JPH09511143A

JPH09511143A - アルファーウイルスｃＤＮＡベクター

Info

Publication number: JPH09511143A
Application number: JP7525612A
Authority: JP
Inventors: ペーターリルエストレム，; ヘンリクガロフ，
Original assignee: ビオプシヨン・エイビー
Priority date: 1994-03-31
Filing date: 1995-03-30
Publication date: 1997-11-11
Also published as: WO1995027044A1; EP0753053A1; ES2223051T3; DK0753053T3; FI963860A7; CA2184261A1; SE9401091D0; AU2155795A; DE69533130T2; AU699384B2; DE69533130D1; ATE268813T1; US6566093B1; FI963860A0; EP0753053B1

Abstract

(57)【要約】本発明は、ポリヌクレオチド分子、およびヒトもしくは動物の細胞内への組込み後の所望の産物の産生のためのそれらの使用に関する。それに加え本発明は、前記ポリヌクレオチド分子を含む薬剤学的組成物および予防的もしくは治療的療法におけるそれらの使用にも関する。本発明は更に、所望の産物の発現を達成するための動物内でのそのようなポリヌクレオチドの使用にも関し、その所望の産物はその動物から回収することができるが、しかし前記動物内で例えば治療的活性のようないずれかの有益な活性は生じることはない。より具体的には本発明は、アルファーウイルスから取得されるｃＤＮＡおよび所望される物質をコードする異種すなわち外来性ｃＤＮＡからできている組換えｃＤＮＡを含んでなるアルファーウイルスｃＤＮＡベクターに関する。

Description

【発明の詳細な説明】アルファーウイルスｃＤＮＡベクター本発明は、ポリヌクレオチド分子、およびヒトもしくは動物の細胞内に組込ませた後に所望される産物の産生のためのそれらの使用に関する。それに加え、本発明は前記ポリヌクレオチド分子を含む薬剤学的組成物および予防的もしくは治療的な療法におけるそれらの使用に関する。本発明は更に所望される産物の発現を達成するための、動物内でのそのようなポリヌクレオチド分子の使用にも関し、その所望される産物は動物から回収することができるが、前記動物内でいずれかの有益な（例えば、治療的）活性を生じることはない。より具体的には本発明は、アルファーウイルスから取得されるｃＤＮＡおよび所望される物質をコードする外因性（すなわち、外来性）ｃＤＮＡからなる組換えｃＤＮＡを含んでなるアルファウイルスｃＤＮＡベクターに関する。アルファウイルスは、ウイルススパイク蛋白質を含むエンベロープにより包囲されるヌクレオカプシド内に被包される正の極性の一本鎖ＲＮＡゲノムを有するトガウイルス（Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ）科に所属する属である。アルファウイルス属には中でも、シンドビス（Ｓｉｎｄｂｉｓ）ウイルス、セムリキ森林（ＳｅｍｌｉｋｉＦｏｒｅｓｔ）ウイルス（ＳＦＶ）、ロスリバー（ＲｏｓｓＲｉｖｅｒ）ウイルス、ベネズエラ（Ｖｅｎｅｓｕｅｌａｎ）、西部（Ｗｅｓｔｅｒｎ）、および東部（Ｅａｓｔｅｒｎ）ウマ脳炎ウイルスが含まれ、これらは全て密接に関連し合っている。特にシンビスウイルスとセミリキ森林ウイルスとは広範囲にわたる研究が行われており、これらのウイルスの生活環、複製様式などは熟知されており、そしてそのため本明細書で具体的に論議する必要はない。アルファウイルスは動物細胞内で非常に効率よく複製し、そのためこのウイルスはそのような細胞内での蛋白質および核酸の産生用のベクターとして重要なものとなっている。シンビスウイルスに基づく発現系が米国特許第５０９１３０９号および米国特許第５２１７８７９号に開示される。米国特許第５０９１３０９号のシンドビスウイルスベクターは、挿入された異種ＲＮＡを有するシンドビスの干渉性欠損（ＤＩ）ＲＮＡから得られるＲＮＡを含む。米国特許第５２１７８７９号では、一つの異種コーディング配列および宿主細胞内でシンドビスウイルスサブゲノムのメッセンジャーＲＮＡ合成を指令することが可能な少なくとも一つのシンドビスウイルスの連結領域を含む自己複製性かつ自己パッキング性組換えシンドビスウイルスＲＮＡ分子が開示される。ＲＮＡ転写物は、プラスミド内の例えばＳＰ６のようなプロモーターの制御下に予め挿入されているシンドビスウイルスｃＤＮＡの転写によりインビトロで合成される。ｃＤＮＡ転写に関連して開示されるＳＰ６プロモーターおよび他のプロモーターは動物もしくはヒトの細胞内では機能しない。国際公開第９２／１０５７８号（ＧａｒｏｆｆおよびＬｉｌｊｅｓｔようなウイルスの説明となる例はセミリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）である。初期の内に、ＳＦＶＲＮＡゲノムの全長ｃＤＮＡコピーが構築されたことが報告された（ＪｏｕｒｎａｌｏｆＶｉｒｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌｕｍｅ６５、ページ４１０７−４１１３、１９９１）。この構築物がＳＰ６転写ベクター内に工学的に組み込まれ、その転写ベクターから全長ＳＦＶゲノムＲＮＡ分子がインビトロで転写され得る。このＲＮＡを動物細胞内にトランスフェクトすることができ、その動物細胞内ではそのＲＮＡ分子は正常な野生型ウイルス感染を援助するであろうが、それはそのＲＮＡ分子が正の極性のものでありかつその細胞内でメッセンジャーＲＮＡ分子として機能することができるためである。トランスフェクションの際には、そのゲノムの最初の部分がポリ蛋白質に翻訳され、そのポリ蛋白質は４つの非構造性蛋白質（ｎｓＰ１−ｎｓＰ４）に自己開裂する。これらの蛋白質がアルファーウイルスのレプリカーゼを構築し、そして新規の全長ゲノムＲＮＡ分子および内部プロモーター（２６Ｓプロモーター）から出発するサブゲノムＲＮＡ種の産生の原因となる。それらは更に、新規のＲＮＡ分子の５ ’末端のキャッピングの原因ともなる。ｐＳＦＶ４ｃＤＮＡプラスミドを更に、構造蛋白質用のコーディング領域の複数部分の削除を行い、そしてそのような削除化部分を外来性コーディング配列の挿入用のリンカー領域で置換することにより一般的なＤＮＡ発現プラスミド内に工学的に挿入した（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌｕｍｅ９、ページ１３５６−１３６１、１９９１；Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌｕｍｅ１１、ページ９１６−９２０、１９９３）。外来性ＤＮＡコーディング配列がそれらのベクター内に挿入される場合には、ウイルス性構造蛋白質がアルファーウイルスのレプリカーゼにより作製されるＲＮＡサブゲノムから翻訳される際に多量の外来性蛋白質が取得される。国際公開第９２／１０５７８号によると、アルファーウイルスＲＮＡゲノムから取得され、かつ動物細胞の効率的感染が可能であるＲＮＡ分子が提供され、そのＲＮＡ分子は前記アルファーウイルスＲＮＡの複製にとって必須である全アルファーウイルスゲノム領域を含み、そして更に前記宿主細胞内でその機能を発現することが可能な外因性ＲＮＡ配列を含み、前記外因性ＲＮＡ配列がそのＲＮＡ分子の内のそれ自体の複製にとって非必須である領域内に挿入される。国際公開第９２／１０５７８号に従うと、そのようなＲＮＡ分子をトランスフェクションのいずれかの手段もしくは後に動物細胞を感染させる目的では感染性アルファーウイルス粒子内への前記ＲＮＡ分子のパッケージングにより動物細胞内に転移させることができる。両事例では、トランスフェクトさせた、もしくは感染させたそのＲＮＡ分子は標的動物細胞内で複製し、かつ前記ＲＮＡ分子内に挿入された外因性ＲＮＡ配列を発現することができるであろう。そのような分子および細胞内でのそれらの発現のための手法を、感染もしくは癌を予防もしくは治療する目的のワクチンもしくはワクチン接種のための手法として用いることができる。現行の遺伝子工学的技術によりＲＮＡ分子を作製することは困難であるため、アルファーウイルスゲノムの操作（例えば、異種コーディング配列の挿入など）が対応するｃＤＮＡ分子において実施されている。その結果、工学的に作製されたｃＤＮＡ分子はインビトロで転写され、そして得られるＲＮＡ転写物を用いて細胞の形質転換が行われている。工学的に作製されたｃＤＮＡを含むこれらの構築物は動物もしくはヒトの細胞内では転写することが不可能であり、それは転写制御に用いられるプロモーターがそのような細胞内では機能しないためである。ｃＤＮＡ分子それ自体を用いて細胞の形質転換を行い、そしてそれらの細胞中での所望される物質の発現を達成することができれば有利であろうことは明白である。国際公開第９０／１１０９２号は、生物学的に活性なペプチドを操作的にコードする薬剤としての裸のままのポリヌクレオチドの使用を開示している。そのような分子を、前記ペプチドのインビボ発現用に組織内に注入することが提案されている。具体的にはそのポリヌクレオチドがＤＮＡであること、ならびにそのペプチドが抗原として機能できること、およびそのためそのペプチドをワクチンとして使用することができることが特許請求されている（更に、Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｖｏｌｕｍｅ２５９、ページ１７４５−１７４９；ＤＮＡａｎｄＣｅｌｌＢｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌｕｍｅ１２、ｎｕｍｂｅｒ９、全刊、１９９３、も参照されたい）。しかしながら動物およびヒトの細胞内で発現され得る異種コーディング配列を含む組換えウイルスｃＤＮＡ構築物はその明細書内では開示されておらず、かつ複製に必要なレプリカーゼをコードする自己複製性ＲＮＡに転写されるｃＤＮＡ構築物も開示されていない。たとえそうであったとしても、ポリペプチドおよびＤＮＡを転写するためのポリメラーゼをコードするＤＮＡの使用が国際公開第９０／１１０９２号には開示されており、その開示では初期量のポリメラーゼは調製物内にそのポリメラーゼをコードするｍＲＮＡを含ませることにより提供され、そのｍＲＮＡがその細胞により翻訳される。従って、アルファーウイルスＲＮＡに相補的でありかつ外因性ｃＤＮＡ配列を含み、そして動物もしくはヒトの細胞内に取り込ませて前記ｃＤＮＡの転写もしくは発現を達成することができる組換えｃＤＮＡ分子を提供することが本発明の目的である（例えばポリヌクレオチドもしくは蛋白質のような所望される産物がそのｃＤＮＡ分子を保持する細胞内で産生される）。本発明に従うと、この目的は、動物もしくはヒトの細胞内で機能するプロモーター配列の転写制御下に完全なｃＤＮＡ分子を配置することにより達成される。前記プロモーター配列は宿主細胞（すなわち、前記ｃＤＮＡ分子を保持する動物もしくはヒトの細胞）によりコードされるＤＮＡ−依存的ＲＮＡポリメラーゼによる転写を開始するであろう。従って本発明は、アルファーウイルスＲＮＡゲノムの少なくとも一部分に相補的なｃＤＮＡ分子に関し、そのｃＤＮＡ分子は前記アルファーウイルスＲＮＡの複製に必須な全アルファーウイルスＲＮＡゲノム領域の相補物を含み、そして更に動物もしくはヒトの細胞内でその機能を発現することが可能な外因性ｃＤＮＡ配列をも含み、前記外因性ｃＤＮＡ配列はそのｃＤＮＡ分子の内のそれ自体の複製に非必須な領域内に挿入され、かつ前記ｃＤＮＡ分子は前記動物もしくはヒトの細胞内で機能するプロモーター配列の転写制御下に配置される。本発明のプロモーター配列は真核生物もしくは原核生物起源のプロモーターを含むことができる。プロモーター領域は更に転写の抑制もしくは亢進のための制御因子を含むこともできる。適切なプロモーターはサイトメガロウイルスの前初期プロモーター（ｐＣＭＶ）およびラウス（Ｒｏｕｓ）肉腫ウイルスの末端反復配列プロモーター（ｐＲＳＶ）であり、それはこれらおよび類似のプロモーターの事例では転写は宿主細胞のＤＮＡ−依存的ＲＮＡポリメラーゼにより実施されるためである。細胞を、ＳＰ６、Ｔ３、もしくはＴ７ＲＮＡポリメラーゼ分子をコードする遺伝子（これらは染色体内に挿入されるかもしくはエピソーム内に残存するかのいずれかのものである）で事前に形質転換させてあるとすると、ＳＰ６、Ｔ３、もしくはＴ７プロモーターも使用することができる。これらの（ＳＰ６、Ｔ３、Ｔ７）ＲＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子の発現は、宿主細胞のＤＮＡ−依存的ＲＮＡポリメラーゼに依存する。本発明に従うと、外因性ｃＤＮＡ挿入断片は所望される産物のためのコーディング配列を含み、その所望される配列は生物学的活性蛋白質もしくはポリペプチド（例えば、免疫原性もしくは抗原性蛋白質もしくはポリペプチド）、あるいは治療的活性蛋白質もしくはポリペプチドであることが適切である。本発明の他の態様に従うと、外因性ｃＤＮＡ挿入断片はＲＮＡ配列に相補的な配列を含み、その例はアンチセンスＲＮＡ配列であり、そのアンチセンス配列を個体に投与して前記個体の細胞内での相補的ポリヌクレオチドの翻訳を阻害することができる。外因性ｃＤＮＡは更に追加的配列を含むこともでき、その例は自己開裂性リボザイム配列であるＲＮＡ配列に相補的な配列である。本発明のｃＤＮＡ挿入断片が組込み配列からできてはいるが、断続的ウイルス配列（一つもしくは複数）の発生が阻まれないことが適切である。定義により「インビトロ」は、ある処理が生きている生物体の内側で実施されることを意味するインビボとは反対の、生きている生物体の外側で実施される処理を意味する。本発明に従うと、生きている生物体は更に、生きている細胞、例えば真核生物もしくは原核生物の培養細胞をも含むことが意図される。本発明に従うと「形質転換」は、一般的には外因性ポリヌクレオチド配列の細胞（真核生物もしくは原核生物）の内側への取り込みを意味し、そしてその外因性ポリヌクレオチド配列が染色体外に滞留していてもよく（エピソームとして）、もしくはその細胞のゲノム内に安定に組込まれていてもよい。形質転換の様式は重要ではないが、現在知られているかもしくは将来開発されることがあるいずれかの方法を本発明に従って用いることができる。本アルファーウイルスｃＤＮＡベクターはアルファーウイルスＲＮＡ配列に相補的なｃＤＮＡに基づく。異種プロモーターの転写制御下で一旦ｃＤＮＡから転写されたら、そのアルファーウイルスＲＮＡはそれ自体のレプリカーゼにより自己複製し、そしてそのことにより転写された組換えＲＮＡ分子のコピー数を増幅することが可能となろう。そのレプリカーゼは更にそれら各分子の５’末端のキャッピングも行うであろう。これらの現象の結果として異種挿入断片ｃＤＮＡ配列の高レベル発現を動物もしくはヒトの個体においてインビボで取得することができる。国際公開第９２／１０５７８号に相反し、本発明は、ＲＮＡ構築物よりはむしろ動物もしくはヒトの細胞内自体に取込まれかつ転写され得るｃＤＮＡ構築物に関する。しかしながらそのｃＤＮＡが一旦ＲＮＡに転写されたら、後続の複製段階および遺伝子発現は原理的には国際公開第９２／１０５７８号にベクターとして記載されるものと同一となる。国際公開第９２／１０５７８号の開示は引用により本出願に含まれる。これ以降では、本発明を制限することなく本発明を説明する本発明の適切な態様が開示される。この態様に従うと、アルファーウイルスのサブゲノムプロモーターの下流に機能的な様式で挿入される異種挿入断片（例えば、ウイルス抗原（一例では、インフルエンザヘマグルチニン蛋白質、インフルエンザ核蛋白質、ＨＩＶ−１エンベロープ蛋白質、ＨＩＶ−１ｇａｇ− ｐｏｌ、ＨＩＶ−１ｎｅｆ）あるいは治療用蛋白質（一例では、ヒト成長ホルモン、インターロイキン−２、エリスロポイエチン、もしくは因子ＶＩＩＩ）あるいはリボザイムもしくはアンチセンスＲＮＡをコードする挿入断片）を含むｐＳＦＶ１のヌクレオチド１〜８２６５（国際公開第９２／１０５７８号、およびＢｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌｕｍｅ９、ページ１３５６−１３６１、１９９１）を含むｃＤＮＡ分子が、ｃＤＮＡ挿入断片の発現がＣＭＶプロモーターにより稼働される様式でプラスミド内のＣＭＶプロモーター下にクローン化される。そのｃＤＮＡ挿入断片の３’末端から下流には転写停止シグナル（例えば、ＳＶ４０に由来するもの）が配置されていて、転写を停止するようになっている。このプラスミドを動物細胞内に転移する場合には、このＣＭＶプロモーターは異種挿入断片を含むｃＤＮＡ断片の転写を促して一本の長いＲＮＡ分子を形成するであろう。このＲＮＡ分子は細胞質に輸送され、そこではその分子がＳＦＶベクターの非構造的レプリカーゼ蛋白質の翻訳のためのｍＲＮＡとして用いられる。初期に転写されたＲＮＡ分子はそれ自体の複製に必要とされる配列を保持するため、このレプリカーゼ蛋白質はその後にマイナス鎖中間体へのｍＲＮＡ分子の複製を開始するであろう。その後にそのＳＦＶレプリカーゼは組換えＲＮＡ分子のマイナス鎖上で内部の２６Ｓプロモーターを用いて、異種蛋白質をコードするかもしくはＲＮＡを生じるメッセンジャーＲＮＡ分子を産生するであろう。このＲＮＡ複製現象は国際公開第９２／１０５７８号に一層詳細に記載されている。アルファーウイルスゲノムの効率的複製は適切な５’および３’末端を必要とすることが知られている。従って本発明の適切な態様に従うと、自己開裂性リボザイム配列がｃＤＮＡ挿入断片の末端領域内に挿入される。このリボザイム分子は、開裂を受けた際にはその配列が適切なアルファーウイルス３’末端を産生するであろう様式でアルファーウイルスのゲノム配列の３’末端に配置される。従って初期転写物が作製され、かつ伸長反応が転写停止シグナル（例えば、ＳＶ４０のもの）で停止される場合には、その転写物の３’末端ドメイン内に保持されるリボザイム配列は自己開裂を生じて適切な３’末端を生じるであろう。本発明の他の態様に従うと、アルファーウイルスＲＮＡ分子の正確な３’末端は、初期形質転換用の直線化させたｃＤＮＡ分子の使用により達成される。従ってそのプロモーターからの合成によりランオフ転写がもたらされて適切な３’末端を有する分子が生じるであろう。本発明の適切な態様に従うと、組換えｃＤＮＡ内では、アルファーウイルス由来のｃＤＮＡ分子領域は５’末端部分に相補的な配列、ＲＮＡ複製に必要な非構造的蛋白質用のコーディング領域（一つもしくは複数）、サブゲノムプロモーター領域、および前記ウイルスＲＮＡの３’末端部分を含む。本発明の他の態様は組換えｃＤＮＡに関し、その組換えｃＤＮＡ内では外因性ｃＤＮＡ配列は外来性ポリペプチドをコードするか、もしくはＲＮＡを生じ、前記配列は一つもしくは複数のヌクレオチドが置換されているアルファーウイルスサブゲノムＲＮＡに相捕的なｃＤＮＡ内に取り込まれる。本発明の更に別の態様は組換えｃＤＮＡに関し、その組換えｃＤＮＡ内では外因性ｃＤＮＡ配列は外来性ポリペプチドをコードするかもしくはＲＮＡを生じ、前記配列はいずれかのヌクレオチドの置換をも伴わないアルファーウイルスサブゲノムＲＮＡ内に取り込まれる。動物（ヒトを含む）起源の広範囲にわたる宿主細胞を本発明に従って用いることができる。そのような宿主細胞は、鳥類、哺乳類、両生類、昆虫、および魚類の細胞から選択することができる。例示的な哺乳類細胞は、ヒト、サル、ハムスター、マウス、およびブタの細胞である。適切な鳥類の細胞はニワトリ細胞である。本ｃＤＮＡ分子を、動物およびヒトにおける感染性疾患、癌、もしくは代謝障害、あるいは他の種類の欠損症の治療に用いることが可能である。それらは更に、感染性疾患もしくは癌を回避する目的での動物もしくはヒトの予防的治療法もしくはワクチン接種に用いることもできる。この分子はそれ自身で薬剤を構成し、その薬剤は生物学的活性ポリペプチドを操作的にコードするかもしくは生物学的活性ポリヌクレオチド（例えば、アンチセンス）を生じ、そしてそれ自体もしくは他の化合物と組み合わせて動物もしくはヒトに、所望される配列の発現のために投与することができる。本発明の一つの態様に従うと、前記分子は裸のプラスミドｃＤＮＡ分子として用いられ、かつ筋肉内、皮膚内、鼻内、表皮、粘膜、静脈内経路、もしくは他の経路により投与することができる。本発明の他の態様に従うと、本分子は脂質もしくは他の化合物と混合されることで輸送を亢進させる（ＴｒｅｎｄｓｉｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌｕｍｅ１１、ページ２１１−２１５、１９９３）。このｃＤＮＡは更に他の担体分子と連結させることが可能であり、その担体分子が細胞内への取り込みのための細胞性レセプターに結合する（ＴｒｅｎｄｓｉｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌｕｍｅ１１、ページ２０２−２０５、１９９３）。このような組み合わせ型の手法はいずれかの投与経路により用いることが可能である。裸のｃＤＮＡを更に粒子衝撃の手段により投与することもできる（ＣｕｒｒｅｎｔＯｐｉｎｉｏｎｉｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌｕｍｅ４、ページ５８３−５９０、１９９３）。更に、本ｃＤＮＡポリヌクレオチドを例えばレトロウイルスのような他のウイルスのゲノムの一部分として投与することができる。初期の内から、異種ウイルスプロモーターから産生された場合にはアルファーウイルスレプリカーゼはアルファーウイルスＲＮＡ分子の複製を効率よく実施することができることが示されている（ＪｏｕｒｎａｌｏｆＶｉｒｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌｕｍｅ６５、ページ６７１４−６７２３、１９９１；ＶｉｒｕｓＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｖｏｌｕｍｅ２３、ページ２０９−２２２、１９９２）。本発明は更に、本ｃＤＮＡもしくはそのｃＤＮＡを含む培養細胞が（単数もしくは複数）動物細胞内に導入されて、前記ｃＤＮＡの発現により産物が産生され、その産物をその動物から回収することができ、かつその産物がその産物が産生される個体動物に有益である効果を全く有することがないという方法にも関する。発現産物が体液（例えば、血液、乳、もしくは腹水）内に分泌され、かつ前記液体の収集により回収されることが適切である。本方法のある態様に従うと、この発現産物は治療的もしくは予防的活性を有し、かつ例えば乳のような体液中で回収される。この方法の他の態様では、免疫原性もしくは抗原性の蛋白質コードする外因性ｃＤＮＡ、あるいはポリペプチドを含むｃＤＮＡの発現が達成され、かつ抗体応答が誘導され、抗体は体液（例えば、全血液もしくは血清）内でその動物から回収される。この方法の更に別の態様に従うとそのｃＤＮＡは、そのｃＤＮＡの発現により産生される抗原決定基、抗原、もしくは免疫原をコードする外因性ｃＤＮＡを含み、かつ体液（例えば、全血液、血清、もしくは腹水）内でその動物から回収される。図面の説明図１：ＤＮＡ／ＲＮＡレイヤー系。本発明のある態様に従うＤＮＡベクターが説明され、この場合ＳＦＶレプリカーゼ蛋白質をコードするＳＦＶｃＤＮＡ（レプリカーゼ遺伝子）はＣＭＶプロモーター（ｐＣＭＶ）下でクローン化される。外因性遺伝子（外因性配列）がそのレプリカーゼ領域の後に、ＳＦＶのサブゲノムプロモーターの下で挿入される。ＳＦＶＲＮＡの複製に必要とされる５’ および３’配列が黒四角により示される。このＳＦＶ由来の配列はポリ−Ａ配列（Ａ）により停止する。自己開裂性リボザイム配列（Ｒ）がそのポリ−Ａ配列の直ぐ後ろに位置している。転写（ｐＣＭＶからの）の停止およびその転写物のポリアデニル化に必要とされる配列がその構築物の最後に位置している（転写停止配列）。最初の現象は全長構築物のｐＣＭＶからの転写である。この転写によりそのレプリカーゼ遺伝子に関して陽の極性であるＲＮＡ分子の産生が生じる（すなわち、そのＲＮＡはそのレプリカーゼ蛋白質の翻訳のためのｍＲＮＡとして機能することができる）（１）。転写直後にそのリボザイム自体がその鎖から開裂する（２）。得られるＲＮＡ分子がその細胞の細胞質に輸送される（３）。細胞質ではそのＲＮＡの第一部分が翻訳されてＳＦＶレプリカーゼを産生する（ＲＥＰ）。このレプリカーゼはその後にその全ＲＮＡをマイナス鎖中間体へとコピーするであろう（４）。その後にこのマイナス鎖中間体は、ＳＦＶレプリカーゼによる新規の全長プラス鎖ＲＮＡ分子の鋳型として作用するであろうし（５）、そのプラス鎖分子はその後に新規の周期のマイナス鎖合成のために用いられることができ、そうして所望の産物の総体的産生が増幅する（７）。このマイナス−鎖中間体は更に、他の種のＲＮＡの産生、ＳＦＶサブゲノムプロモーターの地点で生じる合成の開始（右向きの矢印）のための鋳型としても作用する（６）。この外因性ＲＮＡは所望される外因性蛋白質をコードするか、あるいは別法ではそれ自体が所望される最終産物（例えば、リボザイムもしくは抗−センス分子）を構築することがあるかのいずれかである（８）。図２：異種プロモーターの転写制御下のアルファーウイルスｃＤＮＡポリヌクレオチド。Ａ、異種プロモーター（例えばｐＣＭＶ、ｐＲＳＶ、ＳＰ６）：Ｂ、前記ＲＮＡの複製に必要とされる配列を含むアルファーウイルスゲノムＲＮＡの５’末端；Ｃ、レプリカーゼ蛋白質ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、ｎｓＰ３、およびｎｓＰ４をコードするアルファーウイルス非構造性領域のゲノム領域；Ｄ、アルファーウイルスのサブゲノムプロモーター（２６Ｓ）；Ｅ、異種蛋白質を機能的にコードする（アルファーウイルスのサブゲノムレプリコンの状況において）異種ｃＤＮＡ配列、あるいはＲＮＡ；Ｆ、組換えＲＮＡの複製に必要とされる３’末端配列；Ｇ、ポリ−Ａ配列（随意であることがある）；Ｈ、例えばＳＶ４０に由来するもののような真核生物転写停止シグナル。図３：異種プロモーターの転写制御下にありかつ自己開裂性リボザイム配列を含むアルファーウイルスｃＤＮＡポリヌクレオチド。Ａ、異種プロモーター（例えば、ｐＣＭＶ、ｐＲＳＶ、ＳＰ６）；Ｂ、前記ＲＮＡの複製に必要とされる配列を含むアルファーウイルスゲノムＲＮＡの５’末端；Ｃ、レプリカーゼ蛋白質ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、ｎｓＰ３、およびｎｓＰ４をコードするアルファーウイルス非構造性領域のゲノム領域；Ｄ、アルファーウイルスのサブゲノムプロモーター（２６Ｓ）；Ｅ、異種蛋白質を機能的にコードする（アルファーウイルスのサブゲノムレプリコンの状況において）異種ｃＤＮＡ配列、あるいはＲＮＡ；Ｆ、組換えＲＮＡの複製に必要とされる３’末端配列；Ｇ、ポリ−Ａ配列（随意であることがある）；Ｈ、例えばＳＶ４０に由来するもののような真核生物転写停止シグナル。このリボザイム配列は、ポリ−Ａ領域と転写ストップシグナルとの間に、その配列が自己開裂を生じた際にはゲノムアルファーウイルス配列の真の３’末端を生じるであろう様式で挿入されているように示されている。図４：肝炎デルターリボザイムのインビトロ自己開裂活性。プラスミドｐＳＡ１をＲＮＡのインビトロ転写用の鋳型として用いた。このＲＮＡ産物をポリアクリルアミドゲル電気泳動およびオートラジオグラフィーにより分析した。図５：ＳＦＶＲＮＡという状況下での肝炎デルターリボザイムの自己開裂活性。（Ａ）位置５２８４に挿入されたリボザイム配列を保持するプラスミドｐＳＦＶ−Ｈ１−Ｄｅｌｔａ。（Ｂ）ｐＳＦＶ−Ｈ１−Ｄｅｌｔａに相補的なＲＮＡのインビトロ開裂産物のゲル分析。初期転写物の非開裂形態および５’開裂形態はかなり大きく（各々５５０２および５２８４）、そのためそれらはゲルでは分離せず、かつゲル内を遊走することがないことを銘記されたい。実施例１肝炎デルターリボザイムのインビトロ自己開裂活性ｐＳＡ１（Ｎａｔｕｒｅ、ｖｏｌ３５０、ページ４３４−４３６、１９９１）はＢａｍＨＩで直線化してから転写させた。インビトロ転写は先に記載される要領で（ＪｏｕｒｎａｌｏｆＶｉｒｏｌｏｇｙ、ｖｏｌ６５、ページ４１０７−４１１３、ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ、Ｕｎｉｔ．１６．２０、１９９４、Ｇｒｅｅｎ＆ＷｉｌｅｙＩｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）、合成されたＲＮＡをラベルするための³⁵ Ｓ−ｒＣＴＰの存在下で実施した。転写６０分後に、その試料の１／４を−８０℃に凍結させた。残りを３つの部分に分割し、その内の最初のものを５６℃で３０分間、２５ｍＭＥＤＴＡの存在下でインキュベートした。第二のものをＥＤＴＡ無しで３７℃下で３０分間インキュベートし、そして第三のものをＥＤＴＡ無しで５６℃で３０分間インキュベートした。インキュベーション後に全試料を、尿素を含むＴｒｉｓ−ホウ酸緩衝液を保持する８％ポリアクリルアミド配列決定用ゲル（ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎ＆ＷｉｌｅｙＩｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ社）上で分析した。この結果をオートラジオグラフィーにより可視化させた。図４に示されるように、６０分間の転写の後には、合成された全長ＲＮＡ（１００ヌクレオチド）の内の約５０％が既に開裂を受けて短めの産物になっていた（８５ヌクレオチド）（レーン１）。温度の上昇により自己開裂活性が亢進することが知られている一方で、ＥＤＴＡは同活性を阻害し、それはその反応がマグネシウムイオンに依存するためである（Ｎａｔｕｒｅ、ｖｏｌ３５０、ページ４３４−４３６、１９９１）。レーン２は、マグネシウムがＥＤＴＡによる反応からのキレートを受ける場合には５６℃であったとしても追加的開裂は全く生じないことを示す。それとは対照的に、ＲＮＡを３７℃（レーン３）もしくは５６℃（レーン４）下、キレート剤の非存在下で更にインキュベートすると、自己開裂性活性が存在すること、および全長ＲＮＡは進行的に８５ヌクレオチド産物にまで短縮したことが示された。実施例２ＳＦＶＲＮＡという状況下での肝炎デルターリボザイムのインビトロ自己開裂活性リボザイム配列がＳＦＶＲＮＡ分子という状況下で機能することができるかどうかを検査するために、ｐＳＡ１からの肝炎デルターリボザイム配列に相当するＤＮＡ断片を合成し、そしてＨｅｌｐｅｒ１（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｖｏｌ９、ページ１３５６−１３６１、１９９１）のＨｉｎｄＩＩＩ制限エンドヌクレアーゼ開裂部位５２８４内にクローン化させてプラスミドｐＳＦＶ −Ｈ１−Ｄｅｌｔａを作製した（図５Ａ）。このクローニングは標準技術（ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎ＆ＷｉｌｅｙＩｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ社）を用いて実施した。その後にこのプラスミドをＳｐｅＩで直線化させ、そしてインビトロ転写を実施例１に記載される要領で実施した。この試料の内の半分を対照用に凍結させた一方で、もう一方の半分を５６℃下で追加的に６０分間インキュベートした。その後にこれらの試料を実施例１に記載される要領でゲル電気泳動およびオートラジオグラフィーにより分析した。結果が図５Ｂに示される。レーン１は転写中の自己開裂中に生じた小開裂産物（１６７ヌクレオチド）を表す。転写物を５６℃で追加的に６０分間インキュベートした際には（レーン２）、１６７ヌクレオチド種の顕著な増加が観察され、このことにより自己開裂が効率よく進行していることが示される。実施例３ＳＦＶＲＮＡという状況下での肝炎デルターリボザイムのインビボ自己開裂活性プラスミドｐＳＦＶ３−ｌａｃＺ（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｖｏｌ９、ページ１３５６−１３６１、１９９１）、ｐＳＦＶ−Ｈｅｌｐｅｒ１（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｖｏｌ９、ページ１３５６−１３６１、１９９１）、およびｐＳＦＶ−Ｈ１−ＤｅｌｔａをＳｐｅＩで直線化させ、そしてＲＮＡを先に記載される要領でＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼを用いてインビトロで合成した。転写直後にＥＤＴＡを２５ｍＭになるまで添加し、そしてそのＲＮＡを氷上に置いた。２０μｌのｌａｃＺＲＮＡを、２０μｌのＨｅｌｐｅｒ１ＲＮＡ、あるいは２０μｌもしくは４０μｌのＨ１−ＤｅｌｔａＲＮＡと混合した（自己開裂は転写中に最高５０％で生じるため、Ｈ１−ＤｅｌｔａＲＮＡの量の倍加がこのプロセシングに起因する全長ＲＮＡの喪失を補うように設計した）。その後にこの混合ＲＮＡを用いて先に記載される要領で（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｖｏｌ９、ページ１３５６−１３６１、１９９１）ハムスター幼仔の腎臓細胞（ＢＨＫ）をトランスフェクトさせ、ＳＦＶ粒子内へのｌａｃＺＲＮＡのインビボパッキングを介してウイルス保存物を調製した（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｖｏｌ９、ページ１３５６−１３６１、１９９１）。その後にこれらの培養物の２４時間上清を用いて単層のＢＨＫ細胞を感染させ、そして１６時間後にその細胞をＸｇａｌで染色してベーターガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ蛋白質）の発現を可視化させた。様々な量の培地を用いることでインビボパッケージング反応から取得されるウイルス保存物の力価を決定することが可能であった。Ｈｅｌｐｅｒ１ＲＮＡのみが感染性保存物の産生を援助し、ｍｌ当たり５×１０⁷の力価の感染性粒子を生じた（１０⁷の形質転換細胞からは全体で５×１０⁸の粒子）。それとは対照的にＨ１−ＤｅｌｔａＲＮＡに関与する実験はいずれも全く検出可能なウイルスを産生しなかった。このことにより、Ｈ１−ＤｅｌｔａＲＮＡ内に存在するリボザイム配列の自己開裂によりＲＮＡ複製に必要とされる３’配列が効率よく除去され、その結果ヘルパー構築物によるトランス−相補性作用は生じなくなることが示される。実施例４図３に従うＤＮＡ／ＲＮＡレイヤーベクターからのＬａｃＺの発現図３に概要が示されるようにＣＭＶプロモーターを用いて構築され、かつ異種配列（Ｅ）として大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）のベーター−ガラクトシダーゼ蛋白質をコードする遺伝子を有するプラスミドを、リポフェクション（Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎ）（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓＩｎｃ．社、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ、ＵＳＡ）を用いて１０⁶のＢＨＫ− ２１細胞内にトランスフェクトさせた。トランスフェクションは供給社からの推奨事項に従って実施した。対照ベクター用には同一のＬａｃＺ遺伝子をＢａｍＨＩ断片としてｐＢＫ −ＣＭＶプラスミド（ＳｔｒａｔａｇｅｎｅＩｎｃ．社、ＬａＪｏｌｌａ、ＣＡ、ＵＳＡ）の多重クローニング部位内にクローン化させた。このプラスミドはベーター−ガラクトシダーゼ遺伝子をＣＭＶプロモーターから直接発現する。３７℃での１６時間のインキュベーションの後、培地を除去し、そしてその細胞をＰＢＳで洗浄し、そして１００％メタノールで５分間−２０℃で固定化し、その後にＰＢＳでの新規の洗浄を実施した。細胞をＸｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドイル−ベーター−Ｄ−ガラクトピラノシド）で先に記載される要領で（ＥＭＢＯＪｏｕｒｎａｌ、ｖｏｌ５、ページ３１３３−３１４２、１９８６）で染色した。染色後、対照実験では約０．０３の頻度での細胞内ＬａｃＺ発現（Ｘｇａｌ陽性）が示された。ＤＮＡ／ＲＮＡレイヤー構築物を用いる実験ではトランスフェクションの頻度は０．００５であった。従ってこの特別な実験でのトランスフェクション効率はＤＮＡ／ＲＮＡレイヤーベクターについてよりもむしろ低めであったものの、ベーター−ガラクトシダーゼの発現はＸｇａｌ染色から判定すると高くなった。そのためこの実験によりこの技術の原理および一般的な実行可能性の証拠が示される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ０７Ｈ 21/04 8615−4ＣＣ０７Ｈ 21/04 ＢＣ１２Ｎ 5/10 9282−4ＢＣ１２Ｎ 7/00 7/00 9284−4ＣＡ６１Ｋ 39/00 Ａ // Ａ６１Ｋ 39/00 9282−4ＢＣ１２Ｎ 5/00 Ｂ (Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｒ 1:92） (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．アルファーウイルスＲＮＡゲノムの少なくとも一部分に相補的なｃＤＮＡ分子であって、そして前記アルファーウイルスＲＮＡの複製に必須な全アルファーウイルスＲＮＡゲノム領域の相補物を含み、更に動物もしくはヒトの宿主細胞内でその機能を発現することが可能な外因性ｃＤＮＡ配列を含み、前記外因性ｃＤＮＡ配列がそのｃＤＮＡ分子の内のそれ自体の複製にとって非必須である領域内に挿入され、かつ前記ｃＤＮＡ分子が前記動物もしくはヒト細胞内で機能するプロモーター配列の転写制御下に置かれているｃＤＮＡ分子。２．前記プロモーター配列がサイトメガロウイルス前初期プロモーター（ｐＣＭＶ）もしくはラウス（Ｒｏｕｓ）肉腫ウイルス末端反復配列プロモーター（ｐＲＳＶ）を含む、請求の範囲１のｃＤＮＡ分子。３．前記プロモーター配列がＳＰ６、Ｔ３、もしくはＴ７プロモーターを含み、前記ｃＤＮＡ分子が動物もしくはヒトの宿主細胞の形質転換のために意図され、前記宿主細胞がＳＰ６、Ｔ３、もしくはＴ７ＲＮＡポリメラーゼ分子をコードする遺伝子での予備形質転換を受け、それらの遺伝子が染色体内に挿入されるかもしくはエピソームに残存するかのいずれかである、請求の範囲１のｃＤＮＡ分子。４．アルファーウイルスＲＮＡ配列に相補的なｃＤＮＡがセミリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）ＲＮＡから取得される、請求の範囲１、２、もしくは３のｃＤＮＡ。５．外因性ｃＤＮＡ配列が抗原決定基を含む蛋白質もしくはポリペプチドをコードし、前記蛋白質もしくはポリペプチドが免疫原性もしくは抗原性である、請求の範囲１〜４の内のいずれかのｃＤＮＡ。６．外因性ｃＤＮＡが治療活性を有する蛋白質もしくはポリペプチドをコードする、請求の範囲１〜４の内のいずれかのｃＤＮＡ。７．外因性ｃＤＮＡが抗−センス分子として機能するＲＮＡ分子を生じる、請求の範囲１〜４の内のいずれかのｃＤＮＡ。８．外因性ｃＤＮＡが更にリボザイム分子として機能するＲＮＡ分子を生じるｃＤＮＡをも含む、請求の範囲１〜７の内のいずれかのｃＤＮＡ。９．外因性ｃＤＮＡ挿入断片がアルファーウイルスに相当する３’末端をフランクする自己開裂性リボザイム配列もしくはＳＦＶゲノム配列を保持する、請求の範囲１〜７の内のいずれかのｃＤＮＡ。１０．リボザイムが肝炎デルターウイルスから取得される、請求の範囲８のｃＤＮＡ。１１．アルファーウイルス由来のｃＤＮＡ分子領域が５’末端部分に相補的な配列、ＲＮＡ複製に必要とされる非構造性蛋白質のためのコーディング領域（複数）、サブゲノムプロモーター領域、および前記ウイルスＲＮＡの３’末端部分を含む、請求の範囲１〜１０の内のいずれかのｃＤＮＡ。１２．外因性ｃＤＮＡ配列が外来性ポリペプチドをコードするか、もしくはＲＮＡを生じ、前記配列が一つもしくは複数のヌクレオチドが置換されているアルファーウイルスサブゲノムＲＮＡに相補的なｃＤＮＡ内に組み込まれている、請求の範囲１〜１１の内のいずれかのｃＤＮＡ。１３．外因性ｃＤＮＡ配列が外来性ポリペプチドをコードするかもしくはＲＮＡを生じ、前記配列がいずれのヌクレオチドの置換も伴わないアルファーサブゲノムＲＮＡ内に組み込まれる、請求の範囲１〜１１の内のいずれかのｃＤＮＡ。１４．動物もしくはヒトの培養細胞内、あるいは動物もしくはヒトの個体内でいずれかの前述の請求の範囲のｃＤＮＡの発現を達成するため、およびそのｃＤＮＡがその培養細胞もしくは前記個体の細胞の内側に取り込まれ、かつ前記細胞内でその機能を発現させる様式でその培養細胞をそのｃＤＮＡと接触させることもしくはそのｃＤＮＡを前記個体に組込ませることを含む方法。１５．ｃＤＮＡが、例えば注入、電気穿孔法、もしくは粒子衝撃のようなトランスフェクションによるか、あるいは形質転換により、アジュバンド、あるいは例えば脂質、非イオン性ポリマー、マイクロ被包、もしくは担体分子により生じるレセプター媒介性輸送の手段の助けを借りて裸のポリペプチドとして細胞内に組込まれる、請求の範囲１４の方法。１６．ｃＤＮＡをウイルス担体と結合させ、そして感染により細胞内に組込ませる、請求の範囲１４の方法。１７．ｃＤＮＡが、例えばトランスフェクションのようなインビトロ形質転換もしくは感染により動物もしくはヒトの培養細胞の内側に組込まれ、そして更にその形質転換化細胞を動物もしくはヒトの個体内に投与して前記ｃＤＮＡの発現を達成することを含む、請求の範囲１４〜１６の内のいずれかの方法。１８．形質転換化細胞が、例えば感染性疾患もしくは癌のような疾患の予防療法剤として投与される、請求の範囲１７の方法。１９．形質転換化細胞が、例えば感染性疾患、癌、もしくは代謝障害のような疾患の治療療法剤として投与される、請求の範囲１７の方法。２０．ｃＤＮＡもしくはそのｃＤＮＡを含む培養細胞（一つもしくは複数）が動物内に組込まれて前記ｃＤＮＡの発現による産物が産生され、そしてその産物が動物から回収され、かつその産物が産生される個体動物にとって有益な効果は全く有さない、請求の範囲１４〜１７の内のいずれかの方法。２１．発現産物が、例えば血液、乳、もしくは腹水のような体液内に分泌され、かつ前記液体の収集により回収される、請求の範囲２０の方法。２２．発現産物が治療的もしくは予防的活性を有し、かつ例えば乳のような体液内で回収される、請求の範囲２０もしくは２１の方法。２３．免疫原性もしくは抗原性蛋白質もしくはポリペプチドをコードする外因性ｃＤＮＡを含むｃＤＮＡの発現が達成され、かつ抗体応答を誘導し、抗体が、例えば全血液、血清、もしくは腹水のような体液内でその動物から回収される、請求の範囲２０の方法。２４．ｃＤＮＡが、そのｃＤＮＡの発現により産生され、かつ例えば全血液もしくは血清のような体液内で動物から回収される抗原決定基、抗原、もしくは免疫原をコードする外因性ｃＤＮＡを含む、請求の範囲２０の方法。２５．生理学的に投与可能な形態をとる、請求の範囲１〜１３の内のいずれかのｃＤＮＡを含む薬剤学的調製物。２６．外因性ｃＤＮＡが調製物中の免疫原もしくは抗原として作用する抗原決定基を含むポリペプチドもしくは蛋白質をコードする配列を含み、そして例えば癌もしくは感染性疾患のような疾患の予防的もしくは治的療法用のワクチンを構成する、請求の範囲２５の調製物。２７．外因性ｃＤＮＡが治療活性を有する蛋白質もしくはポリペプチドをコードする配列を含み、前記調製物が例えば代謝障害、感染性疾患、もしくは癌のような疾患の治療用の治療的調製物を構成する、請求の範囲２５の調製物。２８．外因性ｃＤＮＡがアンチセンスＲＮＡに相補的なポリヌクレオチド配列を含み、そして前記アンチセンスＲＮＡが個体の細胞内の相補的ポリヌクレオチドの翻訳を前記個体へのその調製物の投与後に阻害するように作用する、請求の範囲２５の調製物。２９．請求の範囲１〜１３の内のいずれかに記載のｃＤＮＡを含む動物もしくはヒトの細胞。３０．安定に形質転換された細胞である、請求の範囲２９に記載の方法。３１．ｃＤＮＡが前記ｃＤＮＡの発現を達成する目的で請求の範囲１５もしくは１６の方法に従ってその内側に組込まれる、請求の範囲２９の細胞。３２．形質転換化細胞が請求の範囲２０もしくは３０の細胞からできている、請求の範囲１７〜１８もしくは１９の方法。３３．動物もしくはヒトの個体内でのｃＤＮＡの発現を達成する目的での、請求の範囲１４〜１６の内のいずれかの方法における使用のための、請求の範囲２５に記載の薬剤の調製の際の、請求の範囲１〜１３の内のいずれかのｃＤＮＡの使用。３４．請求の範囲１７、１８、もしくは１９の方法における使用のための、請求の範囲２５に記載の薬剤の調製の際の、請求の範囲１〜１３の内のいずれかのｃＤＮＡでインビトロで形質転換させたヒトもしくは動物の培養細胞の使用。３５．形質転換細胞が請求の範囲２９もしくは３０の細胞を含んでなる、請求の範囲３４に記載の使用。３６．細胞培養物中の動物もしくはヒトの細胞、あるいは動物もしくはヒトの個体内での、請求の範囲１〜１３の内のいずれかのｃＤＮＡのインビボでの転写により取得されるＲＮＡ分子。