JPH09511582A - 抗体検出法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、試料中の抗体群を検出する方法に関する。この方法は、確実に検出することができ、かつ試料中の抗体群の予想最大量より少ない抗原の最少量の１０００倍まで、好ましくは１０ないし１００倍である、量の抗原を使用する。抗原：抗体複合体が形成され、これが遊離抗原を結合しない結合剤と結合するに至る。次いで、遊離抗原を、試料中に存在する抗体群の測定尺度として検出する。

Description

【発明の詳細な説明】 抗体検出法 発明の背景 発明の分野 抗体群の検出は、抗原により引き起こされる疾病の診断において有用な手段で ある。自己抗体群の検出もまた患者の疾病発症の危険性を測定するのに有用であ る。インシュリン依存性真性糖尿病(“ＩＤＤＭ”)を発症している患者について 危険因子としての自己抗体群を検出することに関連する多くの研究がある。Ｉ型 糖尿病または若年型糖尿病としても知られているＩＤＤＭの指標であると考えら れている自己抗体群は多数ある。それらには、インシュリン自己抗体群、膵島細 胞抗原自己抗体群、およびもっとも最近では、グルタミン酸デカルボキシラーゼ の６５kdイソ形態（“ＧＡＤ₆₅”）に対する自己抗体群がある。 ＧＡＤ₆₅に対する自己抗体群は、ＩＤＤＭ発症の最初期マーカーの一つである ことが示唆されている。これらの自己抗体群は、ＩＤＤＭの臨床所見の数年前に 先立って存在し、その時点で、疾病の進行を防ぐために介入段階に入ることがで きる。関連技術の説明 特定の抗体群は、それらの抗原またはその模擬体への結合を検出するだけで測 定できる。対象となる抗体群を含有するある種の免疫グロブリンを、アッセイの 前に試料から分離する場合もある（Decker等、EP 0,168,689 A2）が、全てのア ッセイにおいて、試料免疫グロブリンの少なくとも若干部を抗原と接触させる。 例えば、特定のＩgＭのアッセイでは、抗原と接触させることにより、総ＩgＭの 一部を表面および特定のＩgＭの検出の前に除去した試料に吸着させることがで きる。次いで、結合抗体の検出、結合抗原の検出、または遊離抗原の検出により 、結合を測定する。 結合抗体の検出の場合、通常は、標識化抗ヒト免疫グロブリンまたは標識化抗 原を、抗原で被覆した表面上に特異的に吸着させておいた試料由来の抗体群に結 合させる、Bolz等、U.S.特許第4,020,151号。過剰の試薬を洗浄除去し、表面に 結合したまま残っている標識を検出する。これは、例えば、肝炎およびヒト免疫 不全ウイルスについて、また多くの免疫組織化学的試験について最も頻繁に使用 されているアッセイの方法である、Nakamura等、Arch Pathol Lab Med 112:869- 877(1988)。この方法は、相対的に感度が良いが、特異的免疫グロブリンと区別 することができない非特異的免疫グロブリンが表面へ非特異的に結合するという 干渉を受け易い。 その他の結合抗体群検出法は、試料と競合性標識化抗体とを支持体結合抗原と 合わせる必要がある、Schuurs等、U.S.特許第3,654,090号。この方法は、血清中 の抗体群が多くのエピトープに結合して、競合作用を無効にすることから、限界 がある。 結合抗原の検出に際し、試料中に存在する抗体の最大量を超える量の、または 抗体の量以下の量の抗原を使用できる。例えば、ＧＡＤ自己抗体群の放射性免疫 沈降（“ＲＩＰ”）アッセイが開発され、現在使用されている、Atkinson等、La ncet 355:1357-1360(1990)。しかしながら、このアッセイを酵素結合免疫吸着ア ッセイ（“ＥＬＩＳＡ”）形式に転用する試みは、成功していない。ＲＩＰアッ セイは、ヒト血清における免疫グロブリンの沈澱に基づくものであり、ＧＡＤ自 己抗体群のラジオイムノアッセイ（”ＲＩＡ”）の開発へと導くものである。Ｒ ＩＰおよびＲＩＡは両方とも、抗原を過剰に加え、結合した抗原：抗体複合体を プロテインＡ−セファロースで沈澱させるものである。次いで、その複合体を洗 浄または更に電気泳動により分離し、複合体中の抗原を検出する。 他の沈澱剤として、リウマチ因子またはＣ1q、Masson等、U.S.特許第4,062,93 5号；ポリエチレングリコール、Soeldner等、U.S.特許第4,855,242号；およびプ ロテインＡ、Ito等、EP 0,410,893 A2、などが使用できる。沈澱した抗原を測定 して試料中の抗体量を示すことができ；溶液中に残っている抗原量を測定するこ ともでき；また、沈澱した抗原および溶けている抗原の両方を測定して、非特異 的に沈澱する幾つかの標識化抗原について補正することができる。これらの方法 は、非常に感度が良いが、全て遊離抗原を結合複合体から厳密に分離する必要が あるため、最低でも沈澱物を濾過または遠心分離し、さらに多数回洗浄すること が必要となるので実施困難である。 これに代えて、抗原量が抗体の最大量以下の場合は、結合抗原を検出すること ができる。通常、それは、抗原で被覆したラテックス粒子、または赤血球などの 粒子を使用して実施される、Cambiaso等、U.S.特許第4,184,849号およびUchida 等、EP 0,070,527 A１。抗体群は、特異的にこれらの粒子を凝集させることがで き、次いで、光散乱その他の方法により検出できる。あまりにも多量の抗原は感 度に逆影響を与える一方で、あまりにも少量の抗原は、二相性のアッセイ応答を 与え、また高い抗体力価が陰性と読まれることもあるので、これらのアッセイに は、正確な量の抗原を使用することが必要である。それ故に、試料の連続希釈を 行って、陽性試料が見失わないようにする必要がある。更に、これらのアッセイ は、比較的高い親和性を有する抗体のみを検出する傾向があり、それ故、各抗体 の結合部位全てが、粒子上の最初にそれが結合する抗原に結合してしまい、他の 粒子に結合する部位が残らないという傾向により、この方法の感度は低下する。 遊離の抗原を検出するアッセイの場合、抗原を過剰にまたは限定量で加えるこ ともあり得るが、報告されているのは前者の場合のみである。このタイプのアッ セイは、過剰の抗原を試料に加え、免疫グロブリンを沈澱させ、溶液中に残った 抗原を測定すると記載されている、Masson等、上記、およびSoeldner等、上記。 これらのアッセイは、少ない量の抗体では、遊離抗原量の低パーセンテージの変 化が起こるのみであり、この低いパーセンテージを正確に検出するのは困難であ るため、比較的に低感度である。 遊離の抗原を検出し、かつ抗原が試料中にあると予想される抗体の最大量を超 えて存在しないような実用的なアッセイは、報告されていない。しかしながら、 van Erp等、Journal of Immunoassay 12(3)：425−443(1991)では、一定濃度の モノクローナル抗体を、抗原の一連の濃度希釈物と共にインキュベーションし、 次いで、遊離抗原を、金ゾル粒子凝集イムノアッセイを用いて測定し、抗体親和 性定数を測定した。 ＩＤＤＭを発症している患者に対して危険因子を測定するための有用なマーカ ーを評価する分野では、多くの研究がされている。これらには、インシュリン自 己抗体、Soeldner等、上記、およびグルタミン酸デカルボキシラーゼ（“ＧＡＤ ”）に対する循環自己抗体群、Atkinson等、PCT/US89/05570、およびTobin等、P CT/US91/06872、がある。更に、Rabin等、U.S.特許第5,200,318号は、ＧＡＤお よび膵島細胞抗原自己抗体群の検出についての多くのアッセイ形式を記載してい る。ＧＡＤ自己抗体群は、それらが疾病の前臨床段階で起こるため、特に診断用 に重要であり、治療的介入を可能にし得る。しかしながら、診断用マーカーとし てのＧＡＤ自己抗体群の使用は、便利な非アイソトープアッセイがないため、妨 げられている。 あるアッセイ法では、支持体結合抗原を試料とともにインキュベーションし、 次いで、標識化抗ヒト免疫グロブリンを加えることが必要となる。これは、ＧＡ Ｄ₅₆に対する自己抗体群をアッセイするＳyn^elisaキットなどの多くの市販の抗 体アッセイキットの基礎原理であり、“Syn^elisaGAD II-Antibodies”（Elias U SA，Inc.）と題する製品報告書に記載されている。この方法では、非特異的ヒト 免疫グロブリンが支持体へ吸着することから生じる高いバックグラウンドシグナ ルを受け易いので、試料の相当な希釈が必要となる。 上記アッセイの多くは、固定化した抗原に結合するに至った抗体の検出を伴う 。これは、試料中の固定化した抗原に非特異的に結合する、特定免疫グロブリン と、他の免疫グロブリンとの識別が困難であるため、アッセイの感度に対して逆 影響を与えることがある。免疫グロブリンの非特異的検出を回避するアッセイの 開発が望まれているだけでなく、免疫沈降アッセイの感度上の利点と簡略化した プロトコールとを組合せた抗体群検出改良法に対する要望もある。最終的に、Ｉ ＤＤＭなどの疾病が発症する危険性を評価する助けとなり得るアッセイが、医学 的かつ経済的に非常に重要である。本発明はこれらの要望に対応するものである 。 発明の概要 本発明は、抗体群を含有する疑いのある試料中の抗体群の存在または量を測定 する方法に関する。 本発明の一態様は、試料と、試料中の抗体群に結合する抗原を合わせて、抗原 ：抗体複合体を形成させることに関する。使用した抗原の量をＺとすると、Ｚは ＸないしｎＸの範囲内であって、ＺはＹより少なく、ｎは５ないし１０００、好 ましくは１０ないし１００であり、Ｘは試料中に抗体群が存在しない場合に確実 に検出され得る抗原の最少量であり、Ｙは試料中の抗体群の予想最大量である。 本発明のその他の態様は、複合体を結合するが、抗原が複合体の一部でない場 合は抗原を結合しない第１結合剤の使用、および、複合体が第１結合剤に結合さ れ場合、複合体結合と相関して抗原を選択的に結合する第２結合剤の使用に関す る。第１結合剤は、可溶性ポリマーまたは懸濁可能な固相に結合させることがで きる。第２結合剤は、固相に結合させることができる。第２結合剤はまた、抗原 を結合する２つのレセプターであることもでき、その場合、各レセプターをシグ ナル産生系構成員に結合させる。 本発明のその他の態様は、試料中の抗体群の存在または量の指標として、複合 体の一部でない抗原の存在または量を、検出することに関する。 本発明は、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（“ＧＡＤ”）自己抗体群の存在 または量を測定する方法にも関する。 本発明の別の態様は、標的抗体を含有する疑いのある試料とその抗体を結合す る抗原とを合わせて、抗原：抗体複合体と遊離抗原を含有する混合物を形成させ 、その遊離抗原を検出するというアッセイの改良である。この改良は、ＺがＸな いしｎＸの範囲内であって、ＺはＹより少なく、ｎは５ないし１０００、好まし くは１０ないし１００であり、Ｘは試料中に抗体群が存在しない場合に確実に検 出され得る抗原の最少量であり、Ｙは試料中の抗体群の予想最大量である、量Ｚ の抗原の使用を伴う。本発明のその他の態様では、改良は、複合体に結合するが 、遊離抗原には結合しない第１結合剤の添加と、続く、遊離抗原には結合するが 、抗原が第１剤結合複合体の一部である場合は抗原に結合しない第２結合剤の添 加を伴う。 本発明は、更に、これらの方法に使用するためのキットに関する。 特定の実施態様の説明 本発明の特定の実施態様の説明に進む前に、幾つかの用語を定義したい。 分析物：検出すべき抗体群または自己抗体群。これらには、完全な免疫グロブ リン類またはそれらのフラグメントがあり、また、様々な種類およびアイソタイ プ類、例えば、ＩgＡ、ＩgＤ、ＩgＥ、ＩgＧ１、ＩgＧ２a、ＩgＧ２b、およびＩ gＧ３およびＩgＭがある。 抗原：それに対して抗体群が産生され得る化合物であって、抗体に結合して、 特定の抗体：抗原複合体を形成する能力がある化合物。抗原は、抗体分析物に結 合されるものであり、通常は、生体分子、哺乳動物、ウイルスまたは微生物，そ のものまたはそれらの模擬体であるか、または薬剤、農薬、環境汚染物、その他 のような、合成または環境に存在する天然起源の他の分子である。抗原は、その 天然形態でアッセイに使用してもよく、また、その抗原性と抵触しないように修 飾してもよい。典型的な修飾は、抗原に、特異的結合対構成員および／または検 出可能な標識を共有結合または非共有結合させることであり、そのいずれかまた は両方とも、抗原の検出を容易ならしめ得るものである。 分析物を含有する疑いのある試料：対象となる抗体群または自己抗体群を含有 することが合理的に疑われる試料であれば、どれでも本発明の方法により分析さ れ得る。そのような試料は、典型的には、宿主由来の体液、例えば、尿、全血液 、血漿、血清、唾液、精液、大便、たん、大脳髄液、涙、粘液等の水性溶液であ るが、好ましくは血漿または血清である。試料は、下記のように前処理してもよ く、また、アッセイに干渉しない適当な媒質中で調製することもできる。水性媒 質が好ましい。 特異的結合対の構成員(“ｓｂｐ”構成員)：他の分子の特定の空間的および極 性の構成と特異的に結合し、それによって、他の分子の特定の空間的および極性 の構成と相補的なものとして定義される領域を表面上または腔内に有する、２つ の異なる分子のうちの１つ。ｓｂｐ構成員は、例えば、免疫学的ペア、例えば抗 原−抗体の構成員のようなリガンドおよび受容体として表すことができる。ここ で使用した“リガンド”という用語は、受容体が天然に存在するかまたは調製で きるあらゆる有機化合物を表しており、“受容体”という用語は、分子の特定の 空間的および極性の構成、即ち、エピトープ性部位または決定因子部位を認識す る能力のあるあらゆる化合物または組成物を表す。相補的ｓｂｐ構成員は、例え ばリガンドとその相補的受容体のように、もう一方と結合するものである。ｓｂ ｐ構成員は、抗原および抗体のような免疫学的ペア、またはアビジンとビオチン またはオリゴヌクレオチドの相補鎖のような非免疫学的ペアであることができる 。ｓｂｐ構成員は、また、低分子または低分子残基およびそれらの受容体であっ てもよい。低分子は、分子量１００から２０００、好ましくは１５０ないし１０ ００を有し、その低分子に対する受容体が存在するか、または調製できるかのい ずれかである。低分子の例には、ビオチンの誘導体、リセルグ酸、フルオレセイ ン、またはフルオレセイン誘導体、およびビタミンＢ₁₂があり、それぞれアビジ ンまたはストレプトアビジン、抗リセルグ酸、抗フルオレセイン、および内因子 である対応する受容体を持つ。低分子は、他のｓｂｐ構成員に共有結合して、低 分子を少なくとも１つ、頻繁には２ないし２０を有するコンジュゲートを形成す ることが多い。低分子のｓｂｐ構成員への結合は、低分子の水素原子をｓｂｐ構 成員への結合に置き換える結果となる化学反応、または低分子と任意サイズのｓ ｂｐ構成員、ただし、好ましくは低分子に対する受容体とｓｂｐ構成員の両方の コンジュゲートに結合させるのに必要なサイズよりは大きくない、との間の連結 基により達成できる。低分子に対する抗体群は、低分子を免疫原性キャリアーに 連結させることにより、調製した免疫原で動物を免疫処置することにより、調製 できる。 支持体または表面：固相は典型的には支持体または表面であり、多くの形状、 例えば、ストリップ、ロッド、ビーズを含む粒子、および同等物のいずれか１つ を持つことができる多孔性または非多孔性水不溶性物質である。適切な物質は当 該分野ではよく知られており、例えば、出典明示により本明細書の一部としてい る、Ullman等、米国特許第5,185,243号、10-11欄、Kurn等、米国特許第4,868,10 4号、６欄、14−31行に記載されている。リガンドおよび受容体の支持体または 表面への結合は、普通に文献から入手できるよく知られた技術により達成するこ とができる。例えば、“Immobilized Enzymes”、千畑一郎、Halsted Press,New York(1978)およびCuatrecasas，J.Biol.Chem.245:3059(1970)参照。どの型の固 体支持体を用いるとしても、直接的または間接的に抗原に結合する受容体または リ ガンドのいずれかをその表面に結合させるように処理しなければならない。典型 的な受容体には、抗体群、内性因子、詳細には、抗原上の基と反応できるスルフ ヒドリル基などの反応性化学薬剤がある。例えば、アビジンまたはストレプトア ビジンは、０.５ないし１.５mmの球状ガラスビーズに共有結合でき、これを用い てビオチニル化抗原を得ることができる。 シグナル産生系(“ｓｐｓ”)：結合および／または非結合標識の量、即ち、検 出される化合物に結合した標識または結合しなかった標識の量、に相関する検出 可能なシグナルを産生する１またはそれ以上の成分で、少なくとも１つは標識で ある成分。標識は、蛍光剤、酵素、化学発光剤、または光増感剤などのように、 シグナルを生産するかまたはシグナル産生を誘導できる任意の分子である。その ため、酵素活性、化学発光、または光吸収を観察することによりシグナルを検出 および／または測定する。 適切な標識には、例示であって限定ではないが、アルカリホスファターゼ、グ ルコース６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（“Ｇ６ＰＤＨ”）および西洋ワサ ビペルオキシダーゼのような酵素；ＱＢレプリカーゼなどのレプリカーゼの基質 ；プロモーター類；色素類；フルオレセイン、イソチオシアネート、ロダミン化 合物類、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタル デヒド、およびフルオレカミンなどの蛍光剤；イソルミノールなどの化学発光剤 ；感光剤；補酵素；酵素基質；光増感剤；ラテックスまたは炭素粒子などの粒子 ；懸濁可能な粒子；金属ゾル；クリスタライト；リポソーム；細胞等があり、こ れらを更に染料、触媒または他の検出可能な基で標識してもよい。適切な酵素お よび補酵素は、Litman等、米国特許第4,275,149号、19−28欄、およびBoguslask i等、米国特許第4,318,980号、10−14欄に開示されており；適切な蛍光剤および 化学発光剤は、Litman等、米国特許第4,275,149号、30および31欄に開示されて おり、全て出典明示により本明細書の一部としている。好ましくは、少なくとも １つのｓｐｓ構成員を、蛍光剤、酵素、化学発光剤、光増感剤、および懸濁可能 な粒子から選択する。 標識は、シグナルを直接産生できるので、シグナル産生のための更なる成分を 必要としない。多くの有機分子、例えば、蛍光剤は、紫外線および可視光を吸収 でき、その光吸収がエネルギーをこれらの分子に転移させ、それらを励起エネル ギー状態へと高める。その後、この吸収されたエネルギーは、第２波長での光放 出により放散する。シグナルを直接産生する他の標識には、放射性アイソトープ や色素がある。 これとは別に、標識がシグナルを産生するのに他の成分を必要とする場合もあ り、その場合、ｓｐｓは、測定可能なシグナルを産生するのに必要な全ての成分 を含み、その成分には、基質、補酵素、増強剤、更なる酵素、酵素生成物と反応 する物質、触媒、アクチベーター、補助因子、阻害因子、スカベンジャー、金属 イオン、シグナル産生物質の結合に必要な特異的結合物質、および同等物を含む ことができる。適切なシグナル産生系についての詳細な記載は、Ullman等、米国 特許第5,185,243号、11−13欄に見ることができ、これは出典明示により本明細 書の一部とする。 標識は、抗原であるかまたは抗原に直接的または間接的に結合する能力のある ｓｂｐ構成員に結合するものであり、限定ではないが、抗原；抗原に結合した受 容体に対するリガンド；抗原に結合したリガンドに対する受容体；抗原と結合す る抗体に対する受容体；抗体または抗原にコンジュゲートした分子に対する受容 体；抗原に対する受容体と結合する能力がある抗原代用物；抗原と結合するリガ ンド、等がある。標識のｓｂｐ構成員への結合は、例えば、標識と標識に対する 抗体との複合体を形成するような非共有結合手段により、または、例えば、化学 反応の結果、標識の水素原子をｓｂｐ構成員への結合で置換することによる共有 結合手段により、達成することができ、また標識とｓｂｐ構成員との間に連結基 を含むこともできる。このようなコンジュゲーション法は、当該分野ではよく知 られている。例えば、出典明示により本明細書の一部とするRubenstein等、米国 特許第3,817,837号参照。他のｓｐｓ構成員もまたｓｂｐ構成員と共有結合でき る。例えば、Ullman等、米国特許第3,996,345号では、蛍光剤や消光剤などの２ つのｓｐｓ構成員は、両方とも分析物に結合する２つのｓｂｐ構成員にそれぞれ 結合し、そうして、蛍光剤−ｓｂｐ₁：分析物：ｓｂｐ₂−消光剤複合体を形成す る。複合体の形成により、蛍光剤と消光剤は極めて接近した状態になり、そうし て消光剤が蛍光剤と相互作用してシグナルを産生可能にする。これは、蛍光励起 伝達イムノアッセイである。他の概念は、Ullman等、EP 0,515,194 A2に記載さ れており、ｓｐｓ構成員として化学発光化合物および光増感剤を用いるものであ る。これは、発光酸素チャンネリングイムノアッセイといわれるものである。上 記文献はいずれも、出典明示により本明細書の一部としている。 補助物質：様々な補助物質が、本発明に従う方法においてしばしば採用される 。例えば、緩衝液は、通常、アッセイ媒質やアッセイ成分のための安定剤と同じ く、アッセイ媒質中に存在する。これらの添加物に加えて、アルブミンなどのタ ンパク質類、ホルムアミドなどの有機溶媒類、第４級アンモニウム塩類、硫酸デ キストランなどのポリカチオン類、または界面活性剤類、特に非イオン性界面活 性剤、結合増強剤、例えば、ポリアルキレングリコール類、または同等物を含む 場合がしばしばある。 上記のように、本発明は、抗体群を含有する疑いのある試料中の、抗体群、好 ましくは血清抗体群の存在または量を検出する方法に関する。この方法は、感度 良好な免疫沈降アッセイと簡略化プロトコールとを組み合わせたものである。 本発明の方法は、従来の抗体群検出ＥＬＩＳＡ法にまさる重要な利点を与える 。抗体群を検出する“慣用の”ＥＬＩＳＡ法は、試料中の抗体群を抗原に結合さ せ、得られた抗原：抗体複合体を試料から分離し、次いで、抗体または抗原を検 出するというものである。抗体が固定化抗原に直接結合する場合、その抗体を検 出するが、試料中で関係のない免疫グロブリンの非特異的結合が起こり、これが 大量に存在することがあるため、この抗原結合特異的免疫グロブリンの高感度検 出は困難である。結果として、結合した抗体群の量を直接測定するアッセイは、 その感度を制限することが多い。自己抗体群についてアッセイする場合は、何人 かの患者で非常に低い自己抗体群力価が検出されることもあるため、更なる複雑 化要因が持ち上がる。本発明は、抗体群を直接検出するのではないので、免疫グ ロブリンの非特異的結合による影響を受けない。更に、抗原について免疫複合体 を分析する場合、手間暇のかかる分離および洗浄工程が必要であり、その間、抗 原が 一部損失してしまう危険がある。本方法は、かかる工程を回避するものである。 抗原検出を均一法により実施できるため、本発明に従う全過程で分離工程を必要 とせず、非常に簡単なプロトコールを用いることができる。 本発明の鍵となる態様は、試料を含有する媒質に添加する抗原のモル量であり 、これは通常１μＭ以下、多くは、１nＭ以下、および好ましくは０.１nＭ以下 であり、試料中の抗体群の予想最大量を超えない量で添加する。抗体群へ結合し た後に残っている遊離抗原を測定することにより、例外的に抗体群の高感度検出 が可能になる。高濃度の抗体群は定量できないが、直接的ラテックス凝集アッセ イにおいて起こるような高力価試料を損失する危険がない。典型的なＲＩＰアッ セイのように、大過剰の抗原を添加すれば、即ち、抗原のモル量が抗体の予想最 大モル量以上であれば、低力価試料での遊離抗原の減少の正確な測定尺度を得る ことができないため感度の損失がある。 それ故に、最大感度を得るためには、低濃度の抗原の使用が必要となる。抗原 の最少実用濃度は、試料が抗体を有さない場合に検出され得る最少濃度であるが 、通常は、この最少検出可能濃度の１０００倍まで、好ましくは最少検出可能濃 度の１００倍程度で使用することが望ましい。一般に、使用される抗原が多けれ ば多いほど、正確に測定できる抗体濃度範囲は大きくなり、アッセイ感度は低下 する。 本発明の方法で添加する抗原の最少量は、試料中に抗体がない状態での抗原の 検出限界により定まる、即ち、使用するアッセイ法によって検出できるだけの抗 原を添加しなければならない。この値は、当業者ならば、抗原量ゼロから開始し 、アッセイに使用した方法により抗原レベルが確実に検出できる量に達するまで 既知逓増量の抗原を用いる、一連の試験を実施すれば容易に確認可能である。こ こで使用した用語“確実に”は、同じアッセイを繰り返し実施でき、抗原を再現 的に検出することを意味する。確実に検出できる抗原の最少量は、抗原が存在し ないときに得られるシグナルとは標準偏差が約３異なるシグナルを提供する抗原 の量と定める。例えば、アッセイに使用する方法がＥＬＩＳＡである場合、抗− 抗原抗体を支持体に結合させ、様々な既知量の抗原試料を支持体に添加する。そ の 支持体を洗浄し、酵素標識化抗体を支持体に添加し、それを再度洗浄し、続いて 、酵素基質を添加する。基質の生成物への変換率は、存在する抗原量に相関する 。抗原レベルが数回のアッセイ実施にわたって繰り返し検出できるようなレベル に到達すれば、その量は“試料中に抗体が存在しない場合に確実に検出できる抗 原の最少量”を表す。 アッセイに添加される抗原の最大量は、試料からアッセイに導入される抗体の 予想最大量を超えないものであり、通常、抗体の予想最大量の少なくとも１００ 倍低い。このため、任意の一定濃度の抗原を用いる本発明のアッセイを実施し、 試料の連続希釈物に対してそのアッセイを繰り返すことにより、試料中の抗体量 の正確な測定尺度を得ることができる。試料中の抗体量は、抗原量をアッセイ中 の遊離抗原によるシグナルが、加えた試料によって５０％まで低下したときの希 釈率で割った値の２倍とみなす。 本発明において媒質に添加する抗原の量は、“Ｚ”と表し、ここで、ＺはＸな いしｎＸの範囲内であって、ＺはＹより少ない。価”ｎ”は５ないし１０００、 好ましくは１０ないし１００の範囲内である。“Ｘ”の量は、試料中に抗体が存 在しない場合に確実に検出できる抗原の最少量であり、”Ｙ”は試料中の抗体群 の予想最大量である。 本発明のこの態様での一実施態様は、(ａ)(ｉ)ある抗原に対して特異的な抗体 群を含有する疑いのある試料、(ii)それらの抗体を結合して抗原：抗体複合体を 形成するある抗原、ただし媒質に添加する抗原の量をＺとすると、ＺはＸないし ｎＸの範囲内であって、ＺはＹより少なく、ｎは５ないし１０００、好ましくは １０ないし１００であり、Ｘは試料中に抗体群が存在しない場合に確実に検出さ れ得る抗原の最少量であり、Ｙは試料中の抗体群の予想最大量である、および（ iii）複合体を結合し、抗原が複合体の一部でない場合は抗原を結合しない第１ 結合剤、を一緒に水性媒質に入れて混合物を形成させ；（ｂ）複合体が第１結合 剤に結合しているとき複合体との結合と相関して抗原に選択的に結合する第２結 合剤を混合物に添加し；さらに（ｃ）その存在または量が試料中の抗体群の存在 または量に相関している、第２結合剤に結合した抗原を検出する、各工程を含 む方法である。 本明細書で使用した“抗原：抗体複合体”の用語は、抗体に対する抗原の免疫 学的結合により形成された複合体を意味する。ここで使用した“選択的に結合す る”の用語は、第２結合剤が、複合体が第１結合剤に結合しているとき、抗原： 抗体複合体に結合するのに比例して遊離の抗原に優先的に結合する能力を有する ことを意味する。遊離の抗原とは、抗体分析物と複合体を形成しなかった、混合 物中の抗原である。遊離の抗原に対する第２結合剤の親和性は、第１結合剤−結 合複合体に対する親和性の少なくとも５倍であり、好ましくは少なくとも１０倍 である。この優先的結合は、動力学的または熱力学的であることができ、普通は 、電荷反発および／または立体障害の結果である。例えば、第１結合剤は、抗原 ：抗体複合体に結合すると、かなりの大きさになるので、第２結合剤が複合体中 に有意な程度に存在する抗原には結合できなくなるようである。それ故に、遊離 の抗原のみが、第２結合剤に結合することになる。 本発明の重要な特徴は、第１結合剤が第２結合剤の複合体への結合を排除する ような具合に、抗原：抗体複合体を結合できることである。これらの結合剤は、 ｓｂｐ構成員であり、第１結合剤が可溶性ポリマーまたは懸濁可能な固相に結合 しているとき、第２結合剤の第１結合剤結合複合体への結合を一層好適に妨げる ことができる。このことは、第１結合剤結合複合体が遊離抗原の測定に干渉しな いことから、第２結合剤添加に先立って第１結合剤結合複合体を媒質から分離す る必要がないという更なる利点を提供するものである。 第１結合剤を構成するｓｂｐ構成員は、それが抗原：抗体複合体を結合するが 、抗原が複合体の一部でないときは抗原を結合しないように、即ち、第１結合剤 が媒質中に存在する遊離のまたは結合していない抗原に有意には結合しないよう に、選択する。ｓｂｐ構成員は、試料中に存在する他の物質、例えば、非分析抗 体、を結合することもできる。このことは、第１結合剤が、抗原が分析物抗体に 結合しているとき以外は抗原を結合しないならば許容できる。 第１結合剤に適したｓｂｐ構成員には、免疫グロブリンに対する抗体類；補体 因子、Ｃ１ｑ；リウマチ因子；プロテインＧおよび／またはプロテインＡがある が、これらに限定されない。これらの物質の幾つかは、例えば、抗体類およびプ ロテインＡのような、ある種の免疫グロブリン類を非選択的に結合し、またいく つかは、例えば、Ｃ１ｑおよびリウマチ因子などのような免疫複合体を選択的に 結合する。上記のように、抗原：抗体複合体への第２結合剤の結合を妨げるため に、不可欠ではないが、更に第１結合剤が懸濁可能な固相または可溶性ポリマー を含むようにする、即ち、第１結合剤が懸濁可能な固相または可溶性ポリマーに 結合するようにするのが好ましい。 適切な可溶性ポリマーは、直鎖状または好ましくは分枝状のものであり、例示 であって限定ではないが、デキストランおよびヘパリンなどのポリサッカライド 類；ポリアクリレート類、ポリアクリロイルグルコサミン、ポリビニルピロリド ン、および同種物を含む。これらのポリマーは、普通、少なくとも１０,０００ の分子量を有し、好ましくは、第１結合剤を含む可溶性ポリマーは、２５０,０ ００以上の分子量のものとする。 適切な懸濁可能な固相には、例示であって限定ではないが、ラテックス、ガラ ス粒子、特に、多孔性ガラス粒子、ポリアクリルアミド粒子、アガロース、セフ ァデックス（登録商標）（Pharmacia Fine Chemicals，Inc.）、並びに、リポー ム、油滴などのような厳密には固体でない他の粒子相がある。上記多数の可溶性 ポリマーを架橋させて、懸濁可能な固相材料を得ることもできる。これらの材料 は、普通、粒子であり、１０nmから１００nm、好ましくは１００nmから１０nmの サイズ範囲のものとする。 第２結合剤は、抗原に結合する能力のあるｓｂｐ構成員である。それは、抗体 、好ましくはモノクローナル抗体、または抗原に対する他の受容体；抗原が酵素 である場合に、抗原が不可逆性阻害因子として結合するリガンド；またはｓｂｐ の一構成員、この場合他の構成員が抗原に結合する、であることができる。例え ば、ビオチンを抗原にコンジュゲートさせることができ、第２結合剤を含むｓｂ ｐ構成員は、アビジン、ストレプトアビジン、またはビオチンに対する抗体であ ることができる。あるいは、第２結合剤は、化学的に、抗原上の基と特異的に反 応する反応性基であることもできる。例えば、第２結合剤は、抗原上のスルフヒ ドリ ル基に特異的に結合できるブロモアセトアミド基を有してもよい。 第２結合剤は、可溶性ポリマーまたは懸濁可能または懸濁不可能な固相に結合 させることができ、このいずれも、第２結合剤に結合した抗原を検出可能にする ための標識を更に含んでいてもよい。可溶性ポリマーおよび懸濁可能な支持体は 、好ましくは、標識を含み、核酸、タンパク質類、デキストラン類、およびポリ アクリレート類などのポリマー、免疫複合体などの集合体、ラテックスなどの粒 子、アガロース、セファデックス（登録商標）、染料クリスタライト、リポソー ム、油滴、金属ゾル、および同種物を含む。非懸濁可能な固相には、ガラスまた はセルロース紙などの吸水性材料；ポリスチレン、ナイロン、ポリメタクリレー ト等などのプラスチック；シリコン、金およびインジウムなどの金属、および同 種物がある。 第２結合剤の添加後、その存在または量が試料中の抗体の存在または量に相関 する、第２結合剤に結合した抗原を検出する。この関係は、試料中に存在する抗 体濃度が高くなればなるほど、遊離抗原の量、即ち、第２結合剤に結合するに至 った抗原の量は少なくなるため、反比例である。 遊離抗原の検出は、多くの方法で達成できる。不均一系形式では、第２結合剤 を、分離可能な支持体、即ち、懸濁可能なまたは懸濁不可能な固相に結合させる 。例えば、第２結合剤は、抗−抗原抗体、または抗原に結合されるリガンドに結 合できるストレプトアビジンなどの受容体であることができる。これらの形式で は、まず、試料および抗原を合わせ、次いで、第１結合剤を加える。支持体に結 合させた第２結合剤の添加後、その支持体を混合物から分離する。第２結合剤支 持体に結合するに至った抗原の量は、直接的にまたは間接的に測定できる。抗原 自身に標識を結合させてているときは、その支持体上の標識を検出できる。ある 種の支持体、特に、インジウム、シリカ、およびアコースティック装置を用いれ ば、非標識化抗原でさえ、直接的に測定できる。あるいは、抗原を特異的に標識 する試薬を添加することにより、例えば、標識化抗体などの標識剤を抗原に添加 することにより、抗原を間接的に測定することもできる。その後、標識を当業者 によく知られた方法で検出できる。 上記の不均一系形式では、固相は、アッセイ混合物または標識剤を表面結合抗 原から能率よく分離する手段を与えるものである。典型的には、分離可能な支持 体は、マイクロタイターウェルなどの表面、紙またはニトロセルロースなどの多 孔性材料、または磁性粒子などのビーズを含む。その後、固相に結合した抗原を 検出できる。抗原は、ｓｐｓ構成員に結合できるか、または結合する能力がある 。例えば、抗原は、西洋ワサビペルオキシダーゼなどの酵素に結合させてもよく 、また酵素標識化抗−抗原抗体などのｓｐｓ構成員に結合させた受容体と接触さ せてもよい。あるいは、抗原自身にｓｂｐ構成員を結合させているときは、抗原 が結合するに至った第２結合剤固相を標識化相補的ｓｂｐ構成員と接触させるこ ともできる。支持体結合抗原を相補的ｓｂｐ構成員と共にインキュベーション後 、普通、支持体を相補的ｓｂｐ構成員から分離し、支持体上の標識の存在を検出 する。 均一系形式では、抗原を検出可能にするために第２結合剤に結合させた抗原を 分離する必要はない。例えば、第２結合剤を、固相としてのアコースティックカ プラー装置上に、または表面プラズモン共鳴（surface plasmon resonance）ま たは消散波（evanescent wave）蛍光検出を提供する固相上に固定させてもよく 、それらはいずれも、表面に結合した抗原を検出するために液相を分離する必要 がない。また、抗原に結合させた標識から得られるシグナルを固相により、また はポリマーまたは他の集合体または第２結合剤に結合させた懸濁可能な固相によ り、変調させることもできる。このためには、標識は、例えば、感光剤、蛍光剤 、酵素、または消光剤であることができ、そうして第２結合剤を化学発光粒子、 消光剤、第２酵素、または蛍光剤にそれぞれ直接的または間接的に結合させる。 これらの各対の２つの構成員間の結合は、例えば、発光酸素チャンネリングイム ノアッセイおよび蛍光励起伝達イムノアッセイに使用される技術により、結合の 直接検出を可能にするものである。 本発明のこの態様の別の実施態様は、(ａ)(ｉ)ある種の抗原に対する抗体群を 含有する疑いのある試料、(ii)これらの抗体を結合して抗原：抗体複合体を形成 する抗原、ただし媒質に添加する抗原の量をＺとすると、ＺはＸないしｎＸの 範囲内であって、ＺはＹより少なく、ｎは５ないし１０００、好ましくは１０な いし１００であり、Ｘは試料中に抗体群が存在しない場合に確実に検出され得る 抗原の最少量であり、Ｙは試料中の抗体群の予想最大量である、および（iii） 複合体を結合し、抗原が複合体の一部でないときは抗原を結合しない第１結合剤 、を一緒に水性媒質に入れ；（ｂ）媒質を、固相に結合している第２結合剤と接 触させ、ただし、第２結合剤は、抗原を結合して固相結合抗原を形成するが、抗 原：抗体複合体は結合しない受容体である；さらに（ｃ）その存在または量が試 料中の抗体群の存在または量に相関している、固相に結合している抗原を検出す る、各工程を含む方法である。 この実施態様は、下記実施例により例示説明する。Ａ型肝炎ウイルス抗原(“ Ａｇ_HAV”)に対する抗体(“Ａｂ”)を含有する疑いのある血清試料を、蛍光標識 に結合させたＡｇ_HAVと共に、１時間水性媒質中でインキュベートする。Ａｇ_HAV は抗体に結合してＡｇ_HAV：Ａｂ複合体を形成する。媒質に添加したＡｇ_HAVの量 は、試料中に抗体が存在しない場合に確実に検出できるＡｇ_HAVの最少量の１０ ０倍であり、モルに基づけば、臨床試料中に見出されるＡｇ_HAV抗体の最高量の １０００倍以上も低い。分子量２５０,０００のデキストランに結合させた抗ヒ ト免疫グロブリン抗体を加える。抗ヒト免疫グロブリン抗体は、Ａｇ_HAV：Ａｂ 複合体に結合するが、複合体の一部でないＡｇ_HAVには結合しない。更に１時間 インキュベーション後、媒質をマイクロタイターウェルに加え、そこにＡｇ_HAV に結合するモノクローナル抗Ａｇ_HAV抗体が結合して、支持体結合Ａｇ_HAVを形成 する。これらの抗体は、Ａｇ_HAV：Ａｂ複合体に結合しない。２０分インキュベ ーション後、ウェルを入念に洗浄して、残りの蛍光を測定することにより支持体 結合Ａｇ_HAVを検出するが、その量は、試料中の抗体の量に反比例する。 抗原を検出するための別法は、固相を、固相結合抗原に結合する標識化ｓｂｐ 構成員と接触させる必要がある。インキュベーション後、過剰のｓｂｐ構成員を 洗浄除去し、シグナルを産生するのに必要である標識に加えて何らかのｓｐｓ構 成員を加える。その後、シグナルを測定するが、その量は、試料中の抗体の量に 反比例する。例えば、酵素標識化第２モノクローナル抗Ａｇ_HAV抗体を加えても よく、洗浄後、基質を添加する。 本発明のこの態様のまた別の実施態様は、(ａ)(ｉ)抗体群を含有する疑いのあ る試料、(ii)これらの抗体を結合して抗原：抗体複合体を形成する抗原、ただし 媒質に添加する抗原の量をＺとすると、ＺはＸないしｎＸの範囲内であって、Ｚ はＹより少なく、ｎは５ないし１０００、好ましくは１０ないし１００であり、 Ｘは試料中に抗体群が存在しない場合に確実に検出され得る抗原の最少量であり 、Ｙは試料中の抗体群の予想最大量である、および（iii）複合体を結合し、抗 原が複合体の一部でないときは抗原を結合しない第１結合剤、を一緒に水性媒質 に入れ；（ｂ）抗原を結合する２つの受容体を含む第２結合剤を媒質に加え、た だし、受容体の少なくとも１つは、複合体が結合剤を結合している場合は複合体 に有効に結合できないものである；さらに（ｃ）受容体群が抗原を結合するとき に形成される複合体を検出する、各工程を含む方法である。 この実施態様を使用して、ヒト免疫不全ウイルス(“ＨＩＶ”)、風疹、または ヘルペスを有する患者に存在するような多数の抗体を検出することができる。下 記実施例は、ＨＩＶに対する抗体を検出するための本発明のアッセイを例示説明 するものである。ＨＩＶに対する抗体を含有する疑いのある試料を、ＨＩＶ抗原 (“Ａｇ_HIV”)と一緒に水性媒質に入れると、その抗原は、抗体に結合して、Ａ ｇ_HIV：Ａｂ複合体を形成する。上記の場合のように、添加したＡｇ_HIVの量は、 ＸないしｎＸの範囲内であって、Ｙより少ないＺであり、ここでｎは１００であ り、Ｘは試料中に抗体が存在しない場合に確実に検出され得るＡｇ_HIVの最少量 であり、Ｙは試料中の抗体の予想最大量である。１時間インキュベーション後、 硫酸デキストランに結合させたヒト免疫グロブリンに対するヤギ抗体を加える。 第１結合剤は、Ａｇ_HIV：Ａｂ複合体に結合するが、それが複合体の一部でない ときはＡｇ_HIVに結合しない。インキュベーション後、Ａｇ_HIVに対する２つの受 容体を媒質に加える。少なくとも１つ、および好ましくは２つの受容体をラテッ クス粒子に結合させて、硫酸デキストランに結合させたＡｇ_HIV：Ａｂ複合体に 受容体が結合するのを妨げる。好適には、２つの受容体は、Ａｇ_HIVに対する非 競合性モノクローナル抗体である。この抗体の１つは、Ｎ−メチルベンズアラク リダ ンなどの化学発光剤を溶解させてある粒子に結合させてもよい。その他の抗体は 、感光剤に、または好ましくは、クロロフィルＡなどの感光剤を溶解させてある ラテックス粒子に直接結合させることもできる。少なくともこれらの抗体の前者 は、複合体が第１結合剤に結合するとき、Ａｇ_HIV：Ａｂ複合体に効果的に結合 できない。化学発光−Ａｂ₁：Ａｇ_HIV：Ａｂ₂−感光剤複合体は、６００nmの過 剰の波長を有する光を１分照射し、４００ないし５００nmで遅延発光を測定し、 その後照射を終了することにより、１０分インキュベーション後に、検出される 。 本発明は、インシュリン；グルタミン酸デカルボキシラーゼ（“ＧＡＤ”）、 ６５ｋｄおよび６７ｋｄイソ形態の両方、より特定すればＧＡＤ₆₅；および膵島 細胞抗原に対する自己抗体の検出、に特に有用である。自己抗体を含有する疑い のある試料中のＧＡＤ自己抗体の存在または量を測定する方法の１つは、(ｉ)試 料、(ii)自己抗体に結合して抗原：自己抗体複合体を形成するＧＡＤ抗原、ただ し媒質に添加するその量をＺとすると、ＺはＸないしｎＸの範囲内であって、Ｚ はＹより少なく、ｎは５ないし１０００、好ましくは１０ないし１００であり、 Ｘは試料中に抗体群が存在しない場合に確実に検出され得る抗原の最少量であり 、Ｙは試料中の抗体群の予想最大量である、および（iii）第１結合剤、ただし 、第１結合剤は、複合体に結合する自己抗体の受容体であり、かつ懸濁可能な固 相および可溶性ポリマーからなる群から選択される材料に結合する、を一緒に水 性媒質に入れ；複合体を媒質から分離しないときは複合体との結合に相関して抗 原を選択的に結合する第２結合剤を媒質に加え；さらに、その結合が、試料中の 自己抗体の存在または量に相関している、第２結合剤の抗原への結合を検出する 、各工程を含む方法である。 ＧＡＤタンパク質は、生物源から、好ましくはラット、ネコ、またはブタなど の哺乳動物から単離および精製により得ることができる。ブタ脳ＧＡＤを用いる ことにより、特に良好な結果が得られている。更に、ＧＡＤのＤＮＡ配列は既知 であり、これを用いてＧＡＤを遺伝子組換え的に生産することもできる。Rabin 等、上記、４欄、５１行ないし５欄、３２行には、ＧＡＤの両方のイソ形態を得 るための多数の供給源および技術が記載されており、その開示は出典明示により 本明細書の一部としている。 ＧＡＤ抗原の好ましい量“Ｚ”は、０.０１ないし１２.０fmol、より好ましく は０.０２５ないし７．５fmolであり、更に一層好ましいＧＡＤ抗原の量は、０. １ないし２.０fmolである。この“Ｚ”値は、実施例Ｖに記載したような実験に おける“Ｘ”値、および１０^-8Ｍまでである“Ｙ”値から決めた。 上記の方法は、下記実施例によって例示説明する。組換えＧＡＤ₆₅を、ビオチ ンで標識し、ｂＧＡＤを得る。次いで、このコンジュゲートを患者の血清試料と 共にインキュベートする。その後、プロテインＡに結合させたセファロースの懸 濁液を加え、インキュベーションを続けた。懸濁液をストレプトアビジンで被覆 しておいたマイクロタイターウェルに移す。インキュベーションして遊離ｂＧＡ Ｄに結合させた後、ウェルを洗浄し、ＧＡＤに対するマウスモノクローナル抗体 と共にインキュベートするが、この抗体は、西洋ワサビペルオキシダーゼ（“Ｈ ＲＰ”）などの標識にコンジュゲートさせているか、またはコンジュゲートさせ ていないかのいずれかである。非コンジュゲート抗体を使用する場合、ウェルを 再度洗浄し、次いで、標識化抗マウスＩgＧ抗体と共にインキュベートする。い ずれかの場合で、標識化抗体を加えた後、最後にウェルを洗浄し、更なるｓｐｓ 構成員と共にインキュベートする。例えば、標識がＨＲＰであるならば、その場 合は、最終インキュベーションは、過酸化水素およびテトラメチルベンジジンを 含有する溶液を含むことができ、インキュベーション後に発色を読み取る。 本発明のこの形式に従って実施されるアッセイでは、抗ＧＡＤ₆₅陰性であるこ とが知られている試料は、シグナルの最少限の抑制を示した。抗ＧＡＤ₆₅陽性で あることが知られている試料は、発色を抑制した。 本発明のこの実施態様は、ヒト疾患の検出または監視に使用するための抗体を 含有する疑いのある試料中の存在または量を測定するアッセイで例示説明する。 例えば、ＧＡＤ₆₅自己抗体用のアッセイは、ＩＤＤＭの検出に有用である。 その他の態様は、試料、および抗体群に結合する抗原を水性媒質中で合わせて 抗原：抗体複合体および遊離抗原からなる混合物を形成させ；その存在または量 が試料中の抗体の存在または量に相関する遊離抗原を検出する、ことからなる改 良アッセイを含む。一実施態様では、この改良は、抗原の量をＺとすると、Ｚは ＸないしｎＸの範囲内であって、ＺはＹより少なく、ｎは５ないし１０００、好 ましくは１０ないし１００であり、Ｘは試料中に抗体群が存在しない場合に確実 に検出され得る抗原の最少量であり、Ｙは試料中の抗体群の予想最大量である、 を使用することを含む。その他の実施態様では、改良は、複合体を結合するが抗 原を結合しない第１結合剤を添加し、その後、遊離抗原を結合するが抗原が複合 体の一部であるときは抗原を結合しない第２結合剤を添加することを含む。 本発明の方法に有用な抗体群は、モノクローナルまたはポリクローナルである ことができ、宿主の免疫処置および血清の収集などの、当業者にはよく知られた 技術により調製でき、そこから免疫グロブリンを、知られた技術（ポリクローナ ル）により、MilsteinおよびKohlerによりNature 256:495-7(1957)に記載のよう な連続ハイブリッド細胞系列の調製および分泌されたタンパク質の収集（モノク ローナル）により、または、少なくとも、天然抗体の特異的結合に必要であるア ミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列またはそれらの成熟化形態のクローニ ングおよび発現により、分離できる。抗体群は、完全な免疫グロブリンまたはそ れらのフラグメントを含むものであることができ、ＩgＡ、ＩgＤ、ＩgＥ、ＩgＧ １、ＩgＧ２a、ＩgＧ２b、およびＩgＧ３およびＩgＭなどの様々な種類およびア イソタイプのものがある。フラグメント、Ｆab、Ｆv、Ｆ(ａｂ')２およびＦabを 含むことができる。 本発明の方法を実施するためには適切な反応条件を選択する。以下に適切な条 件を述べるが、これは、特定の施用に選択される特定の試薬およびアッセイプロ トコールに合わせて、当業者により変更を受けるものである。例えば、本発明の 方法は、不均一系または均一系などの多種のアッセイに適用でき、使用されるそ の条件および試薬は、それに合わせて選択される。 試料は、好ましくは適切な媒質中で直接試験してもよく、または試料をアッセ イ媒質に添加する前に前処理してもよい。前処理によって、抗体分析物を１また はそれ以上のアッセイ試薬に対して一層容易に利用可能にすることができ、また は、望ましくない物質を除去することによりアッセイにおける干渉を低減するこ とによって一層容易に検出可能にすることができる。試料は、細胞の分離または 溶解：タンパク質の沈殿、加水分解、または変性；脂質の加水分解；その他、の ために前処理することもある。このような前処理には、これらに限定されないが 、遠心分離；有機溶媒、例えば、アルコール、好ましくはメタノールなどの約７ 以下の炭素原子を有するアルコールでの試料の処理；および洗剤での処理がある 。 アッセイされる抗体の濃度は、一般に約０ないし１０^-5Ｍ、普通は、約０から １０^-8Ｍの範囲である。アッセイに使用した、および下記キット中にパッケージ した様々な試薬の相対量は、本発明方法中に起こる必要がある反応を実質的に最 適化する試薬の濃度を提供し、更に、実施するアッセイの感度を実質的に最適化 するために広範囲に変えることができる。例えば、感度とアッセイ範囲との間の トレードオフ、特定の検出技術、および分析物の濃度などを考慮して、上記に説 明したように、使用する抗原の濃度を決定し、通常は、他の試薬の濃度も決定す る。更に、各試薬の最終濃度は、普通、対象の範囲にわたってアッセイ感度を最 適化するように経験的に決められる。非結合のまたは“遊離”の抗原は、測定さ れるそのものであるから、抗原濃度の変化は重要であり、それによって精確に測 定可能なシグナル差を提供すべきである。 本発明の方法の実施に当たり、好ましくは水性緩衝化媒質を穏やかなｐＨで採 用し、一般には、最適アッセイ感度を与えるようにする。水性媒質は、水単独で あってもよく、また、アルコールを含む、炭素原子１から６の、より普通には１ から４の酸素化有機溶媒などの共溶媒を含んでいてもよい。普通、共溶媒は、約 ７０重量％以下、より普通には、約３０重量％以下で存在する。 本発明のアッセイでは、媒質のｐＨは、普通、約５ないし１０の範囲、好まし くは約７ないし９の範囲である。ｐＨは、シグナル産生能力を最適化しながら、 有意なレベルのｓｂｐ構成員間結合を維持するように選択する。ある場合では、 これら２つの条件間の中間を取ることもある。 所望のｐＨを達成し、測定中、そのｐＨを維持するために様々な緩衝液を採用 できる。緩衝液の例には、ボレート、ホスフェート、カーボネート、トリス、バ ルビタール、および同等物がある。採用した特定の緩衝液が本発明にとって重要 なのではないが、個々のアッセイにおいて、１つの緩衝液が他のものよりも好ま しい場合がある。 この方法の実施には、穏やかな温度が採用され、普通、測定期間中、特に、速 度測定中、一定温度である。この温度は、実施している工程に合わせて変えるこ とができ、５から５０℃の範囲、普通は、約１５から４０℃の範囲の温度を用い る。インキュベーション温度は、通常、５から４５℃、より普通には１５から４ ０℃の範囲である。測定中の温度は、一般に、１０から５０℃、より普通には１ ５から４０℃の範囲である。 様々な試薬の添加順序は、定められているが、試薬を定時放出する様々な技術 を用いることにより、多くのプロトコールを工夫できる。このような方法を採用 しない場合は、普通、試料と抗原を第１結合剤と、前後してまたはほぼ同時に、 合わせるのが好ましい。第１結合剤が、非複合体形成免疫グロブリンに結合する ことなく抗原：抗体複合体を結合できる場合、これらの試薬の添加順序は重要で ない。第２結合剤の添加は、この試薬の定時放出手段を提供しないのならば、最 初の２つの添加の後である。抗原を結合する能力のあるその他の試薬を任意の時 点で添加することもできるが、好ましくは、第２結合剤の添加とほぼ同時かまた はその後に添加する。その他の試薬を添加するタイミングは、広範囲に変わり得 る。 所望により、１またはそれ以上のインキュベーション工程を各試薬の添加後に 含めてもよく、一般に、約３０秒から６時間後、より普通には約２分から１時間 後の範囲である。更に、必要に応じて、１またはそれ以上の洗浄工程をこのアッ セイに含ませることもできる。 イムノアッセイの最終工程は、試料中の抗体分析物の存在または量に相関する 、遊離抗原量を測定することである。遊離抗原の測定法は、多数あり、当分野で はよく知られている。例えば、抗原を検出可能な標識にコンジュゲートさせるこ と もでき、また、検出可能に標識した抗−抗原抗体と接触させてもよい。産生され たシグナルは、存在する抗原の量に相関し、これは、試料中の抗体群の量に反比 例する。 例示説明の目的で、下記アッセイプロトコールを利用できる。これらの例示説 明は、本発明の範囲を限定するものと解釈すべきではなく、試料中の抗体の存在 または量を測定するために本発明の方法が使用され得る、定量、半定量、および 訂正アッセイプロトコールを単に例示説明するものである。これらの方法で検出 されるシグナルを、既知の抗体濃度を有する標準または対照と比較する。 （Ａ）インシュリン自己抗体のアッセイでは、抗体を含有する疑いのある試料 を適切な媒質中でインシュリンと合わせる。アガロースに結合させた補体因子( “Ｃ１ｑ”)を加え、混合物をインキュベートする。分子量２,０００,０００の デキストランに結合させ、かつロダミンＢなどの消光剤で標識したモノクローナ ル抗インシュリン抗体を加える。インキュベーション後、アガロースを固定させ 、水性媒質をフルオレセインなどの蛍光剤で標識した第２の非競合性モノクロー ナル抗インシュリン抗体と合わせる。この場合、蛍光剤の消光する量は、存在す るインシュリン量に相関し、これは、試料中に存在するインシュリン自己抗体の 量に反比例する。 （Ｂ）抗ヘルペスウイルス抗体のアッセイでは、ヘルペス抗原（“Ａｇ_H”） をグルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ(“Ａｇ_H−Ｇ６ＰＤＨ”)に コンジュゲートさせる。抗体を含有する疑いのある試料を適切な媒質中でＡｇ_H −Ｇ６ＰＤＨと合わせる。ポリアクリルアミド粒子に結合させたリウマチ因子を 加え、インキュベートする。抗Ａｇ_H自己抗体で被覆した1/4"ポリスチレンボー ルをこの混合物に加える。適切にインキュベーション後、ボールを洗浄し、グル コース−６−ホスフェートおよびＮＡＤと接触させる。ＮＡＤＨの出現により産 生されたシグナルは、表面に結合したＡｇ_Hの量に比例し、試料中に存在する抗 Ａｇ_H抗体の量に反比例する。 便宜上、本発明に使用するための試薬を、抗体を含有する疑いのある試料中の 抗体を検出するアッセイ法に使用するためのキット中に提供することができる。 本発明の典型的なキットは、パッケージした組合せ物中に：(ｉ)抗体群を結合し て抗原：抗体複合体を形成する抗原、ただし、その抗原量をＺとすると、ＺはＸ ないしｎＸの範囲内であって、ＺはＹより少なく、ｎは５ないし１０００、好ま しくは１０ないし１００であり、Ｘは試料中に抗体群が存在しない場合に確実に 検出され得る抗原の最少量であり、Ｙは試料中の抗体群の予想最大量である、(i i)抗原が複合体の一部でないときに抗原に結合することなく、複合体に結合する 第１結合剤、および（iii）複合体が第１結合剤と結合しているとき複合体との 結合に相関して抗原を選択的に結合する第２結合剤、を含む。 好ましいキットは、ＧＡＤ自己抗体の検出に有用であり、ＧＡＤ抗原と、可溶 性ポリマーに結合している第１結合剤としての抗原：抗体複合体に対する受容体 、を含む。その他の好ましいキットは、インシュリン自己抗体の検出に有用であ り、インシュリンと、可溶性ポリマーに結合させている第１結合剤としての抗原 ：抗体複合体に対する受容体、を含む。 好適な環境下、キット中の１またはそれ以上の試薬を溶液状態、または乾燥粉 末として、普通は、凍結乾燥状態で提供でき、これは、賦形剤を含んでいて、溶 解させると、本発明のアッセイ法の実施に適した濃度を有する試薬溶液を与える ものである。主題発明の融通性を高めるために、試薬を、パッケージした組合せ 物中、同じかまたは別個の容器に入れることによって、試薬の比率がこの方法お よびアッセイに実質的に最適であるようにすることができる。試薬は、それぞれ 、別個の容器に入れてもよく、または、試薬の交差反応性および安定性によって も変わるが、様々な試薬を１またはそれ以上の容器に合わせることもできる。便 宜上、本発明に採用した試薬は、予め定めた量で提供できる。キットは、例えば 、パッケージ挿入物の形態で、試薬をどのように使用するか、および／または特 定のアッセイをどのように実施するかについての使用説明書も含み得る。 本発明を更に下記例示説明的な実施例により説明する。 略 語 ＡＥＴ ２−アミノエチルイソチオウロニウムブロミド ｂＧＡＤ₆₅ ビオチニル化ＧＡＤ ＢＳＡ ウシ血清アルブミン ＥＤＴＡ エチレンジアミンテトラ酢酸 ＥＬＩＳＡ Enzyme linked immunosorbent assay ＧＡＤ₆₅ ヒト組換えグルタミン酸デカルボキシラーゼ、 分子量65,300 ＨＲＰ 西洋ワサビペルオキシダーゼ ＩＤＤＭ インシュリン依存性真性糖尿病 ＭＡｂ モノクローナル抗体 ＰＢＳ ホスフェート緩衝化塩水 ＰＬＰ ピリドキサル−５'−ホスフェート ＲＩＡ ラジオイムノアッセイ ＲＴ 室温 ＳＡＶ ストレプトアビジン ＳＤＳ−ＰＡＧＥ ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル 電気泳動 ＴＣＥＰ トリス（カルボキシエチル）ホスフィン ＴＭＢ ３,３',５,５'−テトラメチルベンジジン 材料の調製 本明細書中の部およびパーセンテージは、特記しない限り重量によるものであ る。ストレプトアビジン被覆化プレートは、標準技術により作成した。ＨＲＰ標 識化抗マウス抗体は、マウスＩgＧ（γ鎖特異的）に対するヤギ親和性精製抗体 （Kiekegaard & Perry Laboratories）である。その他の化学品は全て、試薬級 のものであり、SigmaおよびFisher Chemicalなどの供給源から商業的に入手可能 である。特記しない限り、溶液は全て、Ｈ₂Ｏ中で調製し、反応は全て、周辺条 件下で実施した。 緩衝液組成 反応緩衝液の組成は、次の通りである：２０mＭトリス、ｐＨ７.４、１５０m ＭＮaＣl、０.５％トリトン（登録商標）Ｘ−１００、１０mＭベンズアミジン（ １５.７mg／１０ml）、ペファブロック（Pentapharm）２.４mg／１０ml、アプロ チニン（Pentapharm、２２９,５００ＫＩＵ／ml）５０μl／１０ml、およびペプ スタチンＡ（Sigma）０.２mg／１０ml。 Ａ．ヒト組換えＧＡＤ₆₅の発現および精製 組換えヒトＧＡＤ₆₅を発現するバクロウイルス細胞を発酵槽内で増殖させ、収 穫した。ガラスホモジナイザーを用いてペレットを溶解した。破壊後、細胞溶解 物を遠心分離し、洗浄し、洗浄したペレットを抽出して、膜結合ＧＡＤ₆₅を得た 。次いで、この膜抽出物をＱセファロースカラム上に載せ、ＫＣl勾配を用いて 溶出させた。酵素的に活性な画分をプールし、フェニルセファロースカラム上に 載せた。溶出は、ホスフェート逆勾配により行った。溶出した画分を酵素活性に ついてアッセイし、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで純度について試験した。タンパク 質染色により９５％近くの純度を有する画分をプールした。Centriprep−３０（ Amicon）を用いてプールを濃縮した。濃縮したＧＡＤ₆₅をグルセロール中５０％ にし、−７０℃で凍結させた。 １．ＧＡＤ₆₅のヨウ素化 ヨウ素化プロトコールは、市販のエンザイモビーズキット（BioRad）に基づき 、[¹²⁵Ｉ]ＧＡＤ₆₅を得た。キットと共に販売されている単一の反応バイアルの 内容物をまず、再水和した。この再水和したバイアルに、精製ＧＡＤ₆₅２μl（ １μg）、¹²⁵Ｉ ５μl（０.５mＣi）、１％β−Ｄ−グルコース２５μl、０.２ Ｍリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７.２ ５０μl、およびＨ₂Ｏ １８μl（総容量 １５０μl）を加え、続いてインキュベーションした。エンザイモビーズとの反 応後、バイアルの内容物をサイズ排除ゲルカラム上に直接載せ、ＰＢＳ、１mＭ ＡＥＴおよび１mＭＰＬＰを用いて２００μlの画分を溶出した。¹²⁵Ｉを含有す る画分を１μlずつカウントすることにより同定した。 アッセイに使用する前に、プールした正常ヒト血清を用いて、［¹²⁵Ｉ］ＧＡ Ｄ₆₅を予め吸着させた。[¹²⁵Ｉ]ＧＡＤ₆₅ ２００μlを反応緩衝液８０μl、８つ のＩＤＤＭ陰性対照血清のプール１００μl、およびＰＢＳ ２０μlと混合した 。 ４℃で一晩インキュベーション後、ＰＢＳ中プロテインＡ−セファロースの５０ ％懸濁液を加え、４℃で１時間インキュベートした。次いでこの懸濁液をマイク ロフュージし、上清を集め、ペレットをＰＢＳ ４００μlで洗浄し、２つの上清 をプールし、等分ずつ−７０℃で貯蔵した。 ２．ＧＡＤ₆₅のビオチニル化 精製ＧＡＤ₆₅、ＧＡＤ緩衝液中２８２μg／４５０μl、ｐＨ７.０を６Ｎ Ｎa ＯＨ１μlを用いてｐＨ８.０と８.２の間に調整した。ＧＡＤ緩衝液の組成は、 ２０molホスフェート緩衝液（ｐＨ６.８−７.０）、２０μＭ ＰＬＰ、１mＭ Ａ ＥＴ、１mＭ ＥＤＴＡ、０.１％トリトンＸ−１００、および１０％グリセロー ルであった。次いで、１０mＭＰＬＰ ４μlおよびＴＣＥＰ４１mg／ml溶液の５ μlを加えた。氷上でインキュベーション後、暗所でヨードアセチル−ＬＣ−ビ オチン（Pierce）５μlを加えることにより、４℃で３時間ビオチニル化を実施 した。未反応のビオチンを遠心分離により分離した。ビオチン：ＧＡＤ₆₅比率が 、およそ３ないし５mlビオチン／ＧＡＤ₆₅molであることを測定した。 Ｂ．マウス抗ＧＡＤ₆₅抗体群 マウスを、上記のように発現および精製させたＧＡＤ₆₅で免疫処置し、Milste inおよびKohler上記に記載のような標準操作法に従い、ＭＡｂを産した。 得られたＭＡｂを標準ＥＬＩＳＡ形式で試験し、最良のＭＡｂをＧＡＤ₆₅に対 する特異性に基づいて選択した。 ６つの抗ＧＡＤ ＭＡｂの混合物をＳＡＶ被覆化プレートに結合したｂＧＡＤ_{6 5} を検出するために、それぞれＰＢＳ足す０.２％アジ化ナトリウム中、ＭＡｂ １pmol／μlで初期アッセイに用いた。各ＭＡｂの最終濃度は、０.２pmol／１０ ０μl／ウェルであった。 後のアッセイでは、抗ＧＡＤ ＭＡｂを１つだけ利用し、これをＨＲＰで標識 した。そうすることでＨＲＰ標識化抗マウスＭＡｂの必要性を排除した。 Ｃ．プロテインＡ−セファロース懸濁液 プロテインＡ−セファロース（ＣＬ−４Ｂ、Sigma）をＰＢＳおよび０.１％ア ジド中で５０％懸濁液にした。 Ｄ．マイクロトラック（登録商標）プレート・ウォッシャーおよびリーダー マイクロタイタープレートウォッシャーおよびリーダーは、マイクロトラック （登録商標）ＥＩＡシステム（Syva Company）の構成要素である。使用した洗浄 溶液は、マイクロトラック・クラミジアＥＩＡ洗浄緩衝液：０.５５９g／mlクエ ン酸三ナトリウム、０.００２g／mlクエン酸、０.０１８２ml／mlトゥイーン（ 登録商標）２０、０.３１７５ml／mlグリセロール、ｐＨ６.５−６.９である。 各洗浄サイクルは、３００μl／ウェル×５に設定した。 Ｅ．ヒト血清試料 これらの実験に使用したヒト血清は、対照試料（ＧＡＤ₆₅に対する自己抗体な し）またはＩＤＤＭの患者由来のもの（ＧＡＤ₆₅に対する自己抗体が存在する） のいずれかであり、これらは、フロリダ大学のNoel Maclaren博士により提供さ れた。 実施例Ｉ ＧＡＤ₆₅に対するラジオイムノアッセイ ヒト血清に結合された［¹²⁵Ｉ］ＧＡＤ₆₅を測定するために、反応緩衝液中、 ヒト血清６μl、陰性ヒト血清を用いて予め吸着させた［¹²⁵Ｉ］ＧＡＤ₆₅１０μ l（およそ１５０,０００cpm）を総容量２５μlで含有するものを４℃で一晩イン キュベーションした。一晩インキュベーション後、５０％プロテインＡ−セファ ロース５０μlを加え、４℃で１時間静かに振盪させながらインキュベーション を続けた。 プロテインＡ−セファロースのインキュベーション後、懸濁液をＲＴで遠心分 離し、氷冷２０mＭトリス、ｐＨ７.４ ７５０μl、１５０mＭ ＮaＣl、０.５％ トリトンＸ−１００を用いて３回洗浄した。各洗液をガンマカウンターでカウン トし、最終洗浄後、ペレットをカウントした。 下表は、陰性血清または陽性血清の場合のペレットにおける３回の洗浄画分ま たは結合画分のそれぞれに見られた特有のカウントをまとめたものである： ＲＩＡは過剰の放射性標識材料を用いるので、最終的に結合画分において得られ た入力カウントは、非常に低いパーセンテージである。これを、結合した放射性 ＧＡＤ₆₅のパーセントとして下記に示す： 血清 結合カウント％ 陰性 １.１ 陽性 ５.７ ＲＩＡ形式は、高過剰の放射性標識材料を用いたことから、非結合材料の測定 を用いて試料中の抗体量を精確に測定するのはほとんど不可能である。例えば、 ［Ｉ¹²⁵］ＧＡＤ₆₅の５.７％のみが試料中の抗体に結合するに至るとすれば、そ の場合９４.３％が遊離のままであり、測定されなければならない。陰性試料に より産生されるシグナルの基準として１００％［Ｉ¹²⁵］ＧＡＤ₆₅を用いれば、 １００％のものにより産生されるシグナルと９４.３％のものによりされるされ るシグナルとの間の差異を測定する必要がある。このような小さいデルタ値を精 確かつ確実に測定するのは困難である。 ＧＡＤ₆₅が、開始時の合計と溶液に残った合計との差異が顕著な数であるほど 十分に上清液から消耗され得るならば、この形式を用いて、ＩＤＤＭ血清中の自 己抗体量を測定することができる。本発明は、標識化抗原の最少量を用い、標識 した材料の全てを上清から本質的に“消耗すること”により、これを達成するも のである。この消耗形式は、初期反応における高濃度の血清の使用を可能にする ものであり、また、ＲＩＡプロトコール同様、溶液状態での初期反応を可能にす るものである。抗体を検出するＥＬＩＳＡプロトコールとは異なり、ＧＡＤ₆₅の 検出は、５０％血清濃度で開始しても、非常に低いバックグラウンド値ですむ。 このように、本発明の消耗アッセイは、抗原と抗体との間の反応、およびそれ に続いて、抗体と複合体形成しなかった抗原の検出を伴うものである。そのため 、抗−抗原抗体を持たない対照健常血清では、反応混合物中に遊離抗原が残り、 こ れが後の測定においてより高いシグナルを示す。抗原に対する抗体を有する患者 由来の血清は、より低量の遊離抗原を残して、入力した抗原の一部または全てと 複合体を形成する。つづく測定では、これは、低シグナルを生じるであろう。従 って、試料中の抗−抗原抗体の量は、本発明の消耗アッセイにおけるＡ₄₅₀値と 反対比例すると予想された。結果として、本アッセイにおいて、Ａ₄₅₀値が幾つ かの正常対照血清の平均引く２または３標準偏差により定めたカットオフ値を下 回るとき、試料は“陽性”であると判断される。これは、対照平均ｃｐｍ＋２ま たは３ＳＤより高いｃｐｍ値を有する試料を“陽性”と判断する典型的なＲＩＡ とは反対である。これは、下記実施例において、最も良く説明されている。 実施例II ＧＡＤ₆₅のエンザイムイムノアッセイ（遠心分離を用いる） 本実施例は、本発明のアッセイ形式の総括的な能力を例示説明するものである 。ＧＡＤ抗原濃度の最適化は、後の実施例に例示説明する。 ヒト血清１２μlをｂＧＡＤ₆₅１０μl（アッセイ当たり０.２pmol）、５×反 応緩衝液１０μlおよびＨ₂Ｏ １８μlと混合して、最終容量５０μlとした。こ れを４℃で一晩インキュベートした。 プロテインＡ−セファロースの５０％懸濁液１００μlを加え、氷上で静かに 振盪しながら１時間インキュベートした。次いで、これをＲＴで遠心分離した。 （非結合ｂＧＡＤ₆₅を含有する）上清液１００μlをプロテインＡ−セファロ ースペレットから回収し、希釈し、予め洗浄したＳＡＶ被覆プレートに移した。 静かに撹拌させながらＲＴで１時間インキュベーション後、プレートをマイクロ トラックシステムで洗浄した。 マウス抗−ＧＡＤ₆₅ＭＡｂ１００μlを加え、３７℃で１時間インキュベート し、次いで、上記のように洗浄した。 ＨＲＰ−標識化抗マウス抗体１００μlを加え、３７℃で１時間インキュベー トし、次いで、上記のように洗浄した。ＴＭＢ基質を加え、ＲＴで３０分発色さ せた。１ＮＨ₂ＳＯ₄を用いて発色を止め、４５０nmで読み取った。 ９つの患者血清の中から７つをこの方法により、正しく診断した。これは、９ つの試料の中から２つのみを正しく判断した常用のＥＬＩＳＡ技術とは対照的で ある。 実施例III ＲＩＡでの比較 本発明のアッセイの分析能力を評価するために、ＲＩＡ法により予めアッセイ した試験血清を用いて比較を行った。主たる目的は、２つの方法から得られた結 果が、ＧＡＤ₆₅自己抗体力価の範囲を有する血清の性質、即ち、対照試料か患者 試料か、にかかわらず、相互関係にあるかどうかを測定することである。 アッセイプロトコールは、実施例IIに記載のものに下記の変更を加えたもので あった：血清（２４μl）、ｂＧＡＤ₆₅（１２fmolを含有する２０μl）、５×反 応緩衝液（２０μl）、および脱イオン水（３６μl）を４℃で一晩インキュベー トした。プロテインＡ−セファロース（５０％懸濁液の２００μl）を加え、更 に４℃で１時間インキュベートした。次いで、これをＲＴで２分遠心分離した。 上清（１８０μl）を注意深く集め、９０μlずつ２等分したものをそれぞれ、プ レート中の２つのＳＡＶ被覆化ウェルに加え、２重の値を得た。残りプロトコー ルは、実施例IIに記載の通りであった。 実施例IV 抗原濃度の最少値の評価 異なる濃度でＧＡＤ抗原の標準曲線を描き、本条件下で、曲線が、抗原約０. １pmolまで直線であること、および、１０fmol以下のレベルが容易に検出できる ことを測定した。初期アッセイには、検出され得る最少量をはるかに越える２pm olの抗原を利用した。それ故に、抗原濃度は、弱陽性血清試料を測定する能力の 改善を期待して徐々に低下させた。陰性血清、強陽性、および弱陽性血清（ＲＩ Ａにより判断した）を用い、２；０.２；０.１および０.０１pmolの抗原を用い てアッセイを繰り返した。ＩＤＤＭ試料中の弱陽性を検出する能力はＧＡＤ抗原 濃度を低下させることにより、改善されることが明らかであった。 実施例Ｖ 抗原濃度の最適化 ＧＡＤ₆₅自己抗体を含まない対照血清試料を利用した以外は、実施例IIと同様 のプロトコールを用いて、幾つかのアッセイを行った。読み取りは４５０nmで行 った。 ［ｂＧＡＤ₆₅］、fmol シグナル ０ ０.０２３±０.００３ ０.０７５ ０.０６４±０.００４ ０.１５ ０.１１８±０.００３ ０.２０ ０.２２４±０.００２ バックグラウンドシグナルのレベルを測定するためにｂＧＡＤ₆₅の０fmolでの 測定を行った。典型的には、試料中に抗体が存在しないときに確実に検出され得 る抗原の最少量は、バックグラウンドシグナルを越える少なくとも３標準偏差で あるべきである。この場合、試料中に抗体が存在しないときに確実に検出され得 るｂＧＡＤ₆₅の最少量は、０.０２３＋３（０.００３）または０.０３２のシグ ナルを産生したその濃度である。ある量の平方偏差（variance）を許容するため に、この数の２倍、即ち、０.０６４のシグナルを産生したＧＡＤ濃度を、ＧＡ Ｄ₆₅の最少検出可能量として設定した値として選択した。上記の表から理解され るように、０.０６４のシグナルは、０.０７５fmolの最少ｂＧＡＤ₆₅濃度に相当 する。別の最適化アッセイにより、特に良好に機能するのは１.５fmolであるこ とを確定し、この量を実施例VIに用いた。この実施例の記載と同様に、ＧＡＤ₆₅ の最少検出可能レベルを続いて研究した結果、ここに報告した０.０７５fmolよ りおよそ４倍低いＧＡＤ₆₅の最少検出可能レベルを与える、上記データの４倍の 向上が見られた。 実施例VI ＧＡＤ₆₅のエンザイムイムノアッセイ（遠心分離を用いない） ＢＳＡ緩衝液（１０mＭ ＫＰhos、ｐＨ７.０、１mＭ ＡＥＴ、１mＭ ＥＤＴＡ 、２０μＭ ＰＬＰ、０.１％トリトンＸ−１００、１０％グリセロール、および １mg／mlプロテアーゼなしのＢＳＡ）中、ヒト血清２５μlをｂＧＡＤ₆₅ １５μ l（アッセイ当たり１.５fmol）および５×反応緩衝液１０μlと混合して、最終 容量５０μ lにした。これをＲＴで２時間インキュベートした。 プロテインＡ−デキストラン（ＰＢＳ中ストックの１ないし２５希釈）５０μ lを加え、ＲＴで１時間インキュベートした。 上清液（非結合ｂＧＡＤ₆₅）８０μlを回収し、予め洗浄したＳＡＶ被覆化プ レートに移した。振盪させながらＲＴで１時間インキュベーション後、プレート をマイクロトラック・システムで洗浄した。 ＭＡb(６Ｇ１０)−ＨＲＰコンジュゲート（Syvaコンジュゲート希釈物中１： ３２０希釈）１００μlを加え、振盪させながらＲＴで１時間インキュベートし 、次いで、マイクロトラック・システムで洗浄した。 ＴＭＢ基質を加え、ＲＴで３０分間発色させた。１Ｎ Ｈ₂ＳＯ₄を用いて発色 を止め、４５０nmで読み取った。この方法の能力は、実施例IIのプロテインＡお よびセファロースを用いる方法で報告したものに匹敵した。 実施例VII 比較評価 多くのＧＡＤ₆₅イムノアッセイの盲検比較評価は、オーストラリア、ビクトリ アのRoyal Melbourne Hospitalにより集められたデータによる“Second Interna tional GAD Antibody Workshop”（199４）と題するレポートに表された。１０ １のブラインド対照とＩＤＤＭ血清を用いて４０のアッセイが評価された。各協 力者は無記名であったが、それらの各アッセイは、その形式（ＲＩＡ、ＥＬＩＳ Ａ、および酵素的免疫沈降）とＧＡＤの種類（ラット／ヒト／ブタおよび天然／ 組換え）によって同定した。本発明のアッセイ（実施例VIに記載）もまた、この 盲検での評価を受けた。 Royal Melbourne Hospitalは、上記の通り、そのアッセイを形式とＧＡＤ種に より同定しただけの協力者全てに対する結果を提供した。酵素的免疫沈降アッセ イは、能力が乏しく、ＥＬＩＳＡは、ある程度良好な能力であり、ＲＩＡが最も 優れた能力を示した。本発明のアッセイの結果は、ＥＬＩＳＡおよびＲＩＡの平 均結果と共に、下記に表す。 本発明のアッセイ法は、対照試料において、ＲＩＡおよびＥＬＩＳＡ双方より も低い偽陽性を与え、それぞれ１０.６％および１６.７％に比較して６.３％で あった。同様に、本発明は、他の自己免疫疾患を有する患者由来の試料において 偽陽性結果を与えなかった。ＲＩＡおよびＥＬＩＳＡは、それぞれ、３.８％お よび２３.７％という偽陽性示数を与えた。 本発明は、また、ＲＩＡおよびＥＬＩＳＡ双方よりも低い偽陰性を与え、ＩＤ ＤＭおよび前臨床ＩＤＤＭ患者試料のそれぞれ８２％および１００％が陽性であ ったことを示した。ＲＩＡは、試料の７６.２％および９７.１％が陽性であった ことを示しただけであり、ＥＬＩＳＡは、試料の３６.５％および８２.５％が陽 性であったことを示しただけであった。 本発明は、その特定の実施態様を参照して説明しているが、当業者には、本発 明の真の精神および範囲から逸脱することなく、様々な変化を為し得ること、お よび均等物で置き換え得ることが理解されるであろうし、また明らかであろう。 更に、特定の状況、材料、物質の組成、プロセス、プロセス工程または各段階を 本発明の目的、精神、および範囲に適合させるために多くの修飾がなされ得る。 このような全ての修飾は、添付の請求の範囲にあることを意図するものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ウルマン，エドウィン・エフ アメリカ合衆国94025カリフォルニア州 アサートン、セルビー・レイン135番

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ある抗原に対して特異的な抗体群を含有する疑いのある試料中の該抗体群の 存在または量を測定する方法であって、 （ａ）水性媒質中で、 （ｉ）該試料、 （ii）該抗体群を結合して抗原：抗体複合体を形成する抗原、ただし、該 媒質に加えた該抗原の量をＺとすると、ＺはＸないしｎＸの範囲内であって、Ｚ はＹより少なく、ｎは５ないし１０００であり、Ｘは試料中に該抗体群のどれも が存在しない場合に確実に検出され得る該抗原の最少量であり、Ｙは該試料中の 該抗体群の予想最大量である、および、 （iii）該複合体を結合するが、抗原が複合体の一部でない場合は該抗原 を結合しない第１結合剤、 を一緒にして混合物を形成させ、 （ｂ）該複合体が第１結合剤を結合する場合、該複合体との結合と相関して抗 原を選択的に結合する第２結合剤を該混合物に加え、さらに、 （ｃ）その存在また量が試料中の抗体群の存在または量と相関している、第２ 結合剤に結合した抗原を検出する、 各工程を含んでなる、方法。 ２．該第１結合剤が、免疫グロブリン類に対する抗体群、補体因子、Ｃ１ｑ、リ ウマチ因子、プロテインＧ、およびプロテインＡからなる群から選択される、請 求の範囲第１項記載の方法。 ３．該第１結合剤が懸濁可能な固相または可溶性ポリマーに結合している、請求 の範囲第２項記載の方法。 ４．該懸濁可能な固相が、ポリマー、セラミックおよびガラスからなる群から選 択される材料を含む粒子である、請求の範囲第３項記載の方法。 ５．該可溶性ポリマーが、２５０,０００以上の分子量を有するものである、請 求の範囲第３項記載の方法。 ６．該検出工程が、酵素活性、発光、または光吸収の検出を含む、請求の範囲第 １項記載の方法。 ７．該第２結合剤が、該抗原に対する受容体であり、支持体に結合しているか、 または支持体に結合する能力があるものである、請求の範囲第１項記載の方法。 ８．該抗原が、シグナル産生系の構成員に結合しているか、または結合する能力 があるものである、請求の範囲第７項記載の方法。 ９．該第２結合剤が該抗原を結合する第１受容体であり、該抗原を結合する第２ 受容体と該混合物を接触させることを更に含んでなり、そしてこれらの受容体の 少なくとも１つは、直接的または間接的に標識に結合しているものである、請求 の範囲第１項記載の方法。 10．該抗原がリガンドに結合しており、そして該第２結合剤が、支持体に結合し た該リガンドに対する受容体である、請求の範囲第１項記載の方法。 11．更に、該支持体を該混合物から分離し、そして該支持体を該抗原に対する受 容体と接触させることを含んでなる、請求の範囲第１０項記載の方法。 12．該抗体群が、グルタミン酸デカルボキシラーゼまたはインシュリンに対する 自己抗体群である、請求の範囲第１項記載の方法。 13．ある抗原に対する抗体群を含有する疑いのある試料中の該抗体群の存在また は量を測定する方法であって、 （ａ）水性媒質中で、 （ｉ）該試料、 （ii）該抗体群を結合して抗原：抗体複合体を形成する抗原、ただし、該 媒質に加えた該抗原の量をＺとすると、ＺはＸないしｎＸの範囲内であって、Ｚ はＹより少なく、ｎは５ないし１０００であり、Ｘは試料中に該抗体群のどれも が存在しない場合に確実に検出され得る該抗原の最少量であり、Ｙは該試料中の 該抗体群の予想最大量である、および、 （iii）該複合体を結合するが、抗原が複合体の一部でない場合は該抗原 を結合しない第１結合剤、 を一緒にし、 （ｂ）該媒質を、固相に結合している第２結合剤、ただし、該第２結合剤は該 抗原を結合して固相結合抗原を形成するが、該抗原：抗体複合体は結合しない受 容体である、と接触させ、 （ｃ）その存在または量が該試料中の該抗体の存在または量と相関している、 該固相に結合した該抗原を検出する、 各工程を含んでなる、方法。 14．該第１結合剤が、免疫グロブリン類に対する抗体群、補体因子、Ｃ１ｑ、リ ウマチ因子、プロテインＧ、およびプロテインＡからなる群から選択されるもの である、請求の範囲第１３項記載の方法。 15．該第１結合剤が、懸濁可能な固相または可溶性ポリマーに結合している、請 求の範囲第１４項記載の方法。 16．該検出工程が、該固相をシグナル産生系構成員の１またはそれ以上と接触さ せ、その存在または量が、該試料中の該抗体の存在または量と相関している、該 シグナル産生系構成員により産生させたシグナルを測定する、ことを含んでなる 、請求の範囲第１３項記載の 17．該シグナル産生系構成員の少なくとも１つが、蛍光剤、酵素、化学発光剤、 光増感剤、および懸濁可能な粒子からなる群から選択される、請求の範囲第１６ 項記載の方法。 18．抗体群を含有する疑いのある試料中の該抗体群の存在または量を測定する方 法であって、 （ａ）水性媒質中で、 （ｉ）該試料、 （ii）該抗体群を結合して抗原：抗体複合体を形成する抗原、ただし、該 媒質に加えた該抗原の量をＺとすると、ＺはＸないしｎＸの範囲内であって、Ｚ はＹより少なく、ｎは５ないし１０００であり、Ｘは試料中に該抗体群のどれも が存在しない場合に確実に検出され得る該抗原の最少量であり、Ｙは該試料中の 該抗体群の予想最大量である、および、 （iii）該複合体を結合するが、抗原が複合体の一部でない場合は該抗原 を結合しない第１結合剤、 を一緒にし、 （ｂ）該媒質に、該抗原を結合する２種の受容体を含む第２結合剤、ただし、 これらの受容体の少なくとも１つは、該複合体が該結合剤を結合する場合は該複 合体に有効に結合できないものである、を加え、さらに、 （ｃ）それらの受容体が該抗原を結合する場合に、形成された複合体を検出す る、 各工程を含んでなる、方法。 19．該第１結合剤が、免疫グロブリン類に対する抗体群、補体因子、Ｃ１ｑ、リ ウマチ因子、プロテインＧ、およびプロテインＡからなる群から選択される、請 求の範囲第１８項記載の方法。 20．該第１結合剤が、懸濁可能な固相または可溶性ポリマーに結合している、請 求の範囲第１９項記載の方法。 21．該検出工程が、発光または光吸収の検出を含む、請求の範囲第１８項記載の 方法。 22．該受容体の少なくとも１つが、蛍光剤、化学発光剤、光増感剤からなる群か ら選択される検出可能な標識に結合しているものである、請求の範囲第21項記載 の方法。 23．グルタミン酸デカルボキシラーゼ自己抗体群を含有する疑いのある試料中の 該自己抗体群の存在または量を測定する方法であって、 （ａ）水性媒質中で、 （ｉ）該試料、 （ii）該自己抗体群を結合して、抗原：自己抗体複合体を形成するグルタ ミン酸デカルボキシラーゼ抗原、ただし、該媒質に加えた該抗原の量をＺとする と、ＺはＸないしｎＸの範囲内であって、ＺはＹより少なく、ｎは５ないし１０ ００であり、Ｘは試料中に該抗体群のどれもが存在しない場合に確実に検出され 得る該抗原の最少量であり、Ｙは該試料中の該抗体群の予想最大量である、およ び、 （iii）該複合体を結合する第１結合剤、ただし、該第１結合剤は、該自 己 抗体群に対する受容体であり、懸濁可能な固相および可溶性ポリマーからなる群 から選択される材料に結合している、 を一緒にし、 （ｂ）該媒質に、該複合体を該媒質から分離しない場合、該複合体との結合と 相関して該抗原を選択的に結合する第２結合剤を加え、さらに、 （ｃ）その結合が試料中の該自己抗体群の存在または量と相関している、該抗 原に対する該第２結合剤の結合を検出する、 各工程を含んでなる、方法。 24．該第１結合剤が、免疫グロブリン類に対する抗体群、補体因子、Ｃ１ｑ、リ ウマチ因子、プロテインＧ、およびプロテインＡからなる群から選択される、請 求の範囲第２３項記載の方法。 25．該第１結合剤がプロテインＡであり、該可溶性ポリマーがセファロースおよ びデキストランからなる群から選択される、請求の範囲第２４項記載の方法。 26．該検出工程が、酵素活性、発光または光吸収の検出を含む、請求の範囲第２ ３項記載の方法。 27．該第２結合剤が、該抗原に対する受容体であり、支持体に結合しているか、 または支持体に結合する能力がある、請求の範囲第２３項記載の方法。 28．該抗原がシグナル産生系の構成員に結合しているか、または結合する能力が ある、請求の範囲第２７項記載の方法。 29．該第２結合剤が、該抗原に対する受容体であり、さらに該媒質を、該抗原を 結合する第２受容体と接触させ、それらの受容体の少なくとも１つがシグナル産 生系の構成員に結合するようにすることを含んでなる、請求の範囲第２３項記載 の方法。 30．該抗原がリガンドに結合しており、該第２結合剤が該支持体に結合した該リ ガンドに対する受容体である、請求の範囲第２３項記載の方法。 31．更に、該媒質から該支持体を分離し、該支持体を、シグナル産生系の構成員 に結合した該抗原に対する第２受容体と接触させることを含んでなる、請求の範 囲第３０項記載の方法。 32．該媒質に添加する該抗原の量が０.０１ないし１２.０fmolである、請求の範 囲第２３項記載の方法。 33．該媒質に添加する該抗原の量が０.０２５ないし７.５fmolである、請求の範 囲第３２項記載の方法。 34．該媒質に添加する該抗原の量が０.１ないし２.０fmolである、請求の範囲第 ３３項記載の方法。 35．ヒト疾患の検出または監視に使用するための、抗体群を含有する疑いのある 試料中の該抗体群の存在または量を測定するアッセイであって、水性媒質中で該 試料と、該抗体群を結合する抗原とを合わせて抗原：抗体複合体と遊離抗原とを 含む混合物を形成させ、そして、その存在または量が試料中の該抗体群の存在ま たは量と相関するものである該遊離抗原を検出する、各工程を含んでなるアッセ イにおいて、Ｚなる量の抗原を使用する改良、ただし、ＺはＸないしｎＸの範囲 内であって、ＺはＹより少なく、ｎは５ないし１０００であり、Ｘは試料中に抗 体群が存在しない場合に確実に検出され得る抗原の最少量であり、Ｙは試料中の 抗体群の予想最大量である、を含んでなるアッセイ。 36．ヒト疾患の検出または監視に使用するための、抗体群を含有する疑いのある 試料中の該抗体の存在または量を測定するアッセイであって、水性媒質中で該試 料と、該抗体を結合する抗原とを合わせて抗原：抗体複合体と遊離抗原とを含む 混合物を形成させ、そして、その存在または量が試料中の該抗体群の存在または 量と相関するものである該遊離抗原を検出する、各工程を含んでなるアッセイに おいて、該複合体を結合するが該抗原は結合しない第１結合剤を添加し、次いで 、該遊離抗原を結合するが、それが該複合体の一部でない場合は抗原を結合しな い第２結合剤を添加する改良を含んでなる、アッセイ。 37．パッケージした組合せ物中に、 （ａ）該抗体群を結合して抗原：抗体複合体を形成するする抗原、ただし、該 抗原の量をＺとすると、ＺはＸないしｎＸの範囲内であって、ＺはＹより少なく 、ｎは５ないし１０００であり、Ｘは試料中に抗体群が存在しない場合に確実に 検出され得る該抗原の最少量であり、Ｙは該試料中の該抗体群の予想最大量であ る、 （ｂ）該抗原が該複合体の一部でない場合は該抗原を結合するのことのない、 該複合体を結合する第１結合剤、および、 （ｃ）該複合体が該第１結合剤と結合する場合には該複合体との結合と相関し て該抗原を選択的に結合する第２結合剤、 を含んでなる、抗体群検出法に使用するためのキット。 38．該抗体群がグルタミン酸デカルボキシラーゼ自己抗体群であり、該抗原がグ ルタミン酸デカルボキシラーゼであり、さらに、該結合剤が該複合体に対する受 容体であって、可溶性ポリマーに結合したものである、請求の範囲第３７項記載 のキット。 39．該抗体群がインシュリン自己抗体群であり、該抗原がインシュリンであり、 さらに、該結合剤が該複合体に対する受容体であり、可溶性ポリマーに結合した ものである、請求の範囲第３７項記載のキット