JPH09511132A - 変異誘発表現型を有するリンパ球を同定する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、選択マーカーを有するリンパ球を単離し；該リンパ球から同一のクローン増幅セットに属する集団を同定し；そして、この集団が少なくとも２つのリンパ球を有するか否か決定し、該リンパ球がそれらの間に該選択マーカーの遺伝子座の異なる対立遺伝子間に２つの独立する変異を有し、該選択マーカーの存在が変異誘発表現型を示すことにより、変異誘発表現型を有するリンパ球を同定する方法を提供する。本発明の１つの実施態様では、選択マーカーはhprt^-である。

Description

【発明の詳細な説明】 変異誘発表現型を有するリンパ球を同定する方法 発明の背景 本発明は、エネルギー省から授与されたER60502および国立ガン研究所から授 与されたCA30688の下で政府の援助により成された。政府は、本発明に所定の権 利を有する。 本発明は、一般に分子遺伝学の分野、より特定すれば、体細胞変異に起因する 病状の傾向を検出する方法に関する。 変異は、DNA（遺伝情報を含む分子）の化学構造の変化である。変異は、分裂 細胞のDNAに絶えず導入されているが、細胞は、子孫の細胞に変異が伝わる前に 変異を訂正するために、DNA修復酵素のような手段を有する。それにもかかわら ず、訂正機能は完全ではなく、そして、変異は哺乳動物の体細胞に、細胞１世代 につき１遺伝子座あたり約10^-7〜約10^-6の割合で導入される。 体細胞変異性疾患は、遺伝または自然発生した、所定の体細胞の子孫に存在す る変異を有する細胞に起因する。１例はガンである。 多くのガン起因剤（例えば、太陽光中の紫外線および所定の化学化合物）は、 遺伝子の変異を生じることが公知である。遺伝子の変異とガンとの間の関連につ いての研究において、科学者らは腫瘍遺伝子および腫瘍抑制遺伝子を同定した。 腫瘍形成遺伝子が変異した場合、変異遺伝子は正常な細胞をガン細胞に形質転換 し得る。腫瘍遺伝子の変異は、唯一のガンの遺伝的原因であるが、遺伝的事象と 疾患状態との間の原因となる関連を提供する。 これらの事実は、DNA修復機構に欠陥を有する個体は、変異しやすい傾向があ り得、従って、正常な個体よりもガン化しやすい傾向があることを意味する。こ れは、明らかにDNA修復機構に欠陥を含む２つの疾患（色素性乾皮症および毛細 管拡張性運動失調）の発見により支持される。前者の疾患を有する個体は、非常 に高い発生率で日光に誘導される皮膚ガンを患いやすい。これらの個体は、紫外 線によりDNAに起きた損傷型を修復する酵素に欠陥がある。後者の疾患を有する 個体は、乳ガンの危険性の増大を被りやすく、そしてDNA鎖の切断の修復に影響 する酵素に欠陥を有するようである。 従って、変異速度が増大する傾向があり、それゆえ、体細胞変異性の疾患の危 険性の高い個体を同定する方法は、長期にわたり切実に必要である。これらの方 法は、医者が、例えば、患者に発ガン性の薬剤を避けるように警告することによ りこのような疾患の予防の助けとなり得るか、または疾患を遮断するために医者 に警戒体制を取らせ、そして処置がより効果的であるような早期段階で、疾患を 発見できるようにすることにより疾患の処置の助けとなり得る。 従って、高い割合の体細胞変異を有する個体を同定する方法が必要である。本 発明は、この必要性を満たし、そして関連した利点を同様に提供する。 発明の要旨 本発明は、選択マーカーを有するリンパ球を単離する工程；該リンパ球から同 一のクローン増幅セットに属する集団を同定する工程；および、この集団が少な くとも２つのリンパ球を有するか否か決定する工程であって、該リンパ球がそれ らの間に該選択マーカーの遺伝子座の異なる対立遺伝子間に２つの独立する変異 を有し、該選択マーカーの存在が変異誘発表現型を示すことにより、変異誘発表 現型を有するリンパ球を同定する方法を提供する。本発明の１つの実施態様では 、選択マーカーはhprt^-である。 本発明の別の実施態様によれば、この方法は、それぞれの群が異なる選択マー カーを有する、少なくとも２つのリンパ球の群を単離する工程；および、任意の ２つの群が、その存在が変異誘発表現型を示す、同一のクローン増幅セットに由 来する細胞を含むか否か決定する工程を包含する。 発明の詳細な説明 本発明は、「変異誘発表現型」のリンパ球を有する個体を同定する方法を提供 する。変異誘発表現型を表す細胞は、正常よりも有意に高い自然変異率を有し得 る。正常な変異率は、１世代につき１遺伝子座あたり約10^-7〜10^-6であるが、変 異誘発表現型を有する細胞は、１世代につき１遺伝子座あたり約10^-5よりも大き い変異率を有し得、これは正常より10倍以上大きい。これらの細胞はまた、所定 の変異原または発ガン物質に対して正常な細胞よりも感受性であり得る。これら の状態の両方は、細胞サンプル中で決定される変異頻度の増大として反映される 。 遺伝子の変異は、例えばガンのような体細胞変異性疾患の原因である。従って 、変異誘発表現型のリンパ球を有する個体は、これらリンパ球および他の体細胞 に同様に体細胞変異性疾患を発症する、正常よりも大きな危険を有する。 本発明の方法によれば、変異誘発表現型のリンパ球は、選択マーカーを有する リンパ球を単離する工程；該リンパ球から同一のクローン増幅セットに属する集 団を同定する工程；および、この集団が少なくとも２つのリンパ球を有するか否 か決定する工程であって、該リンパ球がそれらの間に該選択マーカーの遺伝子座 の異なる対立遺伝子間に２つの独立する変異を有することにより同定される。ク ローン増殖セット由来の集団に検出される２またはそれ以上の独立な変異の存在 は、１世代につき１遺伝子座あたり10^-5を越える非常に大きな自然変異率、また は、クローン内の変異原に対する異常な感受性の証拠である。25〜100の代表的 なクローン化集団の解析は、独立の変異を同定するために充分であり得る。 本発明の別の実施態様によれば、この方法は、それぞれの群が異なる選択マー カーを有する、少なくとも２つのリンパ球の群を単離する工程、および任意の２ つの群が、同一のクローン増幅セットに由来する細胞を含むか否か決定する工程 を包含する。もしそうであれば、これは、少なくとも２つの独立変異のクローン 増幅セットの細胞内での存在を示す。これは、変異誘発表現型を示す。 本発明の方法は、選択マーカーを有するリンパ球を単離する工程、そして同一 のクローン増幅セットに属するリンパ球の集団を同定する工程を包含する。本明 細書中で使用される「リンパ球」は、Ｔ細胞レセプター(「TCR」)を有するＴリ ンパ球または抗体を産生するＢリンパ球をいう。任意の１つのリンパ球は、１つ の型のTCRまたは抗体しか産生しない。それぞれのTCRまたは抗体は、その同族体 の抗原上の特定のエピトープまたは抗原結合部位に特異性を有する。特異的TCR または抗体は、リンパ球幹細胞中のDNAの再編成により形成される遺伝子（これ は、TCRまたは抗体の定常部(「C」)、接合部(「J」)、可変部(「V」)およびおそ らく多様性部(「D」)をコードする）によりコードされる。哺乳動物は代表的に1 0万〜１億の特異性の異なるリンパ球を有する。 抗原によりリンパ球が刺激されると、その抗原に特異的なこれらのリンパ球が クローン増殖をする。この過程で、リンパ球は「爆発的な」細胞増殖で繰り返し 分裂して、同一起源の親細胞から生産され、そして同一のエピトープに特異性を 有する多数の細胞（クローンと称される）を提供する。この細胞のコレクション を、本明細書中では「クローン増殖セット」という。 同一のクローン増幅セットに属するリンパ球は、同一のエピトープに特異的な TCRまたは抗体をコードする同様に再編成した構造を有するTCRまたは抗体遺伝子 を有することにより、遺伝学的レベルで特徴付けられる。同一のクローン増殖セ ットに属する細胞を検出する１つの方法は、TCRまたは抗体遺伝子の構造決定に よる。これは、サザンブロットでの１本鎖コンホメーションの多形(SSCP)または 配列決定により、遺伝子の制限断片を分析することによりなされ得る。あるいは 、より困難ではあるが、クローン性は、これらの遺伝子によりコードされ、そし てクローンの細胞で発現されるタンパク質の構造を決定することにより決定され 得る。このような方法は、当該分野で周知である。 単一のクローン増幅セットは、身体内の100万のリンパ球の中の少数のリンパ 球を表す。従って、クローン集団のメンバーは、選択マーカーを与えられた遺伝 子を有する単離されたリンパ球から同定される。本明細書中で用いたように、「 選択マーカー」は、その特徴を有する細胞を区別し、そして単離するために使用 され得るリンパ球の任意の表現型の特性をいう。同一の選択マーカーを有するリ ンパ球のプールは、クローン増幅セットに属するリンパ球を含有する。それはま た、同一のクローン増幅セットに属しないがマーカーを有する他のリンパ球を含 み得る。しかし、マーカーを有する細胞を選択することにより、リンパ球のプー ルはクローン増幅セットに属するリンパ球のプールに濃縮され、そしてそれらの 同定が単純になる。 本発明の１つの実施態様では、選択マーカーは、正常の細胞が感受性である化 合物に耐性である。このようなマーカーの１つは、6-チオグアニン、8-アザグア ニン、6-メルカプトプリン、または特定の他のプリン類似体に耐性である。この 特徴は、hprt遺伝子の変異に起因する。この選択マーカーを有する細胞は、マー カーを有さない細胞を十分に殺し得る濃度で、細胞のコレクションをこれらの任 意の薬剤に曝すことにより選択され得る。従って、このプールでは、マーカーを 有する細胞が濃縮される。 本発明の別の実施態様では、選択マーカーはジフテリア耐性、ウアバイン耐性 、または特定のHLA亜型の発現の欠損である。これらの任意のマーカーを有する 細胞は、細胞集団をそれぞれジフテリアトキシン、ウアバイン、または抗HLA抗 体に曝すことにより選択され得る。 選択に使用される指示薬は、野生型とマークされた細胞とを区別するための機 構を提供しさえすれば、細胞を殺す必要はない。例えば、指示薬は特定の表現型 の細胞に潜在的に結合し、それにより、セルソーターによる分離を可能にし得る 。例えば、HLA亜型を発現しない細胞は、このHLA亜型に特異的な抗体に結合する ことができず、そしてセルソーターによりこの抗体と結合した細胞と区別され得 る。 同一のクローン増幅セットに属し、そして選択マーカーにより特徴付けられる リンパ球集団を同定する方法は、本明細書中に参考として援用されているA1bert iniの米国特許第5,112,735号に記載されている。この方法は、以下の工程を含む ：哺乳動物からリンパ球のサンプルを得る工程；クローン化細胞集団を生成する ために、リンパ球の遺伝子座で以前の体細胞変異事象を示し得る薬剤の存在下で リンパ球をクローニングする工程；以前の変異事象を有したことを示すこれらの クローン化細胞集団を選択する工程；単離した変異クローン化細胞集団を提供す るために、選択したクローン化細胞集団を別々に増殖させる工程；単離され変異 されたクローン化細胞集団内での、特定の抗原に特異的な抗原レセプターをコー ドする核酸領域の配置を決定する工程；単離した変異クローン化細胞集団内での 特定の抗原に特異的な抗原レセプターをコードする核酸領域の該配置を比較する 工程；および特定の抗原の刺激に反応して増幅する細胞を同定する工程、それに より、単離した別個の変異細胞クローンで、特異的な抗原レセプターをコードす る核酸領域の同様の構造の存在は、哺乳動物でのクローンリンパ球の増幅を示す 。 この説明に束縛されることを望まないが、１つの遺伝子座で多数の変異が、以 下の方法で起き、そして以下の記載を生じると考えられる。クローン増殖の初期 段階では、セットの全細胞は、１つの遺伝子座に同一の対立遺伝子を有するとみ なされる。増幅の間に、変異が細胞の１つに導入される。この細胞は、その子孫 に変異を伝える。この時点で、このセットは異なる対立遺伝子を有する２つの型 の細胞（元々の対立遺伝子を有する細胞および第１の変異を有する対立遺伝子を 有する細胞）を含む。次いで、例えば、第２の変異が、元々の対立遺伝子を有す る細胞の子孫の１つに導入される。この細胞は、その子孫に変異を伝える。この 時点で、このセットは異なる対立遺伝子を有する３つの型の細胞（元々の対立遺 伝子を有する細胞、第１の変異を有する対立遺伝子を有する細胞、および第２の 変異を有する対立遺伝子を有する細胞）を含む。次いで、例えば、第３の変異が 、既に第１の変異を有する細胞の１つに導入される。この細胞は、その子孫に２ つの変異を伝える。この時点で、このセットは異なる対立遺伝子を有する４つの 型の細胞（元々の対立遺伝子を有する細胞、第１の変異を有する対立遺伝子を有 する細胞、第２の変異を有する対立遺伝子を有する細胞、ならびに第１および第 ３の変異を有する対立遺伝子を有する細胞）を含む。 １つの遺伝子座の異なる対立遺伝子間に２つの独立した変異を有するリンパ球 の存在は、以下のように決定され得る。集団内の細胞由来のDNAは、例えばサザ ンブロットにより、この遺伝子の異なる制限断片について試験され得る。あるい は、集団内のそれぞれの細胞由来の遺伝子コピーをPCRにより増幅し、配列決定 し、そしてそのヌクレオチド配列を比較し得る。両方の方法が、遺伝子の構造の 表示を提供する。もちろん、後者の方法が、遺伝子の各塩基毎の同定を可能にす るためにより敏感である。従って、遺伝子の構造は、集団の細胞間で比較される 。 以下の説明により束縛されることを望まないが、大部分の変異誘発表現型は、 DNA修復を制御する遺伝子で体細胞変異から生じると考えられる。個体は、DNA修 復酵素についての多くの異なる遺伝子座を有する。ヒトおよび全ての他の哺乳動 物は２倍体であるため、これらは、各DNA修復遺伝子の２つのコピーを有する。 大部分の個体では、この遺伝子の両方のコピーが機能的な酵素をコードする。し かし、いくつかの個体は、ヘテロ接合であり、そしてDNA修復遺伝子の機能的な コピーを１つ、および機能しないコピーを１つ遺伝により受け継いでいる。これ らの個体は、この遺伝子の機能的なコピーを１つ有するために、欠損遺伝子の存 在は通常DNA修復の欠陥を導かない。しかし、これらのヘテロ接合体の個体の特 定の細胞では、１つの機能的な遺伝子コピーが変異すると機能しなくなり得る。 このような細胞は、もはやこの遺伝子座にコードされる機能的なDNA修復酵素を 含まない。従って、これらのヘテロ接合の個体は、実際には、細胞レベルでは、 ヘテロ接合の細胞の間に、DNA修復が欠陥しているホモ接合細胞の集団を有する モザイクである。これらのホモ接合の細胞は、DNAに導入された欠陥を修復する ための能力が減少しているので、これらはより高い変異率または１またはそれ以 上の環境的な変異原に対する感受性の増加を示す。変異率の増大した細胞は、そ れ自身、例えばガンのような体細胞変異性の疾患の危険性の増大を被る。さらに 、この個体はヘテロ接合であるために、身体内の他の細胞はまた、DNA修復の欠 陥にホモ接合となる危険性があり、より高い変異率およびこれらの細胞同様に体 細胞変異性の疾患の増大した危険性の結果を生じる。 欠陥のあるDNA修復酵素についてのヘテロ接合性からホモ接合性への変化は、 細胞が変異誘発表現型を獲得し得る唯一の方法ではないことが認識される。例え ば、機能的なDNA修復または「チェックポイント」遺伝子（細胞周期を制御する 遺伝子）を有する細胞が、細胞によるDNA修復活性を減ずる優性変異を遺伝子の １つに発生させ得る。あるいは、細胞は、DNAポリメラーゼ遺伝子をコードする 遺伝子の１つに優性変異を発生させ得、また細胞に増大した変異を被らせる。し かし、変異増大の機構は重要ではない。全ての場合に、正常以上の増大した変異 率、または変異原に対する増大した感受性は、細胞を体細胞変異性の疾患を獲得 する危険性を負わせる。 以下の実施例は、例示手段であるが、本発明を限定しない。 実施例 Ｔリンパ球を使用する実験結果は、変異誘発表現型を有さない「正常な」個体 および変異誘発表現型を有する伺体の両方の存在を示す。「正常な」個体（腎移 植のレシピエント）は、同一のクローン増幅セットに属し、そして919×10^-6の 変異頻度を有するＴリンパ球のhprt^-集団を有する。この頻度は、おそらく腎移 植のために正常の100倍よりも大きい。42のhprt^-変異体単離物のうち25は、同一 のTCR遺伝子で定義されたクローンセットに由来した。今日までこれらのうち11 の配列の分析は、単一のhprt変異のみを示した。従って、変異頻度の著しい増大 にもかかわらず、変異誘発表現型の証拠はなかった。 CD45マーカーは、既にクローン拡大を行ったＴ細胞で発現される。CD45を有す るＴ細胞は、CD45を有さず、それゆえ、クローン拡大を行っていないＴ細胞より もhprt遺伝子が高い変異率を有することが見出された。これは、本発明の根本的 な仮定と一致する。結果を表Ｉに示す。 上と比較して、個体は変異誘発表現型を有すると同定された。１つの個体では 、同一のクローン増幅セットに属するＴリンパ球のhprt^-集団由来の31変異体を 配列決定した。この遺伝子座に異なる対立遺伝子を有する４つの細胞が同定され た。30の変異体がエキソン６の485bpの欠失（ゲノムDNAのＧ₄₈₅−−＞Ｔのトラ ンスバージョン；スプライス部位変異）を示し、１つの変異体は、Ｔ₁₉₈−−＞ Ｇのトランスバージョン変異を示した。しかし、予期しないことに、エキソン６ の欠失を有する30の変異体の内２つは、第２のエキソン８の欠失（おそらくスプ ライス部位の変異）を示し、そして１つは、Ｇ₉₆の後の＋ＴおよびＧ₁₂₉の後の ＋Ｔの、２つの余分なフレームシフト変異を示した。クローン増幅セットに存在 しない他の２つのhprt変異体は、Ｃ₁₁₃−−＞ＴのトランジションおよびＡ₅₈₁− −＞Ｔのトランスバージョンを示した。クローン増幅セットから単離されたhprt 変異体の、最 初のエキソン６のスプライス部位の変化に加えて、別の２〜３の欠失変異がまた 見出された。また、このクローンに使用したVβ TCR遺伝子の配列決定により、V β遺伝子の５’標的領域内の終止コドンを生じる変異が見出された。これらの第 ２の変異は、このクローン内の巨大な変異率を示す。 本発明の実施において有用な分子生物学の方法は、当該分野で公知であるか、 あるいはSambrookら、Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY(1989)に記載されている。 本発明は、現在の好ましい実施態様を引用して記載されているが、本発明の精 神から逸脱せずに種々の改変を行い得ることを理解するべきである。従って、本 発明は、以下の請求項によってのみ限定される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ)，ＡＭ， ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，Ｅ Ｅ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ， ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＩ，ＳＫ，Ｔ Ｊ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．変異誘発表現型を有するリンパ球を同定する方法であって、以下の工程： a)選択マーカーを有するリンパ球を単離する工程； b)該リンパ球から同一のクローン増幅セットに属する集団を同定する工程；およ び c)この集団が少なくとも２つのリンパ球を有するか否か決定する工程であって、 該リンパ球がそれらの間に該選択マーカーの遺伝子座の異なる対立遺伝子間に２ つの独立する変異を有し、該選択マーカーの存在が変異誘発表現型を示す；を包 含する、方法。 ２．前記リンパ球がＴ−リンパ球である、請求項１に記載の方法。 ３．前記選択マーカーがhprt^-である、請求項２に記載の方法。 ４．前記選択マーカーがジフテリア耐性、ウアバイン耐性、または特定のHLA亜 型の発現である、請求項２に記載の方法。 ５．前記リンパ球がＢ−リンパ球である、請求項１に記載の方法。 ６．請求項１に記載の方法であって、ここでa)およびb)の工程が、 (i)哺乳動物からリンパ球のサンプルを得る工程； (ii)クローン化細胞集団を生成するために、リンパ球の遺伝子座での以前の体細 胞変異事象を示し得る薬剤の存在下で該リンパ球をクローニングする工程； (iii)前記以前の変異事象を有したことを示すこれらのクローン化細胞集団を選 択する工程； (iv)単離した変異クローン化細胞集団を提供するために、前記選択したクローン 化細胞集団を別々に増殖させる工程； (v)該単離した変異クローン化細胞集団内での、特定の抗原に特異的な抗原レセ プターをコードする核酸領域の配置を決定する工程；および (vi)該単離した変異クローン化細胞集団内での特定の抗原に特異的な抗原レセプ ターをコードする核酸領域の該配置を比較する工程、それにより、別々に単離さ れた変異した細胞クローン内で、特異的な抗原レセプターをコードする核酸領域 の同様の構造の存在が、該哺乳動物内でのクローンリンパ球の増幅を示す；を包 含する方法。 ７．変異誘発表現型を有するリンパ球を同定する方法であって、 a)それぞれの群が異なる選択マーカーを有する、少なくとも２つのリンパ球の群 を単離する工程；および b)任意の２つの群が、同一のクローン増幅セットに由来する細胞を含むか否か決 定する工程であって、該同一のクローン増幅セットの存在が変異誘発表現型を示 す；を包含する方法。 ８．前記リンパ球がＴ−リンパ球である、請求項７に記載の方法。 ９．前記選択マーカーがhprt^-である、請求項８に記載の方法。 １０．他の選択マーカーがジフテリア耐性、ウアバイン耐性、または特定のHLA 亜型の発現である、請求項８に記載の方法。