JPH09511404A - 呼吸器多核体ウイルスプロテインｇのペプチド断片、免疫原的薬剤、それを含む医薬組成物、および製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 免疫原性の要素として有用であり、かつサブグループＡおよびＢのヒト呼吸器多核体ウイルス、またはウシ呼吸器多核体ウイルスのＧタンパク質の配列のアミノ酸残基１３０〜２３０の間のペプチド配列、または前記ペプチド配列と少なくとも８０％の相同性を有する配列を保持することを特徴とするポリペプチド。前記ポリペプチドを含有する免疫原的薬剤または医薬組成物、およびそれを製造する方法も開示される。

Description

【発明の詳細な説明】 呼吸器多核体ウイルスプロテインＧのペプチド断片、 免疫原的薬剤、それを含む医薬組成物、および製造法 本発明は、免疫原の製造においておよび呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶ）に対 するワクチンを得る際に使用できるポリペプチド、および前記ポリペプチドの製 造を可能とするヌクレオチド配列に関する。本発明は、同様に、クレブシエラ・ ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)から抽出された免疫アジュバントタンパ ク質、可能ならばこのようなアジュバントタンパク質とアソシエートした、免疫 原性ポリペプチドを含む組成物、およびそれらの製造方法に関する。 呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶ）は新生児：気管支肺疾患（細気管支炎）にお ける呼吸器の病気の最も頻繁な原因である。ＷＨＯによればＲＳＶ攻撃は毎年５ ×１０⁷件と概算され、そのうち世界全体において１６０，０００人が死亡する 。このウイルスには２つのサブグループ（サブグループＡおよびＢ）が存在する 。 ＲＳＶはパラミクソウイルス(Parmyxoviridae)族に分類され、すなわち、１０ の特定のタンパク質をコードする、負の極性の非セグメントＲＮＡゲノムを含む 肺炎ウイルス属の１型である。 現在、ＲＳＶに対して有効なワクチンは存在しない。不活性化ウイルスのワク チンは無効であることが示され、そして時には保育乳児の感染を悪化することさ えある。６０歳代において、ホルマリン不活性化ＲＳＶを使用するワクチン接種 の試みは失敗に終わった。ＲＳＶによる再感染時における保護を付与する代わり に、そのワクチンは子供において病気を悪化させた。 出願ＷＯ８７／０４１８５号は、ワクチン、例えば、プロテインＦ（融合タン パク質）またはプロテインＧと呼ばれるエンベロープタンパク質、２２ＫｄのＧ タンパク質、９．５Ｋｄのタンパク質、または主要なキャプシドタンパク質（プ ロテインＮ）を目的としてＲＳＶの構造タンパク質を使用することを提案した。 出願ＷＯ８９／０２９３５号は、ＲＳＶの全体のプロテインＦ（多分モノマー または脱アセチル化された形態で修飾されている）の保護的性質を記載している 。 １系列のプロテインＦの断片は、それらの中和性質を研究することを目的とし てクローニングされた。 しかしながら、今日まで試験された免疫ワクチンは無効であるか、または肺疾 患（細気管支炎または細気管支周囲炎）を誘発することが示された。 現時点において、ＲＳＶのための感染の徹底的な治療は存在しない。 気道上部のＲＳＶの感染：治療は他のウイルスの感染についての治療と同一の 薬物による。 気道下部のＲＳＶの感染：保育乳児における治療は正しい水分補給の維持、分 泌物の吸引および必要に応じた酸素の投与による。陽性の効果はリバビリン、す なわち、ＲＳＶに対してiｎ ｖｉｔｒｏ活性であるヌクレオチドを使用して観察 された。 このことから、本発明の目的は、呼吸器多核体ウイルスのＧタンパク質の配列 のアミノ酸残基１３０と２３０との間のペプチド配列、または前記ペプチド配列 と少なくとも８０％の相同性を有する配列を保持することを特徴とする、免疫原 の生産において有用なポリペプチドである。この配列はヒトＲＳＶのサブグルー プＡおよびＢに関し、またはウシＲＳＶに関しわずかに異なる。本発明は、ヒト ＲＳＶサブグループＡおよびＢ、またはウシＲＳＶから由来する配列を含む。 プロテインＧは、メチオニンが少ない、分子量８４〜９０ＫｄのＲＳＶエンベ ロープ糖タンパク質である。 天然のプロテインＧのアミノ酸１３０〜２３０の配列はＲＳＶによる感染に対 する有効な保護を誘発するために特に適当であることを出願人は証明した。本発 明は、ヒトＲＳＶサブグループＡおよびＢ、またはウシＲＳＶに由来する配列を 含む。 さらに詳しくは、本発明は、上記に含まれる免疫原要素として特に有用であり かつＲＳＶプロテインＧ（ヒト、サブグループＡおよびＢ、またはウシ）のアミ ノ酸残基番号１７４〜１８７のペプチド配列または対応する配列と少なくとも８ ０％の相同性を有する配列を含む、ポリペプチドに関する。 ＲＳＶプロテインＧの前記配列に含まれる免疫原の製造に適合する他のペプチ ド配列は、ヒトまたはウシのＲＳＶプロテインＧのアミノ酸残基番号１７１〜１ ８７の配列または対応する配列と少なくとも８０％の相同性を有する配列により 形成される。本発明による関心ある他のペプチドは、ＲＳＶプロテインＧのヌク レオチド番号１５８〜１９０の間の配列または対応する配列と少なくとも８０％ の相同性を有する配列により支持される。 それを実施する他の方法によれば、本発明は、免疫原の生産に有用でありかつ ヒトまたはウシのＲＳＶプロテインＧのアミノ酸残基番号１４０〜２００のペプ チド配列または対応する配列と少なくとも８０％の相同性を有する配列に相当す る配列を有するペプチドに関する。前記ＲＳＶプロテインＧのアミノ酸分析１４ ０で開始する配列およびそのＣ−末端は、それぞれ、アミノ酸１９８、１９６、 １９４、１９２または１９０に相当し、ならびにこれらの断片により支持される 配列と少なくとも８０％の相同性を有する配列は特に有利である。 上記配列の変異型としては、 ａ）位置１７３および／または１８６におけるＣｙｓアミノ酸がジスルフィド 架橋を形成しないアミノ酸、特にセリンにより置換されている、および／または ｂ）位置１７６および１８２におけるアミノ酸がジスルフィド架橋以外の共有 結合の架橋を形成することができるアミノ酸、特にアスパラギン酸およびオルニ チンである、 配列を含むポリペプチドを挙げることができる。 したがって、ＲＳＶサブグループＡのポリペプチド配列１３０−２３０を完全 に、その天然の形態で使用できる。これは配列は記載した配列番号１（またはＧ ２Ａ）に相当する。 同一の方法において、ＲＳＶサブグループＢの完全なポリペプチド配列１３０ 〜２３０をその天然の形態で使用することができる。これは配列は記載した配列 番号２（またはＧ２Ｂ）に相当する。 配列番号１はこの出願の残部においてＧ２Ａと記載する。 配列番号２はこの出願の残部においてＧ２Ｂと記載する。 Ｇ２ＡまたはＧ２Ｂと少なくとも８０％の相同性を有する配列は、また、適当 である。 アミノ酸１３０〜２３０の間の配列は、位置１７３および１８６におけるシス テイン残基をセリン残基で置換することによって修飾して、位置１７６および１ ８２におけるＣｙｓ残基により形成されるループの維持のために、すぐれた免疫 原性を保持するペプチドを得ることができる。サブグループＡのためのこのポリ ペプチドのアミノ酸およびヌクレオチド配列は、配列番号３（Ｇ２ＡδＣｙｓ） で表される。 サブグループＢについて、アミノ酸およびヌクレオチド配列は配列番号４（Ｇ ２ＢδＣｙs）で表される。 ペプチド配列はＧ２ＡδＣｙｓおよびＧ２ＢδＣｙｓとする。 本発明によれば、本発明の目的は、ＲＳＶプロテインＧのアミノ酸残基番号１ ７４と１８７との間のペプチド配列または前記ペプチド配列と少なくとも８０％ の相同性を有する配列からなることを特徴とする、免疫原の生産に有用なポリペ プチドである。 この最後の配列において、ペプチド１７４〜１８７サブグループＡは下記の配 列を有することができる： 配列番号５： Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｃｙｓ Ｔｒｐ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｃｙｓ Ｌｙｓ。 ペプチド１７４〜１８７サブグループＢは下記の配列を有することができる： 配列番号６： Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ −Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ。 位置１８６におけるＣｙｓを、また、セリン残基で置換して下記の配列を得る ことができる： サブグループＡについて配列番号７： Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｃｙｓ Ｔｒｐ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｌｙｓ。 サブグループＢについて配列番号８： Ｓｅｒ−ＩＩｅ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ −Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ。 免疫原ペプチドの残基１７４〜１８７の間の配列において、本発明の態様の１ つに従い、位置１７６および１８２のアミノ酸残基をそれぞれアスパラギン酸お よびオルニチンで置換して、下記の配列の１つを得る： 配列番号９（サブグループＡについて）： Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｏｒｎ Ｔｒｐ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｃｙｓ Ｌｙｓ。 配列番号１０（サブグループＢについて）： Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｏｒｎ −Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ。 配列番号１１（サブグループＡについて）： Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｏｒｎ Ｔｒｐ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｌｙｓ、 配列番号１２（サブグループＢについて）： Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｏｒｎ −Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ。 免疫原性の維持は、位置１７６〜１８２のアミド架橋によるジスルフィド架橋 （天然のＣｙｓ残基の間）の置換によって得られる。 上に定義したような本発明による他の配列は、本願明細書において名称配列番 号１４〜配列番号７３で示される。 本発明の目的は、同様に、上記配列の１つを有する免疫原的薬剤として使用す ることができかつＮ−末端またはＣ−末端の位置に少なくとも１つの１つのシス テイン残基をさらに含むポリペプチドである。 本発明は、同様に、ＲＳＶプロテインＧ配列サブグループＡおよびサブグルー プＢのアミノ酸残基番号１３０〜２３０の間のペプチド配列、または前記ペプチ ド配列と少なくとも８８％の相同性を有する配列から成り、かつＢＢＧ２ＡδＣ またはＢＢＧ２ＢδＣと呼ばれる、ヒト血清アルブミンレセプター、または他の 結合タンパク質との融合タンパク質の形態であるポリペプチドを包含する。完全 なＢＢタンパク質の配列は明細書中に記載されている（配列番号７４）。 本発明は、同様に、これらの機能が天然であるか、否かにかかわらず、異なる ペプチドの変異型、例えば、グリコシル化または硫酸化された変異型を包含する 。 ポリペプチドは、当業者に知られている、ペプチド合成によるか、または組換 えＤＮＡ技術により製造することができる。 特に、ほぼ１００アミノ酸のエピトープをコードする遺伝子配列は、遺伝子の 固相アセンブリーにより製造することができ、対応するタンパク質は、細胞内経 路により、例えば、大腸菌(E.coli)の中で発現させることができる。 上に定義したタンパク質またはポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（ ＲＮＡまたはＤＮＡ）は、本発明の一部分である。 本発明の他の目的は、担体タンパク質、特に免疫アジュバントタンパク質に結 合されたポリペプチド、例えば、上に定義したポリペプチドを含む免疫原的薬剤 である。 好ましくは、本発明によるポリペプチドは、好ましくは可溶性複合体の形態で 、クレブシエラ(Klebsiella)属の細菌の外膜のＯｍｐＡ型の担体タンパク質に結 合されている。 ＲＳＶプロテインＧの配列１７４〜１８７の変異型は免疫原性が弱いが、この ようなタンパク質とのそれらの結合は特定の免疫応答を誘発することを、出願人 は示すことができた。 免疫応答の強度を、慣用のアジュバント、例えば、フロインドアジュバントと 共投与された担体ＫＬＨ（キーホールリンペットヘモシアニン）への結合、また は担体タンパク質ＴＴ（破傷風トキソイド）への結合、を使用して得られたもの と比較した。 クレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)のタンパク質ｐ４０ま たはタンパク質ｐ４０と少なくとも８０％の相同性を有するタンパク質に結合さ れた本発明による免疫原性ポリペプチドを含む組成物について、特に有利な結果 が得られる。 さらに詳しくは、前記ポリペプチドを配列番号１３に記載されるペプチド配列 を含むタンパク質に結合させる。 配列番号１３を含むタンパク質をコードするヌクレオチド配列（ＤＮＡまたは ＲＮＡ）は、本発明において構築される。 免疫原性ポリペプチドは、当業者に知られている方法により免疫アジュバント タンパク質に結合させることができ、前記方法の例は下記の通りである： − グルタルアルデヒド、 − カルボジイミド（例えば、ＥＤＣ：１−（３ジメチルアミノプロピル）−３ −エチルカルボジイミド）、 − ビスイミドエステル（例えば、ジメチルアジピミデート）、 − Ｎ−ヒドロキシスイクシニミジルエステル（例えば、ジスクシニミジルスベ レート）、 − Ｎ−末端またはＣ−末端の位置に補助的システインを含むポリペプチドにつ いて： ＊ マレイミド−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（例えば、ＭＢＳ： マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）。 ＊ Ｎ−スクシンイミドブロモアセテート。 ポリペプチドは、結合タンパク質、例えば、ヒト血清アルブミンレセプター（ ＢＢ）により、担体タンパク質に複合化することができる。 他の面によれば、本発明の目的は、同様に、 ａ） クレブシエラ(Klebsiella)属の細菌の膜リポ多糖類を２価のカチオンお よび界面活性剤の存在下に沈降させて、上清の中に全体の膜タンパク質を回収し 、 ｂ） 前記タンパク質をアニオン交換クロマトグラフィーにかけて、免疫アジ ュバントタンパク質を含有する画分を分離し、 ｃ） 免疫アジュバントタンパク質を含有する画分を濃縮し、 ｄ） 免疫アジュバントタンパク質を免疫原性ポリペプチド、例えば、上に定 義したポリペプチドと複合化させて可溶性複合体を形成する、 ことを特徴とする、ＲＳＶの感染の予防または治療用組成物の中に挿入された複 合化ペプチドの製造方法である。 工程ａ）において使用する２価のカチオンは、好ましくはカルシウムまたはマ グネシウムの塩である。遠心後、上清のタンパク質はエタノールを使用する２回 の沈降によりすぐれた収率で回収することができる。 膜タンパク質は、再懸濁後、工業的条件下に使用できるアニオン交換カラムで 分離される。このクロマトグラフィーの支持体は非常に安定であり、そして過激 な発熱因子除去の処理と適合性であり、これは既に記載されたクロマトグラフィ ーの支持体には当てはまらなかった。他方において、タンパク質の溶離は無勾配 条件下に実施することができ、そして工業的条件下に特に好都合であるＮａＣｌ 勾配（以前に記載されたように）は適用されない。 本発明の実施する好ましい方法によれば、工程ｃ）に引き続いて、カチオン交 換体を使用する第２のクロマトグラフィー工程を実施し、アジュバントタンパク 質を含有する画分を回収し、濃縮する。この補助的工程はリポ多糖類のよりすぐ れた排除を可能とする。次いで、アジュバントタンパク質を本発明に従い免疫原 性ポリペプチドに複合化する。 他の面によれば、本発明は、上記において特徴づけたポリペプチドを含有する ことを特徴とする、ＲＳＶにより誘発される感染の予防および／または治療用組 成物に関する。 さらに詳しくは、組成物は注射可能な経路による投与に適合した薬学上許容さ れる賦形剤をさらに含有する。 事実、このような組成物の注射は、中性作用ではなく、体の全身的免疫応答に より、保護を提供することを出願人は証明した。 体液性および細胞の応答（ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＴ細胞）は、長期間 の保護およびＲＳＶサブグループａおよびｂに対する免疫学的記憶を同様に誘発 する産物により誘発される。 皮下経路によるワクチン組成物の投与を目的として、慣用法により困難である 、入手可能な可溶性複合体を有することが望ましい。 このため、本発明は、同様に、免疫原性ペプチドと、クレブシエラ(Klebsiell a)属の膜タンパク質、特にクレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae )のタンパク質ｐ４０との間の複合体を製造する方法に関し、この方法において 、カップリングは０．０５％より低いか、またはそれに等しい濃度のグルタルア ルデヒドの存在下に実施される。 このカップリング法は、通常使用される濃度と比較してグルタルアルデヒドの 濃度をかなり減少させ（ほぼ１％の代わりに２×０．０１％）；グルタルアルデ ヒドは５日の期間にわたって２つの部分で添加されるが、記載されたプロトコー ルは２４時間の時間を述べている。 これらの変更は可溶性複合体を、皮下投与に適合の形態で、得ることを可能と した。 通常のプロトコール（グルタルアルデヒドのより高い濃度および短い時間）は 、濃厚なゲルの形成（高い確実性で、Ｐ４０−Ｐ４０複合化反応のために）、一 般的に投与および操作に不適合な形態により表現される。 複合化されたペプチドは凍結し、そのまま使用するか、または凍結乾燥するこ とができる。 下記の実施例により本発明を説明するが、これらの実施例は本発明の範囲を限 定しない。 これらの実施例において、下記の図面について説明する。 − 図１：異なる形態のＧ１Ａに対して誘発された免疫応答の強度、 − 図２：異なる形態で提示されたＧ１Ａに対して誘発された免疫応答の速度論 （kinetics）、 − 図３：担体単独に対して誘発された免疫応答の速度論、 − 図４：ｐ４０の遺伝的増幅によるクローニング法。実施例１：Ｇ₁ Ａの合成および精製 下記の配列のポリペプチド 記載されたＧ₁ ＡはＢｏｃ化学を使用する固相合成により製造される。構築 ペプチドの構築は、Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（２−ｃｌ−Ｚ）−フェニルアセトアミド フェニル架橋剤を使用して開始して、ポリスチレン（ジビニルベンンゼン１％） 上の固相ペプチド合成により実施する。 下記の脱保護−カップリング手法により、Ｂｏｃ−ベンジル化学的法を使用し た： １． ＤＣＭ中の５５％ＴＦＡ （１×５分） ２． ＤＣＭ中の５５％ＴＦＡ （１×２５分） ３． ＤＣＭ （２×１分） ４． イソプロピルアルコール （１×１分） ５． ＤＭＦ （２×１分） ６． ＤＭＦ中の１０％ＤＩＥＡ （２×２分） ７． カップリング ８． ＤＭＦ （２×１分） ９． ＤＣＭ （２×１分） 各工程において、２０ｍｌの溶媒をペプチド樹脂の１ｇにつき使用する。 カップリングはＤＭＦ中でヒドロキシベンゾトリアゾールエステルを使用して ３０分間実施する。カップリングの各工程において、残留遊離アミン官能性がニ ンヒドリン試験により存在するかどうかを評価する。必要に応じて、二重のカッ プリングを実施する。 Ｇ₁ Ａペプチドの合成のために、下記の側鎖の保護を使用した： − リジンについて２−クロロベンジルオキシカルボニル、 − セリンおよびスレオニンについてベンジル、 − システインについて４−メチルベンジル、 − トリプトファンについてホルミル。 最終の脱保護／切断工程の前に、ＤＭＦ中のピペリジンの２５％溶液で３０分 間処理することによって、ホルミル基を除去する。ポリペプチド樹脂をＤＣＭお よびエーテルで洗浄し、減圧下に乾燥する。切断 ペプチドを樹脂から切断し、液体フッ化水素で処理して完全に脱保護する。ト ラップとしてｐ−クレゾールおよびエタンジオールの存在下に、１０ｍｌのフッ 化水素／ｇのペプチド樹脂を０℃において４５分間普通に使用する。フッ化水素 を蒸発させた後、粗反応混合物をエーテルで洗浄し、ＴＦＡ中に溶解し、エーテ ルで沈降させ、乾燥する。環化および精製 ＨＰＬＣによる精製の一般的条件： 静止相： Ｃ₁₈シリカ、１５〜２５μｍ、１００オングストローム、 移動相： 溶媒Ａ：水０．１％ＴＦＡ 溶媒Ｂ：アセトニトリル／Ａ、６０／４０％（ｖ／ｖ） 線状勾配： ２０〜５０％Ｂ、３０分（第１精製工程） １５〜４０％Ｂ、３０分（第２精製工程） 流速： ４０ｍｌ／分 検出： 紫外線（２１０ｎｍ） 切断後に得られた粗ペプチドを前述の条件（勾配、２０〜５０％Ｂ）下に精製 する。７０〜８０％（ＨＰＬＣ）の純度を有する画分を一緒にし、凍結乾燥する 。次いでペプチドをアセトニトリル、水およびＤＭＳＯ（１ｍｇ／ｍｌ）の混合 物中で精製し、結晶化が完結するまで（４〜６日）撹拌する。反応の進行をＨＰ ＬＣにより確認する。反応混合物を最後に調製用ＨＰＬＣで濃縮し、１５〜４０ ％のＢの勾配を３０分間適用してペプチドを精製する。 一般に、凍結乾燥後、同一条件下に精製を実施して、要求される純度を得る。 最終生成物の純度および同一性を分析用ＨＰＬＣ、アミノ酸分析およびＦＡＢ 質量スペクトル分析によりチェックする。 こうして得られたペプチドにおいて、位置１３におけるセリン残基は天然ペプ チドのＣｙｓ残基で置換され、こうして、免疫原性に対して有害であることがあ るジスルフィド架橋の形成における不均一性を回避する。実施例２：エピトープＧ₂ ＡδＣｙｓの調製 遺伝子の構築：材料および方法 エッペンドルフ・マイクロチューブにおいて、３００μｇのビーズを洗浄／結 合緩衝液（１ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１ｍＭ のＥＤＴＡ）で洗浄し、次いで０．２ｐｍｏｌのビオチニル化オリゴヌクレオチ ドを添加し、周囲温度において結合のために１５分間インキュベートする。固定 化されたオリゴヌクレオチドを有するビーズをすすぎ、沈降させる。６０μｌの ハイブリダイゼーション／結合緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７． ６、１０ｍＭのＭｇＣｌ₂、１ｍＭのＡＴＰ、１ｍＭの１，４−ジチオスレイト ール［ＤＴＴ］、５％のポリエチレングリコール［ＰＥＧ］８０００）中の０． ２ｐｍｏｌの下記の５’−リン酸化オリゴヌクレオチドを添加する。ハイブリダ イゼーション混合物を７０℃において５分間インキュベートし、３７℃にした後 、３ユニットのＴ４ＤＮＡリガーゼ（ＢＲＬ）を添加し、次いで３７℃において １５分間インキュベートする。反応混合物をすすいだ後、０．２ｐｍｏｌの 下記のオリゴヌクレオチドを添加する。新しい５’−リン酸化相補的オリゴヌク レオチドを添加するときと同じ回数で、ハイブリダイゼーション／結合操作を反 復する。終わりにおいて、適当な制限酵素を使用する切断により、磁性ビーズ上 に固定化されたＤＮＡ二本鎖を支持体から分離する。 配列Ｇ２ＡδＣｙｓに相当し、かつＢＢＧ２ＡδＣｙｓと記載されるヒト血清 アルブミン（ＢＢ）に対する結合タンパク質に結合された配列Ｇ２ＡδＣｙｓに 相当するＤＮＡを調製する。 ヌクレオチド配列を大腸菌(E.coli)において発現させて、対応するタンパク質 を回収する。発現ベクター ｐＶＡＢＢＧ２ＡδＣは細胞内型の発現ベクターであり、それは大腸菌(E,col i)由来のプロモーター、トリプトファン（Ｔｒｐ）操作、次いでヒト血清アルブ ミンＢＢのレセプターをコードする遺伝子(P-ÅNygren et al．、J.Mol．Recogni t．、1988、1、60)および最後にＲＳＶのＧ２ＡδＣをコードする遺伝子を含有す る。異種遺伝子の発現はＩＡＡ（３−β−インドレアクリル酸）の存在下に誘発 することができる。ＢＢＧ２ＡδＣの融合産物は、大腸菌(E.coli)の細胞質タン パク質を遊離した後、ＨＳＡ−セファローズカラム上のアフィニティーにより精 製することができる。５００ｍｌの培養物から出発するタンパク質の精製の実施例 プラスミドｐＶＡＢＢＧ２ＡδＣにより形質転換された大腸菌(E.coli)ＲＶ３ ０８株(Maurer et al.、J.Mol.Biol.、1980 、139、147)を、アンピシリン（１００ μｇ／ｍｌ）およびテトラサイクリン（８μｇ／ｍｌ）を含有する寒天上で選択 した。この株を１００ｍｌのＴＳＢ培地(Tryptic Soy broth、Dfco)（３０ｇ／ｌ ）［酵母(Yeast Extract、Dfco)（５ｇ／ｌ）、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ ）、テトラサイクリン（８μｇ／ｍｌ）およびトリプトファ ン（１００μｇ／ｍｌ）を補充した］を含有するエルレンマイヤーフラスコに接 種した。３２℃において撹拌（１９０ｒｐｍ）しながら１２時間インキュベート した。４×初期体積（４００ｍｌのＴＳＢ＋酵母＋同一抗生物質、同一濃度にお いて）を含有する他のエルレンマイヤーフラスコ（５リットル）に、培養物を移 した。培地の光学密度（５５０ｎｍにおいて）がほぼ１．５のＯ．Ｄ．に到達し たとき、ＩＡＡを培地に２５μｇ／ｍｌの最終濃度に添加することによって、タ ンパク質の生産を誘発させる。３２℃において撹拌（１９０ｒｐｍ）しながら５ 時間インキュベートした後、培養を停止した。遠心後、ほぼ６０ｍｌの冷ＴＳＴ 溶液（５０ｍＭの Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、２００ｍＭのＮａＣｌ、０ ．０５％のツイーン２０、０．５ｍＭのＥＤＴＡ）を含む容器の中に細菌プラグ を再懸濁させる。 標準的超音波処理装置のプローブ（ＶＩＢＲＡ−ＣＥＬＬ、Ｓｏｍｉｃｓ、Ｍ ａｔ、米国）を容器の中に導入する。超音波処理を５のパワーにおいてほぼ２分 間実施する。遠心後溶液の上清を０．４５μｍにおいて濾過し、そしてほぼ３ｍ ｌのＨＳＡ−セファローズゲルを含有するカラムの中に通過させる(STAHL et al .、J.Immunol．Meth．、1989 、124、43)。 ファスト・システム(Phast System)装置(PHARMACIA)またはミニ・プロテアン ・バイオラド(Mini Protean BIORAD)上のＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、精製された タンパク質を分析する。ゲルをクーマッシーブルーにより可視化する。タンパク 質ＢＢＧ２ＡδＣは、９０％より大きい純度を表し、既知の分子量標準に関して 期待される大きさ（３９．３Ｋｄａ）によく相当する。 プロブロット(Problott)膜（ＡＢＩ）に対するこのタンパク質の免疫転移は、 特定の抗体を使用するＲＳＶ（ｓｓ−グループＡ）の抗ＢＢおよび／または抗プ ロテインＧの同定を可能とする。大腸菌(E.coli)の細胞質から出発して精製され たタンパク質の収量は、培養物の１リットル当たりほぼ５０ｍｇである。 ２リットルの発酵槽において、最適な培養条件下に培養物の１リットル当たり ５００〜８００ｍｇのＢＢＧ２ＡδＣタンパク質を得ることができる。実施例３：天然ｐ４０タンパク質の単離および精製 クレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)Ｉ−１４５株のバイオ マスから出発するｐ４０タンパク質の精製法は、１つの主要な目的をもって、す なわち、大規模かつ工業的推定への転換を可能とする方法を開発するために、開 発した。この方法は膜タンパク質に富んだ画分の調製およびクロマトグラフィー によるｐ４０タンパク質の精製において首尾よく実施される。材料および方法 クレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)（Ｉ−１４５株、４０ ｇの乾燥細胞）のバイオマスを、純粋な酢酸によりｐＨ２．５に調節する。 ６％のセトリミド、６０％のエタノール、１．５ＭのＣａＣｌ₂を含む溶液（ そのｐＨは酢酸で２．５に調節されている）の１／２体積を添加した後、混合物 を周囲温度において１６時間撹拌する。 ４℃において１５，０００ｇで２０分間遠心した後、上清のタンパク質をエタ ノールで沈降させる。中間の遠心（１０分、１０，０００ｇ、４℃）を使用して ２回の連続的沈降（２０から５０％、次いで５０から８０％）を実施する。 第２回の沈降後に得られたプラグを、双性界面活性剤(zwittergent)３−１４ 、１％の溶液の中に再懸濁させる。 周囲温度において４時間撹拌した後、ｐＨを１Ｎ ＮａＯＨにより６．５に調 節する。 混合物を４℃において１０，０００ｇで２０分間遠心により、膜タンパク質に 富んだ画分（ＭＰ画分）を得ることができる。 ＭＰ画分のタンパク質を２０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液ｐＨ８．０；双性 界面活性剤３−１４、０．１％に対して透析する。前述の緩衝液中で平衡化した 強アニオン交換体型の支持体を含有するカラム（カラム直径＝５０ｍｍ×高さ＝ ２５０ｍｍ、Biorad Macroprep High Qゲル）に、透析物を適用する。ｐ４０タ ンパク質を平衡化緩衝液中で５０ｍＭのＮａＣｌ濃度により溶離する。 ｐ４０を含有する画分を集め、２０ｍＭのクエン酸塩緩衝液ｐＨ３．０；双性 界面活性剤３−１４、０．１％に対して透析する。２０ｍＭのクエン酸塩緩衝液 ｐＨ３．０；双性界面活性剤３−１４、０．１％中で平衡化した強カチオン交換 体型の支持体を含有するカラム（カラムの寸法：カラム直径＝２５ｍｍ×高さ＝ １６０ｍｍ、Biorad Macroprep High S ゲル）に、透析物を適用する。ｐ４０タ ンパク質を０．７ＭのＮａＣｌ濃度により溶離する。ｐ４０を含有する画分を集 め、１０ｋＤａのカットオフの限界値を有する膜シートとともに使用するミニタ ン・ミリポア(Minitan Millipore)接線方向の流れの濾過系を使用する限外濾過 により濃縮する。結果 各クロマトグラフィー工程後に得られた画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し て、ｐ４０タンパク質を含有する画分を集める。 タンパク質量をＬｏｗｒｙの方法により測定する（表Ｉ）。ｐ４０タンパク質 の純度および均質度を、分子量標準の存在下に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより推定す る。 カチオン交換クロマトグラフィー工程後、ｐ４０タンパク質はＭＰ画分の中に 存在する主要な混入物質を含有せず（タンパク質は１８ｋＤａの見掛けの分子量 を有する）そして９５％より大きい純度を有する。 ｐ４０の電気泳動のプロフィルはいくつかのバンドを明らかにする。マウスに おいて得られたｐ４０モノクローナル抗体を使用するイムノブロット後、これら のバンドは同定される。上の主要なバンドは変性タンパク質（ＳＤＳの存在下に １００℃において１５分間処理する）に対応し、そして下の小さいバンドはその 天然の形態のタンパク質に対応する。 ｐ４０は事実「熱修飾可能な」タンパク質であり、そして我々はＳＤＳの存在 下に１００℃に加熱した場合の速度論によりこの性質を評価することができた。 加熱しないと、天然の形態のタンパク質はα−らせん構造を有し、これはより多 いＳＤＳを固定し、こうして変性された形態（変性は１００℃において５分後に 完結する）よりアノードに向かっていっそう遠くに移動し、そして変性された形 態はβ−プリーツシート構造を有する(K.B.KELLER(1978)J.Bacteriol.134、1181 -1183）。 リポ多糖類（ＬＰＳ）の混入は、β−ヒドロキシミリスチン酸、クレブシエラ ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)のＬＰＳの脂肪酸マーカーの気相クロ マトグラフィーによる決定により推定される（表Ｉ）。 この方法は、異なる精製工程からの試料中のＬＰＳの含量を概算するために使 用される。 カチオン交換クロマトグラフィー後のｐ４０画分の中に存在するβ−ヒドロキ シミリスチン酸の量は決定の定量限界値より少なく、残留ＬＰＳの量が１％より 少ないことを推定することができる。実施例４：ｐ４０タンパク質のクローニングおよびＢＢｐ４０の発現 細菌株 ＊ 大腸菌(E.coli)：ＲＶ３０８：ＡＴＣＣ３１６０８株(MAURER R.、MEYER B .J．、PTASCHNE M.、J.Mol.BIOL.、1980 、139、147-161)。 ＊ K.pneumoniae:IP145:C.I.B.P.F株ベクター ＊ ｐＲＩＴ２８(Hultman et al．、1988 、7:629-638)：アンピシリン耐性遺 伝子、大腸菌(E.coli)およびファージＦ１の複製起点ならびに大腸菌(E.coli)の ｌａｃ−ｚ遺伝子の一部分（β−ガラクトシダーゼ）を含有するベクターのクロ ーニングおよび配列決定。 ＊ ｐＶＡＢＢ：遺伝子融合発現ベクター。溶液 ＊ 遺伝子増幅： 溶解緩衝液： ２５ｍＭのＴａｐｓ ｐＨ９．３ ２ｍＭのＭｇＣｌ₂ 増幅緩衝液： ２５ｍＭのＴａｐｓ ｐＨ９．３ ２ｍＭのＭｇＣｌ₂ ツイーン２０ ０．１％ ２００ｍＭのｄＮＴＰ。 ＊ タンパク質の精製： ＴＳＴ（２０×）： Ｔｒｉｓ塩基 ０．５Ｍ ＨＣｌ ０．３Ｍ ＮａＣｌ ４Ｍ ツイーン２０ １％ ＥＤＴＡ ２０ｍＭ 洗浄緩衝液： Ｔｒｉｓ ＨＣｌ ５０ｍＭ ｐＨ８．５ ＭｇＣｌ₂ ５ｍＭ 変性溶液： Ｇｕａ−ＨＣｌ ７．８Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ２８ｍＭ ｐＨ８．５ 復元溶液： Ｇｕａ−ＨＣｌ ０．５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ２５ｍＭ ｐＨ８．５ ＮａＣｌ １５０ｍＭ ツイーン２０ ０．０５％。材料および方法 − オリゴヌクレオチドの合成 エンテロバクテリア(E.coli 、S.tryPhimurium 、S.marcescens 、S.dysenteriae c 、E.aeroginosae)の５ ＯＭＰＡの配列の整列からのコンセンサス配列のクレ ブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)のＯＭＰＡの配列の発表された 部分(LAWRENCE 、G.J．、et al．、Journal of General Microbiology、1991 、137、1 911-1921)、ならびにマニュアル配列により得られたペプチドの配列から出発し て、ヌクレオチドプライマーを決定した。 ファーマシア(Pharmacia)からの「遺伝子アセンブラー・プラス(Gene Assembl er Plus)」装置でホスホルアミダイト化学的方法に従い、オリゴヌクレオチドを 合成した。 − ｐ４０遺伝子のＰＣＲによる遺伝子の増幅 クレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)のＯＭＰＡのＤＮＡを 下記の方法において増幅した。 クレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)のコロニーを１０μｌ の溶解緩衝液中で９５℃に５分間加熱することによって溶解する。 この溶液の１μｌを増幅反応のＤＮＡ源として使用する。 これらは１００μｌの増幅緩衝液（添付書類参照）中で、５ｐｍｏｌの各プラ イマーおよび１単位のＴａｑポリメラーゼ酵素(Perkin Elmer Cetus)を使用して 実施する。各サイクルは９５℃における３０秒の１変性工程および引き続くＤＮ Ａへのプライマーのハイブリダイゼーションおよび７２℃における延長を含む。 このようにして、パーキン・エルマー・シータス９０００「ゲン・アンプ・ＰＣ Ｒ(Gen Amp PCR)サーモサイクライザーにより、３０サイクルを実施する。 下記のＰＣＲを上記において増幅したＤＮＡ断片から出発して調製する。 次いで増幅されたＤＮＡ断片を消化し、精製し、ベクターｐＲＩＴ２８に結合 する。配列決定 アプライド・バイオシステム(Applied Biosysiem)３７３ＤＮＡシークエンサ ー(Sequencer)自動化配列決定装置により、このようにしてクローニングされた 断片を配列決定する。遺伝学的増幅後にまたはマクシプレプ(maxiprep)から得ら れた二本鎖ＤＮＡについて、または変性されたＰＣＲ断片からの一本鎖ＤＮＡに ついて、「色素ターミネーター(dye Terminator)」キットを供給業者の推奨に従 いを使用して、配列決定反応を実施する(Hultman et al．、Nucleic Acids Res． 、 1989、17:4937-4946)。タンパク質の発現 全体のｐ４０遺伝子を発現ベクターｐＶＡＢＢ中でクローニングする。このベ クターはアフィニティーテイル「ＢＢ」のｐ４０への結合を可能とする；Ｂは血 清アルブミンを結合する連鎖球菌Ｇタンパク質の部分である(Nygren P.A．et al .、J.Mol.Recognit.1988、1、69-74)。 酵母エキス、アンピシリン（２００μｇ／ｍｌ）、テトラサイクリン（８μｇ ／ｍｌ）およびトリプトファン（１００μｇ／ｍｌ）を補充した１００ｍｌのＴ ＳＢ中で、ベクターｐＶＡＢＢＰ４０により形質転換された大腸菌(E.coli)ＲＶ ３０８株を３７℃において撹拌しながら一夜培養する。次の日に、５８０ｎｍの 波長についてＯ．Ｄ．＝１の培養物をＴＳＢ＋酵母エキス＋ａｍpｉ＋ｔｅｔｒ ａ中で調製する。 １０分間培養した後、培地にＩＡＡを２５μｇ／ｍｌの濃度に添加することに よって、タンパク質の発現を誘発する。培養物を４℃において２４６０ｇで１０ 分間遠心する。 ２０ｍｌのＴＳＴ １×ｐＨ７．４でプラグを取り、次いでこの溶液を４℃に おいて２３，０００ｇで３０分間遠心する。 上清をセファローズを通して濾過し、これにより可溶性であるタンパク質を単 離することができる。プラグを洗浄緩衝液で洗浄し、次いで４℃において２３， ０００ｇで３０分間遠心する。次いで封入体を含有するプラグを９００μｌの変 性溶液＋１００μｌの１０ｍＭのジチオスレイトールで取り、３７℃において２ 時間インキュベートする。 次いでこの溶液を周囲温度において撹拌しながら一夜インキュベートし、１０ ０ｍｌの復元緩衝液中の２３００ｇで１時間遠心する。 上清をＨＳＡセファローズを通して濾過する。 ２つの場合において、固定化されたタンパク質を０．５Ｍの酢酸ｐＨ２．８で 溶離し、１ｍｌの画分で集める。 次いで、集めた画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動ゲル上およびイムノブロット により分析する。結果 第４図に表されている方法に従い３段階において、遺伝子のクローニングを実 施した。 第１段階において、我々は位置１０３におけるＡの代わりのＴを除外して配列 の発表された部分を確認した。 次いで、我々は遺伝子の３’−配列を決定し、最後に５’−配列を決定した。 全体の遺伝子を２つの部分８／４および３／１４の融合により構築し、次いで 発現ベクターｐＲＩＴ２８中でクローニングした。配列は配列番号１３に相当す る。 タンパク質はＢＢＰ４０の形態で発現される。 それは本質的に封入体から出発して得られる。２００ｍｌの培養物について、 １５ｍｇのタンパク質が精製される。 電気泳動のプロフィルは、変性後に得られたＢＢＰ４０が高い純度であること を示す。見掛けの分子量は、６３ｋＤａである計算した理論的分子量に相当する 。 イムノブロットの特性決定は、精製されたタンパク質が事実ウサギ抗Ｐ４０血 清により認識されることを示す。実施例５：Ｇ₁ Ａペプチドへのｐ４０タンパク質のカップリング ｐ４０（５ｍｇ／ｍｌ、４０ｍｇ）を３００体積の０．１Ｍのリン酸ナトリウ ム緩衝液ｐＨ７、双性界面活性剤３−１４、０．１％に対して透析する。 ０．１Ｍの炭酸塩緩衝液ｐＨ９、双性界面活性剤３−１４、０．１％により、 透析物を２ｍｇ／ｍｌの濃度に調節する。ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を ４％の最終濃度に添加する。 Ｇ₁ ペプチド（１０ｍｇ／ｍｌの０．１Ｍの炭酸塩緩衝液ｐＨ９；０．１％の 双性界面活性剤３−１４）をｐ４０溶液に添加する。ｐＨを確認する（ｐＨ９お よびｐＨ１０の間）。 ２２０μｌのグルタルアルデヒド（水中の２．５％）を添加し、４℃において ２４時間撹拌する。 ５ｍｌの０．１Ｍの炭酸塩緩衝液ｐＨ９、０．１％の双性界面活性剤３−１４ を添加し、ｐＨを確認し（ｐＨ９およびｐＨ１０の間）、４℃において７２時間 撹拌する。 ２２０μｌのグルタルアルデヒド（水中の２．５％）を添加し、ｐＨを確認し 、＋４℃において２４時間撹拌する。 １００μｌの１Ｍのリジンの添加により、反応を停止させる。この溶液を４℃ において２４時間透析する。 ＳＤＳを二重ＫＣｌ沈降により排除する。 ｐ４０複合体を含有する溶液を凍結させ、そのまま使用するか、または凍結乾 燥させる。実施例６：活性 材料および方法 アジュバントの存在下に、必要に応じて担体にカップリングした、１０μgの Ｇ１で皮下投与により、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｎ＝５）を第０日、第１０日お よび第２０日に免疫化する。血清を集め、ＥＬＩＳＡにより試験する。抗Ｇ１ま たは抗担体ＩｇをＢＳＡ−Ｇ１支持体上に、および「担体」支持体（ＫＬＨまた はＴＴまたはｐ４０）上に単離する。Ｉｇを抗Ｉｇウサギペルオキシダーゼ複合 体により可視化する。光学密度を４５０ｎｍにおいて読み、バックグラウンドの 雑音を２倍にする最後の希釈を逆数プロットすることによって、抗Ｇ１抗体の力 価を得る。結果は５匹のマウスの力価の平均±標準偏差を表す。結果 Ｇ１Ａに対する免疫応答の誘発 同一の免疫化スキームに従い、マウスを異なる形態のＧ１Ａで免疫化する。異 なる形態のＧ１Ａにより誘発された抗体の応答を、実験の開始後２８日に比較す る。 純粋な形態で投与した合成Ｇ１Ａペプチドは、それをフロインドアジュバント と同時に投与した場合でさえ、免疫応答を誘発しない。担体ＫＬＨとともに投与 すると、Ｇ１Ａは弱い応答を誘発し、これはフロインドアジュバント（ＦＡ）の 同時投与により有意に増加される。ｐ４０とともに投与すると、Ｇ１Ａは慣用の ＫＬＨ／Ｇ１＋ＡＦ、「自己アジュバント担体」性質に対するｐ４０免疫化スキ ームにおいて得られた応答より大きい応答を誘発する。 結果を第１図に表す。Ｇ１Ａに対する免疫応答の速度論 同一の免疫化スキームに従い、マウスを異なる形態のＧ１Ａで免疫化する。異 なる形態のＧ１Ａにより誘発された抗体の応答を下記の時間において比較する： 実験の開始後７、１７、２８、３５、４２日。 マウスをより普通のＴＴ／Ｇ１ＡおよびＫＬＨ／Ｇ１Ａ＋ＡＦの免疫化よりも ｐ４０／Ｇ１Ａで免疫化したとき、抗Ｇ１Ａの応答は有意により高くかついっそ う急速である。ｐ４０／Ｇ１Ａの１回の注射により、７日までに１０００の抗体 力価を得ることができる。この力価はＴＴ／Ｇ１ＡまたはＫＬＨ／Ｇ１Ａ＋ＡＦ を使用して２８日に得られる。３回の注射後に、２８日までに得られる最大の応 答（力価＝１／３８０，０００）は、ＫＬＨ／Ｇ１Ａ＋ＡＦで得られるよりほぼ ３０倍大きく、そしてＴＴ／Ｇ１Ａで得られるより７０倍大きい。抗Ｇ１Ａ抗体 の力価は、第４２日まで弱化しないで、一定に持続する。 結果を第２図に表す。担体に対する免疫応答の速度論 同一の免疫化スキームに従い、マウスを担体にカップリングしたＧ１Ａで免疫 化する。異なる担体により誘発された抗体の応答を下記の時間において比較する ：実験の開始後７、１７、２８、３５、４２日。 抗ｐ４０の応答（１０，０００に近い力価）は、抗ＫＬＨの応答より高いが、 抗ＴＴの応答と有意に異ならない。 結果を第３図に表す。結論 ｐ４０タンパク質へのＧ１Ａペプチドの化学的カップリングは、ＫＬＨ／Ｇ１ Ａ＋ＡＦまたはＴＴ／Ｇ１Ａの参照モデルにより誘発される応答より、有意によ り重要なかつより急速な抗Ｇ１Ａ応答の誘発を可能とする。Ｇ１Ｂペプチドのカ ップリングは同様な応答を誘発すると考えられる。実施例７： ｐ４０担体タンパク質にカップリングされた呼吸器多核体ウイルス （ＲＳＶ）サブグループＡの糖タンパク質Ｇのペプチドおよび組換えペプチドの 保護的可能性の評価 ＢＡＬＢ／ｃマウスを下記の異なる調製物で免疫化する。 １） ＫＬＨ（キーホールリンペットヘモシアニン）にカップリングされたＧ１ Ａ合成ペプチド＝ＫＬＨ・Ｇ１Ａ。 ２） ｐ４０担体タンパク質にカップリングされたＧ１Ａ合成ペプチド＝ｐ４０ ・Ｇ１Ａ。 ３） ｐ４０対照単独。 ４） ｐ４０担体タンパク質にカップリングされた大腸菌(E.coli)中で生産され た組換えタンパク質：ＢＢＧ２ＡδＣ＝ｐ４０・ＢＢＧ２ＡδＣ。 ５） 破傷風トキソイド（ＴＴ）担体タンパク質にカップリングされたＧ１Ａ合 成ペプチド＝ＴＴ・Ｇ１Ａ。 ６） ＴＴ対照単独。 ７） ＢＢ対照単独。 ８） 長いＲＳＶ対照（サブグループＡ）。 マウスにアジュバントとして水酸化アルミニウム（人間において現在使用され ている）とともに３回の筋肉内投与（２００μｇ／マウス）を与えた。保護試験 の結果ならびに血清の免疫学的プロフィルを表２に記載する。 下記の調製物は、ＴＴ・Ｇ１Ａ（これは、また、ペプチドＫＬＨ・Ｇ１Ａに匹 敵する非常にすぐれた保護を与える）に関して、長いＲＳＶ（株Ａ）：ｐ４０・ Ｇ１Ａ、ｐ４０・ＢＢＧ２ＡδＣで試験（challenge）した後、完全な保護を与 える。ＥＬＩＳＡ試験において、それらのすべてはＲＳＶ抗原を認識し、ｐ４０ ・Ｇ１Ａについて最大の力価＝１／１２８００が得られる。 中和試験に関して、調製物のいずれもｉｎ ｖｉｔｒｏの中和活性をもたない 。 実施例８ ＫＬＨにカップリングされた呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶ）サブグループＡ およびサブグループＢの糖タンパク質Ｇのペプチドの保護の可能性の評価。 ＲＳＶの２つのサブグループを用いて実施した試験に対する保護。 ＢＡＬＢ／ｃマウスを下記の異なる調製物で免疫化した： １． ＫＬＨ（キーホールリンペットヘモシアニン）にカップリングされたＧＩ Ａ合成ペプチド＝ＫＬＨ−Ｇ１Ａ。 ２． ＫＬＨ（キーホールリンペットヘモシアニン）にカップリングされたＧ１ Ｂ合成ペプチド＝ＫＬＨ−Ｇ１Ｂ。Ｇ１ＢペプチドはサブグループＢの配列Ｇ（ １７４−１８７）δＣｙｓに相当し、その配列は下記の通りである： ３． ＫＬＨ対照。 ４． 長いＲＳＶ対照（サブグループＡ）。 ５． ８／６０ＲＳＶ対照（サブグループＢ）。 マウスにフロインドアジュバントとともに３回の筋肉内投与（２００μｇ／マ ウス）を与えた。保護試験の結果ならびに血清の免疫学的プロフィルを表３に記 載する。 調製物ＫＬＨ・Ｇ１ＡはＲＳＶサブグループＡに対する完全な保護を可能とす るが、ＲＳＶサブグループＢに対して保護を可能としない。反対に、調製物ＫＬ Ｈ−Ｇ１ＢはＲＳＶサブグループＢに対する完全な保護を可能とするが、ＲＳＶ サブグループＡに対して保護しない。ＥＬＩＳＡ試験は同一として状況を反映す る。 実施例９：獣医学的適用 ＫＬＨ担体タンパク質にカップリングされた呼吸器多核体イルス（ＲＳＶ）の ウシ株(Lerch et al．、1990 、J.Virol.64:5559)のプロテインＧ由来のＧ１ｖ△ Ｃペプチドの保護的可能性の評価。 （位置１７６−１８２にジスルフィド架橋を有する） Ｂｏｃ化学を使用する固相合成により製造されたペプチドを、グルタルアルデ ヒドを使用してＫＬＨにカップリングする(Schaaper et al.、Mol.Immunol.(1989 )26:81-85)。 ２頭の仔ウシを不完全フロインドアジュバントとともに５００μｇのＧ１ｖ△ Ｃ−ＫＬＨで筋肉内経路により３週の間隔で３回免疫化した。一方の仔ウシをＧ １ｖ△Ｃペプチドを含まないＫＬＨと、不完全フロインドアジュバントとで免疫 化した。 動物を最後の接種後２１日にＳｎｏｏｋ株で、鼻内および気管内の経路により 、各々２×１０⁵／ｍｌの滴定ウイルスカ価１ｍｌで試験する。 プラーク法に従い仔ウシ腎細胞について滴定されたウイルスを、試験後それぞ れ３および２日の鼻咽頭の洗浄において、そして７日に殺した動物の肺において 決定する。 循環する抗体の応答： 仔ウシに５００μｇのＧ１ｖ△Ｃ−ＫＬＨ＋不完全フロインドアジュバントを ３週の間隔で３回投与した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ０７Ｋ 19/00 9356−4Ｈ Ｃ０７Ｋ 19/00 // Ｃ１２Ｐ 21/02 9637−4Ｂ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 トルデル，マイケル カナダ国ケベック州、ロレーヌ、バル、ダ ジョール、88

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． サブグループＡおよびサブグループＢのヒト呼吸器多核体ウイルス、ま たはウシ呼吸器多核体ウイルス、またはウシのＧタンパク質の配列のアミノ酸残 基１３０と２３０との間のペプチド配列、または前記ペプチド配列と少なくとも ８０％の相同性を有する配列を保持することを特徴とする、免疫原要素として使 用できるポリペプチド。 ２． ＲＳＶプロテインＧのアミノ酸残基番号１７４と１８７との間のペプチ ド配列または対応する配列と少なくとも８０％の相同性を有する配列を含むこと を特徴とする、請求項１に記載のポリペプチド。 ３． ａ）位置１７３および／または１８６におけるＣｙｓアミノ酸がジスル フィド架橋を形成しないアミノ酸、特にセリンにより置換されている、および／ または ｂ）位置１７６および１８２におけるアミノ酸がジスルフィド架橋以外の共有 結合の架橋を形成することができるアミノ酸、特にアスパラギン酸およびオルニ チンである、 配列を含むことを特徴とする、請求項１または２に記載のポリペプチド。 ４． ＲＳＶプロテインＧの配列のアミノ酸残基番号１４０と２００の間との ペプチド配列または前記ペプチド配列と少なくとも８０％の相同性を有する配列 から成ることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載のポリペプチド 。 ５． ＲＳＶプロテインＧの配列のアミノ酸残基番号１５８と１９０との間の ペプチド配列または前記ペプチド配列と少なくとも８０％の相同性を有する配列 から成ることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載のポリペプチド 。 ６． ヒトＲＳＶ、サブグループＡおよびサブグループＢのプロテインＧまた はウシＲＳＶの配列のアミノ酸残基番号１３０と２３０との間のペプチド配列ま たは前記ペプチド配列と少なくとも８０％の相同性を有する配列から成ることを 特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載のポリペプチド。 ７． 下記の配列： 配列番号５： Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｃｙｓ Ｔｒｐ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｃｙｓ Ｌｙｓ、 配列番号６： Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ｃｙｓ Ｌｙｓ、 配列番号７： Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｃｙｓ Ｔｒｐ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｌｙｓ、 配列番号８： Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｌｙｓ、 配列番号９： Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｏｒｎ Ｔｒｐ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｃｙｓ Ｌｙｓ、 配列番号１０： Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｏｒｎ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ｃｙｓ Ｌｙｓ、 配列番号１１： Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｏｒｎ Ｔｒｐ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｌｙｓ、 配列番号１２： Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｏｒｎ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｌｙｓ、 の中の１つを有することを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載のポ リペプチド。 ８． 配列番号１４〜７３の中の１つを有することを特徴とする、請求項１〜 ３のいずれか一項に記載のポリペプチド。 ９． Ｎ−末端またはＣ−末端の位置に少なくとも１つのシステイン残基をさ らに含むことを特徴とする、請求項１〜８のいずれか一項に記載のポリペプチド 。 １０． 担体タンパク質に結合した請求項１〜９のいずれか一項に記載のポリ ペプチドを含むことを特徴とする免疫原的薬剤。 １１． 担体タンパク質が免疫アジュバントタンパク質であることを特徴とす る、請求項１０に記載の免疫原的薬剤。 １２． 担体タンパク質がＯｍｐＡタンパク質であることを特徴とする、請求 項１０および１１に記載の免疫原的薬剤。 １３． ポリペプチドがクレブシエラ(Klebsiella)属の細菌の外膜のタンパク 質との可溶性複合体の形態であることを特徴とする、請求項１０〜１２のいずれ か一項に記載の薬剤。 １４． 免疫アジュバントタンパク質がクレブシエラ・ニューモニエ(Klebsie lla pneumoniae)のタンパク質ｐ４０またはタンパク質ｐ４０と少なくとも８０ ％の相同性を有するタンパク質であることを特徴とする、請求項１１〜１３のい ずれか一項に記載の薬剤。 １５． ポリペプチドが結合タンパク質により担体タンパク質に複合化されて いることを特徴とする、請求項１０〜１４のいずれか一項に記載の薬剤。 １６． 結合タンパク質がヒト血清アルブミンレセプターであることを特徴と する、請求項１５に記載の薬剤。 １７． 前記ポリペプチドが配列番号１３を含むタンパク質に結合されている ことを特徴とする、請求項１０〜１６のいずれか一項に記載の薬剤。 １８． 結合が共有結合であることを特徴とする、請求項１０〜１７のいずれ か一項に記載の薬剤。 １９． 生物学的経路により得られることを特徴とする、請求項１０〜１８の いずれか一項に記載の薬剤。 ２０． 請求項１〜９のいずれか一項に記載のポリペプチドまたは請求項１０ 〜１９のいずれか一項に記載の薬剤を含有することを特徴とする、ヒトＲＳＶ、 サブグループＡおよび／またはサブグループＢ、またはウシＲＳＶにより誘発さ れる感染の予防および／または治療用組成物。 ２１． 注射可能な経路による投与に適合した薬学上許容される賦形剤をさら に含有することを特徴とする、請求項２０に記載の組成物。 ２２． 非特異的免疫アジュバントを含むことを特徴とする、請求項２０また は２１に記載の組成物。 ２３． 請求項１〜９のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードすること を特徴とするヌクレオチド配列。 ２４． 配列番号１３を含むタンパク質をコードすることを特徴とするヌクレ オチド配列。 ２５． ａ）クレブシエラ(Klebsiella)属の細菌の膜リポ多糖類を２価のカチ オンおよび界面活性剤の存在下に沈降させて、上清中に全体の膜タンパク質を回 収し、 ｂ）前記タンパク質をアニオン交換クロマトグラフィーにかけて、免疫アジュ バントタンパク質を含有する画分を分離し、 ｃ）免疫アジュバントタンパク質を含有する画分を濃縮し、 ｄ）免疫アジュバントタンパク質を請求項１〜９のいずれか一項に記載のポリ ペプチドと複合化させて可溶性複合体を形成する、 ことを特徴とする、請求項２０または２１に記載の組成物の中に挿入された複合 化ペプチドを製造する方法。 ２６． 工程ｄ）を０．０５％より低いか、またはそれに等しい濃度のグルタ ルアルデヒドの存在下に５日より長いか、またはそれに等しい期間の間実施する ことを特徴とする、請求項２５に記載の方法。 ２７． 抗原の免疫原性を改良するための、配列番号１３または少なくとも８ ０％の相同性を有する配列を有するタンパク質の使用。