CZ136196A3 - Polypeptide nucleotide chain, dna vector, process for preparing such polypeptide and a plant obtained by genetic engineering method - Google Patents

Polypeptide nucleotide chain, dna vector, process for preparing such polypeptide and a plant obtained by genetic engineering method Download PDF

Info

Publication number
CZ136196A3
CZ136196A3 CZ961361A CZ136196A CZ136196A3 CZ 136196 A3 CZ136196 A3 CZ 136196A3 CZ 961361 A CZ961361 A CZ 961361A CZ 136196 A CZ136196 A CZ 136196A CZ 136196 A3 CZ136196 A3 CZ 136196A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
sequence
polypeptide
amino acid
plant
nucleotide sequence
Prior art date
Application number
CZ961361A
Other languages
English (en)
Inventor
David Andrew Arrowsmith
Susan Amanda Hellyer
Silva Jacqueline De
Sally Anne Whiteman
Original Assignee
Unilever Nv
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Unilever Nv filed Critical Unilever Nv
Publication of CZ136196A3 publication Critical patent/CZ136196A3/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12N9/1051—Hexosyltransferases (2.4.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y204/00—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12Y204/01—Hexosyltransferases (2.4.1)
    • C12Y204/01207—Xyloglucan:xyloglucosyl transferase (2.4.1.207)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Cosmetics (AREA)
  • Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Plant Substances (AREA)

Description

Polypeptid, nukleotidová sekvence, DNA vektor, hostitelská buňka, způsob výroby poiypeptidu a rostlina, s získaná genetickým inženýrstvím
Oblast techniky
Vynález se týká nukleotidových sekvencí, kódujících rostlinný enzym, vektorů, které obsahují uvedené nukleotidové sekvence, hostitelských buněk, které obsahují uvedené nukleotidové sekvence, sekvencí aminokyselin, kódovaných uvedenými nukleotidovými sekvencemi, metod založených na rekombinantní DNA pro výrobu enzymu a způsobu změny vlastností rostliny.
Dosavadní stav techniky
Buněčné stěny ovoce a zeleniny jsou tvořeny převážně polysacharidy, hlavními součástmi jsou pektin, celulóza a xyloglukan (Selvendran & Robertson, IRF Report 1989). Byly navrženy četné modely buněčné stěny, které se pokoušejí obsáhnout základní vlastnosti pevnosti a pružnosti (například Albersheim, 1975 Sci. Am, 232, 81-95; Albersheim, 1976 The primary cell wall“, Plant
Biochemistry, třetí vydání, Academie Press; a Hayashi, 1989, Ann. Rev, Plant Physiol. & Plant Mol. Biol. 40, 139-168).
- 2 Xyloglukany jsou 1,4-p-glukany, které jsou ve značné míře substituovány a-1,6-xylosylovými postranními řetězci, z nichž některé jsou 1,2-p-galaktosyiovány. Nalézají se ve velkém množství v primárních buněčných stěnách dvoudéložných rostlin, ale také v určitých semenech, kde mají rozličné úkoly.
Xyloglukan primární buněčné stěny je vodíkovými vazbami pevné vázán k celulózovým mikrofibrilám a k uvolnění vyžaduje koncentrované alkálie nebo silná bobtandla. O xyloglukanu se předpokládá, že tvoří křížové můstky mezi celulózovými mikrofibrilami, io přičemž síť celulóza / xyloglukan tvoří hlavní nosnou / elastickou síť stěny. DCB mutovaná suspenze buněk (buněčné stěny bez obsahu celulózy) uvolňuje xyloglukan do kultivačního media, což napovídá, že normálně je xyloglukan pevně navázán na celulózu.
Hydrolýza xyloglukanu primární buněčné stěny byla ukázána na is úsecích ve tmě rostoucích podděložních článků tykve během růstu, indukovaného IAA (Wakabayashi a další, 1991 Plant Physiol. 95, 1070-1076). O vnitřní hydroiýze xyloglukanu stěny se předpokládá, že přispívá k uvolňování stěny, který doprovází expanzi buněk (Hayashi, viz předchozí citace). Bylo rovněž ukázáno, že průměrná molekulová hmotnost xyloglukanu klesá v průběhu zrání rajčat, což může přispívat ke měknutí tkání, které doprovází proces zrání (Huber, 1983 J, Amer. Soc. Hort. Sci. 108, 405-409).
Určitá semena, například řeřichy, obsahují až do 30 % hmotnostních xyloglukanu, umístěného v zesílených děložních buněčných stěnách, který slouží jako zásobní polysacharid a je rychle depolymerizován v půběhu klíčení.
Z klíčících semen řeřichy (Tropaeolum majus L.) byla izolována a vyčištěna do zřejmé homogenity endo 1,4-p-D-glukanáza, která
- 3 specificky působí na xyioglukan (tj. xyloglukanáza) (Edwards a další, 1986 J. Biol. Chem. 261, 9494).
Vyčištěná xyloglukanáza poskytuje jediný polypeptidový pruh (zdánlivá molekulová hmotnost 29 - 31 kDa) na SDS polyakrylamidové s gelové elektroforéze a isoelektrické fokusaci (isoelektrický bod 5,0). Enzym má absolutní specificitu pro xyioglukan a endo- mechanismus působení, jak bylo zjištěno analýzou koncových produktů po hydroiýze xyloglukanu semen tamarindu indického (Wakabayashi a další, viz dřívější citace). Ačkoliv přirozeným substrátem enzymu je rezervní io děložní xyioglukan řeřichy, bylo rovněž ukázáno, že hydrolyzuje xyloglukany primární buněčné stěny in vitro (Edwards a další, viz dřívější citace). Při vysokých koncentracích substrátu byla ukázána aktivita xyioglukan endo-transglykosylázy (XET) (Fanutti a další, 1993
The Plant Journal 3, 691-700).
Sekvence nukleotidů tohoto enzymu xyloglukanázy / XET řeřichy byla určena a je uveřejněna v mezinárodní patentové přihlášce WO 93/17101 a Silvou a dalšími (1993 The Plant Journal 3, 701-711).
Podobná enzymová aktivita byla zjištěna v jiné rostlinné tkáni a bylo ukázáno, že pozitivně koreluje s rychlostí růstu v různých částech stonku hrachu (Fry a další, 1992 Biochem. J. 282, 821-829). Bylo navrženo, že XET je odpovědná za štěpení a znovušpojení intermikrofibrilárních xyloglukanových řetězců, a že to způsobuje uvolnění stěny, požadované pro expanzi buněk rostlin. Aktivita XET byla rovněž ukázána v plodech rajčat (xyloglukanáza zdánlivě aktivovatelná xyloglukanovými oligosacharidy), přičemž nejvyšší koncentrace je hlášena ve dvoudenní po- „přerušovací“ (post“breaker“) fázi zrání (Machlachlan & Brady, 1992 Aust. J. Plant Physíol. 19, 137 - 146) a může se účastnit v procesu měknutí.
Tato přihláška popisuje izolaci nukleotidové sekvence, která kóduje aktivitu XET, z rostlin rajčat.
- 4 Podstata vynálezu
První hledisko vynálezu poskytuje polypeptid, který má xyloglukan endo-transglykosylázovou (XET) aktivitu, který podstatně obsahuje zbytky 21 - 289 sekvence aminokyselin podle obr. 1 (Sekvence 2), nebo jeho funkční ekvivalenty.
Termín „funkční ekvivalent“, jak je zde používán a aplikován na sekvenci aminokyselin, se má vztahovat na ty sekvence aminokyselin, které mají stejné funkční charakteristiky jako sekvence. podle w vynálezu, ale mají poněkud rozdílné sekvence. Obecně je například dobře známo, že lze provést „konzervativní“ substituci, když se zamění jeden zbytek aminokyseliny v sekvenci za jiný zbytek s velmi podobnými vlastnostmi, aniž by to mělo významný vliv na funkci polypeptidu.
Příklad funkčně ekvivalentní polypeptidové sekvence je ukázán na obr. 5 (Sekvence 8). Sekvence aminokyselin, ukázané na obrázcích 1 a 5, se přímo porovnávají na obr. 6.
Dále, jeden nebo více zbytků aminokyselin je možno vynechat nebo přidat bez významného škodlivého účinku. Odborníkům v oboru
2o bude zřejmé, že takové změny je možno provádět hlavně v těch místech sekvence, které nejsou evolučně konzervovány. Pod význam „funkční ekvivalenty“ jsou rovněž zahrnuty prekursory enzymů, stejně jako maturní, upravené enzymy bez signálních sekvencí.
V tomto případě se předpokládá o aminokyselinových zbytcích 1
- 20 podle obr. 1, že tvoří takovou signální sekvenci, a proto nejsou nezbytné pro enzymovou aktivitu. Stejně tak zbytky aminokyselin 1 18 sekvence, ukázané na obr. 5, patrně obsahují postradatelné signální sekvence.
- 5 Proto může vynáiez poskytovat ve zvláštních provedeních polypeptid, který má aktivitu XET, a zahrnuje zbytky 1 - 289 sekvence podle obr. 1; nebo zbytky 19 - 287 sekvence aminokyselin podle obr. 5; nebo zbytky 1 - 237 sekvence aminokyselin, ukázané na obrázku 5.
S výhodou budou takové funkční ekvivalenty vykazovat alespoň % homologii, výhodněji alespoň 85 % homologii a nejvýhodněji alespoň 90 % homologii se sekvencí aminokyselin podle vynálezu.
Analýzou dat sekvence aminokyselin bylo identifikováno několik sekvencí peptidů, o kterých se předpokládá, že jsou mezi funkčními io ekvivalenty sekvence podle vynálezu relativně konzervovány.
S výhodou budou funkční ekvivalenty zahrnovat jako podstatnou část jednu nebo více z následujících peptidových sekvencí (které budou obecně dokonale konzervovány, ale mohou obsahovat až jednu, nebo nejvíce 2 odchylky v aminokyselinách):
DEIDFEFLGN; SLWNADDWAT; FYSKNEYLFG; a GTVTTFYLSS (Sekvence 3 - 6).
S výhodou je polypeptid v podstatě izolován od jiných z rostlin odvozených látek.
Druhé provedení vynálezu poskytuje sekvenci nukleotidů, 20 kódující sekvenci aminokyselin podle obr. 1 (Sekvence 1), nebo její funkční ekvivalenty.
S výhodou obsahuje nukleotidová sekvence nukleotidovou sekvenci podle obrázku 1 nebo jiný funkční ekvivalent sekvencí, získatelný z rostlin rajčat. Termín „funkční ekvivalent“, jak je zde používán a aplikován na sekvence nukleotidů, se má vztahovat k sekvencím nukleotidů, kódujícím polypeptid, který má stejné funkční charakteristiky jako sekvence aminokyselin podle prvního hlediska vynálezu, a zahrnují sekvence nukleotidů, které budou za
- 6 standardních podmínek (popsaných v: Sambroo.k a další, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual) hybridizovat s komplementární sekvencí k sekvenci podle obr. 1. S výhodou bude funkční ekvivalent nukleotidové sekvence vykazovat alespoň 70 % homologii, výhodněji 80 % homologii a nejvýhodněji alespoň 35 % homologii se sekvencí nukleotidu podle obrázku 1. Zvláštní příklad funkčního ekvivalentu nukleotidové sekvence je ukázán na obr. 5 (Sekvence 7).
Pro účely předkládané specifikace se vztahuje termín „funkční io ekvivalent“ rovněž na sekvence s opačným smyslem (anti-sense), které hybridizují za standardních podmínek s nukleotidovou sekvencí podle obr. 1. Takové sekvence jsou užitečné při regulaci směrem ke snížení exprese (down-regulating) nukleotidové sekvence podle vynálezu. S výhodou budou takové funkční ekvivalenty s opačným is smyslem vykazovat alespoň 70 % homologii, výhodněji alespoň 80 % homologii a nejvýhodněji alespoň 90 % homologii s komplementem nukleotidové sekvence podle obr. 1. Obecně, funkční ekvivalenty s opačným smyslem budou mít větší procento homologíe než ekvivalenty se správným smyslem. Je to proto, že konstrukty se správným smyslem budou překládány na polypeptidy, které budou funkční a které mohou obsahovat konzervativní substituce aminokyselin. Naopak, konstrukty s opačném smyslem budou ve velké většině případů fungovat spíše na úrovni nukleové kyseliny než polypeptidu, a tedy jakákoliv změna sekvence baží bude směřovat ke sníženi užitečnosti konstruktu.
Odborníci v oboru rozumí, že těžíce ze zveřejnění, vztahujícího se zde k sekvencím nukleotidů a aminokyselin podle vynálezu, bude jednoduché detekovat, izolovat a klonovat (například PCR) jiné sekvence nukleotidů, které jsou funkčními ekvivalenty nukleotidové ač sekvence podle vynálezu. Vhodné metody se například probírají v knize Sambrook a další. Zvláště užitečné v takové rutinní práci mohou
- 7 být zde uveřejněné peptidové sekvence. Rovněž mohou být polypeptidy podle vynálezu (nebo od nich odvozené peptidy) použity pro vytváření protilátek pro použití při imunologickém prozkoumávání (screeningu) domněle funkčně ekvivalentních sekvencí.
Je výhodné, pokud sekvence podle druhého hlediska vynálezu dále zahrnuje 5'- nepřekládanou oblast včetně vhodného promotoru, aby byla umožněna exprese v hostitelských buňkách. Vynález rovněž poskytuje vektor, zahrnující nukleotidovou sekvenci podle druhého hlediska vynálezu a hostitelskou buňku, která obsahuje nukleotidovou io sekvenci podle vynálezu.
V jednom z provedení vynálezu je vektor schopen exprese nukleotidové sekvence za účelem produkce polypeptidu podle vynálezu. (Jiné vektory mohou zahrnovat funkční ekvivalent nukleotidové sekvence s opačným smyslem).
V dalším hledisku vynález poskytuje způsob produkce polypeptidu s XET aktivitou, zahrnující kroky: vnesení vektoru, schopného řízení exprese polypeptidu, definovaného výše, do vhodné hostitelské buňky, růst hostitelské buňky a/nebo jejích potomků ve vhodných kultivačních podmínkách, aby došlo k expresi polypeptidu, následovaný získáním polypeptidu buď z kultivačního media, a/nebo hostitelských buněk.
Je výhodné, ale v žádném případě ne nezbytné, že hostitelská buňka je eukaryotická, protože u eukaryotické buňky je pravděpodobnější, že bude exprimovat enzym v plně funkční konformaci.
Jsou známy vhodné vektory, které mohu být použity k zavedení a expresi sekvence podle vynálezu v rostlinách.
V dalším hledisku vynález poskytuje způsob transformace hostitelské buňky, který zahrnuje zavedení nukleotidové sekvence
- 3 podle druhého hlediska vynálezu do hostitelské buňky. S výhodou je hostitelskou buňkou buňka rostlinná. S výhodou zahrnuje transformovaná rostlinná buňka část rostliny.
Jak bude odborníkům v oboru zřejmé, při zavedení 5 nukleotidové sekvence podle vynálezu do rostliny nebo její části se očekává změna charakteristiky rostliny nebo její části.
V ještě dalším hledisku vynález poskytuje způsob změny charakteristiky rostliny nebo její části, který zahrnuje zavedení účinného množství nukleotidové sekvence podle vynálezu nebo jejího funkčního ekvivalentu do rostliny nebo její části, aby se změnila úroveň aktivity XET v rostlině nebo její části. S výhodou je způsob takový, aby snížil úroveň aktivity XET v rostlině nebo její části, typicky zavedením sekvence v opačném smyslu. S výhodou bude účinná látka zahrnovat alespoň 50 %, lépe alespoň 70 % a nejlépe alespoň 90 % nukleotidové sekvence podle vynálezu.
V dalším hledisku vynález poskytuje rostlinu, získanou genetickým inženýrstvím, s charakteristikami, změněnými výše uvedeným způsobem, nebo potomstvo takové rostliny.
Změněná rostlina je s výhodou jakákoliv komerčně důležitá 20 rostlina (včetně rostlin ovoce a zeleniny), kde existují dostatečné znalosti k tomu, aby mohl být proveden způsob podle vynálezu, a ve které má xyloglukan strukturní funkci (tj. dvouděložné a netrávovité jednoděložné rostliny).
Takovými rostlinami jsou: vojtěška, jablko, brokolice, kapusta, 25 karotka, květák, celer, bavlna, brusinka, okurka, lilek jedlý, len, vinná réva, křen, kiwi, hlávkový salát, mango, meloun, řepka olejka, papája, hrách, broskve, hrušky, pepře, švestka, topol, brambor, malina, sója, smrk, jahoda, cukrová řepa, batata, tabák, rajče a vlašský ořech.
- 9 Je výhodné, když se nemusí měnit charakteristiky celé rostliny. Může být žádoucí měnit vlastnosti části rostliny (například semen, plodů). Toho by mohlo být dosaženo například použitím tkáňově specifických promotorů k regulaci transkripce zaváděné sekvence.
s Od způsobu podle vynálezu by se dalo očekávat, že změní úroveň aktivity XET a tím četnost rozpadu a obnovování zesítění buněčné stěny (sestávající z xyloglukanových molekul) s následkem povolení stěny, což může dovolit expanzi buňky. Navíc, z hlediska důležité strukturní úlohy xylogiukanu, by se dalo očekávat, že vlastnosti, které by mohly být změněny, budou zahrnovat: velikost, rychlost růstu a texturu, zvláště během zrání.
Přehled obrázků na výkresech
Vynález je dále popsán odkazem na následující ilustrativní 15 příklad a výkresy, ve kterých:
Obrázek 1 ukazuje aminokyselinovou a nukleotidovou sekvenci (klon B1) podle vynálezu;
Obrázek 2 ukazuje částečné aminokyselinové sekvence polypeptidu podle vynálezu a jeho funkčního ekvivalentu ve srovnání se dvěma aminokyselinovými sekvencemi podle stavu techniky;
Obrázek 3 ukazuje strategii sekvenování, použitou k určení sekvence na obrázku 1 (E = EcoRI, P = Pst, H = Hindlll);
Obrázek 4 ukazuje strategii sekvenování, použitou k určení sekvence 25 nukleotidu (klon B2) podle vynálezu (E= EcoRI, P = Pst);
Obrázek 5 ukazuje sekvenci nukleotidů (klon B2) a sekvenci aminokyselin podle vynálezu;
- 10 Obrázek 6 ukazuje srovnání dvou funkčně ekvivalentních sekvencí aminokyselin (tečka = identická aminokyselina; trojúhelník = předpovězené místo štěpení); a
Obrázky 7 a 8 jsou schematické ilustrace různých plazmidových 5 konstruktů.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1 io Po úplném sekvenování cDNA, kódující XET (popsaném v projednávané mezinárodní patentové přihlášce WO 93/17101) byly navrženy příměry, s cílem pokusit se o amplifikaci PCR podobných genových fragmentů z rajčete. Dva z primerů (NXG2H a NXG2S, viz níže) se překrývaly v oblasti, homologní s β-1,3-1,4-glukanázou
Baciilus macerans (oblast s aminokyselinovou sekvencí DEIDIEFJG). Ostatní primery odpovídaly oblastem, přilehlým k nebo obklopujícím histidinové zbytky; (tyto jsou často přítomny v aktivních místech hydrolytických enzymů, a aktivní místa enzymů s podobnou funkcí mají často homologní primární sekvenci). Tyto odpovídají sekvencím aminokyselin PNHNRVD (primer NXG1H), HDEIDIE (primery NXGH2H a NXG28), HLWFDPT (primery NXG3H a NXG38) a TRDHTLT (primer NXG48).
NXG1H 5' AAGCTTCCTCAACATCAAAGGGTAGA 3’ NXG2H AAGCTTCATGATGAAATCGATATTGA NXG2B GGATCCTCAATATCGATTTCATCATG NXG3H AAGCTTCATTTATGGTTTGATCCAAC NXG3B GGATCCGTTGGATCAAACCATAAATG (správný smysl) (správný smysl) (opačný smysl) (správný smysl) (opačný smysl)
- 11 NXG4B GGATCCGTTAACGTGTGGTCTCGTGT (opačný smysl) (Sekvence 9-14)
Tyto primery byly vzhledem k sekvenci řeřichy úplné konzervovány a na svých 5' koncích zahrnovaly rozpoznávací místa restrikčních enzymu, aby bylo umožněno klonování PCR produktu. Všechny pokusy o amplifikaci DNA rajčat PCR při použití jakékoliv kombinace výše uvedených primerú se však ukázaly jako neúspěšné.
io Odvozené sekvence aminokyselin XET ze semen řeřichy sdílejí některé oblasti homologie (identita 42 % v překrytí 151 aminokyselin) se sekvencí, odvozenou z genomického klonu a cDNA Arabidopsis thaliana (Medford a další, 1991 The Plant Cell 3, 359-370). Polypeptid, kódovaný genomickým klonem, je zakončen meri-5 a jeho funkce je zatím neznámá.
Bylo rozhodnuto pokusit se o PCR amplifikaci DNA rajčete za použití směsi degenerovaných nukleotidů (XG 117 a XG 162, viz níže), odpovídajících dvěma z těch oblastí, konzervovaných mezi XET řeřichy a meri-5, ačkoliv byla pouze malá naděje na úspěch vzhledem k předchozím nezdarům a nedostatku znalostí, týkajících se funkce (pokud je nějaká) meri-5.
Překvapivě se podařilo pomocí PCR amplífikovat fragment genomické DNA rajčete o velikosti 122 párů baží, který má významnou homologii sekvence jak k meri-5, tak i XET řeřichy.
- 12 Experiment byl prováděn podle následujícího popisu.
Genomická DNA byla izolována z tkáně mladých lístků rajčat (kultivar VF 1435-7879, dostupný v Tomato Genetics Stock C-entre, Department of Vegitable Corps, University of California, Davis,
CA95616), jak je popsáno u: Dellaporta a další (1983, Plant Mol. Biol.
1, 19-21).
Byly navrženy degenerované směsi oligonukleotidů, odpovídající konzervovaným oblastem DE!D(I/F)EFLG (XG' 117) a HLWFDPT (XG 162), ukázaným níže:
XG117 5’ GA(C/T) GA(A/G) ATI GA(C/T) (A/T)T(A/C/T) GA(A/G) TT 3' (správný smysl)
XG162 3' GT(G/A) (G/A)A(G/A/T/C) ACC AA(G/A) CT(G/A) GGI TG 5’ (opačný smysl) (Sekvence 15 a 16 )
Poté byly degenerované oligonukleotidy použity jako primery v následujících reakcích (každá reakce má celkový objem 100 μΙ): 1-2 pg genomické DNA; 100 pmol každého z XG 117 a XG 162; dGTP, dATP, dTTP a dCTP, vše 0,2 mM; 10 mM Tris-HCI pH 8,3; 50 mM KCI;
1,5 mM MgCI2; 0,01 % (hmotnost/objem) želatiny; a 2,5 jednotky DNA polymerázy Taq (Stratagene).
Cyklování teploty bylo prováděno v přístroji MJ Research programmable thermal controller s počátečním denaturačním krokem 94 °C 2 minuty, následovaným 35 cykly 94 °C 1 minuta, 40 °C 2 minuty a 72 °C 2 minuty. Produkty amplifikace byly frakcionovány na 2% gelu agaróza/TBE s obsahem 0,5 pg/ml ethidiumbromidu a
- 13 pozorovány v procházejícím UV světle. DNA fragmenty byly z gelu vyčištěny použitím DEAE papíru, jak je popsáno v: Sambrook a další (Molecular Cloning: A Laboratory Manual).
Bylo zjištěno, že velikost hlavního produktu PCR je 122 párů 5 baží. Byl ligován do pT7Blue (AMS Biotechnology) a podroben analýze sekvence DNA. Ze čtyř sekvenovaných klonů měly tři identickou sekvenci DNA (PX3) a jeden se lišil jak v sekvenci DNA, tak v odvozené sekvenci aminokyselin (PX1), jak je ukázáno na obr. 2. Na obrázku 2 představují Tom 3 a Tom 1 odvozenou sekvenci io aminokyselin pro PX3 a PX1, ve srovnání s meri-5 a XET řeřichy.
Aby byly získány rozsáhlejší informace, byla získána 5'cDNA knihovna rajčete (Clontech Laboratories lne.- (připravená použitím mRNA z „přerušovací4 (breaker“) fáze zrajících plodů rajčat „Alisa craig“ kultivar VFN8); byl připojen primer oligo-(dT) a náhodné primery pro syntézu cDNA, která byla vnesena do fágu λ gt11.
Bylo testováno přibližně 200000 klonů cDNA z této knihovny za použití 122 bp fragmentu PCR jako radioaktivně značené sondy. Stručně, 25 - 30 ng 122 bp produktu amplifikace přečištěného na gelu bylo denaturováno v 9 μΙ H2O zahříváním 5 minut při 100 °C a potom ochlazeno ledem. Fragmenty byly radioaktivně označeny 32P-dCTP (Amersham International plc) za použití kitu Sequenase v2.0 (United States Biochemicals lne.). Nenavázané nukleotidy byly odstraněny chromatografií na koloně Sephadex G-50.
S použitím této sondy bylo detekováno v knihovně cDNA množství pozitivně reagujících klonů. Ty byly eluovány z vrchní vrstvy agarózy do 0,1 - 1 ml SM (50 mM Tris-HCI pH 7,5, 10 mM MgSO4, 100 mM NaCI, 0,01 % (hmotnost/objem) želatiny) a čištěny dalšími cykly testování. Insert byl izolován z bakteriofága buď přímou PCR zásobní suspenze nebo štěpením izolované DNA.
- 14 Pro PCR zásobní suspenze byly zásobní dávky čištěného bakteriofága (5 μΙ, 10s - 10s pfu) zahřívány 5 minut při 100 °C a přidány ke stejné suspenzi, jak je popsáno výše, s výjimkou toho, že na místo degenerovaných oligonukleotidu bylo použito vždy 20 pmoi s gt11 5' a 3' oligonukleotidu (Clontech). Cyklování teploty bylo následující: 2 minuty při 94 ’C, 25 cyklů 1 minuta 94 °C, 1 minuta 55 °C a 2 minuty 72 °C, a následoval závěrečný krok 5 minut při 72 °C. Produkty amplifikace byly přečištěny na agarózovém gelu, jak je uvedeno výše.
io Na gelu čištěné produkty PCR byly lígovány do pT7 Bíue PCR klonovacího vektoru (AMS Biotechnology Limited) a transformovány do kompetentních buněk E. coli podle doporučení výrobce.
Kolonie s rekombinantními plazmidy byly použity pro inokulaci 30 ml půdy Lennox broth s obsahem 50 pg/ml ampicilinu a 12,5 pg/ml tetracyklinu; po růstu přes noc při 37 aC byla z kultury získána čištěná plazmidová DNA za použití kitu „Plasmid midi“ (Qiagen lne). Restrikční analýza klonovaných produktů byla prováděna enzymy a pufry (Amersham International plc) a následována elektroforézou na agarózovém gelu.
2o DNA byla sekvenována pomocí kitu a protokolů Sequenase v2.0 (United States Biochemicals lne.). Rekombinantní plazmidy (připravené metodou Qiagen) byly buď sekvenovány přímo, nebo byly restrikční fragmenty subklonovány do M13, aby byly získány jednořetězcové templáty. Reakční produkty byly frakcionovány na 30 cm x 40 cm x 0,4 mm polyakrylamidových gelech při použití BRL 6% akrylamidových roztoků. Pro analýzu výsledných sekvencí byl použit software DNAstar na počítači IBM.
Bylo zjištěno, že velikost klonů se pohybuje v rozmezí od 500 do 1400 párů baží. Jeden z klonů, zakončený klon tXET-81 (pro
3o jednoduchost označený ,ΒΓ) měl vnitřní rozpoznávací místa Hindlll a
- 15 Sací, které usnadnily klonování do M13. Bylo rovněž použito vnitřních příměrů, aby byla sekvence klonována úplně a v obou směrech (obr.
3). Sekvence těchto vnitřních primerú (8-TH, 3-HS primery se správným smyslem a 8-TB, 8-HT primery s opačným smyslem) je následující:
8-TH: 5’ CGATGCAGCTGGAATTTCA 3'
8-TB: 5’ AGTTTGAGCTGCATATCGAA 3'
8-HS: 5’ TTTGATCCCACCTCGCCGTT 3' w 8-HT: 5' CAGCTGACCAAACACAAGCA3' (Sekvence 17-20)
Sekvence dalších primerů byly:
is T3: 5' ATTAACCCTCACTAAAGGGA 3'
T7: 5' TAATACGACTCACTATAGGG 3'
U19: 5' GTTTTCCCAGTCACGACGT 3’ (Sekvence 21-23)
U představuje primer M13 (-40). Na počátku byly nalezeny dvě sekvence, každá z jiné amplifikace PCR zásobní dávky lambda. V domnělé kódovací oblasti se lišily ve dvou párech baží. Protože rozdíly byly patrně zaviněny nepřesností termostabilní DNA polymerázy, používané při amplifikacích PCR, byla připravena lambda DNA a cDNA ligována do plazmidu pBluescript SK+, aby byla získána definitivní sekvenční data (obr. 1). Definitivní sekvence nukleotidů
- 16 klonu B1 ukazuje obrázek 1, spolu s odvozenou sekvencí aminokyselin.
Domnělý otevřený čtecí rámec klonu B1 kóduje polypeptid o 289 aminokyselinách s předpovězenou molekulovou hmotností 32,7 kDa.
Má 39 % shodu ve 270 překrývajících se aminokyselinách s XET řeřichy a 59 % shodu ve 186 překrývajících se aminokyselinách s meri-5.
Signálový polypeptid je předpovězen na bázi hydrofobicity aminokyselin v pozicích 1 - 25 a statistická analýza sekvence io aminokyselin předpověděla, že prekurzor je štěpen mezi zbytky alaninu a kyseliny asparagové na pozicích 20 a 21 (Von Heijne, 1983
Eur. J Biochem. 113, 17- 21).
Oblast klonu B1, odpovídající genomickým fragmentům PCR (aminokyseliny 103 - 129) vykazuje rozdíly v předpovězené sekvenci aminokyselin ve srovnání se sekvencí obou genomických fragmentů. To naznačuje, že klon B1 je částí multigenové rodiny rajčete. Bylo identifikováno předpokládané místo N-glykosylace (Asn-X-Ser/Thr; aminokyseliny 105 - 107), které je rovněž přítomno v meri-5 a v genomických fragmentech, ale ne v XET řeřichy.
2o Druhý získaný klon, označený tXET-B2 (zkráceno na „32“) byl větší než klon B1, ale neměl žádná pohodlná restrikční místa pro subklonování, takže bylo použito několika vnitřních primerú, aby bylo možno dokončit sekvenování DNA. Strategie, použitá pro určení sekvence klonu B2, je schematicky ukázána na obrázku 4. V obrázku
4 E = EcoRI místo, P = Pstl místo; (a) ukazuje sekvenování za použití vektorových primerú, (b) a (c) ukazují sekvenování s vnitřními primery. Bylo použito více primerú, včetně:
16-1: 5' AATATCAGCGGAAACAGGG 3'
16-1R: 5' CCCTGTTTCCGCTGATAATT 3'
16-2: 5' CTATTAGCATCTGCACAGTA 3’
16-2R: 5' TACTGTGCAGATGCTAATAG 3'
16-3R: 5’ GGAGGACGGGTGAAGACAGA 3
16-4: 5' GTGTAAGGTAGTCCTGATGA 3'
16-4R: 5’ TCATCAGGACTACCTTACAC 3'
(Sekvence 24-30)
Byl identifikován předpovězený otevřený čtecí rámec 287 aminokyselin. Určená sekvence nukleotidů a předpovězená sekvence aminokyselin klonu B2 jsou ukázány na obrázku 5. Obrázek 6 ukazuje sekvenci cDNA klonu B1 a jeho předpovězenou sekvenci aminokyselin v přímém srovnání s předpovězenou sekvencí aminokyselin pro klon B2. (V obrázku 6 označují tečky stejné aminokyseliny, a šipka označuje předpovězené místo štěpení signálního peptidu.) Předpovězený signálový peptid pro klon B2 byl o 2 aminokyseliny kratší než signálový peptid klonu B1, zanechávající maturní polypeptid se 269 aminokyselinami. Domnělé místo N-glykosylace bylo nalezeno ve stejné poloze jako pro klon B1. Bylo identifikováno 16 rozdílů v aminokyselinách mezi předpovězenými maturními poiypeptidy klonů 8 a 16, z toho 14 konzervativních.
Byla provedena analýza hydrofobních sektorů (Hydrophobic
Cluster Analysis, HCA, jak je popsáno u: Gaboriaud a další, 1987 FEBS Letters 224, 149-155 a Henrissat a další, 1988 Biochem. J. 225, 901-905), aby byla zjištěna možná konformační homologie polypeptidu, kódovaného klonem B1, s jinými známými proteiny.
Pomocí programu WordPerfect™ 5,1 macros byly získány obrazy HCA předpovězených sekvencí aminokyselin XET řeřichy, > t
- 13 meri-5 a klonu rajčete B1, za použití modifikovaného 2D zobrazení α-šroubovice (Henrissat a další, citováno výše). Hydrofobní sektory byly zakroužkovány, ručně seřazeny a vypočteny výsledky homologie HCA.
s Pro všechny tři proteiny bylo předpovězeno podobné složení do prostoru (folding) na základě (a) „souvislé přítomnosti konzervovaných sektoru“ v průběhu většiny délky sekvence a (b) součty homologie pro všechny tři srovnání jsou celkově více než 75 % (meri-5 s XET B1 klonem rajčete 86 %, XET řeřichy s XET B1 klonem rajčete 80 %, io meri-5 s XET řeřichy 78 %).
To podporuje data z homologie primární sekvence a předpovědí sekundární struktury (Kyte & Dooííttle 1982, J. Mol. Biol. 157, 105132), které navrhují, že tyto tři proteiny budou pravděpodobně mít velmi podobné skládání do prostoru a proto podobné funkce, zatímco v detailech se budou odlišovat.
Bylo rozhodnuto pokusit se exprimovat klon B2 v E. coli. To se popisuje níže v příkladu 2.
Příklad 2
Manipulace s klonem B2 pro expresi v E. coli
Pomocí PCR bylo zavedeno těsně k N-koncové kódující sekvenci předpokládaného maturního proteinu rozpoznávací místo BamHI, za použití mutagenního příměru (16-1 B: CCCTTGGATCCGCTATAATT Sekvence 31) a primeru pBluecsript
T3; Stratagene). Reakční podmínky byly následující; 1 ng XET klonu
B2 v pBluecsript SK+; vždy 0,4 mM dATP, dCTP, dGTP a dTTP; 25 pmol každého primeru; 1 x polymerázový pufr VENT a 0,25 jednotek VENT DNA polymerázy (New England Biolabs lne.). Teplotní cykly
- 19 byly následující: 2 minuty při 93 °C, 25 cyklů 1 minuta při 93 °C, 30 s při 55 °C a 1 minuta při 72 °C.
Exprese rekombinované XET v E. coli
Exprese rekombinované XET v E coli bylo dosaženo použitím systému QIAexpress™ (QIAGEN). Fragment BamHI - Hindlíl mutagenizovaného produktu PCR byl ligován do expresního vektoru pQE30 a transformován do buněk E. coli IVU5, obsahujících represní plazmid pREP4, Expresní vektor dovoluje inkorporaci N-konce, io uvedeného (tagged) šesti histidiny, který má vysoku aktivitu k pryskyřici Ni-NTA (Ni-NTA je nikl-nitrilotrioctová kyselina)(QIAGEN). Růst probíhal v mediu Lennox broth s obsahem vhodných antibiotik a při optické hustotě kultury 0,7 - 0,8 při 600 nm byly buňky indukovány 2 mM IPTG. Kultura byla ponechána růst ještě 3 - 5 hodin. Pro analýzu byly buňky z 0,5 ml kultury zcentrifugovány, rozvařeny ve vzorkovém pufru (Laemmii 1970 Nátuře 227, 680 - 685) a analyzovány na polyakrylamidových gelech (10 %); oddělené proteiny byly barveny Coomassie blue. Lokalizace proteinů s histidiny na konci byla provedena podle protokolu 4 příručky „The QIAexpressionist“, 2.
vydání (1992; QIAGEN lne.).
Čištění a prostorové skládání (refolding) rekombinantního proteinu
XET rajčete
Rekombinantní XET rajčete byla čištěna za denaturačních podmínek na prysykřici Ni-NTA, jak je popsáno v „The QIAexpressionist“, protokol 7, s tou výjimkou, že kolona s navázaným proteinem byla po konečném promytí ekviiibrována v pufru 6 M močovina, 0,5 M NaCI, 20 % glycerol, 40 mM Tris-HCI pH 7,4. Pro uvolnění a prostorové složení navázaného proteinu bylo použito .«
- 20 gradientu 6 Μ - 1 M močoviny ve výše uvedeném roztoku, vytvořeného pomocí FPLC, (celkem 24 ml, průtok 0,25 ml/min), který byl eluován do 10 ml pufru 1M močovina, 0,5 M NaCI, 20 % glycerol, 40 mM TrisHCI pH 7,4, 250 mM imidazol.
Testy aktivity XET
Byly získány 3H značené XG oligosacharidy (S C Fry, University of Edinburgh) a jejich inkorporace do polymernich XG stanovena podle metody, popsané v: Fry a další (1992 Biochem. J. 261, 9489io 9494). Koncentrace proteinu byla odhadnuta s použitím kitu (BioRad).
Sekvenování N-koncovych aminokyselin
Vyčištěné rekombinantní proteiny byly podrobeny elektroforéze, jak je popsáno výše, z použitím vysoce kvalitních reagencií. Potom byly elektroblotovány (0,5 A, 2 hodiny) na membráně Probiott™ (derivatizovaný PVDF materiál (ABI)) a barveny v 1% Coomassie Brilliant Blue, 50 % methanol. Blotovaný protein byt podroben postupné Edmanově degradaci na přístroji ABI gas phase sequencer model 740 (funkce pulse liquid update), jak je popsáno u Cottingham a další (1988 Biochim. Biophys. Acta 956, 201-207).
Exprese a charakterizace rekombinantní XET rajčete
XET rajčete byla exprimována v E. coli s N-koncem 6 x His pro usnadnění čištění. Protein se zakončením (tagged) o předpovězené molekulové hmotnosti (32 kDa) byl nalezen v nerozpustné frakci; mikroskopie s fázovým kontrastem ukázala v každé buňce tělíska, silně lámající světlo, značících přítomnost nerozpustných inkluz? (data nejsou ukázána). Následovala velkoobjemová purifikace za
- 21 denaturujících podmínek, a konec s histidinovým zakončením byl podroben N-koncové sekvenaci aminokyselin. Výsledná sekvence (MRGSHHHHHHGSADNFYQDA Sekvence 32) potvrdila jak identitu proteinu jako rekombinantního XET rajčete, tak přítomnost Ns terminálního zakončení (tag) 6 x His.
Rekombinantní XET protein rajčete byl prostorově složen, jsa navázán na Ni-NTA agarózovou pryskyřici, použitím inverzního gradientu močoviny. Po eluci z kolony bylo 15 pl testováno na inkorporací 3H-XG oligosacharidů (XGO) do polymerního XG: přibližně io 400 Bq 3H-XGO bylo inkorporováno na kBq přítomné aktivity za hodinu, na pg proteinu. Následuje dialýza proti 0,5 M NaCI, 50 mM Tris-HCI pH 7,2 a 20 % glycerolu, specifická aktivita vzrostla na přibližně 700 Bq / kBq, hodinu a pg.
Klon B2 byl potom exprimován v E. coli se zdánlivým nis koncovým signálním peptidem nahrazeným zakončením 6 x histidin, které usnadnilo čištění. Po čištění a složení byl schopen rekombinantní protein katalyzovat inkorporací radioaktivně značených XG oligosacharidů do polymerního XG, čímž bylo potvrzeno, že jde o XET. Specifická aktivita složeného XET je poměrně nízká; surový extrakt stonku z rostoucí rostliny rajčete má specifickou aktivitu přibližně 100 Bq / kBq, hodinu a pg, ve srovnání s se 700 Bq / kBq, hodinu a pg pro složený XET. Protože čistota rekombinantního proteinu je větší než 90 %, je to pravděpodobně kvůli tomu, že většina proteinu není správně prostorově složena. Na rozdíl od XET semen řeřichy v je aminokyselinových sekvencích obou klonů přítomno domnělé místo N-glykosylace. Zajímavé zjištění je, že exprese rekombinantů v E. coli, která neglykosyluje proteiny, vedla k aktivnímu XET. To ukazuje, že pro aktivitu XET in vitro není glykosyface nutná, což vyvolává otázku na její roli in vivo. Nepřítomnost glykosylace u
XET semen řeřichy může odrážet její zvláštní roli při mobilizaci uložených zásobních látek.
- 22 Důkazy pro funkci XET v rostlinách se rychle hromadí. Hypotéza, že XET hraje roli při růstu rostliny je podporována její korelací s růstem podle délky stonků hrachu (Fray a další, 1992 Biochem. J. 282, 821-823) a v kořenech kukuřice (Pritchard a další, 1993 J. Exp. Bot.
44, 1281-1289). Předpokládá se, že působí uvolněním buněčné stěny a tím dovolí expanzi buněk.
XET je pravděpodobně rovněž zapojena do zrání ovoce, jak vyplývá z jejích měnících se úrovní v tak rozdílných druzích ovoce jako rajče, hruška (nepublikovaná pozorování vynálezce) a kiwi (Fry 1993 io Current Biology, 3 (č. 6), 355-357). Zde může XET zlepšit přístup ostatních enzymů k těsně sbalené síti buněčné stěny. To by podporovala malá, kompaktní povaha XET (Edwards a další, 1986 J. Biol. Chem. 261, 9489-9494). Alternativně může mít XET funkci (možná ve spojení s jinými hydrolázami buněčných stěn) při depolymerizaci xyloglukanu, která probíhá během zrání ovoce.
Příklad 3
Navíc k výše popsané práci s rekombinantní DNA byl učiněn pokus izolovat a vyčistit polypeptíd s XET aktivitou z rostlin rajčete.
Krok 1: Test na aktivitu XET
Aktivita XET v různých surových extraktech z rostlin rajčat byla měřena inkorporací 3H značených xyloglukanových oligosacharidů do xyloglukanového polymeru. Tento test měří transglykosylázovou aktivitu. Každý test se skládal z následujících složek: 10 μΙ 0,2 M NaMes pH 6,0 (Na-Mes je monosodná sůl kyseliny 2-[Nmorfolinojethansulfonové), 10 μΙ xyloglukanu 8 mg/ml a 5 μΙ [3H] XGO (0,7 kBq).
- 23 Testy byly inkubovány při 25 °C po dobu 1 hodiny, a reakce byla zastavena přídavkem 100 μΙ 20 % kyseliny mravenčí. Reakční směs byla potom kápnuta na kotouč 5 x 5 cm ceiulózového filtračního papíru (Whatman 3MM Chromatography páper). Bylo zjištěno, že xyloglukanový polymer (jak značený, tak i neznačený [3H] XGO) se na celulózový filtr váže, zatímco [3H] XGO oíigosacharidy ne. Filtry byly ponechány uschnout a neinkorporovaný [3H] XGO byl promýván 30 minut pod tekoucí vodovodní vodou. Filtry byly sušeny znovu při 60 °C, srolovány lícem ven do válečku a vloženy do 22 ml scintilační ία lahvičky. Byly přidány 2 ml scintilačního roztoku (Betamax ES) a filtry počítány na 3H. Tento test je v podstatě stejný, jak je popsáno u Fry a další (1992), citováno výše.
Krok 2: Extrakce XET z perikarpu rajčete
Byly použity různé extrakční pufry a zjišťována jejich účinnost.
Bylo zjištěno, že XET je účinně extrahován 0,1 M pufrem fosforečnanu sodného, pH 7,2. Bylo rovněž zjištěno, že uchování aktivity XET je vysoce závislé na iontové síle, a došlo ke ztrátě aktivity, pokud iontová síla chromatografického pufru atd. byla menší než 0,2 M.
Krok 3: Volba výchozího materiálu pro purifikaci
Byly připraveny surové extrakty (0,1 M pufrem fosforečnanu sodného, pH 7,2) tkání perikarpu rajčete (Lycopersicum esculentum, var. Moneymaker) z různých stupňů rustu a dozrávání. Bylo shodně zjištěno (z několika experimentů), že nejvyšší aktivitu XET mají malé zelené plody (tj. o průměru menším než 35 mm), ať jako celkovou, tak jako specifickou aktivitu. Proto byl jako výchozí materiál pro purif ikaci používán perikarp malých zelených plodů.
- 24 Krok 4: Srážení síranem amonným
Byla připravena tkáň periakarpu (100 g) malých zelených plodů o průměru menším než 35 mm, zamražena v kapalném dusíku a skladována při -20 °C až -70 °C. Tkáň byla v mixeru homogenizována v 1 g : 1,5 objemu 0,1 M pufru fosforečnanu sodného, pH 7,2 s 1 % (hmot. / objem) nerozpustného PVP (polyvinylpyrrolídonu). Homogenát byl míchán jednu hodinu při 4 °C, aby byla umožněna difúze enzymů buněčné stěny. Nerozpustný materiál byl odstraněn centrifugací při io 20000g, 30 minut, 4 °C v rotoru SS 34 v centrifuze Sorvall RC5B. Supernatant byl protlačen pře skleněnou vlnu a přídavkem pevného síranu amonného (60,3 g na 100 ml) přiveden do 90 % nasycení síranem amonným. Směs byla míchána při 4 °C po dobu 40 minut a sražené proteiny byly odděleny centrifugací (33000 g, 30 minut, 4 °C).
Proteiny, vysrážené síranem amonným, byly uchovávány bez resuspendování při -20 °C.
Krok 5: Katíontová iontově výměnná chromatoqrafie na S- Sepharose
Proteiny, vysrážené přídavkem síranu amonného do 90 % 20 nasycení, byly resuspendovány v 10 ml pufru: 50 mM octan sodný, pH 5,3, s 0,2 M NaCI (pufr A) s přídavkem 1 mM EOTA, 20 pg/ml chymostatinu a 1 mM PMSF. Resuspendovaná sraženina byla dialyzována 2 hodiny proti 2,5 I pufru A s použitím dilyzační trubice s hranou Mř 3500. Vzorek byl zředěn pufrem (50 mM octan sodný pH
5,3, 1 mM EDTA), aby byla snížena vodivost na hodnotu, vhodnou pro nanášení na kolonu S- Sepharosy. Vzorek byl centrifugován při 38000 g 15 minut, 4 °C, a potom nanesen na 7 ml kolonu Fast Flow SSepharose (Pharmacia), ekvilibrovanou pufrem A. Kolona byla promývána pufrem A (průtok 1 ml/min), dokud nebyly odstraněny všechny nenavázané proteiny. Navázané proteiny byly eluovány i ;r
- 25 gradientem 0-100 % pufru B (jako pufr A, ale s obsahem 1 M NaCI) desetinásobným objemem kolony. Byly jímány frakce 2 ml a testovány na aktivitu XET.
5 Krok 6: Afinitní chromatografie na konkavalinu A
Frakce z iontově výměnné chromatografie na S-Sepharose, které obsahovaly aktivitu XET, byly spojeny a skladovány při -20 °C. Před chromatografií na konkavalinu byly frakce přeneseny do 1 mM MgCI2 a MnCI2. Spojené frakce z S-Sepharosy byly zcentrifugovány a io supernatant nanesen na kolonu Concavalin-A, ekviiibrovanou pufrem C (50 mM octan sodný pH 5,7, 0,2 M NaCI, 1 mM MgCI2, 1 mM CaCI2 a 1 mM MnCI2). Navázané proteiny byly eluovány z kolony jednostupnovou eluci pufrem D (jako pufr C plus 0,5 methyl cc-Dmannopyranosid). Zachycené frakce byly testovány na aktivitu XET.
Krok 7; Sekvenování N-koncových aminokyselin
Vzorky z kolony Concavalin-A s vysoku aktivitou XET byly rozděleny podle zdánlivé molekulové hmotnosti na 15 % SOS polyakrylamidovém gelu. Po elektroforéze byly proteiny přeneseny na membránu Problott™ (přenosový pufr: 10 mM CAPS pH 11 v 10 % methanolu). Membrána Problott™ byla obarvena v 0.1 % Coomassie Brilliant Blue R250 v 1 % kyselině octové a 40 % methanolu a odbarvena v 50 % methanolu. Byl viditelný jediný pruh (tj. protein byl úspěšně vyčištěn do homogenity) o přibližné Mr 36000; byl vyříznut a podroben sekvenování N-koncových aminokyselin na přístroji ABI model 475 protein sequencer. Určená sekvence (Sekvence 33) byla: GYPRRPVDVPFWKNY. Úroveň sekvence byla ve shodě s intenzitou obarveného pruhu proteinu.
- 26 V dalším hledisku proto vynález poskytuje v podstatě čistý polypeptid s xyioglukan endotransglykosylázovou (XET) aktivitou se zdánlivou molekulovou hmotností 36 kDa podle SDS-PAGE.
S výhodou je možno získat enzym z rostlin rajčat, nejvýhodněji z 5 perikarpu zelených plodů rajčat, a s výhodou je v podstatě N-koncová sekvence aminokyselin GYPRRPVDVPFWKNY.
Enzym se s výhodou čistí jedním nebo více kroky srážení síranem amonným, iontově výměnnou chromatografií a/nebo afinitní chromatografií na konkavalinu-A.
Příklad 4
Exprese XET v rajčeti
Pro monitorování aktivity XET v rostlině rajčete (var. Moneymaker) bylo používáno stanovení XET, popsané výše. Byly připraveny extrakty (0,2 M fosfát) z kořene, listu a řapíkových segmentů, izolovaných z různých částí rostoucí rostliny a z plodů ve čtyřech stupních vývoje a třech stupních zrání. Nejvyšší aktivita XET byla zaznamenána v extraktech, připravených z řapíků, izolovaných z vrcholu rostoucí rostliny a vyvíjejícího se (malého zeleného) plodu,
2o což je ve shodě s vlivem XET na růst rostliny.
Z různých částí rostliny rajčete byla extrahována celková RNA s použitím extrakčního postupu Qiagen. Úrovně transkripce tXET-B1 (klon B1 XET rajčete) byla určována analýzou s ochranou proti RNAse. tXET-B1-specifická sonda s opačným smyslem byla syntetizována inkubací piazmidu pXET-B1, linearizovaného Hindlll, s 1 μΙ T3 RNA polymerázy v přítomnosti 0.5 mM rATP/rGTP/rCTP, 5 nM UTP, 1,85 MBq 32P-UTP (29,6 TBq/mmol), 1 μΙ inhibitoru RNAsy a 2 μΙ reakčního pufru (Ambion probe synthesis kit) v konečném reakčním objemu 20 μΙ 1 hodinu při 25 °C. Následovalo trávení DNAsou a
- 27 extrakce fenolem/chloroformem a sonda byla oddělena srážením ethanolem. Značená sonda s aktivitou 103 cpm byla inkubována s 5 pg celkové RNA a analýza s ochranou proti RNAse byla provedena s použitím kitu RPAil (Ambion). Chráněná sonda byla kvantifikována elektroforézou na denaturačním gelu, následovanou analýzou na přístroji Molecular Dynamics Phosphorlmager. Nejvyšší úrovně transkriptú tXET.81 byly detekovány v perikarpu plodu, s úrovněmi stoupajícími v průběhu zrání a s maximem v růžovém plodu. Maximální úrovně ve stonku (ekvivalentní úrovním ve zralých zelených io plodech) byiy nalezeny přibližně 10 cm od vrcholu 30 cm rostliny. Nižší úrovně transkriptú tXET.BI byiy detekovány v listech a zanedbatelné úrovně v kořenech. Rozdíly v rozložení aktivity a úrovni transkripce napovídají, že buď je celková aktivita XET kódována sadou rozdílné exprimovaných genů, nebo že v 0,2 fosfátu se is vyskytuje selektivní oddělení isoforem. Rozložení exprese tXET.81 napovídá, že tato isoforma může mít funkci při zrání ovoce.
Příklad 5
Snížení enzymových úrovní XET v transqenních rostlinách rajčat
Z fragmentu BglII plazmidu pSLJ2'Lnos byt získán konstitutivní promotor 2'mannopin syntézy a iigován do plazmidu ptXET-B1. (pSLJ2'Lnos byl odvozen z pSLJ1006 [Jones a další, 1992 Transgenic Research 1, 285-297 ] náhradou sekvence DNA, kódující enzym βglukuronidázu, sekvencí polylinkeru). To umístilo sekvenci, kódující tXET-B1, do orientace v opačném smyslu vzhledem k, a směrem od (downstream) 2'promotoru (obr. 7). Fragment Xba - Sst, obsahující promotor a 798 bp (nukleotidy 187 - 984) sekvence tXET-B1 byl pak klonován do rostlinného transformačního vektoru pGPTV-kan (Becker D. a další, 1992, Plant Molecular Biology 20, 1195-1197 a obr 8).
Výsledný plazmid, pGPTV-kan-2' tXET-B1 byl použit pro transformaci
- 28 Agrobacterium LBA4404 a rekombinantní kmen agrobacterium byl použit pro infekci děložních segmentu rajčete (var. Moneymaker). Transformované rostliny byly selektivně regenerovány v přítomnosti kanamycinu. Přítomnost přenesené DNA byla potvrzená PCR s amplifikací úseku DNA mezi primery NPTIIB (5'
ATCGGGAGCGGCGATACCGTA 3', Sekvence 34) a 8-HS (viz výše).
Aktivita XET byla monitorována v extraktech, připravených z růžových plodů (15 rostlin) výše popsanou metodou. Úrovně byly u rostlin, transformovaných tXET konstruktem v opačném smyslu, nižší až io přibližně o 80 %.
- 29 VÝPIS SEKVENCE (1) OBECNÉ INFORMACE (i) Žadatel:
(A) Jméno: Unilever PLC (B) Ulice: Unilever House, Blackfriars (C) Město: London (E) Země: United Kingdom io (F) Poštovní kód (ZIP): EC4P 4BQ (G) Telefon: (0234) 222268 (H) Telefax: (0234) 222633 (A) Jméno: Uniiever NV is (B) Ulice: Weena 455 (C) Město: Rotterdam (E) Země: Netherlands (F) Poštovní kód (ZIP): 3013 AL (ii) Název vynálezu: Nový rostlinný enzym (iii) Počet sekvencí: 34 (iv) Počítačová forma:
(A) Typ media: floppy disk (8) Počítač: IBM PC kompatibilní (C) Operační systém: PC-DOS / MS-DOS (D) Software: Patentln Reiease #1.0 Version #1.25 (EPO) (2) INFORMACE PRO SEKVENCI 1 (i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 994 párů baží 35 (B) Typ: nukleová kyselina (C) Typ řetězce: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne (iii) V opačném smyslu: ne as (ix) Rysy:
(A) Jméno/klíč: CDS (B) Umístění: 79 .. 945
- 30 (xi) Popis sekvence: Sekvence 1:
GAAGTAGACG ATGCAGCTGG AATTTCAAAC AIACATTCCC AAAAACAACT AACTACATAT 60
TCCTTAAGAT TTCCTATA ATG TTG CTG CAG CAG CTA TCT GTT CTT GCT CTA 111
Met Leu Leu Gin Gin Leu Ser Val Leu Ala Leu
1 5 10
CTT CTC TTG CTA TGT CCT GTT TGG GCT GAC AAT TTC TAC CAA GAT GCA 159
Leu Leu Leu Leu Cye Pro Val Trp Ala Asp Asn Phe Tyr Gin Asp Ala
15 20 25
ACG GTT ACC TTT GGT GAT CAG CGA GCT CAG ATA CAA GAT GGT GGG CGC 207
Thr Val Thr Phe Gly Asp Gin Arg Ala Gin Ile Gin Asp Gly Gly Arg
30 35 40
CTT CTC GCC TTG TCC CTT GAC AAA ATT TCA GGT TCA GGA TTT CAG TCT 255
Leu Leu Ala Leu Ser Leu Asp Lys Ile Ser Gly Ser Gly Phe Gin Ser
45 50 55
AAG AAT GAA TAT TTA TTT GGA AGG TTC GAT ATG CAG CTC AAA CTA GTA 303
Lys Asn Glu Tyr Leu Phe Gly Arg Phe Asp Mat Gin Leu Lys Leu Val
60 65 70 75
CCT GGA AAT TCT GCT GGC ACT GTC ACT ACC TTC TAT TTG TCT TCT CAA 351
Pro Gly Asn Ser Ala Gly Thr Val Thr Thr Phe Tyr Leu Ser Ser Gin
ao as 90
GGA GCA GGG CAC GAC GAA ATT GAT TTT GAG TTT CTG GGA AAT TCA TCA 399
Gly Ala Gly His Asp Glu Ile Asp Phe Glu Phe Leu Gly Asn Ser Ser
95 100 105
GGC CAA CCG TAC ACG GTT CAT ACT AAT GTC TAC TCT CAA GGA AAA GGC '447
Gly Gin Pro Tyr Thr Val His Thr Asn Val Tyr Ser Gin Gly Lys Gly
110 115 120
AAC AAA GAA CAA CAG TTT CGC CTA TGG TTT GAT CCC ACC TCG CCG TTC 495
Asn Lys Glu Gin Gin Phe Arg Leu Trp Phe Asp Pro Thr Ser Pro Phe
125 130 135
CAC ACC TAC TCT ATT GTT TCG AAC TCT CAA CGC ATC ATA TTT TTG GTC 543
His Thr Tyr Ser Ile Val Trp Asn Ser Gin Arg Ile Ile Phe Leu Val
140 145 150 155
GAT AAT ATC CCA ATA AGA GTA TTC AAC AAC CAC GAA AAG CTT GGT GTT 591
Asp Asn Ile Pro Ile Arg Val Phe Asn Asn His Glu Lys Leu Gly Val
160 165 170
GCA TTC CCA AAG AAC CAA GCA ATC AGA GTT TAT GCC AGT TCA TGG AAT 639
Ala Phe Pro Lys Asn 175 Gin Ala Met Arg 130 Val Tyr Ala Ser Leu 135 Trp Asn
GCT GAT GAC TGG GCA ACA CAA GGA GGG CGA GTG AAG ACG GAT TGG TCA 637
Ala Asp Asp Trp Ala Thr Gin Gly Gly Arg Val Ly3 Thr Asp Trp Ser
190 105 200
ATC GCT CCG TCT ACA GCT TCT TAC AGG AAT TTC AAC ACA AAT GCT TCT 735
Met Ala Pro Phe Thr Ala Ser Tyr Arg Asn Phe Asn Thr Asn Ala Cys
205 210 215
GCT TGG TCA GCT GCA TCG TCT ACT TCG TCC TCT GGA GGC TCT AAG ACT 783
Val Trp Ser Ala Ala Ser Ser Thr Ser Ser Cys Gly Gly Ser Lys Thr
220 225 230 235
GAI TCA GTA AAC AAT GAT CAG GCA TGG CAA ACT CAA GAA CTC AAC GGT 331
Asp Ser Val Asn Asn Asp Gin Ala Trp Gin Thr Gin Glu Leu Asn Gly
240 245 250
AAT GAC AGA AAT AGG CTC CGA TGG GTT CAG CAG AAA TAC ATC ATC TAC 379
Asn Asp Arg Asn Arg Leu Arg Trp Val Gin Gin Ly3 Tyr Met Ile Tyr
255 260 265
AAT TAC TCT GCA GAT GCT AAA AGG TTC TCT CAA GGC CTC TCT CCT GAA 927
Asn Tyr Cys Ala Asp Ala Ly3 Arg Phe Ser Gin Gly Leu Ser Pro Glu
270 275 230
TGC AAA CGT TCA. AGG TTC TAAAGGATCA AATCTACGAA TGTCGTCTGT 975
Cy3 Lys Arg Ser Arg Phe
285
AAIATCATCC CGGAAITCC ' 994 * Λ
- 32 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI 2 (i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 289 aminokyselin s (B) Typ: aminokyselinová (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein io (xi) Popis sekvence: Sekvence 2:
Met Leu Leu Gin Gin Leu Ser Val Leu Ala Leu Leu Leu Leu Leu Cy3 15 10 15
Pro Val Trp Ala Asp Asn Phe Tyr Gin Asp Ala Thr Val Thr Phe Gly 20 25 30
Asp Gin Arg Ala Gin Ile Gin Asp Gly Gly Arg Leu Leu Ala Leu Ser 35 40 45
Leu Asp Lys 50 Ile Ser Gly Ser Gly Phe Gin Ser Lys Asn Glu Tyr Leu
55 50
Phe Gly Arg Phe Asp Met Gin Leu Lys Leu Val Pro Gly Asn Ser Ala
25 55 70 75 80
Gly Thr Val Thr Thr Phe Tyr Leu Ser Ser Gin Gly Ala Gly HÍ3 Asp
35 90 95
30 Glu Ile Asp Phe Glu Phe Leu Gly Asn Ser Ser Gly Gin Pro Tyr Thr
100 105 110
Val HÍ3 Thr Asn Val Tyr Ser Gin Gly Ly3 Gly Asn Lys Glu Gin Gin
115 120 125
25
Phe Arg Leu Trp Phe Asp Pro Thr Ser Pro Phe His Thr Tyr Ser Ile
- 130 135 140
Val Trp Asn Ser Gin Arg Ile Ile Phe Leu Val Asp Asn Ile Pro Ile
* 40 145 150 155 150
Arg Val Phe Asn Asn His Glu Ly3 Leu Gly Val Ala Phe Pro Ly3 Asn
155 170 175
45 Gin Ala Met Arg Val Tyr Ala Ser Leu Trp Asn Ala Asp Asp Trp Ala
180 185 190
Thr Gin Gly Gly Arg 195 Val Ly3 Thr 200 Asp Trp Ser Met Ala 205 Pro Phe Thr
Ala Ser 210 Tyr Arg Asn Phe Asn 215 Thr Asn Ala Cy3 Val 220 Trp Ser Ala Ala
Ser 225 Ser Thr Ser Ser Cys 230 Gly Gly Ser Lys Thr 235 Asp Ser Val Asn Asn 240
Asp Gin Ala Tip Gin 245 Thr Gin Glu Leu Asn 250 Gly Asn Asp Arg Asn 255 Arg
Leu Arg Trp Val 260 Gin Gin Lys Tyr Met 265 Ile Tyr Asn Tyr Cys 270 Ala Asp
Ala Lys Arg Phe Ser Gin Gly Leu Ser Pro Glu Cys Ly3 Arg Ser Arg
275 280 285
Phe (2) INFORMACE PRO SEKVENCI 3 (i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 10 aminokyselin (B) Typ: aminokyselinová (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: peptid (iii) Hypotetická: ano (iii) V opačném smyslu: ne 35 (v) Typ fragmentu: vnitřní (xi) Popis sekvence: Sekvence 3:
4C Asp Glu Ile Asp Phe Glu Phe Leu Gly Asn 1 5 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI 4 (i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 10 aminokyselin
- 34 (B) Typ: aminokyselinová (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: peptid 5 (iii) Hypotetická: ano (iii) V opačném smyslu: ne 10 (v) Typ fragmentu: vnitřní (xi) Popis sekvence: Sekvence 4:
Ser Leu Trp Asn Ala Asp Asp Trp Ala Thr 15 1 5 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI 5 (i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 10 aminokyselin (B) Typ: aminokyselinová (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: peptid (iii) Hypotetická: ano (iii) V opačném smyslu: ne (v) Typ fragmentu: vnitřní (xi) Popis sekvence: Sekvence 5: 35
Phe Tyr Ser Lys Asn Glu Tyr Leu Phe Gly 15 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI 6 (i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 10 aminokyselin (B) Typ: aminokyselinová (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: peptid
- 35 (iii) Hypotetická: ano (iii) V opačném smyslu: ne s (v) Typ fragmentu: vnitřní (xi) Popis sekvence: Sekvence 6:
Gly Thr Val Thr Thr Phe Tyr Leu Ser Ser 15 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI 7 (i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 1289 párů baží (B) Typ: nukleová kyselina (C) Typ řetězce: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne (iii) V opačném smyslu: ne (ix) Rysy:
(A) Jméno/klíč: CDS (B) Umístění: 232 .. 1092 (xi) Popis sekvence: Sekvence 7:
GAATTCTGGG TAGGCTTTGG TTGCAATAAG CGTCTGTTCT TCGCTEACTA CTTTGGAAAA 60
ATTGftCTTTA GGCCTGCGGT CCCTAGCATT AAATTCATCG ACCGCTGTGT CATATAGACG 120
CCGCTTTGCA AGAICGTTGA CCAAGGTATT GTTACCTCGG ACGGTCTCAA GCAAAGCGGA 130
CGATGTGGCT GTTTGTGTGT ATGCCATTGT AGTTGTAGAA TGTAAAATAT A ATG TTG 237 Met Leu
CTG CAG CTT TCT CTT CTT ACA CTA GTC TTA CTA TCC CCT GTT TCC GCT 235
Leu Gin Leu Ser Leu Leu Thr Leu Val Leu Leu Ser Pro Val Ser Ala 15
- 36 GAI AAT TTC 1AC CAA GAC GCG GCG GTC ACG TTT GGT GAC CAG CGC GCT Asp Asn Phe Tyr Gin Asp Ala Ala Val Thr Phe Gly Asp Gin Arg Ala
25 30
333
CAG ATA CAA GAT GGA GGG CGC CTC CTC ACA TTG TCA CTC GAT AAA ATT 381
Gin Xle Gin Asp Gly Gly Arg Leu Leu Thr Leu Ser Leu Asp Ly3 Ile
35 40 45 50
s TCA GGT TCC GGA TTC CAG TCT AAG AAT GAG TAT TCA TTC GGA AGG TTC 429
Ser Gly Ser Gly Phe Gin Ser Ly3 Asn Glu Tyr Leu Phe Gly Arg Phe
55 60 65
GAT ATG CAG CTC AAA CTC GTA CCT GGA AAT TCT GCT GGC ACT GTC ACC
10 Asp Mat Gin Leu 70 Lys Leu Val Pro Gly 75 Asn Ser Ala Gly Thr 30 Val Thr
ACA TTC TAT OTG TCT TCT CAA GGA GCA GGG CAT GAT GAA ATC GAT TTC
15 Thr Phe Tyr 35 Leu Ser Ser Gin Gly 90 Ala Gly His Asp Glu 95 Ile Asp Phe
GAG TTC CTA GGA AAT TCA TCA GGA CTA CCT TAC ACG GTT CAT ACC AAT
20 Glu Phe 100 Leu Gly Asn Ser Ser 105 Gly Leu Pro Tyr Thr 110 Val HÍ3 Thr Asn
GCT TAC TCT CAA GGA AAA GGC AAT AAA GAA CAA CAA TTC CGT CTC TGG
Val 115 Tyr Ser Gin Gly Lys 120 Gly Asn Ly3 Glu Gin 125 Gin Phe Arg Leu Trp 130
25 TTC GAT CCA ACT TCG TCG TTC CAC ACT TAC TCT ATC GTT TGG AAC TCT
Phe Asp Pro Thr Ser 135 Ser Phe His Thr Tyr 140 Ser Ile Val Trp Asn 145 Ser
CAA CGG ATC ATA TTG GTG GAT AAT ATC CCA ATC AGA GTG TCC AAC
30 Gin Arg Ile Ile 150 Phe Leu Val Asp Asn 155 Ile Pro Ile Arg Val 160 Phe Asn
AAC CAC GAA GCA CTC GGT GTC GCA TAC CCA AAG AAT CAA GCA ATG AGA
35 Asn His Glu 165 Ala Leu Gly Val Ala 170 Tyr Pro Ly3 Asn Gin 175 Ala Met Arg
GTC TAC GCG AGT CTA TGG AAT GCT GAT GAT TGG GCT ACA CAA GGA GGA
Val Tyr Ala Ser Leu Trp Asn Ala Asp Asp Trp Ala Thr Gin Gly GTy
477
525
S73
S21
669
717
765
813
130 135 190
CGG Arg 195 GTG AAG ACA Val Lys Thr GAT TGG TCT ATG GCT CCG TTC ACA GCT TCT TAC AGG
Asp Trp Ser 200 Mat Ala Pro Phe 205 Thr Ala Ser Tyr Arg 210
AAT TTC AAT ACA AAT GCT TGT GTC TGG TCA GCT GCT ACG TCT ACT TCG
Asn Phe Asn Thr Asn Ala Cys Val Trp Ser Ala Ala Thr Ser Thr Ser
215 220 225
361
909
TCT Ser TGT GGA GGT TCT AAG Ly3 ACT GAG TCA GTA AAC AAT GAT GAG AGA TGG 957
Cy3 Gly Gly Ser 230 Thr Glu Ser 235 Val Asn Asn Asp Glu 240 Thr Trp
CAA ACG CAA CAA CTG AAC GTT AAT GGA AGA AAT AGA ATA CGA TGG GTT 1005
Gin Thr Gin Gin Leu Asn Ala Asn Gly Arg Asn Arg Ile Arg Trp Val
245 250 255
CAG CAG AAG TAC ATG ATC TAC AAT IAC TCT GCA GAT GCT AAT AGG TTC 1053
Gin Gin Lys Tyr Mat Ile Tyr Asn Tyr Cys Ala Asp Ala Asn Arg Phe
260 265 270
TCT CAA GGC TTT TCT CCT GAA TGC AAG CGT TCA AGG TTC TAAGGCGGAT 1102
Ser Gin Gly Phe Ser Pro Glu Cys Lys Arg Ser Arg Phe
275 280 285
AIAIATAGTA TATGAATGTA AAATTATGTT TGTTTCACTT TTCTATTCTT TTAAITTTGA 1162
TCAGGTAAAA AAAAAAAAGA ACATAGTGTA ATTATTTGTG TATGCAATAT ATTCTTTATT 1222
CTTTTTGTAA TCATCAAAIA GAAATAAIAA TGAATTGTTT TCCTGAAAAA AAAAAAACCG 1282
GAATTCC 1289 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI 8 (i) Charakteristika sekvence 20 (A) Délka: 287 aminokyselin (B) Typ: aminokyselinová (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein 35 (xi) Popis sekvence: Sekvence 8:
Mat Leu Leu Gin Leu Ser Leu Leu Thr Leu Val Leu Leu Ser Pro Val
1 5 10 15
40
Ser Ala Asp Asn Phe Tyr Gin Asp Ala Ala Val Thr Phe Gly Asp Gin
20 25 30
Arg Ala Gin Ile Gin Asp Gly Gly Arg Leu Leu Thr Leu Ser Leu Asp
45 35 40 45
Lys Ile Ser Gly Ser Gly Phe Gin Ser Lys Asn Glu Tyr Leu Phe Gly
55 60
Arg Phe Asp Mat 65 Gin Leu Ly3 70 Leu Val Pro Gly Asn 75 Ser Ala Gly Thr 80
5 Val Thr Thr Phe Tyr 35 Leu Ser Ser Gin Gly Ala Gly 90 His Asp Glu Ile 95
Asp Phe Glu Phe 100 Leu Gly Asn Ser Ser 105 Gly Leu Pro Tyr Thr Val HÍ3 110
10
Thr Asn Val Tar 115 Ser Gin Gly Ly3 Gly 120 Asn Lys Glu Gin Gin Phe Arg 125
15 Leu Trp Phe Asp 130 Pro Thr Ser 135 Ser Phe His Thr Tyr 140 Ser Ile Val Trp
Asn Ser Gin Arg 145 Ile Ile Phe 150 Leu Val Asp Asn Ile 155 Pro Ile Arg Val 160
20 Phe Asn Asn His Glu 165 Ala Leu Gly Val Ala Tyr Pro 170 Ly3 Asn Gin Ala 175
Mat Arg Val Tyr 130 Ala Ser Leu Trp A3n 185 Ala Asp Asp Trp Ala Thr Gin 190
25
Gly Gly Arg Val 195 Lys Thr Asp Trp Ser 200 Met Ala Pro Phe Thr Ala Ser 205
30 Tyr Arg Asn Phe 210 Asn Thr Asn 215 Ala Cy3 Val Trp Ser 220 Ala Ala Thr Ser
Thr Ser Ser Cys 225 Gly Gly Ser 230 Ly3 Thr Glu Ser Val 235 Asn Asn Asp Glu 240
35 Thr Trp Gin Thr Gin 245 Gin Leu Asn Ala Asn Gly Arg 250 Asn Arg Ile Arg 255
Trp Val Gin Gin 260 Lya Tyr Met Ile Tyr 265 Asn Tyr Cys Ala Asp Ala Asn 270
40
Arg Phe Ser Gin Gly Phe Ser Pro Glu Cys Lye Arg Ser Arg Phe
275 280 285
- 40 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI 9 (i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 26 párů baží s (B) Typ: nukleová kyselina (C) Typ řetězce: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne (iii) V opačném smyslu: ne 15 (xi) Popis sekvence: Sekvence 9:
AAGCTTCCTC AACATCAAAG GGTAGA (2) INFORMACE PRO SEKVENCI 10 (i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 26 páru baží 25 (B) Typ: nukleová kyselina (C) Typ řetězce: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA 30 (iii) Hypotetická: ne (iii) V opačném smyslu: ne (xi) Popis sekvence: Sekvence 10:
AAGCTTCATG ATGAAATCGA TATTGA (2) INFORMACE PRO SEKVENCI 11 (i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 26 párů baží (B) Typ: nukleová kyselina (C) Typ řetězce: jednoduchý (D) Topologie: lineární
- 41 (ii) Typ molekuly; cDNA (iii) Hypotetická: ne (iii) V opačném smyslu: ne (xi) Popis sekvence: Sekvence 11:
GGATCCTCAA TATCGATTTC ATCATG (2) INFORMACE PRO SEKVENCI 12 (i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 26 párů baží (B) Typ: nukleová kyselina (C) Typ řetězce: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne (iii) V opačném smyslu: ne (xi) Popis sekvence: Sekvence 12:
AAGCTCCATT TATGGTCTGA TCCAAC (2) INFORMACE PRO SEKVENCI 13 (i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 26 párů baží (B) Typ: nukleová kyselina (C) Typ řetězce: jednoduchý (D) Topologie: lineární 40 (ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne (iii) V opačném smyslu: ne
- 42 (xi) Popis sekvence: Sekvence 13:
GGATCCGTTG GATCAAACCA TAAATG (2) INFORMACE PRO SEKVENCI 14 (i) Charakteristika sekvence' (A) Délka: 26 párů baží (B) Typ: nukleová kyselina (C) Typ řetězce: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne (iii) V opačném smyslu: ne (xi) Popis sekvence: Sekvence 14:
GGATCCGTTA ACGTGTGGTC TCGTGT (2) INFORMACE PRO SEKVENCI 15 (i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 20 párů baží (B) Typ: nukleová kyselina (C) Typ řetězce: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne (iii) V opačném smyslu: ne (xi) Popis sekvence: Sekvence 15:
GAZGARATNG AYWTHGARTT » 40
- 43 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI 16 (i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 20 páru baží 5 (B) Typ: nukleová kyselina (C) Typ řetězce: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne (iii) V opačném smyslu: ne 15 (xi) Popis sekvence: Sekvence 16:
GTNGGRTCRA ACCANAKRTG (2) INFORMACE PRO SEKVENCI 17 (i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 19 páru baží 25 (B) Typ: nukleová kyselina (C) Typ řetězce: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA 30 (iii) Hypotetická: ne (iii) V opačném smyslu: ne 35 (xi) Popis sekvence: Sekvence 17:
CGATGCAGCT GGAATTTCA (2) INFORMACE PRO SEKVENCI 18 (i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 20 párů baží
4S (B) Typ: nukleová kyselina (C) Typ řetězce: jednoduchý (D) Topologie: lineární
- 44 (ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne (iii) V opačném smyslu: ne (xi) Popis sekvence: Sekvence 18:
AGTTTGAGCT GCAIATCGAA (2) INFORMACE PRO SEKVENCI 19 (i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 20 párů baží (B) Typ: nukleová kyselina (C) Typ řetězce: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne 25 (iii) V opačném smyslu: ne (xi) Popis sekvence: Sekvence 19:
TTTGATCCCA CCTCGCCGTT (2) INFORMACE PRO SEKVENCI 20 35 (i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 20 párů baží (B) Typ: nukleová kyselina (C) Typ řetězce: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne (iii) V opačném smyslu: ne
(xi) Popis sekvence: Sekvence 20
5 CAGCTGACCA AACACAAGCA (2) INFORMACE PRO SEKVENCI 21
10 (i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 20 páru baží (B) Typ: nukieová kyselina (C) Typ řetězce: jednoduchý (D) Topologie: lineární
. 15 (ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne
20 (iii) V opačném smyslu: ne (xi) Popis sekvence: Sekvence 21: attaaccctc actaaaggga
25
30 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI 22 (i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 20 párů baží (B) Typ: nukieová kyselina (C) Typ řetězce: jednoduchý (D) Topologie: lineární
35 (ii) Typ molekuly: cDNA
(iii) Hypotetická: ne
40 (iii) V opačném smyslu: ne (xi) Popis sekvence: Sekvence 22: TAATACGACT CACTAIAGGG
- 46 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI 23 (i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 19 párů baží 5 (B) Typ: nukleová kyselina (C) Typ řetězce: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne (iii) V opačném smyslu: ne 15 (xi) Popis sekvence: Sekvence 23:
GTTTTCCCAG TCACGACGT (2) INFORMACE PRO SEKVENCI 24 (i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 19 párů baží as (B) Typ: nukleová kyselina (C) Typ řetězce: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne (iii) V opačném smyslu: ne 35 (xi) Popis sekvence: Sekvence 24:
AATATCAGCG GAAACAGGG • 40 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI 25 (i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 20 párů baží (B) Typ: nukleová kyselina (C) Typ řetězce: jednoduchý (D) Topologie: lineární
- 47 (ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne (iii) V opačném smyslu: ne (xi) Popis sekvence: Sekvence 25:
CCCTGTTTCC GCTGATAATT (2) INFORMACE PRO SEKVENCI 26 15 (i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 20 párů baží (B) Typ: nukleová kyselina (C) Typ řetězce: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne 25 (iii) V opačném smyslu: ne (xi) Popis sekvence: Sekvence 26:
CTATTAGCAT CTGCACAGTA (2) INFORMACE PRO SEKVENCI 27 35 (i) Charakteristika sekvence (Á) Délka: 20 párů baží (B) Typ: nukleová kyselina (C) Typ řetězce: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne 45 (iii) V opačném smyslu: ne >
- 48 (xi) Popis sekvence: Sekvence 27:
TACTGTGCAG ATGCTAATAG (2) INFORMACE PRO SEKVENCI 28 (i) Charakteristika sekvence io (A) Délka: 20 párů baží (B) Typ: nukleová kyselina (C) Typ řetězce: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne (iii) V opačném smyslu: ne (xi) Popis sekvence: Sekvence 28:
GGAGGACGGG TGAAGACAGA (2) INFORMACE PRO SEKVENCI 29 (i) Charakteristika sekvence 30 (A) Délka: 20 páru baží (B) Typ: nukleová kyselina (C) Typ řetězce: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne (iii) V opačném smyslu: ne (xi) Popis sekvence: Sekvence 29:
GTGTAAGGTA GTCCTGATGA
(2) INFORMACE PRO SEKVENCI 30
5 (i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 20 párů baží (B) Typ: nukleová kyselina (C) Typ řetězce: jednoduchý (D) Topologie: lineární
10 (ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne
(iii) V opačném smyslu: ne
• 15 (xi) Popis sekvence: Sekvence 30: TCATCAGGAC TACCTTACAC
20 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI 31
25 (i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 20 párů baží (B) Typ: nukleová kyselina (C) Typ řetězce: jednoduchý (D) Topologie: lineární
30 (ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne
35 * (iii) V opačném smyslu: ne (xi) Popis sekvence: Sekvence 31: CCCTTGGATC CGCTATAATT
40 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI 32
45 (i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 20 aminokyselin (B) Typ: aminokyselinová (D) Topologie: neznámá
- 50 (ii) Typ molekuly: peptid (iii) Hypotetická: ne (iii) V opačném smyslu: ne (v) Typ fragmentu: N-koncový (xi) Popis sekvence: Sekvence 32:
Mat Arg Gly Ser His His HÍ3 His His His Gly Ser Ala Asp Asn Phe 15 10 15
Tyr Gin Asp Ala
20 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI 33 (i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 15 aminokyselin (B) Typ: aminokyselinová (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: peptid (iii) Hypotetická: ne (iii) V opačném smyslu: ne (v) Typ fragmentu: N-koncový (xi) Popis sekvence: Sekvence 33:
Gly Tyr Pro Arg Arg Pro Val Asp Val Pro Phe Trp Ly3 Asn Tyr 15 10 15 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI 34 (i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 21 párů baží (B) Typ: nukleová kyselina (C) Typ řetězce: jednoduchý (D) Topologie: lineární
- 51 (ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne (iii) V opačném smyslu: ne (xi) Popis sekvence: Sekvence 34:
ATCGGGAGCG GCGATACCGT A

Claims (2)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Polypeptid s xyloglukan endo-transglykosylázovou (XET) 5 aktivitou, vyznačující se tím, že podstatně obsahuje zbytky 21 - 289 sekvence aminokyselin podle obrázku 1 (Sekvence 2) nebo její funkční ekvivalent s alespoň 80 % shodou aminokyselin.
    io 2. Polypeptid podle nároku 1, vyznačující se tím, že podstatně obsahuje zbytky 1 - 289 sekvence aminokyselin podle obrázku 1.
    3. Polypeptid podle nároku 1, vyznačující se 15 t í m , ž e podstatně obsahuje zbytky 19 - 287 sekvence aminokyselin podle obrázku 5 (Sekvence 8).
    4. Polypeptid podle nároku 1, vyznačující se tím, že podstatně obsahuje zbytky 1 - 287 sekvence
    20 aminokyselin podle obrázku 1.
    5. Polypeptid podle některého z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že má alespoň z 85 % shodné aminokyseliny se sekvencí zbytků 21 - 289 sekvence
    25 aminokyselin podle obrázku 1.
    - 53 6. Polypeptid podle některého z předcházejících nároku, vyznačující se tím, že má alespoň z 90 % shodné aminokyseliny se sekvencí zbytků 21 - 289 sekvence aminokyselin podle obrázku 1.
    7. Polypeptid podle některého z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že obsahuje jeden nebo více z následujících peptidů DEIDFEFLGN; SLWNADDWAT; FYSKNEYLFG; a GTVTTFYLSS, přičemž v každém peptidu io je možná odlišnost v jedné nebo maximálně ve dvou aminokyselinách.
    8. Polypeptid podle některého z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že je v podstatě
    15 izolován od jiných rostlinných látek.
    9. Nukleotidová sekvence vyznačující se tím, ž e kóduje v podstatě sekvenci aminokyselin zbytků 21 289 sekvence aminokyselin podle obrázku 1, nebo funkční
    20 ekvivalent, který má alespoň 70 % homologii s + nebo řetězcem takové nukleotidové sekvence.
    10. Nukleotidová sekvence podle nároku 9, vyznačující se tím, že podstatně obsahuje sekvenci DNA podle 25 obrázku 1 (Sekvence 1).
    11. Nukleotidová sekvence podle nároku 9, vyznačující se tím, že kóduje v podstatě sekvenci aminokyselin zbytků 19 - 287 sekvence aminokyselin podle obrázku 5.
    - 54 12. Nukleotidová sekvence podle nároku 11, vyznačující se tím, že podstatně obsahuje sekvenci DNA podle obrázku 5 (Sekvence 7).
    13. Nukleotidová sekvence podle nároku 9 nebo 11, vyznačující se tím, že dále obsahuje promotor pro umožnění exprese v hostitelské buňce.
    io 14. Nukleotidová sekvence podie nároku 13, vyznačující se tím, že promotor je různý od promotoru, se kterým je sekvence přirozeně spojena v rostlině.
    15 15. Nukleotidová sekvence podle nároku 9, vyznačující se tím, že má alespoň 80 % homologii s + nebo řetězcem nukleotidové sekvence podle obrázku 1.
    16. Nukleotidová sekvence podle nároku 15, vyzná20 č u j í c í s e t í m , ž e má alespoň 85 % homologii s + nebo - řetězcem nukleotidové sekvence podle obrázku 1.
    17. Nukleotidová sekvence podle některého z nároků 9 - 16, vyznačující se tím, že kóduje polypeptid
  2. 2s podle některého z nároků 1 až 8.
    18. DNA vektor, vyznačující se tím, ž e obsahuje sekvenci podle některého z nároků 9-17.
    1 ,(
    - 55 19. Vektor podle nároku 18, vyznačující se tím, ž e je schopen po zavedení do vhodného hostitele řídit expresi polypeptidu podle některého z nároků 1 - 8.
    20. Hostitelská buňka, vyznačující se tím, ž e má zavedenu nukleotidovou sekvenci podle některého z nároků 9-17, nebo její potomstvo.
    io 21. Hostitelská buňka podle nároku 20, vyznačující se tím, že obsahuje vektor podle některého z nároků 18 nebo 19.
    22. Způsob výroby polypeptidu s xyloglukan endo15 transglykosylázovou (XET) aktivitou, vyznačující se tím, že zahrnuje kroky: zavedení vektoru podle nároku 19 do vhodné hostitelské buňky; růst hostitelské buňky a/nebo jejího potomstva ve vhodných kultivačních podmínkách, takže je exprimován polypeptid; a získání
    2o polypeptidu z kultivačního media a/nebo hostitelských buněk.
    23. Způsob podle nároku 22, vyznačující se tím, ž e hostitelskou buňkou je rostlinná buňka nebo
    25 mikroorganismus.
    24. Způsob podle nároku 22 nebo 23, vyznačující se tím, že hostitelskou buňkou je kvasinková buňka.
    - 56 25. Způsob ovlivnění charakteristiky rostliny nebo její části, vyznačující se tím, že zahrnuje vnesení účinného množství nukleotidové sekvence podle některého z s nároků 9 - 17 do rostliny nebo její části, aby se změnila úroveň aktivity XET v rostlině nebo její části.
    26. Způsob podle nároku 25, vyznačující se tím, ž e úroveň aktivity XET v rostlině nebo její části je snížena.
    10
    27. Způsob podle nároku 25 nebo 26, vyznačující se tím, ž e je změněna jedna nebo více z následujících charakteristik: velikost, rychlost růstu, textura, zrání.
    15 'Rostljna, získaná genetickým inženýrstvím, vyznač ú'j t c- l _ .se tím, že je vyrobená způsobem podle některého z rrároků. 25, 26 nebo 27, nebo ^potomstvo takové rostliny.
CZ961361A 1993-11-10 1994-11-10 Polypeptide nucleotide chain, dna vector, process for preparing such polypeptide and a plant obtained by genetic engineering method CZ136196A3 (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB939323225A GB9323225D0 (en) 1993-11-10 1993-11-10 Novel plant enzyme

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CZ136196A3 true CZ136196A3 (en) 1996-12-11

Family

ID=10744976

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ961361A CZ136196A3 (en) 1993-11-10 1994-11-10 Polypeptide nucleotide chain, dna vector, process for preparing such polypeptide and a plant obtained by genetic engineering method

Country Status (16)

Country Link
US (1) US6215044B1 (cs)
EP (1) EP0728208B1 (cs)
JP (1) JPH09511121A (cs)
AT (1) ATE236256T1 (cs)
AU (1) AU698844B2 (cs)
CA (1) CA2176133A1 (cs)
CZ (1) CZ136196A3 (cs)
DE (1) DE69432427T2 (cs)
DK (1) DK0728208T3 (cs)
ES (1) ES2196048T3 (cs)
GB (1) GB9323225D0 (cs)
HU (1) HUT74598A (cs)
PL (1) PL317046A1 (cs)
PT (1) PT728208E (cs)
SK (1) SK57696A3 (cs)
WO (1) WO1995013384A1 (cs)

Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PL186468B1 (pl) 1995-12-21 2004-01-30 Novozymes As Sposób obróbki materiałów celulozowych
JP4472787B2 (ja) * 1997-02-26 2010-06-02 ノボザイムス アクティーゼルスカブ 微生物キシログルカン エンドトランスグリコシラーゼ（ｘｅｔ）
ID24088A (id) * 1997-07-27 2000-07-06 Yissum Res Dev Co Tanaman transgenik dengan morfology pengganti dan gen endo-1,4-alpha-glukanasa arabidopsis thaliana terisolasi, a, promoter dan protein
GB9720038D0 (en) * 1997-09-19 1997-11-19 Nickerson Biocem Ltd Control
CA2328137A1 (en) 1998-05-29 1999-12-09 Novo Nordisk A/S Methods for using xyloglucan endotransglycosylase in baking
GB0307294D0 (en) * 2003-03-29 2003-05-07 Univ Southampton A novel genetic approach to improve the processability of fresh produce
US20100143969A1 (en) * 2005-03-24 2010-06-10 Neose Technologies, Inc. Expression of soluble, active eukaryotic glycosyltransferases in prokaryotic organisms
WO2015134729A1 (en) 2014-03-05 2015-09-11 Novozymes A/S Compositions and methods for improving properties of non-cellulosic textile materials with xyloglucan endotransglycosylase
US20170027167A1 (en) 2014-03-05 2017-02-02 Novozymes Bioag A/S Formulations comprising polymeric xyloglucan as a carrier for agriculturally beneficial agents
CN106062271A (zh) 2014-03-05 2016-10-26 诺维信公司 用于改进具有木葡聚糖内糖基转移酶的纤维素纺织材料的性质的组合物和方法
WO2015134773A1 (en) 2014-03-05 2015-09-11 Novozymes A/S Compositions and methods for functionalizing and linking materials
CN106068077B (zh) 2014-03-05 2019-06-07 诺维信公司 用于改进农作物的收获后特性的组合物和方法

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ZA931333B (en) * 1992-02-28 1994-08-25 Unilever Plc Recombinant plant enzyme.
JP2898499B2 (ja) 1992-03-26 1999-06-02 寳酒造株式会社 エンド型キシログルカン転移酵素遺伝子

Also Published As

Publication number Publication date
DE69432427D1 (de) 2003-05-08
EP0728208A1 (en) 1996-08-28
EP0728208B1 (en) 2003-04-02
US6215044B1 (en) 2001-04-10
GB9323225D0 (en) 1994-01-05
ES2196048T3 (es) 2003-12-16
JPH09511121A (ja) 1997-11-11
HU9601232D0 (en) 1996-06-28
DK0728208T3 (da) 2003-07-21
HUT74598A (en) 1997-01-28
DE69432427T2 (de) 2004-03-18
AU698844B2 (en) 1998-11-12
PL317046A1 (en) 1997-03-03
ATE236256T1 (de) 2003-04-15
PT728208E (pt) 2003-08-29
SK57696A3 (en) 1996-10-02
AU8112994A (en) 1995-05-29
CA2176133A1 (en) 1995-05-18
WO1995013384A1 (en) 1995-05-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Arrowsmith et al. Characterisation of two tomato fruit-expressed cDNAs encoding xyloglucan endo-transglycosylase
JP4068152B2 (ja) セルロース及び／又はβ―１，４―グルカンの操作
AU724942B2 (en) Transgenic potatoes having reduced levels of alpha glucan L- or H-type tuber phosphorylase activity with reduced cold-sweetening
De Silva et al. Xyloglucan endotransglycosylase and plant growth
JPH11513256A (ja) 種子粉砕
AU8991198A (en) Improvements in or relating to stability of plant starches
JP2002509696A (ja) 植物ＧｎｔＩ配列、及びＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ（ＧｎＴＩ）活性が減少または欠如した植物の産生のためにそれを用いる方法
KR20010108234A (ko) 푸코실 트랜스퍼라제 유전자
KR100271594B1 (ko) 엔도-1, 4-베타-d-글루카나제
EP0629243A1 (en) Recombinant plant enzyme
CZ136196A3 (en) Polypeptide nucleotide chain, dna vector, process for preparing such polypeptide and a plant obtained by genetic engineering method
AU707797B2 (en) Novel (exo)-(1-4)-beta-D galactanase
Tu et al. Expression of the Brazil nut methionine-rich protein and mutants with increased methionine in transgenic potato
US5646029A (en) Plant arabinogalactan protein (AGP) genes
JPH11514222A (ja) 植物グルタチオンｓ−トランスフェラーゼプロモーター
US5912413A (en) Isolation of SU1, a starch debranching enzyme, the product of the maize gene sugary1
CN100419077C (zh) 编码甘油-3-磷酸酰基转移酶的dna链
US6469230B1 (en) Starch debranching enzymes
JPWO1997005246A1 (ja) グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼをコードするｄｎａ鎖
US6495743B1 (en) Plant xylanases
JP3349440B2 (ja) 植物の制御方法
WO1999023200A2 (en) The uridine diphosphate glucose dehydrogenase gene and its role in altering plant growth and plant characteristics
JPH0690632A (ja) 矮性ペチュニアの作成法
MXPA99010181A (es) Pululanasa de maiz
AU3225099A (en) Novel exo-(1-ge4)-beta-D galactanase