JPH09511125A

JPH09511125A - 腫瘍形成能抑制活性を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド

Info

Publication number: JPH09511125A
Application number: JP7515713A
Authority: JP
Inventors: ホーフェエリックフォン; モーシェシーフ
Original assignee: ハイブリドンインコーポレイテッド; マックギルユニヴァーシティー
Priority date: 1993-12-01
Filing date: 1994-11-30
Publication date: 1997-11-11
Also published as: DE69431164T2; DE69431164D1; AU1296195A; EP0731835B1; ATE221914T1; CA2177732C; US5919772A; US5578716A; ES2180622T3; EP0731835A1; DK0731835T3; PT731835E; US6054439A; CA2177732A1; AU700264B2; WO1995015378A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、哺乳類のＤＮＡメチルトランスフェラーゼをコードするｍＲＮＡまたは二本鎖ＤＮＡに相補的な腫瘍形成能抑制アンチセンスオリゴヌクレオチドを包含する。本発明はさらに、腫瘍形成能を抑制する方法、および腫瘍形成能抑制アンチセンスヌクレオチドを含む医薬組成物を包含する。

Description

【発明の詳細な説明】腫瘍形成能抑制活性を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド発明の分野本発明は、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼの発現の抑制に使用するオリゴヌクレオチドに関し、より具体的には腫瘍形成能のアンチセンス抑制に関する。関連技術の記載細胞の正常な遺伝子発現プロフィールの変化は、発癌性変化の初期事象であると考えられる。腫瘍遺伝子の多くは転写因子である。しかしながら、多数の腫瘍遺伝子は転写因子ではないけれども、転写因子の活性化の引き金となるシグナル変換経路（例えばＲＡＳ誘導経路によるＪｕｎの活性化）で中心的役割を果たす。ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＤＮＡＭｅＴａｓｅ）遺伝子の５’領域の性状が最近明らかにされた(Rouleauら、J．Biol．Chem.，267:7368-7377(1992)) 。この領域は、少なくとも２つの機能的ＡＰ−１部位を含み、この遺伝子のプロモーターは、Ｆｏｓ、ＪｕｎまたはＲａｓによって劇的に遠隔活性化（transact ivated）を受けることができる。ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ遺伝子は、ジヌクレオチド配列ＣｐＧのシトシン残基をメチル化することができる活性をコードする。ＤＮＡメチル化の特徴は、ＣｐＧ部位の８０％を作為的態様でメチル化し、部位特異的、組織特異的さらに遺伝子特異的メチル化パターンを生じることである。メチル化パターンは発生の段階で形成される。適切なメチル化パターンの樹立と維持(Razin & Szyf，Biochem．Biophys．Acta，782:331-342(1984))は、発生（Liら、Cell，69:915-926(1992)）および細胞分化の状態を限定する(Szy fら、J．Biol．Chem.，267:12831-12836(1992))ために必須である。メチル化パターンは、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼによって複製時に維持され(Szyfら、J．Biol．Chem.，260:8653-8656(1985))、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ活性および遺伝子発現レベルは、種々の初代培養細胞および永代細胞株の増殖の状態で調節されている(Szyfら、J．Biol．Chem.，266:10027-10030(1991))。ＤＮＡメチル化と腫瘍形成能との関係はここしばらく混乱の状態にある。幾つかの報告は、ある種の遺伝子の低メチル化は新形成を暗示することを示唆した( 例えば以下を参照のこと、Ohtani-Fukitaら、Oncogene，8:1063-1967(1993))。しかしながら、多くの報告は、ゲノムＤＮＡ全体の低メチル化を明らかにした( 例えば以下を参照のこと、Feinbergら、Cancer Res.，48:1159-1161(1988); Goe lz & Vogelstein，Science，228:187-190(1985))。また他の報告は、個々の遺伝子の低メチル化を腫瘍形成と結び付けた（例えば以下を参照、Feinberg & Vogel stein，Nature，301:89-92(1983); Jones & Buckley，Adv．Can．Res.，54:1-12 (1990)）。さらにまた、ＤＮＡメチル化と癌についての最新の仮説では、ＤＮＡメチル化を低下させる薬剤は細胞の癌化を引き起こすことを示唆するということが提唱された(Jones & Buckley，上掲書)。したがって、従来技術は、ＤＮＡメチル化をどのように調節すれば腫瘍形成能を減少させることができるかについて意義のある提案を欠いている。アンチセンスオリゴヌクレオチド技術は、種々の遺伝子の発現抑制を可能にした。一般的にはアグラワルの報告を参照されたい(Agrawal，Trends in Biotech. ，10:152(1992))。ＲＮＡの相補的核酸配列に結合することによって、アンチセンスオリゴヌクレオチドはＲＮＡの組み継ぎ接合（スプライシング）と翻訳を抑制することができる。このようにして、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、蛋白の発現を抑制することができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、ゲノムＤＮＡに結合して三重合体(triplex)を形成し、転写を抑制することができることも明らかにされた。さらに、統計的に１７量体の塩基配列は、ヒトゲノムでただ１度発生し、したがって、そのようなアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて、特異的な配列に極めて正確に照準を合わせることが可能である。１９７８年にザメクニックとステファンソンは、治療目的でアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用することを初めて提唱した（Zamecnik & Stephenson，Pro c．Natl．Acad．Sci．USA，75:285(1978); Zamecnik & Stephenson，Proc．Natl ．Acad．Sci．USA，75:280(1978)）。彼らは、ラウス肉腫ウイルスのＲＮＡに対して相補的な１３量体のオリゴヌクレオチドを用いることによって、細胞培養でウイルスの増殖が抑制されることを報告した。その時から、アンチセンスオリゴヌクレオチドのウイルス増殖抑制のインビトロでの有効性を明らかにする膨大なその他の研究が報告されてきた。例えば、水庖性口内炎ウイルス（Leonetti ら、Gene，72:323(1988)）、単純庖疹ウイルス(Smithら、Proc．Natl．Acad．Sc i．USA，83:2787(1986))、およびインフルエンザウイルス(Zerialら、Nucleic A cidsRes.，15:9909(1987))である。アンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、内因性哺乳類遺伝子の蛋白発現を抑制することが示された。例えば、バーチとメーハンは、ネズミおよびヒトのＩＬ −１レセプターを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドを開示したが、これらは、それぞれネズミおよびヒトの線維芽細胞でＩＬ−１刺激ＰＧＥ₂合成を抑制した（Burch & Mahan，J．Clin．Invest.，88:1190(1991)）。コリージらは、アンチセンスオリゴヌクレオチドが、核酸導入(transfected)マウス３Ｔ３細胞で変異ヒトプロコラーゲン遺伝子の発現を、この同じ蛋白の内因性遺伝子の発現を抑制することなく特異的に抑制することを開示した（Coligeら、Biochemist ry，32:7(1993)）。さらに、モニアらは、ホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて変異体Ｈａ−ｒａｓｍＲＮＡの発現が選択的に抑制されることを示した(Moniaら、J．Biol．Chem.，267:19954(1992))。アンチセンス手法は種々の病状に対して有望であることを示したが、アンチセンス手法の使用の成功によって腫瘍形成に影響を与えることを可能にする何らかの遺伝子標的が存在するのか否か、またはどのように存在するのかについての明確な情報はない。したがって、この有望な技術を新形成に対抗するために利用することが可能なように開発する必要がある。発明の要旨これまでの開示は、ＤＮＡメチル化を抑制する薬剤は細胞を形質転換させる能力を有することを示唆した（Jones & Buckley，Adv．in Cancer Res.，54:1-23( 1990)参照）。本発明は、驚くべきことに腫瘍形成能抑制活性を示すアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。本発明のオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子の発現を抑制することによって腫瘍形成を抑制する。これらのオリゴヌクレオチドは、哺乳類のＤＮＡメチルトランスフェラーゼをコードするｍＲＮＡまたは二本鎖ＤＮＡに相補的である。本発明はさらに、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ遺伝子の発現を防止するために有用な化合物、組成物および方法を提供する。本発明のさらに別の目的は、腫瘍形成を治療しさらに抑制するための化合物、組成物および方法を提供することである。したがって、本開示は、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼをコードする核酸配列に結合させ、それによってその発現生成物の産生を阻害するように構築されたアンチセンスオリゴヌクレオチドを提示する。さらに提示されるものは、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼの発現および腫瘍形成を抑制する方法である。本発明は腫瘍をもつ実験用マウスの治癒に有用である。より特定すれば、本発明は、ヒトの腫瘍（特にヒト小型肺細胞癌）をもつヌードマウスの治癒に有用である。したがって、本発明は、実験終了時に動物を殺処分することを避けるために用いてもよい。本発明は、細胞株（特にマウスおよびヒト癌細胞株）で、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼに対してアンチセンスメッセージを発現させることによって腫瘍発生を抑制する方法を提供する。アンチセンスＤＮＡメチルトランスフェラーゼの発現は以下の現象をもたらす。（ｉ）ゲノムのメチル化含有量の一般的低下、（ｉｉ）細胞株内で異常にメチル化された領域（例えば副腎特異的２１−ヒドロキシラーゼ遺伝子の他、腫瘍サプレッサ遺伝子座）の脱メチル化、（ｉｉｉ）形質転換表現型の抑制を示唆する形態的変化、（ｉｖ）インビトロでの腫瘍形成の抑制の他、脈管形成機能の低下、および（ｖｉ）適切な条件下でアポプトシスによる細胞死プログラムを受ける能力。図面の簡単な説明図１は、ｐＺＥＭおよびｐＺαＭプラスミドの物理的地図である。メタロチオニン（ＭＴ）プロモーター（黒塗り四角）、ヒト成長ホルモン３’領域（ＨＧＨ）（白色棒）、およびメチルトランスフェラーゼｃＤＮＡ配列（斜線部分）が図示されている。図２は、Ｙ１_pＺαＭ核酸導入体（transfectant）の全ゲノムＤＮＡおよび特定遺伝子のメチル化の状態を示すグラフである。Ｃおよび５−メチルＣに対応するＴＬＣプレート上のスポットをこすり落とし、液体βシンチレーションカウンターで計数した。値は平均±ＳＥＭを示す。図３は、Ｙ１ｐＺＥＭ（クローン４および７）およびＹ１ｐＺαＭ核酸導入体（クローン４、７および９）の付着物非依存性増殖アッセーを示すグラフである。図４は、Ｙ１ｐＺαＭ核酸導入体に由来する腫瘍でのアンチセンス発現の低下を示すグラフである。図５ａは、密度制限増殖アッセーによって求めたＹ１ｐＺαＭ細胞の生存およびアポプトシスを示すグラフである。図５ｂは、血清枯渇培養液でのＹ１ｐＺαＭ細胞の生存およびアポプトシスを示すグラフである。図６は、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼに対するアンチセンスを発現しているＮＣＩＨ４４６細胞およびＤＮＡメチルトランスフェラーゼのコントロールセンスオリゴヌクレオチドを発現している細胞でのＣｐＧメチル化の％を示すグラフである。図７は、アンチセンスおよびコントロールオリゴヌクレオチドで処理したＮＣＩＨ４４６細胞の、軟寒天中で付着物非依存性態様で増殖することができる能力を示す。好ましい実施例の詳細な記載本発明は、驚くべきことに腫瘍形成能を抑制するアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。これらのオリゴヌクレオチドは、哺乳類、特にヒトまたはネズミのＤＮＡメチルトランスフェラーゼを発現するｍＲＮＡまたは二本鎖ＤＮＡに相補的で、予想に反して腫瘍形成能抑制活性を示す。本発明の好ましいアンチセンスオリゴヌクレオチドの１つは５’−ＣＡＴＣＴＧＣＣＡＴＴＣＣＣＡＣＴＣＴＡ−３’（配列番号：１）でホスホジエステルまたはホスホロチオエート結合のいずれかを有する。他の適切なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート、５’−ＴＴＧＧＣＡＴＣＴＧＣＣＡＴＴＣＣＣＡＣＴＣＴＡ−３’ （配列番号：２）を含む。腫瘍形成能にインビボで対抗する活性を有する修飾オリゴヌクレオチドは、本明細書では抗腫瘍形成性または腫瘍形成能抑制修飾オリゴヌクレオチドと呼ぶ。本発明は、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼの発現を抑制することにおいて有効性を有する腫瘍形成能抑制修飾オリゴヌクレオチドを提供する。本発明の修飾オリゴヌクレオチドは、下記のそれぞれ好ましい実施例において詳細に検討する特定の好ましい特徴を有する。これらの特徴に加え、本発明の修飾オリゴヌクレオチドは、場合によって追加のリボヌクレオチド、２’−置換リボヌクレオチド、および／またはデオキシリボヌクレオチド単量体を有していてもよく、そのいずれも５’−３’結合を介して共に連結されてあり、この結合には当該技術分野で既知のヌクレオチド間結合の全てが含まれる。好ましくは、そのような修飾オリゴヌクレオチドは、場合によってホスホジエステル、ホスホトリエステル、ホスホルアミデート、シロキサン、カルボネート、カルボキシメチルエステル、アセトアミデート、カルバメート、チオエーテル、架橋ホスホルアミデート、架橋メチレンホスホネート、架橋ホスホロチオエートおよび／またはスルホンヌクレオチド間結合を含むことができる。下記文献で詳述されているように、これらヌクレオチド間結合のいずれかを含むオリゴヌクレオチドの合成は当業者には周知であることは当業者には理解されよう(Uhlmann & Peyman，Chemical Reviews，90: 543-584(1990); Schneider & Banner，Tetrahedron Lett.，21:335(1990))。好ましくは、本発明の修飾オリゴヌクレオチドは、合計約６から約１００個の単量体、最も好ましくは合計約１２から約５０の単量体を含むべきである。そのような修飾オリゴヌクレオチドはまた、場合によって修飾核酸塩基および／または糖の他、追加置換基（例えばジアミン、コレステリルまたは他の親油基）を含むことができる。本発明の修飾オリゴヌクレオチドの種々の好ましい実施例は下記で検討される。これら実施例の全てはＤＮＡメチルトランスフェラーゼ遺伝子の同じ領域のヌクレオチド配列を有するが、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼの他の必須の核酸配列に対して相補的なヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドの腫瘍形成能抑制の有効性は、本発明の修飾オリゴヌクレオチドの好ましい実施例の構造的特徴をそのようなオリゴヌクレオチドに取り込ませることによってもまた強化できることは、当業者には理解されるところである。本発明の目的のためには、相補的とは、生理的条件下でこの必須の核酸配列にハイブリダイズする配列を有することを意味する。ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ遺伝子の必須の核酸配列とは、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼを発現するために必要な核酸配列を指す。例えば、そのようなオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ遺伝子由来の他の配列を有することができる。実際、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ遺伝子由来のいずれの配列も（ロウリューらまたはイェンらによって開示された５’領域(Rouleauら、J．Biol．Chem.，267: 7368-7377(1992); Yenら、Nucl．AcidsRes.，9:2287-2291(1992))本発明の修飾オリゴヌクレオチドの基礎として役立つはずである。実際的な事柄として、本発明の修飾オリゴヌクレオチドの好ましい実施例の構造的特徴は、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ遺伝子に必須であるいずれかの核酸配列と細胞内でハイブリダイズするヌクレオチド配列を有する、いずれのアンチセンスオリゴヌクレオチドの腫瘍形成能抑制活性をも強化するはずである。本発明の修飾オリゴヌクレオチドの各々好ましい実施例は、それぞれ別個に極めて詳細に下記で考察される。第一の好ましい実施例では、本発明の腫瘍形成能抑制修飾オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエートまたはホスホロジチオエートヌクレオチド間結合によって連結された１つまたは２つ以上のヌクレオチド領域（“ホスホロチオエートまたはホスホロジチオエート領域”）の他、アルキルホスホネートヌクレオチド間結合によって連結された１つまたは２つ以上の領域（“アルキルホスホネート領域”）を有する混成バックボーンまたはキメラオリゴヌクレオチドの形態を有する。この実施例では、少なくとも１つのアルキルホスホネート領域は、好ましくは、このオリゴヌクレオチドの５’末端にもしくは５’末端近くに、および／または３’末端にもしくは３’末端近くにヌクレオチドを含む。本発明の目的のために、“このオリゴヌクレオチドの５’末端にもしくは５’末端近くに、および／または３’末端にもしくは３’末端近くに”は、このオリゴヌクレオチドの５ ’または３’末端から約５ヌクレオチド以内に少なくとも１個のヌクレオチドを含むことを意味する。好ましくは、このアリキルホスホネート領域は、アルキルホスホネート結合によって連結された約２個から約１０個の連続したヌクレオチドを含む。好ましくは、このホスホロチオエートまたはホスホロジチオエート領域は、ホスホロチオエートまたはホスホロジチオエート結合によって連結された少なくとも３個、さらには約１００個までの連続したヌクレオチドを含む。このタイプのバックボーン構造をもつオリゴヌクレオチドの多くの例は、米国特許第５１４９７９７号および５２２０００７号で教示されているが、その教示内容は参照により本明細書に含まれる。本発明のこの実施例の腫瘍形成能抑制活性を有する修飾オリゴヌクレオチドは、固相法によって合成され、ホスホロチオエート領域についてはＨ−ホスホネート化学反応とイオウの酸化が交互になり、アルキルホスホネート領域についてはアルキルホスホンアミデート化学反応が交互に入る。好ましいＨ−ホスホネート手法は米国特許第５１４９７９８号(Agrawalら)に教示されているが、この教示内容は参照により本明細書に含まれる。アルキルホスホンアミダイト化学反応は当該技術分野で周知であり、アグローワルとグッドチャイルドによって詳述されている（Agrawal & Goodchild，Tetrahedron Lett.，28:3539-3542(1987)）。ホスホロジチオエート含有オリゴヌクレオチドの合成もまた当該技術分野で周知であり、米国特許第５１５１５１０号に詳述されている。この教示内容は参照により本明細書に含まれる（さらに、例えばマーシャルとカルサーの文献およびその中の引用文献も参照されたい（Marshall & Caruthers，Science，259:1564-1570 (1993)）。第二の好ましい実施例では、本発明の腫瘍形成能抑制活性をもつ修飾オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエートまたはホスホロジチオエートヌクレオチド間結合によって連結された１つまたは２つ以上のヌクレオチド領域（“ホスホロチオエートまたはホスホロジチオエート領域”）の他、アルキルホスホノチオエートまたはアリールホスホノチオエートヌクレオチド間結合によって連結された１つまたは２つ以上のヌクレオチド領域（“アルキルホスホノチオエート領域”）をもつキメラオリゴヌクレオチドの混成バックボーンの形態を有する。この実施例では、少なくとも１つのアルキルホスホノチオエート領域は、好ましくはこのオリゴヌクレオチドの５’末端または５’末端近く、および／または３’末端または３’末端近くにヌクレオチドを含む。好ましくは、アルキルホスホノチオエート領域は、アルキルホスホノチオエート結合によって連結された約２個から約１０個の連続したヌクレオチドを含む。好ましくは、ホスホロチオエートまたはホスホロジチオエート領域は、ホスホロチオエートまたはホスホロジチオエート結合によって連結された少なくとも３個から約１００個までの連続したヌクレオチドを含む。本発明のこの実施例の腫瘍形成能抑制修飾オリゴヌクレオチドは、合成されるべき各領域についての化学反応を交互に入れ換えて固相法によって合成される。ホスホロチオエートまたはホスホロジチオエート領域は、第一の実施例について述べたように合成される。アルキルホスホノチオエート領域は、アルキルホスファイト結合を介して２つまたは３つ以上のヌクレオシドを一緒に共役させ、続いてアルキルホスファイト結合を酸化的にチオール付加しアルキルホスホノチオエート結合を生成して合成される（例えば、アグローワルらの文献(Agrawalら、Nu cl．Acids Res.，20:2729-2735(1993)を参照のこと）。第三の好ましい実施例では、本発明の腫瘍形成能抑制修飾オリゴヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドの領域（“デオキシリボヌクレオチド領域”）およびリボヌクレオチドまたは２’−置換リボヌクレオチド（“リボヌクレオチド領域”）をもつハイブリッドオリゴヌクレオチドの形態を有する。好ましくは、約１個からほぼ全てのヌクレオチド間結合が、ホスホロチオエートまたはホスホロジチオエート結合である。好ましい２’−置換リボヌクレオチドは、ハロ、アミノ、アルキル、アリールまたは低級アルキル（炭素原子１−６個）置換リボヌクレオシド、特に２’−ＯＭｅ−リボヌクレオチドである。好ましくは、リボヌクレオチド領域のいくつかは、このオリゴヌクレオチドの５’末端または５’末端近く、および／または３’末端または３’末端近くに存在するヌクレオチドを含む。最も好ましくは、リボヌクレオチド領域の各々は、約２個、好ましくは約４から約１００個の連続したリボヌクレオチドおよび／または２’−置換オリゴヌクレオチドを含む。デオキシリボヌクレオチド領域は存在してもしなくてもよいが、それが存在する場合は、約１から約１００個の連続したデオキシリボヌクレオチドを含むことができる。本発明のこの実施例の腫瘍形成能抑制修飾オリゴヌクレオチドは、典型的には固相法、好ましくはホスホルアミダイト法によって合成されるが、この場合、デオキシリボヌクレオチド領域にはデオキシヌクレオチドホスホルアミダイトが、リボヌクレオチド領域にはリボヌクレオチドホスホルアミダイトまたは２’−置換リボヌクレオチドホスホルアミダイトが用いられる。第四の好ましい実施例では、本発明の腫瘍形成能抑制修飾オリゴヌクレオチドは、その５’および／または３’末端に、エキソヌクレアーゼ耐性をこのオリゴヌクレオチドに付与するキャップ構造を有するオリゴヌクレオチドの形態を有する。そのような修飾オリゴヌクレオチドは、好ましくはまた、１個からほぼ全ての修飾（非ホスホジエステル）ヌクレオチド間結合を有する。好ましいキャップ構造は低級アルキル（Ｃ₁−Ｃ₁₂）またはアルコール基を含む。好ましい修飾ヌクレオチド間結合は、ホスホトリエステル、ホスホルアミデート、シロキサン、カルボネート、カルボキシメチルエステル、アセトアミデート、カルバメート、チオエーテル、架橋ホスホルアミデート、架橋メチレンホスホネート、架橋ホスホロチオエート、スルホン、ホスホロチオエートおよびホスホロジチオエート結合を含む。本発明のこの実施例の腫瘍形成能抑制修飾オリゴヌクレオチドは、当該技術分野で周知の方法にしたがって合成される（例えば以下の文献を参照されたい、Uhlmann & Peyman，Chemical Reviews，90:43-584(1990); Schneider & B anner，Tetrahedron Lett.，31:335(1990)）。３’末端にキャップ構造をもつオリゴヌクレオチドのためには、このキャップ構造は固形支持体に可逆的に結合され、続いてこの合成系の第一のヌクレオチド単量体に共役される。５’末端にキャップ構造をもつオリゴヌクレオチドのためには、このキャップ構造は、この合成系の最後のヌクレオチド単量体を付加した後、オリゴヌクレオチドの末端に共役される。第五の実施例では、腫瘍形成能抑制修飾オリゴヌクレオチドは、このオリゴヌクレオチドと分子内でハイブリダイズする自己相補的領域をもち、エキソヌクレアーゼ耐性ヘアピン様構造を形成することによって自己安定化されている（例えばアグローワルらの文献を参照のこと、Agrawalら、Nucleic Acids Res .20:2729-2753(1993)）。本発明のこの実施例の修飾オリゴヌクレオチドは、一般に２つの領域（ＤＮＡメチルトランスフェラーゼハイブリダイズ領域および自己相補的領域）をもつことを特徴とする。このＤＮＡメチルトランスフェラーゼハイブリダイズ領域は、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼの必須の核酸配列に相補的なヌクレオチド配列を有する。好ましくは、この領域は約６から約１００個のヌクレオチドを有する。この実施例では、オリゴヌクレオチドは安定化されている。すなわち、標的ハイブリダイズ領域と自己相補的領域との間の塩基対形成によるか、および／またはこの自己相補的領域内の相補的配列間の塩基対形成によって末端分解性核酸分解（exonucleolytic degradation）に対して耐性を与えられる。オリゴヌクレオチドが、相補的な核酸配列をもつＤＮＡメチルトランスフェラーゼ核酸分子に出会うと、オリゴヌクレオチドのＤＮＡメチルトランスフェラーゼハイブリダイズ領域と自己相補的領域との間の塩基対形成が壊れ、オリゴヌクレオチドのＤＮＡメチルトランスフェラーゼハイブリダイズ領域とこの核酸分子の相補的核酸配列との間の塩基対形成によって置き換えられる。塩基対形成のこの崩壊と置き換えは、標的核酸配列と標的ハイブリダイズ領域との間のハイブリッドによって形成される分子間塩基対構造が自己相補的オリゴヌクレオチドによって形成される分子内塩基対構造よりも熱力学的により安定であるために生じる。本発明のこの実施例のオリゴヌクレオチドの第二の形態は、第一の形態と同様な態様で機能するが、自己相補的塩基対形成に際して異なる構造を形成する。この代替形態はハンマー様構造を形成する。この形態では、この自己相補的領域は、自己相補的領域内で他のオリゴヌクレオチド配列と塩基対を形成できるオリゴヌクレオチド配列を含む。この自己相補的配列はまた、腫瘍形成性ハイブリダイズ領域の相補的なオリゴヌクレオチド配列を含む。本発明の自己安定化オリゴヌクレオチドの第二の重要な領域は自己相補的領域である。この自己相補的領域は、オリゴヌクレオチド内に他のオリゴヌクレオチドに対して相補的なオリゴヌクレオチド配列を含む。これら他のオリゴヌクレオチド配列は、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼハイブリダイズ領域内もしくは自己相補的領域内に存在するかもしれないし、またはそれらは、両方の領域に広がるかもしれない。この相補的配列は塩基対を形成し、ヘアピン構造またはハンマー様構造の形成をもたらす。ヘアピン構造またはハンマー様構造はどちらも、塩基対非形成ヌクレオチドから生じるおそらく４から５個以上のヌクレオチドループを有するであろう。自己相補的領域を中心とする分子内ハイブリダイゼーションによって形成される塩基対の数は多様であってもよいが、エンドヌクレアーゼが３’末端にアクセスできないように二本鎖構造を維持するために適切なものでなければならない。一般には、約４から５個以上の塩基対が、そのような二本鎖構造を維持するために必要である。好ましい実施例では、最も３’側のヌクレオチドを含む連続した１０塩基対をもつ自己安定化オリゴヌクレオチドで形成された約１０個の分子内塩基対が存在する。もちろん、この分子内塩基対形成は、オリゴヌクレオチドの全ヌクレオチドを巻き込むほど広範囲であることも可能である。好ましくは、分子内塩基対形成は、約５０ヌクレオチドまたはそれ未満の自己相補的領域を含む。この実施例のオリゴヌクレオチドは、第四の実施例で述べたように１個からほぼ全ての修飾ヌクレオチド間結合を有する。好ましくは、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼハイブリダイズ領域または自己相補的領域の少なくともいずれか、最も好ましくはその両方が、ホスホロチオエートおよび／またはホスホロジチオエート結合によって共役された約２個からほぼ全てのヌクレオチドを含む。上記の種々の好ましい実施例の特徴を組み合せ、より高い腫瘍形成能抑制活性さえももつまた別の具体例を製造することが可能であることは、当業者には理解されるところである。したがって本発明は、キメラの特性、ハイブリッドの特性、キャップ構造および自己安定化特性（全て本明細書に開示されている）のあらゆる可能な組合せを有する修飾腫瘍形成能抑制オリゴヌクレオチドを含む。そのようなオリゴヌクレオチドは腫瘍増殖抑制用治療薬として有用である。そのような処置のために、オリゴヌクレオチドは、腹腔内、鼻腔内、経口的または肛門内に投与できる。好ましくは、そのようなオリゴヌクレオチドは、約１から約５０ｍｇ／ｋｇ体重の濃度で投与されるであろう。以下の実施例は本発明の好ましい一定の実施例をさらに詳述することを目的とし、全く制限を目的とするものではない。実施例１ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ遺伝子に対するアンチセンスのＹ１細胞での発現はＤＮＡ脱メチル化の制限をもたらす細胞培養とＤＮＡ仲介遺伝子伝達Ｙ１細胞でＤＮＡメチル化を直接的に抑制するために、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼアンチセンス発現構築物ｐＺαＭまたはｐＺＥＭコントロールベクター(Szyfら、J．Biol．Chem.，267:12831-12836(1992))のいずれかを、以下のようにＤＮＡ仲介遺伝子伝達によってＹ１副腎皮質癌細胞に導入した。Ｙ１細胞は単層培養としてＦ−１０培養液中で維持された。この培養液には７．２５％熱不活化ウマ血清および２．５％熱不活化ウシ胎児血清（Immunocorp．モントリオール）を補充した(Yasumuraら、Cancer Res.，26:529-535(1988))。細胞培養のための他の全ての培養液および試薬はギブコ(GIBCO-BRL)から入手した。Ｙ１細胞（１×１０⁶）は核酸導入の１５時間前に１５０ｍｍ皿（Nunc）に播種した。ｐＺαＭ発現ベクター（１０μｇ）を、選択可能なマーカーとして１ μｇのｐＵＣＳＶｎｅｏとともに、燐酸カルシウムプロトコルを用いたＤＮＡ仲介遺伝子伝達(Ausubelら、分子生物学の最新プロトコル(Current Protocols in Molecular Biology)、Wiley & Sons，(1988)，ニューヨーク)によってＹ１細胞に同時導入した。選別は、培養液に０．２５ｍｇ／ｍｌのＧ４１８（GOBCO-BRL ）を添加することによって核酸導入後４８時間で開始した。両方の構築物のために、Ｇ４１８耐性細胞を分離し、続いて選択培地でクローニンク化た。軟寒天での増殖分析については、１×１０³の細胞を３列１組として３０ｍｍ皿(Falcon) に４ｍｌのＦ−１０培養液とともに３７℃で播種したが、この培養液は７．５％のウマ血清、２．５％のＦＣＳ、０．２５ｍｇ／ｍｌのＧ４１８（核酸導入体のために）および０．３３％寒天溶液を含んでいた(Freedman & Shin，Cell，3:35 5-359(1974))。細胞には１日おきにＧ４１８含有培養液２ｍｌを与えた。増殖は播種後２１日して１０^?より多い細胞を含むコロニーとしてスコアした。実施例２ＤＮＡおよびＲＮＡ分析ゲノムＤＮＡおよび全細胞ＲＮＡの調製、標識（ベーリンガーマンハイム(Boe hringer Mannheim)のランダムプライマー標識キット使用）、ハイボンド(Hybond )−Ｎ⁺(Amersham)へのＲＮＡのブロッティング(blotting)、および他の全ての標準的な分子生物学操作はオースベルら(Ausubelら、分子生物学の最新プロトコル (Current Protocols in Molecular Biology)、Wiley & Sons，(1988)，ニューヨーク)にしたがって実施した。ＭｓｐＩおよびＨｐａＩＩ制限酵素（ベーリンガーマンハイム）は２．５単位／ｕｇの濃度で３７℃で８時間ＤＮＡに添加した。放射性ヌクレオチド（３０００ｍＣｉ／ｍｍｏｌ）はアマーシャムから購入した。核酸導入体がこの導入された構築物を受容していることを確認するために、核酸導入体からＤＮＡを調製し、ＭｓｐＩまたはＨｐａＩＩのいずれかで消化し、サザンブロット分析および³²Ｐ標識０．６ｋｂＤＮＡメチルトランスフェラーゼフラグメントとのハイブリダイゼーションを実施した。結果は、３つのｐＺαＭ核酸導入体は顕著なレベルでＤＮＡメチルトランスフェラーゼｃＤＮＡ配列を含み、一方、コントロール核酸導入体には異物の混入はないことが明示された。ｐＺαＭ構築物が核酸導入体で発現されるか否か、さらに、これらの細胞でメタロチオネインプロモーターが機能しているか否かを調べるために、核酸導入体を５０μＭのＺｎＳＯ₄とともに培養し異なる時点でＲＮＡを調製し、続いてノザンブロット分析および³²Ｐ標識ＭＥＴ０．６プローブによるハイブリダイゼーションを実施した。核酸導入体７および９は、ＺｎＳＯ₄での誘発前でも相当量のＭＥＴ０．６ｃＤＮＡ（〜１．３ｋｂキメラｍＲＮＡ）を発現する。実施例３Ｙ１ｐＺαＭ核酸導入体での特異的遺伝子の脱メチル化ｐＺαＭの発現は脱メチル化をもたらすことを証明し、さらに特異的遺伝子が脱メチル化されるか否かを決定するために、ＨｐａＩＩ／ＭｓｐＩ制限酵素分析を実施し、続いてサザンブロットおよび特異的遺伝子プローブによるハイブリダイゼーションを実施した。ＨｐａＩＩは配列ＣＣＧＧ、ＣｐＧジヌクレオチド配列（当該部位がメチル化されていない場合のみ）を切断し、一方、ＭｓｐＩはメチル化の状態に関係なく同じ配列を切断する。ｐＺαＭ発現細胞における特異的遺伝子のＨｐａＩＩ切断パターンを親Ｙ１またはベクターのみを有する細胞のそれと比較し、アンチセンス核酸導入体でこの遺伝子が脱メチル化されているか否かを決定した。ステロイド２１−ヒドロキシラーゼ遺伝子Ｃ２１のメチル化の状態がまず分析された(Szyfら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA，86:6853-6857(1989 ); Szyfら、Mol．Endocrin.，4:1144-1152(1990))。この遺伝子は副腎皮質で特異的に発現され低メチル化されているが、Ｙ１細胞で不活化され高メチル化される(Szyfら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA，86:6853-6857(1989);Szyfら、Mo l．Endocrin.，4:1144-1152(1990))。Ｙ１、ｐＺαＭ(Bernardsら、Proc．Natl ．Acad．Sci．USA，86:6474-6478(1989);Collinsら、J．Exp．Med.，176:1043-1 091(1992))およびｐＺＥＭ（Bernardsら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA，86:647 4-6478(1989)）核酸導入体から調製されたＤＮＡをＭｓｐＩまたはＨｐａＩＩのいずれかで消化し、サザンブロット分析および、Ｃ２１遺伝子のエンハンサーとプロモーター領域を含む０．３６ｋｂＸｂａ−ＢａｍＨＩフラグメントによるハイブリダイゼーションを実施した(このプローブの物理的地図については以下の文献を参照のこと、Szyfら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA，86:6853-6857(1989) ; Szyfら、Mol．Endocrin.，4:1144-1152(1990))。このプローブは、このプロモーター領域が完全に脱メチル化されているとき、０．３６ｋｂおよび０．１６ｋｂＨｐａＩＩフラグメントが検出される(Szyfら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA ，86:6853-6857(1989); Szyfら、Mol．Endocrin.，4:1144-1152(1990))。このプロモーター領域およびエンハンサー領域は、Ｙ１細胞およびｐＺＥＭ核酸導入体で濃密にメチル化されている。対照的に、Ｙ１ｐＺαＭ核酸導入体は部分的に脱メチル化されたＣ２１の５’領域を有する。このことは、３．８および２ｋｂフラグメントの相対的減少、並びに完全に脱メチル化された微かな０．３６ｋｂのバンドの出現の他、ＨｐａＩＩ切断によって０．５６および〜１ｋｂの部分フラグメントが得られるという事実（このエンハンサー領域に対して上流および下流部位の部分的低メチル化を示唆する）によって示唆される。低メチル化がこのエンハンサー領域に限定されるのか、またはＣ２１遺伝子の遺伝子座全体に広がっているのかを決定するために、同様なＨｐａＩＩ消化およびサザンブロットトランスファーを、Ｙ１細胞、コントロールｐＺＥＭ(Bernard sら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA，86:6474-6478(1989))核酸導入体、および３つのｐＺαＭアンチセンス核酸導入体から抽出したＤＮＡの種々の調製物で実施した。フィルターを、Ｃ２１遺伝子本体および３’配列(物理的地図については以下の文献を参照のこと：Szyfら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA，86:6853-6857 (1989); Szyfら、Mol．Endocrin.，4:1144-1152(1990))を含む３．８ｋｂＢａｍＨＩフラグメントでハイブリダイズさせた。この領域の完全な脱メチル化によって、１対の〜１ｋｂ、０．８ｋｂフラグメントおよび０．４ｋｂフラグメントの他、多数の低分子量フラグメント（０．１−０．２ｋｂ）が得られた。２３ｋｂより大きい高分子量フラグメントによって示唆されるように、Ｃ２１遺伝子座は、コントロールの核酸導入体と同様にＹ１細胞で濃密にメチル化される。微かなバンドのみが１．９ｋｂの局部的範囲同様、予想された１ｋｂの分子量範囲に存在し、さらに、１から０．４ｋｂの間の低分子量範囲に新規な部分フラグメントが出現し、このことは、Ｃ２１遺伝子の３’領域に含まれる多数のＨｐａＩＩ部位の部分的低メチル化を示唆している(Szyfら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA，8 6:6853-6857(1989); Szyfら、Mol．Endocrin.，4:1144-1152(1990))。多数のＨｐａＩＩ部分フラグメントによって示唆される脱メチル化パターンは、Ｃ２１遺伝子の限定領域におけるメチル化の特異的低下よりむしろ一般的な部分的低メチル化と考えられる。脱メチル化が、Ｙ１細胞で潜在的に発現可能な遺伝子（例えば副腎皮質特異的Ｃ２１遺伝子）に限定されるのか(Szyfら、Mol．Endocrin.，4:1144-1152(1990) )、または脱メチル化はゲノム全体に広がっているのかを決定するために、他の遺伝子、例えば筋肉特異的ＭｙｏＤ遺伝子の他、海馬特異的５ＨＴ１Ａレセプター遺伝子を分析した。両方の遺伝子が低メチル化された。特異的低メチル化を受ける可能性がある別の種類の遺伝子には腫瘍サプレッサ遺伝子が含まれる。この種類の２つの遺伝子（ｐ５３および網膜芽腫（ＲＢ）で、これらは両方とも細胞サイクル調節に中心的な役割を果たす腫瘍サプレッサ遺伝子である）のメチル化の状態を決定した。これら遺伝子産物のいずれか一方の消失は、細胞サイクルの調節解除および新形成をもたらすことが示された(Berna rdsら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA，86:6474-6478(1989); Donehoweerら、Nat ure，356:215-221(1992))。ＰＣＲによるｐ５３と網膜芽腫（ＲＢ）プローブの生成プライマー選別プログラム（ＰＣＧｅｎｅ）を用いて、マウスｐ５３遺伝子の５’領域のオリゴプライマーを公表されたゲノム配列（アクセッション番号：ＸＯ１２３５）(Zakut-Houriら、Nature，306:594-597(1983))から選択した。塩基１５４−１７２に対応する５’プライマー（５’ＴＣＣＧＡＡＴＣＧＧＴＴＴＣＣＡＣＣＣ３’（配列番号：３））および塩基４７２−４９５に対応する３’ プライマー（ＧＧＡＧＧＡＴＧＡＧＧＧＣＣＴＧＡＡＴＧＣ３’（配列番号：４））を、製造元（Amersham Hot tub）の推奨する保持(incubation)条件（１．５ｍＭＭｇＣｌ₂）を用いて１００μｇのマウスＤＮＡ（Ｃ２Ｃ１２細胞由来）を含む増幅反応混合物に添加し、９５℃２分、５５℃２分および７２℃０．５分の４０サイクルでＤＮＡを増幅させた。反応産物を低温溶融アガロースゲル(BRL )で分離し、予想されるサイズに対応するバンドを切り出し、標準的なプロトコルにしたがって抽出した(Ausubelら、分子生物学の最新プロトコル(Current Pro tocols in Molecular Biology)、Wiley & Sons，(1988)，ニューヨーク)。マウスＲＢ遺伝子のゲノム配列はゲンバンク(GenBank)から入手できないので、ランダムオリゴヌクレオチドプライマー（Boehringer）を用いてスーパースクリプト逆転写酵素(BRL)とともに０．５μｇの全マウスＲＮＡ（Ｃ２Ｃ１２細胞由来）から網膜芽腫ｍＲＮＡを製造元の推奨する条件下で逆転写した。ＲＢ配列は、公表されたｃＤＮＡ（Bernardsら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA，86:6474- 6478(1989)）の塩基２−６２８に対応するオリゴヌクレオチドを用いて逆転写したｃＤＮＡから増幅させた。用いたオリゴプライマーは、５’ＧＧＡＣＴＧＧＧＧＴＧＡＧＧＡＣＧＧ３’（１−１８）（配列番号：５）および５’ＴＴＴＣＡＧＴＡＧＡＴＡＡＣＧＣＡＣＴＧＣＴＧＧ３’（６２０−６１０）（配列番号：６）であった。増幅条件は上記に記載したとおりである。マウスＲＢｃＤＮＡの５’領域由来の３００ｂｐの配列に対するプローブを用いて、ｐＺαＭ核酸導入体と同様にコントロールベクターで核酸導入したＹ１細胞でこの遺伝子のメチル化のレベルを決定した。ＨｐａＩＩによるこの領域の切断によって０．６ｋｂおよび０．１ｋｂのフラグメントが得られた。ＲＢ遺伝子座は、高分子量フラグメントへのプローブのハイブリダイゼーションによって示されたとおり、コントロール細胞で濃密にメチル化されている。この遺伝子座は、高分子量マーカーの量が相対的に減少すること、並びに０．６ｋｂおよび０．１５ｋｂフラグメントが部分的に存在することによって示唆されるとおり、ｐＺ αＭ核酸導入体では部分的に低メチル化されている。実施例４最隣接分子分析ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ遺伝子に対するアンチセンスＲＮＡの発現がゲノムのメチル化レベルの一般的低下につながるか否かを決定するために、“最隣接分子”分析をラジンらの記載(Razinら、Biochemistry & Biology of DNA Me thylation(ＤＮＡメチル化の生化学と生物学)、A．Razin & G.L．Cantoni編、Al lan R．Liss，Inc．ニューヨーク(1985))にしたがって〔α−³²Ｐ〕−ｄＧＴＰを用いて実施した。この分析は、ジヌクレオチド配列（ＣｐＧ）内に存在するメチル化シトシンの百分率を決定することを可能にする。核酸導入体およびコントロールＤＮＡにＤＮＡアーゼＩで切れ込み（ニック、nick）を入れ、ＤＮＡポリメラーゼＩを用いて一本鎖ヌクレオチド〔α−³²Ｐ〕−ｄＧＴＰとともにニック翻訳を実施した。３’から導入されたα−³²ＰへとＤＮＡを切断するミクロコッカスヌクレアーゼを用いて標識されたＤＮＡを消化して３’燐酸モノヌクレオチドを得た。ｄＧＭＰの〔α−³²Ｐ〕標識５α隣接分子をＴＬＣプレートでクロマトグラフィーにより分離し、ｄＣＭＰおよびｄＣ^metＭＰについて得られたスポットをこすり落とし液体シンチレーションで計数した。図２ａ（サンプルのオートラジオグラム）およびｂ（グラフ表示）に示した３組１セットの実験結果は、コントロール列ｐＺＥＭと比較したとき、ＤＮＡメチル化の全体的レベルの限界はあるが顕著な低下（核酸導入体＃４では１２％、＃７では２２％）がｐＺαＭ構築物発現核酸導入体で生じることが示唆された。 “最隣接分子”分析は以下のように実施した：２μｇのＤＮＡを、０．１単位のＤＮＡアーゼ、２．５μｌの³²Ｐ−α−ｄＧＴＰ（３０００Ｃｉ／ｍｍｏl、アマーシャムから入手）とともに３７℃、１５分保持し、続いてコーンバーグ（ Kornberg）ＤＮＡポリメラーゼ（ベーリンガー）を加え、反応物をさらに２５分３０℃で保持した。５０μｌの水を加え、ミクロコンカラム（microcon colum、 Amicon）で最大速度で３０秒回転させることによって未取り込みヌクレオチドを除去した。標識ＤＮＡ（２０μｌ）を製造元の推奨する緩衝液で３７℃１０時間７０μｇのミクロコッカスヌクレアーゼ（ファルマシア）で消化した。等量の放射能活性をＴＬＣホスホセルロースプレート（メルク）に添加し、一次元クロマトグラフィーによって３’モノヌクレオチドを分離した（イソブチル酸：Ｈ₂Ｏ：ＮＨ₄ＯＨの比は６６：３３：１）。クロマトグラムはＸＡＲフィルム（イーストマン−コダック）に感光させ、シトシンおよび５−メチルシトシンに対応するスポットをこすり落とし、β−シンチレーションカウンターで計数した。実施例５インビトロ腫瘍形成能アッセーコントロールＹ１およびＹ１ｐＺＥＭ細胞が限定的な接触増殖抑制(contact i nhibition)を示し多層細胞巣を形成する一方で、Ｙ１ｐＺαＭ核酸導入体はより球形で異なる形態を示し、もっぱら単層状態で増殖する。ＤＮＡメチルトランスフェラーゼに対してアンチセンスの発現が腫瘍形成性潜在能力の復元をもたらすか否かを決定するために、付着物非依存性態様で増殖する核酸導入体の能力を調べた。このアッセーは腫瘍形成能のインジケーターと考えられる(Freedman & Shin，Cell 3:355-359(1974))。Ｙ１ｐＺαＭ核酸導入体は、軟寒天中でコロニーを形成する能力、のみならず図３Ｂに示したようにわずか数個の細胞を含むコロニーを形成する能力もほぼ完全に消失することを明らかにした。軟寒天上の増殖は肉眼観察で定量化し、図３にグラフで表した。これらの実験は、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼに対するアンチセンスメッセージの発現によるＤＮＡメチル化の抑制は腫瘍形成能のインビトロでの消失をもたらすことを明らかにした。実施例６インビボ腫瘍形成能アッセーＬＡＦ−１同系マウス（６−８週齢雄）の皮下に、Ｙ１ｐＺαＭ、Ｙ１およびＹ１ｐＺＥＭ核酸導入体を各々１０⁶細胞ずつ注射した。腫瘍の存在については毎日触診することによってモニターした。直径が１ｃｍより大きい腫瘍をもつマウスをＣＯ₂で窒息させて殺処分し、腫瘍を切り出しイソチオシアン酸グアニジウム中で均質化した。腫瘍をもたないマウスは９０日間維持してから殺処分した。ＲＮＡを塩化セシウムによって腫瘍から調製した(Ausubelら、分子生物学の最新プロトコル、Wiley & Sons，(1988)，ニューヨーク)。腫瘍の存在は触診によって決定した。Ｙ１細胞を注射された全動物が注射後２から３週間後に腫瘍を形成する一方で、ｐＺαＭ核酸導入体を注射された動物の腫瘍形成率は極めて低かった。結果は下記の表Ｉに示す。実施例６Ａヌードマウス系におけるヒト小型肺癌細胞の腫瘍形成能のインビボ抑制アンチセンスメッセージの発現によるＤＮＡメチルトランスフェラーゼの抑制がヒト癌腫の細胞性変換の抑制をもたらすか否かを決定するために、翻訳開始部位（＋１５５から＋４８１）を含む３３０ｂｐ配列を公表されたヒトＤＮＡメチルトランスフェラーゼｃＤＮＡ配列を用いて上記の実施例３で述べた増幅プロトコルによって増幅させた（アンチセンスプライマーは５’ＧＣＡＡＡＣＡＧＡＡＴＡＡＡＧＡＡＴＣ３’（配列番号：７）で、センスプライマーは５’ＧＴＡＴＧＧＴＧＧＴＴＴＧＣＣＴＧＧＴ３’（配列番号：８））。この３３０ｂｐ配列は、マウスアンチセンスについて上記に述べたようにアンチセンスの方向で発現ベクターｐＺＥＭでサブクローニングされた。ヒト小型肺癌細胞株ＮＣＩＨ４４６に、アンチセンスＤＮＡメチルトランスフェラーゼ発現ベクターまたはコントロールのセンス発現ベクターのいずれかとヒグロマイシン耐性を付与したプラスミドとを上記の核酸導入プロトコルを用いて同時核酸導入を実施した。ヒグロマイシン耐性コロニーを選別し、導入アンチセンスの存在は、ＥｃｏＲＩによる消化、サザンブロットトランスファーおよび０．４ｋｂヒトＤＮＡメチルトランスフェラーゼｃＤＮＡプローブによるハイブリダイゼーションによって確認した。アンチセンスを発現している細胞のゲノムＤＮＡの脱メチル化は、上記および特異的遺伝子プローブによるハイブリダイゼーションで述べたように最隣接分子分析（図６）によって確認された。ＩＧＦ−１増殖因子をコードする遺伝子はアンチセンス核酸導入体で脱メチル化されるがセンスコントロールでは脱メチル化されなかった。ＤＮＡメチルトランスフェラーゼに対するアンチセンスの発現が腫瘍形成潜在能力についての復元をもたらすか否かを決定するために、付着物非依存性態様で増殖することができる核酸導入体の能力を調べた。アンチセンス核酸導入体は、軟寒天中でコロニーを形成する能力を失ったが、これはインビトロの腫瘍形成能の消失を示唆している。ヌードマウスでの腫瘍増殖は以下のように評価した：４群のマウスには、ｐＺαＭ５’ヒトメチルトランスフェラーゼ（０．４ｋｂ）アンチセンス発現プラスミドとヒグロマイシン耐性プラスミドを導入した１０⁶ 個のＮＣＩＨ４４６細胞を注射した。１群のマウスには、ｐＺαＭ５’ヒトメチルトランスフェラーゼ（０．４ｋｂ）センス発現プラスミドとヒグロマイシン耐性プラスミドを導入した１０⁶個のＮＣＩＨ４４６細胞を注射した。１群のマウスには、ヒグロマイシン耐性プラスミドを含む１０⁶個のＮＣＩＨ４４６細胞を注射した。１群のマウスには、１０⁶個のＮＣＩＨ４４６肺細胞株を注射した。マウスは１２週間以上追跡調査した。結果は表ＩＩに示す。これらの結果は、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼに対するアンチセンスの発現によってインビボで腫瘍形成が抑制されたことを示している。新生血管形成脈管形成能と細胞株の転移能とは正の関係にあることは多くの証拠によって示唆されている（Liottaら、Cell，64:327-336(1991)）。ｐＺαＭ核酸導入体から生じる腫瘍は極めて限定的な新生血管形成を示し、一方、Ｙ１細胞またはコントロール核酸導入体を注射された動物で形成される腫瘍では脈管形成は強度である。Ｙ１ｐＺαＭ核酸導入体から生じる腫瘍のＲＮＡを分離し、０．６ｋｂアンチセンスメッセージの発現レベルをインビトロの核酸導入体株について観察されたものと比較した。分離ＲＮＡでノザンブロット分析および³²Ｐ標識ＭＥＴ０．６フラグメントによるハイブリダイゼーションを実施した。その放射能活性をもつフィルターを取り外し、先に述べたように（Szyfら、Mo．Endocrinol.，4:1144- 1152(1990)）１８ＳｒＲＮＡに対する³²Ｐ標識オリゴヌクレオチドプローブで再度ハイブリダイズさせた。このオートラジオグラムを走査し、ＭＥＴ０．６の発現レベルを１８Ｓプローブで得られたシグナルに対して決定した。アンチセンスメッセージの発現は腫瘍で顕著に低下した。したがって、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼに対するアンチセンスメッセージの発現は腫瘍形成と両立しないようである。明らかに、ｐＺαＭ核酸導入体を注射した動物で発生する少数の腫瘍は、インビボの淘汰的圧力下でＤＮＡメチルトランスフェラーゼに対するアンチセンス発現を失った復帰変異体に由来するものであった。実施例７アポプトシス的細胞消滅プログラムに対するＹ１細胞のｐＺαＭ発現と血清枯渇との関係腫瘍細胞は血清に対して限定的な依存生を示し、通常、血清非依存性増殖が可能である(Barns & Sato，Cell，22:649-655(1980))。血清中に存在する因子は多くの腫瘍非形成性細胞の生存に必須である。数種の証明によって最近、腫瘍形成性細胞の生存能の強化はプログラムされた細胞死の抑制と関連することが提唱された。例えば、オンコジーンｂｃｌ−２は細胞増殖の刺激因子ではないが、むしろアポプトシスの抑制を惹起する(Strasserら、Nature，348:331-333(1990))。腫瘍サプレッサｐ５３はヒト結腸癌由来株でアポプトシスを誘発することができ（Shawら、Proc．Natl．Acad．Sci.，89:4495-4499(1992)）、ある種の化学療法剤は癌細胞でアポプトシスを誘発することが示された(Collinsら、J．Exp．Med. ，176:1043-1091(1992))。ｐＺαＭ核酸導入体での観察によって、それらが血清に対して依存性を強めていること、および血清枯渇条件下では生存能力に限りがあることが明らかにされた。血清欠乏の影響をｐＺαＭ核酸導入体で調べた。ｐＺαＭ核酸導入体およびコントロールＹ１ｐＺＥＭ核酸導入体（３×１０⁵／穴）を６穴プレートの低血清培養液（１％ウマ血清）に播種し、２４時間毎に採取し、トリパンブルー染色によって生存率について検査した（図６Ｂ）。血清枯渇培養液に移した後７２時間までコントロール細胞はほぼ１００％の生存率を示し、一方、Ｙ１ｐＺαＭ細胞では４８時間で生存率が７５％まで失われた（図６Ｂ）。Ｙ１ｐＺαＭ細胞を欠乏培養液（１％ウマ血清）に播種し、２４時間間隔で採取した。血清欠乏条件で４８時間後、ｐＺαＭ核酸導入体は特徴的な１８０ｂｐのヌクレオソーム間ＤＮＡラダー（ladder）を示し、一方、コントロールｐＺＥＭ核酸導入体はこの時点ではアポプトシスを示さない。Ｙ１ｐＺαＭ細胞で２４時間血清を欠乏（２％ウマ血清）させ、さらに採取して以下のように電子顕微鏡で調べた。カコジル酸緩衝液（０．１Ｍ）中のグルタルアルデヒド（２．５％）で細胞を１時間固定し、さらに１％四酸化オスミウムで固定した。アルコール濃度および酸化プロピレンを高めながらサンプルを脱水し、その後エポン（Epon）中に包埋した。半薄切切片（１μＭ）をブロックからウルトラミクロトームで切り出し、酢酸ウラニルおよびクエン酸鉛で対比染色を施した。フィリップス４１０電子顕微鏡(Maysingerら、Neurochem．Intl.，23:1 23-129(1993))を用いてサンプルを調べた。コントロールＹ１ｐＺＥＭおよびＹ１ｐＺαＭ核酸導入体の種々の倍率での電子顕微鏡によって、コントロール細胞は微細で均一な核膜を有するが、一方、ｐＺαＭ細胞は、アポプトシスの主要マーカー(Willieら、Histochem．J.，13:681 -692(1981))であるクロマチン凝縮と核周辺へのその移動、クロマチン凝縮、核の断片化、アポプトシス体(apoptotic body)の形成および細胞の断片化を示した。これらの実験群は、脱メチル化が腫瘍形成能を抑制する可能なメカニズムは、プログラムされた細胞死の抑制を排除することによるものであることを提唱する。実施例８この実験では、ヒト小型肺癌細胞（ＮＣＩＨ４４６）を５μｌのリポフェクチン試薬(Gibco BRL)およびオリゴ（５μｌ）とともに１ｍｌの血清非含有培養液中で約４時間処理した（オリゴ最終濃度＝５μＭ）。続いて培養液を２ｍｌの通常の培養液と交換し、さらにオリゴを添加して５μＭの濃度とした。以後の３日間、培養液とオリゴを毎日交換した。用いたオリゴは以下のものであった：３４：ＤＷ２−３４Ｂ（アンチセンスホスホジエステル）５’ＣＡＴＣＴＧＣＣＡＴＴＣＣＣＡＣＴＣＴＡ３’（配列番号：９）３５：ＤＷ２−３５Ｃ３４の５’ホスホロチオエート（配列番号：１０）３６：ＤＷ２−３６Ｃ（ランダムコントロールホスホジエステル）５’ＣＴＧＡＣＴＧＣＣＡＡＣＴＡＴＧＡＡＣＡ３’（配列番号：１１）３７：ＤＷ２−３７Ｄ３６の５’ホスホロチオエート（配列番号：１２）細胞はそこそこによく増殖したが、増殖期間を通してオリゴ３５で処理した穴の細胞は他の穴の細胞より少なく、これらの穴の細胞では多くの細胞が浮遊していた。オリゴ３７で処理した穴のいくつかの細胞もまた剥がれた。実験Ａこの実験では、細胞を前の実験よりもっと長く（１４日）オリゴの存在下で増殖させた。最初の処置は５μｌのリポフェクチンおよび１０μｌのオリゴを１ｍｌの培養液中に含んでいた。その後、毎日培養液を交換しオリゴを９日間加えたが（２ｍｌ中に１０μｌ）、最後の４日間については浮遊しているが必ずしも死んでいるわけではない細胞が失われるのを防ぐために、培養液は１度だけ交換し、オリゴは１日おきに培養液に加えた。この実験では細胞はゆっくりと増殖を開始した。オリゴで処理した最初の週では、細胞は極めてまばらのままで、非常に高い比率で細胞は球形および／または浮遊しているのが認められた。第二の週では、細胞はより元気に増殖し始めたので、コントロールの穴並びに３４および３６の穴で細胞凝集塊が出現した。オリゴ３５で処理した穴ではコントロールの穴より細胞数は定常的に少なく、浮遊細胞の割合は高かった。さらに、付着したままの３５細胞はコントロールよりもっと細長かった。同様な特徴は３７細胞でより軽度に認められた。実験の最後の方で、コントロール細胞は以前よりももっと細長くみえたが、３５細胞よりもその程度は極めて低かった。３４および３６の穴は、他のものよりもっと大きな細胞凝集塊を含んでいた（コントロールよりも）。全体として、３５および３７の穴では他の全ての穴より凝集塊の数は少なかった。オリゴ３４（アンチセンスホスホジエステル）は、細胞の形態に影響を与えないようであった。ＤＮＡメチルトランスフェラーゼアンチセンスオリゴヌクレオチドによる処理がインビトロでの腫瘍形成を抑制するか否かを決定するために、処理細胞の付着物非依存性態様で増殖する能力を決定した。２組の細胞を分析した：組Ａは１５日間処理し、組Ｂは９日間処理した。細胞の数は播種後１８日して肉眼での検査で求めた。図７に示したように、オリゴ３５で処理した細胞はインビトロで付着物非依存性態様で増殖する能力を消失し、インビトロでの腫瘍形成能抑制を示唆した。実験Ｂ実験Ａの最初の段階で細胞は極めて良好には増殖しなかったので、もっと多くの細胞（８００００の代わりに〜１５００００）を播種して実験を繰り返した。これらの細胞を１日目にリポフェクチン（５μｌ）およびオリゴ（１０μｌ）で処理し、続いて培養液を交換し１０μｌのオリゴを３日間毎日加え、さらに次の４日間は１０μｌのオリゴを毎日加え、培養液はただ１度交換した。８日間の処理の後、穴３６および３７の細胞はコントロールの穴の外観と類似していた。オリゴ３５で処理した細胞のみが、増殖がより少なく全体的にコントロールより凝集の程度が軽いように見えるという点で他のものとは顕著に異なっているようであった。さらにまた、オリゴ３５で処理した細胞は軟寒天でコロニーを形成する能力を失っており、インビトロでの腫瘍形成性の復元を示唆した。用量曲線：細胞を異なる用量のオリゴ３５（アンチセンスホスホロチオエート）で５日間処理した：０．５μＭ、１．５μＭ、５μＭ、１５μＭおよび５０μＭ。リポフェクチンおよびオリゴによる最初の処理は１ｍｌの培養液中で実施し、続いて細胞を２ｍｌの培養液に入れた。オリゴ３５による処理は細胞の形態に劇的な変化を生じた。全ての用量で、コントロールに対して大きな細胞凝集塊の形成が抑制された。オリゴの濃度が増加するにつれ、細胞の凝集性は低下しより細長くなった。浮遊細胞の数は増加し、生存率計測によって明示されたようにその多くは生きていた。１５μＭオリゴによる処理で細胞は劇的に細長くなり、細胞凝集塊は認められなかった（写真参照）。高い割合で細胞は浮遊していたが、生存率は５０％を越えていることが分かった。このことは浮遊細胞の多くはなお生きていることを示している。実施例９アンチセンス技術を用いた腫瘍形成能のインビボ抑制ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ発現と腫瘍形成のインビボ抑制が、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの哺乳類への投与によって達成できる。例えば、マウスへの投与は、緩徐な輸液ポンプによって約０．５−３．０ｎＭ／時間（体重１ｋｇにつき２０量体のオリゴヌクレオチドが約０．１５−１．０ｍｇ）の速度で実施できる。また別に、尾静脈に体重１ｋｇ当たりオリゴヌクレオチドを約１−５ｍｇ静脈注射してもよい。約１０から２１日後、腫瘍を切り出しＤＮＡメチルトランスフェラーゼの発現の他、腫瘍の重さと形態を調べることによって分析した。コントロールオリゴヌクレオチドで処理したマウスの腫瘍とＤＮＡメチルトランスフェラーゼレベルを比較することができる。本発明の特定の実施例は詳述のために本明細書に記載したが、本発明の範囲から逸脱することなく種々の修飾を実施することができるということは、前述の記載から理解されるところであろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者フォンホーフェエリックアメリカ合衆国マサチューセッツ州 02181 ウェルズリーレッドウィングロード 33 (72)発明者シーフモーシェカナダケベックエイチ４ダブリュー２ゼット７コートセントルークメーリング 5770

Claims

【特許請求の範囲】１．哺乳類のＤＮＡメチルトランスフェラーゼをコードするｍＲＮＡまたは二本鎖ＤＮＡに相補的な、腫瘍形成能抑制アンチセンスオリゴヌクレオチド。２．該アンチセンスオリゴヌクレオチドが、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼをコードするｍＲＮＡまたは二本鎖ＤＮＡのコード配列にアニールする、請求の範囲第１項の腫瘍形成能抑制オリゴヌクレオチド。３．該アンチセンスオリゴヌクレオチドが、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼをコードするｍＲＮＡまたは二本鎖ＤＮＡの開始または停止配列にアニールする、請求の範囲第１項の腫瘍形成能抑制アンチセンスオリゴヌクレオチド。４．該オリゴヌクレオチドが自己安定化されている、請求の範囲第１項の腫瘍形成能抑制アンチセンスオリゴヌクレオチド。５．該オリゴヌクレオチドが、メチルホスホノチオエートヌクレオチド間結合、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合、メチルホスホネートヌクレオチド間結合、ホスホルアミデートヌクレオチド間結合、３’末端キャップまたは３’ヘアピンループ構造によって安定化される、請求の範囲第４項の腫瘍形成能抑制アンチセンスオリゴヌクレオチド。６．該オリゴヌクレオチドが、ＲＮアーゼＨを活性化させる内部配列を有し、しかもその配列にはＲＮアーゼＨを活性化することができない配列が片側または両側に隣接している混成ホスフェートバックボーンをもつオリゴヌクレオチドである、請求の範囲第１項の腫瘍形成能抑制アンチセンスオリゴヌクレオチド。７．５’−ＣＡＴＣＴＧＣＣＡＴＴＣＣＣＡＣＴＣＴＡ−３’（配列番号：１）の配列を有する請求の範囲第１項の腫瘍形成能抑制アンチセンスオリゴヌクレオチド。８．５’−ＴＴＧＧＣＡＴＣＴＧＣＣＡＴＴＣＣＣＡＣＴＣＴＡ−３’（配列番号：２）の配列を有する請求の範囲第１項の腫瘍形成能抑制アンチセンスオリゴヌクレオチド。９．腫瘍形成能抑制に有効な量のＤＮＡメチルトランスフェラーゼｍＲＮＡに対して相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供することを含む、腫瘍形成能を抑制する方法。 10．該オリゴヌクレオチドが、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼｍＲＮＡのコード配列にアニールする、請求の範囲第９項の腫瘍形成能を抑制する方法。 11．該オリゴヌクレオチドが、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼｍＲＮＡの開始または停止配列に結合する、請求の範囲第９項の腫瘍形成能を抑制する方法。 12．該オリゴヌクレオチドが自己安定化されている、請求の範囲第１１項の腫瘍形成能を抑制する方法。 13．該オリゴヌクレオチドが、メチルホスホノチオエートヌクレオチド間結合、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合、メチルホスホネートヌクレオチド間結合、ホスホルアミデートヌクレオチド間結合、３’末端キャップまたは３’ヘアピンループ構造によって安定化される、請求の範囲第１２項の腫瘍形成能を抑制する方法。 14．該オリゴヌクレオチドが、ＲＮアーゼＨを活性化させる内部配列を有し、しかもその配列にはＲＮアーゼＨを活性化することができない配列が片側または両側に隣接している混成ホスフェートバックボーンをもつオリゴヌクレオチドである、請求の範囲第９項の腫瘍形成能を抑制する方法。 15．腫瘍形成能抑制に有効な量のＤＮＡメチルトランスフェラーゼｍＲＮＡに対して相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供することを含む、腫瘍形成能を抑制する方法。 16．該オリゴヌクレオチドが、５’−ＣＡＴＣＴＧＣＣＡＴＴＣＣＣＡＣＴＣＴＡ−３’（配列番号：１）の配列を有する請求の範囲第９項の方法。 17．該オリゴヌクレオチドが、５’−ＴＴＧＧＣＡＴＣＴＧＣＣＡＴＴＣＣＣＡＣＴＣＴＡ−３’（配列番号：２）の配列を有する請求の範囲第９項の方法。 18．腫瘍形成能抑制に有効な量のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物。 19．該オリゴヌクレオチドが、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼｍＲＮＡのコード配列にアニールする、請求の範囲第１５項の医薬組成物。 20．５’−ＴＴＧＧＣＡＴＣＴＧＣＣＡＴＴＣＣＣＡＣＴＣＴＡ−３’（配列番号：２）の配列を有する請求の範囲第１６項の医薬組成物。 21．５’−ＣＡＴＣＴＧＣＣＡＴＴＣＣＣＡＣＴＣＴＡ−３’（配列番号：１）の配列を有する請求の範囲第１６項の医薬組成物。