JPH09511395A - ＨＩＶ の Ｖｐｒ及び Ｖｐｘ蛋白質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、ヒト免疫不全ウィルスのVpr蛋白質の生物学的に活性なペプチドフラグメント、これらのペプチド又はその生物学的に活性なアナログを含む医薬的組成物、前記ペプチドのアンタゴニスト、及びこれらのアンタゴニストを含む医薬的組成物、並びに本発明の化合物及び組成物を利用する治療及びスクリーニング方法に関する。１つの好ましい実施形態において、本発明は、HFRIG及びHSRIGから選択される少くとも１つのアミノ酸配列モチーフを含むヒト免疫不全ウィルス(HIV)のVpr蛋白質の、又は生物学的に活性なフラグメントもしくはそのアナログのアンタゴニストであって、該アンタゴニストが、増殖停止、細胞複製停止、細胞毒性、細胞骨格破壊、及び小胞体に対する効果からなる群から選択されるVprにより媒介される１以上の活性を阻害する能力を有することを特徴とするアンタゴニストを提供する。本発明は、細胞増殖により媒介される、又は真核細胞により引きおこされる病状の治療において、共通配列を含むVpr蛋白質又は生物学的に活性なフラグメントもしくはそのアナログの使用にも関する。

Description

【発明の詳細な説明】 HIVのVpr及びVpx蛋白質 本発明は、ヒト免疫不全ウィルスのVpr蛋白質の生物学的に活性なペプチドフ ラグメント、これらのペプチド又はその生物学的に活性なアナログを含む医薬的 組成物、前記ペプチドのアンタゴニスト、及びこれらのアンタゴニストを含む医 薬的組成物、並びに本発明の化合物及び組成物を利用する治療及びスクリーニン グ方法に関する。 発明の背景 AIDSの原因となる因子であるHIV−１は、単なるレトロウィルスには見い出さ れていない遺伝子tat，rev，vif，vpr，vpu 、及びnef を有する他の霊長類動物 レンチウィルス様の複合レトロウィルスである。tat 及びrev の機能はかなりよ く理解されているが、ウィルスの試験管内感染性に本質的でないので補助的遺伝 子としてしばしば言及される残りのものは、病因における役割についてほとんど 理解されていない。 HIV−１ウィルス蛋白質Ｒ(Vpr)(Wong−Staal et al ，1987)は、ビリオン会合 性蛋白質である（Cohen et al ，1990ａ；Yuan et al ，1990）。HIV-１Vprは弱 い転写活性化因子であり（Ogawa et al ，1990；Cohen et al ，1990ｂ）、HIV- １Gag蛋白質に結合する(Lu et al ，1993；Paxton et al ，1993；Lavallee e t al ，1994)ことが報告されている。Vprは、確立された細胞系におけるウィル ス複製に本質的でない(Dedera et al ，1989；Cohen et al ，1990ｂ）が、それ が初期のマクロファージにおけるウィル ス複製に重大な機能を有する可能性があることを示唆する証拠がある（Balotta et al ，1993；Matsuda et al ，1993）。そのビリオことの会合のため、Vprが おそらくウィルスの侵入又は未コート化において、HIV−１感染において早期の 役割を有することが示唆されている（Cohen et al ，1990ａ；Yuan et al ，19 90；Yu et al ，1990）。 Vprは、HIV−１の最も高度に保存された蛋白質の１つであり、全ての霊長類動 物レンチウィルスによいてVpr及び／又はVpxとして存在する（Tristem et al ， 1990；図４Ａを参照のこと）。Vpxは同様にビリオン会合性である（Cohen et al ，1990ａ；Yuan et al ，1990；Yu et al ，1988，1990，1993）。HIV-２Vpr は、ヒトマクロファージの生産的感染に本質的である（Hattori et al ，1990） がHIV−１Vprのように、確立された細胞系における複製において重要でない（Pe dera et al，1989）。同様にHIV-２Vpxは確立された細胞系に重要でない（Yu e t al ，1988；Guyader et al ，1989；Hu et al ，1989）が、新しいマクロフ ァージにおける感染に必要とされ（Guyader et al ，1989；Yu et al ，1991） 、末梢血液リンパ球におけるウィルス感染性を増大させる（Kappes et al ，19 91）。全ての中でおそらく最も説得力があるのは、完全なvpr 読み枠の保持のた めの生体内推進力があること及びVprにおける変異がアカゲザルにおける低ウィ ルス負荷を導くことが観察されている（Lang et al，1993）。 我々はイーストにおいてVpr遺伝子をクローニングし、単相のイースト細胞に 対するVpr蛋白質の効果と蛋白質Vif，Vpu及びNefの効果とを比較した。我々はVp r蛋白質が細胞増殖に絶大な効果を有するのに対して、テストされた他の蛋白質 は効果を有さないという驚くべき発見をした。Vpr蛋白質は増殖阻止を引きおこ し、これは 細胞骨格への効果により媒介されるようである。我々は、この活性に重大なVpr 蛋白質の部分を同定した。この重大な部分は、保存されたアミノ酸配列モチーフ 、即ちH(S／F)RIGを含み、この部分を含むペプチドは、哺乳動物又はイースト細 胞に細胞外的に添加された時に活性を有する。Vpr蛋白質はHIV感染における早期 の及びおそらく重大な役割を有するようであるのでこれは有用な治療標的を表す 。 我々は、Vpr蛋白質、及び特にそのＣ末端配列が真核細胞に対して一般的な抗 増殖効果を有し、それゆえ細胞増殖により媒介される状態の治療において有用で あることも見い出した。 発明の概略 １つの態様によれば、本発明は、HIV感染の治療方法であって、HFRIG及びHSRI Gから選択される少くとも１つのモチーフを含むVpr蛋白質のアンタゴニストの、 又は生物学的に活性なフラグメントもしくはそのアナログの効果的な量を前記治 療の必要な患者に投与するステップを含み、それによりHIV感染を防ぐこと、症 状的AIDSへのHIV感染の進行を防ぐこと、又はAIDSの症状を緩和することを特徴 とする方法を提供する。 好ましくは、前記Vpr蛋白質は、HSRIG，HFRIG，HSRIS，HFRAG，HIRAG，HLRAG ，RSRKG，RSRIS及びRSRIGからなる群から選択される少くとも１つの配列を含む 。 第２の態様において、本発明は、増殖阻止、細胞複製阻止、細胞毒性、細胞骨 格破壊、及び小胞体への効果からなる群から選択されるVprにより媒介される１ 以上の活性を阻害する能力を有する、Vpr蛋白質の、又は先に定義される生物学 的に活性なフラグメントもしくはそのアナログのアンタゴニストを提供する。こ のようなアン タゴニストは、HIV感染の治療のための治療剤として有用であろうと考えられる 。 本発明は、医薬として許容される担体と共に活性構成物として先に定義される Vprのアンタゴニストを含む医薬的組成物も含む。 Vpr又は生物学的に活性なフラグメントもしくはそのアナログに対する特異的 な抗体、好ましくはモノクローナル抗体、並びにVprの、又は前記生物学的に活 性なフラグメントもしくはそのアナログの発現を防ぐアンチセンスRNAもしくは 三本鎖DNAが、Vprの活性の阻害の方法を供し、結果として本発明の範囲内である ことを当業者は認識するであろう。与えられたペプチド配列に対するモノクロー ナル抗体の製造方法、並びに標的細胞におけるアンチセンスRNAもしくは三本鎖D NA製造を誘導するための方法は、当該技術において公知である。例えば、Vpr蛋 白質のＣ末端部分をコードする領域が抑制性アンチセンス配列により、又は抑制 性ペプチドをコードする配列により置換されているvpr 遺伝子を、HIV感染又はA IDSの遺伝子治療のために用いることができるであろう。 第３の態様において、本発明は、Vpr蛋白質の、又は先に定義される生物学的 に活性なフラグメントもしくはそのアナログのアンタゴニストとして有用である と推測される化合物をスクリーニングする方法であって、本明細書に記載される ような、増殖阻止、細胞複製阻止、細胞毒性、細胞骨格破壊、及び小胞体への効 果からなる群から選択される生物学的活性のアッセイにおいて、Vprの活性を阻 害することにおけるテスト化合物の効果性を測定するステップを含むことを特徴 とする方法を提供する。 我々の結果は、Vpr蛋白質又は生物学的に活性なフラグメントもしくはそのア ナログが、細胞内又は細胞外のレベルのいずれにおいても攻撃され得る活性を有 することを示し、それゆえ両方のタイプ の生物学的活性は本発明の範囲内である。 第４の態様によば、本発明は、HIV感染を防ぐための、又はHIV感染の効果を緩 和するためのワクチンであって、医薬として許容される担体と共に、Vpr配列の 少くともＣ末端21アミノ酸をコードするHIVゲノムの部分が削除されているヒト 免疫不全ウィルス−１又はヒト免疫不全ウィルス−２を含むことを特徴とするワ クチンを提供する。好ましくは、Vpr配列の少くともＣ末端33アミノ酸をコード する前記ゲノムの部分が削除される。更に好ましくは、Vpr配列のＣ末端領域を コードするゲノム部分とNef遺伝子のＮ末端をコードするHIVゲノムの部分との両 方が削除される。Nef遺伝子の関連した部分は、1994年３月18日に出願された我 々の同時係属特許出願第PCT／AU94／00254号(WO94／26776)に記載される。 第５の態様によれば、本発明は、細胞増殖により媒介される病気の治療方法で あって、Vpr蛋白質の、又は本明細書に記載される共通配列の少くとも１つを含 む生物学的に活性なフラグメントもしくはそのアナログの効果的な量を、前記治 療の必要な哺乳動物に投与し、それにより前記病気と媒介する細胞の増殖を阻害 することを含むことを特徴とする方法を提供する。 細胞増殖により媒介される病気は、これらに限定されないが、癌、白血病及び 乾癬を含む。 増殖している細胞は、高度にカルシウム依存性である。我々は、Vprペプチド の抗増殖効果がＣ²⁺−チャンネル輸送のインヒビターにより妨げられることを見 い出した。それゆえ本発明のこの態様において、Vpr蛋白質又はフラグメントも しくはそのアナログは、Ｃ²⁺−チャンネル輸送のエンハンサーと組み合わせて任 意に用いられ得る。 第６の態様によれば、本発明は、病原体により引きおこされる病 気を治療する方法であって、Vpr蛋白質の、又は本明細書に記載される共通配列 の少くとも１つの配列を含む生物学的に活性なフラグメントもしくはそのアナロ グの効果的な量を、前記治療の必要な哺乳動物に投与するステップを含むことを 特徴とする方法を提供する。バクテリア、寄生虫、イースト、又は真菌により引 きおこされる病気は全て本発明のこの態様の範囲内である。 第７の態様によれば、本発明は、細胞膜に、又は細胞の内部に医薬的に活性な 物質を輸送するための薬剤であって、該薬剤が、Vprペプチド、又はHFRIG及びHS RIGから選択される少くとも１つのアミノ酸配列モチーフを含む生物学的に活性 なフラグメントもしくはそのアナログを含み、前記ペプチド、フラグメント又は アナログが前記医薬的に活性な物質に結合されていることを特徴とする薬剤を提 供する。 本発明は、細胞膜又は細胞の内部に医薬的に活性な物質を輸送する方法であっ て、前記細胞を先に定義される薬剤に接触させるステップを含むことを特徴とす る方法も提供する。 前記活性物質は、ペプチドに結合することができるいずれの化学的実在物でも あり得、特にペプチド又はヌクレオチドであり得る。カップリングはいずれの慣 用の手段によってもおこされ得、例えばカルボジイミドのような薬剤を用いる化 学的カップリングによりおこされ得る。活性物質がペプチドである場合、Vprペ プチド及び医薬的に活性なペプチドが、融合蛋白質として組換え手段により共に 合成され得る。当業者は、この方法において輸送され得る適した種々の医薬活性 剤、及び方法を知り、それによりVpr蛋白質に結合され得るであろう。当業者は 、結合が効果的であるか否か、及び薬剤が要求される医薬的活性を維持するか否 かも知っているであろう。 本発明の好ましい実施形態において、Vpr蛋白質は少くともVpr 配列のＣ末端21アミノ酸、更に好ましくは少くともVpr配列のＣ末端配列33アミ ノ酸を含むフラグメントである。グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ(GST) のような相体又は融合蛋白質に結合したVpr蛋白質又はその生物学的に活性なフ ラグメントが本発明の範囲内であることが明らかに理解されよう。組換え、合成 及び天然由来のVpr蛋白質並びにフラグメント及びそのアナログが本発明の範囲 内であることが更に理解されよう。 本明細書内の記載は特にHIV-１のVpr蛋白質に関するが、上述のように、HIV- ２もVpr蛋白質を有するので、本発明は、HIV−２由来のVpr蛋白質及びH(S／F)RI Gモチーフの同等物、並びに他のレトロウィルスのVpr蛋白質に同様に適用できる 。 本明細書を通して、アミノ酸のための略号の一文字コードを用いる。Ｓ／Ｆは Ｓ又はＦのいずれもが存在し得ることを示す。 発明の詳細な記載 本発明は、以下の非限定の実施例及び図面のみの参照により詳細に記載される であろう： 図１は、イーストにおけるvpr 遺伝子のクローニングに用いられるスキームを 示す； 図２は、イーストにおけるHIV−１補助蛋白質の発現の増殖への効果を示す。 図３は、Vprを発現するイースト細胞における形態変化を示す。 銅誘導イースト細胞を光学顕微鏡により検査した。DY150(pYEULCBX)対照形質 転換細胞を上部パネル（ａ）に示し、典型的に大きいDY150(pYEULCBX．Vpr)形質 転換細胞を下部パネル（ｂ）に示す。バーは10μｍを表す。 図４は、フローサイトメトリーによる誘導された細胞の分析の結 果を示す； 図５は、Vprにおける毒性領域の同定を示す； 一連のVpr構成物を示す。構成物により製造されたVprの領域をうす暗いブロッ クで示し、暗いブロックはGSTを表す；GSTはスケールを示していない蛋白質配列 に関するBamHI(Ｂ)、EcoRI（Ｅ）及びSalＩ（Ｓ）部位を示す。ボールドで示さ れるH(S／F)RIGは、Sal Ｉ部位の両方の部位上の配列によりコードされる。これ らの蛋白質を製造する形質転換されたイースト細胞の増殖を、右のコラムに記載 する。 図６はHIV−１VprとHIV−２，SIV及びイースト由来の蛋白質との関係を示す。 Ａ．HIV−１Vprと関連するVprとのアラインメント Vpr及びVpx蛋白質をその全体についてのアラインメントさせる。配列は、HIV- １Vpr NL４−３(Adachi et al ，1992)，HIV−２ROD（Clavel et al ，1992） 及びSIVmac 239（Regier and Desrosiers，1990）から得られる。３以上の同一 アミノ酸の領域を影で示す。 Ｂ．Sac１ｐ及びHIV−１Vprのアラインメント Vprの完全なアミノ酸配列をSac１ｐのアミノ酸77〜176とアラインメントした （Cleves et al ，1990）。同一残基を影で示し、H(S／F)RIGにおける残基を下 線で示す。 図７は、Vprを発現するイーストの浸透感応性(osmosensitivity)を示す。 図８は、変異ウィルスの作製のために用いられるストラテジーを示す。 図９は、逆転写酵素アッセイにより測定されるヒトPBMCにおける変異ウィルス の複製速度を示す。Ａ．刺激された細胞；Ｂ．未刺激の細胞。 図10は、イーストコロニー形成への合成Vprペプチドの効果を示す。Ａ．ペプ チドなし；Ｂ．ペプチド１；Ｃ．ペプチド２；Ｄ．ペプチド３。 図11は、合成Vprペプチドへのイースト細胞の応答の結果を要約する。処理条 件は実施例11に記載される。 図12は、ペプチド３についての投与応答関係を示す。ペプチド３を濃度範囲に わたりイースト細胞に添加し、細胞をコロニー形成についてアッセイした。 図13は、Vprペプチドの存在中でのコロニー形成に対するイースト細胞濃度の 効果を示す。種々の細胞濃縮物を５μＭペプチド３の存在中でインキュベートし 、細胞をコロニー形成についてアッセイした。 図14は、１時間の合成Vprペプチドでのイースト細胞のインキュベーションの 後のプロピジウムイオジド（PI）取り込みのフローサイトメトリー分析の結果を 示す。サンプルは、ペプチドなし、ペプチド１、ペプチド２及びペプチド３であ る。 図15は、種々の時間でのペプチド３でのイースト細胞のインキュベーションの 後のプロピジウムイオジド取り込みのフローサイトメトリー分析の結果を示す。 図16は、合成Vpr蛋白質でエレクトロポレーションされたRC２ａ細胞における プロピジウムイオジド取り込みのフローサイトメトリー分析の結果を示す。 図17は哺乳動物細胞がエレクトロポレーションされ、前及び横散乱により測定 された細胞構造における変化についてのフローサイトメトリーにより分析された 時に得られた結果を示す。 図18は、TMB−８によるイースト細胞の保護を示す。 図19は、（Ａ）エレクトロポレーション及び（Ｂ）エレクトロポレーションな しの細胞外添加の後にフローサイトメトリーにより測定されたCD⁴⁺ヒト細胞との FITC（フルオレセインイソチオシアネート）標識ペプチドの会合を示す。 図20は、フローサイトメトリーにより測定されたＳ．セレビシアエ(S．cerevi siae) イースト細胞におけるエレクトロポレーションなしでのFITC−標識ペプチ ドの会合を示す。 図21は、ヒトCD⁴⁺細胞（Ａ）及び（Ｂ）イースト細胞におけるインターナリゼ ーションされたFITC−標識ペプチド３を示す。 図22は、Vpr及びSac１ｐとアクチンとの間の遺伝的相互作用を示す。 イースト及びバクテリア 本研究において用いられるイースト株は、サッカロマイセス・セレビシアエ（ Saccharomyces serevisiae）株DY150（MATa ura 3-52．leu 2-3，112 Trp 1-1 ade 2-1 his 3-11 can 1-100)、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans） 臨床的単離体JRW５、カンジダ・グラブラタ（Candida glabrata）株Ｌ５（Leu ）、クルイベロマイセス・ラクティス（Kluyveromyces lactis）株MW−98−８ｃ （α uraＡ arg lys）及びスキゾサッカロマイセス・ポンブ(Schizosaccharomyc es pombe)株SpULA(ade6-704 ura4-D18 leu1-32 )ｈ^-である。株をYEPD（１％イ ースト抽出液、２％ペプトン、２％グルコース）中で増殖させた。大腸菌株TG１ Δ(lac-proAB )sup Ethi hsd Δ５Ｆ′（tra D36 proAB⁺ lacI^q lacZ ΔM15 ） も毒性 研究のために用い、ZxYT培地(1.6％トリプトン、１％イースト抽出液、0.5％ Na Cl)上にプレートした。 哺乳動物細胞 ２つのCD⁴⁺細胞系、RC２ａ及びJurkatを10％熱不活性化胎児ウシ血清(HIFCS) を含むRPMI−1640中に保持した。標準的なFicoll／Hypaque密度勾配法により血 液バンク有志者から得られたHIV−１漿液陰性血液から単核細胞を単離した。末 梢の単核白血球細胞（PBMC）をフィトヘマグルチニン(PHA：10μｇ／10⁶細胞)で 37℃で48時間刺激し、洗浄して、10％ HIFCSを有するRPMI−1640培地、10％組換 えヒトインターロイキン−２（Boehringer Mannheim）、５mM Hepes，０.１％重 炭酸ナトリウム、25μｇ／mlグルタミン、100IU／mlペニシリン、100μｇ／mlス トレプトマイシン、２μｇ／mlポリブレン(Sigma)及び１：1000抗インターフェ ロン(Miles)を含む、IL−２培地中に懸濁した。実施例１ HIV遺伝子の分子クローニング HIV−１ゲノムクローンpNL４−３をポリメラーゼ鎖反応(PCR)による増幅のた めのHIV−１遺伝子のソースとして用いた。pNL４−３（Adachi et al，1986）を National Institutes of Health CNIH）AIDS Research and Reference Reagent Program，National Institutes of Allergy and Infections Diseases，NIH（Ad achi et al ，1986）から得た。vpr のクローニングのために用いられるスキー ムを図１に示す。一方vif のクローニングにはPCR及び類似の周知の手順を用い た。PCR及び示されるプライマーを用いてHIV−１ゲノムクローンpNL４−３(Adac hi et al ，1986)からvpr を増幅した。PCR産物をBam HI＋Sma Ｉで切断し、イ ースト−大腸菌シャトルベクターpYEULCBX（Macreadie et al ，1992）内にクロ ーニ ングし、Bam HI＋Eco RI(T4 polished)で消化してpYEULCBX．Vprを製造した。こ のように他のHIV−１遺伝子、nef ，vpu 及びvif もpYEULCBX内にクローニング し、pYEULCBX．Nef27(Macreadie et al ，1993)，pYEULCBX．Vpu（Macreadie et al ，1992）及びpYEULCBX．Vifを作製した。これらのプラスミドを各々にNef ，Vpu及びVifの銅誘導可能な産物を支配するよう設計した。vif プライマーは5 ′GCTCCGGATCCATGGAAAACAGATGGCAGG及び5′CGCCCGGGAGCTCTAAAAGCTCTAGTGTCCで ある。vif PCR産物をBam HI−Sma Ｉフラグメントとしてクローニングした。プ ライマーにおけるBam HI及びSma Ｉクローニング部位（上述）は下線であり、斜 体の配列はvif開始及び停止コドンを表す、全ての増幅されたDNAを誤りのないこ とを確かめるために並べた。イースト発現ベクターpYEULCBX内へのnef ，vpr ，vpu 及びvif のクローニングを各々Nef，Vpu及びVifの銅誘導可能産物を支配す るように設計した。実施例２ 内在的に発現されたvpr蛋白質はイーストにおける増殖停止を引きお こす。 本研究において、我々はイースト内のvpr を、その機能を認識するために発現 させた。同時に、簡単な細胞の機能へのHIV−１調節蛋白質の効果の全般の検査 の一部として、我々は、ハプロイドイースト中にVif，Vpu及びNefも製造し、細 胞増殖へのそれらの効果を捜した。これは、vpr 及び他のHIV−１補助蛋白質の 遺伝子を発現ベクター、pYEULCBX内へクローニングし、pYEULCBX．Vpr(図１参照 )、pYEULCBX．Nef27(Macreadie et al ，1993)、pYEULCBX．Vpu(Macreadie et a l ，1992）、及びpYEULCBX．Vif(本研究)を作製することにより達成される。 University of Utah Medical Centerのデビッドスティルマン博士(Dr David S tillman)から得られた株DY150(MATa ura ３−52．leu ２−３，112 Tri １−１ ade ２−１ his ３−11 can １−100; Macrea die et al，1993)を上述のイーストベクター＋グルタチオンＳ−トランスフェラ ーゼ(GST)の銅誘導可能産物のためのベクターで形質転換し、Vpr．DY150に融合 されたGSTをYEPD培地（１％イースト抽出液、２％ペプトン、２％グルコース） 上で増殖させた。イースト細胞をBecker and Guarente(1991)のエレクトロポレ ーション手順により形質転換し、形質転換体を、必要な場合３％Phytagar^TM(Gib co)を有する、20μｇ／mlヒスチジン、アデニン及びトリプトファンを含み、固 体化された最小選択培地上で増殖させた。示された量までCuSO₄を添加すること によって発現を誘導し、増殖をアッセイした。形質転換体を滅菌状で懸濁し、28 ℃での増殖のためにプレート上にドロップした。この結果を図21に示す。これは 、0.25mM CuSO₄，20μｇ／mlヒスチジン、アデニン及びトリプトファンを含み 、３％ Phytagar^TM(Gibco)で固体化されたSDプレート（0.67％イースト窒素ベ ース(Difco)、２％グルコース）を示す、形質転換体により産生された蛋白質を 示す。 図２に示すように、細胞増殖に対する顕著な効果はVpr蛋白質により、一方、 テストされた他のHIV−１蛋白質は植物細胞増殖への効果を有さない。低レベル （0.25mM）のCuSO₄は、Vprを発現する細胞における全体の増殖停止を引きおこし 、一方、逆の効果は、１mM CuSO₄程度の高さの誘導レベルでさえ、他の蛋白質 により引きおこされなかった。CuSO₄を添加しないで、CUP1プロモーターからの 基底の発現は誘導されたレベルの５％である（Macreadie et al ，1994）場合、 Vpr形質転換体は対照形質転換体より遅い増殖比率で増殖するので、Vprの効果は 銅の毒性とは無関係であった。 Vpr毒性は、誘導された細胞が、インデューサーの存在中24時間の後でさえ、 銅が添加されていない培地上にプレートされた時コロ ニーを形成するので、増殖停止のため殺さないことが見い出された。アッセイか ら増殖したDY150〔pYEULCBX．Vpr〕形質転換コロニーは、DY150〔pYEULCBX〕形 質転換コロニーよりかなり小さかった。これらの“小さな”コロニーは、銅を添 加しない後の培養における親YD150〔pYEULCBX．Vpr〕形質転換体様に増殖した。 これは、Vpr合成の誘導の後の細胞周期停止を示し、次に最後に回収して通常の 細胞周期にもどることを示す。実施例３ 停止した細胞は非常に大きくされる 光学顕微鏡による細胞の検査は、Vprを産生する誘導された細胞が著しく変化 した形態を有することを示した。図３に示すようにＶpr産生性細胞は、同じ条件 下で増殖した参照DY150〔pYEULCBX〕形質転換体の２倍の直径である16μｍの直 径を有していた。この大きな細胞内の細胞内スペースのほとんどは構造がなく、 単一の大きなオルガネラ、おそらく空胞により占有されているようであった。こ れは、DY150〔pYEULCBX．Vpr〕形質転換体が細胞分裂の前の成長において停止さ れていることを示唆する。実施例４ フローサイトメトリー分析 析し、分類した。照度は、488nmアルゴンイオンレーザーで（細胞サイズに関係 して）前方角光散乱であり、側方散乱を記録した。細胞を前方角光散乱を基礎と して分類した。生きた細胞は、プロピジウムイオジドによりゲートされ、２μｇ ／mlプロピジウムイオジドでの染色の後600nmより大きい蛍光発光の欠如により 示される。 変化した細胞の割合を測定するために、誘導されたイースト細胞をフローサイ トメトリー前方角光散乱（細胞サイズの割合）により分析した。この結果を図４ に示す。これは、細胞集団においてVpr形質転換体がそれらのより大きいサイズ を示すより大きい範囲の前 方光散乱を示すことを確かにした。50,000細胞超を含む集団は、示されるように DY150〔pYEULCBX〕及びDY150〔pYEULCBX．Vpr〕についてである。実施例５ 増殖停止を引きおこす配列の位置はH(S／F)RIG繰り返しモチーフを含 む 増殖停止を引きおこす原因である配列を、細胞増殖への効果についてVpr蛋白 質の種々の部分をテストすることにより同定した。グルタチオンＳ−トランスフ ェラーゼ(GST)に融合されたVprも、増殖停止を引きおこす（図２；構成物GST−V pr、図５）ので、我々は、イーストGST−融合ベクター、pYEULCGT（Ward et al ，1994）における一連のGST融合蛋白質も製造した。 EcoRIフラグメント（構成物 VprBE及びGST−VprBE.図５）によりコードされる Vprの最後の33アミノ酸の欠失が増殖停止を和らげ、一方Vprのこの部分のGSTへ の付加（構成物 GST-VprEE、図５）は増殖停止を引きおこし、これは、このドメ インが増殖停止の原因であることを示す。Vprのちょうど最後の21アミノ酸のGST への付加（構成物 GST−VprSE、図５）により、部分的増殖停止も見られた。 各々の場合において、増殖停止は、フローサイトメトリー分析及び光学顕微鏡 により判別されるような細胞の大きさに相互関係があった。重要なのは、このＣ 末端配列は、Ｔ挿入のため73アミノ酸の端を切り取ったvpr 遺伝子産物をコード するHIV−１単離物を多くの試験所において欠失している領域である（Yuan et al ，1990；Ogawa et al ，1990；Lavallee et al ，1990）。これらの単離物 におけるVprは、ビリオンと会合せず（Ogawa et al ，1990）、これはおそらく 端を切り取ったためであろう。我々の発現は、同じＣ末端領域の重要性を確かに するが、もう１つの理由も確かにする。 このイーストにおける増殖停止はAIDSの病因と関連している可能性がある。 細胞増殖停止を引きおこすHIV-１Vprの領域を周知のVpr関係物と比較した。最 も近い関係物はSIVVpr、次にHIV−２Vpr、その次にVpx蛋白質であった（図６Ａ ）。この配列は33％アルギニンを含み、これはVpx蛋白質の相当する部分におい て見い出されるものより著しく高いアルギニン含量である。Vpr種において繰り 返しモチーフ、H(S／F)RIGの保存があることは注目に値する。このモチーフは（Eco RI−SalＩフラグメントにおいてコードされる）アミノ酸72〜75において、 及び（Sal Ｉ−EcoRIフラグメントにおいてコードされる）アミノ酸78〜82にお いて存在する。２つの複製をコードするフラグメントにより引きおこされるより 大きな毒性は、複製数効果又はおそらく構造的効果を示し得る。 プログラムALIGNを用いるVprとの細胞関係物についての研究において、我々は 、イースト蛋白質、Sac１p（Cleves et al ，1983）が、Genbankデータベース（ release 82.0）においてリストされる細胞の蛋白質の最も重大な配列類似性を有 する。Sac１p及びVprのアラインメント（図６Ｂ）において、Sac１pが、Vpx中に 全体的によく保存されているモチーフの１部である末端Gsを含むH(S／F)RIGモチ ーフにおいて60％の同一性を有することが見い出され得る。実施例６ ペプチド合成 製造したペプチドは以下の通りである： α−アミノ基が塩基−不安定Fmoc（９−フルオレニルメチロキシカルボニル） 基により保護されるFast Mac固相技術を用いて、Applied Biosystems 430A Pept ide Synthesizer上でペプチドを合成した。最も短い配列を樹脂上に合成し、そ の後ペプチド／樹脂のおおよそ３分の１を反応容器から除去した。その後、第２ のペプチドを集めるまで残りのものにおいて合成を続けた。この段階において、 ペプチド／樹脂の半分を反応容器から除去した。その後残ったペプチド／樹脂上 に第３のペプチドを集めた。 Ｏ−tert−ブチル基によりtert−ブチル基及びグルタミン酸によりアルギニン 側鎖を保護した。アミノ酸の２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１ ，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート活性化及び 溶媒としてＮ−メチルピロリドンを用いることによりカップリングを行った。こ のペプチドをトリフルオロ酢酸（＋スカベンジャーとしてフェノール、エタンジ チオール、チオアニソール及び水）で樹脂から切断した。このペプチドをエレク トロポレーションの前にエレクトロポレーション緩衝液(0.213ｇ／ｌ．Na₂HPO₄ ，0.068ｇ／ｌ KH₂PO₄，93.1ｇ／ｌスクロース)(Wojchowski and Sytkonski，19 86)に対して透析した。 ペプチド４〜６について、保護を以下の通り行った：基に−不安定９−フルオ レニルメチロキシカルボニル（Fmoc）基によるα−アミノ基；２，２，５，７， ８−ペンタメチルクロマン−６−スルホ ニル(Pnc)によるアルギニン側鎖；tert−ブチル基によるセリン及びトレオニン ；トリチルによるアスパラギン、グルタミン、ヒスチジン及びシステイン；並び に０−tert−ブチル基によるグルタミン酸。アミノ酸の２−（１Ｈ−ベンゾトリ アゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルロニウムヘキサフルオロ ホスフェート（HBTU）活性化及び溶媒としてＮ−メチルピロリドン(NMP)を用い てカップリングを行った。このペプチドをTFAで、スカベンジャーとしてフェノ ール、エタンジチオール、チオアニソール及び水を足して、樹脂から切断した。実施例７ 合成ペプチドにおけるH(S／F)RIGモチーフは浸透感受性を引きおこす 我々は、合成ペプチド： を用いてH(S／F)RIGモチーフの機能を更に研究した。このペプチドは、実施例６ において作製され、Vprの各々最後から２番目の14，21及び26アミノ酸を含む。H (S／F)RIGモチーフ（下線）は、これらのペプチド内に各々0.1及び２の複製にお いて存在する。これらのペプチドをイースト細胞内にエレクトロポレーションし て、その後浸透感受性について分析した。２mg／mlのエレクトロポレーション緩 衝液中に溶解されたペプチドを、Baekon 2000(Saratoga，CA)を用いてイースト 細胞内にエレクトロポレーションした。Baekon 2000における処理のための条件 は：２¹¹パルス、８kv，0.8秒バースト時間、100μ秒パルス時間、10サイクル、 溶液と上部電極との間のギャップ１mmである。このキュベットは、５μｌのDulb ecco 's Phosphate-Buffered Saline及び５μｌのペプチド溶液を足した新鮮なYEPD増 殖培地中に30μｌのイースト懸濁液を含んでいる生存している細胞の不均一の浸 透を達成するため60〜80％を殺すことが必要であることが見い出された。 YEPD培地並びに1.2Ｍ KCl，1.8Ｍソルビトールもしくは0.9Ｍ NaClを含むYEP D培地にプレートし、Chowdhuvy et al(1992)により開示されるようにコロニー形 成単位の数を計数することにより、細胞を浸透感受性について検査した。２つの 培地上のコロニー形成単位の相対数を比較することにより浸透感受性を計算した 。浸透感受性細胞を含む全ての生きている細胞はYEPD上で増殖するが、浸透感受 性であるものは高浸透力培地上で増殖しなかった。図７に示す結果は、H(S／F)R IGモチーフを欠如するペプチドが本質的に乱されないことを示す。しかしながら 、H(S／F)RIGモチーフを含むペプチドは浸透の感受性の原因となり、50％までの 細胞が高浸透力培地上で殺された。この効果は、存在するH(S／F)RIGモチーフの 複製の数に比例し、これは、この配列の直接的役割を示す。実施例８ 病原性はH(S／F)RIGモチーフを含む配列に関連する H(S／F)RIGモチーフを含むVpr蛋白質の領域は、ヒト及びサル免疫不全ウィル スの病原性に相互に関連し得る。ヒト及びサル免疫不全ウィルス由来のVpr及びV pxの配列の簡単な編集を表１に示す。高病原性ウィルスであるHIV−１における ２つの繰り返しH(S／F)RIGモチーフを含むアミノ酸のほとんど全ての保存性あが る。 ７つのサル免疫不全ウィルスVpr配列は、H(S／F)RIGモチーフを含む配列の高 度な保存性（２つの変化）を示す。しかしながら、アスタリスクにより示される ２つの配列は、配列の保存性ががほとんどない（８又は９の変化）。マンドリル ウィルス及びSykes’monkeyウィルスの両方は、ほとんど配列保存性がなく、無 症候性感染 の原因となることが報告されている（Hirsch et al ，1993；Tsujimoto et al ，1989）。 HIV−２単離物において、標準配列から２〜５の変換がある。HIV−２はHIV− １より病原性が小さく、これらの変換は病原性の減少の理由となり得ると我々は 確信する。更に、Vpxの存在は病原性を削減し得る。Matsuda et al （1993）は 、HIV−１においてVpxをVprのかわりにおきかえた時、そのウィルス状その感染 性を喪失することを示した。これにより、Vpxを産生するいずれのウィルスも、V prのみを産生するものより小さい病原性であることが予想される得ることを我々 は予測する。 アスタリスクにより表されるものを除くVpr配列についての全体の共通は： である。 要約すると、配列HFRIGCRHSRIGにおいて、下線の残基がVprにおいて不変であ る。ＦはＩ又はＬであり得る；ＩはＬ，Ｇ，Ｓ又はＭであり得る；最後のＧはＳ であり得る。モチーフ間のＣが不変であることも注意すべきである。実施例９ 変異プロウィルスの複製速度 ウィルス培養物の製造及び滴定 変異体の半クローン及び野生型HIVDNAをLipofectamine(GIBCO−BRL)法により Ｔ25フラスコ内でHeLa細胞（５×10⁶細胞）に共に移入した。移入後12時間にPBM L（20×10⁶細胞）を加えて無細胞ウィルス産生量を規則的な間隔で測定した。上 清を無細胞ウィルスの最大産生量において取り出し、保存ウィルスとして用いた 。24ウェル Linbroプレートにおいてウィルス保存液の滴定を行い、逆転写酵素（RT）活性及 び生存能細胞変性効果の両方により終点希釈率を評価した。標準的な方法に従っ てマイクロタイタープレート内のRTアッセイを行った。 変異プロウィルスの作製 HIVNL 4.3分子クローン（Adachi et al ，1986）を、nef 及びvpr 遺伝子の開 始コドンの点変異のためにpKP５のベクター内に２つの半分のフラグメントとし て再クローニングした。表２に概説される変異誘発スキームを用いて、図８に記 載される手順に従って、変異プロウィルスを作製した。 用いたHIV-１分子クローンはpNL４−３である。大腸菌における全長のクロー ンの不安定性のため、低複製ベクター、pKP59において半クローンを作製し、大 腸菌内に安定に維持させた。５′配列をStu Ｉ−Eco RIフラグメントとして導入 し、一方、３′配列をEco RI−Avr IIフラグメントとして導入した。これらの半 クローンをほぼ消化させることができ（５′クローンについてXba Ｉ＋Eco RIフ ラグメント及び３′クローンについてEco RI＋Hae II）、この切断DNAを、生体 内において組換えが野生型ウィルスを元に戻す哺乳 動物細胞内に導入した。変異ウィルスを得るために、pNL４−３の適切なセグメ ントをファージミド（phagemid）内にクローニングし、一本鎖DNAを作製し、そ して特異的vpr 及びnef 変異を導入するよう設計された表３に示すオリゴヌクレ オチドの存在中で第２の鎖を合成した。 精製及び配列変換の検定の後、DNAをpKP59−半クローンにサブクローニングし 、野生型配列を変異配列におきかえた。変異クローンはNefを発現しないかVprを 発現しないか、又はいずれの蛋白質も発現しない。 PMMCの感染 末梢血液単核細胞を0.01の感染の多重度(MOI)で感染させ、無細胞上清を、標 準的技術により、逆転写酵素（RT）産生について毎日アッセイした。 刺激を受けたPBMCにおいて、Nef又はVprの産生について欠損のある変異プロウ ィルスは、両方の場合において親ウィルス株におけるよりかなり少い無細胞ウィ ルス粒子の類似量を産生した。ウィルス複製に対するVprの効果は、表４に示す ようにH(S／F)RIGモチ ーフにより媒介されるようである。 Nef及びVprの両方の産生において欠損のある変異プロウィルスウィルス製造に おいて激しく抑制され、遅れた複製速度を示した（図９ａ）。生体内細胞集団に 極めて似た未刺激のヒト初期細胞において、Nef及びVprの両方は無細胞ウィルス 産生のために欠くことのできないものである（図９ｂ）。Vpr^-変異体はより少量 のウィルスを産生し、Nef^-変異体は遅れた複製速度を示し、一方Nef^- Vpr^-２重 変異体は共同的に作用するようである。実施例10 合成ペプチド内のH(S／F)RIGモチーフはイーストにおける増幅停止の 原因となる ペプチドをPBSに対して透析し、最終容量200μｌの水における10⁶細胞／mlの 密度に懸濁されたイースト細胞に、最終濃度２μＭで添加した。１時間のインキ ュベーションの後５×10⁴細胞を固体化YEPD上に広げ、このプレートを28℃で48 時間のインキュベーションの後コロニー増殖について検査した。ペプチド溶液の 定量アミノ酸分析によりペプチド濃度を決定した。 ペプチド２又はペプチド３の添加により細胞はコロニー形成能力 を完全に失い、一方ペプチド１の添加は効果を有さなかった（図10）。これを実 施例５と比較することで、我々は、浸透感受性により評価されるような生物活性 とH(S／F)RIGモチーフの細胞内の存在との相関関係を見い出した。 それゆえ、我々はH(S/F)RIGモチーフのみを含み、図11に示すようにいくつか の浸透感受性の原因にもなるペプチド４のようなペプチドを更に研究した。ペプ チド４はコロニー形成能力の完全な損失も引きおこす。ペプチド２様であるがシ ステインを欠損するペプチド５もかなりの効果を引きおこしこれは、システイン は活性に本質的でないが、おそらく構造的効果のため、活性を増加させることを 示す。 投与応答関係を確立するために我々はペプチド３を用いた。特定の範囲の濃度 のペプチド３での細胞の処理は、完全な増殖停止を誘導する最も低いペプチド濃 度は図12に示すように約１μＭであることを示す。0.05μＭまで下がった濃度は 部分的に効果的であるが、この濃度未満においては効果がない。実施例11 細胞塊による増殖停止効果の妨害 細胞濃度により引きおこされる効果もある。高細胞濃度において、ペプチドの 効能は限定される。図13は、５μＭのペプチド３での特定の範囲の細胞濃度にお けるイーストの処理の後のコロニー形成を示す。10⁵細胞／mlまでの細胞濃度に おいて、完全な効果が見られた；しかしながら、10⁶細胞／mlの濃度においては 、効果が観察されなかった。これは、細胞当りペプチドの約10⁶分子がコロニー 形成の阻害に必要とされることを示す。我々は、この効果が培地の存在により排 除され得ることも観察されている；例えば、この効果は、通常の強度の１／10程 度の低さの濃度においてでさえ、YEPDの存在中で大きく削減される。実施例12 他の微生物に対する合成ペプチドの効果 我々は、いくつかの付加的な微生物の増殖に対するこれらのペプチドの効果を 研究した。この結果を表５に示す。 大腸菌及び３つの出芽イースト；カンジダ・アルビカンス（Candida albicans ） 、カンジダ・グラブラタ（Candida glabrata）及びクルイベロマイセス（Kluy veromyces） において、並びに分裂イースト、スキゾサッカロマイセス・ポンブ( Schizosaccharomyces pombe)において、結果はＳ．セレビシアエ(S．cerevisiae ) で見られるのと同様であった。培養プレート表面上のローンのRC２ａ細胞によ る形成をペプチドが阻害する効果が哺乳動物細胞上においても見られた。 我々は、処理された細胞を２％グルコース／50mN HEPS中に懸濁した他は、イ ーストと同様にペプチド１，２及び３で大腸菌を処理した。表５中のデータは、 H(S／F)RIGモチーフを含むペプチドが大腸菌の生存能力に影響を及ぼすことを示 す。しかしながら、大腸菌をPBS中に懸濁してこれらのペプチドで処理した時に 、コロニー形成能力の損失が観察されないことを我々は見い出した。それゆえ、 この活性は用いた培地によると思われる。実施例13 イースト細胞浸透性に対するペプチドの効果 我々はFungolight Live/Dead Stain（Molecular Probes）で細胞を検査し細胞 がペプチド処理の後数時間行き続けている、即ち代謝的に活性があることを見い 出した；しかしながら、それらはコロニー形成能力を失っていた。これにより、 ペプチドの効果は、不可逆的増殖停止を作ることのようである。 我々は、フローサイトメトリーの後にプロピジウムイオジドでの染色、生体染 色によりペプチド処理された細胞を更に検査した。図14に示される結果は、１時 間後にペプチド２及び３により引きおこされる著しい効果があることを確かにす る。ペプチド１での処理又は処理なしにおいて、細胞の95％がほとんど又は全く プロピジウムイオジドを取り込まない。ペプチド２及び３において、細胞の半分 未満がプロピジウムイオジドを取り込む。プロピジウムイオジド取り込みは、イ ーストに対する細胞の死又は膜損傷を通常示す。この分析は、この時において重 大な細胞溶解が起こらないことを示す。 図15に示されるペプチド３の効果の速度分析は、この効果が直ちに表れ、ペプ チドを添加して数分以内に細胞がプロピジウムイオジドを取り込むことを示す。実施例14 VPRペプチドはCD⁴⁺細胞を殺す 我々は、２つのCD⁴⁺細胞系、RC２ａ及びジャーカットを、各々前単球及びＴリ ンパ球細胞を表現するために用いた。 ペプチドのエレクトロポレーション 55μｌ Baekon緩衝液(1.5mM Na₂HPO₄，0.5mM KH₂PO₄，0.27ＭスクロースpH7 .0)及び10μｌのPBS(リン酸で緩衝された塩類溶液)中に懸濁された１百万のCD⁴⁺ 細胞に10μｇのペプチドを添加した。Baekon 2000 Advanced Macromolecule Tra nsfer System(San Francisco，CA)におけるエレクトロポレーション条件は、２^{1 1} パルス８kV，0.8秒バースト時間、62.5μ秒パルス時間、３サイクル、溶液と上 部電極との間の85mmギャップである。ペプチド−エレクトロポレーションされた 細胞を１ml RPMI−1640 10％HIFCS中に懸濁し、37℃で増湿された５％CO₂イン キュベーターにおいてインキュベーションした。 再エレクトロポレーション及び細胞の前処理 ペプチド−エレクトポレーションされた細胞をペプチドを用いて又はペプチド なしで各々の細胞の再エレクトロポレーションのために24時間、収集し、24時間 後にフローサイトメトリーによりこの細胞をアッセイした。エレクトロポレーシ ョンの前30分に１百万の細胞を0.5nM TMB−８塩酸塩((８−（ジエチルアミノ） −オクチル−３，４，５−トリメトキシベンゾエート）、HCl)又は0.5μＭプロ スタグランジンのいずれかで前処理した。エレクトロポレーションの後、細胞を 各々の試薬の同じ濃度において保持した。 フローサイトメトリーのための細胞の調製 １百万の細胞を収集してPBS中で1600rpmで５分間、１回洗浄し、このペレット をフローサイトメトリーのための調製において２μｇプロピジウムイオジドを含 む200μｌPBS中に再懸濁した。エレクトロポレーションの後48時間に、細胞をパ ラメーターの数24について、Coulter Epics Elite Flowサイトメーターを用いて 分析した。488nmアルコンイオンレーザーの前方及び側方散乱を測定した。600nm 超の蛍光発光の欠如により、プロピジウムイオジド排除を測定した。 図16は、擬似エレクトロポレーションされた細胞と比較してペプチド３がRC２ ａ細胞を重大な程度まで殺すことを示す。ペプチド２は、ペプチド３より少い数 の細胞を殺し、この結果は、両細胞系において比較できる。しかしながら、H(S ／F)RIGモチーフを欠くペプチド１は、これらの細胞系に影響を及ぼさない。ペ プチド２及び３の効果はプロスタグランジンＥ２での前処理により増強されたの で、二重のエレクトロポレーションの必要性を除去する。ペプチドの効果はCa²⁺ −チャンネル遮断体TMB−８ HClでの前処理により改良される。H(S／F)RIGモチ ーフは、図17に示すような前方及び側方散乱により測定されるような細胞構造に も影響を与える。ペプチド３は、擬似エレクトロポレーションされた及び他のペ プチドがエレクトロポレーションされた細胞と比較して側方及び前方散乱の両方 の右シフトを作る。これは、ペプチド３が細胞サイズ及び細胞粒状度の両方にお ける増加を誘導することを示す。実施例15 TMB８及び高イオン強度によりイースト細胞増殖停止の阻止 ペプチドの添加前30分におけるTMB−８の添加は、図18に示すようにペプチド ３の効果を排除する。 種々の濃度のTMB−８をイースト細胞で30分間予備インキュベートした後、細 胞を５μＭペプチド３の存在又は欠損下でインキュベートした。その後、細胞を コロニー形成についてアッセイした。低濃度のTMB−８は約13％の細胞を保護し た。 TMB−８は高濃度においていくらかの毒性をもたらすが、低濃度においては毒 性は観察されなかった。これら低レベルのTMB−８において、Vpr蛋白質は、イー スト細胞のコロニー形成能力を阻害するのに全体的に効果的でなかった。 ナトリウム、カルシウム、カリウム又はリチウムイオンは、ペプチド３の添加 前30分、又は添加後直ちに添加された時、Vprペプチドの効果を全体的に排除し た。浸透支持ソルビトールも部分的な保護を供し、全体の保護は0.1×YEPDでの インキュベーションにより供された。これらの結果を表６に概説する。塩の存在 下でのこの明らかな保護は、イースト細胞がH(S／F)RIGモチーフを含むペプチド に結合してインターナリゼーションできないためである。しかしながら、哺乳動 物細胞の場合、これらのペプチドの取り込みが標準的な血清含有培地において観 察された。 実施例15 Vprを産生するバクテリア細胞の生存能力 細胞をインデューサーIPTGで処理し、アリコートを適当な時間後に２×YT＋ア ンビシリンプレート上にプレートし、プレートの一晩のインキュベーションの後 にコロニーの数を計数した。このデータは、(vpr のBam HI−Eco RIフラグメン トによりコードされる)GST及びGST−Vpr.BEの産生が大腸菌細胞を殺さないが誘 発が増殖を遅くすることを示す。全長のVpr蛋白質に融合されたGSTの産生は、３ 時間の誘発後の同様の効果を導く；しかしながら、インデューサー中に30時間お いた後、ml当りのアンピシリン耐性細胞の数の実際の削減がある。これは、一晩 のインキュベーション後に培地が典型的に最適な濃度に達するのにかかわらず、 培養内の細胞のほとんど大部分がAmp^x決定因子を失っている（及びもはやvpr を 発現しない）ことを示す。更に、それは、細胞の死においてVprのＣ末端領 域に影響を与える。未誘導の細胞が数において増加しないことも明らかであり、 これはインデューサーの欠如下における細胞静止効果を示す。しかしながら、細 胞が10⁸細胞／mlまで増殖したことは、毒性効果が消費された培地のような特定 の条件に特異的である可能性があることを示唆する。 実施例16 蛍光標識ペプチドと細胞との相互作用 図19は、（Ａ）エレクトロポレーション、及び（Ｂ）エレクトロポレーション なしの細胞外添加の後にフローサイトメトリーにより測定されたFITC（フルオレ セインインチオシアネート）標識ペプチドとCD⁴⁺ヒト細胞と会合を示す。 図20はフローサイトメトリーにより測定されたＳ．セレビシアエ(S.cerevisia e)イースト細胞におけるエレクトロポレーションなしでのFITC−標識ペプチドの 会合を示す。ペプチド２〜４は、イースト細胞との高程度の会合を示し、一方ペ プチド５のかなり少い会合を示す、H(S／F）RIGモチーフを欠くペプチドは、ペ プチド２及び３より細胞との会合が100倍超少い。光学顕微鏡により、我々は、 図21に示されるようにFITC−標識ペプチド３がイースト及び哺乳動物細胞を効果 的に標的にすることを観察している。ペプチド２及び４も同様である。これらの データは、H(S／F）RIGモチーフが細胞 内を標的とすることのために十分であることを示し、それら又はその配列のサブ セットでもあり得る関係する誘導体が、病気の治療のための細胞内への薬剤の輸 送のための有用な担体であろう。 図21は、ヒトCD⁴⁺細胞内（Ａ）及びイースト細胞内（Ｂ）におけるインターナ リゼーションされたFITC標識ペプチド３を示す。FITC標識ヒト細胞は、なお完全 であるいくらかの細胞及び溶解している他のものを含んでいる。実施例17 Vpr及びSac1pとアクチンとの間の遺伝相互作用 イースト act１及び sac１変異体、各々DBY1195及びDBY1715をpYEULCBX及びpY EULCBX-Vprで形質転換した。その後、形質転換体を、0.5mM硫酸銅を含むプレー ト上に誘導し、Vprの効果についてアッセイした。DY150〔pYEULCBX〕及びDY150 〔pYEULCBX.Vpr〕形質転換体は先に記載されている。Sac1−vpr 相互作用につい てのこれらの結果の例を図22に示す。 Vprがイースト蛋白質Sac1pとの構造的な相同性を示すことを我々は発見した。 イースト細胞のアクチン細胞骨格のアセンブリーにおけるSac1pの正確な機能は まだ研究中である；しかしながら、Sac1変異体は著しい細胞骨格欠如及び低温で の増殖停止を示す(Cleves etal,1989；Novick etal，1989；Whitters etal，199 3)。イーストにおけるVprの産生は、Sac1p及びVprの間の配列及び機能的類似性 のため、Sac1変異体と類似した効果をおそらく引きおこすであろう；Vprの産生 は、通常のSac1p機能と拮抗し得、大きい細胞サイズ及び最終的な増殖停止を含 む細胞骨格欠如を導く。実際に細胞骨格が欠如したイーストの多くの研究におい て、母細胞は異常に大きく、娘細胞は異常に小さい（例えば、Liu及びBretscher ，1992を参照のこと）。我々は、Vprを産生する新しく誘導された細胞の時間経 過分析が同じ現象を示すことを見いだしている。浸透感 受性もVprにより誘導される可能な細胞骨格欠如を示した。Vprを産生する大きな 細胞をフローサイトメトリーにより単離し、高浸透力を含む培地及び通常の培地 上にプレートした。通常の培地上で増殖することができる細胞の50％だけが高浸 透力培地上で増殖することができ、これは、これらの細胞における構造的な欠如 を示す。 Vprは哺乳動物細胞及びイースト細胞において細胞骨格欠如をおこすようであ る。Levyらによる研究は、横紋筋肉腫細胞系において、Vprが細胞複製停止及び 大きな細胞の大きさをひきおこすことを示す(Levy etal，1993)。更に、CD⁴⁺Ｔ −リンパ芽球型（T-lymphoblastold）細胞系において、HIV-１が、感染の最初の 時間、膜破壊、“バルーニング（ballooning）”及び小胞体の空胞化を含む超構 造変化の原因となることが示されている(Fermin and Garry，1992)。これらのデ ータは細胞骨格欠如と一致しており、これらの細胞における細胞骨格の研究が関 心事となろう。 HIV−１生活環におけるVprの役割は何か、及びこれに関連する増殖停止に何が 誘導されるのか。時にHIV−１及び他のレトロウィルスの間の区別に関するジレ ンマがある；レトロウィルスは感染のために細胞増殖を必要とし、一方、HIV− １は最終的に分化したマクロファージのような非増殖の細胞に感染する。Lenis etal （1993）はCD⁴⁺細胞系がＧ２増殖期において停止している時、HIV−１に生 産的に感染され得ることを示した。従って宿主細胞の非増殖は、全て又はいくつ かの細胞型の生産的感染に最初に必要とされ得るであろう。Vprの機能は、組み 込み様の過程がおこり得るように増殖停止を引きおこす可能性がある。これが本 当であるなら、それが初期の出来事が起こり得るようにVpr（及びVpx類似物）が ビリオンと会合していることの原因であろう。Vprに対する抗体は、AIDS患者の1 7％のみにおいて検出されているが、無症候性の個人の47％ において見い出されている(Wong-Stoal etal，1987)。これは、Vprが感染におけ る早期に存在し、それゆえそれがこの時点のみにおいておそらく本質的であるこ とを示唆する。Vprのインヒビターが感染又はウィルスのゆっくりした細胞外へ の広がりを防止するはずであることも示唆される。 本研究において、我々は、配列HFRIGCRHSRIGを含むVprの部分又はRHSRIGを含 む部分でさえも、イースト細胞に添加された時、細胞損傷及び不可逆的な増殖停 止を引きおこす。この効果は、細胞類及びペプチド濃度に関連し、最小で細胞当 りペプチドの10⁶分子がその効果を観察するのに要求される。我々は、同じ配列 が、この配列を含むペプチドから細胞内にエレクトロポレーションされた時に浸 透感受性及び構造的欠如を引きおこすことに関連することも示した。エレクトロ ポレーション培地中のYEPDが細胞外効果を排除するので、エレクトロポレーショ ン後に細胞内効果のみを検査した。 H(S／F)RIGモチーフを含むペプチドは哺乳動物及びイースト細胞の両方におい て増加した浸透性及び細胞溶解を生じる細胞損傷の原因となるようである。我々 は、H(S／F)RIGモチーフを含むVprペプチドが細胞会合されることを観察した；F ITC標識ペプチドを用いた蛍光顕微鏡は、それらが１時間以内にインターナリゼ ーションされることを示す。我々は、H(S／F)RIGモチーフがペプチドの活性的取 り込みの原因となることを確かめている；FITC標識ペプチド１の取り込みは、H( S／F)RIGモチーフを含むペプチドの取り込みより100倍低いようであり、これは 、このモチーフが取り込みを促進することを示している。実施例７において、ペ プチド取り込みは、エレクトロポレーションにより人為的に得られ、研究した結 果は、浸透感受性であった；エレクトロポレーション技術自体は、種々の程度の 細胞死又はコロニー形成能力の損失を誘導した。しかしな がら、コロニーを形成した多数の細胞において、高い程度の浸透感受性があった 。実施例10〜15において観察された効果は、コロニー形成能力の全体の損失にお いて全く異なっている。これらの違いは、細胞内のペプチドの局在化に関連して いる可能性がある。コロニー形成能力の損失よりむしろ浸透感受性が、実施例２ に記載されるようにより生活様の条件におけるイースト中のvpr 遺伝子の発現に おいても観察された。 何のAIDSの現象が我々の結果と関係しているのであろうか。Levy etal（1994 ）による現在の研究は、Vprが血清中に存在していることを示し、これはそれが 感染した細胞から遊離されることを示し、この蛋白質の推定されるアンタゴニス トを設計することにおいて、それは、細胞内効果の他に未感染の宿主細胞をHIV が殺すことの原因となり得るVprの細胞外効果を考えることに関連する。 Vprの生物学的活性フラグメントを用いて、我々は、Vprの部分、おそらく完全 なVpr蛋白質が、Vpr内のH(S／F)RIGモチーフの作用を通してコロニー形成能力に 不可逆的に影響を与えることを示した。この効果の作用の方法は、Ca²⁺イオンチ ャンネルに関連している可能性がある。というのは、Ca²⁺イオンチャンネルブロ ッカーTMB−８が実施例14及び15に示されるようにこの効果を排除するからであ る。 本明細書内に言及される引用を、以下のページにリストし、引用により本明細 書内に組み込む。 本発明が明快さ及び理解の目的でいくらか詳細に記載されているが、本明細書 内に記載される実施形態及び方法への種々の改良及び変換が、本明細書内に記載 される本発明の概念の範囲から離れることなしに行われ得ることは、当業者に明 らかであろう。

【手続補正書】特許法第１８４条の８ 【提出日】１９９６年３月１５日 【補正内容】 明細書 発明の概略 １つの態様によれば、本発明は、HIV感染の治療方法であって、HFRIG及びHSRI Gから選択される少くとも１つのモチーフを含むVpr蛋白質のアンタゴニストの、 又はVpr蛋白質の生物学的に活性なフラグメントもしくはアナログの効果的な量 を前記治療の必要な患者に投与するステップを含み、それによりHIV感染を防ぐ こと、症状的AIDSへのHIV感染の進行を防ぐこと、又はAIDSの症状を緩和するこ とを特徴とする方法を提供する。 好ましくは、前記Vpr蛋白質は、HSRIG，HFRIG，HSRIS，HFRAG，HIRAG，HLRAG ，RSRKG，RSRIS及びRSRIGからなる群から選択される少くとも１つの配列を含む 。 第２の態様において本発明は、増殖阻止、細胞複製阻止、細胞毒性、細胞骨格 破壊、及び小胞体への効果からなる群から選択されるVprにより媒介される１以 上の活性を阻害する能力を有する、先に定義されるVpr蛋白質の、又はVpr蛋白質 の生物学的に活性なフラグメントもしくはアナログのアンタゴニストを提供する 。このようなアンタゴニストは、HIV感染の治療のための治療剤として有用であ ろうと考えられる。 本発明は、医薬として許容される担体と共に活性構成物として先に定義される Vprのアンタゴニストを含む医薬的組成物も含む。 Vpr又はVpr蛋白質の生物学的に活性なフラグメントもしくはアナログに対する 特異的な抗体、好ましくはモノクローナル抗体、並びにVprの、又は前記生物学 的に活性なフラグメントもしくはアナログの発現を防ぐアンチセンスRNAもしく は三本鎖DNAが、Vprの活性の阻害の方法を供し、結果として本発明の範囲内であ ることを当業者は認識するであろう。与えられたペプチド配列に対するモノクロ ーナル抗体の製造方法、並びに標的細胞におけるアンチセンス RNAもしくは三本鎖DNA製造を誘導するための方法は、当該技術において公知であ る。例えば、Vpr蛋白質のＣ末端部分をコードする領域が抑制性アンチセンス配 列により、又は抑制性ペプチドをコードする配列により置換されているvpr 遺伝 子を、HIV感染又はAIDSの遺伝子治療のために用いることができるであろう。 第３の態様において、本発明は、先に定義されるVpr蛋白質の、又は生物学的 に活性なフラグメントもしくはそのアナログのアンタゴニストとして有用である と推測される化合物をスクリーニングする方法であって、本明細書に記載される ような、増殖阻止、細胞複製阻止、細胞毒性、細胞骨格破壊、及び小胞体への効 果からなる群から選択される生物学的活性のアッセイにおいて、Vprの活性を阻 害することにおけるテスト化合物の効果性を測定するステップを含むことを特徴 とする方法を提供する。 我々の結果は、Vpr蛋白質又は生物学的に活性なフラグメントもしくはそのア ナログが、細胞内又は細胞外のレベルのいずれにおいても攻撃され得る活性を有 することを示し、それゆえ両方のタイプの生物学的活性は本発明の範囲内である 。 第４の態様によれば、本発明は、HIV感染を防ぐための、又はHIV感染の効果を 緩和するためのワクチンであって、医薬として許容される担体と共に、Vpr配列 の少くともＣ末端21アミノ酸をコードするHIVゲノムの部分が削除されているヒ ト免疫不全ウィルス−１又はヒト免疫不全ウィルス−２を含むことを特徴とする ワクチンを提供する。好ましくは、Vpr配列の少くともＣ末端33アミノ酸をコー ドする前記ゲノムの部分が削除される。更に好ましくは、Vpr配列のＣ末端領域 をコードするゲノム部分とNef遺伝子のＮ末端をコードするHIVゲノムの部分との 両方が削除される。Nef遺伝子の関連した部分は、1994年３月18日に出願された 我々の同時係属特許出 願第PCT／AU94／00254号(WO94／26776)に記載される。 請求の範囲 １．HFRIG及びHSRIGから選択される少くとも１つのアミノ酸配列モチーフを含 むヒト免疫不全ウィルス(HIV)のVpr蛋白質の、又はVpr蛋白質の生物学的に活性 なフラグメントもしくはアナログのアンタゴニストであって、該アンタゴニスト が、増殖停止、細胞複製停止、細胞毒性、細胞骨格破壊、及び小胞体に対する効 果からなる群から選択されるVprにより媒介される１以上の活性を阻害する能力 を有することを特徴とするアンタゴニスト。 ２．前記Vpr蛋白質が、HSRIS，HFRAG，HIRAG，HLRAG，RSRKG，RSRIS及びRSRIG からなる群から選択される少くとも１つの配列を更に含むことを特徴とする請求 項１に記載のアンタゴニスト。 ３．前記Vpr蛋白質が、Vpr配列の少くともＣ末端21アミノ酸を含むフラグメン トであることを特徴とする請求項１又は２に記載のアンタゴニスト。 ４．前記Vpr蛋白質がVpr配列の少くともＣ末端33アミノ酸を含むフラグメント であることを特徴とする請求項３に記載の方法。 ５．抗体、アンチセンスRNA、及び３本鎖DNAからなる群から選択される請求項 １〜４のいずれか一に記載のアンタゴニスト。 ６．抗体であることを特徴とする請求項５に記載のアンタゴニスト。 ７．モノクローナル抗体であることを特徴とする請求項６に記載のアンタゴニ スト。 ８．アンチセンスRNAであることを特徴とする請求項５に記載のアンタゴニス ト。 ９．三本鎖DNAであることを特徴とする請求項５に記載のアンタゴニスト。 10．医薬として許容される担体と共に、活性構成物として請求項１〜９のいず れか一に記載のアンタゴニストを含むことを特徴とする医薬的組成物。 11．Vpr蛋白質の、又はVpr蛋白質の生物学的に活性なフラグメントもしくはア ナログのアンタゴニストとして役立つと予想される化合物をスクリーニングする 方法であって、増殖停止、細胞複製停止、細胞毒性、細胞骨格破壊、及び小胞体 に対する効果からなる群から選択される生物学的活性のアッセイにおいて、Vpr の活性を阻害することにおけるテスト化合物の有効性を測定するステップを含む ことを特徴とする方法。 12．HIV感染の防止のための、又はHIV感染の効果の緩和のためのワクチンであ って、該ワクチンがNef遺伝子内にヌル変異を有するヒト免疫不全ウィルスを含 まない条件において、Vpr配列の少くともＣ末端21アミノ酸をコードするHIVゲノ ムの部分が削除されているヒト免疫不全ウィルス−１又はヒト免疫不全ウィルス −２を、医薬として許容される担体と共に含むことを特徴とするワクチン。 13．Vpr配列の少くともＣ末端33アミノ酸をコードする前記ゲノムの部分が削 除されていることを特徴とする請求項12に記載のワクチン。 14．Vpr配列のＣ末端領域をコードするゲノムの部分及びNef遺伝子のＮ末端を コードするHIVゲノムの部分の両方が削除されていることを特徴とする請求項12 又は13に記載のワクチン。 15．Vpr蛋白質のＣ末端部分をコードする領域が、抑制性アンチセンス配列に より、又は抑制性ペプチドをコードする配列により置換されていることを特徴と するvpr遺伝子。 16．HIV感染の治療の方法であって、請求項１〜９のいずれか一に記載のVpr蛋 白質の、又はVpr蛋白質の生物学的に活性なフラグ メントもしくはアナログのアンタゴニストの効果的な量を前記治療の必要な患者 に投与し、それによりHIV感染を防ぐか、症候性AIDSへのHIV感染の進行を防ぐか 、又はAIDSの症候を緩和するステップを含むことを特徴とする方法。 17．細胞増殖により媒介される病気の治療の方法であって、HFRIG及びHSRIGか ら選択される少くとも１つのアミノ酸配列モチーフを含むVpr蛋白質の、又は生 物学的に活性なフラグメントもしくはそのアナログの効果的な量を前記治療の必 要な哺乳動物へ投与し、それにより前記病気を媒介する細胞の増殖を阻害するス テップを含むことを特徴とする方法。 18．前記細胞増殖により媒介される病気が癌、白血病、又は乾癬であることを 特徴とする請求項17に記載の方法。 19．前記Vpr蛋白質又はフラグメントもしくはそのアナログがCa²⁺チャンネル 輸送のエンハンサーと組み合わせて用いられることを特徴とする請求項17又は18 に記載の方法。 20．病原体により引きおこされる病気の治療の方法であって、HFRIG及びHSRIG から選択される少くとも１つのアミノ酸配列モチーフを含むVpr蛋白質又は生物 学的に活性なフラグメントもしくはそのアナログの効果的な量を前記治療の必要 な哺乳動物に投与するステップを含むことを特徴とする方法。 21．前記病気がバクテリア、寄生虫、イースト又は真菌により引きおこされる ことを特徴とする請求項20に記載の方法。 22．細胞膜への、又は細胞の内部への医薬的に活性な物質の輸送のための薬剤 であって、該薬剤がHFRIG及びHSRIGから選択される少くとも１つのアミノ酸配列 モチーフを含むVprペプチド又は生物学的に活性なフラグメントもしくはそのア ナログを含み、前記Vprペプチド、フラグメント又はアナログが前記医薬的に活 性な物質に 結合されていることを特徴とする薬剤。 23．細胞膜への、又は細胞の内部への医薬的に活性な物質の輸送の方法であっ て、請求項22に記載の薬剤に前記細胞を接触させるステップを含むことを特徴と する方法。 24．細胞増殖により媒介される病気の治療における、HFRIG及びHSRIGから選択 される少くとも１つのアミノ酸配列モチーフを含むVpr蛋白質の、又は生物学的 に活性なフラグメントもしくはそのアナログの使用。 25．病原体により引きおこされる病気の治療における、HFRIG及びHSRIGから選 択される少くとも１つのアミノ酸配列モチーフを含むVpr蛋白質の、又は生物学 的に活性なフラグメントもしくはそのアナログの使用。 26．HCKKG，CLGEG，CLGEE，CLGGE，CLGRG，HVRKG，HYTKG，HFKRG，HFKKG，HAK RD，CLQEG，CLGGG，CRGEG，CWGED，HFRCG及びRRQPFからなる群から選択される少 くとも１つのアミノ酸配列モチーフを含むヒト免疫不全ウィルス−２（HIV−２ ）のVpx蛋白質の、又はVpx蛋白質の生物学的に活性なフラグメントもしくはアナ ログのアンタゴニストであって、前記アンタゴニストが集団停止、細胞複製停止 、細胞毒性、細胞骨格破壊及び小胞体に対する効果からなる群から選択されるVp xにより媒介される１以上の活性を阻害する能力を有することを特徴とするアン タゴニスト。 【手続補正書】特許法第１８４条の８ 【提出日】１９９６年７月２４日 【補正内容】 明細書 図15は、種々の時間でのペプチド３でのイースト細胞のインキュベーションの 後のプロピジウムイオジド取り込みのフローサイトメトリー分析の結果を示す。 図16は、合成Vpr蛋白質でエレクトロポレーションされたRC２ａ細胞における プロピジウムイオジド取り込みのフローサイトメトリー分析の結果を示す。 図17は哺乳動物細胞がエレクトロポレーションされ、前及び横散乱により測定 された細胞構造における変化についてのフローサイトメトリーにより分析された 時に得られた結果を示す。 図18は、TMB−８によるイースト細胞の保護を示す。 図19は、（Ａ）エレクトロポレーション及び（Ｂ）エレクトロポレーションな しの細胞外添加の後にフローサイトメトリーにより測定されたCD⁴⁺ヒト細胞との FITC（フルオレセインイソチオシアネート）標識ペプチドの会合を示す。 図20は、フローサイトメトリーにより測定されたＳ．セレビシアエ(S．cerevi siae) イースト細胞におけるエレクトロポレーションなしでのFITC−標識ペプチ ドの会合を示す。 図21は、ヒトCD⁴⁺細胞（Ａ）及び（Ｂ）イースト細胞におけるインターナリゼ ーションされたFITC−標識ペプチド３を示す。 図22は、Vpr及びSac１ｐとアクチンとの間の遺伝的相互作用を示す。 図23は、H(S／F)RIG繰り返しモチーフを含むVpr蛋白質及び合成ペプチドが哺 乳動物細胞におけるDNAフラグメンテーション及び細胞周期の原因となることを 示す。 図24は、H(S／F)RIG繰り返しモチーフを含む細胞外Vpr蛋白質 及びペプチドがヒトCD⁴⁺細胞における膜透過性上昇の原因となることを示す。 図25は、ヒトCD⁴⁺細胞内へのVprの細胞外Ｃ末端ペプチドの浸透及び細胞損傷 の誘導を示す。 イースト及びバクテリア 本研究において用いられるイースト株は、サッカロマイセス・セレビシアエ（ Saccharomyces serevisiae）株DY150(MATa ura 3-52．leu 2-3，112 Trp 1-1 a de 2-1 his 3-11 can 1-100)、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans） 臨床的単離体JRW５、カンジダ・グラブラタ（Candida glabrata）株Ｌ５（Leu ）、クルイベロマイセス・ラクティス（Kluyveromyces lactis）株MW−98−８ｃ （α ura A arg lys）及びスキゾサッカロマイセス・ポンブ(Schizosaccharomyc es pombe)株SpULA(ade6-704 ura4-D18 leu1-32 )ｈ^-である。株をYEPD（１％イ ースト抽出液、２％ペプトン、２％グルコース）中で増殖させた。大腸菌株TG１ Δ（lac-proAB ）sup Ethi hsd Δ５Ｆ′（tra D36 proAB⁺ lacI^q lacZ ΔM15 ）も毒性研究のために用い、ZxYT培地(1.6％トリプトン、１％イースト抽出液、 0.5％ NaCl)上にプレートした。 イーストにおけるVprの産生は、Sac１ｐ及びVprの間の配列及び機能的類似性 のため、Sac1変異体と類似した効果をおそらく引きおこすであろう；Vprの産生 は、通常のSac１ｐ機能と拮抗し得、大きい細胞サイズ及び最終的な増殖停止を 含む細胞骨格欠如を導く。実際に、細胞骨格が欠如したイーストの多くの研究に おいて、母細胞は異常に大きく、娘細胞は異常に小さい（例えば、Liu及びBrets cher，1992を参照のこと）。我々は、Vprを産生する新しく誘導された細胞の時 間経過分析が同じ現象を示すとを見いだしている。浸透感受性もVprにより誘導 される可能な細胞骨格欠如を示した。Vprを産生する大木な細胞をフローサイト メトリーにより単離し、高浸透力を含む培地及び通常の培地上にプレートした。 通常の培地上で増殖することができる細胞の50％だけが高浸透力培地上で増殖す ることができ、これは、これらの細胞における構造的な欠如を示す。 Vprは哺乳動物細胞及びイースト細胞において細胞骨格欠如をおこすようであ る。Levy５による研究は、横紋筋肉腫細胞系において、Vprが細胞複製停止及び 大きな細胞の大きさをひきおこすことを示す(Levy et al，1993)。更に、CD^4-Ｔ −リンパ芽球型（Ｔ−lymphoblastoid）細胞系において、HIV-１が、感染の最初 の時間、膜破壊、“バルーニング(ballooning)”及び小胞体の空胞化を含む超構 造変化の原因となることが示されている（Fermin and Garry，1992）。これらの データは細胞骨格欠如と一致しており、これらの細胞における細胞骨格の研究が 関心事となろう。実施例18 H(F／S)繰り返しモチーフを含む細胞外Vpr及びペプチドは、哺乳動物 細胞のDNAフラグメンテーション及び細胞周期停止の原因となる。 ヒトCD⁴⁺前単球（RC２ａ）及びＴリンパ球（Jurkat and CEM）細 胞系を10％胎児ウシ血清を有するRPMI1640内で培養し、増殖期において収集し、 リン酸緩衝塩類溶液(PBS)，pH7.2で１回洗浄し、等張グルコース−HEPES緩衝液( 2.4％グルコース、13mM HEPES，68mM NaCl，1.3mM KCl，４mM Na₂HPO₄及び0.7mM KH₂PO₄，pH7.2)中に再懸濁（10⁷細胞／ml）した。10⁶細胞当り１μｇペプチド 又は５μｇ蛋白質の濃度において、ペプチドを細胞に添加した。グルコース−HE PES緩衝液中でのVpr蛋白質又はペプチド処理の30分後、Vpr蛋白質及びペプチド 処理したCEM細胞を処理後18及び36時間において収集した。収集した細胞を４％ パラホルムアルデヒド中で固定し、0.1％クエン酸ナトリウム、pH7.2中0.1％Tri ton X-100で透過性上昇させた。供給者により本質的に記載されるように、イン シテュー細胞死検出キット（Cell Death Detection Kit）、フルオレセイン(Boe hringer Mannhein)を用いるフラグメンテーションされたDNAを“ニック翻訳する ”のにFITC標識dUTPを用いた。ペプチド１及びペプチド３で処理された細胞は、 次のようにPIでも染色した。100万のパラホルムアルデヒドで固定され、ニック 翻訳された細胞をPBS中で２回洗浄し、４mMクエン酸ナトリウム、pH7.2中に15mg のPEG6000，25μｇのPI，９単位のRNase A，0.1％Triton X-100を含む500μｌの プロピジウムイオジド（PI）染色溶液で処理した。37℃での20分間のインキュベ ーションの後15mgのPEG6000，25μｇのPI及び0.1％Triton X-100を含む160mM Na Cl溶液500μｌを添加した。その後、細胞を暗所で４℃で一晩インキュベートし 、その後、FITC標識及びPI染色についてCoulter EPICS Eliteフローサイトメー ターにおいて10⁶細胞をアッセイした。凝集体及び破片の寄与を除去するように ヒストグラムをゲートした。これらの細胞の特定のdUTP組み込み、PI蛍光並びに 前方及び右方角光散乱を測定した。ペプチド１及びペプチド３で処理された細胞 のDNA含量（PI染色） をMac Cycle（Phoenix Flow System，California）を用いて分析した。DNAフラ グメンテーション及びDNA含量の速度分析を、高い蛍光についてゲートされた細 胞について行った。 ペプチド３−誘導細胞損傷により、VprがDNAフラグメンテーションによるアポ プトシスの原因となる可能性を検査することを我々は思いついた、アポプトシス の一般の診断測定は、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（Gorczy ka et al ，1992）の存在中のDNA中の１本鎖ニックにおけるdUTPの組み込みで ある。この技術を用いて、図23Ａに示すように全長のGST-Vprで、又はペプチド ３及び６で18時間処理された細胞において増加した右角（90％）右方散乱及びdU TPの増加した組み込みがあったが、端を切りとったGST−Vpr又はペプチド１で処 理された細胞（図23Ｂ）においてはないことを我々は見い出した。これは、DNA フラグメンテーションがH(F／S)RIG繰り返しモチーフを含む細胞外蛋白質又はペ プチドで処理された細胞においておこることを証明する。Vprで、及びH(F／S)RI G繰り返しモチーフを含むペプチドで外部的に処理された細胞において、（図23 Ｃ及びＤに示されるような）細胞周期の広範囲にわたる停止があることを我々は 見い出した。実施例９ VprのＣ末端領域と関連した膜活性 大腸菌における可溶性Vpr蛋白質の十分な量の製造が困難であったので、我々 はほとんどの研究を合成ペプチドで行った。ペプチド３は細胞の迅速な浸透性上 昇を引きおこすことにおいて、GST-Vprより有効であったので、Vpr誘導膜孔が膜 一体性及び膜を横切るイオンコンダクタンスに影響を及ぼすか否かを研究するの にペプチド３を用いた。膜のポテンシャル（Cohen and Salzberg，1978）を測定 するために、細胞膜の液体区画中に溶解し、膜を横切ってポテンシャル勾配に依 存して蛍光を発する染料、DiS−Ｃ₃−（５）を 用いた。DiS−Ｃ₃−（５）（３，３′−ジプロピルチオジカルボシアニン）染料 （Molecular Probes，Eugene，Oregon）を50μＭの濃度の緩衝液中に室温で15分 間封入することによりCEM細胞(PBS中10⁶細胞／ml)内に予備充填した。ペプチド １〜３を添加（１μｇ／100μｌ細胞）し、（633nm超で測定された）DiS−Ｃ₃− （５）蛍光の励起について633nmにおける照度をフローサイトメトリーにより0.5 及び30分間後に染料蛍光測定した。DiS−Ｃ₃−（５）からの増加した蛍光シグナ ルは、増加した膜ポテンシャルを示す。DiS−Ｃ₃−（５）染料で処理された細胞 へのペプチド３の添加は、（図23Ｄに示すように）５分後に膜ポテンシャルの重 大な増加を、30分後に劇的な増加を引きおこした。Ｎ末端HFRIGCRHSTIG配列を欠 くペプチド１は、この効果を示さなかった。我々は、Vpr蛋白質又はＣ末端ペプ チドのヒトCD⁴⁺細胞への細胞外添加がプロピジウムイオジド（PI）取り込みによ り測定されるような脱透過性上昇を引きおこすことも証明している。PI取り込み は進行的であり、図24に示すようにH(F／S)RIGアミノ酸繰り返しモチーフの存在 に依存した。実施例20 Vprの細胞外Ｃ末端ペプチドは、ヒトCD⁴⁺細胞に浸透することができ 、粒状体内に局在化し、細胞損傷も誘導する。 次に我々は、細胞外培地中に存在する合成ペプチドの取り込み及び局在化を検 査した。FITC標識ペプチドでの処理後３時間のCD⁴⁺細胞のフローサイトメトリー 分析は、培地からの取り込みを示すペプチド２及び３でインキュベートされた細 胞に関連する増加した蛍光があることを示した。可視光及び蛍光下においてOlym pus BH２−RFCA蛍光顕微鏡で顕微鏡検査を行った（励起キューブ／フィルターＧ ）。FITC標識ペプチドで処理された細胞の顕微鏡検査は、ペプチド ３と対比して、30分後にペプチド１を取り込んだ細胞がほとんどないことを示し た。より高い倍率は、５分後にペプチド３で処理された細胞の表面上を染色する 蛍光物質があり、30分後に細胞内染色が非常に濃くなり明るく濃厚なパッチが見 られ得ることを示した。FITC標識ペプチド３は３時間以内に明るく蛍光を発する 粒状体内に局在化し、ペプチド３処理した細胞をDNA染色（DAPI）させた時極め て類似した染色パターンも見られた。細胞をFITC標識ペプチドで処理し、30分間 、１％ホルモル塩溶液で固定し、４，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール (DAPI)(Sigma Chemicals)（１μｇ／10⁶細胞）で10分間染色した。この処理した 細胞をUV光下での顕微鏡検査の前にPBSで１回洗浄した。我々は、FITC標識され たペプチド３で処理され、DAPIで染色されたイースト細胞において、同様のペプ チド局在化がおこることも見つけた。図25Ａ及びＢに示される未処理の細胞、並 びにペプチド１で処理された細胞（図25Ｃ及びＤ）と対照的に、ペプチド３で処 理さた細胞は、（減少した細胞サイズを示す）前方光散乱の削減及び（増加した 粒状性を示す）光の増加した右角（90°）散乱を示し、これは、これらの細胞が 構造的に損傷したことを示す（図25Ｅ及びＦ）。細胞内膜小胞を横切るCa²⁺の動 きに作用する細胞内Ca²⁺チャンネルブロッカーTMB８は、細胞がTMB−８で予備イ ンキュベートされTMB８が培地中に維持されたなら、ペプチド３により引きおこ されるCD⁴⁺細胞への損傷を削減する（図25Ｇ及びＨ）。しかしながら、TMB８は ペプチド３により引きおこされる膜ポテンシャルの増加を阻害しなかった。 HIV−１生活環におけるVprの役割は何か、及びこれに関連する増殖停止に何が 誘導されるのか。時にHIV−１及び他のレトロウィルスの間の区別に関するジレ ンマがある；レトロウィルスは感染のために細胞増殖を必要とし、一方、HIV− １は最終的に分化したマ クロファージのような非増殖の細胞に感染する。Leuis et al ，(1993)はCD⁴⁺細 胞系がＧ２増殖期において停止している時、HIV−１に生産的に感染され得るこ とを示した。従って宿主細胞の非増殖は、全て又はいくつかの細胞型の生産的感 染に最初に必要とされ得るであろう。 【図１】 【図２】 【図３】 【図４】 【図５】 【図６】 【図７】 【図８】 【図９】 【図１０】 【図１１】 【図１２】 【図１３】 【図１４】 【図１５】 【図１６】 【図１７】 【図１８】 【図１９】 【図２０】 【図２１】 【図２２】 【図２３】 【図２３】 【図２４】 【図２５】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 39/395 ＡＤＺ 9051−4Ｃ Ａ６１Ｋ 48/00 ＡＤＹ 48/00 ＡＤＹ 8615−4Ｃ Ｃ０７Ｈ 21/04 Ｂ Ｃ０７Ｈ 21/04 9356−4Ｈ Ｃ０７Ｋ 7/06 Ｃ０７Ｋ 7/06 9356−4Ｈ 7/08 7/08 9356−4Ｈ 14/155 14/155 9637−4Ｂ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｃ１２Ｐ 21/02 9358−4Ｂ 21/08 21/08 7823−4Ｂ Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｑ 1/02 9051−4Ｃ Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＢＤ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:92） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:865） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)， ＡＵ，ＣＡ，ＪＰ，ＵＳ (72)発明者 マクレディ．イアン ジー. オーストラリア国，ビクトリア 3052，パ ークビル，ロイヤル パレード 343，バ イオモレキュラー リサーチ インスティ テュート リミティド (72)発明者 アルナギリ，チンニアー オーストラリア国，ビクトリア 3052，パ ークビル，ロイヤル パレード 343，バ イオモレキュラー リサーチ インスティ テュート リミティド

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．HFRIG及びHSRIGから選択される少くとも１つのアミノ酸配列モチーフを含 むヒト免疫不全ウィルス(HIV)のVpr蛋白質の、又は生物学的に活性なフラグメン トもしくはそのアナログのアンタゴニストであって、該アンタゴニストが、増殖 停止、細胞複製停止、細胞毒性、細胞骨格破壊、及び小胞体に対する効果からな る群から選択されるVprにより媒介される１以上の活性を阻害する能力を有する ことを特徴とするアンタゴニスト。 ２．前記Vpr蛋白質が、HSRIS，HFRAG，HIRAG，HLRAG，RSRKG，RSRIS及びRSRIG からなる群から選択される少くとも１つの配列を更に含むことを特徴とする請求 項１に記載のアンタゴニスト。 ３．前記Vpr蛋白質が、Vpr配列の少くともＣ末端21アミノ酸を含むフラグメン トであることを特徴とする請求項１又は２に記載のアンタゴニスト。 ４．前記Vpr蛋白質がVpr配列の少くともＣ末端33アミノ酸を含むフラグメント であることを特徴とする請求項３記載の方法。 ５．抗体、アンチセンスRNA、及び３本鎖DNAからなる群から選択される請求項 １〜４のいずれか一に記載のアンタゴニスト。 ６．抗体であることを特徴とする請求項５に記載のアンタゴニスト。 ７．モノクローナル抗体であることを特徴とする請求項６に記載のアンタゴニ スト。 ８．アンチセンスRNAであることを特徴とする請求項５に記載のアンタゴニス ト。 ９．三本鎖DNAであることを特徴とする請求項５に記載のアンタゴニスト。 10．医薬として許容される担体と共に、活性構成物として請求項１〜９のいず れか一に記載のアンタゴニストを含むことを特徴とする医薬的組成物。 11．Vpr蛋白質の、又は生物学的に活性なフラグメントもしくはそのアナログ のアンタゴニストとして役立つと予想される化合物をスクリーニングする方法で あって、増殖停止、細胞複製停止、細胞毒性、細胞骨格破壊、及び小胞体に対す る効果からなる群から選択される生物学的活性のアッセイにおいて、Vprの活性 を阻害することにおけるテスト化合物の有効性を測定するステップを含むことを 特徴とする方法。 12．HIV感染の防止のための、又はHIV感染の効果の緩和のためのワクチンであ って、Vpr配列の少くともＣ末端21アミノ酸をコードするHIVゲノムの部分が削除 されているヒト免疫不全ウィルス−１又はヒト免疫不全ウィルス−２を、医薬と して許容される担体と共に含むことを特徴とするワクチン。 13．Vpr配列の少くともＣ末端33アミノ酸をコードする前記ゲノムの部分が削 除されていることを特徴とする請求項12に記載のワクチン。 14．Vpr配列のＣ末端領域をコードするゲノムの部分及びNef遺伝子のＮ末端を コードするHIVゲノムの部分の両方が削除されていることを特徴とする請求項12 又は13に記載のワクチン。 15．Vpr蛋白質のＣ末端部分をコードする領域が、抑制性アンチセンス配列に より、又は抑制性ペプチドをコードする配列により置換されていることを特徴と するvpr遺伝子。 16．HIV感染の治療の方法であって、請求項１〜９のいずれか一に記載のVpr蛋 白質の、又は生物学的に活性なフラグメントもしくはそのアナログのアンタゴニ ストの効果的な量を前記治療の必要な 患者に投与し、それによりHIV感染を防ぐか、症候性AIDSへのHIV感染の進行を防 ぐか、又はAIDSの症候を緩和するステップを含むことを特徴とする方法。 17．細胞増殖により媒介される病気の治療の方法であって、HFRIG及びHSRIGか ら選択される少くとも１つのアミノ酸配モチーフを含むVpr蛋白質の、又は生物 学的に活性なフラグメントもしくはそのアナログの効果的な量を前記治療の必要 な哺乳動物へ投与し、それにより前記病気を媒介する細胞の増殖を阻害するステ ップを含むことを特徴とする方法。 18．前記細胞増殖により媒介される病気が癌、白血病、又は乾癬であることを 特徴とする請求項17に記載の方法。 19．前記Vpr蛋白質又はフラグメントもしくはそのアナログがCa²⁺チャンネル 輸送のエンハンサーと組み合わせて用いられることを特徴とする請求項17又は18 に記載の方法。 20．病原体により引きおこされる病気の治療の方法であって、HFRIG及びHSRIG から選択される少くとも１つのアミノ酸配列モチーフを含むVpr蛋白質又は生物 学的に活性なフラグメントもしくはそのアナログの効果的な量を前記治療の必要 な哺乳動物に投与するステップを含むことを特徴とする方法。 21．前記病気がバクテリア、寄生虫、イースト又は真菌により引きおこされる ことを特徴とする請求項20に記載の方法。 22．細胞膜への、又は細胞の内部への医薬的に活性な物質の輸送のための薬剤 であって、該薬剤がHFRIG及びHSRIGから選択される少くとも１つのアミノ酸配列 モチーフを含むVprペプチド又は生物学的に活性なフラグメントもしくはそのア ナログを含み、前記Vprペプチド、フラグメント又はアナログが前記医薬的に活 性な物質に結合されていることを特徴とする薬剤。 23．細胞膜への、又は細胞の内部への医薬的に活性な物質の輸送の方法であっ て、請求項23に記載の薬剤に前記細胞を接触させるステップを含むことを特徴と する方法。 24．細胞増殖により媒介される病気の治療における、HFRIG及びHSRIGから選択 される少くとも１つのアミノ酸配列モチーフを含むVpr蛋白質の、又は生物学的 に活性なフラグメントもしくはそのアナログの使用。 25．病原体により引きおこされる病気の治療における、HFRIG及びHSRIGから選 択される少くとも１つのアミノ酸配列モチーフを含むVpr蛋白質の、又は生物学 的に活性なフラグメントもしくはそのアナログの使用。 26．HCKKG，CLGEG，CLGEE，CLGGE，CLGRG，HVRKG，HYTKG，HFKRG，HFKKG，HAK RD，CLQEG，CLGGG，CRGEG，CWGED，HFRCG及びRRQPFからなる群から選択される少 くとも１つのアミノ酸配列モチーフを含むヒト免疫不全ウィルス−２（HIV−２ ）のVpx蛋白質の、又は生物学的に活性なフラグメントもしくはそのアナログの アンタゴニストであって、前記アンタゴニストが集団停止、細胞複製停止、細胞 毒性、細胞骨格破壊及び小胞体に対する効果からなる群から選択されるVpxによ り媒介される１以上の活性を阻害する能力を有することを特徴とするアンタゴニ スト。