JPH09511399A - アファミン：ヒト血清アルブミン様タンパク質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 この発明は、ヒト血清アルブミン、ヒトαフェトプロテイン、又はヒトビタミンＤ結合タンパク質と共通の１つ以上の活性を有し、且つＳＤＳ−ＰＡＧＥによる見掛け分子量が８７ｋｄであるＡＦＭと称する新規のヒト血清タンパク質と、その変異体と、関連する遺伝子、ベクター、細胞、並びに方法に係わる。

Description

【発明の詳細な説明】 アファミン：ヒト血清アルブミン様タンパク質 発明の分野 本発明は概して、関連するタンパク質：ヒト血清アルブミン（ＡＬＢ）、ヒト α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）及びビタミンＤ結合タンパク質（ＶＤＢ）に機 能的、構造的に類似のヒト血清タンパク質の分野に関する。発明の背景 ヒト血清タンパク質アルブミン（ＡＬＢ）、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ） 及びビタミンＤ結合タンパク質（ＶＤＢ）は、多遺伝子ＡＬＢファミリーのメン バーであることが知られている。３種のタンパク質はいずれも血清中に認められ 、血清中で多様なリガンドの輸送を媒介する。ＡＬＢは、脂肪酸、アミノ酸、ス テロイド、グルタチオン、金属、ビリルビン、リゾレシチン、ヘマチン、プロス タグランジン及び医薬剤に結合する（総説については文献１を参照）。ＡＦＰは 、脂肪酸、ビリルビン及び金属に結合する（２、３参照）。ＶＤＢは、ビタミン Ｄ及びその代謝産物並びに脂肪酸、アクチン、Ｃ５ａ、及びＣ５ａのＡｒｇ欠失 体に結合する（４〜７参照）。 ＡＬＢファミリーのタンパク質は、その輸送能力に加えて、多岐にわたる他の 機能活性を有している。ＡＬＢは、血漿のコロイド浸透圧に主に寄与し、酸素遊 離ラジカルのスカベンジャーとして作用し、銅刺激による脂質の過酸化、過酸化 水素の放出及び好中球の拡散を阻害し得る（１、８〜１０参照）。ＡＦＰは、免 疫過程の調節（１１〜１４参照）に係わりがあり、ＶＤＢは、好中球の共走化性 因子（６及び１５参照）として、またマクロファージの活性化因子（１６参照） として作用し得る。 ＡＬＢファミリータンパク質の血清レベルが種々の病的症状に敏感であること も知られている。ＡＬＢは、ストレスを受けるとそのレベルが減少する陰性急性 期タンパク質（１７参照）である。ある種の発育障害（１８、１９参照）を有す る胎児を孕んでいる女性、及び肝癌、奇形癌、遺伝性チロシン血症又は毛細管拡 張性運動失調（２０〜２４参照）に罹患している患者ではＡＦＰレベルが増大す る。ＶＤＢレベルは、敗血症性ショック（２５参照）又は電撃性肝性壊死（２６ 、２７参照）に罹患している患者では減少する。 ＡＬＢファミリーのメンバーは有意な構造類似性をも有 している。既に一次アミノ酸配列レベルにおいて相同性が認められており、また 十分に保存されたパターンのＣｙｓ残基も存在するので、類似の二次構造が予測 される（２８〜３２参照）。ＡＬＢファミリー遺伝子は、類似のエキソン／イン トロン構造（３３〜３６参照）を有し、いずれもヒト４番染色体の４ｑ１１〜ｑ ２２領域内にマッピングされている（３７、３８参照）。 ヒト「アファミン」（Ａｆａｍｉｎ）（「ＡＦＭ」と略記する）は、分子量８ ７，０００ダルトンの新規な血清タンパク質である。ＡＦＭはアルブミンファミ リーのメンバーと極めて類似しており、該ファミリーに認められる特徴的なパタ ーンのジスルフィド結合を有している。さらに、該遺伝子は、アルブミン遺伝子 ファミリーの他のメンバーと同様、４番染色体に位置する。従って、ＡＦＭはア ルブミンファミリータンパク質の第４のメンバーである。ＡＦＭのｃＤＮＡをチ ャイニーズハムスターの卵巣細胞に安定にトランスフェクトし、組換えタンパク 質（ｒＡＦＭ）をならし培地から精製した。ｒＡＦＭ及びヒト血清から精製した ＡＦＭはともに、ＡＦＭの推定アミノ酸配列から誘導された合成ペプチドに対し て産生されたポリクローナル抗 体と反応する。ＡＦＭは、ＡＬＢ、ＡＦＰ及びＶＤＢと共通の特性及び生物学的 活性を有していると予測される。 「発明の背景」に記載された刊行物 以下の項は、ＡＬＢ、ＡＦＰ及びＶＤＢに関して現在入手し得る背景情報の要 約及びこれらの公知タンパク質に関する追加刊行物のリストを含む。 Ｉ．ヒト血清アルブミン ヒト血清アルブミンは、血漿のコロイド浸透圧に寄与することにより血漿の量 及び組織液の平衡の調節を司る重量な因子である。通常、アルブミンは、血漿タ ンパク質の５０〜６０％を構成し、その比較的低い分子量（６６，３００〜６９ ，０００）のために、血液のコロイド浸透圧の８０〜８０％を付与する。 ＡＬＢの最も良く知られている機能には、血管通過液の流れ、従って血管内及 び血管外の液量並びに脂質及び脂質可溶性物質の輸送の調節が含まれる。ＡＬＢ 溶液は、やけど、手術、出血、又は循環量の不足が存在する他の外傷若しくは症 状を含む特定のタイプのショック又は切迫ショックの治療における血漿量の増大 及び心拍出量の維持に用いられることが多い。赤血球欠乏の程度によっては、全 血又は赤血球の輸血も必要となり得る。 ＡＬＢ濃厚溶液を静脈内（IV）投与すると、間質空間からの体液が循環系に移 動するようになり、血漿タンパク質 の濃度が僅かに増大する。各容量の２５％ＡＬＢ溶液を、十分に水分を補給した 患者に静脈内投与すると、１５分以内に約３．５容量の追加液が循環系に吸い込 まれ、血液濃度及び血液粘度が下がる。循環血液量が低減した（出血又は滲出物 を介して若しくは血管外空間への体液の流失による）患者においては、血液希釈 は何時間も続くが、正常な血液量を有する患者では、過剰の体液及びタンパク質 は数時間内に循環系から失われる。一般に脱水症状の患者の場合、追加液を投与 しない限り、ＡＬＢによる臨床的な改善は殆ど又は全く得られない。 ＡＬＢは結合アミノ酸をいくらか含んではいるが、それは、限られた栄養効果 を提供するに過ぎない。ＡＬＢは中間代謝物（ビリルビンを含む）、微量金属、 ある種の薬剤、染料、脂肪酸、ホルモン及び酵素に結合し、それらのキャリヤー として機能し、従って、組織産物の輸送、失活及び／又は交換に作用する。 ＡＬＢは、他の多くの生体機能にも関与するが、該機能のいくつかが最近にな って示唆されたに過ぎず、おそらく他の機能は未だ認識されていない。アルブミ ンの独特な特性の中で認識されたものには：（ａ）毒性産物の結合、従 ってその失活；（ｂ）血漿、並びに内在性及び外から投与された物質や薬剤の血 漿及び間質液濃度の調節；（ｃ）抗凝血への関与；（ｄ）タンパク質に対する微 小血管透過性の維持；及び（ｅ）遊離ラジカルの捕集及び脂質の過酸化の阻止が 含まれる。この最後の特性は、特に、遊離ラジカルが、組織の酸化による直接的 な損傷、またａ₁−ＰＩ及びＡＴ−IIIのような重要な抗プロティナーゼの失活に よる間接的な組織損傷における主因であると考えられる炎症性疾患症状において 極めて重要であることがわかる。 以下は、文献に報告されているＡＬＢの多くの有用性についてのより詳細な要 約である。 Ａ．ＡＬＢの機能 ・ コロイド浸透圧に寄与し、それによって循環系からの水分の流失を阻止する ； ・ 恐らく内皮上で同定された特異的アルブミンレセプターを介して、脂肪酸（ 主として長鎖のもの）、アミノ酸（Ｃｙｓ及びＴｒｐ）、ステロイド、グルタチ オン、金属（Ｃａ、Ｚｎ）、ビリルビン、リゾレシチン、ヘマチン、プロスタグ ランジン及び医薬品の肝臓、腸、腎臓及び脳への輸送、分配、代謝を助ける； ・ 血管内及び血管外の脂肪酸の貯蔵所としての役割を果たす（ＡＬＢの６０％ は血管外に認められる）； ・ ＡＬＢの同様な使用を示唆する、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）に結合させ ることによるドキソルビシン（ＤＸＲ）の修飾、及びＤＸＲのみ（動物モデルの ）の場合と比較した、おそらくＢＳＡ−ＤＸＲの排出の減少によると考えられる ＤＸＲの化学療法効能の改善； ・ Ｃｕにより刺激される脂質の過酸化及び赤血球膜の溶血を阻止する（酸化防 止剤として作用する）； ・ ＨＯＣｌ及びペルオキシラジカルを捕集する； ・ 脂肪酸に結合して該酸の過酸化を防止する； ・ 内因性酸化防止作用を殆ど有していない体液（例えば、眼液及び能脊髄液） 中で保護作用を付与し得る； ・ 尿における高レベルのＡＬＢは、糖尿病の初期腎性病変を検出するための診 断薬である； ・ ショック症状をなくすための投与及び呼吸窮迫症候群に罹患している新生児 に対する投与； ・ 急性間欠性ポルフィリン症を治療するためのヘマチン用ビヒクルとして投与 ； ・ 全血清の代わりに組織培養に使用； ・ スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）に結合すると、血清半減期の増大 によりＳＯＤの効果を高める； ・ 微小球状ＡＬＢは治療薬の担体として有用である； ・ 過酸化水素の放出及び好中球の拡散を阻止する。 Ｂ．ＡＬＢに関する刊行物 II．α−フェトプロテイン α−フェトプロテイン（ＡＦＰ；分子量 ７０，０００）は、発育中に産生さ れる主要な血清タンパク質であり、主として胎児の肝臓及び卵黄嚢細胞で産生さ れる。その合成は、出生後には著しく減少し、大人の血清中には微量存在するに 過ぎない。大人の血清レベルの増大は肝癌又は卵黄嚢腫瘍の徴候である。という のは、これらの腫瘍がＡＦＰを産生するからである。ＡＦＰと胎児の発育並びに 上記タイプの悪性腫瘍との特異的な関係は多大な興味の対象となり、ＡＦＰの構 造及びその遺伝子、遺伝子発現の調節並びに生物学的機能について多くの研究が 行われている。 ＡＬＢと同様にＡＦＰは、不飽和脂肪酸、エストロゲン、ビリルビン、銅及び ニッケルイオンなどのような種々のリガンドに結合することが示された。さらに ＡＦＰは、多くの異なる実験室からの多様な系における免疫過程を調節するとも 言われているが、その結果は論議の的である。 以下は、文献で入手可能なＡＦＰの有用性についてのより詳細なリストである ： Ａ．ＡＦＰの機能 ・ 不飽和脂肪酸、エストロゲン、ビリルビン、Ｃｕ、Ｎ ｉに結合する； ・ 胎児の発育不全を示す妊娠中の女性の羊水レベルの増大； ・ 遺伝性チロシン血症又は毛細管拡張性運動失調（胸腺及び肝臓の組織分化に おける欠陥を特徴とする常染色体の劣性障害）にも認められる高レベル； ・ ＮＫ細胞活性を阻害する； ・ サプレッサーＴ細胞を誘発させる； ・ ＰＨＡ及びＣｏｎＡに対するリンパ球のマイトジェン応答を阻害する； ・ Ｉａ決定基に対するＴ細胞増殖を阻害する； ・ マクロファージ貧食作用及びＩａ発現を低下させる； ・ ブタ顆粒膜細胞によるＦＳＨ媒介エストラジオールの産生を阻害する； ・ ブタ顆粒膜細胞の成長因子媒介細胞増殖を促進する。 Ｂ．ＡＦＰに関する刊行物 III．ビタミンＤ結合タンパク質 グループ特異的成分（Ｇｃ；ＶＤＢ）は、分子量５１，０００のα₂−グロブ リンである。ＶＤＢは、肝臓で合成される、血漿中の主要ビタミンＤ結合タンパ ク質である。ＶＤＢは、ヒト母集団中に３種の共通な遺伝表現型：Ｇｃ１、Ｇｃ ２及びＧｃ２−１として出現する。ＶＤＢはＧ−アクチンにも結合し、リンパ球 膜上のＩｇＧと空間的に会合しているとも報告されている。 以下は、文献で入手可能なＶＤＢの有用性についての詳細なリストである：Ａ．ＶＤＢの機能 ・ 恐らく血漿中での輸送のために、セコステロイド、ビタミンＤ並びにその誘 導体２５−ヒドロキシビタミンＤ及び１，２５−ヒドロキシビタミンＤに結合す る； ・ １，２５−ビタミンＤは単球を分化し、ＶＤＢはこれを阻害する； ・ アクチンと結合する（アクチン重合体の組み立てを妨げる）； ・ 不飽和脂肪酸（例えば、アラキドン酸）に結合する； ・ Ｃ５ａ及びＣ５ａのＡｒｇ欠失体に結合し、好中球の 共走化性因子として作用する； ・ マクロファージの活性化因子として作用する。 Ｂ．ＶＤＢに関する刊行物 ５１．Ｗａｔｔ，Ｇ．Ｈ．ら，Ｃｉｒｃｕｌａｔｏｒｙ Ｓｈｏｃｋ ２８，２７９−２９１（１９８９）． 本発明のタンパク質、ＡＦＭ、は、ＡＬＢ、ＡＦＰ及びＶＤＢと極めて類似し た構造を有し、従って、上記の公知タンパク質が有する上記の有用性及び活性を 共有していると考えられる。発明の要旨 本出願人は、リポ多糖（ＬＰＳ）でコーティングした赤血球がヒトマクロファ ージに結合することを阻害し得る血清タンパク質を精製するための実験の間に、 アポリポタンパク質Ａ１（ＡｐｏＡ１）と同時精製される新規のヒトタンパク質 を精製した。この新規タンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけると、８７，００ ０の見かけ分子量を有しており、ＡＦＭと称される。本出願人は、本明細書にＡ ＦＭのｃＤＮＡのクローン化を記載し、ＡＦＭが構造的にも機能的にもＡＬＢフ ァミリーの他のメンバーに極めて類似し ていることを示す。さらに、本出願人は、ＡＦＭのｃＤＮＡでトランスフェクト したＣＨＯ Ｄ^-細胞の無血清ならし培地からＡＦＭを精製し、それによって、Ａ ｐｏＡ１の不在下のＡＦＭの研究を可能にした。 本発明は、上記に基づき、新規のヒトポリペプチド「ＡＦＭ」、ＡＦＭとＡｐ ｏＡ１及び／又は脂質との複合体、及びＡＦＭに特異的な１種以上の生物学的活 性又は特性を示すそのポリペプチド変異体（断片及び類似体を含む）、をコード する精製・単離ポリヌクレオチド（例えば、そのＤＮＡ配列及びＲＮＡ転写体） を提供する。 本発明の好ましいＤＮＡ配列には、ゲノム及びｃＤＮＡ配列、並びに全体又は 一部が化学的及び／又は酵素的に合成されたＤＮＡ配列及びその生物学的レプリ カが含まれる。本発明はさらに、そのような配列を組み込んだプラスミド及びウ イルスＤＮＡベクター、特に、ＡＦＭ又はＡＦＭ変異体をコードするＤＮＡが内 因性又は外因性発現調節ＤＮＡ配列に作動可能に結合しているベクターのような 自律複製組換え構築物を提供する。 本発明の別の態様により、宿主細胞、特に単細胞宿主細胞、例えば、原核及び 真核細胞を、ＡＦＭ及びその変異体 を内部で発現させ得るように、本発明のＤＮＡ配列で安定に形質転換する。 本発明の宿主細胞は、細胞を適切な培養培地中で増殖させ、所望のポリペプチ ド産物を細胞又は増殖培地から単離する、ＡＦＭ及びＡＦＭ変異体の大量製造法 に有用である。 本発明の新規のＡＦＭ及びＡＦＭ変異体産物は、天然の細胞源からの単離体と して得ることもできるが、本発明の宿主細胞を含む組換え法により製造するのが 好ましい。該産物は、組換え体の産生及び／又は単離後のプロセシング用に選択 された宿主細胞に応じて、完全又は部分的グリコシル化、部分的又は完全脱グリ コシル化、あるいは、非グルコシル化形態で得ることができる。該産物は、他の 分子、例えば、細胞誘導脂質及び／又はＡｐｏＡ１に結合していてもよい。 本発明の産物には、本明細書の図１に記載の−２１〜５７８番目のアミノ酸残 基配列を有するポリペプチドモノマー及びマルチマーが含まれる。以下に詳細に 説明するように、この配列は、「成熟」タンパク質配列の前にあって、−２１（ Ｍｅｔ）〜−１（Ｔｈｒ）残基を含み、その後に１（Ｌｅｕ）〜５７８（Ａｓｎ ）残基にわたる成熟タンパ ク質が続く推定シグナル又はリーダー配列を含む。アミノ酸組成に基づいて計算 されたグリコシル化又は他の翻訳後修飾を欠く成熟タンパク質の分子量は、約６ ６，５７６ダルトンである。 本発明のＡＦＭ変異体は、本明細書に特定されている１つ以上の領域を含むフ ラグメントを含むが、該変異体は、さらに１種以上の特定のアミノ酸が、（１） 実質的な欠損無しに、好ましくはＡＦＭに特異的な１種以上の生物学的活性又は 免疫学的特性が増強されるか；又は（２）特定のリガンド／レセプター結合機能 の特異的調節を伴うように、欠失又は置換されたポリペプチド類似体を含んでい てもよい。マルチマーの形成を容易にする、追加のアミノ酸残基（例えば、リシ ン）を含むポリペプチド類似体も考慮に含まれる。 本発明により、抗体（例えば、モノクローナル又はポリクローナル抗体、単鎖 抗体、キメラ抗体、ＣＤＲグラフト抗体など）又はＡＦＭ若しくはＡＦＭ変異体 に特異的な他の結合タンパク質も考慮に含まれる。抗体は、単離された天然又は 組換えＡＦＭ若しくはＡＦＭ変異体を用いて産生させ得る。 該抗体は、免疫感作用複合体並びに本発明のポリペプチドの精製に有用である 。該抗体はまた、ＡＦＭが係わるリガンド／レセプター結合反応の調節（即ち、 ブロッキング、阻害又は刺激）にも有用である。 抗ＡＦＭ抗体に特異的な抗イディオタイプ抗体及び治療における該抗体の使用 も考慮に含まれる。細胞表面上及び血清のような体液中でのＡＦＭの検出及び定 量アッセイには、単一抗体又は「サンドイッチ」アッセイ法における多重抗体が 関与し得る。 本発明のＤＮＡ及びアミノ酸配列の有用性は様々である。例えば、ＡＦＭのｃ ＤＮＡ配列がわかれば、ＡＦＭをコードし、プロモーター、オペレーターなどの ようなＡＦＭ発現制御調節配列を特定するゲノムＤＮＡ配列のＤＮＡ／ＤＮＡハ イブリダイゼーションによる単離が可能になる。本発明のＤＮＡ配列を用い、ス トリンジェントな条件下に実施されるＤＮＡ／ＤＮＡハイブリダイゼーション法 によっても、ＡＦＭの対立遺伝子変異体、ＡＦＭの生物学的及び／又は免疫学的 特異性を共有する他の構造的に関連したタンパク質、並びに非ヒト種からの（特 に他の哺乳動物からの）ＡＦＭと同種のタンパク質をコードするＤＮＡを単離 し得る。本発明のＤＮＡは、細胞のＡＦＭ合成能を検出するＤＮＡ／ＲＮＡハイ ブリダイゼーションアッセイに有用である。ＡＦＭの種々の特定の有用性を以下 に開示する。これらの有用性は、主として上記の同種アルブミンタイプのポリペ プチドの公知有用性に基づいている。 さらに本発明により、通常、ＡＦＭを発現する細胞によるＡＦＭの発現調節に 関連したアンチセンスポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ及びＲＮＡ）を得るこ とができる。さらに、ＡＦＭのＤＮＡ及びアミノ酸配列がわかれば、組換え手段 による、ＡＦＭタンパク質配列及び免疫グロブリンの重鎖定常領域及び／又はヒ ンジ領域の存在を特徴とするハイブリッド融合タンパク質の産生が可能になる。 Ｃａｐｏｎら，Ｎａｔｕｒｅ，３３７；５２５−５３１（１９８９）；Ａｓｈｋ ｅｎａｚｉら，Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．（ＵＳＡ），８８，１０５３５−１０５３９（ １９９１）；及び１９８９年４月６日に公開されたＰＣＴ ＷＯ ８９／０２９２ ２を参照されたい。 図面の簡単な説明 従って、本発明の多くの他の態様及び利点は、図面を参照して以下の詳細な説 明を考慮すれば明らかになるであろ う。 図１は、ＡＦＭのヌクレオチド及び推定アミノ酸配列を示す。推定シグナル配 列は小文字で示されている。アスタリスクは、推定Ｎ−グリコシル化部位を示し ている。これらは配列番号１及び配列番号２としても示す。 図２Ａ及び図２Ｂは、ＡＬＢファミリーのアミノ酸配列の比較を示す。図２Ａ はＡＬＢファミリータンパク質の整列を示す。配列は、ＭｅｇＡｌｉｇｎプログ ラム（ＤＮＡＳＴＡＲ）のＣｌｕｓｔａｌ法を用いて整列させた。同一アミノ酸 残基はボックスで囲まれている。コンセンサス（Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ）とは、４ つの配列全てにおいて同一の残基を示す。マジョリティー（Ｍａｊｏｒｉｔｙ） とは、４つの配列全てにおいて２又は３個の残基が同一であることを示す。図２ Ｂは、ＡＬＢファミリーメンバー間の類似率（対角線の右側）及び同一率（対角 線の左側）を示す。類似性はＧＣＧ ＧＡＰプログラムを用いて決定した。以下 のような比較タンパク質の配列も提供する：血清アルブミン、配列番号３；α− フェトプロテイン、配列番号４；及びビタミンＤ結合タンパク質、配列番号５。 図３は、ＡＬＢファミリータンパク質中に保存されてい るＣｙｓパターンを示す。成熟形のＡＬＢファミリータンパク質は、単一のＣｙ ｓ残基を表す細い垂直線と−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−配列を表す太い垂直線とで示され ている。 図４は、ＡＦＭの推定ジスルフィド結合パターンを示す。ドメイン及び二重ル ープの構造は、初期にＡＬＢについて提案されたように描かれている。 図５は、安定にトランスフェクトされたＣＨＯ Ｄ^-細胞におけるｒＡＦＭの発 現を示す。試料を、還元条件下にＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、次いで、電気泳動さ せてニトロセルロースに移す。スキムミルクでブロッキングした後、膜をＡＭ３ ３９抗体でプローブし、その後、ドンキーラビット抗Ｉｇと共にインキュベート した。免疫反応性タンパク質を化学発光により視覚化した。レーン１、ＡＦＭの ｃＤＮＡでトランスフェクトしたＣＨＯ Ｄ^-細胞からの８０ｍｌならし培地（Ｃ Ｍ）；レーン２、トランスフェクトしていないＣＨＯ Ｄ^-細胞からの８０ｍｌ ＣＭ；レーン３、ヒト血漿から精製した１００ｎｇ ＡＦＭ。サイズマーカー（ ｋＤａ）は左側に示されている。 図６は、ｒＡＦＭの精製を示す。ＡＦＭのｃＤＮＡでトランスフェクトしたＣ ＨＯ Ｄ^-細胞から精製した試料を、 等量の２×試料緩衝液（１２５ｍＭ トリス−ＨＣｌ，ｐＨ６．８，４％ ＳＤＳ ，０．００５％ ブロモフェノールブルー，１０％グリセロール）で調整し、還 元条件下に４〜２０％ポリアクリルアミド勾配ゲル（Ｎｏｖｅｘ）を用い、ＳＤ Ｓ−ＰＡＧＥで分析した。ゲルはクーマシーブリリアントブルーで染色した。レ ーン１及び６、１０ｍｇ Ｍａｒｋ−１２分子量マーカー（Ｎｏｖｅｘ，Ｉｎｃ ．）；レーン２、濃縮ＣＭに硫酸アンモニウムを添加した後の５０ｍｇ 総タン パク質（上清をＰＢＳに対して透析し、次いでゲル上に加えた）；レーン３、２ ５ｍｇ フェニルセファロース水溶出物；レーン４、１０ｍｇ Ｑ セファロース 精製ｒＡＦＭ；レーン５、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００で精製したｒＡＦＭ１ｍｇ 。 好ましい実施態様の詳細な説明 ＡＦＭの定義 ＡＦＭは、図１のＡＦＭと共通の定性的生物学的活性又は特性を有するポリペ プチドと定義される。 上記定義のＡＦＭの範囲に含まれるのは、図１に記載のＡＦＭのアミノ酸配列 、配列番号２を有するＡＦＭ；ＡＦＭのグリコシル化、脱グリコシル化又は非グ リコシル化誘 導体；及びＡＦＭの脂質化（ｌｉｐｉｄａｔｅｄ）又は脱脂質化形態である。 さらに該ＡＦＭ範囲に含まれるのは、ヒト、マウス、ラット、ブタ、ウサギ、 サル、イヌなどを非限定的に含む任意の種由来のＡＦＭである。ヒト形態のＡＦ Ｍが特に好ましい。ＡＦＭ変異体 ＡＦＭ変異体には、図１のＡＦＭと共通の生物学的活性又は特性を示し得る、 図１の配列の相同アミノ酸配列変異体及びＡＦＭの相同ｉｎ ｖｉｔｒｏ産生変 異体及びＡＦＭ誘導体が含まれる。 本明細書に用いられている「相同」という用語は、配列を整列し、必要な場合 には最大比率の相同性を達成すべくギャップを導入した後の、図１のＡＦＭ配列 の残基と同一の候補配列の残基を指す。 ＡＦＭの生物学的活性又は特性は、（１）少なくとも１つのＡＦＭエピトープ との免疫学的交差反応性、又は（２）ＡＦＭと定性的に共通の少なくとも１つの 調節又はエフェクター機能を有することと定義する。これらの活性の例は、本明 細書にＡＦＭの有用性について記載した項に見ること ができる。 本明細書に用いられている「免疫学的に交差反応性」とは、候補ポリペプチド が、この活性を有するＡＦＭ又はＡＦＭ変異体の定性的生物学的活性を、公知活 性類似体に対して産生されたポリクローナル抗血清と競合して阻害し得ることを 意味する。そのような抗血清は、ヤギ又はウサギのような動物に、例えば、フロ イントの完全アジュバント中の既知活性類似体を皮下注射し、次いで、フロイン トの不完全アジュバントを腹腔内又は皮下注射して免疫追加することにより慣用 法で調製する。ポリクローナル抗血清産生の例は、後述の実施例の項に示す。 ＡＦＭのアミノ酸配列変異体は、その結合パートナーに対するＡＦＭの親和性 の増強、安定性の促進、ＡＦＭの精製及び作製などを含む種々の目的を考慮して 作製する。 ＡＦＭのアミノ酸配列変異体は、３つのクラス：挿入、置換又は欠失変異体の １つ以上を包含する。これらの変異体は、通常、ＡＦＭをコードするＤＮＡのヌ クレオチドの部位特異的突然変異誘発により変異体をコードするＤＮＡを得、そ の後で、組換え細胞培養中でＤＮＡを発現させる。しかし、最大約１００〜１５ ０個のアミノ酸残基を有する 変異体ＡＦＭフラグメントはｉｎ ｖｉｔｒｏ合成により作製するのが便利であ る。 ＡＦＭのアミノ酸配列変異体は、天然又は天然産生対立遺伝子中には認められ ない予決定変異体である。ＡＦＭ変異体は、典型的には天然産生ＡＦＭ分子と同 じ定性的生物学的活性を示す。しかし、ＡＦＭ変異体及び、そのリガンドに結合 し得ない誘導体は、（ａ）ＡＦＭ又は抗ＡＦＭ抗体についての診断アッセイにお ける試薬として、（ｂ）公知方法では溶解しない場合に、抗血清又はハイブリド ーマ培養上清から抗ＡＦＭ抗体を精製するための物質として、及び（ｃ）少なく とも１つのＡＦＭエピトープが活性を保つ限り、抗ＡＦＭ抗体を産生させるため の免疫原として、又は免疫アッセイキットの成分（天然ＡＦＭの場合は競合試薬 として標識して、又はＡＦＭアッセイの場合には標準として無標識で）として有 用である。 アミノ酸配列変異を導入する部位は予決定するが、突然変異それ自体を予決定 する必要はない。例えば、所定部位における突然変異の成果を最適にするために 、ランダム又は飽和突然変異誘発（２０個の可能な残基全てを挿入する場合）を 標的コドンで実施し、発現されたＡＦＭ変異体を 所望活性の最適な組合わせについてスクリーニングする。そのようなスクリーニ ングは当業者が熟知するところである。 アミノ酸の挿入は通常一般に約１〜１０個程度のアミノ酸残基であり、置換は 典型的には単一の残基に導入し、欠失は一般に約１〜３０個の残基の範囲である 。欠失又は挿入は隣接する塩基対、即ち、２個の残基を欠失させるか又は２個の 残基を挿入して行うのが好ましい。以下の説明から、置換、欠失、挿入又はその 任意の組合わせを、最終構築物となるように導入するか又は組み合わせることは 明らかであろう。 ＡＦＭの挿入アミノ酸配列変異体は、ＡＦＭに対して外来の１個以上のアミノ 酸残基を標的ＡＦＭの予決定部位に導入し、既に存在している残基と置換するも のである。一般に、挿入変異体は、ＡＦＭのアミノ又はカルボキシル末端基と、 異種タンパク質又はポリペプチドとの融合体である。そのような変異体は、ＡＦ Ｍと、通常ＡＦＭの挿入位置に認められるものとは異なる配列を含むポリペプチ ドとの融合体と称される。本明細書では、いくつかの融合体群が企図されている 。 免疫活性ＡＦＭ誘導体及び融合体はＡＦＭと、非ＡＦＭエピトープを有するポ リペプチドとを含み、これらの誘導体及び融合体は本発明の範囲内である。非Ａ ＦＭエピトープとは、免疫学的にコンピテントな任意のポリペプチド、即ち融合 体を投与するべき動物において免疫応答を引き出し得るか、または非ＡＦＭポリ ペプチドに対する抗体よって結合され得る任意のポリペプチドのことである。典 型的な非ＡＦＭエピトープは、アレルゲン、自己免疫エピトープ、またはｔｒｐ ＬＥ、β−ガラクトシダーゼといった細菌ポリペプチド、ヘルペスｇＤタンパク 質などのウイルスポリペプチド等を含めた、融合体受容体に予め存在する抗体に よって認識される他の有効免疫原もしくは抗原が保持するものである。 免疫原融合体はｉｎ ｖｉｔｒｏ架橋によって、または免疫原ポリペプチドを コードするＤＮＡで形質転換した組み換え細胞の培養によって製造する。免疫原 融合体は、その免疫原配列が（１個以上の）ペプチド結合によってＡＦＭまたは ＡＦＭフラグメントに結合しているかまたは挿入されているものが好ましい。従 ってこの生成物は、ＡＦＭエピトープを有し、かつＡＦＭにとって外来のエピト ープ を少なくとも１個有するポリペプチド直鎖から成る。エピトープをＡＦＭ分子ま たはそのフラグメント中の任意の位置に導入することは本発明の範囲内であると 理解される。 上記のような融合体は組み換え宿主細胞において、または二価性架橋剤の使用 によって製造すれば都合が好い。ＡＦＭと免疫原ポリペプチドとの融合に架橋剤 を用いることは直鎖状融合体を得ることほど望ましくなく、なぜなら架橋生成物 は構造的に均質な形態で合成することがさほど容易でないからである。 上記のような免疫原挿入体は、医薬的に許容可能なキャリヤ（または担体）中 に配合して、ＡＦＭに対する抗体を産生させるべく被検者に投与すれば特に有用 であり、その際前記抗体自体は診断薬に、またはそれ自体公知である免疫親和性 技術によるＡＦＭ精製に有用である。診断薬用途では抗体を、典型的には検出可 能基に結合させるかまたは前記基と関連付けるが、前記基の例は当業者には良く 知られている。免疫親和性技術は例えばＡＦＭ精製に用い得る。 免疫活性であってもなくてもよいその他の融合体には、成熟ＡＦＭ配列とＡＦ Ｍにとって異種であるシグナル配列との融合体、及びＡＦＭと免疫グロブリン鎖 またはそのフ ラグメントなどの、（通常約２０時間を越える）長い血漿半減期を有するポリペ プチドとの融合体が含まれる。 シグナル配列融合体は、ＡＦＭの分泌をより迅速に行なわせるべく用いる。異 種シグナルが天然のＡＦＭシグナルに置き換わり、得られる融合体が宿主細胞に よって認識されれば、即ちプロセシング及び切断されればＡＦＭが分泌される。 シグナルは使用する宿主細胞に基づいて選択し、細菌配列、酵母配列、哺乳動物 配列及びウイルス配列などをシグナルとし得る。天然ＡＦＭシグナルまたはヘル ペスｇＤ糖タンパク質シグナルは哺乳動物発現系での使用に適する。 実質的価値のある変異体は、図２の配列中の少なくとも１個の残基が除去され 、その位置に異なる残基が挿入されたものである。このような置換は、ＡＦＭの 特性を微妙に調節することが望ましい場合は通常、次の表１に従って行なう。 表１のものほど保存性でない置換を選択することによって、即ち（ａ）ポリペ プチド主鎖の置換領域の、例えばシートまたはヘリックスコンホーメーションと しての構造、（ｂ）分子の標的部位の電荷もしくは疎水性、または（ｃ） 側鎖の嵩高さの維持に及ぼす影響がはるかに甚だしく異なる残基を選択すること によって、機能または免疫学的同等性をかなり変更することができる。ＡＦＭ特 性を最も変化させると通常考えられるのは、（ａ）親水性残基、例えばセリルま たはトレオニルで疎水性残基、例えばロイシル、イソロイシル、フェニルアラニ ル、バリルまたはアラニルを（またはこの逆に）置換するか、（ｂ）システイン またはプロリンで他の任意の残基を（またはこの逆に）置換するか、（ｃ）正荷 電側鎖を有する残基、例えばリシル、アルギニルまたはヒスチジルで負荷電残基 、例えばグルタミルまたはアスパルチルを（またはこの逆に）置換するか、また は（ｄ）嵩高い側鎖を有する残基、例えばフェニルアラニンで側鎖を有しない残 基、例えばグリシンを（またはこの逆に）置換する置換である。 欠失、挿入及び置換には、ＡＦＭ分子の特性に根底的な変化を生じさせないも のも有る。しかし、置換、欠失または挿入の実施前にその影響を正確に予測する ことが困難である場合、例えばＡＦＭ細胞外ドメインまたは免疫エピトープを修 飾する場合に通常のスクリーニングアッセイによって影響を評価することは、当 業者には理解されよう。 別種のＡＦＭ変異体に、欠失変異体が有る。欠失は、ＡＦＭ配列からの１個以 上のアミノ酸残基の除去によって特徴付けられる。ＡＦＭの生物活性または免疫 交叉反応性を保存する、ＡＦＭのＣ末端またはＮ末端からの欠失が適当である。 システインまたは他の不安定な残基の欠失も、例えばＡＦＭの酸化安定性を向 上させる場合などに望ましい。潜在的タンパク質分解部位、例えばＡｒｇ−Ａｒ ｇの欠失または置換は、いずれか１個の塩基性残基を欠失させるか、またはグル タミニルもしくはヒスチジル残基によって置換することにより行なえる。 好ましい変異体は、保存性置換を行なったものである。変異体によっては生物 活性を僅かしか、または全く示さないことがあると理解される。しかしそのよう な変異体は、ＡＦＭの免疫エピトープを少なくとも１個保持していれば、ＡＦＭ に関するイムノアッセイにおいて標準として有用である。 グリコシル化変異体もＡＦＭの範囲内に含まれる。この変異体には、グリコシ ル化を完全に欠く（非グリコシル化）変異体、及び天然形態と比べてグリコシル 化されていない 部位を少なくとも１個有する（脱グリコシル化）変異体、並びにグリコシル化部 分が変化した変異体が含まれる。加えて、天然ＡＦＭのアミノ酸配列を有する非 グリコシル化ＡＦＭは組み換え原核細胞培養物において産生され、なぜなら原核 生物はポリペプチドにグリコシル化を導入し得ないからである。 グリコシル化変異体は適当な宿主細胞の選択によって、またはｉｎ ｖｉｔｒ ｏ方法によって製造する。例えば、酵母は哺乳動物系とは著しく異なるグリコシ ル化を導入する。同様に、ＡＦＭ起源とは異なる種（例えばハムスター、マウス 、昆虫、ブタ、ウシまたはヒツジ）または組織（例えば肺、リンパ様組織、間葉 組織または表皮組織）に由来する哺乳動物細胞は、例えばマンノースレベルの上 昇、またはマンノース、フコース、シアル酸及び哺乳動物の糖タンパク質中に典 型的に見出される他の糖の変異比率によって特徴付けられる、変異体グリコシル 化を導入する能力に関して通常のようにスクリーニングする。ＡＦＭのｉｎ ｖ ｉｔｒｏプロセシングは典型的には、酵素加水分解、例えばノイラミニダーゼ消 化によって実現する。 天然源から単離したかまたは組み換え技術で製造したＡ ＦＭは通常、結合脂質を有する。結合脂質の性質はＡＦＭ源に依存すると考えら れる。脱脂質化型（ｄｅｌｉｐｉｄａｔｅｄ ｖｅｒｓｉｏｎｓ）のＡＦＭは当 分野、特に脱脂質化が通常の操作とされるＡＬＢ関連分野において知られている 標準的な脱脂質化法によって製造できる。好ましい一方法では、ＡＦＭの水溶液 を１−ブタノールまたはジイソプロピルエーテルといった、脂質が溶解し得る溶 媒で抽出する。脱脂質化法の特定例の一つを実施例８に示す。 発現されるポリペプチドに組み換え宿主細胞が作用する結果として、或る種の 翻訳後誘導体化が生起する。グルタミニル及びアスパラギニル残基はしばしば翻 訳後に脱アミド化されて、対応するグルタミル及びアスパルチル残基となる。あ るいは他の場合には、上記残基は弱酸性条件下に脱アミド化される。いずれの形 態の上記残基も本発明の範囲内である。 その他の翻訳後修飾には、プロリン及びリシンのヒドロキシル化、セリルまた はトレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リシン、アルギニン及びヒスチ ジン側鎖のα−アミノ基のメチル化（Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，“Ｐｒｏｔ ｅｉｎｓ： Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍ ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，”ｐｐ．７９−８６，Ｗ．Ｈ．Ｆｒ ｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，１９８３）、Ｎ末端ア ミンのアセチル化、及び場合によってはＣ末端カルボキシルのアミド化が含まれ る。ＡＦＭに関連するオリゴヌクレオチド ＦＭをコードするＤＮＡはｉｎ ｖｉｔｒｏ方法によって合成し、またはヒト 肝臓ｃＤＮＡライブラリーから容易に取得する。ＡＦＭをコードするＤＮＡを手 作業で、または自動装置を用いて合成創出する手段は通常、特に本明細書の教示 に照らして当業者には公知である。ポリヌクレオチド合成に関する従来技術の例 としては、Ｍａｎｉａｔｉｓ等，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，”Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏ ｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８４及びＨｏｒｖａｔｈ等，“Ａｎ Ａｕｔｏ ｍａｔｅｄ ＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ Ｅｍｐｌｏｙｉｎｇ Ｄｅｏｘ ｙｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ３′−Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅｓ，”Ｍｅｔ ｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １５４，ｐｐ．３１３−３２６， １９８７が挙げられる。 あるいはまた、ＡＦＭの好ましい具体例のための完全ＤＮＡ配列が得られるの でマウスまたはヒト以外の供給源からＡＦＭコーディングＤＮＡを得る場合には 、標識したＡＦＭコーディングＤＮＡまたはその断片（普通約２０ｂｐより大き く、通常は約５０ｂｐ）を用いてハイブリダイゼーションスクリーニングを行な い、それによって当該動物の肝臓に由来するｃＤＮＡライブラリー中で相同配列 を有するクローンを検出し、その後クローンを制限酵素分析及び核酸配列決定に より分析して完全長クローンを同定しさえすればよい。ライブラリー中に完全長 クローンが存在しない場合は、様々なクローンから適当な断片を回収し、これら の断片をその共通する制限部位において連結して完全長クローンを形成する。他 の動物種に由来するＡＦＭコーディングＤＮＡは、当該種由来のライブラリーを ヒト配列をプローブとして探索するか、または当該遺伝子をｉｎ ｖｉｔｒｏ合 成することによって取得する。 ストリンジェントな条件下に図１のＤＮＡ配列の断片とハイブリダイズする核 酸配列も本発明の範囲内に含まれ、その際前記断片は約１０ｂｐより大きく、好 ましくは２０ 〜５０ｂｐより、更には１００ｂｐより大きい。ストリンジェントな条件下にＡ ＦＭの断片とハイブリダイズする核酸配列も本発明の範囲内に含まれる。「スト リンジェント」という語は、当分野でストリンジェントであると共通に理解され ている条件を差すのに用いてある。そのような一連の条件の例に、６０〜７０℃ （好ましくは約６５℃）の温度、及び０．７０〜０．８０Ｍ（好ましくは約０． ７５Ｍ）の塩濃度などが有る。 ストリンジェントな条件下にＡＦＭのｃＤＮＡと、またはＡＦＭのゲノム遺伝 子（イントロン、及び約５，０００ｂｐの隣接遺伝子まで伸長する５′側及び３ ′側隣接領域のいずれか大きい方を含む）とハイブリダイズし得る核酸プローブ も本発明の範囲内に含まれる。ＡＦＭの組み換え発現 本発明に有用なベクターの構築では通常、ＤＮＡ配列のクローニングに原核生 物を用いる。例えば、大腸菌Ｋ１２株２９４（ＡＴＣＣ Ｎｏ．３１４４６）が 特に有用である。用い得る他の微生物株には大腸菌Ｂ及び大腸菌Ｘ１７７６（Ａ ＴＣＣ Ｎｏ．３１５３７）などが有る。あるいは他の場合には、ｉｎ ｖｉｔ ｒｏクローニング方法、 例えばポリメラーゼ連鎖反応が適当である。 本発明のＡＦＭはＮ末端メチオニル類似体として、またはＡＦＭにとって異種 のポリペプチド、好ましくはシグナル配列、もしくはＡＦＭのＮ末端の特異的切 断部位を有する他のポリペプチドとの融合体として、組み換え細胞培養物におい て直接発現される。宿主の原核生物がＡＦＭシグナルのプロセシングを行なわな い場合はシグナルを、例えばアルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、及び熱 安定エンテロトキシンIIリーダーの中から選択した原核生物シグナルによって置 換する。酵母分泌のためには、ヒトＡＦＭシグナルを酵母インベルターゼ、α因 子または酸性ホスファターゼリーダーによって置換し得る。哺乳動物細胞発現で は哺乳動物ＡＦＭのための天然シグナルで十分であるが、他の哺乳動物分泌タン パク質シグナルも、ウイルス分泌リーダー、例えばヘルペスシンプレックスｇＤ シグナル同様適当である。 ＡＦＭは任意の宿主細胞において発現され得るが、好ましくは哺乳動物宿主に おいて合成される。しかし、原核生物、真菌類、酵母、昆虫等に由来する宿主細 胞も発現のために用いられる。原核生物の例には、大腸菌Ｗ３１１０（Ｆ −； １−； 原栄養株； ＡＴＣＣ Ｎｏ．７３２５）、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｅｓｃａｎｓなど他の腸内細菌科菌、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属菌及び様々なＰ ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属菌などの、クローニングに適した株が有る。好ましくは 宿主細胞は、タンパク質分解酵素を極少量しか分泌しないものであるべきである 。 発現宿主は典型的には、発現ベクター中に連結したＡＦＭコーディングＤＮＡ で形質転換する。上記ベクターは通常、複製部位を有する（染色体組み込みが生 起する場合は不要であるが）。発現ベクターは、後段に詳述する形質転換細胞に おける表現型選択を可能にするマーカー配列も含む。発現ベクターは好ましくは 、転写及び翻訳の制御に有用な配列、例えばプロモーター及びシャイン−ダルガ ーノ配列（原核生物の場合）、またはプロモーター及びエンハンサー（哺乳動物 細胞の場合）も有する。プロモーターは誘導性であってもよいが、これは必須で はない。 宿主を原核生物とする場合に用いるのに適したプロモーター例には、β−ラク タマーゼ及びラクトースプロモーター系（Ｃｈａｎｇ等，Ｎａｔｕｒｅ ２７５ ，ｐ．６１５，１９７８及びＧｏｅｄｄｅｌ等，Ｎａｔｕｒ ｅ ２８１，ｐ．５４４，１９７９）、アルカリホスファターゼ、トリプトファ ン（ｔｒｐ）プロモーター系(Ｇｏｅｄｄｅｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．８，ｐ．４０５７，１９８０及びヨーロッパ特許出願公開第３６，７７ ６号)、及びｔａｃプロモーター(Ｈ．ｄｅ Ｂｏｅｒ等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０，ｐｐ．２１−２５，１９８３)などのハイブ リッドプロモーターが含まれる。しかし、他の機能性細菌性プロモーターも適当 である。それらのヌクレオチド配列は通常公知であり、従って、必要な制限部位 を供給するリンカーまたはアダプターを用いれば、当業者は当該プロモーターを ＡＦＭコーディングＤＮＡに作動可能に連結することができる(Ｓｉｅｂｅｎｌ ｉｓｔ等，Ｃｅｌｌ ２０，ｐ．２６９，１９８０)。細菌系用のプロモーター は、ＡＦＭコーディングＤＮＡに作動可能に連結されたシャイン−ダルガーノ（ ＳＤ）配列も有する。 原核生物に加えて、酵母や糸状菌類といった真核微生物も十分用い得る。最も 普通に用いられる真核微生物はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉ ａｅであるが、他の幾つかの株も通常利用可能である。 宿主を酵母とする場合に用いるのに適したプロモーター配列には、３−ホスホ グリセリン酸キナーゼ用のプロモーター（Ｈｉｔｚｅｍａｎ等，Ｊ．Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．２５５，ｐ．２０７３，１９８０）、またはエノラーゼ、グリセルア ルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボ キシラーゼホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３ −ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメ ラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ及びグルコキナーゼなど、他の解糖系酵 素用のプロモーター（Ｈｅｓｓ等，Ｊ．Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｇ．７，ｐ ．１４９，１９６８； 及びＨｏｌｌａｎｄ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １７ ，ｐ．４９００，１９７８）が含まれる。 転写が増殖条件によって制御されるという付加的な利点を有する誘導性プロモ ーターである他の酵母プロモーターに、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソシ トクロムＣ、酸ホスファターゼ、窒素代謝に関連する分解用酵素、メタロチオネ イン、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、並びにマルトース及 びガラクトース利用の原因 となる酵素用のプロモーター領域が有る。酵母発現に用いるのに適したベクター 及びプロモーターは、Ｒ．Ｈｉｔｚｅｍａｎ等のヨーロッパ特許出願公開第７３ ，６５７Ａ号にも開示されている。 発現制御配列は、真核生物では既知である。実質的に総ての真核生物遺伝子が 、転写開始部位の約２５〜３０塩基上流にＡＴに富む領域を有する。多くの遺伝 子の転写開始部位の７０〜８０塩基上流に別の配列のＣＸＣＡＡＴ領域が見出さ れ、この領域のＸは任意のヌクレオチドであり得る。ほとんどの真核生物遺伝子 の３′末端にＡＡＴＡＡＡ配列が有り、この配列はコーディング配列の３′末端 へのポリＡテールの付加のためのシグナルであり得る。これらの配列はいずれも 哺乳動物発現ベクターに挿入する。 哺乳動物宿主細胞におけるベクターからの転写の制御に適したプロモーターは 様々な供給源、例えばポリオーマウイルス、ＳＶ４０、アデノウイルス、ＭＭＶ （ステロイド誘導性）、レトロウイルス（例えばＨＩＶのＬＴＲ）、Ｂ型肝炎ウ イルス、及び最も好ましくはサイトメガロウイルスなどのウイルスのゲノムから 、または異種哺乳動物プロモーター、例えばβ−アクチンプロモーターから容易 に得 られる。ＳＶ４０の初期及び後期プロモーターは、ＳＶ４０ウイルス複製開始点 も含むＳＶ４０制限断片として好ましく得られる。Ｆｉｅｒｓ等，Ｎａｔｕｒｅ ２７３，ｐ．１１３，１９７８参照。ヒトサイトメガロウイルスの即時型初期 プロモーターはＨｉｎｄIII Ｅ制限断片として好ましく得られる。Ｐ．Ｊ．Ｇ ｒｅｅｎａｗａｙ等，Ｇｅｎｅ １８，ｐｐ．３５５−３６０，１９８２参昭。 比較的高等な真核生物によるＡＦＭコーディングＤＮＡの転写は、ベクターに エンハンサー配列を挿入することによって促進できる。エンハンサーとは、ＤＮ Ａの転写を促進するべくプロモーターに作用する、普通１０〜３００ｂｐのシス 作用性ＤＮＡ要素である。エンハンサーは向き及び位置から比較的独立であり、 転写単位の５′側(Ｌ．Ｌａｉｍｉｎｓ等，ＰＮＡＳ ７８，ｐ．９９３，１９ ８１)及び３′側(Ｍ．Ｌ．Ｌｕｓｋｙ等，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ．３，ｐ． １１０８，１９８３)、イントロン中(Ｊ．Ｌ．Ｂａｎｅｒｊｉ等，Ｃｅｌｌ ３ ３，ｐ．７２９，１９８３）、並びにコーディング配列自体の中(Ｔ．Ｆ．Ｏｓ ｂｏｒｎｅ等，Ｍ ｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ．４，ｐ．１２９３，１９８４）にも見出されている。 現在では、哺乳動物遺伝子（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェト プロテイン及びインシュリン）に由来するエンハンサー配列が多数知られている 。しかし、典型的には真核細胞ウイルス由来のエンハンサーが用いられる。その 例には、複製開始点の後期側に位置するＳＶ４０エンハンサー（ｂｐ１００〜２ ７０）、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製開始点の後 期側に位置するポリオーマエンハンサー、及びアデノウイルスエンハンサーが含 まれる。 真核宿主細胞（酵母、真菌類、昆虫、植物、動物、ヒト、または他の多細胞生 物由来の有核細胞）において用いる発現ベクターは、ｍＲＮＡ発現に影響し得る 転写の終結に必要な配列も含む。このような領域は、ＡＦＭコーディングｍＲＮ Ａの非翻訳部分のポリアデニル化セグメントとして転写される。３′非翻訳領域 には転写終結部位も含まれる。 発現ベクターは、選択マーカーとも呼称される選択遺伝子を含み得る。哺乳動 物細胞に適する選択マーカーの例には、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ） 、チミジンキナーゼ（ＴＫ）またはネオマイシンが有る。 ＡＦＭの発現に適する真核宿主細胞には、ＳＶ４０で形質転換したサル腎細胞 ＣＶ１系（ＣＯＳ−７； ＡＴＣＣＣＲＬ １６５１）； ヒト胚性腎細胞系［ ２９３、または浮遊培養での増殖のためにサブクローン化した２９３細胞（Ｆ． Ｌ．Ｇｒａｈａｍ等，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．３６，ｐ．５９，１９７７）］ ； ベビーハムスター腎細胞（ＢＨＫ； ＡＴＣＣ ＣＣＬ １０）； チャイ ニーズハムスター卵巣細胞−ＤＨＦＲ［ＣＨＯ； Ｕｒｌａｕｂ及びＣｈａｓｉ ｎ，ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）７７，ｐ．４２１６，１９８０］； マウスセルトリ細 胞（ＴＭ４； Ｊ．Ｐ．Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３，ｐｐ． ２４３−２５１，１９８０）； サル腎細胞（ＣＶ１； ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７ ０）； アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ−７６； ＡＴＣＣ ＣＲＬ １ ５８７）； ヒト子宮頸癌細胞（ＨｅＬａ； ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）； イヌ 腎細胞（ＭＤＣＫ； ＡＴＣＣ ＣＣＬ ３４）； バッファローラット肝細胞 (ＢＲＬ ３Ａ； ＡＴＣＣ ＣＲＬ １４４２)； ヒト肺細胞（Ｗ１３８； ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７５）； ヒト肝細胞（Ｈｅｐ Ｇ２； ＨＢ ８０６５） ； マウス乳癌細胞（ＭＭＴ ０６０５６２； ＡＴＣＣ ＣＣＬ ５１）； 及び ＴＲＩ細胞（Ｊ．Ｐ．Ｍａｔｈｅｒ等，Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．３８３，ｐｐ．４４−６８，１９８２）が含まれる。 所望のコーディング配列及び制御配列を含む適当なベクターの構築には、標準 的な連結技術を用いる。単離したプラスミドまたはＤＮＡ断片を切断し、適宜処 理し、かつ所望の形態で再連結して必要なプラスミドを形成する。 宿主細胞を本発明の発現ベクターで形質転換し、プロモーターの誘導、形質転 換体の選択、またはＡＦＭ遺伝子の増殖のために適宜改質した通常の栄養培地中 で培養する。温度、ｐＨ等といった培養条件は、発現用に選択した宿主細胞に関 して従来用いられているものとし、そのような条件は当業者には明らかであろう 。 本明細書の開示で言及する宿主細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養細胞も宿主動物 を構成する細胞も包含する。 「形質転換」という語は、生物にＤＮＡを染色体外要素として、または染色体 への組み込みにより、該ＤＮＡが複製可能であるように導入することを意味する 。本発明で宿主細胞の形質転換に用いる方法は、例えばＦ．Ｇｒａｈ ａｍ及びＡ．ｖａｎ ｄｅｒ Ｅｂ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２，ｐｐ．４５６− ４５７，１９７３の方法であり得る。しかし、細胞へのＤＮＡ導入には核への注 入やプロトプラスト融合によるものなど、他の方法を用いることも可能である。 原核細胞、または堅固な細胞壁構造を有する細胞を用いる場合、好ましいトラン スフェクション法はＦ．Ｎ．Ｃｏｈｅｎ等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ ｃｉ．（ＵＳＡ）６９，ｐ．２１１０，１９７２に記載されている、塩化カルシ ウムを用いるカルシウム処理である。 「トランスフェクション」という語は、究極的にコーディング配列が発現する かどうかにかかわらず宿主細胞にＤＮＡを導入することを意味する。多くのトラ ンスフェクション法、例えばＣａＰＯ₄及びエレクトロポレーションが当業者に 公知である。宿主細胞の形質転換はトランスフェクションの成功を指示する。ＡＦＭの回収及び精製 組み換え細胞培養物からＡＦＭを、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈澱、 酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースク ロマトグラフ ィー、免疫親和性クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィ ー、レクチンクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー及びゲル 濾過クロマトグラフィーを含めた公知方法で回収及び精製する。本発明の範囲内 に有る他の公知精製方法では、例えば固定化した炭水化物、上皮細胞増殖因子、 または相補的ドメインを用いる。更に、逆相ＨＰＬＣ、及び抗ＡＦＭ抗体を用い るクロマトグラフィーもＡＦＭの精製に有用である。ＡＦＭは好ましくは、ＰＭ ＳＦなどのプロテアーゼ阻害剤の存在下に精製する。特に好ましいＡＦＭ精製方 法を実施例１に示す。ＡＦＭの用途 先に述べたように、ＡＦＭとＡＬＢ、ＡＦＰ及びＶＤＢそれぞれとの相同性か らして、ＡＦＭ及びその変異体は同等または類似の生物活性及び用途を有すると 考えられる。通常、アルブミンファミリーに属するタンパク質は、脂肪酸、ホル モン、酵素、色素、微量金属及び薬物を含めたきわめて様々な物質に結合して当 該物質を体中に運搬する高い傾向を示す。内在脂質を除去したＡＦＭの製剤は、 急性膵炎、ＡＲＤＳ、敗血症及びアテローム性動脈硬化症など の疾患状態に見出される遊離脂肪酸の高い濃度（高脂血症）を低下させるのに用 い得る。 ＡＬＢに関して提案される機能に類似して、ＡＦＭは場合によっては酸化防止 剤としても用い得る。ＡＦＭは、金属イオンを封鎖して該イオンが遊離基反応（ 即ち脂質過酸化物のペルオキシ及びアルコキシラジカルへの分解；過酸化水素か らのヒドロキシルラジカルの生成）を加速するのを防止することにより酸化防止 剤として機能すると考えられ、あるいはまたＡＦＭは、過酸化水素、ヒドロキシ ルラジカル及び次亜塩素酸を直接不活性化するべく機能し得る。ＡＦＭによる酸 素代謝物の無毒化は、有益な抗プロテアーゼ（α₁−抗プロテイナーゼ及びα₁− 抗トリプシン）の不活性化並びにＤＮＡ、タンパク質及び脂質の傷害において遊 離の酸素代謝物が有する有害な作用を制限し得る。即ち、ＡＦＭは、虚血−再灌 流損傷、慢性関節リウマチ、ＡＲＤＳ、心肺バイパス、敗血症、並びに白血球及 び／またはアラキドン酸代謝由来の酸素代謝物の過剰生成により惹起される他の 任意の疾患または組織傷害を改善するのに用い得る。 ＡＦＭの更に別の用途は、アルブミンファミリーのタン パク質は人工薬物を含めたきわめて様々な有毒生成物と結合して当該生成物を無 毒化するという発見に基づく。即ち、ＡＦＭは、炎症の結果として放出される有 毒な血漿物質の作用を改善し得、また有毒な医薬と結合して薬物の有害な活性を 最小限に留め得る。 ＡＦＭは、ＡＬＢに関して報告されているような抗凝血特性も有し得る。ＡＦ Ｍは血小板凝集を抑制し得、即ち敗血症、出血性ショック及び熱傷などの、血小 板凝集の亢進を特徴とする疾患状態において蘇生液への有用な添加物となり得る 。 血中ＡＦＭレベルは、ＡＦＰに関して観察されているように、特定の病的状態 に起因して上昇または低下し得る。即ち、実施例１１に述べた抗体を利用しての 血中ＡＦＭレベルの算出は、特定のヒト疾患の診断に有用である。ＡＦＭの投与 ｉｎ ｖｉｖｏ投与のためには、ＡＦＭを滅菌等張製剤中に存在させ、当業者 に良く知られた標準的な手段で投与する。ＡＦＭの製剤は好ましくは液剤で、そ の際通常はｐＨ６．８〜７．６の０．５〜１０ｍＭカルシウム非リン酸塩緩衝液 を含有する生理的塩溶液であり、または前記製剤 は凍結乾燥散剤であり得る。 治療投与のための主要な経路として考えられるのは、静脈内送達、またはカテ ーテルもしくは他の管状外科器具を介しての送達である。他の経路には、錠剤等 、液剤用の市販ネブライザー、及び凍結乾燥またはエアゾル化レセプターの吸入 などが有る。液剤は、散剤から再構成した液剤も用い得る。 ＡＦＭは、マイクロスフェア、リポソーム、他の微粒状送達系、または血液を 含めた或る特定の組織中に配置した徐放製剤を介しても投与可能である。 ＡＦＭの投与量は、医師であれば十分理解できるように、用いるＡＦＭの特性 、例えばその活性及び生物学的半減期、製剤のＡＦＭ濃度、ＡＦＭ投与経路、投 与部位及び投与速度、投与を受ける患者の臨床的許容量、患者が罹患した病的状 態等に依存する。 ＡＦＭは、抗生物質、抗炎症薬及び抗腫瘍薬など、他の薬物と共に投与するこ とも可能である。ＡＦＭをγ−インターフェロンその他の免疫調節剤と共に投与 することも有用であり得る。ＡＦＭのリガンド 本発明のＡＦＭが１個以上の付加的な天然リガンド（本明細書に検討した脂質 以外）を有すること、及びそのリガンドがｉｎ ｖｉｖｏでＡＦＭの生物活性を 調節し得ることも可能である。当業者であれば、本発明の教示を用いてここに開 示したＡＦＭのリガンドをスクリーニングし、検出したリガンドを、例えば固体 支持体に結合させたＡＦＭまたはその変異体を用いる免疫クロマトグラフィーに よって単離及び精製し得よう。ＡＦＭに対する抗体 ＡＦＭまたはその変異体に特異的である抗体（例えばモノクローナル及びポリ クローナル抗体、１本鎖抗体、キメラ抗体、ＣＤＲグラフト抗体等）または他の 結合タンパク質も、本発明の範囲内に含まれる。抗体は、天然または組み換えＡ ＦＭもしくはＡＦＭ変異体、またはその表面において前記のような分子を発現さ せる細胞を用いて開発することができる。このようにして得られる抗体の活性フ ラグメントも本発明の一部である。 上記抗体は、本明細書に開示したポリペプチドの精製、またはその表面に前記 ポリペプチドを産生する細胞の同定及び精製に有用である。上記抗体は、ＡＦＭ に結合するリ ガンドの調節（例えば遮断、抑制または刺激）にも用い得る。抗イディオタイプ 抗体も本発明の範囲内である。細胞表面上、及び体液（血清、血液、脳脊髄液、 尿、精液、乳及び涙）中に存在するＡＦＭを検出及び定量するアッセイでは、単 一抗体、または「サンドイッチ」アッセイ方式を用い得る。 本発明の教示を特定の問題または状況に適用することは、本明細書に含まれる 教示を参照すれば当業者には可能であると理解される。本発明の生成物の例、並 びにそれらを単離、使用及び製造する代表的な方法を後段に示す。引用した文献 及び特許は総て明らかに本明細書に参考として含まれる。実施例 実施例１ リポ多糖類（ＬＰＳ）中和アッセイ Ａ． ＥＬＰＳの形成 最初にヒツジ赤血球を上記の通りにＳ．ｍｉｎｎｅｓｏｔａ Ｒｅ５９５ Ｌ ＰＳ（Ｌｉｓｔ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）で被覆する（Ｊ．Ｅｘ．Ｍｅｄ．１７ ０：１２３１）。赤血球を被覆するのに使用するＬＰＳの濃度は赤血球８ｘ１０⁷ 個当たり１０ｍｇである。ＬＰＳで被覆した後に、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０ ．１％ゼラチン、及び、１ｍＭ ＥＤＴＡ（ＥＤＴＡＧＶＢ^2-）を含む５ｍＭベ ロナール緩衝液（ｐＨ ７．５）中に、１ｘ１０⁸細胞／ｍＬの濃度で赤血球を 再懸濁させる。 Ｂ． ＥＬＰＳのオプソニン作用 オプソニン作用タンパク質（ｓｅｐｔｉｎ）源として正常ヒト血漿（ＮＨＰ） を使用してＥＬＰＳをオプソニン化する（Ｊ．Ｅｘ．Ｍｅｄ．１７６：１２３１ ）。１ｍＭ ＥＤＴＡ（ＰＤＥＤＴＡ）を含むリン酸緩衝塩水液（二価カチオン は含まない）中でＮＨＰを１：１００に希釈し、ＥＬＰＳ（１×１０⁸細胞／ｍ Ｌ）と１：１で混合する。この混合液を３７℃ で１０分間インキュベートし、スイング型バケット遠心分離機で８００×ｇで１ 分間遠心分離する。細胞をＥＤＴＡＧＶＥ^2-で２回洗浄し、ＥＤＴＡＧＶＢ^2-中 に１×１０⁸細胞／ｍＬの最終濃度に再懸濁させる。上記の通りに処理した赤血 球をＥ−ｓｅｐｔｉｎと呼ぶ。 Ｃ． ＬＰＳ中和活性を調べるための試料アッセイ 次に説明するステップは、ＣＤ−１４に依存した仕方でマクロファージに結合 するＬＰＳ被覆赤血球の結合量を低減させる所与の試料の能力を測定する。 試験対象試料の希釈液をＰＤＥＤＴＡ中で作る。Ｅ−ｓｅｐｔｉｎを試料希釈 液と１：１で混合し、４０分間３７℃でインキュベートする。対照試料として、 Ｅ−ｓｅｐｔｉｎをＰＤＥＤＴＡだけと共にインキュベートする試料を１つ含む 。インキュベーションの後で、Ｅ−ｓｅｐｔｉｎをスイング型バケット遠心分離 機で８００×ｇで１分間遠心し、ＥＤＴＡＧＶＢ^2-中に１ｘ１０₈細胞／ｍＬの 最終濃度に再懸濁させる。このように処理したＥ−ｓｅｐｔｉｎをＥ−ｓｅｐｔ ｉｎ¹と呼ぶ。再懸濁させたＥ−ｓｅｐｔｉｎ¹５ｍＬを、６０穴ｔｅｒａｓａｋ ｉ ｐｌａｔｅ（ＮＵＮＣ，Ｉｎｃ．）内のマクロファージ 単層に加える。このプレートを室温で２０分間インキュベートし、その後で反転 させ、更に室温で１２分間インキュベートし、非結合Ｅ−ｓｅｐｔｉｎ¹をマク ロファージから分離させる。プレートを、アジド０．００１％を含む冷ＰＢＳ（ 二価カチオンは含まない）を入れたビーカーの中に浸し、非結合赤血球を洗浄し て取り除く。Ｅ−ｓｅｐｔｉｎ¹の結合を位相差顕微鏡で調べる。結合を、マク ロファージ１００個当たりの結合赤血球数を表す付着指数（ａｔｔａｃｈｍｅｎ ｔ ｉｎｄｅｘ）として表す。ＰＤＥＤＴＡ中の試料希釈液と共にインキュベー トしたＥ−ｓｅｐｔｉｎ¹の結合を、ＰＤＥＤＴＡだけと共にインキュベートし たＥ−ｓｅｐｔｉｎ¹の結合と比較することによって、試料のＬＰＳ中和活性を 評価する。この活性を単位／ｍＬとして測定する。これは、試料が標準的アッセ イでＥ−ｓｅｐｔｉｎ¹結合を５０％低減させる希釈度を表す。 Ｄ． マクロファージ単層 単核細胞誘導マクロファージを、上記の通りにテフロンビーカー中でヒト単核 細胞を培養することによって得る（Ｊ．Ｅｘ．Ｍｅｄ．１５９：１１４９）。上 記アッセイの当日に、マクロファージをビーカーから取り出し、二価カチオンを 含むＰＢＳ （ＰＢＳ²⁺）で洗浄し、ヒト血清アルブミン（Ａｒｍｏｕｒ Ｐｈａｒｍ．）０ ．５ｍｇ／ｍＬとアプロチニン（Ｓｉｇｍａ）０．３Ｕ／ｍＬと３ｍＭグルコー ス（ＨＡＰ緩衝液）を含むＰＢＳ²⁺ 中に１ｘ１０⁶細胞／ｍＬの濃度に再懸濁 させる。上記ｔｅｒａｓａｋｉ ｐｌａｔｅにＥ−ｓｅｐｔｉｎ¹を加える３０ 分前に、細胞５ｍＬとＨＡＰ緩衝液５ｍＬとを各々のプレート穴に加えることに よってマクロファージ単層を形成する。Ｅ−ｓｅｐｔｉｎ¹を加える直前に、プ レートをＰＤＥＤＴＡであふれさせ、穴を僅かに吸引する。実施例２ ＡＦＭの精製 特記した場合を除いて、室温に調整した温度で全てのステップを行った。全て の緩衝液を、発熱物質を含まない水で作り、使用前に滅菌濾過した。新鮮な凍結 血漿（ＦＦＰ）１単位を、室温の水浴中にパケットを浸すことによって解凍した 。解凍した血漿を最初にメスシリンダーに移して、体積を測定し、ビーカーの中 に注入した。その後で、ビーカーを氷水浴中に浸けたままＦＦＰを磁気撹拌した 。十分な量の３．９Ｍ硫酸アンモニウム（４℃）をＦＦＰにゆっくりと加え、１ ．６Ｍの最終硫酸 アンモニウム濃度を得た。この混合物を４℃で更に４時間撹拌した。混合物を６ ０分間１０，０００Ｘｇで遠心した。上清液を回収し、室温の水浴中に浸けるこ とによって室温にした。 この硫酸アンモニウム上清液の一部（２５０ｍＬ）を、５０ｍＭリン酸ナトリ ウムと１．６Ｍ硫酸アンモニウム（ｐＨ７．５）とで予め平衡化したＰｈｅｎｙ ｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰカラム（２．６ｘ１０ｃｍ）上にロードした。ロ ーディングと洗浄と溶出を４０ｃｍ／時の直線流速で行った。試料添加の後に、 ５０ｍＭリン酸ナトリウムと１．６Ｍ硫酸アンモニウム（ｐＨ７．５）と５０ｍ Ｍ硫酸ナトリウム（ｐＨ７．５）でカラムを洗浄した。水を導入することによっ て活性画分の溶出（実施例１を参照されたい）を完了させた。０．１Ｍトリス塩 基で水溶出液のｐＨを８．２に調整し、２０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．２）で予 め平衡化したＱ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰカラム（２．６ｘ１０ｃｍ）上に１ ５０ｃｍ／時の流速でロードした。試料添加の後に、最初に２０ｍＭトリス塩酸 でカラムを十分に洗浄し（ｐＨ８．２）し、更に、０．１Ｍ塩化ナトリウムと２ ０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．２）で洗浄した。その後で、０．１Ｍから０．３Ｍ の範囲内の塩化ナトリウムの ０．３３ｍＭ／ｍＬ直線勾配でカラムから溶出分離させ、更にその後で、２０ｍ Ｍトリス塩酸（ｐＨ８．２）中の０．３Ｍから１．０Ｍの範囲の塩化ナトリウム の７ｍＭ／ｍＬ直線勾配によってカラム溶出分離させた。活性画分をプールした （３０ｍＬ）。 こうして得た活性画分プールの１／３を、リン酸緩衝塩水液（ｐＨ７．４）で 予め平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００分取カラム（２．６×１０ｃｍ）上に ロードした。カラムのローディングと溶出分離とを、１ｍＬ／分の流速で行った 。還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって画分の活性を分析した。還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ によって、適切な画分のプール（８ｍＬ）が、分子量８７ｋｄと分子量２８ｋｄ の２つの主要なタンパク質バンドを示した。上記プールの２ミリリットルを配列 分析のために使用した。２８ｋｄタンパク質はＡｐｏＡ１と同じＮ末端を有し、 ８７ｋｄタンパク質は新たなＮ末端を有した（下記を参照）。Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ 分取カラムからの溶出液プールの残りの６ｍＬを、１％デオキシコー ル酸ナトリウムと０．１５Ｍ塩化ナトリウムと５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．５ ）とで予め平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ 分取カラム（２．６ ×６０ｃｍ）上にロードした。カラムのローディングと溶出分離を１ｍＬ／分の 流速で行った。画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。８７ｋｄタンパク質に相当 する画分と２８ｋｄタンパク質に相当する画分を別々にプールした（各々１６ｍ Ｌ）。 各プール４ミリリットルを５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．５）に対し透析濾過 して、過剰のデオキシコール酸ナトリウムを取り除き、約０．１ｍｇ／ｍＬに濃 縮した。実施例３ 精製ＡＦＭのＮ末端とタンパク質加水分解フラグメントのアミノ酸配列分析 Ｎ末端配列を得るために、１０μｇの精製ＡＦＭを、プレサイクル二相配列決 定カラム（ｐｒｅｃｙｃｌｅｄ ｂｉｐｈａｓｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｃ ｏｌｕｍｎ）の逆相部分にロードした。このカラムを、Ｈｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃ ｋａｒｄ Ｇ１００４Ａ タンパク質シークエンサーにロードし、Ｈｅｗｌｅｔ ｔ Ｐａｃｋａｒｄ １０９０ 高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）に よるオンラインのフェニルチオヒダントインアミノ酸分析を行った。このタンパ ク質から得たＮ末端アミノ酸配列は次の通りであり、 この配列中の「Ｘ」は確定不可能なアミノ酸を表す。 ＡＦＭのトリプシン消化ペプチドから配列を得るために、１００ｍｇのＡＦＭ を、０．４Ｍ炭酸水素アンモニウムと共に８Ｍ尿素中に溶解した後、ＤＴＴで還 元し、ヨード酢酸でカルボキシメチル化した。その後で、試料を水で希釈し、尿 素濃度を２Ｍに調整し、１：５０の「酵素」対「基質」の比で１８時間に亙って ３７℃で配列決定グレードのトリプシン（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｇｒａｄｅ ｔｒｙｐｓｉｎ）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）で消化した。消 化したタンパク質を４．６ｘ２５０ｍｍ Ｃ−１８逆相カラム（Ｖｙｄａｃ）を 備えたＨｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ １０９０ ＨＰＬＣ上に注入した。０ ．７５ｍＬ／分の流速で、トリフルオロ酢酸０．１％を含むアセトニトリルの直 線勾配を使用して溶出分離を行った。溶出を２１４ｎｍで監視し、画分を集めた 。選択した画分を上記の通りにＨｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ Ｇ１００４Ａ タンパク質シークエンサーにかけた。選択したトリプシン消化フラグメントか ら得たアミノ酸配列を下記の表１に要約した。 実施例４ ＡＦＭ ｃＤＮＡの単離 正確なプローブを誘導することが可能なＡＦＭ遺伝子の一部を増幅するために 、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用した。最初に、Ｎ末端アミノ酸配列Ｑ ＫＦＩＥＤＮ（配列番号：１５）［５′ＡＣＧ ＣＴＧ ＡＡＴ ＴＣＧ ＣＣ Ａ （ＧＡ）ＡＡ （ＧＡ）ＴＴ （ＣＴ）ＡＴ （ＡＴＣ）ＧＡ （ＧＡ）Ｇ Ａ （ＣＴ）ＡＡ］（配列番号：１６）をコードするセンス鎖と、ＦＸ２９トリ プシン消化ペプチド配列ＩＶＱＩＹＫＤ（配列番号：１７）［５′ＡＣＧ ＣＴ Ａ ＡＧＣ ＴＴＧ Ｃ（ＧＡ）Ｔ Ｃ（ＣＴ）Ｔ Ｔ（ＧＡ）Ｔ Ａ（ＧＡＴ）Ａ Ｔ（Ｃ Ｔ）Ｔ Ｇ（ＡＧＣＴ）Ａ Ｃ（ＧＡＴ）Ａ Ｔ］（配列番号：１８）をコード するアンチセンス鎖とを特定する完全縮重プライマーを使用して、ＰＣＲ（ＰＣ Ｒ１）を行った。１ｎｇのＱｕｉｃｋ Ｃｌｏｎｅ Ｈｕｍａｎ ｌｉｖｅｒ ｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，ｃａｔ．ｎｏ．７１１３−１）を、各縮重プライ マー１ｍＭを使用して標準緩衝液（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ）中 で行った１００ｍＬ ＰＣＲにおいて鋳型として使用した。このＰＣＲで使用し たサイクリングパラメーターは次の通りである：９５℃、８分（１サイクル）； ９４℃、１分、３４℃、１０分、７２℃、２分（３サイクル）；９４℃、１分、 ５０℃、１分、７２℃、２分（４５サイクル）；７２℃、５分（１サイクル）。 ＰＣＲ１のアガロースゲル分析では特定の生成物の増幅を示さなかったので、 ネストした（ｎｅｓｔｅｄ）プライマー対を使用する第２のＰＣＲ（ＰＣＲ２） のための鋳型としてＰＣＲ１のアリコートを使用した。この実験のために、Ｎ末 端アミノ酸配列ＤＮＩＥＹＩＴ（配列番号：１９）［５′ＡＣＧ ＣＴＧ ＡＡ Ｔ ＴＣＧ ＣＧＡ（ＣＴ）ＡＡ（ＣＴ）ＡＴ （ＡＴＣ）ＧＡ （ＧＡ）ＴＡ （ＣＴ）ＡＴ （ＡＴＣ）ＡＣ］（配列番号： ２０）をコードするセンス鎖と、ＦＸ２０トリプシン消化ペプチド配列ＦＴＦＥ ＹＳ（配列番号：２１）［５′ＡＣＧ ＣＴＡ ＡＧＣ ＴＴＧ Ｃ（ＧＡＴＣ ）Ｇ Ａ（ＧＡ）Ｔ Ａ（ＣＴ）Ｔ Ｃ（ＧＡ）Ａ Ａ（ＡＣＧＴ）Ｇ Ｔ（Ｇ Ａ）Ａ Ａ］（配列番号：２２）をコードするアンチセンス鎖とを特定する完全 縮重プライマーを使用した。その後で、ＰＣＲ２を、ヒト肝臓ｃＤＮＡの代わり に１ｍＬのＰＣＲ１を使用したことを除いて、ＰＣＲ１と同じ反応混合物とサイ クリングパラメーターを使用して、ＰＣＲ２を行った。アガロースゲル電気泳動 によるＰＣＲ２分析は、１ｋｂ生成物の増幅を示した。 ＤＮＡ配列決定のためのＰＣＲ２を準備するために、縮重プライマーの中に組 み込まれたＥｃｏＲ Ｉ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位を使用した。これらの部位を 、上記フラグメントをｍｐ１９（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）の 中にクローニングするために使用した。その後で、ｍｐ１９（ｍｐ１９ ＡＦＭ ）中にクローニングされた１ｋｂ ＰＣＲ２生成物を、両方の鎖から全体の配列 を決定した。上記フラグメント のヌクレオチド配列分析によって、すでに配列決定された３つのトリプシン消化 ペプチドをコードするオープンリーディングフレームをその配列が有することが 判明した（表１、Ｆｘｓ２７、４５、５３）ので、ＡＦＭ ｃＤＮＡのセグメン トが増幅されたことが確認できた。１ｋｂフラグメントのヌクレオチド配列を、 Ｇｅｎｂａｎｋデータベースのすべての配列と比較し、ユニークであることを発 見した。本出願人は更に、部分ＡＦＭ ｃＤＮＡが、ＡＬＢファミリータンパク 質（ＡＬＢ、ＡＦＰ、ＶＤＢ）に関して報告されているｃＤＮＡと著しい相同性 を有することを発見した。従って、ＡＦＭをコードする全長ｃＤＮＡを単離して 、他のＡＬＢファミリー遺伝子とハイブリダイズする可能性を最小化するために 、ＡＬＢ、ＡＦＰ、ＶＤＢと高い相同性を持たないＡＦＭ配列セグメントから誘 導した正確な１８マーのオリゴヌクレオチド（５′ＴＡＴ ＧＴＧ ＣＴＡ Ｔ ＧＧ ＡＧＧ ＧＧＣ）（配列番号：２３）でヒト肝臓ｃＤＮＡライブラリーを スクリーニングした。このオリゴヌクレオチドを³²Ｐ_iで末端標識し、ヒト肝臓 ｃＤＮＡライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，ｃａｔ．ｎｏ．ＨＬ１１１５ａ）を スクリーニングするために使用した。陽性のクローンを 精製し、同じオリゴヌクレオチドプローブを使用して再選別した。２．３ｋｂの 挿入体を有する単一の陽性クローン（１７ＡＦＭ）を、更に調査を行うために選 択し、ファージＤＮＡを調製した。その後で、上記２．３ｋｂ挿入体を両方の鎖 から全体の配列を決定し、ＡＦＭをコードすることを検証した。 このアプローチによって、全長ＡＦＭ ｃＤＮＡを含むラムダファージ（１７ ＡＦＭ）を単離することが可能になった。実施例５ ＡＦＭの特性決定 １７ＡＦＭ中の挿入体は、３１７ｂｐの５′非翻訳領域と、５９９アミノ酸の タンパク質をコードする１７９７ｂｐの配列と、１７３ｂｐの３′非翻訳領域と から成る、２２８７ｂｐである（図１）。ＡＦＭの推定アミノ酸配列が、上記精 製タンパク質から事前に配列決定されていたトリプシン消化ペプチドの全て（表 １を参照されたい）を含むことを見出した。ＡＦＭ ｃＤＮＡ配列の翻訳によっ て、実験によって確定した成熟ＡＦＭのＮ末端の前に２１アミノ酸疎水性リーダ ーペプチドが位置することが判明した。成熟ＡＦＭが５７８アミノ酸を有し、計 算上のＭｒが６６５７６でｐＩが５．６５であると予測される。 ＡＦＭの計算上のＭｒとＳＤＳ−ＰＡＧＥによる見掛け分子量との間の差異は、 グリコシル化に起因すると考えられる。ＡＦＭは、４つのＮ−グリコシル化可能 部位を有し（図１）、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析（データは示していない ）では、Ｎ−グリカナーゼ処理がＡＦＭの見掛けＭｒを６５０００に低減させた 。 推定ＡＦＭアミノ酸配列と他のＡＬＢファミリータンパク質配列の比較を図２ に示す。ＡＦＭと他のＡＬＢファミリータンパク質との間では、そのタンパク質 全体に亙って著しい類似性があることが明らかである。保存アミノ酸を考慮に入 れると、ＡＦＰに対するＡＦＭの相同性は６０．４％であり、ＡＬＢに対するＡ ＦＭの相同性は５４．８％であり、ＶＤＢに対するＡＦＭの相同性は４１．２％ である。ＡＬＢファミリーのメンバーではＣｙｓ残基の分布が保存される。ＡＦ Ｍ Ｃｙｓ残基の位置は明らかにこの配置と一致している（図３）。更に、３つ の構造ドメインを画定する一連の９つの二重ループとしてこれらのタンパク質が 表されることを可能にするジスルフィド架橋パターンを、ＡＬＢファミリータン パク質中のＣｙｓ残基が形成するということも主張されている。ＡＦＭ中の３４ 個の Ｃｙｓ残基を、他のＡＬＢファミリータンパク質に認められるドメイン構造に対 応する１７個のジスルフィド結合対のパターンの形に配列することが可能である ことを、図４は示している。実施例６ 染色体マッピング 遺伝子の染色体位置を特定するために体細胞雑種（Ｂｉｏｓ Ｌａｂｏｒａｔ ｏｒｉｅｓ，ｃａｔ．ｎｏ．ＣＰ２−０２）のパネル上でＰＣＲを行った。ＰＣ Ｒのために、ＡＦＭ ｃＤＮＡ内のヌクレオチド１７９０とヌクレオチド１８７ ８との間の８８ｂｐフラグメントを増幅すると予測されるプライマー（５′ＣＡ Ａ ＣＣＣ ＴＧＣ ＴＧＴ ＧＧＡ ＣＣＡ Ｃ；５′ＧＣＡ ＣＡＴ ＡＴ Ｇ ＴＴＴ ＴＡＴ ＣＡＧ ＣＴＴ Ｔ）（配列番号：２４、及び、配列番号 ：２５）を使用した。体細胞雑種ＤＮＡ上での各々のＰＣＲを、２５０ｎｇのＤ ＮＡを含み且つ各プライマーの最終濃度が０．１ｍＭである標準１００ｍＬ反応 混合液（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ）中で行った。サイクリングパ ラメーターは次の通りである：９５℃、５分（１サイクル）；９４℃、１分、５ ６℃、１分、７２℃、１分（２５サイクル）；７２℃、５分（１ サイクル）。 市販品の体細胞雑種パネル上でＰＣＲを行った（データは示していない）時に は、２つの雑種において増幅生成物を検出しただけだった。この２つの雑種は両 方ともヒト染色体４、５及び８番由来の共通のＤＮＡを有していた。染色体５及 び８番由来のＤＮＡを含む雑種に対して行ったＰＣＲでは増幅生成物が得られな かったので、ＡＦＭが他のＡＬＢファミリー遺伝子と共にヒト染色体４番上に存 在すると結論付けた。実施例７ ｒＡＦＭの安定発現 ＡＦＭ ｃＤＮＡ配列全体に及ぶ２つのオーバーラップフラグメントを生じさ せるために、２つの別々のＰＣＲをＡＦＭ ｃＤＮＡ上で行った。第１のＰＣＲ で使用したオリゴヌクレオチド対（５′ＴＣＡ ＣＣＴ ＣＴＡ ＧＡＣ ＣＡ Ｃ ＣＡＴ ＧＡＡ ＡＣＴ ＡＣＴ ＡＡＡ ＡＣＴ ＴＡＣ ＡＧ ＋ ５ ′ＡＡＴ ＴＴＣ ＴＣＡ ＧＧＡ ＧＡＴ ＣＴＴ ＴＧＴ ＡＴＡ）（配列 番号：２６、及び、配列番号：２７）は、ＡＦＭ開始コドンの前にＸｂａ Ｉ部 位と完全なＫｏｚａｋ配列とを導入した。その後で、増幅生成物をｐＧＥＭＴ （Ｐｒｏｍｅｇａ）中にクローニングし、ｐＤＪ１１を生じさせた。第２のＰＣ Ｒで使用したオリゴヌクレオチド対（５′ＡＡＡ ＴＡＴ ＡＣＡ ＡＡＧ Ａ ＴＣ ＴＣＣ ＴＧＡ ＧＡＡ ＋ ５′ＴＣＣ ＣＧＧ ＴＣＧ ＡＣＴ Ｃ ＡＧ ＴＴＧ ＣＣＡ ＡＴＴ ＴＴＴ ＧＧＡ Ｃ）（配列番号：２８、及び 、配列番号：２９）は、ＡＦＭ内の天然の停止コドンの後にＳａｌ Ｉ部位を導 入し、生成物をｐＧＥＭＴ中にクローニングし、ｐＤＪ１３を生じさせた。その 後で、ｐＤＪ１３からのＢｇｌ ＩＩ−Ｓａｌ Ｉフラグメントを、Ｂｇｌ Ｉ ＩとＳａｌ Ｉとで消化しておいたｐＤＪ１１の中に結合させることによって、 ＡＦＭの３′末端を５′末端に結合させた。その結果得たプラスミド（ｐＤＪ１ ４）をＸｂａ ＩとＳａｌ Ｉとで消化し、ＡＦＭ ｃＤＮＡ全体を単一のＸｂ ａ Ｉ部位とＳａｌ Ｉ部位を含むように改変した哺乳動物発現ベクターｐＤＳ Ｒａ（欧州特許出願公開第２０３９８７５３号）中にクローニングした。このＡ ＦＭ発現ベクターを、ジヒドロ葉酸レダクターゼが欠損したチャイニーズハムス ター卵巣（ＣＨＯ）細胞系（ＣＨＯ Ｄ^-）をトランスフェクションさせるため に使用した。ヒポキサンチンとチミジンとを欠く培地 中でトランスフェクタントを選択した。ＡＦＭ特異性ｍＲＮＡを有するトランス フェクタントを選別するスクリーニングを行うために、ＲＮａｓｅ保護アッセイ を使用した。ｒＡＦＭを含むならし培地（ＣＭ）を生じさせるために、上記の通 りに単一のクローンを血清なしで成長させた（Ｂｏｕｒｄｒｅｌ，Ｌ．他，Ｐｒ ｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐｕｒｉｆ．４：１３０（１９９３）を参 照されたい）。 高レベルのＡＦＭ特異ｍＲＮＡを発現させる１つの安定トランスフェクタント を単離した。ＡＭ３９９を使用して行った免疫ブロット（実施例１２参照）は、 この抗体が、そのトランスフェクタントから生じたｒＡＦＭと、ヒト血漿から単 離した天然ＡＦＭとの両方を認識することを実証している（図５）。このトラン スフェクタントから得たＣＭからｒＡＦＭを精製し（図６）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ によって、ｒＡＦＭの純度が９５％よりも高く、血漿から精製したＡＦＭと同じ Ｎ末端を有することが明らかになった（データは示していない）。実施例８ タンパク質精製 血清を含まないＣＭを１０倍に濃縮し、１０Ｋ分子量カット オフフィルターを装着したＦｉｌｔｒｏｎ限外濾過装置を使用して、２５ｍＭリ ン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）に対して透析濾過した。その後で、最終硫酸アン モニウム濃度が１．６ＭとなるようにＣＭを３．９Ｍ硫酸アンモニウムで調整し た。この混合液を０．５時間攪拌した。沈殿物は全く観察できなかった。その後 で、０．４５ｍｍフィルターと０．２２ｍｍフィルターを連続して通過させるこ とによって溶液を濾過した。その結果得られた濾液を、５０ｍＭリン酸ナトリウ ムと１．６Ｍ硫酸アンモニウム（ｐＨ７．５）とで予め平衡化したＰｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰカラム上にロードした。ローディングと洗浄と溶出 を４０ｃｍ／時の直線流速で行った。試料添加の後に、カラムを５０ｍＭリン酸 ナトリウムと、１．６Ｍ硫酸アンモニウム（ｐＨ７．５）と、５０ｍＭリン酸ナ トリウム（ｐＨ７．５）で連続的に洗浄した。ｒＡＦＭを水で溶出させ、免疫ブ ロットで検出した（下記参照）。 ０．１Ｍトリス塩基で水溶出液のｐＨを８．０に調整し、２０ｍＭトリス塩酸 （ｐＨ８．０）で予め平衡化したＱ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰカラム上に１０ ０ｃｍ／時の流速でロードした。試料添加の後に、最初に２０ｍＭトリス塩酸 （ｐＨ８．２）でカラムを十分に洗浄し、更に、０．１Ｍ塩化ナトリウムと２０ ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．２）で洗浄した。その後で、２０ｍＭトリス塩酸（ｐ Ｈ８．０）中の０Ｍから０．３Ｍの範囲内の塩化ナトリウムの３カラム体積（Ｃ Ｖ）直線勾配でカラムの溶出分離を行い、更にその後で、２０ｍＭトリス塩酸（ ｐＨ８．０）中の０．３Ｍから１．０Ｍの範囲の塩化ナトリウムの１ＣＶ直線勾 配によってカラムの溶出分離を行った。ｒＡＦＭを含む画分をプールし、リン酸 緩衝塩水液（ｐＨ７．４）で予め平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００カラム上 にロードした。カラムローディングと溶出分離を流速１ｍＬ／分で行った。実施例９ ＡＦＭの脱脂質化 １容のタンパク質溶液に２．５容の１−ブタノール／ジイソプロピルエーテル （４０：６０）を加えた。その混合液を室温で３０分間静かに攪拌した後、５０ ０×ｇで５分間遠心した。水層を回収し、この水層に別の２．５容の１−ブタノ ール／ジイソプロピルエーテル（４０：６０）を加えた。上記の通りに試料を処 理し、水相を回収した。２回抽出した水相に、１容の ジイソプロピルエーテルを加え、混合液を振とうし、すぐに２５０×ｇで５分間 遠心した。水層を回収し、実質的に脱脂質化した状態で使用した。実施例１０ 免疫ブロッティング 免疫ブロッティング用の試料の全てを、４−２０％ ＳＤＳポリアクリルアミ ドゲル（Ｎｏｖｅｘ）上で電気泳動した後に、ニトロセルロース膜（Ｓｃｈｌｅ ｉｃｈｅｒ ａｎｄ Ｓｃｈｕｅｌｌ，ｃａｔ．ｎｏ．ＢＡ８３）上に電気泳動 によって移動させた。最初にフィルターを、ＡＦＭ中のアミノ酸３０４−３１９ から誘導した合成ペプチド（ＤＬＳＬＲＥＧＫＦＴＤＳＥＮＶＣ）（配列番号： ３０）に対してウサギ体内で産生させたポリクローナル抗体ＡＭ３３９で処理し 、更にその後で、セイヨウワサビペルオキシダーゼに結合したロバ抗ウサギ Ｉ ｇ（ｄｏｎｋｅｙ ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ Ｉｇ）で処理した。製造者（Ａｍ ｅｒｓｈａｍ）の指示に従って増強化学発光によって免疫複合体を視覚化した。実施例１１ ヌクレオチド配列の比較 Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ），Ｉｎｃ．（Ｍ ａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）のＦＡＳＴＡプログラム中のＰｅａｒｓｏｎ及びＬｉｐｍ ａｎの方法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４，２４４４ −２４４８（１９８８））を使用して、ヌクレオチド配列をＧｅｎｂａｎｋ（Ｒ ｅｌｅａｓｅ ７８．０）配列と比較した。比較結果を図２Ａに示す。実施例１２ ＡＦＭ特異性ペプチド抗体の作製 ＡＦＭがアルブミンファミリーの３つ以上のメンバーに類似していたので、こ のタンパク質全体に対して作製した抗体が他のアルブミンファミリータンパク質 と交差反応すると考えられる。ＡＦＭ特異性抗体を作製するために、他のアルブ ミンファミリータンパク質に見出されるペプチド配列に類似していないＡＦＭの 特異的ペプチドを同定した。その後で、こうしたペプチド配列を合成し、その合 成ペプチドをウサギに注射して、各ペプチドに対するポリクローナル抗血清を得 た。合成したＡＦ Ｍペプチドは次の通りである。 ＡＦＭ中のａａ４３−５６ 対応する抗体をＡＭ３８４と呼ぶ。 ＡＦＭ中のａａ２９２−３０８ 対応する抗体をＡＭ６０９と呼ぶ。 ＡＦＭ中のａａ３０４−３１９ 対応する抗体をＡＭ３３９と呼ぶ。 ＡＦＭ中のａａ３１９−３３４ 対応する抗体をＡＭ１１０４と呼ぶ。実施例１３ ＡＦＭに対するポリクローナル抗血清の作製 ウサギポリクローナル抗血清を、当業界で標準的な方法によって精製ＡＦＭか ら作製した。この抗血清がＡＦＭに特異的に結合することが判明した。実施例の考察 ＡＬＢファミリータンパク質は３つの相同な折りたたみドメインから構成され 、６つのジスルフィド架橋によって形成される３つの二重ループを含む約１９０ アミノ酸の単一ドメインタンパク質をコードした先祖遺伝子から進化してきたと 推測されている。ＡＬＢファミリータンパク質の遺伝子は４番染色体の４ｑ１１ −ｑ２２領域に全てマッピングされている。ＡＦＭはＡＬＢファミリータンパク 質と著しく高い相同性を有し、類似の３つのドメイン構造全体と一致したＣｙｓ 残基を有する。これに加えて、ＡＦＭは４番染色体に局在化されている。従って 、ＡＦＭがＡＬＢファミリーの第４のメンバーであるという確実な証拠がある。 ＡＬＢファミリーのメンバー相互間には幾つかの注目すべき相違点がある。成 人血清中のＡＦＰ濃度は５０ｎｇ／ｍＬであり、ＶＤＢ濃度は３５０ｍｇ／ｍＬ であり、ＡＬＢ濃度は４０ｍｇ／ｍＬであり、ＡＦＭ濃度は３０ｍｇ／ｍＬであ る（免疫ブロット分析で得たデータ）。ＡＬＢはグリコシル化されず、ＡＦＰと ＶＤＢは各々に１つのＮ−グリコシル化可能部位を有するが、ＡＦＭは４つのＮ −グリコシル化可能部位を有する。 ＡＬＢは、Ｃｙｓ、グルタチオン、水銀剤(mercurial)、及び、金化合物との錯 体形成に関連した１つの遊離チオール基を発現させる。これとは対照的に、ＡＦ ＰとＶＤＢは偶数個のＣｙｓ残基を有し、一方、遊離チオールを持たないと考え られている。ＡＦＭは偶数個のＣｙｓ残基を有し、これは、ＡＦＭが遊離チオー ルを持たず、ＡＬＢとは違ってグルタチオンと水銀剤とに結合し得ないことを示 唆している。 更に、ＡＬＢファミリーメンバー間では、ドメイン内ジスルフィド結合パター ンに差異がある。ＶＤＢが二重ループ１Ａにジスルフィド架橋を有することが推 測されている。この架橋はＡＬＢとＡＦＰとＡＦＭには存在しない。ジスルフィ ド架橋ドメイン２ＣはＡＬＢとＶＤＢとＡＦＭには共通であるが、ＡＦＰには存 在しない。従って、これらの４つのＡＬＢファミリータンパク質は進化的には関 連しているが、これらのタンパク質の分子構造には明らかな相違がある。 ＡＦＭと他のＡＬＢファミリーメンバーとの間の構造的類似性は、ＡＦＭが様 々なリガンドを捕捉又は輸送することが可能であることを示唆している。本出願 人は、ＡＬＢファミリータ ンパク質の配列内の既知のリガンド結合部位がＡＦＭ中にも存在するかどうかを 調べた。ＶＤＢは、アミノ酸３５−４９の間のステロール結合部位とアミノ酸３ ７３−４０３の間のアクチン結合部位とを有する。ＧＣＧ ＧＡＰプログラムと 図２Ａの整列させた配列とを使用すると、ＡＦＭがＶＤＢアミノ酸３５−４９の 間には６０％の類似性と４０％の同一性を有するが、ＶＤＢアミノ酸３７３−４ ０３の間には３２％の類似性と１０％の同一性しか有しない。従って、ＡＦＭが ステロール結合部位を有する（例えば、ＶＤＢのアミノ酸３５−４９に対応する ＡＦＭ中のアミノ酸）ことはあり得るが、アクチンに結合する可能性は考えられ ない。ドメイン２Ａ内のアミノ酸１８６−２６０の間でＡＬＢが様々なリガンド （アスピリン、ワルファリン、ＩＳ、ＤＩＳ、ＴＩＢ、ビリルビン）と結合し、 ドメイン３Ａ内のアミノ酸３７９−４５５の間でＡＬＢが一連のリガンド（アス ピリン、ジアゼパム、ジギトキシン、クロフィブレート、イブプロフェン、ＩＳ 、ＤＩＳ、ＴＩＢ、長鎖脂肪酸）と結合することを示すために、ＡＬＢのＸ線結 晶構造を使用した。ＡＦＭ中の類似領域の間のＧＣＧ ＧＡＰ比較によって、 ＡＦＭがドメイン２Ａ内に５４％の類似性と３５％の同一性を有し、ドメイン３ Ａ内に４５％の類似性と２５％の同一性を有することが明らかになった。こうし た中等度の類似性は、ＡＦＭがドメイン２Ａとドメイン３ＡとにおいてＡＬＢと 同じリガンドに結合すると結論付けることはできないまでも、そうであると推定 することを可能にする。略語 上記実施例で使用した略語は次の通りである。ＡＦＭ＝アファミン、ＡＦＰ＝ α-フェトプロテイン、ＡＬＢ＝ヒト血清アルブミン、ＣＨＯ＝チャイニーズハ ムスター卵巣、ＣＭ＝ならし培地、ＣＶ＝カラム体積、ＤＩＳ＝３，５−ジヨー ドサリチル酸、ＤＴＴ＝ジチオトレイトール、ＨＰＬＣ＝高性能液体クロマトグ ラフィー、ＩＳ＝５−ヨードサリチル酸、ＰＡＧＥ＝ポリアクリルアミドゲル電 気泳動、ＰＢＳ＝リン酸緩衝水類液、ＰＣＲ＝ポリメラーゼ連鎖反応、ｒ＝組換 え、ＴＩＢ＝２，３，５−トリヨード安息香酸、ＶＤＰ＝ビタミンＤ結合タンパ ク質 上記では本発明を詳細に説明してきたが、本明細書で説明する通りの本発明の 思想と範囲から逸脱することなしに本発明に 対して様々な変形と変更を加えることが可能なことが当業者には明らかだろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ１２Ｐ 21/02 9358−4Ｂ Ｃ１２Ｐ 21/08 21/08 7823−4Ｂ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ Ｃ１２Ｑ 1/68 0276−2Ｊ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ Ｇ０１Ｎ 33/53 0276−2Ｊ 33/577 Ｂ 33/577 9282−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)， ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｈ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ， ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，Ｍ Ｗ，ＭＸ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ， ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 リチエンステイン，ヘンリ・ステイーブン アメリカ合衆国、カリフオルニア・93004、 ベンチユラ、ルーサーン・ストリート・ 9586 (72)発明者 ライオンズ，デイビツド・エドウイン アメリカ合衆国、カリフオルニア・91320 −1789、サウザンド・オークス、トウルエ ツト・サークル・2027 (72)発明者 ワーフエル，マーク・マツオ アメリカ合衆国、ニユー・ヨーク・10021、 ニユー・ヨーク、イースト・セブンテイ・ ストリート・420 (72)発明者 ライト，サミユエル・ドナルド アメリカ合衆国、ニユー・ヨーク・10538、 ラーチモント、ブライアー・クローズ・２

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． ＡＦＭポリペプチド、又はＡＦＭに対して特異的な生物活性を有するその 変異体、をコードする精製単離されたポリヌクレオチド。 ２． ＤＮＡ配列である請求項１に記載のポリヌクレオチド。 ３． ｃＤＮＡ配列又はその生物学的レプリカである請求項２に記載のＤＮＡ配 列。 ４． ＡＦＭをコードする請求項３に記載のｃＤＮＡ配列。 ５． ゲノムＤＮＡ配列又はその生物学的レプリカである請求項３に記載のＤＮ Ａ配列。 ６． 更に内在性発現調節ＤＮＡ配列も含む請求項３に記載のＤＮＡ配列。 ７． 部分的に又は全体的に化学合成されたＤＮＡ配列又はその生物学的レプリ カである請求項３に記載のＤＮＡ配列。 ８． 請求項３に記載のＤＮＡ配列を含むＤＮＡベクター。 ９． 前記ＤＮＡ配列が発現調節ＤＮＡ配列に作動可能に結合されている請求項 ８に記載のベクター。 １０． ＡＦＭポリペプチド、又はＡＦＭに対して特異的な生 物活性を有するその変異体、がその宿主細胞中で発現することを可能にするよう に請求項３に記載のＤＮＡ配列によって安定的に形質転換又はトランスフェクシ ョンされた宿主細胞。 １１． 適切な栄養培地中で請求項８に記載の宿主細胞を成長させて、ＡＦＭポ リペプチド、又はＡＦＭに対して特異的な生物活性を有するその変異体、を前記 宿主細胞又は前記成長培地から単離することを含む、ＡＦＭポリペプチド又はそ の変異体を製造する方法。 １２． 精製単離されたＡＦＭポリペプチド、又はＡＦＭに対して特異的な生物 活性を有するその変異体。 １３． 図２のアミノ酸残基１からアミノ酸残基５７８までを含む請求項１２に 記載のポリペプチド。 １４． 図２のアミノ酸残基−２３からアミノ酸残基５７８までを含む請求項１ ２に記載のポリペプチド。 １５． アポリポタンパク質Ａ１と複合体形成した精製単離されたＡＦＭポリペ プチド。 １６． ＡＦＭ又はその変異体に対して特異的な抗体。 １７． 請求項１６に記載のモノクローナル抗体。 １８． 請求項１６又は１７に記載のヒト抗体化抗体。 １９． 請求項１６又は１７に記載の抗体とＡＦＭを接触させることを含む、Ａ ＦＭの生物活性を調節するための方法。 ２０． 検出可能なＡＦＭコーディングポリヌクレオチド又はその断片をその細 胞のＲＮＡとハイブリダイズさせることを含む、細胞のＡＦＭ合成能を検出する ための方法。 ２１． その細胞によって産生されるポリペプチドと請求項１６に記載の抗体を 反応させることを含む、細胞のＡＦＭ合成能を検出するための方法。 ２２． 請求項１６に記載の抗体と試料体液を接触させることを含む、試料体液 中のＡＦＭの存在を測定するための方法。 ２３． ＡＦＭコーディングポリヌクレオチドのアンチセンスポリヌクレオチド 。 ２４． ＡＦＭの内在性発現調節ＤＮＡ配列を特定するＤＮＡのアンチセンスポ リヌクレオチド。 ２５． ＡＦＭポリペプチド、又はＡＦＭに対して特異的な生物活性を有するそ の変異体、をアミノ末端に有し、且つ、免疫グロブリン重鎖又はその対立遺伝子 変異体の少なくとも１つの定常ドメインをカルボキシ末端に有する、ハイブリッ ド融合ポリペプチド。 ２６． 請求項２５に記載のハイブリッド融合タンパク質をコードするポリヌク レオチド。 ２７． ＡＦＭに対して特異的な生物活性を有するポリペプチドをコードし、且 つ、 （ａ）図１に示すＤＮＡ配列、 （ｂ）ストリンジェントな条件下で（ａ）のＤＮＡとハイブリダイズするＤＮ Ａ、及び、 （ｃ）遺伝コードの縮重がなければストリンジェントな条件下で（ａ）又は（ ｂ）のＤＮＡ配列とハイブリダイズするＤＮＡ配列 から成る群から選択される、ＤＮＡ配列。