JPH09511142A

JPH09511142A - リボソームフレームシフト低下によるｈｉｖ阻害のためのｄｎａオリゴマーの使用

Info

Publication number: JPH09511142A
Application number: JP7525315A
Authority: JP
Inventors: ブラキア−ジングラ，レア; メランコン，ピエール; コテ，マール; ペイヤン，カトリーヌ
Original assignee: ユニヴェルスィテ・ドゥ・モントリオール
Priority date: 1994-03-30
Filing date: 1995-03-28
Publication date: 1997-11-11
Also published as: WO1995027054A1; ATE190654T1; US5707866A; AU694494B2; EP0753063B1; EP0753063A1; AU2064495A; CA2186107A1; DE69515652D1

Abstract

(57)【要約】本発明は、以下の群：a) 大腸菌16S rRNAにおける領域10に相当するヒト18S rRNAにおけるヌクレオチド1-20b) 大腸菌16S rRNAにおける領域530 に相当するヒト18S rRNAにおけるヌクレオチド595-641c) 大腸菌16S rRNAにおける領域900 に相当するヒト18S rRNAにおけるヌクレオチド1182-1220およびd) 大腸菌16S rRNAにおける領域1400に相当するヒト18S rRNAにおけるヌクレオチド1695-1715から選択される哺乳動物細胞の小リボソームサブユニットのRNA の領域に相補的なアンチセンスDNA オリゴマーに関するものであって、前記オリゴマーはリボソームフレームシフトの発生を低下しそしてウィルス酵素たんぱく質の発現を阻害する。

Description

【発明の詳細な説明】リボソームフレームシフト低下によるHIV 阻害のためのDNA オリゴマーの使用発明の背景 (a) 発明の分野本発明は、HIV メッセンジャーRNA を翻訳する場合HIV 酵素たんぱく質の産生に必要なリボソームのフレームシフトの発生を低下するためにアンチセンスDNA オリゴマーを使用し、ウィルス粒子の生成を阻止しそしてHIV のライフサイクルを中断することに関する。 (b)先行技術の開示メッセンジャーRNA に含まれる情報は、連続するオーバーラップしないトリプレットにおいてリボソームにより、開始点と言われる出発点からたんぱく質へ翻訳される。メッセンジャーRNA の翻訳の失敗は、トリプレットの読み誤りまたはリーディングフレームのシフトにより起こり、偽たんぱく質が生じる。レトロウィルスはRNA の形でこれらの遺伝暗号を有し、リバーストランスクリプターゼと呼ばれる酵素を利用してこれらの遺伝コードまたはウィルスRNA をプロウィルスDNA へ転化し、これを宿主細胞DNA へインテグレートすることになる。これらのインテグレートされたプロウィルスは、各々の細胞分割の間に正常な細胞遺伝子と重複化される。すなわち、最初に感染した細胞の前駆体の全てはレトロウィルスのDNA を含むであろう。さらに感染ウィルスの複数のコピーが作られうる。これらのウィルス粒子の生成により他の細胞が感染するようになる。レトロウィルスは腫瘍性および非- 腫瘍性の両方の病気を引き起こす。レトロウィルスの中には、そのウィルス遺伝子の発現が細胞を癌化する腫瘍形成性であるか、または正常な細胞機能を変えたりまたは細胞を死なせるであろう他の病因効果を有するものもある。同じウィルスでも別の動物には別の病気を起こすかもしれない。ヒトに感染することが知られているレトロウィルスの中には、HTLVI 型およびII型がリンパ腺腫および神経系の疾患と関係するがしかし重度の免疫抑制とは関係せず、一方ヒト免疫不全ウィルス(HIV)は免疫抑制を起こすがしかし肉腫を直接には起こさないようである。HIV は本発明よる興味あるレトロウィルスの一つである。全てのレトロウィルスのpol 遺伝子は、逆転写に必須の酵素活性、プロウィルスインテグレーションおよびウィルス前駆体たんぱく質の分解を仲介するプロテアーゼ活性をコードする。興味深いことに、ヒト免疫不全ウィルス(HIV -1)では、ウィルスpol 遺伝子は、リボソームがスプライスされていないHIV mRNA種を翻訳する時に、リボソームフレームシフトを介して発現される（ジャックス、ティ .(Jacks,T.)（1990）Curr.Top.Microbiol.Immunol.,157，93-124; ハットフィールドら（Hatfied et al.）(1992)，Adv．Viurs Res.，41,193- 239）。このフレームシフトの効力は、gag 遺伝子生成物、ウィルスコアたんぱく質、およびpol 遺伝子生成物の比を確定する。この比における変化がウィルスアッセンブリーに著しく影響を与えるかもしれない(パーク、ジェイ．およびモロウ、シー．ディー.(Park，J．and Morrow，C.D．)（1991）J．Virology，65，5111-5117)。ビッカーズ(Vickers)およびエッカー(Ecker)((1992)Nucleic Acids Research ，20，3945-3953)は、HIV メッセンジャーRNA におけるgag-pol フレームシフト領域を標的とするオリゴヌクレオチドを使用するとリボソームフレームシフトの発生が増加することを示した。これらのオリゴヌクレオチドはHIV gag-pol領域に特異的であり、それ故、ウィルスメッセンジャーRNA 配列を変えるかもしれない突然変異により影響を受ける。哺乳動物細胞に対し副作用を起すことなくレトロウィルスのウィルス発現に影響を与えるであろう哺乳動物細胞におけるリボソームフレームシフトの発生を低下する手段を提供することが非常に望まれる。発明の概要本発明の一つの目的は、細胞に副作用を起こすことなくレトロウィルスのウィルス発現に影響を与えるヒト細胞におけるリボソームフレームシフトの発生を低下させるためのアンチセンスDNA オリゴマーを提供することである。本発明の別の目的は、ウィルスメッセンジャー配列にける突然変異により影響されないようなアンチセンスDNA オリゴマーを提供することである。本発明のアンチセンスDNA オリゴマーは、ビッカーズおよびエッカー((1992)N ucleic Acids Research，20，3945-3953)のものと比べて以下の利点を有する。 a) こられはリボソームフレームシフトを低下し、これはリボソームフレームシフトを増加するオリゴヌクレオチドと比べて恐らくウィルス粒子の生成に著しい影響を及ぼすであろう。 b) これらはリボソームを標的にし、HIV gag-pol 領域を標的にしない。したがって、これらの効力は、ウィルスメッセンジャーRNA 配列を変えるかもしれない突然変異による影響を受けない。さらに、これらは、ウィルス粒子の生成のためにリボソームフレームシフトを必要とするいずれの型のウィルスにも使用されうるので、より広い作用スペクトルを有する。本発明によれば、ヒト細胞の小リボソームサブユニットのRNA の領域の一部に相補的なアンチセンスDNA オリゴマーを提供するものであり、これは以下の群から選択されうる a) 大腸菌16S rRNAにおける領域10に相当するヒト18S rRNAにおけるヌクレオチド1-20； b) 大腸菌16S rRNAにおける領域530 に相当するヒト18S rRNAにおけるヌクレオチド595-641； c) 大腸菌16S rRNAにおける領域900 に相当するヒト18S rRNAにおけるヌクレオチド1182-1220；および d) 大腸菌16S rRNAにおける領域1400に相当するヒト18S rRNAにおけるヌクレオチド1695-1715；から選択され、これにより前記オリゴマーはリボソームフレームシフトの発生を低下しそしてウィルス酵素たんぱく質の発現を阻害する。本発明によれば、四つの前記領域 a)、b)、c)およびd)を定義するために使用されたアンチセンスDNA オリゴマーは以下の群から選択される：本発明によれば、宿主におけるレトロウィルス感染の治療方法を提供するものであり、これは前記宿主へ本発明のアンチセンスDNA オリゴマーを薬剤上許容されうる担体とともに投与することからなり、これによりウィルス酵素たんぱく質の発現が阻害される。本発明によれば、宿主におけるレトロウィルス感染の治療のための薬剤組成物を提供するものであり、これはウィルス酵素たんぱく質の発現を阻害のに十分な量の本発明のアンチセンスDNA オリゴマーおよび薬剤上許容されうる担体とからなる。本発明の目的に対し、以下の用語が次のように定義される： “レトロウィルス”はHIV、ヒトT-細胞白血病ウィルス１型(HTLV-1)に関し、そしていずれのヒトレトロウィルスもpol 遺伝子を発現するためにリボソームフレームシフトを必要とする。用語“十分量”とは、レトロウィルスの酵素たんぱく質発現を実質的に阻害するのに必要な本発明アンチセンスDNA オリゴマーの量に関する。正確な有効量は、使用されるアンチセンスDNA オリゴマーの性質により変わりそして一般的実験だけで当業者が決めることができる。図面の簡単な説明図１は、大腸菌 16SリボソームRNA の構造を示し；図2Aは、pCAT-HIV(-1)に挿入されるHIV-1 フレームシフト要素を含む領域を示し；図2Bは、pCAT-HIV(0)に挿入されるHIV-1 フレームシフト要素を含む領域を示し；図3Aは、pCAT-HIV(-1)におけるCAT コード領域の開始点およびレポーターたんぱく質の相当するアミノ酸配列を示し；図3Bは、pCAT-HIV(0)におけるCAT コード領域の開始点およびレポーターたんぱく質の相当するアミノ酸配列を示し；図4は、HIV で感染された培養細胞の上澄みにおけるHIV リバーストランスクリプターゼ活性におけるオリゴマーの効果のグラフである。発明の詳細な説明本発明によれば、まず最初に、簡単な調査：すなわちフェニルアラニンをコードする人工的メッセンジャーポリ(U)の読み違え、を用いてリボソームの翻訳精度に影響を与えることができることを示す。読み違えは、たんぱく質鎖ヘロイシン、非一同族系のアミノ酸の取込みを測定することにより調査される。翻訳精度を調節するために使用される薬剤は、小リボソームサブユニットのRNA における特定領域に相補的な“アンチセンスDNA オリゴマー”と呼ばれるオリゴデオキシリボヌクレオチドであり、これは翻訳の忠実性のコントロールに関係する。本発明によれば、第二に、小リボソームサブユニットのRNA における特定領域に相補的なアンチセンスDNA オリゴマーは、リボソームフレームシフトを低下することができることが示される。この研究では、リポーターたんぱく質、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)をコードする天然 mRNA を使用する。このメッセンジャーに相当する遺伝子は、コード領域の開始点がフレームシフトがHIV mRNAにおいて生じる領域を含むように、すなわちシフトするヘプタヌクレオチドの後にステム/ ループ構造が続くように修飾されている。CAT の発現はこのシステムにおいてリボソームフレームシフトを必要とする。 1- ポリ(U)の読み違えにおけるアンチセンスDNA オリゴマーの効果ポリ(U)は、ポリフェニルアラニンの合成をコードする。ポリ(U)- 指示システムにおいてリボソームによるロイシンの誤った取込みは、翻訳における誤りを示す。ロイシン取込みに影響する薬剤の中に、リボソームがHIV mRNAを翻訳する場合にフレームシフトを妨害するかもしれない有力な候補が見られる。これらの薬剤がポリ(U)の読み違えを低下するかまたは増加するかは、実験のこの段階ではそれ自体重要ではなかった。重要なことは、アンチセンスオリゴマーが翻訳精度のコントロールに影響することができるかを示すことであった。方法翻訳に必要なリボソームおよび酵素は、常法（メランソン、ピィ．ら（Melanc on,P．et al.）（1984）Biochemistry，23，6697-6703）により、大腸菌株 K12A 19（大腸菌遺伝子貯蔵センター(E．coli Genetic Stock Center)、エール大学（ Yale University）、受入れ番号CGSC No.5997から得られる）から単離された。1 6S rRNAの特定領域に相補的なデオキシリボヌクレオチドは、ファルマシア自動合成機(Pharmacia Automatic Synthesizer)^TMにおいて合成され、そしてポリアクリルアミドゲル電気泳動により精製された。ロイシンのポリ(U)- 指示誤取込みおよびフェニルアラニンの取込みは標準的方法(グラベル、エム．ら(Gravel,M ．et al.)(1989)Nucleic Acids Research，17，2723-2732)から適合するようにした。フェニルアラニン取込みを測定する場合、反応混合物(100μｌ)は次のものを含む：70S リボソームの１A₂₆₀単位：（１A₂₆₀単位=24ピコモル）、4μg ポリ(U)、50mM Hepes-KOH，pH 7.9，60 mM NH₄Cl，10 mM 酢酸マグネシウム、16 m M 2-メルカプトエタノール、0.25 mM ATP、0.25 mM GTP、8 mMホスホエノールピルベート、0.3 μg ピルベートキナーゼ、75μg 大腸菌ストリップtRNA、最適量 (約300 μg たんぱく質）の高速リボソーム後上澄み(S150)および10μM[³H]フェニルアラニン(5 Ci/mmol; 5 μCi)。ロイシンの誤取り込みを測定する場合、非- 同族系アミノ酸、[³H]ロイシン(5 Ci/mmol; 5 μCi)および同族系アミノ酸[¹²C ］フェニルアラニンを、それぞれ１μM および10μM の濃度で同時添加した。ポリ(U)- 指示による取込みを、アンチセンスDNA オリゴマーの存在下に行う場合、これらのオリゴマーはポリ(U)の添加によりたんぱく質合成を開始する前に、モル比30/ リボソームで添加された。結果および検討文献(ノラー、エッチ．エフ.(Noller,H.F.)(1991)Annu．Rev．Biochem.,60,19 1-227)の調査および我々の実験における最近の研究(ピナルド、アール．ら(Pina rd，R．et al.)(1993)FASEBJ.,7，173-175; ピナルド、アール．ら、(199 4)Nucleic Acids Research，22:619)は、小リボソームサブユニットにおける16S リボソームRNA の四つの領域: いわゆる10，530，900および 1400/1500領域が翻訳精度のコントロールに重要であることを示唆している（図1）。図１は、大腸菌16SリボソームRNA の構造を示す(グッテル、アールアール(Gutell,R.R.)(19 93)Nucleic Acids Research，21,3051-3057)。環は、翻訳精度のコントロールに関連する領域を示す。したがって、これらの領域に相補的なデオキシリボヌクレオチドが翻訳精度に影響するかどうか（低下するかまたは増加するか）を調査した。調査したアンチセンスDNA オリゴマーの例を以下の表１に示す。配列は、3'-5’方向で記されている。表２は、これらの薬剤で得られた結果をまとめたもので、これら薬剤の幾つかは翻訳精度を調節することができることを示す。翻訳の読み違えは、テキストに記載のように、ポリ(U)指示のシステムにおけるロイシンの誤取込みを測定することにより評価される。結果は4-5 回の独立した実験の平均である。実験変動は±10% である。同族系アミノ酸フェニルアラニン(500 814 ± 5000cpm)はオリゴマーの添加により影響されなかった。^xは、リボソームの翻訳精度に影響を与えるオリゴマーを示す。本発明の第二の部分は、リボソームがHIV mRNAに存在するものに相当するシフト領域を翻訳しなければならない場合、特にどの薬剤がリボソームフレームシフトを低下させるかを研究する。 2- フレームシフト効力におけるアンチセンスDNA オリゴマーの効果 T7プロモーターのコントロール下にクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)遺伝子をコードする発現ベクター、pCAT-HIV(-1)は、CAT 遺伝子を含む発現ベクター pLRC-CATから導かれた（以下参照）。CAT 遺伝子は、コード領域の開始点で、HIV フレームシフト領域を含む延長部により修飾された。pC AT-HIV(-1)からの発現は、リボソームがHIV シフト領域において翻訳リーディングフレームを変化させ、左にシフトさせた場合のみ、活性CAT たんぱく質を導く。我々は、インビトロでのpCAT-HIV(-1)からのCAT 遺伝子の発現を、以下のようにしてアンチセンスDNA オリゴマーの存在または不存在下に調査した：最初に、CA T 遺伝子をT7 RNA ポリメラーゼでインビトロ転写し、続いてCAT メッセンジャーをDNA オリゴマーと共にまたはこれと別に翻訳して、CAT 活性を測定した。 pCAT -HIV(-1)を用いた場合にはCAT 活性を低下させるが、対照 pLRC-CAT ではCAT 活性に影響しないDNA オリゴマーは、HIV に対する強力な治療薬である。比較のために、発現ベクター pCAT-HIV(0)もまた構築した。これは、CAT 遺伝子の開始点でHIV フレームシフト領域を含むがただしこの場合フレームシフトはCA T 酵素を得るのに必要ではないというものであった。方法 1- N-末端修飾CAT 遺伝子を含むCAT 発現ベクターの構築 CAT 発現ベクター、pLR -CATを、pACYC184(ニューイングランドバイオラボ) から、CAT コード配列+ ぶら下がり領域をコードするTaq1-Taq1 フラグメントを切り出しそしてこのフラグメントをプラスミドpBluescript SK-（ストラタジーン）のポリリンカー部位と連結し、Cla1で直線化することにより構築した。Sph1 部位は、開始AUG トリプレット(AAATGGをGCATGCで置換した）の周囲に部位特異的突然変異誘発することにより作りだされ、その結果pLRC-CATが得られた。全ての操作は、サムブロックらにより基本的に記載されたプロトコールを用いて実施された（サムブロック、ジェイ.(Sambrook，J.)、フリッシュ、イー．エフ.(Fri tsch,E.F.)およびマニアティス、ティ.(Maniatis，T.)（1989）In Molecular Cl oning．A Laboratory Manual，２^d編、コールドスプリングハーバーラボラトリー(Cold Spring Harbor Laboratory)，ニューヨークのコールドスプリングハーバー）。 pCAT -HIV(-1)およびpCAT-HIV(0)を構築するために、HIV のフレームシフト領域および突出する付着Sph1端部を含む合成の二重ストランドDNA を調製し、Sph1 で制限したpLRC-CATへ挿入した。図２は、これらのフラグメントの配列を示す。方法はビッカーズおよびエッカーから導かれた（ビッカーズ、ティ．エー．およびエッカー、ディ．ジェイ.(1992)Nucleic Acids Research，20,3945-3953)。 2- “インビトロ”転写および翻訳 Hind IIIで直線化されたpCAT -HIV(-1)、pCAT-HIV(0)およびpLRC-CATのインビトロ転写を、次のものを含む転写混合物(100μｌ)中で、T7 RNA -ポリメラーゼを用いて実施した：10μg の直線状プラスミド、80 mM Hepes-KOW，pH 7.5，12 mM MgCl₂，2 mM スペルミジン、5 mMジチオトレイトール、1000単位/ml RNasin 、5 単位/ml のピロホスファターゼ、T7 RNA ポリメラーゼの最適量、500 μM A TP，CTP，UTP，50 μM GTP および500 μM のキャップ類似物Me⁷GpppG（ファルマシア）。120 分間37℃でインキュベーション後、トランスクリプトをフェニル - クロロホルムおよびエタノール- 沈殿物で抽出した。 RNA 転写は、製造業者の指示に従って、ヌクレアーゼ処理した網状赤血球（プロメガ）中30℃で１時間翻訳された。翻訳生成物の大きさを分析するために、翻訳は［³⁵S］メチオニンの存在下に実施され、15 % SDS/ ポリアクリルアミドゲル電気泳動により翻訳生成物を分析した。非標識化メチオニンは、CAT 活性を調査すると存在した。アンチセンスDNA オリゴマー(1.5μg)は、存在する場合には、RNA 転写物約0. 25μg を添加する前に、翻訳混合物(25 μl)へ添加された。CAT 分析 CAT 分析のために、プロメガ社のTechnical Bulletin TB084にしたがって、25 μg の翻訳混合物を、5 μｌのブチリルCoA(5 mg/ml)、10μｌの[³H]クロラムフェニコール(0.5 mM)、0.25μCi、および85μｌのトリス- HCl 緩衝液0.25M（pH 8）とともに混合した。混合物を約３時間インキュベーションし、キシレン抽出後に、変性クロラムフェニコールの液体シンチレーションカウンターによりCAT 活性を定量化した。結果すべての生存微生物のリボソームRNA には非常に高い保存性がある(ラウ、エッチ．エー．ら(Raue,H.A．et al．)（1988）Prog．Biophys．Molec．Biol.,51 ，77-129;:グッテル、アール．アール．(1993)Nucleic Acids Research，21，30 5 1-3057; ニーフス、ジェイ．エム．ら(Neefs，J.M．et al.)(1993)Nucleic Acid s Research，21，3025-3049）。本発明の最初の部分では、翻訳精度に影響するかもしれないオリゴマーの潜在的標的物である大腸菌16S リボソームRNA の領域が同定された。リボソームRNA の高い保存性のために、16S 類似の哺乳動物リボソームRNA(18S rRNA)において相当する領域が直ちに同定された。アンチセンスオリゴマーは、リボソームフレームシフトに影響を及ぼすためにこれらの領域に対して向かった。表３は、本発明にしたがって使用されたアンチセンスDNA オリゴマーの幾つかを示す。配列は、3'-5’方向で記載されている。’は、プローブが大腸菌リボソームとともに使用される相当するプローブと若干異なり、一方のウサギ(Oryctolagus c uniculus)とヒト(Homo sapiens)、他方の大腸菌との間に配列の変化があることを考慮することを示す。括弧内の数は、大腸菌 16S rRNA における相当する位置を示す。ウサギおよびヒトの18S rRNA の完全配列は、EMBLヌクレオチド配列ライブラリー（それぞれ、ライルカー、エー．ら(Rairkar，A．et al.)（1988）NucleicA cids Research，16，3113；ゴンザレス、アイ．エル．(Gonzalez，I.L.)およびシュミッケルアール．ディ.(Schmickel R.D.)(1986)Am．J．Hum．Genet.,38， 419-427）から得られた。表４は、一連のアンチセンスDNA オリゴマーの存在下にウサギリボソームでpCAT-HIV(-1)、pCAT-HIV(0)およびpLRC-CATに相当するメッセンジャーを翻訳した場合得られる結果を示す。 pCAT-HIV(-1)から転写されたメッセンジャーを用いて翻訳すると、CAT 活性はリボソームフレームシフトを必要とする。翻訳は、テキストに記載のようにウサギ網状赤血球溶解物において行われた。添加するオリゴマーの量は1.5μg であった。実験は６回の独立した分析の平均値である。これらの分析において、CAT 活性は、クロラムフェニコールとの翻訳混合物のインキュベーション後３時間してから、テキストに記載のように調査された。CAT 活性は、cpm で表される。括弧内の数字は、翻訳をオリゴマーの存在下に行った場合のCAT 活性±標準変動のパーセントを示し、100%の値はオリゴマーの不存在下のCAT 活性である。オリゴマーは、対照pLRC-CAT(67318 ±7000 cpm)のいずれかから転写されたmRNAで測定したCAT 活性に影響を与えなかった。CAT 活性が、pCAT-HIV(0)（これは、コード領域の最後に延長部を有するがしかしCAT 発現のためにリボソームフレームシフトを必要としない）から転写されたmRNAで測定された場合、その値は59482±600 0 cpmであった。これは、オリゴマー6'または10により影響を受けないがしかしオリゴマー8 および9'でその初期値の約85 %まで低下し、そしてオリゴマー７で約60 %まで低下した。表４における結果は、リボソームフレームシフトをHIV mRNAのシフト領域に沿って著しく低下させることを示す。いわゆる領域10を標的とするオリゴマー（オリゴマー6'）および1400を標的とするオリゴマー(オリゴマー10')は、リボソームフレームシフトに影響を与えなかった。しかしながら、大腸菌リボソームではこれらの領域を標的とするオリゴマーがリボソームの翻訳精度を調節することができるので、領域10または1400内で相互作用する他のオリゴマーはリホソームフレームシフトに影響するであろうと思われる。オリゴヌクレオチドの治療用途は、クルッケら(クルッケ、エス．ティ.(Crook e,S.T．et al.)(1992)Annu．Rev．Toxicol.，32，329-378)により最近研究された。オリゴマーの細胞吸収はリポソームを用いることにより強化されるであろう (DOTMA,Gibco BRLまたは DOTAP，Boehringer Mannheim)。オリゴマーの細胞内安定性を強化するために広い範囲の修飾が記載されている。記載した様々な変法の中で、メチルホスホネートを生ずるホスホジエステル結合の変法または糖(2'-0- メチル- オリゴマー)の2'位の変法は、これらがRNアーゼ H活性を排除せずしたがってリボソームを害さないので、好ましい。本発明は、以下の実施例を参考にすることにより一層迅速に理解されるてあろう。そしてこの実施例はその範囲を制限するというより本発明を説明するためのみのものである。実施例１培養したヒト細胞におけるリボソームのフレームシフトおよびヒーラ-T4 細胞におけるHIV-1 の複製におけるアンチセンスDNA オリゴマーの効果誘導プロモーターのコントロール下にCAT 遺伝子を含む発現ベクター(pGRE5-C AT-HTV(-1))を、リボソームのフレームシフトにおけるアンチセンスDNA オリゴマーの効果を調査するために、培養したヒト細胞に使用した。CAT 遺伝子は、コード領域の開始点でHIV フレームシフト領域を包含する延長部により、ちょうど試験管内翻訳分析(in vitro trnaslation assays)におけるように、修飾された。比較のために、対照発現ベクター、pGRE5-CAT-HIV(0)もまた構築し、これは、 CAT 遺伝子の開始点でHIV フレームシフト領域を含むが、ただしこの構築物では CAT 酵素を産生するためにフレームシフトは必要ではない。 HIV-1 の複製におけるDNA オリゴマーの阻害効果は、HIV で感染された培養細胞の細胞不含有上澄みにおけるHIV リバーストランスクリプターゼ活性を測定することにより評価された。培養細胞とともに分析に使用されるDNA オリゴマーは、細胞内ヌクレアーゼによる分解を避けるため、またこれらが標的RNA 分子を攻撃するであろうRNアーゼ H活性を誘発することを避けるために修飾された。修飾は、オリゴマーのホスホジエステル結合（メチルホスホネート）またはオリゴマーの糖の2'位(2'-0-メチルホスホジエステル)のいずれかである(クルック、エス．ティ．ら(1992)Annu ．Rev.Toxicol.,32,329-376)。メチルホスホネートおよび2'-0- メチルオリゴマーの合成すべてのオリゴデオキシヌクレオチド合成は、自動DNA 合成機（ミリポアエクスペダイト核酸合成システム 8908^TM型）で行われた。メチルホスホネートを、ホグレフ、アール．アイ．ら((Hogrefe R.I.et al.)(1933)Nucleic AcidsRese rach,21，2031-2038)の方法に従って合成し脱保護化し、そして2'-0- メチルホスホジエステルを、オリゴリボヌクレオチドについて製造者により提供された標準的プロトコールにしたがって合成し脱保護化した。DNA オリゴマーをC18セプパック(SepPak)^TMカートリッジ（ウォーターズ）において精製した。発現ベクター発現ベクターは、マダー、エス．およびホワイト、ジェイ．エッチ.((Mader,S .and White,J.H.)(1993)Proc,Natl.Acad.Sci.USA,90,5603-5607)により構築されたEBV エピゾームベクター p220.2- pGRE 5/CAT プラスミドの誘導体であり、これはデキサメタゾンで誘導されうる。我々が構築した誘導体は、それぞれ図3Aおよび3Bに正確に記載されているように、HIV ゲノムのフレームシフト領域の挿入によりN-末端が修飾されたCAT 遺伝子を含む pGRE5-CAT-HIV(-1)およびpGRE5-CA T-HIV(0)である。CAT 発現は、pGRE5-CAT-HIV(-1)ではリボソームフレームシフトを必要とするがpGRE5-CAT-HIV(0)では必要としない。プラスミドpSV-βGal（プロメガ）、すなわちβ- ガラクトシダーゼ活性をコードする発現ベクターを使用してトランスフェクションの効力を標準化した。細胞培養リボソームのフレームシフトを測定するために使用する細胞列は、ヒーラ細胞列であり、アメリカ合衆国、メリーランド州、ロックビレ、パークローンドライブ 12301(12301 Parklawn Drive，Rockville，MD 20852 USA)のアメリカンタイプカルチャーコレクション(American Type Culture Collection)に、ATCC C CL2 の寄託番号にて寄託されたヒト上皮癌細胞列である。細胞は、10% ウシ胎児血清、100 U/mlペニシリン Gおよび100 μg/mlストレプトマイシンを加えたダルベッコ変性イーグル培地において培養された。真核細胞発現ベクターを用いたトランスフェクションは、４時間の標準的カルシウムホスフェート共沈技術とこれに続くグリセロールショックにより行われた。10-cm プレートにおいて集密度50 %の細胞に、20μg の pGRE5-CAT-HIV(-1)または pGRE5-CAT-HIV（0）、10μg のpSV-βgal を、DNA オリゴマー(約40μg)とともにまたはこれを用いることなくトランスフェクションした。デキサメタゾン（シグマ）をトランスフェクション後直ちにおよびトランスフェクション後約48時間してから25 nM で添加した。 HIV の複製を測定するために使用される細胞列は、ヒーラ-T4(HT-6C)細胞であり、これはAIDS Research Reference Reagent Program，Division of AIDS，N IAID，NIH（チェセブロ、ビィ.(Chesebro,B.)およびウェルリー、ケー.(Wehrly ，K.)（1988）J．Vriol．62，3779-3788）を通して得ることができる。リボソームのフレームシフトにおけるオリゴマーの効果細胞は、100 μｌの0.25M トリス- HCl(pH 8)において採取された;80 μl はプロメガ社からの技術報告書 #084 に記載されているように、試験管内翻訳分析と同じ方法で液体シンチレーション計測によりCAT 活性を分析され、一方20μｌは、標準プロトコール(ミラー、ジェイ．エッチ.(Miller J.H)(1972)Experiment s in Molecular Genetics,コールドスプリングラボラトリープレス、ニューヨーク、pp 352-355)に記載のように、o-ニトロフェニル β- D-ガラクトシド(O NPG)を分解して o- ニトロフェノールを作る比色分析を用い、β- ガラクトシダーゼ活性について評価された。HIV-1 ウィルスの複製におけるオリゴマーの効果ヒーラ-T4 細胞(1x10⁶)を、トランスフェクションする24時間前に10% ウシ胎児血清を加えたダルベッコ変性イーグル培地８ml において10 cm プレートへ播種した。ヒーラ-T4 細胞に、標準燐酸カルシウム法により15μg のHIV-1 プロウィルス(HXBH10)DNA(タービリガー、イー．エフ．ら(Terwilliger,E.F．et al.) （1989）Proc，Natl．Acad．Sci．USA，86，5163-5167)およびオリゴマー20μg をトランスフェクトした；トランスフェクションしてから12時間後、細胞を洗浄し、10% ウシ胎児血清を加えたダルベッコ変性イーグル培地８ml中で培養し；トランスフェクションしてから48時間後、上澄みをHIV-1 リバーストランスクリプターゼ活性分析のために集めた：細胞不含有上澄み50μｌを低速遠心分離(3000r pmで20分間)のために集めそして記載されているように検定した(リー、エム．エッチ．ら(Lee,M.H.et al.)（1987）J.Clin．Microbiol.，25，1717-1721)。リボソームのフレームシフトにおけるオリゴマーの効果の結果を表５に示す。これらの結果により、修飾されたオリゴマーはリボソームフレームシフトを低下し、このためHIV 発生を阻止する能力を有することがわかる。オリゴマーは、pGRE5-CAT-HIV(0)ではCAT 活性に影響を与えなかった。これはリボソームの普通の機能に影響を与えないことを意味する。図４は、HIV で感染した培養細胞の上澄みにおけるHIV リバーストランスクリプターゼ活性を測定することにより評価されるように、HIV-1 複製におけるオリゴマーの効果の例である。HIV リバーストランスクリプターゼ活性の大きな低下は、オリゴマーの効力がウィルス複製を阻止することを示す。本発明は特定の実施態様と結びつけて記載したが、別の変法も可能であり、そして本出願は、一般的には本発明の原則に従って本発明のバリエーション、使用または改造のいずれをも含みそして本発明が属する技術内で公知のまたは通常のプラクティスの範囲内であり、これまで記載した本質的特徴を応用し、そして添付の請求の範囲に従うような本記載からの逸脱をも含むことは理解されるであろう。

【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９６年４月１５日【補正内容】条約３４条補正書の翻訳文（１）英文明細書第２頁を差し替えて同頁第30〜31行目に文章を挿入したので、日本語明細書第２頁を差し替えた（日本語明細書第２頁第18〜19行目に挿入）。スの一つである。全てのレトロウィルスのpol 遺伝子は、逆転写に必須の酵素活性、プロウィルスインテグレーションおよびウィルス前駆体たんぱく質の分解を仲介するプロテアーゼ活性をコードする。興味深いことに、ヒト免疫不全ウィルス(HIV -1)では、ウィルスpol 遺伝子は、リボソームがスプライスされていないHIV mRNA種を翻訳する時に、リボソームフレームシフトを介して発現される（ジャックス、ティ .(Jacks,T.)(1990)Curr.Top.Microbiol.Immunol.,157，93-124; ハットフィールドら(Hatfied et al.)(1992)，Adv．Viurs Res.，41,193-239）。このフレームシフトの効力は、gag 遺伝子生成物、ウィルスコアたんぱく質、およびpol 遺伝子生成物の比を確定する。この比における変化がウィルスアッセンブリーに著しく影響を与えるかもしれない(パーク、ジェイ．およびモロウ、シー．ディー.(P ark，J．and Morrow，C.D．)（1991）J．Virology，65，5111-5117)。ビッカーズ(Vickers)およびエッカー(Ecker)((1992)Nucleic Acids Research ，20，3945-3953)は、HIV メッセンジャーRNA におけるgag-pol フレームシフト領域を標的とするオリゴヌクレオチドを使用するとリボソームフレームシフトの発生が増加することを示した。これらのオリゴヌクレオチドはHIV gag-pol領域に特異的であり、それ故、ウィルスメッセンジャーRNA 配列を変えるかもしれない突然変異により影響を受ける。アマン(Amann)ら((1992)Appl．Env．Microbiol.，58(2)：614-623)は、鋳型としての16S rRNAの使用および該rRNAの特定の部分に相補的なプローブとしてのオリゴマーの使用を教示する。これによりポリメラーゼチェインリアクション(PCR )を用いて該rＲＮＡの一定の部分を特異的に増幅することが可能になり、よってバイオフィルム集団中の硫酸還元バクテリアの存在の検出が可能になる。国際公開番号第90/08841号として1990年８月９日に公開された国際特許出願において、バクテリアであるリステリア(Listeria)のリボソームの16S rRNAの特定の部分に相補的なDNAプローブの使用が教示されている。このプローブは標識されて（とりわけP32およびフルオレセイン）食物サンプルを含むさまざまな媒体中の標的を検出する。哺乳動物細胞に対し副作用を起すことなくレトロウィルスのウィルス発現に影響を与えるであろう哺乳動物細胞におけるリボソームフレームシフトの発生を低下する手段を提供することが非常に望まれる。発明の概要本発明の一つの目的は、細胞に副作用を起こすことなくレトロウィルスのウィルス発現に影響を与えるヒト細胞におけるリボソームフレームシフトの発生を低下させるためのアンチセンスDNA オリゴマーを提供することである。本発明の別の目的は、ウィルスメッセンジャー配列にける突然変異により影響されないようなアンチセンスDNA オリゴマーを提供することである。本発明のアンチセンスDNA オリゴマーは、ビッカーズおよびエッカー((1992)N （２）請求の範囲を全頁差し替えた（日本語明細書第22〜23頁）。請求の範囲１．以下の群： a) 大腸菌16S rRNAにおける領域10に相当するヒト18S rRNAにおけるヌクレオチド1-20 b) 大腸菌16S rRNAにおける領域530 に相当するヒト18S rRNAにおけるヌクレオチド595-641 c) 大腸菌16S rRNAにおける領域900 に相当するヒト18S rRNAにおけるヌクレオチド1182-1220 および d) 大腸菌16S rRNAにおける領域1400に相当するヒト18S rRNAにおけるヌクレオチド1695-1715 から選択さるオリゴマーであって、前記オリゴマーはリボソームフレームシフトの発生を低下しそしてウィルス酵素たんぱく質の発現を阻害するものである哺乳動物細胞の小リボソームサブユニットのRNA の領域に相補的なアンチセンスDNA オリゴマー。２．オリゴマーが3'-5'方向に読まれ、そして請求項１記載の領域(a)，(b)，(c) および(d)がからなる群から選択される、請求項１のアンチセンスDNAオリゴマー。３．請求項１のアンチセンスDNA オリゴマーと、薬剤上許容されうる担体とをレトロウィルス感染宿主へ投与し、これにより前記レトロウィルスの酵素たんぱく質発現を阻害することからなる宿主におけるレトロウィルス感染の治療方法。４．前記レトロウィルスが、HIV、ヒトT-細胞白血病ウィルス１型(HTLV-1)、およびpol 遺伝子を発現するためにリボソームフレームシフトが必要なヒトレトロウィルスからなる群から選択される請求項３の方法。５．前記レトロウィルスの酵素たんぱく質発現を実質的に阻害するのに十分な量の請求項１のアンチセンスDNA オリゴマーと、薬剤上許容されうる担体とからなる宿主におけるレトロウィルス感染の治療のための薬剤組成物。６．前記レトロウィルスがHIV、ヒトT-細胞白血病ウィルス１型(HTLV-1)、およびpol 遺伝子を発現するためにリボソームフレームシフトが必要なヒトレトロウィルスからなる群から選択される請求項５の薬剤組成物。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者コテ，マールカナダ国ケベックアーシュ２ヴェ４カ１，モントリオール，ジャン−マンス 5170，アパルトマン３ (72)発明者ペイヤン，カトリーヌカナダ国ケベックアーシュ３テ１アーシュ７，モントリオール，サンケヴィン 3920，アパルトマン８

Claims

【特許請求の範囲】１．以下の群 a) 大腸菌16S rRNAにおける領域10に相当するヒト18S rRNAにおけるヌクレオチド1-20 b) 大腸菌16S rRNAにおける領域530 に相当するヒト18S rRNAにおけるヌクレオチド595-641 c) 大腸菌16S rRNAにおける領域900 に相当するヒト18S rRNAにおけるヌクレオチド1182-1220 および d) 大腸菌16S rRNAにおける領域1400に相当するヒト18S rRNAにおけるヌクレオチド1695-1715 から選択さるオリゴマーであって、前記オリゴマーはリボソームフレームシフトの発生を低下しそしてウィルス酵素たんぱく質の発現を阻害するものである哺乳動物細胞の小リボソームサブユニットのRNA の領域に相補的なアンチセンスDNA オリゴマー。２．前記請求の範囲１のa)、b)、c)およびd)を定義し、そして以下の群：から選択される請求項１のアンチセンスDNA オリゴマー。３．請求項１のアンチセンスDNA オリゴマーと、薬剤上許容されうる担体とをレトロウィルス感染宿主へ投与し、これにより前記レトロウィルスの酵素たんぱく質発現を阻害することからなる宿主におけるレトロウィルス感染の治療方法。４．前記レトロウィルスが、HIV、ヒトT-細胞白血病ウィルス１型(HTLV-1)、およびpol 遺伝子を発現するためにリボソームフレームシフトが必要なヒトレトロウィルスからなる群から選択される請求項３の方法。５．前記レトロウィルスの酵素たんぱく質発現を実質的に阻害するのに十分な量の請求項１のアンチセンスDNA オリゴマーと、薬剤上許容されうる担体とからなる宿主におけるレトロウィルス感染の治療のための薬剤組成物。６．前記レトロウィルスがHIV、ヒトT-細胞白血病ウィルス１型(HTLV-1)、およびpol 遺伝子を発現するためにリボソームフレームシフトが必要なヒトレトロウィルスからなる群から選択される請求項５の薬剤組成物。