示したアミノ酸配列の実質的に２１〜２８９の残基を含むポリペプチド又はそれらの機能的同等物。２．図１に示したアミノ酸配列の実質的に１〜２８９の残基を含む、請求項１に記載のポリペプチド。３．図５（配列番号８）に示したアミノ酸配列の実質的に１９〜２８７の残基を含む、請求項１に記載のポリペプチド。４．図１に示したアミノ酸配列の実質的に１〜２８７の残基を含む、請求項１に記載のポリペプチド。５．図１に示した配列の２１〜２８９の残基の配列と少なくとも８０％相同性を持つ、請求項１乃至請求項４のいずれか１請求項に記載のポリペプチド。６．図１に示した配列の２１〜２８９の残基の配列と少なくとも８５％相同性を持つ、請求項１乃至請求項５のいずれか１請求項に記載のポリペプチド。７．図１に示した配列の２１〜２８９の残基の配列と少なくとも９０％相同性を持つ、請求項１乃至請求項６のいずれか１請求項に記載のポリペプチド。８．請求項１乃至請求項７のいずれか１請求項に記載のポリペプチドであって、以下のペプチドの一つ以上を含むペプチド（各ペプチドにおいて一つまで、多くとも二つまで、アミノ酸の変更は可能）：DEIDFEFLGN；SLWNADDWAT；FYSKNEYLFG 及びGTVTTFYLSS。９．請求項１乃至請求項８のいずれか１請求項に記載のポリペプチドであって、実質的に他の植物誘導物質より単離されるペプチド。 10．図１に示したアミノ酸配列の１〜２８９の残基の実質的なアミノ酸配列をコードするか又はそれらの機能的同等物。 11．図１（配列番号１）に示したＤＮＡ配列を実質的に含む、請求項１０に記載の配列。 12．図５に示したアミノ酸配列の１９〜２８７残基のアミノ酸配列を実質的にコードする、請求項１０に記載のヌクレオチド配列。 13．図５（配列番号７）に示したＤＮＡ配列を実質的にコードする、請求項１２に記載のヌクレオチド配列。 14．宿主細胞において発現可能なプロモーターを更に含有する、請求項１０又は請求項１２に記載のヌクレオチド配列。 15．配列が本来植物において結合しているプロモーターではない、プロモーターを含む、請求項１４に記載の配列。 16．図１のヌクレオチド配列と少なくとも７０％相同性をもつ、請求項１０に記載のヌクレオチド配列。 17．図１のヌクレオチド配列と少なくとも８０％相同性をもつ、請求項１６に記載のヌクレオチド配列。 18．図１のヌクレオチド配列と少なくとも８５％相同性をもつ、請求項１６に記載のヌクレオチド配列。 19．請求項１乃至請求項９のいずれか１請求項に記載のポリペプチドをコードする、請求項１０乃至請求項１８のいずれか１請求項に記載のヌクレオチド配列。 20．図１の完全なヌクレオチドと少なくとも７０％相同性を持つ機能的に同等なアンチセンスである、請求項１０に記載のヌクレオチド配列。 21．図１の完全なヌクレオチドと少なくとも８０％相同性を持つ、請求項２０に記載のヌクレオチド配列。 22．図１の完全なヌクレオチドと少なくとも９０％相同性を持つ、請求項２０に記載のヌクレオチド配列。 23．請求項１０乃至請求項２２のいずれか１請求項に記載の配列を含有するＤＮＡベクター。 24．適した宿主に導入したとき、請求項１乃至請求項９のいずれか１請求項に記載のポリペプチドの発現が可能である、請求項２３に記載のベクター。 25．請求項１０乃至請求項２２のいずれか１請求項に記載のヌクレオチド配列を導入した宿主細胞、又はその後代。 26．請求項２３又は請求項２４に記載のベクターを含有する、請求項２５の宿主細胞。 27．キシログルカンエンドトランスグクコシラーゼ（ＸＥＴ）活性を持つポリペプチドの製造方法であり、請求項２４に記載のベクターを適した宿主細胞に導入する工程、宿主細胞及び／又はその後代を、ポリペプチドを発現させるのに適した培養条件で生育する工程、及び培養溶媒及び／又は宿主細胞からポリペプチドを得る工程を含む方法。 28．宿主細胞が植物細胞又は微生物である、請求項２７に記載の方法。 29．宿主細胞が酵母細胞である、請求項２７又は請求項２８に記載の方法。 30．植物又は植物の部分の性質を変える方法であり、請求項１０乃至請求項２２のいずれか１請求項に記載のヌクレオチド配列の効果的な部分を植物又は植物の部分に導入し、植物又は植物部分のＸＥＴ活性のレベルを変えることを含む、方法。 31．植物又は植物部分のＸＥＴ活性のレベルを減少させる、請求項３０の方法。 32．大きさ、生長速度、テクスチャー、熟成の一つ以上の性質を変える、請求項３０又は請求項３１に記載の方法。 33．請求項３０、請求項３１、又は請求項３２に記載の方法により製造された、遺伝子操作された植物、又はそのような植物の後代。