JPH02501410A - 二座共役体及びその使用方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 二速共役体及びその使用方法 この出願と同時にチャン　ニス　オー及びジェームス　シー　ステーンベルグの 名前で出願された「王座共役体及びその使用方法ｊとの名称の同時係属出願第　 号をここ １、症罠致立弦１ 免疫化学的又はその他の形式の特異結合反応の測定方法は近年医学試験の分野に おいて広く受け入れられるようになってきた。一般的に言えば、免疫化学反応に は少なくとも一つの抗原と少なくとも一つの抗体の間の反応が含まれる。抗原− は通常動物−又はヒトの体内へ取り入れられた時免疫応答、すなわち、抗体生成 を誘発することができるタンパク質又は炭水化物などの物質である。免疫応答の 結果として生成する抗体は本質的に二価であり、通常ｒＹＪとして描写され、ｒ ＹＪの各々の腕（アーム）は抗体の生成を誘発した抗原と結合することができる 。患者の試験試料中に特殊な抗原又は抗体が存在することはある病状又は肉体的 な状態、例えば妊娠を示す。

免疫化学反応は特異結合反応の一形式である。

抗体のフラグメント（ｆｒａｇｍｅｎｔ）はしばしば免疫検定においてそのまま の抗体に添加して使用されるか又はそれらの代りに使用される、一般に抗体のフ ラグメントは異なった３種のタイプがある。フラグメントの第１のタイプはＦａ ｂ又はＦ　（ａｂ）として示されるが、これは通常酵素パパインによる消化によ ってそのままの抗体から直接開裂された抗体の１本の腕である。各Ｆａｂフラグ メントは一価であり、その分子量はそのままの抗体が約１５０．０００ダルトン であるのに対し約ｓｏ、ｏｏｏダルトンである。フラグメントの第２のタイプは Ｆ（ａｂ’）ｔとして示され、これはなお互いに連結した抗体の両方の腕からな っているが尾部はペプシン消化によって除去されて存在しない、二価のＦ（ａｂ ’）＊フラグメントは約１００，０００ダルトンの分子量を有しており、さらに ２個の一価Ｆａｂ　’フラグメント（抗体フラグメントの第３のタイプ）に開裂 されることができるが、それはまたそれぞれＦ（ａｂ’）として示され約５０， ０００ダルトンの分子量を有している。

抗体の腕が結合する抗原の部位はエピトープ（抗体決定基）と呼ばれる。大部分 の抗原は多重ピトープ性ズあり、抗１体に対する多重の、かつしばしば繰り返し の結合部位を有している。免疫検定において、ほかに免疫複合体として知られる 大きさの異なった大きな抗体−抗原複合体の形成を可能ならしめるのは抗原の多 エピトープ性及びＦ（ａｂ”）ｔを含めた抗体の二価性である。

この特徴の利点を用いた特殊な形式の免疫検定は三成分免疫複合体が形成される サンドイッチ免疫検定である。最も一般的な形式のサンドイッチ免疫検定では通 常固体の支持体に結合させた第１の不溶化抗体及び第２の標識抗体を用いる。各 抗体は関心とする抗原（すなわち、測定すべき被検出体（ａｎａｌｙｔｅ）　） に対して特異的であり、抗原上の異ったエピトープと結合する。好ましくは第１ の抗体は第２の抗体が結合するエピトープから離れたエピトープと結合する。不 溶性の抗体：抗原：標識抗体の三成分複合体は関心とする抗原が第１及び第２の 抗体と接触した場所で形成される。各抗体はただ１個の抗原と結合することが要 求されるから、抗体の３タイプのフラグメント全てがこの種の方法において使用 することができよう、関心とする抗原の存否が固体支持体上の標識抗体の存否に よって示される０通常、反応の不溶解比相は結合又は遊離の標識抗体のどちらか を定量するため液相から分離されねばならない、このような反応は分離段階が必 要とされるので不均質タイプの反応と称される。

ネフェロ分析及びタービジティ分析は例えば抗体及び抗原の大凝集体の形成を必 要とする。各抗体は２種の異った抗原分子と結合しなければならないから一価の Ｆａｂ及びＦａｂ　’フラグメントは一般的にこの方法には有効ではない、大Ｕ 体は溶液の光散乱に変化をもたらし、ネフェロ分析及びタービジティ分析の方法 によって測定することができる。これらの方法は形成された複合体を検知するの に酵素、放射性同位元素、蛍光性又は化学発光性化合物のような従来の標識を必 要としない、むしろネフエロ分析法及びタービジティ分析法は直接複合体の量を 測定する０分離段階を必要としないからネフェロ分析及びタービジ分析は均質免 疫検定と称される。

抗原は多重エピトープ性であり、抗体は二価であるので存在する抗原及び／又は 抗体の量に応じて光を散乱させるのに十分大きい抗原：抗体複合体の形成を可能 にする０通常、患者の血液、血清、脳を髄液（ＣＳＦ）又は尿試料などから得ら れる限定された量の抗原とともに過剰量の抗体が使用される。このような場合、 試料中に存在する抗原の量は形成される抗原：抗体凝集体の量及び大きさを決定 する上での制限因子となるであろう。

タービジティ分析においては粒子又は凝集体の懸濁液を通過する光の減少程度を 測定する。その減少は凝集体による光の反射、散乱及び吸収により生じる。ネフ エロ分析で測定されるのは光の直接的な通路でない場所に置かれた検知器に入る 散乱光又は反射光である。タービジティ分析及びネフエロ分析においてはともに 光散乱の変化率（レート）はまた存在する抗原の量の指示値として測定される。

ネフェロ分析法は初期段階における抗原：抗体反応を複合体が溶液から免疫沈殿 物として分離する前に光を散乱させることができるものとして成長してい（速度 を検知することにより監視する簡便な方法となってきた。これら複合体の生成は 究極的−には「散乱センター」として機能するのに十分な大きさとなる凝集体が 作られることに始まる。ステーンベルグ　ジェー　シー「免疫沈殿反応による特 異タンパク質測定用速度ネフエロ分析」クリニカル・ケミスト丈二呈３：８　１ ４５６−１４６４　（１９７７）、散乱センターの形成は水の多（の部分を排除 することによってタンパク質−タンパク質の相互作用の確率を高めるデキストラ ン又はポリエチレングリコールのような親水性非イオン重合体の使用により促進 することができる。免疫ネフェロ分析検定におけるポリマーの使用はまた感度な 高め抗血清消費を少なくするという利点がある。

２、ハブテン　ネフェロ　、 ハブテンは免疫検定において独特の問題を有している。ハブテンは比較的小さい 一価の分子であり、時には不完全又はフラグメント化抗原とみなされる。ハブテ ンの共通の分類は薬剤である。例えば、テオフィリンはこのハブテンのサブクラ ス（ｓｕｂｃｌａｓｓ）である。

ハブテンはそれ自身ではヒト又は動物の体内で免疫応答を誘発することはできな いが、これはハブテンが一般的に小さすぎて体内の免疫系によって認知されない からである。しかしながら、タンパク質のような担体と結合した時、ハブテン： 担体タンパク質共役体は抗体生成を誘発するのに十分大きい抗原として作用する 。この方法でハブテンに対抗した抗体を作ることができる。しかし、小さいハブ テン分子は比較的大きい抗原と異なりそれ自身は多重エピトープ性ではない、こ のためハブテンはハブテンに対抗して作られた抗体で大きい複合体ないし凝集体 を形成することはできない。

従って、治療医薬監視用などのネフエーロ分析又は、タービジティ分析でハブテ ン検定を遂行するためハブテンが複合体形成阻害剤として作用するネフェロ分析 阻害免疫検定法（ＮＩＩＡ）が開発された。伝統的なＮＩ　ＩＡにおいて「顕色 剤抗原Ｊ　（ｄｅｖｅｌｏｐｅｒ　ａｎｔｉｇｅｎ）として知られる第２の共役 体が検知可能な光散乱を生じさせるのに十分な大きさの複合体を顕色するため用 いられる。顕色剤抗原はハブテン分子の多重性部に共役した通常タンパク質であ る第２担体から形成きれる。このようにして顕色剤抗原は１個以上の抗体分子と ともに凝集して究極的に光散乱センターとなることができる「多価ハブテン」と して作用する。第２担体タンパク質は時々「標識」と呼ばれる・患者の試験試料 中に存在する一価の遊離ハブテンは抗体分子の腕の一方又は両方に結合すること によって顕色剤抗原：抗体複合体形成量を阻害し、そのため複合体形成が減少し 、光散乱量が低下する。阻害免疫検定の本質上、光散乱において検知された増加 量及び増加速度はともに患者の試料中に存在するハブテンの量に反比例する。

タービジティ分析及びネフェロ分析阻害免疫検定の従来技術においていくつかの 問題点が生じていた。その一つの問題点は顕色剤抗原試薬に関連している。伝統 的な顕色剤抗原は一般に不安定で特殊な貯蔵条件を特徴とする特殊な貯蔵条件の 必要性は顕色剤抗原の担体タンパク質が天然のタンパク質系物質であり、貯蔵中 周様製造中にも比較的迅速に分解するという事実から生じている。室温において 典型的な顕色剤抗原は約８時間の寿命しか期待できない、冷凍温度においてさえ も大部分の顕色剤抗原は約６か月の貯蔵寿命しか示さない、このことは製造及び 配送の間月に太きくｍ与し、この種製品のコストを高める。さらに、顕色剤抗原 用担体タンパク質が天然資源から作られるものであるためこれらタンパク質の品 質に相当の変動がある。伝統的な顕色剤抗原試薬は均一な反応性を確保するため 注意深く調製し、精製し、特性化しなければならない、特性化工程は従来技術の 顕色剤抗原の製造に関し最も経費のかかるものである。

従来技術のＮＩＩＡ法はサンドイッチ免疫検定のような他の形式の免疫検定に比 較して制限された感度しか有していない、この感度制限は第一に血清試料の他の 成分によって生じる散乱の結果である。この理由のため、試験試料はＮＩ　ＩＡ の反応媒質に添加する前に相当希釈されねばならず、それによって反応媒質中の 被検出体の濃度が希釈される。サンドイッチ免疫検定のような他の形式の免疫検 定においては、典型的に約１００−２００μρの試料が反応媒質へ添加される。

これと対象的に普通的１−３μβの試料のみがＮＩ　ＩＡ用反応媒質中へ注入さ れる。感度改善のために提案された方法として米国特許第４．６０４．３６５号 に開示された顕色剤抗原に対するハブテン：担体の比を最適化することがある。

高い及び低いハブテン：担体比は中間の比において感度改善が観察されるのに対 し中程度の感度となることが報告されている。しかしながら、この方法は時間が かかり、ＮＩＩＡ感度の顕著な上昇はもたらさない。

従来技術のＮＩＩＡ法において遭遇するもう一つの問題には「非生産結合ｊとし て知られる現象がある。非生産結合は、例えば、同一抗原の２本の結合腕が同一 顕色剤抗原９２個のへステン部分と結合する場合である。このような例の場合的 の顕色剤抗原と結合する抗体上の遊離の腕がなくなるから他の顕色剤抗原との架 橋結合が存在しな（なる、その結果高価な抗体及び顕色剤抗原試薬が十分使用さ れないことになる。

均一タービジティ分析及びネフェロ分析阻害免疫検定法は容易かつ簡便なもので あるから、−貫した特性を有するように容易に製造することができ、室温で長い 貯蔵寿命を示す安定な顕色剤抗原を入手することは有利である。また、ＮＩＩＡ の感度を改善し、非生産結合の発生を減少させることも有利であろう。

３．７来　′・の二″′″″鼾共′体 従来技術には数種の低分子二官能共役体（ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ｃｏｎｊ ｕｇａｔｅ）が存在する。ここで「低分子二官能共役体」の意味することはスペ ーサー基（ｓｐａｃｅｒ　ｍｏｉｅｔｙ）を通じて架橋している２個の低分子を 有する共役体である。スペーサー基はた°だ１つの化学結合（例えば、スペーサ ーに１つの原子もない）からなるような非常に小さいものであってもよい、一般 に、これらの分子の大きさは約７．０００ダルトン以下である０両方の分子は低 分子配位子として作用し、それ自体がおのおの低分子に対し特異結合親和性を有 する物質、すなわち、それの特異結合パートナ−と相互作用することができる。

この定義において１個以上の大分子を有する共役体及び／又は特異結合パートナ −を持たない１個以上の化学基を有する共役体は含まれない０例えば、サンドイ ンチ免疫検定における典型的な酵素標識抗体は二つの理由、すなわち、抗体部分 が一般に約ｉｓｏ、ｏｏｏダルトンを越える大きさ９巨大分子−であること及び 酵素基が基質上に作用するけれども一般にその基質に対する特異結合パートナ− であると考えられていないことの理由により含まれない、また、２個の低分子配 位子というよりも２個の化学的反応基を共役体の各末端に１個ずつ有するヘテロ ニ官能架橋剤も含まれない。

従来技術に存在する低分子二官能共役体は２種類ある。−その第一の種類の共役 体はホモニ官能共役体として知られており、共役体の各末端に同一の化学基を有 している。ホモニ官能共役体は一般におのおのの化学基と相互作用する同一の特 異結合パートナ−と結合するように設計されている。特異結合パートナ−が多価 であれば巨大な凝集体が形成されよう。

例えば、酵素の沈殿剤としてＢ１５−ＮＡＤホモニ官能共役体が提案されている 。ラールソン　ビー、モスバック　ケー「酵素の親す−基で分離されている２個 のＮＡＤからなるＢ　ｉ　５−ＮＡＤ共役体は乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）をそれ ぞれのＢ１５−ＮＡＤ末端でＬＤＨの大分子と特異結合することによって溶液か ら沈殿させることができる。ＬＤＨの大分子のそれぞれはＮＡＤに対する多数の 結合部位を有しているからネフエロ分析で形成されるのと同等の大凝集体が得ら れる。これらの大凝集体は酵素を伴って溶液から沈殿析出する。スペーサー基を 変えたＢ１５−ヌクレオチドの同様な使用も提案されている。

従来技術において応用されているその一他のホモニ官能共役体の例はアビジンの 構造試験に使用されているＢ１５−ビオチン共役体である。グリーン　エヌ　エ ム、コニズニイ　エル、トムスイージェー、バレンチン　アール　シー「アビジ ン中のサブユニットの配列決定における三官能ビオチン化合物の使用」バイオケ ミストリー１２５．７８１−７９１　（１９７１）、Ｂ１５−ビオチン共役体の ２個のビオチン基が約１．８人のスペーサー基で接合された場合、強力な複合体 ないし高分子が多価巨大分子アビジンとの間で形成された。

従来技術の低分子二宮能共役体の第二の種類はへテロニ官能共役体である。ホ、 モニ官能共役体と対象的にヘテロニ官能共役体は共役体の各末端で異なった化学 基を有している。これらの各化学基は異なった特異結合パートナ−と相互作用す ることができる。これら従来技術のへテロニ官能共役体は特異結合パートナ−の 化学基との結合が対応する特異結合パートナ−が同時に他の化学基と結合するの を妨害又は除外する場合のモジニレ−ターとして専ら使用されてきた。ヘテロニ 官能共役体の両方の末端での同時結合は、ホモニ官能共役体が上記の様に使用さ れるところで所望の同時結合を行うために必要とされるのよりも短いスペーサー 基を使用することによって一般に生じる立体障害によって阻害される。換言すれ ば巨大分子特異結合パートナ−の共役体のモジュレータ−基との結合が特異結合 パートナ−の信号発生原因となる化学基との結合を立体的に阻害する。

従来技術のへテロニ官能共役体は一般的にその共役体の化学基の一つとして関心 とする低分子配位子、通ヌ被検出体−を用いる。この化学基はある所定量の被検 出体の特異結合パートナ−に対し試料からのようなフリーの被検出体と競合する ことができる。ヘテロニ官能共役体の他の化学基は酵素モジュレータ−又は酵素 の補欠分子団又は他の補因子のような「代理（ｓｕｒｒｏｇａｔｅ）　Ｊ標識で ある０代理標識は指示標識、通常は酵素の活性をモジュレート（ｍｏｄｕｌａｔ ｅ）する、この種の従来技術へテロニ官能共役体は酵素の活性度が直接抗原：酵 素反応によって影響されるから一般的に均質酵素免疫検定用のものである。遊離 酵素に起因する活性度に対する結合酵素に起因する酵素活性度の量を測定するに は均質酵素免疫検定の場合同様分離段階は必要でない。

酵素モジニレート免疫検定は低分子配位子：酵素モジュレータ−へテロニ官能共 役体の指示酵素の活性度に影響する能力に基くものである０例えば、大型の代理 標識つき共役体も開示している米国特許第４，１３４，７９２号参照、この例に おいては配位子基と酵素モジュレータ−基との間のスペーサー基は比較的短く、 好ましくはその長さは炭素原子数又はヘテロ原子数で１〜１０、すなわち、約１ ．３〜１４．０人である。

低分子配位子：酵素モジュレータ−へテロニ官能共役体は所定量の抗体に対し試 料からの配位子と競走する。もし低分子配位子：酵素モジニレ−ターへテロニ官 能共役体が合体の配位子基を通じ抗体と結合していれば、酵素モジュレータ−は 指示酵素の活性度に作用することはできない。指示酵素の酵素活性度を増大又は 減少させるモジュレータ−を使用することができ、酵素活性度を減少させるモジ ュレータ−１すなわち、酵素阻害剤がゑも一般的、に使用される。

阻害モジュレータ−を用いる検定では観察される酵素活性度は被検出体の濃度に 逆比例する。

同様形式の均質酵素免疫検定は低分子配位子：酵素モジュレータ−へテロニ官能 共役体の使用に基いている。広義では、酵素補因子は陽性酵素モジュレータ−１ すなわち、酵素活性度を増大させるモジュレータ−として作動する。一般に酵素 は２つのグループ、すなわち、（１）酵素的活性が全くその酵素のタンパク質の 性質によるもの、（２）最適酵素活性度が補因子と呼ばれる熱安定性の非タンパ ク質構造によるものに分けられる。この第２のグループの酵素を用いる免疫検定 は低分子配位子：酵素モジニレ−ターへテロニ官能共役体の使用を通じてそれ自 身をモジュレートするものである。

補因子の本質は簡単な無機イオンからより複雑な有機物質まで変化するが、その 多くはビオチン及びフラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）のようなビタミ ン誘導体である。有機補因子はしばしば補酵素と呼ばれる。成る場合、典型的に は補欠分子団（ｐｒｏｓｔｈｅｔｉｃｇｒｏｕｐ）を用いる場合、補因子は親酵 素（個別的にはアポ酵素として知られる）のタンパク質基と通常は共有結合によ り固（結合している。古典的な酵素学では完全な酵素的活性酵素：補因子複合体 はホロ酵素と呼ばれる。

ＦＡＤ、フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）又はヘムなどの成る種の補因子の 残基は、例えば、低分子配位子：酵素補欠分子団へテロニ官能共役体に用いる特 に良好な酵素補欠分子団となる。例えば、大型の代理標識つき共役体も開示し１ いる米国一特許第４，２３８．５６５号参照、この例においては配位子基と酵素 補欠分子団基との間のスペーサー基の長さは炭素原子数１４以下で、より一般的 には炭素原子数１〜６又はヘテロ原子数で０〜５、すなわち、約１．３〜１４． ０人である。

米国特許第４，２３８，５６５号によれば、配位子：補欠分子団へテロニ官能共 役体（例えば配位子：　ＦＡＤ）は所定量の抗体に対し試料からの配位子と競争 する。もし配位子：　ＦＡＤ共役体が抗体によって結合していれば、アポ酵素と 結合して酵素的に活性なホロ酵素を形成することはもはやできない、観察される 酵素活性度は試験試料中に存在する被検８体の濃度に直接関連する。

このヘテロニ官能共役体を用いるモジュレータ−の一つの例外はカラムクロマト グラフィー精製の分野である。その物質を含有する溶液をクロマトグラフィーカ ラムの中を２方のうち１方を通過させることによって物質を精製することができ る。精製の一つの方法ではカラムは溶液の特定の不純物と特異結合もしくはそれ を引き付ける基を結合含有している。別の精製方法では精製すべき物質と特異結 合する基をカラム上に固定化している。これらの基は所望の物質を溶液から引き 取る。後者の場合、物質は後でカラムから溶出せねばならない。

ＪＪ、Ｑの配位子親和性クロマトグラフィーは後者の方式に準じ、単一の固定化 配位子が脱水素酵素又はキナーゼなどの酵素のファミリーを遊離酵素で吸収し、 次いで生物特定溶出に適した条件下で溶出することができるという原理に基いて いる。一般的な配位子としてはしばしば補因子又は補因子フラグメントが用いら れる。

不溶化された低分子へテロニ官能共役体ＡＭＰ−ＡＴＰが一般の配位子親和性ク ロマトグラフィー用に提案されている。リー　シーワイ、ラールソン　ビー　オ ー、モスバック　ター「三官能ジヌクレオチドＡＭＰ−ＡＴＰの合成及びその汎 用配位子親和性クロマトグラフィーにおける応用」ジャーナル・オブ・ソリッド フェース・バイオケミストリー、λ（１）、３１−３９　（１９７７）。ＡＴＰ 基（キナーゼに特異的）はセファロース（商品名）４Ｂ（架橋アガロースゲル、 スエーデン、ウプサラ、ファーマシア製）カラムに予め結合させたＡＭＰ基（脱 水素酵素に特異的）を通じて結合させてある。ＡＴＰ基及びＡＭＰ基は両者がＡ ＭＰ部分を通じてセファロースカラムに結合されていてもそれぞれキナーゼ及び 脱水素酵素に対する親和性挙動を保持しているとの報告がある。可溶性のＡＭＰ −ＡＴＰジヌクレオチドを調製する試みは不成功であった。

Ｉｄ。

これら従来技術の二官能共検体のうちネフェロ分析及びタービジティ分析検定法 に応用されたものは一つもなかった。さらに、ホモ二官能複合体がネフェロ分析 及びタービジティ分析に必要とされるような大きな複合体の形成に使用すること が示唆されただけであった。ホモニ官能共検体は同じ分子と結合するためにのみ 有用である。同じでない巨大分子を凝集することができる可溶性へテロ二官能共 役体を入手することは有利であろう、そのようなヘテロニ官能共検体は特にＮＩ ＩＡ法に使用されよう。

４、アビジン　びビオチンの　にお【るアビジン及びビオチンはともに天然に詳 在する化合物である。アビジンは比較的大きい巨大分子であり、卵白中に見出さ れる。アビジンは４種のサブユニットを含有している。ビオチンは比較的小さく 安定な水溶性ビタミンである。アビジン分子の４種のサブユニットの各々はビオ チンの分子に特異的に結合することができる。アとシンとビオチンの結合反応は 非常に強く、結合定数は約１０　ｌ５Ｌ１モルである。この結合は非常に強く、 ビオチンがそのカルボキシル基によって他の分子と共役した場合又はアビジンが 他の分子に付着結合した場合でさえも持続することが発見された。ビオチンが他 の分子と共役した場合、その結果の共役体は通常ビオチニル化化合物、例えばビ オチニル化クンバク質と呼ばれる０例えば、ビオチニル化タンパク質は迅速に対 応アビジン付着結合分子と強力に結合することになる。このビオチニル化化合物 のアビジン共役体と結合する特徴は、成功度合いに変動はあったが、主として不 均質免疫検定に用いられてきた。

そのような応用のうち２件がサンドイッチ免疫検定に関係している。その１つの 例においてアビジン：ビオチン結合がサンドイッチの標識端で用いられる。これ は米国特許第４，２２８，２３７号に見られ、ここでは測定すべき配位子の特異 結合パートナ−をビオチニル化したものを酵素標識アビジンとの共役に用いてい る。もう１つの例においてはビオチン：アビジン結合がサンドイッチ免疫検定で 形成されるサンドイッチの不溶化末端で使用されよう０例えば、米国特許第４， ２９８，６８５号は通常標識つきサンドイッチが溶液中で形成された後添加され る不溶化アビジンの使用を教示している。サンドイッチの標識つけされない提体 が予めビーオチンで標識つけされた場合、不溶化アビジンは溶液から標識つきサ ンドイッチを捕獲することができる。これらの用途はネフエロ分析又はタービジ ティ分析に応用されない、さらに、試薬の調製に必要な追加共役段階はそのよう な方法を経済的により魅力の無いものとする。

アビジンはまた上述の低分子配位子：酵素モジュレータ−へテロ二官能共役体と 同様な方法で用いられる大型の代理標識つき共役体の酵素モジュレータ−標識成 分として均質免疫検定に用いられてきた。アビジンはピルビン酸カルボキシラー ゼのようなビオチン含有酵素の天然阻害剤である。これら酵素のビオチン基がア ジピンと連結、すなわち、複合化すると酵素活性は停止ないし減少する。これは ビオチンがこれら酵素に必要な補因子であり、ビオチン基が補因子として機能ａ 来なくなる場合酵素活性が阻害されるからである。

従ってアビジンは基質上に作用し得るようになるとある種の均質免疫検定システ ムにおいて測定し得る信号が得らけるビオチン含有酵素の活性をモジュレータな いし制御する能力によりモジュレータ−標識として使用することができる。

米国特許第４，５５０，０７５号は均質免疫検定に使用する大型の標識共役体の モジュレータ−としてのアビジンを開示している。米国特許第４，５５０．０７ ５号の標識共役体は大部分のモジュレータ−標識、すなわち、酵素阻害剤よりも かなり大きい約６３．０００ダルトンというアビジン大分子サイズの利点を利用 している。これはアビジンが大型代理標識共役体について典型的に遭遇する立体 障害問題を緩和することが出来るようにする０例えば、低分子配位子：酵素モジ ュレーターヘテＰ二官能共、検体が使用される場合、比較的小型の典型的な低分 子量酵素モジュレーターはその共役体の配位子部分のそれに対比し得るものであ り、それゆえモジュレーターは検定において有効に機能することができる。しか しながら、配位子が抗原でである場合のように配位子が通常の酵素モジュレータ −よりも非常に大きい場合、典型的な酵素モジュレータ−は配位子の大きさによ って阻害され、モジュレータ−標識の活性度は配位子成分による特異結合パート ナ−が存在しなくても立体的に阻害される。

この立体障害問題は前述の米国特許第４，２３８，５６５号である程度取り上げ られており、配位子が比較的分子量が大きい分子の場合若干長いスペーサー基を 用いることが提案されている。どの場合でもスペーサー基はその長さが炭素原子 数的１４及びヘテロ原子数○−５を越えない。目標は立体障害が共役体の配位子 基がその特異結合パートナ−と結合している時にのみ起き、その共役体の配位子 基が遊離状態の時に起きないことにある。これに反し、米国特許第４，５５０， ０７５号では単に抗原のような大配位子が巨大分子酵素モジュレータ−アビジン の活性を立体的に阻害することができないという利点を取り上げている。立体障 害は配位子部分がそれの特異結合パートナ−と結合した時にのみ発生する。

アビジン：ビオチン結合は高度の特異性及び結合強度がネフエロ分析及びタービ ジティ分析操作用として好ましく見えるけれどもそれらに使用されなかった。複 合体形成におけるアビジン：ビオチンの唯一の使用は前述のアビジンを凝集させ るためのＢ１５−ビオチンの使用である。この方法はネフエロ分−析又はター、 ビジティ分析用のものではない。従って、アビジン：ビオチン結合をネフエロ分 析又はタービジティ分析検定法に適用することは有利であろう。

及肛立亘豹 本発明は関心とする被検８体を測定するための種々の免疫検定法、特に大複合体 の形成が要求もしくは望まれる場合に応用することができる新規な二座共検体（ ｂｉｄｅｎｔａｔｅ　ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）を提供するものである。この二座体 はネフエロ分析及びタービジティ分析操作に特に用いられる０本発明の二座共検 体は本質的に同時に結合し究極的に大複合体を形成することができる可溶性低分 子へテロニ官能共膜体である。特に、この二座共検体ないし二座体はそれぞれ特 異結合によって異なった巨大分子と結合することができる２種の異った低分子配 位子、すなわち、二座体メンバーを有する可溶性へテロニ官能共検体である。大 複合体の形成が所望される場合、巨大分子は多価性でなければならない、二座体 メンバーそれぞれがその対応する特異結合パートナ−と同時に結合できるように 適切なスペーサ一部分）を通じて結合されている。

二座体をネフェロ分析又はタービジティ分析の操作用に使用する場合は二座体の 第１メンバーは関心とする被検出体と同じが又は類似のものから選ばれる。第２ のメンバーは配位子：特異結合パートナ一対の低分子配位子部分である。配位子 は、例えば、アビジンがその特異結合パートナ−であるビオチンである。配位子 の特異結合パートナ−（例えばビオチンが配位子である時のアビジン）及び関心 とする被検出体に対する抗体が存在する場合、二座体は連結体として作用し、光 散乱複合体を形成する。−アビジンが一特異結合パートナーである場合、各アビ ジン分子は各二座体のビオチンメンバーを通じて２つの二座体と好ましく結合す るが、各二座体の残余のメンバーは抗体と結合する。

区国立旦皇皇１］ 第１図は本発明の二座共検体の特定の実施態様を用いる阻害免疫検定操作を示し 、 第２図は二座共検体工同族体の合成を模式的に示し、第３図は二座共検体■同族 体の合成を模式的に示し、第４図は二座共検体の両方のメンバーのそれぞれの特 異結合パートナ−との同時結合能力に対するスペーサーの長さの影響を示し、第 ５図は本発明の二座共検体の特定の実施態様を用いるＮＩＩＡの感度に対するス ペーサーの長さの影響を示す。

及豆二且亘皇且朋 本開示の文中において次の用語は特に示さない限り次のように定義される： 配位子：複合体又は共役体のより小さい分子で、特異的により大きい分子又は物 質と結合するもの、この配位子は天然に存在するものであってもよいし１人工的 に処理したものであってもよい。

特異結合パードナー：複合体又は共役体中のより大きい分子又は物質で、特異的 により小さい分子と結合するもの、特異結合パートナ−は他の物質を除いて配位 子と特異的に結合する親和力を有している。特異結合パートナ−は天然に存在す るものであってもよいし、人工的に処理したものであってもよい。

配位子類似体：配位子と殆ど同じ方法でその配位子の特異結合パートナ−と結合 することができる配位子分子の類似体。ここで用いる「配位子」は全般的に配位 子類似体及び免疫化学的に均等の物質を含むものである。

低分子配位子：大きさが約７，０００グルトン未満の配位子、低分子配位子は抗 原のようなより大きい配位子の一片ないしフラグメントであってもよい、低分子 配位子が抗原のフラグメントである場合、そのフラグメントはまるごとの抗原に 対して抗体が有しているのと同じ又は同程度の親和性で抗体に抗原として認知さ れるものでなければならない。

巨大分子：大きさが約１０，０００グルトンを越える大きい分子又は物質。

同時結合：同じ二座共検体の両方の二座メンバーがそれらの特異結合パートナ− と同時に結合する能力、一方の特異結合パートナ−の結合が事実上地の特異結合 パートナ−の結合前に生じてもよい。

本発明によれば、新規な二座共検体が提供される。二座共検体によって意味する ことは低分子配位子として機能し適切なスペーサー基を通じて結合された化学基 、すなわち、二座体メンバーを有する可溶性低分子へテロニ官能共検体である。

２つの低分子配位子はおのおの異った巨大分子と特異結合することができる。本 発明の二座体に用いることができる低分子配位子の例を特に挙げれば、インシュ リン、ステロイドホルモン、甲状腺ホルモンなどのホルモン、ポリペプチド、オ リゴヌクレオチド、Ｂ１０、葉酸、ビオチンなどのビタミン、ｌ−置換−２，４ −ジニトロベンゼン（ジニトロフェノール又はＤＮＰとして知られる）及び−ブ ロンクローディレーターテオフィリンを含む薬剤などがある。

説明の明解化のため二座体メンバーを第に座体メンバー及び第２二座体メンバー と呼ぶことにする。第１及び第２二座体メンバーは本来低分子配位子：特異結合 パートナ一対の配位子部分である。

２種の好ましい低分子配位子：特異結合パートナ一対の例はハブテン：抗体及び とオチン：アビジンである。その他の低分子配位子：特異結合パートナ一対の例 にはホルモン：レセプター、ポリペプチド：抗体、オリゴヌクレオチド：相補的 ＤＮＡ又はＲＮＡ、ビタミンＢ１．：内因子、葉酸塩二葉酸塩結合タンパク質及 びインシュリン：抗インシュリンなどがある。

驚くべきことに、このような可溶性低分子へテロニ官能共検体が比較的容易に合 成でき、かつ２種の異った巨大分子と結合するのに利用できることが発見された 。さらに、それぞれの二座体メンバーの巨大分子特異結合パートナ−がおのおの 多価性である場合低分子へテロニ官能共検体を通じて通常の大複合体が形成され ることが観察された。本発明の二座体は可溶性であるため結合二官能共検体の反 応動力学が大いに改善される。

二座体をネフェロ分析又はクービジティ分析検定法に使用しようとする場合、第 に座体メンバーは試験試料中に存在するであろう関心とする被検８体、通常はハ ブテンと同じか又は類似体となるように選定される。必要なことは第に座体メン バーが同じ特異結合パートナ−１通常は抗体について遊離被検出体と競争し得る ことである。好ましくは、被検出体は一価である。本発明の二座体は関心とする 被検８体が分子量約１００〜１５−００ダルトンのハブテン又はその類似体であ る場合のネフェロ分析又はタービジティ分析阻害検定に特に有用である。第２二 座体メンバーは低分子配位子：特異結合パートナ一対の配位子部分である。大複 合体を形成させるために特異結合パートナ−は多価体でなければならない、特異 結合パートナ−は二価であることが好ましい。後者にはまるごとの抗体及びＦ　 （ａｂ”　）、フラグメントが含まれる。

本発明の二座体の合成は第１及び第２二座体メンバーが選定されれば比較的簡単 である。この二座体をネフエロ分析、タービジティ分析又はその他の競争形式の 検定法に使用しようとする場合、二座体メンバーは好ましくは上記に示唆したよ うに選定される。その他の用途に使用しようとする場合、通常は最初に二座体メ ンバーの特異結合パートナ−が選ばれる。それらは好ましく互いに結合すること が望まれるものである２次いで第１及び第２二座体メンバーとして先に選定され た大きい特異結合パートナ−と特異的に結合する対応の低分子配位子が選ばれる 。

スペーサ一部分を通じて二官能共検体のメンバーを互いに連結するには当業者公 知の多くの方法がある０例えば、米国特許第４．１３４．７９２号、米国特許第 ４．２３８．５６５号及びグリーンエヌ　エム、コニエツニイ　エル、トムス　 イー　ジェー、バレンチン　アール　シー「三官能ビオチン化合物のアビジン中 のサブユニットの配列決定における使用」バイオケミカル・ジャーナル、上呈二 、７８１−７９１　（１９７１）を参照、これらの方法には反応前に活性化され るか又はされていない化学基間の典型的な縮合反応、付加反応及び置換反応が含 まれる。

後記の例において数種の共役性を述べる。もしその選定された方法にその類の化 合物の一連の同族体の１つである化合物の挿入操作が含まれていれば一般的に便 利である０例えば、アルカンジアミン（ＮＨｔ　−ＣＣＨ＊　）ｓ　−ＮＨｔ　 ）類の化合物にはエタンジアミン（Ｎ＝２）、プロパンジアミン（Ｎ＝３）、ブ タンジアミン（Ｎ＝４）、ペンタンジアミン（Ｎ＝５）以下同様が含まれる。１ 合成工程にこれら同族体の１つを挿入することが含まれる場合、二座体の２メン バーを連結するスペーサー基の鎖長を変えるのに他の同族体と容易に置換するこ とができる。

それぞれのスペーサー基の化学的組成はそのスペーサー基を連結する二座体メン バーのそれぞれに用いられる化学部位の性質に成る程度依存する。炭素原子に加 えて、窒素、酸素、硫黄及びリンを含む典型的なヘテロ原子をスペーサ一部分に 使用できる。スペーサー基は芳香族基が含まれてもよいが、一般に脂肪族である 。炭素、窒素又は酸素を用いる単結合がスペーサ一部分に取り込まれる典型的な 二価類においては、これらの各原子はスペーサ一部分の長さを約１．２〜約１． ５人増加すると考えることができる。

スペーサー基を通じて二座体メンバーを互いに連結するのに用いられる精密な方 法は臨界的なことではない。重要なことは両方の二座体メンバーがその二座体の 合成後にそれらの特異結合パートナ−と効果的に結合する能力を保持しているこ とである。この考え方はスペーサー基との連結用の化学的部位を正確に選定する のにも影響する０通常はその二座体メンバーの活性部位を特異結合反応が生じ得 るよう最大限露出する。

二座体メンバーを連結するスペーサー基の長さは両方の二座体メンバーがそれら それぞれの特異結合パートナ−と同時結合する能力を調整するのに特に重要であ ることが発見された０例えば、もし二座体メンバー間のスペーサー基が比較的短 いと立体障害が所望の同時結合を阻害し、さらには阻止さえすることができる。

立体障害は二官能共検体が比較的短いスペーサー基を用い、その二官能共検体メ ンバーの特異結合パートナ−が非常に長い場合に発生する。例えば、前述したよ うに、アビジンは約６３，０００ダルトンの分子量を有しており、他方典型的な 抗体は約１５０．０００ダルトンの分子量を有している。もしこれらの巨大分子 の１つが短いスペーサー基を有する二官能共検体と結合すれば、その他の分子は 従来技術のへテロニ官能共検体を用いたモジュレーション検定の場合のように同 じ二言能共検体と同時結合することができなくなるであろう。大複合体形成が所 望の場合にはこれは当然阻止すべきである。

２つのホモニ官能共検体メンバーがそれらそれぞれの特異結合パートナ−と同時 結合し得るのに必要な最小限スペーサー基は当業者公知の多数の方法のうちどれ かで決定することができる。例えば、ラルソン　ビー　オー、モスバック　ケ− 「酵素の親和性ヌ　エム、コニエツニイ　エル、トムス　イー　ジエー、バレン チン　アール　シー「二価性ビオチン化合物のアビジン中のサブユニットの配列 決定における使用」バイオケミカル・ジャーナル、上λ二、７８１−７９１　（ １９７１）を夕照。同じ方法は２つの二座体メンバーの同時結合に必要な最小限 スペーサー基の決定に用いることができる０本発明の二座体を信号が二座体によ る同時結合に従って発生する競争検定に使用しようとする場合、同時結合を行わ せるのに必要な最小限スペーサー基は最終的に所望される検定条件と同じ条件で 、但し遊離の被検出体の不在下で決定される。これらの条件下で、スペーサー基 は測定可能な信号が初めて観測されるまで長（される、これが最小限スペーサー 基である。重要な考慮事項はその選定された方法が結合の有効さを検知する機会 を提供し得ることである。

最小限スペーサー基を決定する１つの簡便な方法は標準ネフエロ分析又はタービ ジティ分析の操作を通じて行うことである。これらの方法は二座体が大複合体、 すなわち、散乱センターを形成するのに十分な大きさの複合体を形成するのに用 いることができる場合、たとえそれがその二座体の最終的な用途とするものでな （でも、有用である。この方法は多価の特異結合パートナ−が両方の二座体メン バーに適用される場合にのみ用いることができる。特に、スペーサー基に関して のみ変わる（同族体として知られる）二座体はそれらのそれぞれの多価特異結合 パートナ−と接触させられる。複含体形成は同時結合を許容する最小限スペーサ ー基長で観察されるように開始されよう。最適最小限スペーサー基は本来最小限 スペーサー基より若干長いものであろう、しかしながら、複合体形成量は一般に 最小限スペーサー基の数個の炭素原子数又はヘテロ原子数内で平衡に到達する。

本発明の二座体をＮＩＩＡに使用しよ−うとする場−合、二座体メンバー間のス ペーサー基が長ずざるとＮＩ　ＩＡの感度もまた損なわれる。これは、例えば、 第２二座体メンバーが第２二座体メンバーに対し２以上の結合部位を有する、ア ビジンのような、巨大分子と結合する場合に発生する。このような場合にはより 長いスペーサー基が２以上の二座体の各巨大分子との結合を可能にしよう。

アビジンを例にとると、アビジン分子上にはビオチン結合に有用な４部位がある 。これらの結合部位は対になっており、各対の両方の結合部位は分子の面上で比 較的接近して存在する。二座共検体のスペーサー基が正当な範囲内にある場合、 二座体は立体障害によりアビジン分子の同一面上に存在する対の一方の結合部位 にしか結合できない。しかしながら、二層体のスペーサー長が長ければ長いほど 抗体（二層体の一端に結合）はアビジン分子（二層体の他方の端に結合）とます ます遠く離れる。最終的に、スペーサー長が第２二座体の第に座体が既に結合し ているアビジンの結合部位対に隣接する結合部位への結合を可能ならしめるのに 十分な長さとなる点に到達する。

光散乱複合体を保持するのに十分な長さを持つ線状凝集体を形成する、すなわち 、アビジン１分子当り合計２の結合を使用することが好ましい。このような方法 で、１個の遊離被検出体が、通常抗体である多価特異結合パートナ−と結合し最 終的に散乱複合体を形成せしめたであろう第に座体メンバーと本質的に置き換わ ることによって線状凝集体の成長の中断をもたらすことができる。対となった結 合部位の両方がアビジンの一面上で占められると、線状凝集体最適範囲内におい て、ＮＩＩＡに使用する二層体のスペーサー長はそれぞれの結合パートナ−が第 １及び第２二座体メンバーの両方との同時結合を許容するのに十分な長さである が、二層体が単一の特異結合パートナ−の２以上の結合部位と結合するのを阻害 するには十分な短さである。

本発明の二層体はＮＩＩＡ法において用いられる従来技術の顕色剤抗原より優れ ている。この二層体は室温において数年間効力が保持できる精製有機薬品である 。その製造、精製及び特性化は容易で品質管理経費は従来技術の顕色剤抗原に比 較して最低である。この二層体はまたおのおのがただ１つのハブテン基を有して いるので従来技術の非生産的結合問題は排除されている。従って抗体のただ１つ の腕がこの二層体と結合することができる。

本発明の二層体を用いるＮＩＩＡ法は抗体製造の予備段階に関してのみ従来技術 のＮＩ　ＩＡ法と類似する。どちらの場合も、関心とする被検出体がハブテンで ある第１Ａ図に示したように、関心とする被検出体に対する抗体はまず動物の中 へ複数の被検出体分子と共役した担体タンパク質を注射することによって生成さ れる。

このように関心とする被検出体に対して生起した抗体は本発明の被検８体：配位 子二層体にその配位子の特異結合パートナ−及び試験試料とともに接触させられ る。これら試薬類の相互作用は適当な反応容器中でなされよう。試験試料中に遊 離被検出体が僅かしか又は全熱存在しない場合皿座共役体は有効な抗体及び第２ 二座体メンバーの特異結合パートナ−と反応し散乱−性の複合体−が形成される 。

この反応は第１Ｂ図に示すが、ここではハブテンが関心とする被検出体であると ともに第に座体メンバーであり、抗体が第に座体メンバーの特異結合パートナ− であり、ビオチンが配位子、すなわち、第２二座体メンバーであり、アビジンが 第２二座体メンバーの特異結合パートナ−である。

しかしながら、遊離被検出体が存在すれば、第１Ｃ図に示すように、複合体化の 多くは遊離被検出体の有効な抗体との結合によって阻害されよう、これは遊離被 検出体が分析物：配位子二層体の場合と異なり抗体と連結して光を散乱する複合 体を形成するために配位子の特異結合パートナ−と結合することができないから である。光を散乱する複合体の形成度合の指示として測定される信号の量は試験 試料中に存在する遊離被検出体量と逆比例する。

明瞭化のために、数種のテオフィリン：ビオチン二層体の合成及び使用に関して のみ詳細に説明する。もちろん、テオフィリン以外のハブテンについて同じ一般 的操作同様同じ合成法及びＮＩ　ＩＡ操作が同等になされると認識されよう。本 発明の二層体を使用してＮＩＩＡで効果的に検定できる薬剤の例にはジゴキシン 、ジンピラミド、ライドカイン、プロカインアミド、プロパノロール、キニジン 、アミカマイシン、クロラムフェニコール、ゲンタマイシン、カナマイシン、ネ チルマイシン、トブラマイシン、三環抗うつ剤、エソスクシミド、フェノバルビ クール、フェニトイン、ブリミドン、パルプロイン酸、アセトミノフェン、アセ チルサリチル酸、メトトレキセートなどの治療薬及びモルフイネ、コディン、ヘ ロインなどの悪習薬並びにそれらの代謝生成物が含−まれる。皿座共役体を用い て検定することができるその他のハブテンにはＤＮＰ、１−置換一４−ヒドロキ シ−２−二トロベンゼン及び４−置換−２−ニトロートリアルキルアニリニウム 塩が含まれる。関心とする被検出体は好ましくは二層体の１メンバーとして使用 され、他の二層体メンバーはビオチンのような異った小分子配位子である。

スペーサ一部分の長さの効果を示すために、２種の異なったテオフィリン同族体 （スペーサー長さを除き他は同じ）−ビオチン皿座共役体を合成し、ネフェロ分 析法条件下で評価した。明解さのために、ここでは２種の皿座共役体を皿座共役 体１及び皿座共役体■と呼ぶことにする。皿座共役体■は二座共検体工ではその テオフィリン部分に隣接して窒素原子が配置されているのに対しテオフィリン部 分に隣接して炭素原子を有している点が相違する。両方の二層体の合成には二層 体のテオフィリン部分（第に座体メンバー）とビオチン（第２二座体メンバー） との間にジアミンを挿入することが含まれる。二層体のスペーサー基の鎖長は合 成工程で用いるジアミンの選択によって変えることができる。この場合、鎖長は スペーサー中へ取り込まれる５炭素原子脂肪族尾部を有するビオチンの生物学的 活性な脂環構造から測定される。同じ合成工程を他のハブテン−ビオチン二層体 を含むその他の二層体を製造するのに用いることができる。

合成工程の第１段階として、最初にテオフィリンの第一級アミン銹導体を出発物 質の市販テオフィリン誘導体から調製する。他の工程が他のハブテンの第一級ア ミン誘導体の調製に用いることができる。二座共検体工を調製する場合、過剰Ｉ のジアミンを出発物質の８−ブロモテオフィリン誘導体とともに還流する。これ は一般に窒素気流下でそれぞれ選定したジアミンに応じて２〜７２時間行い、生 成物Ｉを得る。

皿座共役体■を調製する場合は、選定したジアミンを挿入する前に、出発物質の 誘導体テオフィリン−８−酪酸のカルボキシル基を活性化するためカルボニルジ イミダゾール（ＣＤＩ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）を使用す る必要がある。活性化はテオフィリン−８−酪酸を無水ジメチルフォルムアミド （ＤＭＦ）に溶解し、次いで等モル量のＣＤＩを順次添加しながら約７０℃に加 熱する。反応温度は通常的１５分間で約７０℃に保持しなければならない。その 後冷却して室ｆＡにまでもどす。次いで等モル量のＮＨ５を冷却した反応混合物 に添加し、室温で一晩中撹拌する。その後この活性化反応混合物へ過剰量のジア ミンを添加し、その結果生成物■を得る。

所望の第一級アミン誘導体製造反応の完了は反応混合物工又は反応混合物Ｈのそ れぞれを薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）分析でシリカゲルを塗布したガラス ＴＬＣ板及び紫外線指示器を用いて決定することができる。

反応混合物は次いで減圧下で小容積になるまで蒸発させ、濃縮混合物は標準シリ カゲルカラムクロマトグラフィーによりこう配クロロフォルム：メタノール混合 液を用い精製せねばならない、純粋なテオフィリンの第一級アミン誘導体を含有 する溶出留分は一括して回転蒸発器中で蒸発乾固する。蒸発により得られた白黄 色の結晶固体はさらに精製することなく次の反応に、使用するこ−とができる。

テオフィリンモノアミン誘導体はメタノール中で２９５ｎｍで１．９×１０３の モル吸光率を有している。

ビオチン−テオフィリン共役体Ｉは、第２図に模式的に示すように、反応混合物 Ｉからのテオフィリンの第一級アミン誘導体を含有する結晶固体を無水ＤＭＦに 溶解し、これをカプロアミドビオチンの活性化Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエ ステル（ビオチン−Ｎ−ＮＨＳ）中で攪拌する。他のハプテンの第一級アミン誘 導体も同様にビオチン−Ｎ−ＮＨＳ又は他の有効な活性化カルボキシル基含有化 学部分を用いて縮合させることができる。この溶液はまた室温で一晩中撹拌する 。ビオチン−テオフィリン共役体■も、第３図に示すように、反応混合物■から のテオフィリンの第一級アミン誘導体を含有する結晶固体をビオチンのＮ−ヒド ロキシスクシンイミドエステル（ビオチン−ＮＨＳ）と混合する以外は同様にし て調製する。どちらの場合も、所望の生成物は通常ＤＭＦから白色の綿状固体と して分離する。生成物はろ紙上に集め、分取薄層クロマトグラフィー又はカラム クロマトグラフィーのどちらかによりＴＬＣ試験で単一スポットとなるまで精製 する。

二座共検体の同族体はネフエロ分析又は他の検定条件を用い最適スペーサー長を 決定することができる。最適最小限スペーサー長は二層体、アビジン、ビオチン の配合比率が変っても大きくは変化しない、さらに、同じ最小限スペーサー長デ ータは一般にテオフィリン以外のハブテンがハブテンービオチン二座共検体のメ ンバーの１つとして使用された場合にも適用できる。ただしこれら配位子の特異 結合パートナ−の大きさや形がアビジーンに比較し−て大きく変動することによ って若干の変動が観察されよう。ビオチン以外の低分子配位子が二層体メンバー の１つとして取り込まれた場合若干程度の大きい変動が予期される。それでも、 テオフィリンービオチンニ座体の研究は何種かの二層体合成を開始する基礎とす るのに十分な最小限スペーサー長データを提供する。

例−」。

二座社′　工のＡ スペーサー中へ挿入する可変物としてヘキサンジアミン（Ｎ＝６）を用いる二座 共検体工の合成を第２図に模式的に示す。二座共検体のＮ＝６同族体は下記の方 法で調製した。

過剰量のヘキサンジアミン（ＮＨ，−（ＣＨ２）、−ＮＨ，）を８−ブロモテオ フィリンとともに窯素気流下で２４時間還流した。

還流反応終点は反応混合物をＴＬＣ分析でシリカゲルを塗布したガラスＴＬＣ板 及び紫外線指示器を用いて決定した。

反応混合物は次いで減圧下で小容積になるまで蒸発させた。濃縮反応混合物を少 量のシリカゲルと混合し、熱板上で乾燥し、次いでノールの量を変えたクロロホ ルムを含有する溶媒で溶出処理した。

こう配組成がクロロホルム中メタノール２０％に達した時カラムをメタノール２ ０％、アンモニア４％、クロロホルム７６％を含有する混合液で溶出処理した。

純粋なＮ−（８−テオフィリン）−６−アミンへキサミンを含有する留分は一括 して回転蒸発器中で蒸発乾固した。白黄色の結晶固体はさらに精製することなく 次の反応に使用した。

等モル量のＮ−（８−テオフィリン）−６−アミノへキサミンを無水ＤＭＦに溶 解し、次いで対応するモル量のビオチン−Ｘ−ＮＨＳと混合し室温で２４時間撹 拌放置した。所望の生成物をＤＭＦから白色の綿状固体として分離し、ろ紙上に 集め、カラムクロマトグラフィーよりＴＬＣ試験で単一スポットとなるまで精製 した。

スペーサ一部分の鎖長は二層体の合成に用いるジアミン（ＮＨＩ　−（ＣＨｔ　 ）Ｎ　−ＮＨｔ　）を選定することにより制御される。例えば、最初の合成段階 でヘキサンジアミンを選定した場合は、第２図に示すように、６個の炭素原子が スペーサー基鎖長に寄与する。この場合スペーサー基の近似的な長さは２６．０ 人である。二座共検体のスペーサー中へ種々のジアミンをＮ−６同族体の調製に 用いたのと同じ操作を用い挿入することにより得られた鎖長を第１表に示す。

第１表 二座共検体工同族体のスペーサ一部分の長さジアミン　スペーサー中の全原子数 　近似スペーサー長（入）Ｎ＝２　１６　２１．０ Ｎ＝３　１７　２２．２ Ｎ＝４　１８　２３．５ Ｎ＝５　１９　２４．８ Ｎ＝６　２０　２６．０ Ｎ＝７　２１　２７．３ Ｎ＝８　２２　２８．５ 二座丘′　の六　に文・　るスペーサー。　の交果評第工表に示した一連の二座 共検体を調製した後、これら共役体についてネフェロ分析条件下で二座共検体に より発生される信号量に対するスペーサー長の効果をめ評価した。

Ａ、　ハ　スペーサー 最小限スペーサー長を抗テオフィリン抗体及びアビジンの存在下で第工表に示し た各二層体により発生される信号の量（レート）を検出することにより測定した 。これは第１Ｂ図に示すのと同じ反応である。第１Ｃ図に示すＮＩＩＡの場合の ような複合化阻害のための遊離テオフィリンは添加しなかった。この測定の目的 は二座体、抗体及びアビジンの化学量論的比率における最適結合のための最小限 スペーサー長を単にめることにあった・試薬は次のようにして調製した。テオフ ィリンに対するモノクロナール抗体をＩＣ５（商標）希釈液（ベックマン・イン スツルメンツ、商標ＩＣＳ試薬）中にｌ：１３．３に希釈した。ボーリンガーマ ンハイムから購入したアビジンをＩＣＳ希釈液中に０．１３ｍｇ／ｍρの濃度に なるよう溶解した。第工表に示した各二速共役体を種々の希釈率でｐ）（！５． ５のＯ，１モルリン酸緩衝液に溶解した。

ネフェロ分析測定はＩＣ５（商標）ネフェロメーター（ベックマン・インスツル メンツ）にＩＣＳ（ｍ標）ガラスびん（ベックマン・インスツルメンツ）に入れ た６００μβのＩＣＳ緩衝液（ベックマン・インスツルメンツ、商標ＩＣＳ試薬 ）を置き、抗体溶液４２μβ及びアビジン溶液４２μ℃を注入した。一時的な注 入がおさまり、基線が得られた後、４２μ２の二速共役体を添加し計器のビーク レート信号記録を開始させた。

ＮＩ２からＮＩ８までの結果を第４図に示す、第４図において、水平軸の単位は ２９５ｎｍでの吸光度に基く二座体濃度を表わす。

垂直軸の単位はＩＣ５（商標）マニニアルモードカードＭ３３（ベックマン・イ ンスツルメンツ）を用いて得たＩＣ５（商標）レートユニットである。約２００ ０ユニツト以上の高レート信号の場合はＩＣ５（商標）ローゲインカードな用い 、その結果はＭ３３ゲインに換算した。

第４図の結果かられかるように、テオフィリン環炭素とビオチンの脂環炭素の間 に１７結合（１６原子）を有する二座共検体工の最低縁同族体（ＮＩ２）は測定 可能な複合体形成を得るに至らなかった。その次の級の同族体（二座複合体工、 ＮＩ３）から測定可能な複合体形成を示し始めた。それより高級な同族体（ＮＩ ４からＮ；８）は相当した高さの信号を発し、ＮＩ８で天井に達した。この研究 はテオフィリンを第に座体メンバーとして用い、ビオチンを第２二座体メンバー とじてを用いた場合、信号を生成するためには約２２．２人の最小限スペーサニ 長が必要であることを示している。

最適としては、スペーサー長は少なくとも約２３．５人（二座共検体工、ＮＩ４ ）であるべきである。

Ｂ、　スペーサニ五 最大限スペーサー長はＮＩＩＡで典型−的に見られる阻害条件下において第１表 に示すＮＩ４からＮＩ８までの二座共検体工の同族体によって発せられる信号の 量（レート）を検出することにより測定した。

検定操作は例２のＡの部において最小限スペーサー長を測定するために各二速共 役体の濃度を変えたのに対し二速共役体の濃度を一定にした以外は例２のＡの部 で述べたのと同様に行った。各二速共役体はｐＨが７．５の０．１モルリン酸に 溶解し、２９５ｎｍにおける吸光度が０．１３６になるように希釈した。吸光度 ０．１３６という値は例２のＡの部において最大限レートの信号が観測された点 、すなわち、最大の複合体形成が発生する二速共役体の濃度における値を選んだ 、第１ｃ図に模式的に示す阻害を生じさせるために遊離テオフィリンの量を固定 せず変えて添加した。

この検定の結果は第５図に示した。第５図に示すグラフ上の各点は抗テオフィリ ン抗体、アビジン及び所定量のテオフィリンの存在下においてそれぞれの二速共 役体について得られたビークレートを表わす、最高のビークレートは被検出体不 在、換言すればテオフィリン０．００μｇ／ｍβにおいて得られた。被検出体の 不在下で得られたビークレートは検定のパラメーター下で得られる最大限ビーク レートであり、ビークレート信号１００％として表わされる。遊離被検出体の存 在下ではビークレートは阻害される。遊離のハブテン又は被検出体の量の増加に 従って阻害の度合は増加し、ピークレート信号は減少する。

テオフィリンＮＩ　ＩＡの最大の感度は二座共検体工のＮＩ４の同族体を用いて 得られた。感度は所定濃度−の被検出体によってもたらされるピークレート信号 の変化の程度を表わす。遊離テオフィリンの濃度０．１０１．Ｌｇ／ｍβはＮＩ ４の同族体を使用した時ビークレート信号最大値的５０％の低下をもたらすこと ができた。ＮＩ５又はＮＩ６の同族体を使用した場合は濃度的０．３０μｇ　／ 　ｍ　Ｑの遊離テオフィリンを系中へ添加するまではビークレート信号最大値的 ５０％の低下は観察されなかった。ＮＩ７又はＮＩ８の同族体は伝統的な顕色剤 抗原を用いる従来技術のそれに対比し得る感度を示した。すなわち、信号の５０ ％の低下が測定される前に濃度的０．５０μｇ　／　ｍ　Ｘのテオフィリンが必 要であった。二座共検体工のＮＩ４からＮＩ８の同族体はすべてこの実験で検討 した検定条件下のＮＩ　ＩＡにおいて満足に作動することが見出された。ただし 、ＮＩ４の同族体は感度を目的とした場合価れていることが見出され従来技術Ｎ Ｉ　ＩＡ法の感度に顕著な改善を示した。ＮＩ５及びＮＩ６の同族体もまた優れ た結果を与えた。二座体、抗体及びアビジンの異った配合比を用いた検定ではそ の他の検定条件を変えた場合同様スペーサー長の最適最大値に若干の変動がある と予期される。

二速共役体のＮＩ６の同族体を用い典型的なＮＩ　ＩＡを行った。

検定は例２のＢの部で述べたのと同じ条件で運転した。

試薬は次のようにして調製した。テオフィリンに対するモノクロナール抗体をＩ Ｃ５（商標）希釈液（ベックマン・インスツルメンツ、商標ＩＣ５試薬）中に１ ：１３．３に希釈した。ボーリンガーマンハイムから購入したアビジンを、ＩＣ ５希釈液中に０．１３ｍ　ｇ　／　ｍρの濃度になるよう溶解した。二速共役体 をｐＨ５，５の０．１モルリン酸緩衝液に溶解し、さらにその光学濃度が２９５ ｎｍで０．１３６になるように希釈した。１０μｇ／ｍ℃のテオフィリンを含有 するＩＣ５（商標）薬剤キャリブレータ−（ベックマン・インスツルメンツ、商 標ＩＣ３試薬）をＩＣ５（Ｑ標）希釈液で１：１０．１：２０．１：３０．１　 ：４０，１　：　６０、ｌ：８０．１：１００．１：２００．１：４００．１　 ：　６００及び１　：　１０００に希釈した。

ネフェロ分析測定はＩＣ５（商標）ネフエロメーター（ベツクマン・インスツル メンツ）にＩＣ３（商標）ガラスびん（ベックマン・インスツルメンツ）に入れ た６００ＩｉｊｌＬのＩＣ３緩衝液（ベックマン・インスツルメンツ、商標ＩＣ Ｓ試薬）を置き、薬剤キャリプレークー４２μ℃、抗体溶液４２μ℃及びアビジ ン溶液４２μ氾を注入した。マニュアルモードＭ３３の装置ゲイン設定を用いた 。一時的な注入がおさまり、基線が得られた後、４２μ℃の二速共検体を添加し 計器のビークレート信号記録を開始させた。結果を第■表に示す。

第■表 １：１０　０．９６６　６６６　２５ １：２０　０．４８３　１１２３　４２．４１：３０　０．３２２　１３５３　 ５１．１１：４０　０．２４２　１４８５　５６．１１：６０　０．１６１　１ ７１０　６４．６１：８０　０．１２０　１７Ｂ７　６７．５１：１００　０． ０９６　１８９０　７１．４１：２００　０．０４８　２０５７　７７．７１： ４００　０．０２４　２２９０　８６．５１：６００　０．０１６　２４０７　 ９０．９１：１０００　０．００９６　２４５３　９２．７ブランク　２６４７ 　１００．０ 二速社′　■のＡ 二速共検体工で得られた結果を確認し、別の合成法を実証するため第２の二速共 検体を作成した。スペーサー中へ挿入する可変物としてヘキサンジアミンを用い る二速共検体ＩＩの合成を第３図に模式的に示す。二速共検体１１のＮ＝６同族 体は下記の方法で調製した。

テオフィリン−８−酪酸を無水ＤＭＦに溶解し、約７０℃に約１５分間保持し、 次いで室温に冷却するまで放置した。冷却した反応混合物に等モル量のＮＥＳを 添加し、室温で一晩中撹拌放置した６反応混合物に約３〜６モル過剰のヘキサン ジアミン（Ｈｚ　Ｎ−（ＣＨ＊　）ｓ　−ＮＨｔ　）を添加した。反応の完了は 反応混合物をＴＬＣ分析でシリカゲルを塗布したガラスＴＬＣ板及び紫外線指示 器を用いて決定した。

反応混合物は次いで減圧下で小容積になるまで蒸発させた。濃縮反応混合物を少 量のシリカゲルと混合し、熱板上で乾燥し、次いでそのシリカゲル−試料混合物 を開始溶離剤としてのクロロホルムを用いて注意深（シリカゲルカラムの頂部に 載せた。カラムはメタノールの量を変えたクロロホルムを含有する溶媒で溶出処 理した。

こう配合組成がクロロホルム中メタノール２０％に達した時カラムをメタノール ２０％、アンモニア４％、クロロホルム７６％を含有する混合液で溶出処理した 。純粋な６−（８’−テオフィリン酪酸−カルボキサミド）−ヘキシルアミンわ 含有する留分は一括して回転蒸発器中で蒸発乾固した。白黄色の結晶固体はさら に精製することな（次の反応に使用した。

等モル量の６−（８′−テオフィリン酪酸−力ルポキサミド）−ヘキシルアミン を無水ＤＭＦに溶解し、次いで対応するモル量のビオチン−ＮＨＳと混合し室温 で２４ｖｊ間撹拌放置した。所望の生成物をＤＭＦから白色の綿状固体として分 離し、ろ紙上に集め、カラムクロマトグラフィーよりＴＬＣ試験で単一スポット となるまで精製した。

二速共検体■のＮ＝５の同族体をヘキサンジアミンの代りにペンタンジアミンを 用いた以外同じ操作により調製した。これら２種の同族体のスペーサー長は第ｍ 表に示す。

第ｍ表 二速共検体ＩＩ同族体のスペーサ一部分の長さジアミン　スペース中の全原子数 　近似スペーサー長（人）Ｎ＝５　１６　２１．０ Ｎ＝６　１８　２２．０ 二速共役体工のＮ＝２同族体は二速共検体ｎのＮ＝５同族体と同等である（２１ ．０人）、二速共検体工及びＨのそれぞれＮ＝３及びＮ＝６同族体もまた同等で ある（２２．２人）。共役体■のＮ＝５同族体は共役体ＩのＮ＝２同族体同様測 定し得る複合体形成を作ることができなかった。しかしながら、二速共検体■の Ｎ＝６同族体及び二速共検体工のＮ＝３同族体からは対比し得る信号が得られた 。このことはテオフィリンとビオチンがそれぞれ第１及び第２二座体メンバーと して選定された場合、両方の二層体メンバーのそれぞれの特異結合パートナ−と の同時結合が達成されるためには少なくとも２２．２人のスペーサ一部分が必要 とされることを確認している。

他の二層体メンバー及びスペーサー基に異った原子又は原子配列を用いる他の形 式の二速共検体が本発明の範囲内にあることは予期され、それは当業者にとって 明白であろう。本発明の二層体は両方の二層体メンバーの同時結合が必要又は所 望とされる検定又は操作のどれにでも有用である。スペーサ一部分の最適長さ多 価特異結合パートナ−が用いられるネフェロ分析又はタービジティ分析を使用し て容易に決定することができる。

本発明の本質的な精神から離れることなく本発明をいくつかの形式で具体化する ことができるから、本発明は上記の記載に対照させて別記の請求の範囲により明 確にされるべきものである。

二速体を用いる阻害免疫検定方法 Ａ、ハプテンの抗血清の生成 注 ＮｎＡの感度に対するスペーサー長の効果国際調査報告　＝ｔｆｆ”Ｒ＋＋。ｃ ｃ＋ｎ＋ｉ一つｍｅｍ＄ｅ’ｗｌ　Ａｍ−ｏｌｌｅｅ　Ｎｏ、　？Ｃ’：／υＳ 　８ε１０３３７２

Claims (53)

【特許請求の範囲】
1. １．第１二座体メンバー及びそれとスペーサー基を通じて結合した第２二座体メ ンバーを有し、（ａ）該第１及び第２二座体メンバーが異つた低分子配位子であ り、（ｂ）該第１及び第２二座体メンバーのおのおのが異なった巨大分子特異結 合パートナーと特異結合し得るものであり、（ｃ）該スペーサー基が該第１及び 第２二座体メンバーのそれぞれの特異結合パートナーとの同時結合を許容するの に十分な長さである可溶性二座共役体。
2. ２．該第１二座体メンバーが関心とする被検出体と同じかその類似体である請求 項１記載の二座共役体。
3. ３．該関心とする被検出体がハプテン、．ホルモン、．ポリペプチド、オリゴヌ クレオチド及びビタミンからなる群から選ばれる請求項２記載の二座共役体。
4. ４．該関心とする被検出体が分子量約１００から１５００ダルトンのハプテンで ある請求項３記載の二座共役体。
5. ５．該ハプテンがテオフィリン、ジゴキシン、ジソピラミド、ライドカイン、プ ロカインアミド、プロパノロール、キニジン、アミカマイシン、クロラムフェニ コール、ゲンタマイシン、カナマイシン、ネチルマイシン、トブラマイシン、三 環抗うつ剤、エソスクシミド、フェノバルビタール、フェニトイン、プリミドン 、バルプロイン酸、アセトミノフェン、アセチルサリチル酸、メソトレキセート 、及びモルフィネ、コデイン、ヘロインなどの悪習薬並びにそれらの代謝生成物 、ＤＮＰ、１−置換−４−ヒドロキシ−２−ニトロベンゼン及び４−置換−２− ニトロ−トリアルキルアニリニウム塩からなる群から選ばれる請求項４記載の二 座共役体。
6. ６．該第２二座体メンバーがビオチンである請求項５記載の二座共役体。
7. ７．該第１二座体メンバーがテオフィリンであり、該第２二座体メンバーがピオ チンである請求項６記載の二座共役体。
8. ８．該スペーサー基が少なくとも約２２Åの長さである請求項７記載の二座共役 体。
9. ９．該異なった巨大分子複合異結合パートナーの両方が多価体である請求項１記 載の二座共役体。
10. １０．該第１二座体メンバーが関心とする被検出体と同じかその類似体である請 求項９記載の二座共役体。
11. １１．該関心とする被検出体がハプテン、ホルモン、ポリペプチド、オリゴヌク レオチド及びビタミンからなる群から選ばれる請求項１０記載の二座共役体。
12. １２．該関心とする被検出体が分子量約１００から１５００ダルトンのハプテン である請求項１１記載の二座共役体。
13. １３．該ハプテンがテオフィリン、ジゴキシン、ジソピラミド、ライドカイン、 プロカインアミド、プロパノロール、キニジン、アミカマイシン、クロラムフェ ニコール、ゲンタマイシン、カナマイシン、ネチルマイシン、トブラマイシン、 三環抗うつ剤、エソスクシミド、フェノバルビタール、フェニトイン、プリミド ン、パルプロイン酸、アセトミノフェン、アセチルサリチル酸、メソトレキセー ト、及びモルフィネ、コデイン、ヘロインなどの悪習薬並びにそれらの代謝生成 物、ＤＮＰ、１−置換−４−ヒドロキシ−２−ニトロベンゼン及び４−置換−２ −ニトロ−トリアルキルアニリニウム塩からなる群から選ばれる請求項１２記載 の二座共役体。
14. １４．該第２二座体メンバーがビオチンである請求項１３記載の二座共役体。
15. １５．該第１二座体メンバーがテオフィリンであり、該第２二座体メンバーがビ オチンである請求項１４記載の二座共役体。
16. １６．該スペーサー基分が少なくとも約２２Åの長さである請求項１７記載の二 座共役体。
17. １７．該異なった巨大分子特異結合パートナーの少なくとも１つが二価体である 請求項９記載の二座共役体。
18. １８．該第１二座体メンバーが関心とする被検出体と同じかその類似体である請 求項１７記載の二座共役体。
19. １９．該関心とするの被検出体がハプテン、ホルモン、ポリペプチド、オリゴヌ クレオチド及びビタミンからなる群から選ばれる請求項１８記載の二座共役体。
20. ２０．該関心とする被検出体が分子量約１００から１５００ダルトンのハプテン である請求項１９記載の二座共役体。
21. ２１．該ハプテンがテオフィリン、ジゴキシン、ジソピラミド、ライドカイン、 プロカインアミド、プロパノロール、キニジン、アミカマイシン、クロラムフェ ニコール、ゲンタマイシン、カナマイシン、ネチルマイシン、トブラマイシン、 三環抗うつ剤、エソスクシミド、フェノバルビタール、フェニトイン、プリミド ン、パルプロイン酸、アセトミノフェン、アセチルサリチル酸、メソトレキセー ト、及びモルフィネ、コデイン、ヘロインなどの悪習薬並びにそれらの代謝生成 物、ＤＮＰ、１−置換−４−ヒドロキシ−２−ニトロベンゼン及び４−置換−２ −ニトロ−トリアルキルアニリニウム塩からなる群から選ばれる請求項２０記載 の二座共役体。
22. ２２．該第２二座体メンバーがビオチンである請求項２１記載の二座共役体。
23. ２３．該第１二座体メンバーがテオフィリンであり、該第２二座体メンバーがビ オチンである請求項２２記載の二座共役体。
24. ２４．該スペーサー基が少なくとも約２２Åの長さである請求項２３記載の二座 共役体。
25. ２５．該異なった巨大分子特異結合パートナーの両方が二価体である請求項１記 載の二座共役体。
26. ２６．該第１二座体メンバーが関心とする被検出体と同じかその類似体である請 求項２５記載の二座共役体。
27. ２７．該関心とする被検出体がハプテン、ホルモン、ポリペプチド、オリゴヌク レオチド及びビタミンからなる群から選ばれる請求項２６記載の二座共役体。
28. ２８．該関心とする被検出体が分子量約１００から１５００ダルトンのハプテン である請求項２７記載の二座共役体。
29. ２９．該ハプテンがテオフィリン、ジゴキシン、ジソピラミド、ライドカイン、 プロカインアミド、プロパノロール、キニジン、アミカマイシン、クロラムフェ ニコール、ゲンタマイシン、カナマイシン、ネチルマイシン、トブラマイシン、 三環抗うつ剤、エソスクシミド、フェノバルビタール、フェニトイン、プリミド ン、バルプロイン酸、アセトミノフェン、アセチルサリチル酸、メソトレキセー ト、及びモルフィネ、コデイン、ヘロインなどの悪習薬並びにそれらの代謝生成 物、ＤＮＰ、１−置換−４−ヒドロキシ−２−ニトロベンゼン及び４−置換−２ −ニトロ−トリアルキルアニリニウム塩からなる群から選ばれる請求項２８記載 の二座共役体。
30. ３０．該ハプテンがテオフィリンである請求項２９記載の二座共役体。
31. ３１．関心とする被検出体の抗体及び請求項４記載の二座共役体からなるタービ ジティ分析又はネフェロ分析阻害免疫検定法操作に使用する試薬。
32. ３２．該二座共役体が請求項５記載の二座共役体である請求項３１記載の試薬。
33. ３３．該二座共役体が請求項１２記載の二座共役体である請求項３１記載の試薬 。
34. ３４．該二座共役体が請求項１３記載の二座共役体である請求項３３記載の試薬 。
35. ３５．該二座共役体が請求項２０記載の二座共役体である請求項３１記載の試薬 。
36. ３６．該二座共役体が請求項２１記載の二座共役体である請求項３５記載の試薬 。
37. ３７．該二座共役体が請求項２８記載の二座共役体である請求項３１記載の試薬 。
38. ３８．該二座共役体が請求項２９記載の二座共役体である請求項３７記載の試薬 。
39. ３９．該二座共役体が請求項６記載の二座共役体であり、該試薬がさらにアビジ ンを含んでなる請求項３１記載の試薬。
40. ４０．該二座共役体が請求項１４記載の二座共役体である請求項３９記載の試薬 。
41. ４１．該二座共役体が請求項２２記載の二座共役体である請求項４０記載の試薬 。
42. ４２．該二座共役体が請求項２３記載の二座共役体であり、該試薬がさらに抗− テオフィリン抗体を含んでなる請求項４１記載の試薬。
43. ４３．該二座共役体が請求項２４記載の二座共役体である請求項４２記載の試薬 。
44. ４４．（ａ）関心とする被検出体を含有又は含有しない試験試料を、請求項１１ 記載の二座共役体、該関心とする被検出体の多価巨大分子特異結合パートナー、 及び該第２二座体メンバーの多価巨大分子特異結合パートナーと接触させ、（ｂ ）複合体形成を検出して該試験試料中の該被検出体の存在を分析することからな る阻害免疫検定方法。
45. ４５．該二座共役体が請求項１９記載の二座共役体であり、該多価巨大分子特異 結合パートナーの少なくとも１つが二価体である請求項４４記載の方法。
46. ４６．該二座共役体が請求項２７記載の二座共役体であり、該多価巨大分子特異 結合パートナーの両方が二価体である請求項４５記載の方法。
47. ４７．該二座共役体が請求項２０記載の二座共役体であり、該多価巨大分子特異 結合パートナーの１つが抗体である請求項４４記載の方法。
48. ４８．該二座共役体が請求項２１記載の二座体である請求項４７記載の方法。
49. ４９．該二座共役体が請求項２８記載の二座共役体である請求項４４記載の方法 。
50. ５０．該二座共役体が請求項２９記載の二座共役体である請求項４９記載の方法 。
51. ５１．該二座共役体が請求項２２記載の二座共役体であり、該多価巨大分子特異 結合パートナーの１つが抗体であり、該多価巨大分子特異結合パートナーの１つ がアビジンである請求項４４記載の方法。
52. ５２．該二座共役体が請求項２３記載の二座共役体であり、該抗体が抗テオフィ リン抗体である請求項５１記載の方法。
53. ５３．該二座共役体が請求項２４記載の二座共役体である請求項５２記載の方法 。