JPH09511396A - 酵素的抗菌組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 バナジウムハロペルオキシダーゼ、ハロゲン化物源及び過酸化水素又は過酸化水素源を含む抗菌組成物を提供する。バナジウムハロペルオキシダーゼはＣｕｒｖｕｌａｒｉａ ｉｎａｅｑｕａｌｉｓから得られるクロロペルオキシダーゼであるのが好ましい。

Description

【発明の詳細な説明】 酵素的抗菌組成物 技術分野 本発明は、酵素的抗菌組成物(ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａ ｌ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ)及びその使用に関する。より具体的に言えば、本発 明は、バナジウムハロペルオキシダーゼ、過酸化水素源及びハロゲン化物源を含 む酵素的抗菌組成物に関する。本発明はさらに、組換えＤＮＡ技術を用いた、酵 素的抗菌組成物に用い得るバナジウムハロペルオキシダーゼの製造に関する。背景及び従来技術 当業界において種々の酵素的抗菌組成物が公知である。例えば、ＷＯ−Ａ−９ ４／０４２１７号は、抗菌的に有効な濃度の次亜チオシアン酸イオン（ＯＳＣＮ^- ）を生成し得る安定化歯磨き組成物を開示している。該組成物は、過酸化水素 を産生するオキシドレダクターゼ及び通常唾液中に存在するチオシアン酸イオン を抗菌性次亜チオシアン酸イオン（ＯＳＣＮ^-）に酸化し得るペルオキシダーゼ 酵素を含んでいる。適当なペルオキシダーゼには、ラクトペルオキシダーゼ、ミ エロペルオキシダーゼ、唾液ペルオキシ ダーゼ及びクロロペルオキシダーゼが含まれる。 ハロペルオキシダーゼを含む酵素的抗菌組成物は、ＥＰ−Ａ−５００３８７号 （Ｅｘｏｘｅｍｉｓ）にも開示されている。ハロペルオキシダーゼは、過酸化物 及びハロゲン化物の存在下、選択的に標的微生物に結合して、その増殖を阻止す ると記載されている。ＥＰ−Ａ−５００３８７号は、適当なハロペルオキシダー ゼとして、ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）、好酸球オキシダーゼ（ＥＰＯ） 、ラクトペルオキシダーゼ（ＬＰＯ）及びクロロペルオキシダーゼ（ＣＰＯ）を 記載している。ハロゲン化物と過酸化水素の比率がハロペルオキシダーゼの安定 性及び機能性に関する重要な因子であると報告された。過酸化水素は、極く低比 率であってもハロペルオキシダーゼ機能を阻害し得るのに対し、ハロゲン化物は 極めて高比率で酵素反応を阻止し得る。該比率は広い範囲内で変動し得るが、約 ５０以上に保つのが好ましい。 過酸化水素の望ましくない副反応のために、抗菌組成物中の過酸化水素の実際 の濃度は予測値より低いと考えられる。従って、本出願人は、抗菌組成物に、慣 用量のハロゲン化物と組み合わせて、高出発濃度の過酸化水素を用い得 るようにするのがより望ましいことを見いだした。 さらに、公知の酵素的抗菌組成物とは異なる抗菌活性スペクトルを有する酵素 的抗菌組成物に対する要望がある。該組成物は、撲滅困難な微生物、例えば、Ｓ ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓに対する抗菌活性を有し得るのが 好ましい。他の状況下では、食品を腐敗させ得ることから、非病原性微生物をも 撲滅するのが望ましい。 従って、本発明の目的は、上記欠点の一つ以上を排除する酵素的抗菌組成物を 提供することである。 驚くべきことには、本出願人は、バナジウムハロペルオキシダーゼを用いると 、特に有効な酵素的抗菌組成物を処方し得ることを見いだした。 上記従来技術には、抗菌組成物に用いるための多様なハロペルオキシダーゼが 含まれるが、これまで、バナジウムハロペルオキシダーゼ種は特に注目されてい なかった。 バナジウムハロペルオキシダーゼは、該酵素中の補欠分子族がバナジン酸（バ ナジウム Ｖ）に類似の構造特性を有しているのに対し、他のハロペルオキシダ ーゼはヘムペルオキシダーゼであるという点で、他のハロペルオキシダーゼと異 なっている。 本発明の他の目的は、バナジウムハロペルオキシダーゼをコードする遺伝子を クローン化し、その配列を決定して増殖により好都合な他の微生物中で該造伝子 を発現させ、且つ組換えＤＮＡ技術を用いて産生され得る酵素の量を増大させる ことである。 ある種のバナジウムブロモペルオキシダーゼは、海草表面に天然に見いだされ る（Ｗｅｖｅｒら，１９９１）。海水中の健全な植物では、バナジウムブロモペ ルオキシダーゼは、加えられた基質に接近可能であり、過酸化水素を添加すると ＨＯＢｒを放出し得る。該酵素の役割は末だ解明されていないが、海水中での高 度に酸化性のＨＯＢｒの形成は、植物表面上の微生物又は菌類の増殖を阻止する 植物の防御システムの一部であると考えられる。 海草Ａｓｃｏｐｈｙｌｌｕｍ ｎｏｄｏｓｕｍから非ヘムバナジウムブロモペ ルオキシダーゼが発見されて以来、多数の他の海草種もこれらの酵素を含んでい ることが示された。特に、Ａ．ｎｏｄｏｓｕｍから得られるブロモペルオキシダ ーゼについては広範な研究が行われ、特性が決定された（総説については参考文 献２−３を参照されたい）。これらの酵素中の補欠分子族は、バナジン酸（バナ ジウム Ｖ）に類似の構造特性を有している。該酵素に対して誘導された触媒機構におい て、過酸化水素が該酵素と反応して過酸化水素／酵素複合体を形成し、その後で 、臭化物及びプロトンが該複合体と反応して、酵素／ＨＯＢｒ複合体を形成する 。該複合体が崩壊すると、酵素とＨＯＢｒを生ずることが示された（Ｄｅ Ｂｏ ｅｒら，１９８８）。これらのバナジウムブロモペルオキシダーゼは、水性及び 有機媒体中で高い操作安定性を有することも示された(Ｄｅ Ｂｏｅｒら，１９８ ８)。例えば、これらの酵素は、代謝回転条件下に３週間安定であったし、有機 溶媒、例えば、アセトン、メタノール、エタノール（最大６０ｖ／ｖ％まで存在 する）及び１−プロパノール中で、活性を失なうことなく１ケ月以上保存可能で あった。しかし、該酵素は、臭化物が存在するか又は添加される潜在的用途や、 海草から得られるこれらのブロモペルオキシダーゼをコードする遺伝子をクロー ン化して、そのアミノ酸配列を決定しようとする試みはうまくいかない、という 欠点を有している。 Ｃａｌｄａｒｉｏｍｙｃｅｓ ｆｕｍａｇｏから得られる現存の公知ヘム含有 クロロペルオキシダーゼは、その固有の不安定性及び２．７５という低い最適ｐ Ｈのために、 その用途が大いに制限され、酵素的抗菌組成物の製造にはあまり適していない。 同様な理由から、ＨＯＣｌを発生し得るヒト白血球由来酵素ミエロペルオキシダ ーゼ（ＭＰＯ）の使用が妨げられる（Ａ．Ｒ．Ｊ．Ｂａｋｋｅｎｉｓｔら，１９ ８０）。 デマチウム科ヒホミケス（ｈｙｐｈｏｍｙｃｔｅｓ）類が極めて安定にハロペ ルオキシダーゼを分泌するという論文（参考文献７、８参照）が既に発表されて いる。特に、陸生真菌類Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ ｉｎａｅｑｕａｌｉｓが、塩化 物に対して高親和性を有し、約ｐＨ５．５という塩素化反応に最適なｐＨを有す るバナジウムクロロペルオキシダーゼを分泌することが示された（Ｊ．Ｗ．Ｐ． Ｍ．Ｖａｎ Ｓｃｈｉｊｎｄｅｌら，１９９３）。海草から得られるブロモペル オキシダーゼの場合と同様に、クロロペルオキシダーゼ中の補欠分子族は、バナ ジン酸（バナジウムＶ）に類似の構造特性を有している。その後のより詳細な研 究（Ｊ．Ｗ．Ｐ．Ｍ．Ｖａｎ Ｓｃｈｉｊｎｄｅｌら，１９９４）において、過 酸化水素による塩化物酸化の酵素反応速度が海草Ａ．ｎｏｄｏｓｕｍから得られ るバナジウムブロモペルオキシダーゼのものと類似していることが示さ れた。さらに、３種の異なる方法により、該酵素が反応生成物として酸化塩素種 （ＨＯＣｌ）を産生し、それ自体該産物に対する耐性を有していることが示され た。該酵素は、高い熱安定性（Ｔｍ ９０℃）を有し、４０％メタノール、エタ ノール及びプロパノールのような有機溶媒中で高安定性を示す。発明の定義 本発明は、第１の態様において、バナジウムハロペルオキシダーゼ、ハロゲン 化物源及び過酸化水素又は過酸化水素源を含む酵素的抗菌組成物に関する。 本発明は、第２の態様により、複製起源、転写・終結調節配列、及びバナジウ ムハロペルオキシダーゼをコードするＤＮＡ配列の少なくとも一部を含む発現ベ クターを用いて適当な宿主を形質転換し、該宿主を、構造遺伝子を発現させ得る 条件下に培養し、バナジウムハロペルオキシダーゼを単離することによる、バナ ジウムハロペルオキシダーゼの製造に関する。発明の詳細な説明 （ａ）バナジウムハロペルオキシダーゼ 本発明の酵素的抗菌組成物は、第１成分としてバナジウ ムハロペルオキシダーゼを含む。バナジウムハロペルオキシダーゼは、原則とし て、当業界において開示されている種々のバナジウムハロペルオキシダーゼから 選択し得る。例えば、ＵＳ−Ａ−４７０７４６６号に記載のようなＣｕｒｖｕｌ ａｒｉａ ｉｎａｅｑｕａｌｉｓから産生されたバナジウム（非ヘム）ハロペル オキシダーゼを用いてよい。あるいは、Ｊ．Ｗ．Ｐ．Ｍ．Ｖａｎ Ｓｃｈｉｊｎ ｄｅｌら（１９９３）の方法に従って、Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ ｉｎａｅｑｕａ ｌｉｓ（ＣＢＳ １０２．４２）からクロロペルオキシダーゼを単離・精製して もよい。 他のバナジウムハロペルオキシダーゼ源には、Ｄｒｅｃｈｓｌｅｒａ ｂｉｓ ｅｐｔａｔａ(ＣＢＳ ３７１.７２)、Ｄｒｅｃｈｓｌｅｒａ ｆｕｇａｘ(ＣＢＳ ５０９.７７)、Ｄｒｅｃｈｓｌｅｒａ ｎｉｃｏｔｉａｅ(ＣＢＳ ６５５.７４) 、Ｄｒｅｃｈｓｌｅｒａ ｓｕｂｐａｐｅｎｄｏｒｆｉｉ（６５６．７４）、Ｅ ｍｂｅｌｉｓｉａ ｈｙａｃｉｎｔｈｉ（４１６．７１）、Ｅｍｂｅｌｉｓｉａ ｄｉｄｙｍｏｓｐｏｒａ（ＣＢＳ ７６６）、Ｕｌｏｃｌａｄｉｕｍ ｃｈａｒ ｔａｒｕｍ（２００．６７）及びＵｌｏｃｌａｄｉｕｍ ｂｏｔｒｙｔｉｓ（４ ５２．７２）が含まれる。 あるいは、複製起源、転写及び終結調節配列、並びにバナジウムハロペルオキ シダーゼをコードするＤＮＡ配列を含む発現ベクターを用いて適当な宿主を形質 転換し、該宿主を構造遺伝子を発現させ得る条件下に培養し、バナジウムハロペ ルオキシダーゼを単離することによる組換えＤＮＡ技術を用いて、バナジウムハ ロペルオキシダーゼを製造し得る。これは、後述の実施例に詳細に記載する。 （ｂ）ハロゲン化物イオン源 本発明の衛生組成物の第２成分はハロゲン化物イオン源である。これらはいず れのハロゲン化物イオンであってもよいが、最も有効であるという理由でヨウ化 物又は塩化物イオンが好ましい。塩化ナトリウムが最も好ましいハロゲン化物イ オン源である。ハロゲン化物を本発明の酵素的抗菌組成物に加えてもよいし、水 道水中に天然に存在し、通常２〜５ｍＭのオーダーであるハロゲン化物を用いて もよい。 （ｃ）過酸化水素源 本発明の衛生組成物は、過酸化水素源又は過酸化水素発生系をさらに含む。適 当な過酸化水素発生系の例は、過ホウ酸塩又は過炭酸塩、好ましくは過炭酸ナト リウム又は過 ホウ酸ナトリウムである。 過酸化水素は、酵素的過酸化水素発生系によっても供給され得る。酵素的過酸 化水素発生系は、原則として、当業界において開示されている種々の酵素的過酸 化水素発生系から選択してよい。例えば、アミンオキシダーゼとアミン、アミノ 酸オキシダーゼとアミノ酸、乳酸オキシダーゼと乳酸塩、コレステロールオキシ ダーゼとコレステロール、尿酸オキシダーゼと尿酸、又はキサンチンオキシダー ゼとキサンチンを用い得る。しかし、好ましいのは、グルコースオキシダーゼと グルコースの組合わせである。 グルコースオキシダーゼの量は、その比活性及び存在し得る残留カタラーゼの 活性に依存するが、例えば、一般に本発明の洗剤組成物は、該組成物１ｇ又は１ ｍｌ当たり、１０〜１０００、好ましくは、２０〜５００単位のグルコースオキ シダーゼを含むと言える。酵素活性の１単位は、標準条件下に、１分間に１μｍ ｏｌの基質を変換するに要する量と定義されている。 （ｄ）他の成分 本発明の酵素的抗菌組成物は一般に、０．０１〜５０重量％、好ましくは、０ ．１〜５．０重量％の１種以上の界 面活性剤又は湿潤剤を含んでいる。適当な界面活性剤又は洗浄活性化合物は、セ ッケン又は非セッケンアニオン界面活性剤、非イオン界面活性剤、カチオン界面 活性剤、両性若しくは双性イオン化合物である。界面活性剤系は通常、１種以上 のアニオン界面活性剤及び１種以上の非イオン界面活性剤を含んでいる。界面活 性剤系は、両性又は双性イオン界面活性剤化合物をさらに含んでいてもよいが、 該化合物が比較的高価であるために普通は望ましくない。 一般に、界面活性剤系の非イオン及びアニオン界面活性剤は、Ｓｃｈｗａｒｔ ｚ及びＰｅｒｒｙによる“Ｓｕｒｆａｃｅ Ａｃｔｉｖｅ Ａｇｅｎｔｓ”第１巻 、Ｓｃｈｗａｒｔｚ、Ｐｅｒｒｙ及びＢｅｒｃｈによるＩｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃ ｅ １９４９,第２巻、Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ １９５８、Ｍａｎｕｆａｃｔ ｕｒｉｎｇ Ｃｏｎｆｅｃｔｉｏｎｅrｓ社により出版された“ＭｃＣｕｔｃｈｅ ｏｎ’ｓ Ｅｍｕｌｓｉｆｉｅｒｓ ａｎｄ Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ”の最新版、 又は“Ｔｅｎｓｉｄｅ−Ｔａｓｃｈｅｎｂｕｃｈ”，Ｈ．Ｓｔａｃｈｅ,第２巻, Ｃａｒｌ Ｈａｕｓｅｒ Ｖｅｒｌａｇ,１９８１に記載の界面活性剤から選択し 得る。 使用し得る適当な非イオン洗剤化合物には、特に、疎水性基及び反応性水素原 子を有する化合物、例えば、脂肪族アルコール、酸、アミド又はアルキルフェノ ールと、アルキレンオキシド、特にエチレンオキシドのみ若しくはプロピレンオ キシドを含むエチレンオキシドとの反応生成物が含まれる。特定の非イオン洗剤 化合物は、一般に５〜２５ＥＯ、即ち、１分子当たり５〜２５単位のエチレンオ キシドのＣ₆−Ｃ₂₂アルキルフェノール／エチレンオキシド縮合物、及び脂肪族 Ｃ₈−Ｃ₁₈第１級若しくは第２級直鎖若しくは分枝鎖アルコールと一般に５−４ ０ＥＯのエチレンオキシドとの縮合物である。 使用し得る適当なアニオン洗剤化合物は、通常、約８〜約２２個の炭素原子を 含むアルキル基を有する水溶性有機硫酸及びスルホン酸アルカリ金属塩であって よい。アルキルという用語は、高級アシル基のアルキル部分を含むものとして用 いられている。適当な合成アニオン洗剤化合物の例は、アルキル硫酸ナトリウム 及びカリウム、特に、例えば、牛脂又はヤシ油から産生された高級Ｃ₈−Ｃ₁₈ア ルコールを硫酸化して得られたもの、アルキルＣ₉−Ｃ₂₀ベンゼンスルホン酸ナ トリウム及びカリウム、特に、線状第２ 級アルキルＣ₁₀−Ｃ₁₅ベンゼンスルホン酸ナトリウム；並びに、牛脂又はヤシ油 から誘導された高級アルコールエーテル及び石油から誘導された合成アルコール である。好ましいアニオン洗剤化合物は、Ｃ₁₁−Ｃ₁₅アルキルベンゼンスルホン 酸ナトリウム及びＣ₁₂−Ｃ₁₈アルキル硫酸ナトリウムである。 さらに使用可能なものは、ＥＰ−Ａ−３２８１７７号（Ｕｎｉｌｅｖｅｒ）に 記載のもののような塩析耐性を示す界面活性剤、ＥＰ−Ａ−０７００７４号に記 載のアルキルポリグリコシド界面活性剤、及びアルキルモノグリコシドである。 好ましい界面活性剤系は、アニオン洗浄活性物質と非イオン洗浄活性物質との 混合物、特に、ＥＰ−Ａ−３４６９９５号（Ｕｎｉｌｅｖｅｒ）に記載のアニオ ン界面活性剤と非イオン界面活性剤群及びその例である。特に好ましいのは、Ｃ₁₆ −Ｃ₁₈第１級アルコール硫酸アルカリ金属塩とＣ₁₂−Ｃ₁₅第１級アルコール３ −７ＥＯエトキシレートとの混合物である界面活性剤系である。 非イオン洗剤が、界面活性剤系の１０重量％を超える量、例えば、２５〜９０ 重量％の量で存在するのが好ましい。 アニオン界面活性剤は、例えば、界面活性剤系の約５〜約４０重量％の範囲の量 で存在してよい。 本発明の酵素的洗剤組成物は、増粘剤のような抗菌組成物に通常用いられてい る他の成分を含んでいてもよい。この点で特に有用なのは、ＥＰ−Ａ−３１４２ ３２号（Ｕｎｉｌｅｖｅｒ）に開示されている界面活性剤組合わせであり、該組 合わせは、水に溶解すると増粘ゲルとなる。 本発明の抗菌組成物を用いると、硬質表面の洗浄及び繊維製品の洗浄に対する 衛生上の利点が得られるだけでなく、病院のような産業／施設における衛生及び 洗浄、並びに医療器具の洗浄及び消毒という利点も得られる。他の用途は、乳業 における搾乳装置の消毒用である。該抗菌組成物は、異臭の原因となる細菌を撲 滅する能力を有するために、脱臭剤に用いても好結果を得ることができる。 本発明の抗菌組成物は、使用前に水に溶かす粉末形態で使用し得るが、液体製 品又はゲルとして処方してもよい。該製品形態においては、組成物を使用する時 まで次亜ハロゲン酸塩（ｈｙｐｏｈａｌｉｔｅ）の生成が開始されないことが重 要である。これは、例えば、周知の方法で酵素をカプセル封入して、酵素とその 基質とを物理的に分離する ことにより達成し得る。 本発明の酵素的抗菌組成物を用いる場合、水を添加して該組成物を５〜１００ 倍に希釈すると、有効な抗菌活性を有する媒体が得られる。次いで、該媒体を消 毒すべき表面に接触させる。 以下の非限定的実施例により、本発明を詳細に説明する。実施例１ 次亜塩素酸塩の最小発育阻止濃度（ＭＩＣ） 材料 ： この実施例に用いた細菌株は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＮＣＴＣ ９００、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ＡＴＣＣ １５４４２ 、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ＡＴＣＣ １３５６５、Ｓｔｒ ｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ ＮＣＴＣ １０９２及びＬｉｓｔｅｒ ｉａ ｉｎｎｏｃｕａ ＡＴＣＣ ３３０９０ 血清型 ６Ｂであった。細菌を、ブ レインハートインフュージョン（ＢＨＩ）ブロス培地中３０℃で１５〜１８時間 増殖させた。培養後、クエン酸緩衝液ｐＨ５．５（２０ｍＭ Ｎａ₃クエン酸／Ｎ ａＯＨ緩衝液＋１０ｍＭＮａＣｌ）中で細菌株を２回洗浄した。細菌懸濁液をエ ッペンドルフ遠心分離機で遠心（１４,０００ｒｐｍで５分）し、次いで、上清 を除去した後、細菌ペレットをクエン酸緩衝液に再懸濁した。次いで、各細菌懸 濁液に対してこの洗浄手順をもう一度繰り返した。次いで、２回洗浄した細菌懸 濁液をクエン酸緩衝液ｐＨ５．５で希釈して、約１０⁷ 細菌／ｍｌの懸濁液を得る。洗浄段階の間、細胞を氷上に維持した。緩衝液及 びＢＳＡ溶液（クエン酸緩衝液ｐＨ５．５中１％ｗ／ｖ）をフィルター殺菌し、 ４℃で貯蔵した。貯蔵溶液（１０７，０００ｐｐｍ）を無菌脱イオン水で希釈し て次亜塩素酸塩溶液を調製した。方法 ： 無菌法（ｓｔｅｒｉｌｅ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）を用い、クエン酸緩衝液ｐＨ ５．５中約１０⁷細菌／ｍｌの懸濁液を調製した。該懸濁液からの１．９ｍｌア リコートを無菌管に加えた。次いで、次亜塩素酸塩の希釈範囲を得るように、該 管に種々の濃度の冷次亜塩素酸塩溶液０．１ｍｌを加えた。該管を磁気攪拌機で 連続的に攪拌した。さらに、次亜塩素酸塩溶液の代わりに無菌緩衝液のみを加え たブランク測定も行った。試料を３０℃できっかり５分間インキュベートした。 インキュベーション後、反応混合物から１ｍｌを採取し、９ｍｌの冷ＢＳＡ（１ ％ｗ／ｖ）溶液に加え、直ちに氷上に置いた。これで、次亜塩素酸塩と微生物と の反応を停止した。試料を１０^-1〜１０^-5に希釈し、種々の希釈液からの１００ μｌ試料を標識ＢＨＩ−寒天プレートにのせて、１ｍｌ当たりのコロニー形成単 位（ＣＦ Ｕ）としての生存率を測定した。次いで、プレートを３０℃で１５〜１８時間イ ンキュベートした。このインキュベーション期間後に検出可能なＣＦＵが存在し なかった場合には、プレートを３０℃でさらに２４時間インキュベートする。定義 ：最小発育阻止濃度（ＭＩＣ値）は、本明細書では、用いた実験条件下に、 テストした特定の微生物のコロニー形成単位を少なくともｌｏｇ６減少させる次 亜塩素酸塩の濃度と定義する。 得られた結果を表Ｉに示す。検出された値は文献記載のものと同一範囲にある 。 実施例２ 次亜塩素酸塩及び、Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ ｉｎａｅｑｕａ ｌｉｓ由来バナジウムクロロペルオキシダーゼ（Ｖ−ＣＰＯ）により酵素的に産 生させた次亜塩素酸塩の最小発育阻止濃度 この実施例では、次亜塩素酸塩の殺菌作用を、Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ ｉｎａ ｅｑｕａｌｉｓから得られたバナジウムクロロペルオキシダーゼ（Ｖ−ＣＰＯ） により酵素的に産生させた次亜塩素酸塩の殺菌作用と比較する。比較を可能にす るために、マイクロポンプを用いた。これは、実験の間の次亜塩素酸塩の濃度を 、次亜塩素酸塩を酵素的に産生させる状況と同じプロフィールにするために行っ た。さらに、実験の各時点に存在する次亜塩素酸塩の量を知るために、実験条件 下にＶ−ＣＰＯ活性を極めて慎重に測定した。材料 ： この実施例に用いた細菌株は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＮＣＴＣ ９００、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ＡＴＣＣ １５４４２ 、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ＡＴＣＣ １３５６５、Ｓｔｒ ｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ ＮＣＴＣ １０９２及びＬｉｓｔｅｒ ｉａ ｉｎｎｏｃｕａ ＡＴＣＣ ３３０９０血清型 ６Ｂであった。細菌を、ブレインハートインフュージョン（ ＢＨＩ）ブロス培地中３０℃で１５〜１８時間増殖させた。培養後、クエン酸緩 衝液ｐＨ５．５（２０ｍＭ Ｎａ₃クエン酸／ＮａＯＨ緩衝液＋１０ｍＭＮａＣｌ ）中で細菌株を２回洗浄した。細菌懸濁液をエッペンドルフ遠心分離機で遠心（ １４，０００ｒｐｍで５分）し、次いで、上清を除去した後、細菌ペレットをク エン酸緩衝液に再懸濁した。次いで、各細菌懸濁液に対してこの洗浄手順をもう 一度繰り返した。次いで、２回洗浄した細菌懸濁液をクエン酸緩衝液ｐＨ５．５ で希釈して、約１０⁷細菌／ｍｌの懸濁液を得た。洗浄段階の間、細胞を氷上に 維持した。緩衝液及びＢＳＡ溶液（クエン酸緩衝液ｐＨ５．５中１％ｗ／ｖ）を フィルター殺菌し、４℃で貯蔵した。貯蔵溶液（１０７，０００ｐｐｍ）を無菌 脱イオン水で希釈して次亜塩素酸塩溶液を調製した。３０％貯蔵溶液を無菌脱イ オン水で希釈してＨ₂Ｏ₂溶液を調製した。Ｄｉｆｃｏからカシトーン（ｃａｓｉ ｔｏｎｅ）を得た。Ｖａｎ Ｓｃｈｉｊｎｄｅｌら（１９９３）に従って、Ｃｕ ｒｖｕｌａｒｉａ ｉｎａｅｑｕａｌｉｓからクロロペルオキシダーゼを精製し た。分光光度計を用い、２０ｍＭ クエ ン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５．５、１０ｍＭ ＮａＣｌ、１００μＭ Ｈ₂Ｏ₂、５ ０μＭ モノクロロジメドン中３０℃で、モノクロロジメドン（ｅ ２９０ｎｍ＝ ２０．２ｍＭ^-1．ｃｍ^-1）からジクロロジメドン（ｅ ２９０ｎｍ＝０．２ｍＭ^{- 1} ．ｃｍ^-1）への変換を経過観察して、Ｃｌ^-からＨＯＣｌへの変換におけるクロ ロペルオキシダーゼ活性を測定した。１単位のクロロペルオキシダーゼを、１分 当たりに１μｍｏｌのモノクロロジメドン（Ｓｉｇｍａ）を変換する酵素の量と 定義する。方法 ： 無菌法を用い、クエン酸緩衝液ｐＨ５．５中約１０⁷細菌／ｍｌの懸濁液を調 製した。該懸濁液からの１．８ｍｌアリコートを無菌反応容器に加え、これを、 実験期間中磁気攪拌機で連続的に攪拌した。次いで、Ｖ−ＣＰＯの希釈範囲を得 るように、該反応容器に種々の濃度（計算については、以下参照）のＶ−ＣＰＯ 溶液０．２ｍｌを加えた。また、０．２ｍｌのＶ−ＣＰＯ溶液の代わりに０．２ ｍｌの無菌緩衝液を加えたブランク測定も行った。反応容器を３０℃でインキュ ベートし、次いで、０．５ｍｌのＨ₂Ｏ₂貯蔵溶液を加えてＶ−ＣＰＯ反応を開始 した。用いたＨ₂ Ｏ₂貯蔵溶液濃度は、生成される次亜塩素酸塩濃度に依存し、Ｈ₂Ｏ₂の最終濃度 （フラックスの終わりの）が次亜塩素酸塩の最終濃度に対して５倍モル過剰にな るように選択した。試料を３０℃できっかり５分間インキュベートした。インキ ュベーション後、１ｍｌの反応混合物を取り出し、９ｍｌの冷ＢＳＡ（１％ｗ／ ｖ）溶液に加え、直ちに氷上に置いた。これで、次亜塩素酸塩と微生物との反応 を停止した。試料を１０^-1〜１０^-5に希釈し、種々の希釈液からの１００μｌ試 料を標識ＢＨＩ−寒天プレートにのせて、１ｍｌ当たりのコロニー形成単位（Ｃ ＦＵ）としての生存率を測定した。次いで、プレートを３０℃で１５〜１８時間 インキュベートした。このインキュベーション期間後に検出可能なＣＦＵが存在 しなかった場合には、プレートを３０℃でさらに２４時間インキュベートする。 マイクロポンプを用い、得られたＭＩＣ値を同量の次亜塩素酸塩を加えたとき に得られたＭＩＣ値と比較した。これは、以下のように行った。 無菌法を用い、クエン酸緩衝液ｐＨ５．５中約１０⁷細菌／ｍｌの懸濁液を調 製した。この懸濁液からの１．８ｍｌアリコートを無菌反応容器に加え、これを 、実験期間中 磁気攪拌機で連続的に攪拌した。反応容器を３０℃でインキュベートし、次いで 、０．２ｍｌのＨ₂Ｏ₂貯蔵溶液を加えた。用いたＨ₂Ｏ₂貯蔵溶液濃度は、生成さ れる次亜塩素酸塩濃度に依存し、Ｈ₂Ｏ₂の最終濃度（フラックスの終わりの）が 、次亜塩素酸塩の最終濃度に対して５倍モル過剰になるように選択した。次いで 、０．５ｍｌの既知濃度の次亜塩素酸塩溶液のフラックスを３０℃で５分かけて （流速：０．１ｍｌ／分）加えた。それぞれ異なる濃度の種々の次亜塩素酸塩溶 液を用いて一連の実験を行い、次亜塩素酸塩の最終濃度範囲を得た（計算につい ては、以下参照）。５分間インキュベートした後、１ｍｌの反応混合物を取り出 し、９ｍｌの冷ＢＳＡ（１％ｗ／ｖ）溶液に加え、直ちに氷上に置いた。これで 、次亜塩素酸塩と微生物との反応を停止した。試料を１０^-1〜１０^-5に希釈し、 種々の希釈液からの１００μｌ試料を標識ＢＨＩ−寒天プレートにのせて、１ｍ ｌ当たりのコロニー形成単位（ＣＦＵ）としての生存率を測定した。次いで、プ レートを３０℃で１５〜１８時間インキュベートした。このインキュベーション 期間後に検出可能なＣＦＵが存在しなかった場合には、プレートを３０℃でさら に２４時間インキュベートする。 分光光度計に組み込んだ同一の実験設定（ブランク実験の場合には、微生物を 加えない）を用い、一定時間内の次亜塩素酸塩濃度を、モノクロロジメドン（ｅ ２９０ｎｍ＝２０．２ｍＭ^-1・ｃｍ^-1）からジクロロジメドン（ｅ ２９０ｎｍ ＝０．２ｍＭ^-1・ｃｍ^-1）への変換を利用して２９０ｎｍで経過観察することに より、それぞれＶ−ＣＰＯ及び貯蔵溶液からの次亜塩素酸塩を用いて上記実験で 得られた次亜塩素酸塩プロフィールの類似性を確認した。計算 ： Ｖ−ＣＰＯにより産生された次亜塩素酸塩の最終濃度を以下のように計算した ： ０．０１Ｕ／ｍｌのＶ−ＣＰＯを用いた場合、２．０ｍｌの初期量に加えた０ ．５ｍｌのフラックスの希釈作用により、５分当たり０．０５μｍｏｌ 次亜塩 素酸塩／ｍｌに相当する０.０１μｍｏｌ 次亜塩素酸塩／ｍｌ／分が産生される 。５分後の最終濃度は、（２．０／２．５）＊０．０５μｍｏｌ／ｍｌ＝５分後 の０.０４μｍｏｌ 次亜塩素酸塩／ｍｌである。次いで、この濃度を、０．０ ４μｍｏｌ次亜塩素酸塩／ｍｌ＝０．０４＊５２．５ｐｐｍ次亜塩素酸塩＝２． １０ｐｐｍ次亜塩素酸塩と表し得る。Ｖ−Ｃ ＰＯ濃度を増減して、他の次亜塩素酸塩の最終濃度を得た。加えた次亜塩素酸塩 の最終濃度を以下のように計算した： ２．０ｍｌの反応容量に０．５ｍｌのフラックスを加えるので、最終容量は２ ．５ｍｌとなり、これは、５倍希釈に相当する。２．１０ｐｐｍの次亜塩素酸塩 最終濃度を得るために、１０．５０ｐｐｍの貯蔵溶液を用いた。次亜塩素酸塩貯 蔵溶液を増減して他の次亜塩素酸塩濃度を得た。定義 ：最小発育阻止濃度（ＭＩＣ値）は、本明細書では、用いた実験条件下に、 テストした特定の微生物のコロニー形成単位を少なくともｌｏｇ６減少させる次 亜塩素酸塩の濃度と定義する。 結果を表IIに示す。Ｖ−ＣＰＯによって産生されるか、又は次亜塩素酸塩フラ ックスの終わりに産生された種々の最終濃度の次亜塩素酸塩の殺菌作用を比較す る。表IIから結論し得るように、既にＶ−ＣＰＯにより酵素的に産生された次亜 塩素酸塩は、０．４ｐｐｍ程度の低い次亜塩素酸塩濃度でＳｔａｐｈｙｌｏｃｏ ｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ以外のテストした全ての微生物の増殖を完全に阻止する のに対し、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓでは、同様な増殖の阻 止を得るには２ｐｐｍの次亜塩素酸塩を必 要とする。これらの結果は、バナジウム含有ハロペルオキシダーゼが、その次亜 塩素酸塩産生能だけから予測されたもの以上の有効な衛生成分であることを示し ている。さらに、Ｖ−ＣＰＯが、病原性であれ非病原性であれ、テストした全て の微生物を殺菌するのに対し、ヘム含有ハロペルオキシダーゼは、病原性細菌の みを効率的に殺菌するに過ぎないことは明らかである（ＥＰ−Ａ−５００３８７ 号参照）。 実施例３ 次亜塩素酸塩及び、タンパク質水解物の存在下にＶ−ＣＰＯにより酵素的に産生 された次亜塩素酸塩の殺菌効率 衛生を得るためには、実際に遭遇する状況下において、次亜塩素酸塩の過剰投 与が必要であることは公知である。 というのは、該反応性分子は微生物と反応するだけでなく、存在する他の化合物 とも反応するからである。従って、例えば、タンパク質水解物を含む液体中のバ ナジウム含有ハロペルオキシダーゼの挙動をテストすることが重要であった。材料 ： この実施例に用いた細菌株は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＮＣＴＣ ９００であった。細菌を、ブレインハートインフュージョン（ＢＨＩ）ブロス培 地中３０℃で１５〜１８時間増殖させた。培養後、クエン酸緩衝液ｐＨ５．５（ ２０ｍＭ Ｎａ₃クエン酸／ＮａＯＨ緩衝液＋１０ｍＭＮａＣｌ）中で細菌株を２ 回洗浄した。細菌懸濁液をエッペンドルフ遠心分離機で遠心（１４，０００ｒｐ ｍで５分）し、次いで、上清を除去した後、細菌ペレットをクエン酸緩衝液に再 懸濁した。次いで、各細菌懸濁液に対してこの洗浄手順をもう一度繰り返した。 次いで、２回洗浄した細菌懸濁液をクエン酸緩衝液ｐＨ５．５で希釈して、約１ ０⁸細菌／ｍｌの懸濁液を得た。洗浄段階の間、細胞を氷上に維持した。緩衝液 及びＢＳＡ溶液（クエン酸緩衝液ｐＨ５．５中１％ｗ／ｖ）をフィルター殺菌し 、４℃で貯蔵し た。貯蔵溶液（１０７，０００ｐｐｍ）を無菌脱イオン水で希釈して次亜塩素酸 塩溶液を調製した。３０％貯蔵溶液を無菌脱イオン水で希釈してＨ₂Ｏ₂溶液を調 製した。Ｄｉｆｃｏからカシトーンを得た。Ｖａｎ Ｓｃｈｉｊｎｄｅｌら,１９ ９３に従ってＣｕｒｖｕｌａｒｉａ ｉｎａｅｑｕａｌｉｓからクロロペルオキ シダーゼを単離・精製した。方法 ： 無菌法を用い、クエン酸緩衝液ｐＨ５．５中約１０⁸細菌／ｍｌの懸濁液を調 製した。該懸濁液からの１．３ｍｌアリコートを無菌反応容器に加え、これを、 実験期間中磁気攪拌機で連続的に攪拌した。次いで、０．５ｍｌの０．５ｍｇ／ ｍｌカシトーン（クエン酸緩衝液ｐＨ５．５中）溶液及び０．５ｍｌのクエン酸 緩衝液ｐＨ５．５を加えた。次いで、３．２ｐｐｍ又は６．５ｐｐｍの次亜塩素 酸塩の最終濃度が得られるように、種々の濃度（計算については実施例２参照） のＶ−ＣＰＯ溶液０．２ｍｌを反応容器に加えた。また、０．２ｍｌのＶ−ＣＰ Ｏ溶液の代わりに０．２ｍｌの無菌緩衝液を加えたブランク測定も行った。反応 容器を３０℃でインキュベートし、次いで、０．５ｍｌのＨ₂Ｏ₂貯蔵溶液（５倍 モル過剰の過酸化水素がフラックス の終わりに得られるように濃度を選択した）を加え、Ｖ−ＣＰＯ反応を開始した 。試料を３０℃できっかり５分間インキュベートした。インキュベーション後、 １ｍｌの反応混合物を取り出し、９ｍｌの冷ＢＳＡ（１％ｗ／ｖ）溶液に加え、 直ちに氷上に置いた。これで、次亜塩素酸塩と微生物との反応を停止した。試料 を１０^-1〜１０^-6に希釈し、種々の希釈液からの１００μｌ試料を標識ＢＨＩ− 寒天プレートにのせて、１ｍｌ当たりのコロニー形成単位（ＣＦＵ）としての生 存率を測定した。次いで、プレートを３０℃で１５〜１８時間インキュベートし た。このインキュベーション期間後に検出可能なＣＦＵが存在しなかった場合に は、プレートを３０℃でさらに２４時間インキュベートする。 マイクロポンプを用い、得られた殺菌効率を同量の次亜塩素酸塩を加えたとき に得られた殺菌効率と比較した。これは、以下のように行った。 無菌法を用い、クエン酸緩衝液ｐＨ５．５中約１０⁸細菌／ｍｌの懸濁液を調 製した。この懸濁液からの１．３ｍｌアリコートを無菌反応容器に加え、これを 実験期間中磁気攪拌機で連続的に攪拌した。次いで、０．５ｍｌの０． ５ｍｇ／ｍｌカシトーン溶液（クエン酸緩衝液ｐＨ５．５中）及び０．５ｍｌの クエン酸緩衝液ｐＨ５．５を加えた。次いで、０．２ｍｌの無菌クエン酸緩衝液 ｐＨ５．５を加えた。反応容器を３０℃でインキュベートし、次いで、それぞれ ３．２ｐｐｍ及び６．５ｐｐｍの次亜塩素酸塩の最終濃度（濃度の計算について は、実施例２を参照）を得るように、０．５ｍｌの次亜塩素酸塩溶液のフラック スを３０℃で５分かけて（流速：毎分０．１ｍｌ）加えた。５分間インキュベー トした後、１ｍｌの反応混合物を取り出し、９ｍｌの冷ＢＳＡ（１％ｗ／ｖ）溶 液に加え、直ちに氷上に置いた。これで、次亜塩素酸塩と微生物との反応を停止 した。試料を１０^-1〜１０^-6に希釈し、種々の希釈液の１００μｌ試料を標識Ｂ ＨＩ−寒天プレートにのせて、１ｍｌ当たりのコロニー形成単位（ＣＦＵ）とし ての生存率を測定した。次いで、プレートを３０℃で１５〜１８時間インキュベ ートした。このインキュベーション期間後に検出可能なＣＦＵが存在しなかった 場合には、プレートを３０℃でさらに２４時間インキュベートする。結果を表II Iに示す。 実施例４ バナジウム含有ハロペルオキシダーゼとヘム含有ハロペルオキシダーゼの殺菌効 率の比較 材料 ： この実施例に用いた細菌株は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＮＣＴＣ ９００、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ ＮＣＴＣ １０９２及 びＬｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ ＡＴＣＣ ３３０９０ 血清型 ６Ｂであっ た。細菌を、ブレインハートインフュージョン（ＢＨＩ）ブロス培地中３０℃で １５〜１８時間増殖させた。培養後、クエン酸緩衝液ｐＨ５．５(２０ｍＭ Ｎａ₃ クエン酸／ＮａＯＨ緩衝液＋１０ｍＭ ＮａＣｌ)中で細菌株を２回洗浄した。 細菌懸濁液をエッペンドルフ遠心分離機で遠 心（１４，０００ｒｐｍで５分）し、次いで、上清を除去した後、細菌ペレット をクエン酸緩衝液に再懸濁した。次いで、各細菌懸濁液に対してこの洗浄手順を もう一度繰り返した。次いで、２回洗浄した細菌懸濁液をクエン酸緩衝液ｐＨ５ ．５で希釈して、約１０⁷細菌／ｍｌの懸濁液を得た。洗浄段階の間、細胞を氷 上に維持した。緩衝液及びＢＳＡ溶液（クエン酸緩衝液ｐＨ５．５中１％ｗ／ｖ ）をフィルター殺菌し、４℃で貯蔵した。 Ｖａｎ Ｓｃｈｉｊｎｄｅｌら（１９９３）に従って、Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ ｉｎａｅｑｕａｌｉｓからクロロペルオキシダーゼを精製した。ヘム含有クロロ ペルオキシダーゼをＳｉｇｍａ（Ｃａｌｄａｒｉｏｍｙｃｅｓ ｆｕｍａｇｏ由 来）から得た。分光光度計で、２０ｍＭ クエン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５．５ 、１０ｍＭ ＮａＣｌ、１００μＭ Ｈ₂Ｏ₂、５０μＭ モノクロロジメドン中３ ０℃で、モノクロロジメドン（ｅ ２９０ｎｍ＝２０．２ｍＭ^-1・ｃｍ^-1）から ジクロロジメドン（ｅ ２９０ｎｍ＝０．２ｍＭ^-1／ｃｍ^-1）への変換を経過観 察して、Ｃｌ^-からＨＯＣｌへの変換におけるクロロペルオキシダーゼ活性を測 定した。１単位のクロロペルオキシダーゼは、１分当た りにモノクロロジメドン（Ｓｉｇｍａ）１μｍｏｌを変換する酵素の量と定義す る。等活性の２種の酵素を投与し得るように、両酵素に対して同一アッセイ（及 び活性の定義）を用いた。方法 ： 無菌法を用い、２０ｍＭ クエン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５．５、１０ｍＭ Ｎ ａＣｌ中約１０⁷細菌／ｍｌの懸濁液を調製した。該懸濁液からの１．９ｍｌア リコートを無菌管に加えた。次いで、それぞれバナジウム含有クロロペルオキシ ダーゼ及びヘム含有クロロペルオキシダーゼの貯蔵溶液から０．１ｍｌを該管に 加えて、両酵素についての希釈液範囲を得た。また、酵素貯蔵溶液の代わりに無 菌緩衝液のみを加えたブランク測定も行った。次いで、０．５ｍｌの２５ｍＭ Ｈ₂Ｏ₂貯蔵溶液を加えた。試料を３０℃できっかり５分間インキュベートした。 インキュベーション後、１ｍｌの反応混合物を取り出し、９ｍｌの冷ＢＳＡ（１ ％ｗ／ｖ）溶液に加え、直ちに氷上に置いた。試料を１０^-1〜１０^-5に希釈し、 種々の希釈液からの１００μｌ試料を標識ＢＨＩ−寒天プレートにのせて、１ｍ ｌ当たりのコロニー形成単位（ＣＦＵ）としての生存率を測定し た。次いで、プレートを３０℃で１５〜１８時間インキュベートした。このイン キュベーション期間後に検出可能なＣＦＵが存在しなかった場合には、プレート を３０℃でさらに２４時間インキュベートする。 結果を表IVに示す。該データは、バナジウム含有クロロペルオキシダーゼが、 等活性で投与されても、ヘム含有クロロペルオキシダーゼよりはるかに有効な衛 生系を提供することを明らかに示している。 実施例５ Ｖ−ＣＰＯの阻止作用に対する種々の過酸化水素源の効果 これまでの実施例では、Ｖ−ＣＰＯ反応における基質の１つである過酸化水素 を貯蔵溶液から加えたが、この実施例では、他の過酸化水素源を用いた場合の効 果を記載する。緩衝液としてクエン酸緩衝液ｐＨ５．５（２０ｍＭ Ｎａ₃クエン 酸／ＮａＯＨ緩衝液＋１０ｍＭ ＮａＣｌ）を用い、酸素消費をモニターする生 物学的酸素モニター（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｏｘｙｇｅｎ Ｍｏｎｉｔｏｒ）Ｙ ＳＩモデル５３００（酸素チャンバーモデル５３０１）中３０℃でオキシダーゼ をアッセイした。緩衝液を３０℃で空気で飽和した。グルコースオキシダーゼ用 の基質として、１５ｇ．１^-1（最終濃度）のグルコースを用いた。この実施例で 用いた細菌株は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＮＣＴＣ ９００であった 。細菌を、ブレインハートインフュージョン（ＢＨＩ）ブロス培地中３０℃で１ ５〜１８時間増殖させた。培養後、クエン酸緩衝液ｐＨ５．５（２０ｍＭ Ｎａ₃ クエン酸／ＮａＯＨ緩衝液＋１０ｍＭ ＮａＣｌ）中で細菌株を２回洗浄した。 細菌懸濁液をエッペンドルフ遠心 分離機で遠心（１４，０００ｒｐｍで５分）し、次いで、上清を除去した後、細 菌ペレットをクエン酸緩衝液に再懸濁した。次いで、各細菌懸濁液に対してこの 洗浄手順をもう一度繰り返した。次いで、２回洗浄した細菌懸濁液をクエン酸緩 衝液ｐＨ５．５で希釈して、約１０⁸細菌／ｍｌの懸濁液を得た。洗浄段階の間 、細胞を氷上に維持した。緩衝液及びＢＳＡ溶液（クエン酸緩衝液ｐＨ５．５中 １％ｗ／ｖ）をフィルター殺菌し、４℃で貯蔵した。貯蔵溶液（１０７，０００ ｐｐｍ）を無菌脱イオン水で希釈して次亜塩素酸塩溶液を調製した。３０％貯蔵 溶液を無菌脱イオン水で希釈して、Ｈ₂Ｏ₂溶液を調製した。Ｄｉｆｃｏからカシ トーンを得た。Ｖａｎ Ｓｃｈｉｊｎｄｅｌら（１９９３）に従って、Ｃｕｒｖ ｕｌａｒｉａ ｉｎａｅｑｕａｌｉｓからクロロペルオキシダーゼを単離・精製 した。Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ由来のグルコースオキシダーゼをＳ ｉｇｍａから得た。方法 ： 無菌法を用い、クエン酸緩衝液ｐＨ５．５中、約１０⁸細菌／ｍｌの懸濁液を 調製した。該懸濁液からの１．３ｍｌアリコートを無菌反応容器に加え、これを 、実験期間中 磁気攪拌機で連続的に撹拌した。次いで、０．５ｍｌの０．５ｍｇ／ｍｌカシト ーン溶液（クエン酸緩衝液ｐＨ５．５中）を加えた。次いで、反応容器に０．２ ｍｌのＶ−ＣＰＯ溶液を加えて、最終濃度６．５ｐｐｍの次亜塩素酸塩を得た。 また、０．２ｍｌのＶ−ＣＰＯ溶液の代わりに０．２ｍｌの無菌緩衝液を加えた ブランク測定も行った。反応容器を３０℃でインキュベートし、次いで、以下の ３種の過酸化水素発生系の中の１種を０．５ｍｌ加えた： １．３ｍＭ 貯蔵溶液からのＨ₂Ｏ₂； ２．３ｍＭ 貯蔵溶液からの過炭酸ナトリウム； ３．グルコースオキシダーゼ（０．３９単位／ｍｌ）と７５ｍｇ／ｍｌのグルコ ースの混合物。 試料を３０℃できっかり５分間インキュベートした。インキュベーション後、 １ｍｌの反応混合物を取り出し、９ｍｌの冷ＢＳＡ（１％ｗ／ｖ）溶液に加え、 直ちに氷上に置いた。これで、次亜塩素酸塩と微生物の反応を停止した。試料を １０^-1〜１０^-6に希釈し、種々の希釈液からの１００μｌ試料を標識ＢＨＩ−寒 天プレートにのせて、１ｍｌ当たりのコロニー形成単位（ＣＦＵ）としての生存 率を測定した。次いで、プレートを３０℃で１５〜１８時間イ ンキュベートした。このインキュベーション期間後に検出可能なＣＦＵが存在し なかった場合には、プレートを３０℃でさらに２４時間インキュベートする。マ イクロポンプを用い、得られた値を全く同量の次亜塩素酸塩を加えたときに得ら れたＭＩＣ値と比較した。これは、以下のようにおこなった。 無菌法を用い、クエン酸緩衝液ｐＨ５．５中、約１０⁸細菌／ｍｌの懸濁液を 調製した。該懸濁液からの１．３ｍｌアリコートを無菌反応容器に加え、これを 、実験期間中磁気攪拌機で連続的に攪拌した。次いで、０．５ｍｌのカシトーン 溶液（クエン酸緩衝液ｐＨ５．５中０．５ｍｇ／ｍｌ）を加えた。次いで、０． ２ｍｌの無菌クエン酸緩衝液ｐＨ５．５を加えた。反応容器を３０℃でインキュ ベートした。次いで、３２．５ｐｐｍの次亜塩素酸塩溶液０．５ｍｌのフラック スを３０℃で５分かけて（流速：毎分０．１ｍｌ）加えた。５分間インキュベー トした後、１ｍｌの反応混合物を取り出し、９ｍｌの冷ＢＳＡ（１％ｗ／ｖ）溶 液に加え、直ちに氷上に置いた。これで、次亜塩素酸塩と微生物の反応を停止し た。試料を１０^-1〜１０^-6に希釈し、種々の希釈液からの１００μｌ試料を標識 ＢＨＩ− 寒天プレートにのせて、１ｍｌ当たりのコロニー形成単位（ＣＦＵ）としての生 存率を測定した。次いで、プレートを３０℃で１５〜１８時間インキュベートし た。このインキュベーション期間後に検出可能なＣＦＵが存在しなかった場合に は、プレートを３０℃でさらに２４時間インキュベートする。結果を表Ｖに示す 。 実施例６ クロロペルオキシダーゼ遺伝子（ｃＤＮＡ）及びＣｕｒｖｕｌａｒｉａ ｉｎａ ｅｑｕａｌｉｓ（Ｃｅｎｔｒａａｌ Ｂｕｒｅａｕ ｖｏｏｒ Ｓｃｈｉｍｍｅｌ ｃｕｌｔｕｒｅｓ，ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ，菌株番号 １０２． ４２）から得た遺伝子並びに可能な発現系のコード配列を決定する方法 Ｖａｎ Ｓｃｈｉｊｎｄｅｌら（１９９３）により記載のＣ．ｉｎａｅｑｕａ ｌｉｓの液体培養体からクロロペルオキシダーゼを単離・精製したが、但し、Ｄ ＥＡＥクロマトグラフィーの後で、ＦＰＬＣ系（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ） を用いて、２段階の追加精製を実施した。先ず、フェニルセファロースＣｌ−４ Ｂ疎水性相互作用カラムを用い、２Ｍ ＮａＣｌの存在下に５０ｍＭ Ｔｒｉｓ− ＨＣｌ（ｐＨ８．３）中で酵素を結合し、次いで、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ８．３）中の２Ｍ ＮａＣｌから下降勾配で溶離した。最終精製として、 ＭｏｎｏＱ ＨＲ ５／５アニオン交換カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ製） を用いて酵素を結合し、次いで、２０ｍＭ ピペラジン−ＨＣｌ（ｐＨ５．４） 中０Ｍ→０．５Ｍ ＮａＣｌ勾配で溶離した。その後、回転蒸発法（ｒｏｔａｔ ｉｏｎ ｅｖａｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いて酵素を濃縮し、次いで、５０ｍＭ Ｔ ｒｉｓ−ＳＯ₄緩衝液（ｐＨ８）に対し透析した。当業界において公知の標準手 順に従い、精製されたクロロペルオキシダーゼをそれぞれプロテアーゼＳｔａｐ ｈｙｌｏｃｏｃｃｕ ｓ Ｖ８及びトリプシンで酵素的に消化するか、又はＣＮＢｒ〔Ｇｒｏｓｓ，Ｅ ．（１９６７）、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １１，２３８−２５５ 〕で化学的に切断した。Ｌａｅｍｍｌｉ〔Ｌａｅｍｍｌｉ，Ｕ．Ｋ．（１９７０ ）Ｎａｔｕｒｅ ２２７，６８０−６８５〕に従ってＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いる か、又はＳｃｈａｇｇｅｒ及びＶｏｎ Ｊａｇｏｗ（１９８７）に従ってトリシ ンゲル上で、得られたペプチドを単離した後、Ｍａｔｓｕｄａｉｒａ（１９８７ ）により記載のＣＡＰＳ転移緩衝液（ｔｒａｎｓｆｅｒ ｂｕｆｆｅｒ）（１０ ｍＭ ３−［シクロヘキシルアミノ］−１−プロパンスルホン酸，１０％メタノ ール，ｐＨ１１）を用い、ＰＶＤＦ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ製Ｉｍｍｏｂｉｌｏ ｎ−Ｐ）に移した。電気泳動溶離した後、膜を脱イオン水で５分間すすぎ、５０ ％メタノール中０．１％のクーマシーブルー Ｒ−２５０で５分間染色、５０％ メタノール、１０％酢酸中室温で１０分間脱色して、風乾した。ペプチドバンド を、Ｐｏｒｔｏｎ ＬＦ ３０００タンパク質配列決定装置（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｉ ｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）上の全自動Ｅｄｍａｎｎシークエン シングにかけた。アミノ酸配列決定の結果を図１に要約する。 ペプチドのアミノ酸配列に基づいて、全ての縮重オリゴヌクレオチドを設計し た（表VII参照）。これらの縮重プライマーを、鋳型として第１鎖ｃＤＮＡを用 いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に用いた。第１鎖ｃＤＮＡを以下のように 作製した： ＲＮＡを単離するために、Ｃ．ｉｎａｅｑｕａｌｉｓの胞子を、１リットル当 たり４ｇの酵母抽出物及び２ｍｌの微量成分溶液（Ｖａｎ Ｓｃｈｉｊｎｄｅｌ ら，１９９３）を含む発酵培地に接種した。数日増殖させた後、菌糸体を濾過し て収穫し、凍結乾燥した。凍結乾燥Ｃ．ｉｎａｅｑｕａｌｉｓ菌糸体を液体窒素 下に粉砕した。ＲＮＡ抽出緩衝液（４２ｍＭ クエン酸ナトリウムｐＨ７、０． ８３％ Ｎ−ラウリルサルコシン、５０ｍＭ β−メルカプトエタノール、１％ト リトン Ｘ−１００及び４Ｍ グアニジンイソチオシアネート）を加えてＲＮＡを 抽出し、室温で１時間インキュベートした。０．１容の２Ｍ 酢酸ナトリウム（ ｐＨ４）及び１容のフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５： ２４：１）を加え、混合物を氷上に１５分間置いた。１０，０００×ｇ（４℃） で１０分間遠心した後、水相を捕集し、１容の無水アルコールを加え、混合 物を−２０℃で１時間インキュベートし、次いで、１０，０００×ｇで軽く遠心 した。ペレットを適量のＲＮＡ抽出緩衝液に再懸濁し、塩化セシウム勾配（Ｓａ ｍｂｒｏｏｋら，１９８９）中での超遠心により分画した。ペレットを慎重に洗 浄し、７５％エタノール溶液中に−７０℃で保存した。ｍＲＮＡを単離するため に、ＲＮＡを沈降させ、ＲＮＡｓｅを含まない水に再懸濁した後、ＰｏｌｙＡｔ ｒａｃｔ ｍＲＮＡ単離キット（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ＵＳ Ａ）を用いてｍＲＮＡを抽出した。Ｐｈａｒａｍａｃｉａ第１鎖ｃＤＮＡ合成キ ット（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用い、Ｃ．ｉｎａｅｑｕａｌｉ ｓから単離したｍＲＮＡ上で第１鎖ｃＤＮＡ合成を行った。クロロペルオキシダ ーゼペプチドのアミノ酸配列（表VIIも参照）に基づいて、４個の２０マー縮重 オリゴヌクレオチドを設計し、鋳型としてＣ．ｉｎａｅｑｕａｌｉｓから得た第 １鎖ｃＤＮＡを用いるポリメラーゼ連鎖反応におけるプライマーとして用いた。 サーモサイクラー(エッペンドルフマスターサイクラー５３３０)及びＴａｑポリ メラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いてポリメラーゼ連 鎖反応を実施した。縮重プライマーを用 いてクロロペルオキシダーゼをコードするｃＤＮＡの最適増幅を得るために、ポ リメラーゼ連鎖反応を４６℃で（アニーリング段階）３０サイクル実施した。得 られた２つの特定のフラグメントをｐＵＣ１８ベクターに連結し、クローン化し て、両方の鎖から配列決定した。ＤＮＡ配列の結果に基づいて、以下の２つの特 定のプライマーを設計した： 及び これら２つのプライマーを、鋳型として第１鎖ｃＤＮＡを用いるポリメラーゼ 連鎖反応に用いた。このようにして、２つの既知ＤＮＡ配列と結合する遺伝子特 異的ＤＮＡフラグメントを得た。このフラグメントをｐＵＣ１８ベクターにクロ ーン化した後、配列決定した。クロロペルオキシダーゼをコードするｍＲＮＡの ５′領域を得るために、５′−Ａｍｐｌｉｆｉｎｄｅｒ ＲＡＣＥキット（Ｃｌ ｏｎｅｔｅｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いた。Ｃ．ｉｎａｅｑｕａｌｉ ｓからゲノムクロロペルオキシダーゼ遺伝子を以下のように単離した： Ｃ．ｉｎａｅｑｕａｌｉｓゲノムＤＮＡを凍結乾燥菌糸体から単離し、液体窒 素下に粉砕、適量の抽出緩衝液（２００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．５， ２５ｍＭ ＥＤＴＡ，２５０ｍＭ ＮａＣｌ，１％ ＳＤＳ及び０．２ｍｇ／ｍｌ プロテイナーゼＫ）で抽出した。室温で一晩インキュベートした後、０．７容の フェノールと０．３容のクロロホルムを加え、激しく攪拌した。管を１０，００ ０×ｇで遠心し、水相を清浄な管に移した。２容の無水エタノールでゲノムＤＮ Ａを沈降させた。５，０００×ｇで５分間遠心した後、ペレットを、２ｍｌの１ ０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０及び１ｍＭ ＥＤＴＡに再懸濁し、製造業 者の推奨に従ってＲＮＡｓｅ(Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ)で処理 した。ゲノムＤＮＡ含有溶液をフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコー ル（２５：２４：１）で抽出し、エタノールで沈降させた後、最後に、適量の１ ０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８、１ｍＭ ＥＤＴＡ緩衝液に溶解した。ゲノム ＤＮＡのサザーン分析を実施するために、ＤＮＡを、数種の制限酵素組合わせで 消化し、アガロースゲル電気泳動後にニトロセルロース膜にブロットした（Ｓａ ｍｂｒｏｏｋら，１９８９）。 α−³²Ｐ標識ｄＡＴＰ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９）を用いるランダムプ ライミングによって作製した、(上記２個の特異的プライマーを用いて増幅した) 放射性標識遺伝子特異的フラグメントを用いてハイブリダイゼーションを実施し た。得られた結果に基づき、Ｐｓｔ Ｉで消化し、ベクターｐＵＣ１８に挿入し たゲノムＤＮＡを用いてミニライブラリーを作製した。該ライブラリーをサザー ンブロット法について記載したものと同じプローブを用いてスクリーニングした 。陽性クローンを単離し、さらに両方の鎖から部分的に配列決定して、ｃＤＮＡ 配列結果を確認した。Ｃ．ｉｎａｅｑｕａｌｉｓクロロペルオキシダーゼをコー ドする遺伝子及びその推定遺伝子産物を図２に示す。 以下のように、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける クロロペルオキシダーゼ産生系を作製した。 Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ野生型ＧＡＬ１遺伝子（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎ ｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １０，４７５７−４７６９，１９９０） からＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩフラグメントとして、周知のＧＡＬ１誘導性酵母プ ロモーターを得、これを、それぞれプラスミドＹＣ ｐｌａｃ３３及びＹＥｐｌａｃ９５〔Ｇｉｅｔｚ及びＳｕｇｉｎｏ（１９８８） Ｇｅｎｅ ７４，５２７−５３４〕のＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨ１部位にクローン化 した。得られたプラスミドをそれぞれＴＮＴ１、ＴＮＴ２と名付けた。ｐＵＣ１ ８にサブクローン化したＣ．ｉｎａｅｑｕａｌｉｓクロロペルオキシダーゼ遺伝 子のＰｓｔＩ ＥｃｏＲＩ５′フラグメントを鋳型として、またプライマーとし てＭ１３／ｐＵＣ２２マー逆方向配列プライマー及び以下のプライマー： を用いてＰＣＲ実験を行い、Ｃ．ｉｎａｅｑｕａｌｉｓクロロペルオキシダーゼ 遺伝子の５′開始部位の前に、ＢａｍＨＩ制限部位を形成した。 増幅したフラグメントをＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩで消化した。Ｃ．ｉｎａｅ ｑｕａｌｉｓクロロペルオキシダーゼ遺伝子からその３′部分を含むＥｃｏＲＩ −ＰｖｕＩＩフラグメントを、ＥｃｏＲＩ ＳｍａＩ消化ｐＵＣ１８にサブクロ ーン化した。このクローンをＥｃｏＲＩ及びＸｂａＩで消化した後、該クローン からＣ．ｉｎａｅｑｕａｌｉｓクロロペルオキシダーゼ遺伝子の３′部分を含む フラグ メントを精製した。 それぞれＢａｍＨＩ及びＸｂａＩで消化したＴＮＴ１又はＴＮＴ２、並びに５ ′ＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩフラグメント及び３′ＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩフラグメ ントからなる３つの部分の連結反応を実施した。連結・クローン化後、得られた プラスミドの同定を行った。このようにして得られたプラスミドをそれぞれＴＮ Ｔ３（ＴＮＴ１由来）及びＴＮＴ４（ＴＮＴ２由来）と名付けた。 当業界において公知の手順に従い、酵母株ＢＪ１９９１をプラスミドＴＮＴ３ 及びＴＮＴ４で形質転換し、ｕｒａ＋ 形質転換体について選択した。ｕｒａ＋ 形質転換体をグルコース（２％）又はガラクトース（２％）を含むＹＰ−プレー トに複製した。増殖後、該プレートから数個の細胞を取り出し、２００μｌの２ ０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ８．１に再懸濁した。５分間インキュベートした 後、該溶液から１０μｌを採取し、ニトロセルロースフィルター上にスポットし た。ニトロセルロースフィルターを１００ｍＭ 酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５ ．５）、１ｍＭ オルトジアニシジン、１００ｍＭ ＫＢｒ及び２ｍＭ Ｈ₂Ｏ₂中 でインキュベートした。透明な色の形成がガラクトース 増殖酵母由来の全ての斑点に認められたのに対し、グルコース増殖酵母には認め られなかった。これは、酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａ ｅ中にＣｕｒｖｕｌａｒｉａ ｉｎａｅｑｕａｌｉｓクロロペルオキシダーゼ遺 伝子のガラクトース誘導性産生系が構築されたことを示している。１００ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）、１００ｍＭ ＫＢｒ、１ｍＭ Ｈ₂Ｏ₂及び ４０μＭ フェノールレッド（ＢＤＨ）を用いた同様なアッセイにおいて、ガラ クトース増殖酵母から得た溶液には青紫色が形成されたのに対し、グルコース増 殖酵母から得た溶液には色の変化が生じなかったことが明らかに示された。酵母 中の異種クロロペルオキシダーゼ遺伝子発現系が、Ｃ．ｉｎａｅｑｕａｌｉｓク ロロペルオキシダーゼと同じ機能性を有するＣ．ｉｎａｅｑｕａｌｉｓクロロペ ルオキシダーゼを産生させたことをさらに確認するために、ガラクトース誘導Ｔ ＮＴ３又はＴＮＴ４で形質転換した酵母株から組換え酵素を精製した。ガラクト ース含有培地中で増殖させた後、酵母細胞を収穫し、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ ｌ（ｐＨ８．１）に再懸濁した。次いで無菌ガラスビーズを加え、懸濁液を激し く振盪した。１０，０００×ｇで１５分間遠 心した後、上清を取り、ＤＥＡＥカラムに加え、野生型Ｃ．ｉｎａｅｑｕａｌｉ ｓ酵素（上記参照）の場合と実質的に同じ精製プロトコルを用いて組換え酵素を 精製した。精製後、２２Ｕ／ｍｇ タンパク質の比活性（１００ｍＭ 酢酸ナトリ ウム緩衝液ｐＨ５．０、１ｍＭ Ｈ₂Ｏ₂、５ｍＭ 塩化カリウム及び５０μＭ Ｍ ＣＤ中で測定、Ｖａｎ Ｓｃｈｉｊｎｄｅｌら，１９９３も参照）を有する組換 えクロロペルオキシダーゼを得た。該活性は、Ｃ．ｉｎａｅｑｕａｌｉｓ自体か ら精製された（上記参照）クロロペルオキシダーゼを用いて得られた比活性 約 ２０Ｕ／ｍｇ タンパク質と極めて類似している。野生型クロロペルオキシダー ゼと酵母から誘導された組換えクロロペルオキシダーゼのｐＨ活性プロフィール を図３に示す。図３は、組換え酵母産生酵素が野生型酵素と同じ機能性を有して いることをさらに実証している。実施例７ 他の微生物中の適当なハロペルオキシダーゼのスクリーニング この実施例に用いた微生物は、Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ ｉｎａｅｑｕａｌｉｓ （ＣＢＳ １０２．４２）、Ｄｒｅｃｈ ｓｌｅｒａ ｂｉｓｅｐｔａｔａ（ＣＢＳ ３７１．７２）、Ｄｒｅｃｈｓｌｅｒ ａ ｆｕｇａｘ（ＣＢＳ ５０９．７７）、Ｄｒｅｃｈｓｌｅｒａ ｎｉｃｏｔｉ ａｅ（ＣＢＳ ６５５．７４）、Ｄｒｅｃｈｓｌｅｒａ ｓｕｂｐａｐｅｎｄｏｒ ｆｉｉ（６５６．７４）、Ｅｍｂｅｌｉｓｉａ ｈｙａｃｉｎｔｈｉ（４１６． ７１）、Ｅｍｂｅｌｉｓｉａ ｄｉｄｙｍｏｓｐｏｒａ（ＣＢＳ ７６６）、Ｕｌ ｏｃｌａｄｉｕｍ ｃｈａｒｔａｒｕｍ（２００．６７）及びＵｌｏｃｌａｄｉ ｕｍ ｂｏｔｒｙｔｉｓ（４５２．７２）である。種々の菌類を寒天プレート上 で増殖させる。増殖が完了したら、細胞外タンパク質を、予め５０ｍＭ Ｔｒｉ ｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．３）中で湿潤させておいたニトロセルロースフィル ターに移す（レプリカブロットする）。寒天プレート上で１５分間インキュベー ションした後、０．１Ｍ 臭化カリウムの存在又は不在下に、１００ｍＭ 酢酸ナ トリウム（ｐＨ５．５）又はリン酸カリウム（ｐＨ６．５及び７．５）、１ｍＭ オルトジアニシジン、２ｍＭ 過酸化水素中にフィルターを浸漬させて、ハロペ ルオキシダーゼ活性についてフィルターをテストした。このようにして、ブロモ ペルオキシダーゼ及び／又はクロロペルオキシダーゼの産 生を検出し得る。産生されたハロペルオキシダーゼがバナジウム含有ハロペルオ キシダーゼであるかどうかをテストするために、１０μＭ及び１００μＭ バナ ジン酸ナトリウムの存在及び不在下に上記テストを繰り返した。バナジウム含有 ハロペルオキシダーゼの場合には、バナジン酸塩を追加するとシグナルの増加が 認められた。同定されたクロロペルオキシダーゼが実際にＣ．ｉｎａｅｑｕａｌ ｉｓから得られたバナジウムハロペルオキシダーゼに類似しているかどうかをテ ストするために、Ｕｌｏｃｌａｄｉｕｍ ｃｈａｒｔａｒｕｍ、Ｅｍｂｅｌｉｓ ｉａ ｄｉｄｙｍｏｓｐｏｒａ及びＤｒｅｃｈｓｌｅｒａ Ｓｕｂｐａｐｅｎｄｏ ｒｆｉｉから少量のクロロペルオキシダーゼを精製した（Ｖａｎ Ｓｃｈｉｊｎ ｄｅｌら，１９９３による記載と実質的に同様に）。これらの酵素の最適ｐＨは 、ｐＨ４．５〜５．５の範囲で変動した。該酵素の塩素化活性はバナジン酸塩を 添加すると増大したが、これは、該酵素が実際にバナジウムハロペルオキシダー ゼであることを明瞭に示している。同定された酵素とＣ．ｉｎａｅｑｕａｌｉｓ バナジウムクロロペルオキシダーゼとの類似性をさらにテストするために、同定 されたハロペルオキシダーゼの中の１種 をさらに特性決定した。このために、真菌類Ｄｒｅｃｈｓ ｌｅｒａ ｂｉｓｅｐ ｔａｔａ（ＣＢＳ ３７１．７２）により産生されたクロロペルオキシダーゼを 選択した。該クロロペルオキシダーゼは、高い熱安定性及びその基質に対して高 親和性を有するＣｕｒｖｕｌａｒｉａ ｉｎａｅｑｕａｌｉｓ由来クロロペルオ キシダーゼに類似の特性を有している。さらに、精製された酵素のＥＰＲスペク トルも記録した。他のバナジウムハロペルオキシダーゼ（ｄｅ Ｂｏｅｒら，１ ９８８；Ｗｅｖｅｒら，１９８８）については、酸化酵素は観察されるＥＰＲス ペクトルを全く示さないが、亜ジチオン酸ナトリウムで還元すると、典型的なバ ナジルＥＰＲスペクトルが認められた（データは示さず）。ｇ₀が１．９６９で 、Ａ₀が９．０ｍＴの等方性ＥＰＲパラメーターは、Ｃ．ｉｎａｅｑｕａｌｉｓ （Ｗｅｖｅｒら，１９８５）由来の酵素に認められたものと殆ど同じであった。 さらに、プロテアーゼ及び臭化シアンを用いて、精製された酵素をペプチドに分 離した。ペプチドマップは同一パターンを示し、これは、これら２種の酵素が高 い配列相同性を有していることを示唆している。これは実際に、プロテアーゼで 処理して得られ且つ精製さ れた酵素の２つの別々のペプチドが配列決定されたということである。これらの 配列は極めて高い相同性を示し、従って、これら２種の酵素は極めて類似してい ると結論し得る。 Ｃ．ｉｎａｅｑｕａｌｉｓ由来ペプチドのアミノ酸配列： （ａｓｐ）−ｌｅｕ−ａｒｇ−ｇｌｎ−ｐｒｏ−ｔｙｒ−ａｓｐ−ｐｒｏ−ｔｈ ｒ−ａｌａ−ｐｒｏ−ｉｌｅ−ｇｌｕ−ａｓｐ−ｇｌｎ−ｐｒｏ−ｇｌｙ−ｉｌ ｅ−ｖａｌ−ａｒｇ−ｔｈｒ− Ｄ．ｂｉｓｅｐｔａｔａから得た類似ペプチドのアミノ酸配列： ａｓｐ−ｌｅｕ−ａｒｇ−ｇｌｎ−ｐｒｏ−ｔｙｒ−ａｓｐ−ｐｒｏ−ｔｈｒ− ａｌａ−ｐｒｏ−ｉｌｅ−ｇｌｕ−ｇｌｕ−ｇｌｎ−ｐｒｏ−ｇｌｙ−ｉｌｅ− ｖａｌ−ａｒｇ−ｔｈｒ− 従って、適当なバナジウム含有ハロペルオキシダーゼは、バナジン酸塩添加後 の活性の増大をテストするレプリカ法を用いて及び／又は酵素を（部分的に）精 製してバナジン酸塩添加後の活性の増大を調べることにより同定し得る。実施例８ 抗体を用いた、他の微生物中の適当なクロロペルオキシダーゼのさらなるスクリ ーニング この実施例で用いた株は、Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ ｉｎａｅｑｕａｌｉｓ（Ｃ ＢＳ １０２．４２）、Ｄｒｅｃｈｓｌｅｒａ ｂｉｓｅｐｔａｔａ（ＣＢＳ ３ ７１．７２）、Ｄｒｅｃｈｓｌｅｒａ ｓｕｂｐａｐｅｎｄｏｒｆｉｉ(ＣＢＳ ６５６．７４)、Ｅｍｂｅｌｌｉｓｓｉａ ｄｉｄｙｍｏｓｐｏｒａ（ＣＢＳ ７ ６６．７９）及びＵｌｏｃｌａｄｉｕｍ ｃｈａｒｔａｒｕｍ（ＣＢＳ２００． ６７）である。 微生物を２段階で増殖させた。第１段階では、５０ｍｌの無菌発芽培地（Ｖａ ｎ Ｓｃｈｉｊｎｄｅｌら，１９９３に記載）に微生物の胞子団を接種した。２ ３℃で３日間振盪した後、培養体を、１リットルの発酵培地〔脱イオン水１リッ トル中、５ｇのカゼイン水解物（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）、３ｇの酵母抽出物及び １ｇのフルクトース〕を含む３リットル三角フラスコに移した。２３℃で振盪し た培地を１４〜１７日後に捕集し、濾過して、実質的にＶａｎ Ｓｃｈｉｊｎｄ ｅｌら（１９９４）に従ってクロロペルオキシダーゼを精製した。（２ケ月齢の メス）ウサギ中で、Ｃ ｕｒｖｕｌａｒｉａ ｉｎａｅｑｕａｌｉｓから精製した（Ｖａｎ Ｓｃｈｉｊｎ ｄｅｌら，１９９４）クロロペルオキシダーゼに対してポリクローナル抗体を産 生させた（最初の注射にはフロイントの完全アジュバントを用い、免疫追加注射 にはフロイントの不完全アジュバントを用いた）。最後の追加免疫注射の６日後 にウサギから出血させた。５６℃で３０分間血清を加熱して補体を不活化し、次 いで遠心した。上清を取り出した。それぞれ精製クロロペルオキシダーゼ及びＡ ｓｃｏｐｈｙｌｕｍ ｎｏｄｏｓｕｍ由来ブロモペルオキシダーゼ（Ｗｅｖｅｒ ら，１９８５に従って精製した）から、５０μｌの各タンパク質（約０．１ｍｇ ／ｍｌ）から出発する希釈系列を調製し、各試料を逐次２倍希釈した。ドットブ ロット装置（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用い、ニトロセルロースフィルター上に希釈液 をスポットし、２％ＢＳＡで洗浄して、順次、ウサギ抗クロロペルオキシダーゼ 抗血清（希釈率１：８００）、ビオチニル化ヤギ抗ウサギ（希釈率１：３０００ ）、アルカリホスファターゼ結合ストレプトアビジン（希釈率１：２０００）及 び発色剤〔５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート、４−Ｎｉｔ ｒｏＢｌｕｅ Ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ クロリド（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）〕と共にインキュベート した。全ての段階を標準プロトコルに従って実施した。得られた結果を表VIに示 す。 表VIに示されている結果に基づき、Ｃ．ｉｎａｅｑｕａｌｉｓクロロペルオキ シダーゼに対して産生された抗体を用いたイムノアッセイは、他の適当なバナジ ウム含有ハロペルオキシダーゼの同定に適していると結論し得る。これらのハロ ペルオキシダーゼは粗製形態であっても、部分的又は完全に精製された形態であ ってもよい。精製法は、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互 作用クロマトグラフィー、沈降法、（限外）濾過法、アフィニ ティークロマトグラフィー、ゲル電気泳動などのような当業界において公知のい ずれの方法であってもよい。実施例９ 他の微生物中の適当なクロロペルオキシダーゼのさらなるスクリーニング この実施例では、Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ ｉｎａｅｑｕａｌｉｓ由来クロロペ ルオキシダーゼ遺伝子から誘導された放射性プローブを用いて他の微生物中の同 種遺伝子を検出する方法を記載する。これは以下のようにして行った。 Ｃ．ｉｎａｅｑｕａｌｉｓ（ＣＢＳ １０２．４２）、Ｅｍｂｅｌｉｓｓｉａ ｄｉｄｙｍｏｓｐｏｒａ（ＣＢＳ ７６６．７９）及びＤｒｅｃｈｓｌｅｒａ ｂ ｉｓｅｐｔａｔａ（ＣＢＳ ３７１．７２）由来の染色体ＤＮＡを、実質的にＣ ．ｉｎａｅｑｕａｌｉｓ染色体ＤＮＡについての記載と同様に（実施例６に記載 のように）精製した。ゲノムＤＮＡのサザーン分析をするために、ＤＮＡを数種 の制限酵素組合わせで消化し、アガロースゲル電気泳動後に、ニトロセルロース 膜（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９）にブロットした。α−³²Ｐ標識ｄＡＴＰを 用いたランダムプライミング（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９）により作製した 放射性標識遺伝子特異的フラグメントを用いてハイブリダイゼーションを実施し た。用いた遺伝子特異的フラグメントを、鋳型として第１鎖ｃＤＮＡ（実施例６ 参照）を用い、以下のプライマー： を利用して、ポリメラーゼ連鎖反応で増幅した（放射性標識する前に）。 ハイブリダイゼーション条件は以下の通りであった。 予備ハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションにおいて、６＊ＳＳ ＰＥ、５＊Ｄｅｎｈａｒｄｔｓ、０．５％ＳＤＳ及び１０ｍｇのサケ精子ＤＮＡ を緩衝液として用いた。５５℃で１時間予備ハイブリダイゼーションを行い、次 いで、放射性プローブを１分間煮沸し、そのまま加えた。その後で、ハイブリダ イゼーションを一晩継続した。Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ ｉｎａｅｑｕａｌｉｓ及 びＤｒｅｃｈｌｅｒａ ｂｉｓｅｐｔａｔａのＤＮＡを用いて得られたオートラ ジオグラフを図４に示す。該図において、レーン１：λＤＮＡ；レーン２：非消 化Ｃ．ｉｎａｅｑｕａｌｉｓゲノムＤＮＡ；レーン３：ＥｃｏＲＩで消化した該 ＤＮＡ；レーン４：ＢａｎＨｉで消化した該ＤＮＡ；レーン５：ＥｃｏＲＩ及び ＢａｍＨＩで消化した該ＤＮＡ；レーン６：ＸｂａＩで消化した該ＤＮＡ；レー ン７：ＰｓｔＩで消化した該ＤＮＡ；レーン８：ＸｂａＩ及びＰｓｔＩで消化し た該ＤＮＡ；レーン９〜１４：Ｄ．ｂｉｓｅｐｔａｔａｔａを用いた前述と同様 なものである。該図に見られるように、Ｄｒｅｃｈｓｌｅｒａ ｂｉｓｅｐｔａ ｔａから得た染色体ＤＮＡで陽性シグナルが得られるが、これは、両遺伝子の高 度の類似性を示している。Ｅｍｂｅｌｌｉｓｉａ ｄｉｄｙｍｏｓｐｏｒａから 得たＤＮＡでも同様な結果が得られた。従って、該遺伝子から誘導されたクロロ ペルオキシダーゼ遺伝子若しくはその一部又はＣ．ｉｎａｅｑｕａｌｉｓクロロ ペルオキシダーゼ遺伝子配列をベースとするプローブを用いて、他の微生物から の適当なバナジウムハロペルオキシダーゼを検出することが可能であると結論し 得る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:645） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)， ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｈ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ， ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 シモンズ，ランベルタス・ヘンリカス オランダ国、1183・カー・ハー・アムステ ルフエーン、カメラ・オツプスクララー ン・368 (72)発明者 テル・ステーフ，ピーター・フエルデイナ ンド オランダ国、2803・エル・ハー・ゴーダ、 ケルフエルハールデ・５ (72)発明者 ウエーバー，ロナルド オランダ国、1622・ハー・ヘー・ホーン、 ホウツアーヒモレン・62

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．バナジウムハロペルオキシダーゼ、ハロゲン化物源及び過酸化水素又は過酸 化水素源を含む酵素的抗菌組成物。 ２．バナジウムハロペルオキシダーゼがクロロペルオキシダーゼである、請求項 １に記載の酵素的抗菌組成物。 ３．バナジウムハロペルオキシダーゼがＣｕｒｖｕｌａｒｉａ ｉｎａｅｑｕａ ｌｉｓから得ることができるクロロペルオキシダーゼである、請求項１又は２に 記載の酵素的抗菌組成物。 ４．バナジウムハロペルオキシダーゼが、Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ ｉｎａｅｑｕ ａｌｉｓ ＣＢＳ １０２.４２と免疫学的に交差反応性であるクロロペルオキシ ダーゼである、請求項１から３のいずれか一項に記載の酵素的抗菌組成物。 ５．過酸化水素源が酵素的過酸化水素発生系である、請求項１から４のいずれか 一項に記載の酵素的抗菌組成物。 ６．酵素的過酸化水素発生系が、グルコース／グルコースオキシダーゼ又は乳酸 塩／乳酸オキシダーゼである、請求項５に記載の酵素的抗菌組成物。 ７．実質的にカタラーゼ活性を有していない、請求項１か ら６のいずれか一項に記載の酵素的抗菌組成物。 ８．殺菌すべき表面に、請求項１から７のいずれか一項に記載の組成物を適用す ることを含む、微生物の増殖を阻止する方法。 ９．衛生化剤としてのバナジウムハロペルオキシダーゼの使用。 １０．Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ ｉｎａｅｑｕａｌｉｓ ＣＢＳ １０２.４２由来バ ナジウムクロロペルオキシダーゼをコードする構造遺伝子を含むＤＮＡ配列。 １１．図２に示されているＣｕｒｖｕｌａｒｉａ ｉｎａｅｑｕａｌｉｓ ＣＢＳ １０２．４２由来バナジウムクロロペルオキシダーゼをコードする構造遺伝子 を含むＤＮＡ配列。 １２．複製起源、転写及び終結調節配列、並びに請求項１０又は１１に記載のＤ ＮＡ配列の少なくとも一部を含む発現ベタター。 １３．請求項１２に記載の発現ベクターを用いて適当な宿主を形質転換し、構造 遺伝子を発現させ得る条件下に該宿主を培養し、バナジウムハロペルオキシダー ゼを単離することによる、バナジウムハロペルオキシダーゼの製造方法。