【発明の詳細な説明】
ヒトＴ（２；５）リンパ腫に存在する特異的融合核酸及び
タンパク質、それらの検出方法及び用途
本発明で行われた研究の一部は、米国立衛生研究所（National Institute of
Health）及び米国立がん研究所（National Cancer Institute）,Grant No.K08CA
01702,P01CA20180,P30CA21765の認可により政府資金の使用でなされた。発明の分野
本発明はがん診断及び療法の分野に関する。特に、本発明はヒトｔ（２；５）
陽性リンパ腫の検出及び治療方法に関する。発明の背景
大細胞リンパ腫は、子供及び若年者におけるすべての非ホジキンリンパ腫の約
１／４を占める。これら腫瘍の約１／３はｔ（２；５）（ｐ２３；ｑ３５）染色
体転座を有し(H.Stein及びF.Dallenbach,in Neoplastic Hematopathology,D.M.K
nowles,Ed.(Williams & Wilkins,Baltimore,pp.675-714(1992))、これら染色体
上における細胞がん原遺伝子の再配列がリンパ腫発生の一因であることを示唆し
ている。ｔ（２；５）を有するリンパ腫は典型的にはリンパ節、皮膚、肺臓、軟
組織、骨及び胃腸管と関係があり、主に活性化Ｔリンパ球から生じる（Y.Kaneko
ら,Blood,73:806（1989）;M.M,Le Beau ら,Leukemia,3:866（1989）;R.Rimokhら
,Br.J.Haematol,71:31(1989)；D.Y.Mason ら,Br.J.Haematol.,74:161(1990)；M.
A.Bitter Am,J.Surg.Pathol.,14:305(1990)；M.E.Kadin,J.Clin.Oncol.,9;533（
1991）；J.P.Greer ら,J.Clin.Oncol.,9:539(1991)；V.Vecchiら,Med.Pediatr.O
ncol.,21:402(1993)）。悪性細胞はＩＬ‐２レセプター及びＣＤ３０（Ｋｉ‐１
）抗原、腫瘍壊死因子リガンドファミリーの新たに記載されたメ
ンバー用のレセプターを発現する（H.Durkopら,Cell,68:421(1992)；C.A.Smith
ら,Cell,73:1349(1993)）。最新のキール（Kiel）リンパ腫分類によると、ｔ（
２；５）を有するほとんどの腫瘍は退生大細胞非ホジキンリンパ腫として分類さ
れる(A.G.Stansfeldら,Lancet,1:292(1988))。
染色体異常は悪性疾患にしばしば伴う。いくつかの場合に、発がん性質のある
タンパク質についてコードする融合遺伝子を生じる特異的染色体転座が特徴付け
られている(Sawyersら,Cell,64:337-350(1991))。特異的ｔ（２；５）転座はヒ
ト退生大細胞非ホジキンリンパ腫の顕著な特徴である。発明の要旨
ヒトｔ（２；５）リンパ腫で起きるｔ（２；５）（ｐ２３；ｑ３５）染色体転
座現象で再配列されたヒト核酸配列のクローニング及び配列決定について本明細
書では開示されている。その再配列では、染色体５ｑ３５上にある核小体リンタ
ンパク質遺伝子（ＮＰＭ遺伝子）からの配列を、染色体２ｑ２３上にあるこれま
で未同定のタンパク質チロシンキナーゼ遺伝子（以下、ＡＬＫ遺伝子）からの配
列に運ぶことがわかった。融合遺伝子及び融合タンパク質（以下、各々ＮＰＭ／
ＡＬＫ融合遺伝子又はタンパク質）の配列も開示されている。
同定されたＮＰＭ／ＡＬＫ融合遺伝子の配列を利用して、本発明では：
サンプルを２種の核酸増幅プライマーと接触させる（第一核酸増幅プライマー
はＮＰＭについてコードする核酸配列又はその相補配列とハイブリッド形成する
ことができ、第二核酸増幅プライマーはＡＬＫについてコードする核酸配列又は
その相補配列とハイブリッド形成することができる）；
２種のプライマーとハイブリッド形成する、サンプル中のプライム化配列を増
幅させる；及び
ＮＰＭ／ＡＬＫ融合体を含有した、サンプル中の増幅核酸配列の存在を検出す
る；
ステップからなる、ＮＰＭ／ＡＬＫ融合配列を含む、サンプル中の核酸配列の存
在を同定する方法を提供する。
本発明は：
サンプルを２種の核酸プローブと接触させる（第一核酸プローブはＮＰＭにつ
いてコードする核酸配列とハイブリッド形成することができ、第二核酸プローブ
はＡＬＫについてコードする核酸配列とハイブリッド形成することができる）；
及び
第一及び第二核酸プローブ双方とハイブリッド形成する、サンプル中の核酸配
列の存在を検出する；
ステップからなる、ＮＰＭ／ＡＬＫ融合体を含む、サンプル中の核酸配列の存在
を同定する代替方法を提供する。
一方、ＮＰＭ／ＡＬＫ融合ジャンクションにわたる単一核酸プローブも、２つ
の別々のプローブの代わりに用いることができる。
本発明は抗体検出系に基づくＮＰＭ／ＡＬＫ融合体の存在を検出する方法も更
に提供する。特に、ＮＰＭ／ＡＬＫ融合タンパク質はｔ（２；５）リンパ腫細胞
で発現されるため、融合タンパク質を同定する抗体はＮＰＭ／ＡＬＫ融合タンパ
ク質の存在を検出するために使用できる。例えば、ＮＰＭ／ＡＬＫ融合タンパク
質は：
サンプルを２種の抗体と接触させる（第一抗体はＮＰＭと結合することができ
、第二抗体はＡＬＫと結合することができる）；及び
第一及び第二抗体双方と結合する、サンプル中のタンパク質の存在を検出する
；ことにより検出できる。
加えて、ＮＰＭ／ＡＬＫ融合で作られる融合タンパク質の性質のために、その
融合タンパク質と選択的に結合する単一抗体がＮＰＭ／ＡＬＫ融合体を同定する
上で作製及び使用できる。
本発明は上記検出方法で用いられる試薬を含有した１以上の容器をきっちりと
収納した区画化キットを更に提供する。図面の簡単な説明
図１（パネルＡ‐Ｃ）：（Ａ）核型上正常なエプスタイン‐バールウイルス不
死化ヒトリンパ球細胞系（コントロール、列１、４及び７）、ｔ（２；５）陽性
細胞系ＳＵ‐ＤＨＬ‐１（列２、５及び８）及びＳＵＰ‐Ｍ２（列３、６及び９
）から作製されたＤＮＡとｐ１６‐３／１．３Ｓプローブとのサザンブロット分
析。矢じりは再配列制限断片を示す。（Ｂ）ｔ（２；５）陰性Ｂリンパ様（ＮＡ
ＬＭ‐６、列２）、Ｔリンパ様（ＭＯＬＴ４、列１；ＣＥＭ、列３）及び横紋菌
肉腫（Ｒｈ３０、列７）形質転換細胞系並びにｔ（２；５）陽性系ＳＵ‐ＤＨＬ
‐１、ＳＵＰ‐Ｍ２及びＵＣＯＮＮ‐Ｌ２（列４‐６）からのＲＮＡと５′ＮＰ
Ｍ ｃＤＮＡ断片（最上パネル）及びＮＰＭ‐ＡＬＫ ｃＤＮＡ（ｐＳ１．２）
の３′断片（最下パネル）とのノーザンブロット分析（ｐＳ１．２とハイブリッ
ド形成したｔ（２；５）陽性細胞系ＲＮＡで明白な薄い約４ｋｂバンドは、この
プローブと２８ＳリボソームＲＮＡとの交差ハイブリッド形成を表す；このよう
なバンドはポリ（Ａ）＋ＲＮＡのハイブリッド形成では明白でなかった）。全Ｒ
ＮＡ ２０μｇが各サンプル列にのせられたが、但しＲｈ３０（ポリ（Ａ）＋８
μｇ）である。（Ｃ）３′ＮＰＭ‐ＡＬＫ ｃＤＮＡプローブ（ｐＳ１．２）に
よる様々な成人及び胎児組織からのＲＮＡ〔各列ポリ（Ａ）＋２μｇ；クロンテ
ック(Clontech),San Diego,CA〕の分析。白丸、６．５ｋｂ ＡＬＫ転写物；黒
円、８．０ｋｂ転写物；白四角、４．４ｋｂ転写物；矢じり、６．０ｋｂ転写物
。β‐アクチンｃＤＮＡプローブで得られたハイブリッド形成結果は下のパネル
で示されている。ｐＳ１．２とハイブリッド形成したパネルは６日間オートラジ
オグラフィー照射を表し、β‐アクチンハイブリッド形成は４時間照射された。
図２（パネルＡ‐Ｃ）：（Ａ）ＮＰＭ‐ＡＬＫ及び（Ｂ）融合ジャンクション
にすぐ隣接するＡＬＫの部分の演繹アミノ酸配列と、及び（Ｃ）ＡＬＫの触媒ド
メインとインスリンレセプターサブファミリーの他のチロシンキナーゼとの相同
性比較。パネルＡにおいて、黒丸は可能なタンパク質キナーゼＣリン酸化部位；
点下線は潜在的金属結合ドメイン；矢印はＡＬＫ触媒ドメインの境界；星印は共
通ＡＴＰ認識配列の保存残基及びＡＴＰ結合リジン残基；実下線はチロシンキナ
ーゼに特異的な共通配列について示す。パネルＢにおいて、矢印はＮＰＭ‐ＡＬ
Ｋ融合が起きる正常ＡＬＫ中の位置；ボックスは推定経膜ドメインを含んだ残基
（１．５以上の疎水性）について示す。パネルＣでは、チロシンキナーゼ触媒ド
メインのアミノ酸残基が並べられ、ギャップはダッシュで示されている。陰影ボ
ックスはＡＬＫのアミノ酸と同一である関連チロシンキナーゼ中の残基を示す。
すべての配列は７１ｅｓ(Drosophila melanogaster Sevenless)を除いてヒトタ
ンパク質に関するものである(J.J.Krolewskiら,EMBO J.,10:2911(1991)；H.Toyo
shima ら,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,90:5404(1993)；D.Martin-Zancaら,Natur
e,319:743（1986）；H.Matsushimeら,Mol.Cell.Biol.,6:3000(1986)；J.M.Chen
ら,Oncogene,6:257（1991）;K.Baslerら,Cell,54:299(1988)；D.D.Bowtell ら,G
enes and Development,2:620(1988)；A.Ullrich ら,EMBO J.,5;2503（1986）;A.
Ullrich ら,Nature,313:756(1985); Y.Ebina ら,Cell,40:747(1985))。
図３（パネルＡ‐Ｃ）：（Ａ）ＮＰＭ‐ＡＬＫ及びＮＰＭ ＲＮＡ‐ＰＣＲ産
物のサザンブロット分析。ｔ（２；５）陽性細胞系（ＳＵ‐ＤＨＬ‐１、ＳＵＰ
‐Ｍ２及びＵＣＯＮＮ‐Ｌ２；列３‐５）と診断サンプル（Ｐｔ．１‐４；列６
‐９）からの全ＲＮＡ（１μｇ）が分析された；加えて、転座を欠くが正常ＡＬ
Ｋを発現するｔ（２；５）陰性Ｂ及びＴリンパ様白血病細胞系（各々ＮＡＬＭ‐
６及びＣＥＭ；列１、２）とＲｈ３０横紋菌肉腫細胞系（列１０）からのＲＮＡ
は陰性コントロールとして含め、同様にＲＮＡのないブランク（列１１）も含め
た。（Ｂ）ＮＰＭ‐ＡＬＫ ＲＮＡ‐ＰＣＲ産物のヌクレオチド配列。単下線は
増幅に用いられるプライマーに相同的（５′末端）又は相補的（３′末端）な配
列；二重下線はサザンハイブリッド形成用のプローブとして用いられる検出オリ
ゴヌクレオチドに相同的な配列；垂直線はＮＰＭ及びＡＬＫ間の融合ジャンクシ
ョンについて示す。（Ｃ）正常ＮＰＭ、ＮＰＭ‐ＡＬＫ融合遺伝子及び正常ＡＬ
Ｋによりコードされるタンパク質の概略図。矢印はＮＰＭ‐ＡＬＫ融合ジャンク
ションの位置とＮＰＭ及びＡＬＫでの対応位置；ＭＢは潜在的金属結合ドメイン
；ＡＣは酸性アミノ酸クラスター；Ｎは核局在化シグナル；Ｔｍは正常ＡＬＫの
推定経膜ドメインの位置について示す。ＮＰＭリン酸化部位も示されている（黒
丸、タンパク質キナーゼＣ；白丸、核小体タイプIIキナーゼ；星印、ｃｄｃ２キ
ナーゼ）。ＮＰＭアミノ末端における２つのタンパク質キナーゼＣリン酸化部位
だけが可能性のある部位である；すべての他の部位はインビトロ又はインビボで
証明されている(M.Peterら,Cell,60:791(1990)；P.K.Chanら,Biochem.J.,270:54
9(1990)；R.Beckmannら,Eur.J.Biochem.,210:45(1992))。十分に特徴付けられて
いないＡＬＫの一部は点線内に示されている。発明の具体的な説明
本発明は、ヒトｔ（２；５）リンパ腫に伴う転座現象の結果として存在する核
酸配列（以下、ＮＰＭ／ＡＬＫ融合遺伝子）の同定、染色体２ｐ２３上の新規タ
ンパク質チロシンキナーゼ遺伝子（以下、ＡＬＫ遺伝子及びタンパク質）の同定
、ｔ（２；５）リンパ腫細胞中に存在する核小体リンタンパク質遺伝子（以下、
ＮＰＭ）及びＡＬＫ遺伝子の融合体を含んだｍＲＮＡの同定と、新規融合タンパ
ク質産物（以下、ＮＰＭ／ＡＬＫ融合タンパク質）についてコードするＮＰＭ／
ＡＬＫ融合ｍＲＮＡ内にあるオープン読取枠の同定に基づいている。
これらの観察に基づいて、本発明の一態様では、部分的ＡＬＫタンパク質につ
いてコードする単離された核酸配列（Ｓｅｑ．ＩＤ Ｎｏ．１）、ＮＰＭ／ＡＬ
Ｋ融合タンパク質についてコードする単離された核酸配列（Ｓｅｑ．ＩＤ Ｎｏ
．２）、単離された部分的ＡＬＫタンパク質（Ｓｅｑ．ＩＤ Ｎｏ．３）及び単
離
されたＡＬＫ／ＮＰＭ融合タンパク質（Ｓｅｑ．ＩＤ Ｎｏ．４）を提供する。
特に、ＡＬＫタンパク質の部分的アミノ酸配列は図２ｂ及びｃ（Ｓｅｑ．ＩＤ
Ｎｏ．３）で示され、ＡＬＫについてコードする部分的核酸配列はＳｅｑ．Ｉ
Ｄ Ｎｏ．１で示され、ＮＰＭ／ＡＬＫ融合タンパク質のアミノ酸配列は図２ａ
（Ｓｅｑ．ＩＤ Ｎｏ．２）で示され、ＮＰＭ／ＡＬＫ融合ジャンクションのア
ミノ酸配列は図３ｂ（Ｓｅｑ．ＩＤ Ｎｏ．７）で示され、ＮＰＭ／ＡＬＫ融合
ジャンクションについてコードする核酸配列は図３ｂ（Ｓｅｑ．ＩＤ Ｎｏ．４
）で示されている。ＡＬＫ ｃＤＮＡを含むクローンはブダペスト条約の規則に
従いＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ６９４９７と付された。
本発明のいずれかの核酸配列を適切なベクター中に挿入することにより、当業
者は多量の特異的配列を容易に産生することができる。一方、本発明の核酸配列
は本発明のアミノ酸配列を産生するために発現ベクター中に挿入することができ
る。
核酸配列の増殖及び／又は発現タンパク質の産生に利用しうる宿主／ベクター
系は多数ある。これらにはプラスミド及びウイルスベクターと原核及び真核宿主
があるが、それらに制限されない。当業者であれば、異種ＤＮＡを増殖又は発現
して本発明の配列を産生又は発現させうる宿主／ベクター系に容易に改変するこ
とができる。
例１において、本発明はＮＰＭ／ＡＬＫ融合配列を含む核酸配列がｔ（２；５
）リンパ腫を有する患者に存在するという証拠を提示している。この観察に基づ
き、本発明ではサンプル中におけるＮＰＭ／ＡＬＫ融合体含有核酸配列の存在に
ついてのアッセイ方法を提供し、こうしてｔ（２；５）リンパ腫の検出用アッセ
イを提供する。
ＮＰＭ／ＡＬＫ融合体を検出するために用いられる本発明のアッセイ方法の一
例は、ＮＰＭ／ＡＬＫ融合タンパク質についてコードする核酸配列を含有したサ
ンプル内における配列の優先的増殖に基づいている。
一般的に、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）のような増幅反応は、ＮＰＭ／ＡＬ
Ｋ融合タンパク質についてコードするｍＲＮＡ又はｔ（２；５）転座を含むゲノ
ムＤＮＡを増幅させるために用いられる。特に、同定された融合遺伝子の配列を
利用して、本発明では：
サンプルを２種の核酸増幅プライマーと接触させる（第一核酸増幅プライマー
はＮＰＭについてコードする核酸配列又はその相補配列とハイブリッド形成する
ことができ、第二核酸増幅プライマーはＡＬＫについてコードする核酸配列又は
その相補配列とハイブリッド形成することができる）；
プライム化核酸配列をサンプルで増幅させる；及び
ＮＰＭ／ＡＬＫ融合配列を含むサンプル中の増幅核酸配列の存在を検出する；
ステップからなる、ＮＰＭ／ＡＬＫ融合配列を含むサンプル中の核酸配列の存在
を同定する方法を提供する。
本発明で用いられる増幅プライマーとは、標的配列とハイブリッド形成して、
適切な条件下で適切な試薬と共にインキュベートされたときにその標的配列を増
幅させることができる、いずれかの短いＤＮＡ配列である。例えば、Ausubel ら
,Current Protocols in Molecular Biology,Wiley Press（1993）参照。増幅に
は増幅させるべき領域に隣接する２種のプライマーの使用を要する。一方のプラ
イマーは標的配列とハイブリッド形成し、他方のプライマーは標的配列と相補的
な配列とハイブリッド形成する。
本発明において、一方の増幅プライマーはＮＰＭ遺伝子の配列から誘導され、
第二プライマーはＡＬＫ遺伝子の配列から誘導される。ＮＰＭ又はＡＬＫ遺伝子
配列のいかなる断片も、選択される配列の断片がＮＰＭ／ＡＬＫ融合遺伝子に存
在するかぎり、適切な増幅プライマーを作るために使用できる。例１において、
Ｓｅｑ．ＩＤ Ｎｏ．５と、Ｓｅｑ．ＩＤ Ｎｏ．６の逆相補配列がプライマー
として選択された。当業者であれば、ＮＰＭ及びＡＬＫ遺伝子の他の断片も同様
の結果を得るためにプライマーとして使用できることを容易に認識するであろう
。
増幅させるべき標的配列は、ＮＰＭ／ＡＬＫ融合タンパク質についてコードす
るｍＲＮＡでもよく、又はｔ（２；５）転座を含むゲノムＤＮＡであってもよい
。熟練者であれば、適切な標的分子を含有したサンプルを作製するために当業界
で知られる技術を容易に用いることができる。
本発明で用いられる増幅プライマーは、そのプライマーが適切な条件下で標的
配列と水素結合を形成できるならば、核酸配列とハイブリッド形成できると言わ
れる。一般的に、好ましい条件は高度緊縮条件であるとして特徴付けられる。熟
練者であれば、他で記載された方法に従い適切な条件を容易に決定することがで
きる（PCR Protocols,Cold Spring Harbor Press(1991),Priviteraら,Blood,79:
1781(1992)）。
本発明で用いられる増幅とは、標的配列の多数コピーを作るプロセスに関する
。様々な方法及び酵素がこの目標を達成するために利用できる。好ましい態様に
おいて、Ｔａｑ‐１ ＤＮＡポリメラーゼが標的配列を増幅させるためにＰＣＲ
として知られる方法で用いられる（例１参照）。しかしながら、熟練者であれば
増幅目標が達成されるかぎりＴａｑ‐１ポリメラーゼの代わりに他の酵素を用い
ることができる。
本発明で用いられる増幅標的配列の検出とは、所定サイズの増幅核酸配列又は
又は特定配列の存在又は不在について調べるために使用できるいずれかの方法に
関する。１つの適用において、増幅産物は増幅サンプル中に存在する様々なサイ
ズの核酸を分割するためにアガロース又はアクリルアミドゲル電気泳動に付され
る。次いで得られたゲルは、適切なサイズの核酸分子が増幅サンプル中に存在し
ているかどうかを調べるために、核酸染色剤、例えばエチジウムブロミドを用い
て視覚的に分析できる。
一方、検出できるように標識されたプローブも、サンプルが増幅配列を含有し
ているかどうかを調べるために使用できる（例１参照）。このようなプローブは
上記電気泳動に従い用いても、あるいはドットブロット又はその場でのアッセイ
法に用いてもよい。ＮＰＭ／ＡＬＫ融合遺伝子上における検出プローブベースの
形成については、以下で詳細に記載されている。
標的配列の増幅に依存した方法に加えて、本発明では配列増幅を要しないＮＰ
Ｍ／ＡＬＫ融合体を含む核酸を同定するための方法も更に提供する。特に、サザ
ン及びノーザンブロットハイブリッド形成の公知方法が、サンプルがＮＰＭ／Ａ
ＬＫ核酸融合配列を含有しているかどうかを調べるために使用できる（Sambrook
ら,Molecular Cloning ed.,Spring Harbor Press(1989)）。詳しくは、このよう
な融合体は：
サンプルを２種の核酸プローブと接触させる（第一核酸プローブはＮＰＭにつ
いてコードする核酸配列とハイブリッド形成することができ、第二核酸プローブ
はＡＬＫについてコードする核酸配列とハイブリッド形成することができる）；
及び
第一及び第二核酸プローブ双方とハイブリッド形成するサンプル中の核酸配列
の存在を検出する；
ことにより検出できる。
本発明の核酸プローブにはＤＮＡとＲＮＡプローブを含み、このようなプロー
ブは当業界で知られる技術を用いて作られる（Sambrookら,Molecular Cloning e
d.,Spring Harbor Press(1989)）。熟練者は、プローブとして本明細書で記載さ
れたＮＰＭ及びＡＬＫ遺伝子配列又はそれらの断片を用いて、このような公知技
術を用いることができる。
上記方法のもう１つの適用において、２つの別々なプローブとは反対に、ＮＰ
Ｍ／ＡＬＫ融合体の融合領域にわたる単一核酸プローブが、サザン又はノーザン
アッセイ系で用いられる。
特に、このような方法は：
サンプルを単一核酸プローブと接触させる（核酸プローブはＮＰＭ／ＡＬＫ融
合遺伝子の融合ジャンクションとハイブリッド形成することができる）；及び
核酸プローブとハイブリッド形成するサンプル中の核酸配列の存在を検出する
ステップからなる。
一方、ＡＬＫ、ＮＰＭ又はＮＰＭ／ＡＬＫ融合配列のいずれかに基づく単一プ
ローブも考えられる。このようなプローブはＮＰＭ又はＡＬＫの制限酵素断片に
相当しており、そのサイズは再配列の結果として異なる（制限断片多型、ＲＦＬ
Ｐ分析）。
当業界で知られるいかなる方法も、上記アッセイ法で用いられるプローブを標
識するために利用できる。２プローブ態様において、第一及び第二プローブは異
なるラジオアイソトープ、酵素又は発色団で標識できる。異なる標識プローブを
用いて、一方又は双方のプローブと結合するＤＮＡ配列を同定することができる
。もう１つの適用では、第一及び第二プローブは、それらのプローブが同一の核
酸断片とハイブリッド形成するとシグナルが発せられるように標識できる。この
ような操作は米国特許第４，８２０，６３０号明細書で記載されている。
上記方法の１適用において、一方の核酸プローブは固体支持体に固定される。
このような固体支持体の例には、ポリカーボネートのようなプラスチック、アガ
ロース及びセファロースのような複合炭水化物と、ポリアクリルアミド及びラテ
ックスビーズのようなアクリル樹脂があるが、それらに制限されない。核酸プロ
ーブをこのような固体支持体にカップリングさせる技術は当業界で周知である。
本発明の検出方法で用いられるサンプルには細胞又は組織、タンパク質、膜あ
るいは細胞又は組織の核酸抽出物と、血液、血清及び血漿のような生物学的流体
があるが、それらに制限されない。上記方法で用いられるサンプルは、アッセイ
フォーマット、検出方法の性質と、サンプルとして用いられる組織、細胞又は抽
出物に基づいて変わる。タンパク質抽出物、膜抽出物又は細胞の核酸抽出物の作
製方法は当業界で周知であり、利用される方法と適合するサンプルを得るため容
易に改変することができる。
本発明で利用されるサンプルの１つの好ましいタイプは、単離されたリンパ腫
細胞から誘導される。このような細胞は適切な抽出物を作製するために使用して
も、又はその場での分析に基づく操作に用いてもよい。その場での分析の例は蛍
光現場ハイブリッド形成（ＦＩＳＨ）と称され、例１と Selleriら,PNAS,88:887
-891(1991)及び Tkachukら,Science,250:559-562(1990)で詳細に記載されている
。
本発明は、特異的抗原と選択的に結合する抗体の能力に依存したＮＰＭ／ＡＬ
Ｋ融合体の検出方法も更に提供する。
一態様において、ＮＰＭ／ＡＬＫ融合タンパク質は２組の抗体を用いて検出さ
れ、１組はＮＰＭタンパク質と結合できる抗体からなり、他の組はＡＬＫタンパ
ク質と結合できる抗体からなる。
特に、このような方法は：
サンプルを２種の抗体と接触させる（第一抗体はＮＰＭと結合することができ
、第二抗体はＡＬＫと結合することができる）；及び
第一及び第二抗体双方と結合するサンプル中のタンパク質の存在を検出する；
ステップからなる。
上記方法で利用される抗体は、モノクローナル又はポリクローナル抗体と、こ
れら抗体の断片である。一般的に、モノクローナル抗体の作製技術は当業界で周
知である（Campbell,A.M.,′Monoclonal Antibody Technology: Laboratory Tec
hniques in Biochemistry and Molecular Biology″,Elsevier Science Publish
ers,Amsterdam,The Netherlands（1984）；St.Grothら,J.Immunol.Methods,35:1
-21(1980)）。例えば、ＮＰＭ又はＡＬＫタンパク質と結合できる
抗体は、配列がＮＰＭ／ＡＬＫ融合タンパク質中に存在するＮＰＭ又はＡＬＫタ
ンパク質の領域から得られるポリペプチドで動物を免疫することにより作製でき
る。
抗体を産生することが知られているいかなる動物（マウス、ウサギ等）も、望
ましい特異性のある抗体を産生するために利用できる。免疫方法は当業界で周知
である。このような方法にはポリペプチドの皮下又は腹腔内注射がある。当業者
であれば、免疫に用いられるポリペプチドの量が免疫される動物、選択されたポ
リペプチドの抗原性及び注射の部位に基づき変わることを認識するであろう。ポ
リペプチドは、ペプチド抗原性を増加させるために、修飾しても又はアジュバン
トで投与してもよい。ポリペプチドの抗原性を増加させる方法は当業界で周知で
ある。このような操作には、抗原を異種タンパク質（例えばグロブリン又はβ‐
ガラクトシダーゼ）とカップリングさせること、又は免疫中アジュバントの含有
がある。 モノクローナル抗体を作る場合、免疫動物から脾臓細胞が摘出され、
ＳＰ２／０‐Ａｇ１４ミエローマ細胞のようなミエローマ細胞と融合されて、ハ
イブリドーマ細胞産生モノクローナル抗体とされる。
当業界で周知ないくつかの方法のうちいずれか１つが、望ましい特性のある抗
体を産生するハイブリドーマ細胞を同定するために使用できる。これらにはＥＬ
ＩＳＡアッセイ、ウェスタンブロット分析又はラジオイムノアッセイによるハイ
ブリドーマのスクリーニングがある（Lutzら,Exp.Cell Res.,175:109-124(1988)
）。
望ましい抗体を分泌するハイブリドーマがクローニングされ、クラス及びサブ
クラスが当業界で公知の操作を用いて決定される（Campbell,A.M.,Monoclonal A
ntibody Technology: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular
Biology,Elsevier Science Publishers,Amsterdam,The Netherlands(1984)）。
ポリクローナル抗体の場合、抗体含有抗血清が免疫動物から単離され、上記操
作の１つを用いて望ましい特異性のある抗体の存在についてスクリーニングされ
る。
試験サンプルと共に抗体をインキュベートするための条件は様々である。イン
キュベート条件は、アッセイに用いられるフォーマット、用いられる検出方法、
試験サンプルの性質と、アッセイに用いられる抗体のタイプ及び性質に依存して
いる。当業者であれば、一般に利用できる免疫学的アッセイフォーマット（例え
ば、ラジオイムノアッセイ、酵素結合イムノソルベントアッセイ、拡散ベースの
オクタロニー又はロケット免疫蛍光アッセイ）のうちいずれか１つが本発明の抗
体を用いるため容易に改変できることを認識するであろう。このようなアッセイ
の例は、Chard,T.,″An Introduction to Radioimmunoassay and Related Techn
iques″,Elsevier Science Publishers,Amsterdam,The Netherlands（1986）;Bu
llock,G.R.ら,″Techniques in Immunocytochemistry″,Academic Press,Orland
o,FL,Vol.1(1982),Vol.2(1983),Vol.3(1985)；Tijssen,P.,″Practice and Theo
ry of Enzyme Immunoassays: Laboratory Techniques in Biochemistry and Mol
ecular Biology″,Elsevier Science Publishers,Amsterdam,The Netherlands(1
986)でみられる。
上記方法の一態様において、抗ＮＰＭ抗体又は抗ＡＬＫ抗体が固体支持体上に
固定される。このような固体支持体の例には、ポリカーボネートのようなプラス
チック、アガロース及びセファロースのような複合炭水化物と、ポリアクリルア
ミド及びラテックスビーズのようなアクリル樹脂があるが、それらに制限されな
い。抗体をこのような固体支持体にカップリングさせる技術は当業界で周知であ
る(Weir,D.M.ら,″Handbook of Experimental lmmunology″,4th Ed.,Blackwell
Scientific Publications,Oxford,England,Chapter 10(1986),Jacoby,W.D．ら,
Meth.Enzym.,34,Academic Press,N.Y.(1974))。
加えて、上記方法で用いられる抗体の１種以上は使用前に検出可能に標識する
ことができる。抗体はラジオアイソトープ、親和性標識（例えば、ビオチン、ア
ビジン等）、酵素標識（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスフ
ァターゼ等）、蛍光標識（例えば、ＦＩＴＣ又はローダミン等）、常磁性原子等
の使用で検出可能に標識することができる。このような標識を行うための操作は
当業界で周知であり、例えばSternberger,L.A.ら,J.Histochem.Cytochem.,18:31
5（1970）;Bayer,E.A.ら,Meth.Enzym.,62:308（1979）;Engval,E．ら,Imnunol.,
109:129（1972）；Goding,J.W.,J.Immunol.Meth.,13:215(1976)参照。
上記方法のもう１つの例において、抗体は２種の抗体が同一の分子と結合する
ときにシグナルが発せられるように標識される。１つのこのような系は米国特許
第４，６６３，２７８号明細書で記載されている。
抗体ベース検出系のもう１つの態様では、ＮＰＭ／ＡＬＫ融合タンパク質の融
合ジャンクションに存在するが、非融合ＮＰＭ又はＡＬＫタンパク質に存在しな
いエピトープと結合することができる単一抗体が用いられる。ＮＰＭ／ＡＬＫ融
合タンパク質の融合ジャンクションは図３ｂに記載されている。熟練者であれば
、上記抗体作製方法で有用なペプチド抗原を作るために、融合ジャンクションの
アミノ酸配列を容易に用いることができる。
上記アッセイ方法（核酸及びタンパク質ベース双方）で用いられる物質はキッ
トの製造に申し分なく適している。例えば、増幅ベース検出系の場合、本発明で
は：
（ａ）本発明の増幅プライマーの１種以上を含有した第一容器；及び
（ｂ）下記のうち１種以上を含有した１以上の他の容器：サンプルリザーバー、
増幅試薬、洗浄試薬及び検出試薬；
からなる１以上の容器をきっちりと収納した区画化キットを提供する。
抗体ベース検出系の場合、本発明では：
ａ）ＮＰＭと結合できる抗体を含有した第一容器；
ｂ）ＡＬＫと結合できる抗体を含有した第二容器；及び
ｃ）下記のうち１種以上を含有した１以上の他の容器：洗浄試薬、及び第一及び
第二容器からの結合抗体の存在を検出できる試薬；
からなる１以上の容器をきっちりと収納した区画化キットを提供する。
本発明では：
ａ）ＮＰＭ／ＡＬＫ融合タンパク質の融合ジャンクションに存在するが、２種の
非融合タンパク質のいずれにも存在しないエピトープと結合することができる抗
体を含有した第一容器；及び
ｂ）下記のうち１種以上を含有した１以上の他の容器：洗浄試薬、及び第一容器
からの結合抗体の存在を検出できる試薬；
からなる１以上の容器をきっちりと収納した区画化キットを更に提供する。
詳しくは、区画化キットには試薬が別々の容器に入れられたあらゆるキットが
ある。このような容器には小さなガラス容器、プラスチック容器、あるいはプラ
スチック又は紙のストリップがある。このような容器によれば、サンプル及び試
薬が交差汚染されず、各容器の薬剤又は溶液が区画毎に定量的に添加できるよう
に、区画毎に効率的に試薬を移すことができる。このような容器には、試験サン
プルを入れる容器、アッセイで用いられる抗体又はプローブを含む容器、洗浄試
薬（例えば、リン酸緩衝液、トリス緩衝液等）を含む容器と、結合抗体又はハイ
ブリット化プローブを検出するために用いられる試薬を含む容器がある。
核酸プローブの場合、検出試薬の例には放射性標識プローブ、酵素標識プロー
ブ（西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ）及び親和性標識プ
ローブ（ビオチン、アビジン又はストレプトアビジン）があるが、それらに制限
されない。抗体の場合、検出試薬の例には標識第二抗体、あるいは代わりに第一
抗体が標識されているならば、その標識抗体と反応できる発色、酵素又は抗体結
合試薬があるが、それらに制限されない。当業者であれば、本発明で記載された
抗体及び核酸プローブが当業界で周知の確立されたキットフォーマットの１つの
中に容易に配合できることを容易に認識するであろう。
本発明にはＮＰＭ／ＡＬＫ融合タンパク質を発現する細胞を選択的に殺す方法
も更に含む。詳しくは、このような方法ではＮＰＭ／ＡＬＫ融合タンパク質を発
現する細胞を毒素誘導抗体と接触させるが、その抗体は融合タンパク質と結合で
きるが、非融合ＮＰＭ又はＡＬＫタンパク質と結合できない。このような抗体の
例は、Ｓｅｑ．ＩＤ Ｎｏ．２の融合ジャンクションと結合する毒素誘導抗体で
ある。
本発明で用いられる抗体は、抗体が毒素部分と共有結合されたときに“毒素誘
導”であると言われる。このような部分を分子にカップリングさせる操作は当業
界で周知である。
毒素誘導抗体と細胞との結合性は毒素部分を細胞近くに運んで、それにより細
胞死を促進させる。このような抗体分子を哺乳動物に与えることにより、融合タ
ンパク質を発現する細胞が優先的に殺せる。
いかなる適切な毒素部分も用いてよい；しかしながら、例えばリシン毒素、コ
レラ毒素、ジフテリア毒素、ラジオアイソトープ毒素又は膜チャンネル形成毒素
のような毒素を用いることが好ましい。
本発明の抗体は静脈内、筋肉内、皮下、経腸、局所又は非経口で哺乳動物に投
与される。注射により抗体又はペプチドを投与するとき、投与は連続注射による
かあるいは単回又は多数回注射による。
本発明の抗体は“治療上有効な”十分な量で“薬学上許容される形”でレシピ
エント哺乳動物に与えられる。量は、剤の投与量、投与経路等がＮＰＭ／ＡＬＫ
融合タンパク質を発現する細胞の一部を優先的に殺す上で十分であるならば、治
療上有効であると言われる。抗体は、その投与がレシピエント患者により許容で
きるならば、“薬理上許容される形”であると言われる。本発明の抗体は薬学上
有用な組成物を製造する公知方法に従い処方でき、それによりこれらの物質又は
それらの機能性誘導体が製薬上許容されるキャリアビヒクルと組み合わされる。
他のヒトタンパク質、例えばヒト血清アルブミンを含めて、適切なビヒクル及び
それらの処方は、例えばRemington′s Pharmaceutical Sciences(16th ed.,Osol
,A.,Ed.,Mack,Easton PA(1980))で記載されている。有効な投与に適した薬学上
許容される組成物を形成するために、このような組成物は適量のキャリアと一緒
に本発明の抗体の有効量を含有する。キャリアに加えて、本発明の抗体はヒト化
形で供給してもよい。
ヒト化抗体は、例えば抗体の免疫原部分を対応する非免疫原部分と置き換える
ことにより産生してもよい（即ち、キメラ抗体）（Robinson,R.R．らの国際特許
出願ＰＣＴ／ＵＳ８６／０２２６９；Akira.K.らの欧州特許出願１８４，１８７
；Taniguchi.M.の欧州特許出願１７１，４９６；Morrison,S.L．らの欧州特許出
願１７３，４９４；Neuberger,M.S.らのＰＣＴ出願ＷＯ８６／０１５３３；Cabi
lly.S.らの欧州特許出願１２５，０２３；Better,M．ら,Science,240:1041-1043
(1988)；Liu,A.Y.ら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84:3439-3443(1987)；Liu,A.Y.ら
,J.Immunol.,139:3521-3526（1987）;Sun,L.K.ら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84:2
14-218(1987)；Nishimura,Y.ら,Canc.Res.,47:999-1005(1987)；Wood,C.R.ら,Na
ture,314446-449（1985）；Shawら,J.Natl.Cancer Inst.,80:1553-1559(1988)）
。
患者に毒素誘導抗体を与える場合、投与剤の用量は患者の年齢、体重、身長、
性別、一般的医学的状態、過去の病歴等のようなファクターに応じて変わる。一
般的に、約１pg/kg〜１０mg/kg（患者の体重）の範囲内である用量の抗体をレシ
ピエントに与えることが望ましいが、それより低い又は高い用量でも投与してよ
い。
本発明のもう１つの態様では、細胞中でＮＰＭ／ＡＬＫ融合タンパク質につい
てコードするＲＮＡの翻訳を調節する方法が提供される。特に、このような方法
ではＮＰＭ／ＡＬＫ融合タンパク質についてコードするｍＲＮＡと相補的なＲＮ
Ａを転写することができるＤＮＡ配列を細胞中に導入する。このようなＤＮＡ配
列を細胞中に導入することにより、ハイブリッド形成してＮＰＭ／ＡＬＫ融合タ
ンパク質の翻訳を阻止するアンチセンスＲＮＡが産生される。アンチセンスクロ
ーニングは他にもMethisら,Blood,82:1395-1401（1993）;Stein ら,Science,261
:1004-1012(1993)；Mirabella ら,Anti-Cancer Drug Design,6:647-661(1991)；
Rosenberg ら,Nature,313:703-706（1985）;Preissら,Nature,313:27-32（1985
）;Melton,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82:144-148(1985)；Kim ら,Cell,42:129-13
8(1985)で更に詳細に記載されている。
導入されたＤＮＡの転写により、アンチセンスＲＮＡの多数コピーが作られる
。アンチセンスＲＮＡの転写レベルと、プロモーター選択による発現の組織特異
性又はアンチセンス発現配列の遺伝子標的化をコントロールすることにより、当
業者は患者内の特定細胞でＮＰＭ／ＡＬＫ融合タンパク質の翻訳レベルを調節す
ることができる。
ＮＰＭ／ＡＬＫ融合タンパク質の発現レベルは、リボザイム技術の使用によっ
てもコントロールできる（例えば、Shore ら,Oncogen,8:3183-3188(1993)；Sarv
erら,Science,247:1222-1225(1990)；Cech,T.,JAMA,260:303-3034(1988)参照）
。詳しくは、公知操作を用いて、ＮＰＭ／ＡＬＫ融合ｍＲＮＡに特異的なリボザ
イムが作られて細胞内に供給されるか又はその中で発現される。リボザイムの供
給又は発現により、ＮＰＭ／ＡＬＫ融合体についてコードするｍＲＮＡを開裂さ
せる。
本発明のもう１つの態様では、本明細書で記載されたＮＰＭ／ＡＬＫ融合タン
パク質と結合できる作用物質（agents）を同定するための方法が提供される。
詳しくは、このような方法は：
（ａ）作用物質をＮＰＭ／ＡＬＫ融合タンパク質又はその断片と接触させる；及
び
（ｂ）作用物質が融合タンパク質と結合するかどうかを調べる
ことからなる。
この方法を用いて、ＮＰＭ／ＡＬＫ融合タンパク質の活性を調節するために使
用できる作用物質が同定される。
本発明のもう１つの態様では、本明細書で記載されたＡＬＫ融合体と結合でき
る作用物質を同定するための方法が提供される。
詳しくは、このような方法は：
（ａ）作用物質をＡＬＫタンパク質又はその断片と接触させる；及び
（ｂ）作用物質がＡＬＫタンパク質と結合するかどうかを調べる
ことからなる。
この方法を用いて、ＡＬＫタンパク質の活性を調節するために使用できる作用
物質が同定される。加えて、この方法はＡＬＫタンパク質のリガンドを同定する
ために使用できる。
ＡＬＫの作動剤、拮抗剤及びリガンドを単離するために、過度な実験の必要性
なしに熟練者により使用できる、上記アッセイの様々なバリエーションがある。
例えば、抗体はＡＬＫ結合剤を共沈させて精製及び同定を助けるために使用でき
る。加えて、ＡＬＫタンパク質又はＡＬＫの活性部位を含む断片は、ＡＬＫと結
合するタンパク質についてコードする遺伝子の発現ライブラリーをスクリーニン
グするために使用できる。更に、表面でＡＬＫを発現する細胞は、単離されたＡ
ＬＫタンパク質を用いる代わりとして使用できる。
上記アッセイでスクリーニングされる物質はペプチド、炭水化物又はビタミン
誘導体であるが、それらに制限されない。その物質はランダムに選択及びスクリ
ーニングしても、あるいは合理的にタンパク質モデリング技術を用いて選択又は
デザインしてもよい。ランダムスクリーニングの場合、ペプチド又は炭水化物の
ような物質はランダムに選択され、偽遺伝子ペプチドと結合するそれらの能力に
ついて調べられる。一方、物質は合理的に選択又はデザインしてもよい。本発明
で用いられる物質は、その物質が偽遺伝子ペプチドの配置に基づき選択されると
き、“合理的に選択又はデザインされた”と言われる。例えば、当業者であれば
、合理的にデザインされた抗ペプチドペプチドを作るために、特異的ペプチド配
列と結合しうるペプチドを作る現行操作を容易に改変することができる。例えば
Hurby ら,Application of Synthetic Peptides: Antisense Peptides″,In Synt
hetic Peptides,A User′s Guide,W.H.Freeman,NY,pp.289-307(1992)と、Kaspcz
akら,Biochemistry,28:9230-8(1989)参照。
上記操作を用いて、本発明では：
（ａ）その作用物質をＮＰＭ／ＡＬＫ融合タンパク質又はその断片と接触させる
；及び
（ｂ）上記作用物質が上記ＮＰＭ／ＡＬＫ融合タンパク質と結合するかどうかを
調べる
ステップにより産生される、ＮＰＭ／ＡＬＫ融合タンパク質と結合できる作用物
質を提供する。
上記操作を用いて、本発明では：
（ａ）その作用物質をＡＬＫタンパク質又はその断片と接触させる；及び
（ｂ）上記作用物質が上記ＡＬＫタンパク質と結合するかどうかを調べる
ステップにより産生される、ＡＬＫタンパク質と結合できる作用物質を提供する
。
本発明ではＮＰＭ／ＡＬＫ遺伝子融合体及び／又はＡＬＫ遺伝子を含むトラン
スジェニック動物を作製する方法も更に提供する。このような動物はヒトｔ（２
；５）リンパ腫とＡＬＫ機能及び活性研究用の動物モデルとして有用である。
一般的に、トランスジェニック動物の作製方法も当業界で周知である（例えば
、
Grosveldら,Transgenic Animals,Academic Press Ltd.,San Diego,CA(1992)参照
）。ＮＰＭ／ＡＬＫ融合体又はＡＬＫタンパク質について本明細書で開示された
配列を用いて、熟練者であればＮＰＭ／ＡＬＫ融合タンパク質及び／又はＡＬＫ
タンパク質を含む及び発現するトランスジェニック動物を容易に作製することが
できる。ＮＰＭ／ＡＬＫ融合体を発現するトランスジェニック動物（例えばマウ
ス及びブタ）はヒトｔ（２；５）リンパ腫用の動物用モデルとして使用できる。
ＡＬＫタンパク質を発現するトランスジェニック動物は、ＡＬＫ機能及び活性を
研究する上で有用である。このような動物はｔ（２；５）リンパ腫に関する代替
療法の開発用モデルとして使える。
ヒトＡＬＫ遺伝子又はＮＰＭ／ＡＬＫ融合遺伝子を含むように変えられたトラ
ンスジェニック非ヒト哺乳動物に加えて、本発明ではＡＬＫ遺伝子の正常非ヒト
哺乳動物相同体の発現を“ノックアウトする”ように変えられた非ヒトトランス
ジェニック哺乳動物を更に提供する。特にその他で記載された遺伝子標的化操作
を用いて、熟練者は非ヒト哺乳動物で相同的遺伝子を不活化（ノックアウト）す
るために本発明のＡＬＫ遺伝子を用いることができる(Mansourら,Nature,336:34
8-352(1988))。“ノックアウト”操作はいくつかの哺乳動物系でうまく用いられ
てきた。例えばLui ら,Cell,75:59-72(1993)参照。ＡＬＫ遺伝子の高度の保存性
のために、ヒトＡＬＫ配列は標準ノックアウト操作で非ヒト哺乳動物に用いるこ
とができる。
本発明で一般的に記載されてきたが、物質とそれを得る方法は下記例を参考に
すると更に容易に理解されるようになり、例は説明のために示されていて、それ
らは指摘されないかぎり本発明の制限ではないと考えられる。
例１
ｔ（２；５）により変えられた遺伝子をクローニングするために、我々は局所
的に誘導されたコスミドクローンの蛍光現場ハイブリッド形成（ＦＩＳＨ）順序
に基づく位置的戦法を用いた。（分子的に特徴付けられた白血病及びリンパ腫関
連染色体転座の大部分とは対照的に、ｔ（２；５）は免疫グロブリン又はＴ細胞
レセプター遺伝子だけでなく、ブレークポイント領域に前に局在していた他のク
ローン化遺伝子も含まない。このため、染色体５でブレークポイントを同定する
ために、我々はバンド５ｑ３４‐ｑ３５から微切裂クローンを単離して、３９の
コスミドクローンを同定するためにそれらを用い(D.Saltmanら,Nucleic Acids R
es.,20:1401(1992))、その後ＳＵＰ‐Ｍ２及びＳＵ‐ＤＨＬ‐１ ｔ（２；５）
陽性細胞系からの中期染色体のＦＩＳＨ分析によりブレークポイントに対する向
きを定めた（R.Morganら,Blood,73:2155(1989)）。１７のクローンはブレークポ
イントに対してセントロメア、２２のクローンはテロメアに位置し、これらグル
ープからのクローンは２色中期ＦＩＳＨ分析により互いに比較して向きを定めた
。ＦＩＳＨは既に記載されたように行った（S.Morrisら,Blood,78:2013(1991)；
D.Saltman ら,Genomics,16;726(1993)）。ｃｏｓ４７Ｃ１２（セントロメア）及
びｃｏｓ１９１Ｅ７（テロメア）と称されるブレークポイントに最も近く隣接す
る２つのコスミド間の推定ゲノム距離は、正常染色体５を含む細胞で間期ＦＩＳ
Ｈ分析によると２９０ｋｂであった（J.Lawrenceら,Science,249:928(1990)；B.
Trask ら,Am.J.Hum.Genet.,48:1(1991)）。染色体５ブレークポイントへのそれ
らの近接にもかかわらず、これらのコスミドから作製されたプローブは、ｔ（２
；５）含有細胞系のＤＮＡから作製されたパルスフィールドゲルのサザンブロッ
ト分析で再配列制限断片を検出しなかった。）
二方向染色体歩行を染色体５上のブレークポイントに約２９０ｋｂ離れて隣接
するコスミドから行った；各歩行は１５０ｋｂのゲノム領域にわたった。テロメ
アコスミドから７０ｋｂ離れたゲノムプローブを用いて、我々はｔ（２；５）含
有細胞系２つのＤＮＡで再配列制限断片を検出した（図１Ａ）。（テロメア隣接
クローンからブレークポイント方向に約７０ｋｂのところで、我々はｔ（２；５
）
陽性細胞系からのＤＮＡのサザンブロット分析で多数の酵素により再配列断片を
同定する染色体５‐特異性ゲノムプローブ（ｐ１６‐３／１．２Ｓ及びｐ２１‐
３／３Ｅ）を単離した。ゲノム断片ｐ１６‐３／１．２Ｓは染色体５ブレークポ
イントのすぐセントロメア側に位置し、ｐ２１‐３／３Ｅはブレークのちょうど
テロメア側にある。双方のプローブはｔ（２；５）陽性及び陰性細胞系から作製
されたＲＮＡのノーザン分析で１．６ｋｂ転写物を同定した；加えて、ｐ１６‐
３／１．２Ｓはｔ（２；５）陽性ＲＮＡのみにみられる２．４ｋｂ転写物とハイ
ブリッド形成した。）
一方のプローブ（ｐ２１‐３／３Ｅ）は、ｔ（２；５）を欠くＵＯＣ‐Ｂ１
ｐｒｏ‐Ｂ白血病細胞系のポリアデニル化ＲＮＡから作製されたｃＤＮＡライブ
ラリーとハイブリッド形成した。ヌクレオホスミン（ＮＰＭ；Ｂ２３又はヌマト
リンとしても知られる）‐リボソームアセンブリーの後期段階において核小体及
び細胞質間でリボソーム成分を運ぶ高度保存核小体リンタンパク質（W.Y.Chanら
,Biochemistry,28:1033（1989）;R.A.Borer ら,Cell,56:379(1989)）についてコ
ードすることが配列分析により予測された偏在発現１．６ｋｂ ｍＲＮＡとハイ
ブリッド形成する多数のｃＤＮＡクローンを単離した。ＮＰＭ ｃＤＮＡの５′
末端からのサブクローンを用いて、ｔ（２；５）を含む又は含まない細胞系から
作製されたＲＮＡのブロービングにより、正常ＮＰＭ転写物とｔ（２；５）陽性
細胞系に限定される２．４ｋｂ転写物双方を同定した（図１Ｂ、最上）。３′非
翻訳配列含有サブクローンは正常１．６ｋｂ ＮＰＭ転写物のみを検出した（示
さず）。
ＳＵ‐ＤＨＬ‐１ ｔ（２；５）含有細胞系のｍＲＮＡから作製されたｃＤＮ
Ａライブラリーをスクリーニングすることにより、我々は３′ではなく５′ＮＰ
Ｍプローブとハイブリッド形成する２０以上のクローンを単離した。３つの最長
クローンの５′末端からの配列は５′ＮＰＭ ｃＤＮＡ配列と同一であったが、
Ｖａｌ117のコドン後に異なる。このコドンの３′側ＮＰＭ配列を１２２３ヌク
レオチドで置き換えて、１５７５ヌクレオチドのオープン読取枠を得た（図２Ａ
）。融合ｃＤＮＡ（ｐＳ１．２）の３′末端から作製されたプローブは、ｔ（２
；５）陽性細胞からのＲＮＡにおいて５′ＮＰＭプローブで検出された同様の２
．４ｋｂ転写物を同定した（図１Ｂ、最下）。この断片は、ヒトｘげっ歯類体細
胞ハイブリッドのＤＮＡとのハイブリッド形成及び中期ＦＩＳＨ分析によると、
染色体２のバンドｐ２３に局在しており（示さず）、２．４ｋｂ ｍＲＮＡがｔ
（２；５）により作られた融合遺伝子によりコードされていることを示している
。
キメラｔ（２；５）ｃＤＮＡの３′部分は、タンパク質‐チロシンキナーゼ（
ＰＴＫ）遺伝子ファミリーのメンバーの触媒ドメインに特徴的な保存残基につい
てコードしている(S.K.Hanksら,Science,241:42（1988）;S.S.Taylorら,Annu.Re
v.Cell Biol.,8:429(1992))（図２Ａ及びＣ）。この新たに同定された退生リン
パ腫キナーゼ（ＡＬＫ）（ＮＰＭ及びＡＬＫは承認されたＨＧＭ遺伝子シンボル
である(P.McAlpine,personal communication)）と公知ＰＴＫファミリーメンバ
ーとの比較では、白血球チロシンキナーゼ（ＬＴＫ；６４％アミノ酸同一率）、
ＴＲＫＡ（３８％）、ＲＯＳ（３７％）及びそのDrosophila相同性Sevenless（
３５％）、インスリン様増殖因子‐１レセプターのβ‐鎖（ＩＧＦＩＲ；３７％
）とインスリンレセプターのβ‐鎖（ＩＲ；３６％）を含めて、インスリンレセ
プターキナーゼサブファミリーのメンバーと最大の相同性を示した(J.J.Krolews
kiら,EMBO J.,10:2911(1991)；H.Toyoshima ら,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,90:
5404(1993)；D.Martin-Zancaら,Nature,319:743(1986)；H.Matsushimeら,Mol.Ce
ll.Biol.,6:3000(1986)；J.M.Chenら,Oncogene,6:257(1991)；K.Baslerら,Cell,
5:299(1988)；D.D.Bowtell ら,Genes and Development,2:620(1988)；A.Ullrich
ら,EMBO J.,5:2503（1986）;A.Ullrich
ら,Nature,313:756（1985）;Y.Ebina ら,Cell,40:747(1985))。
正常ＡＬＫタンパク質の構造は、ｐＳ１．２ＡＬＫプローブを用いて、横紋筋
肉腫細胞系（Ｒｈ３０）から作製されたｃＤＮＡライブラリーをスクリーニング
することで調べた。２つの最大クローンｐＲＭＳ４及びｐＲＭＳ１７‐２のイン
サートの分析では融合遺伝子ｃＤＮＡの場合と同一の３′ＡＬＫ配列を示し、変
異がキメラタンパク質で起きなかったことを示している。ＮＰＭ‐ＡＬＫジャン
クションのすぐ上流にあるＡＬＫの配列は経膜ドメインに典型的な２３疎水性ア
ミノ酸についてコードし（図２Ｂ）、ＡＬＫクローンの最５′末端からのものは
インスリン様増殖因子結合タンパク質‐１（ＩＢＰ‐１）（ＩＢＰ‐１は、高度
親和性のあるインスリン様増殖因子‐１（ＩＧＦ１）と結合する、ヒト血漿及び
羊水中でみられる３０ｋＤａ分泌タンパク質である）についてコードする配列と
５０％同一であった（A.Brinkmanら,EMBO J.,7:2417（1988）;Y.L.Lee ら,Mol.E
ndocrinol.,2:404(1988)；M.Julkunenら,FEBS Lett.,236:295(1988)）。これら
の比較では、正常ＡＬＫ産物が膜スパニングチロシンキナーゼレセプターである
ことを示している。重要なことに、経膜セグメント及び推定細胞外リガンド結合
ドメインはＮＰＭ‐ＡＬＫキメラタンパク質に含まれていない。
６．５ｋｂ及び８．０ｋｂのＡＬＫ ｍＲＮＡは小腸及び横紋筋肉腫細胞系で
容易に同定され、脳（胎児及び成人）、結腸及び前立腺で弱く発現された（図１
、Ｂ（下）及びＣ）。豊富な量の４．４ｋｂ及び６．０ｋｂ ｍＲＮＡは精巣で
検出され、胎盤及び胎児肺臓では各々単一６．０ｋｂ転写物を発現した。全部で
４種のｍＲＮＡも３′非翻訳ＡＬＫ配列のみを含むプローブで検出され、それら
が他のＰＴＫ遺伝子の交差ハイブリッド形成転写物ではなく、別にスプライスさ
れたＡＬＫ ｍＲＮＡを表すことを示唆している。ＡＬＫ転写物は正常脾臓、胸
腺、末梢血白血球、Ｂ‐リンパ芽球様細胞系、フィトヘマグルチニン刺激Ｔリン
パ球、あるいは骨髄様又はＢもしくはＴリンパ様源のｔ（２；５）陰性白血病／
リンパ
腫細胞系で検出されず、それらが造血細胞で正常には発現されないことを意味し
ている。
ＦＩＳＨ地図作成では、ＮＰＭ及びＡＬＫが各々染色体５及び２でセントロメ
アからテロメア方向に転写されて、２．４ｋｂ融合転写物が誘導５転座染色体か
ら生じることを示した。ノーザンブロット分析では、誘導２染色体から形成させ
ることができた、相互ＡＬＫ‐ＮＰＭキメラ転写物の発現に関する証拠を与えな
かった。
ＲＮＡベースポリメラーゼ鎖反応（ＲＮＡ‐ＰＣＲ）法では、ｔ（２；５）保
有リンパ腫で発現されるキメラ転写物において融合ジャンクションの特異性を確
認した（図３、Ａ及びＢ）。（ＲＮＡ‐ＰＣＲはE.Privitera ら,Blood,79:1781
(1992)で既に記載されたように行った。反応は、キメラＮＰＭ‐ＡＬＫ転写物に
特異的なオリゴヌクレオチドプライマー（図３Ｂ参照）と、逆転写及び増幅用の
コントロールとして偏在発現ＮＰＭ遺伝子から誘導されたプライマーペアとで同
時に行った。３′ＮＰＭプライマー（５′‐ＧＣＴＡＣＣＡＣＣＴＣＣ ＡＧＧ
ＧＧＣＡＧＡ‐３′（Ｓｅｑ．ＩＤ Ｎｏ．８））をコントロール増幅のため図
３Ｂで示されたＮＰＭプライマーと共に用い、１８５ｂｐ ＮＰＭ産物を融合ジ
ャンクションが起きる領域からの正常ＮＰＭ配列と相同的な末端標識オリゴヌク
レオチド（５′‐ＡＧＣＡＣＴＴＡＧＴＡＧＣＴＧＴＧＧＡＧＧＡＡＧ‐３′（
Ｓｅｑ．ＩＤ Ｎｏ．９））とのハイブリッド形成により検出した。ＮＰＭ‐Ａ
ＬＫ融合ＲＮＡ‐ＰＣＲ産物は融合ジャンクションにわたる末端標識オリゴヌク
レオチド（５′‐ＡＧＣＡＣＴＴＡＧＴＡＧＴＧＴＡＣＣＧＣＣＧＧＡ‐３′）
（Ｓｅｑ．ＩＤ Ｎｏ．１０）で検出した。緊縮ハイブリッド形成後洗浄はＮＰ
Ｍ‐ＡＬＫ及びＮＰＭ検出オリゴヌクレオチド双方について２×ＳＳＣ／０．１
％ＳＤＳで６２℃にて行った。）
逆に、融合転写物は、ＡＬＫ転写物を発現するいくつかの横紋筋肉腫系を含め
た、ｔ（２；５）を欠く細胞系で検出されなかった。ＮＰＭ‐ＡＬＫジャンクシ
ョン配列は、ＳＵ‐ＤＨＬ‐１、ＳＵＰ‐Ｍ２及びＵＣＯＮＮ‐Ｌ２細胞系を含
めた７つ全部のｔ（２；５）陽性サンプルと、退生大細胞リンパ腫の患者４例か
らの診断サンプルとのＲＮＡでみられた。（患者サンプル（リンパ節生検３例、
胸膜滲出液１例）は各々ｔ（２；５）保有リンパ腫細胞を含有することが細胞遺
伝子分析により示された。患者２及び４の細胞からのＲＮＡ‐ＰＣＲ産物の配列
を配列決定したところ、ＳＵ‐ＤＨＬ‐１細胞系から得られたｃＤＮＡ配列と同
一であることがわかった（図３Ｂ）。文書によるインフォームドコンセントが患
者から得られ、研究はSt.Jude Children′s Research Hospitalの臨床試験検討
委員会により承認された。）
したがって、２；５転座のブレークポイントはＮＰＭ及びＡＬＫ遺伝子の同一
のイントロンを一致して含んでいるらしく、融合遺伝子から生じるスプライスさ
れたｍＲＮＡで同一ジャンクションとなる。リンパ腫生検サンプルの細胞遺伝子
分析における困難性のために、ＲＮＡ‐ＰＣＲによるＮＰＭ‐ＡＬＫ融合ｍＲＮ
Ａの分子検出はこれら腫瘍の同定を著しく改善することになる。
退生大細胞リンパ腫におけるｔ（２；５）の頻度は、ＮＰＭ‐ＡＬＫ産物がこ
れら新生物の病原性に重要な役割を有することを示している。正常ＮＰＭタンパ
ク質は、大小双方のリボソームサブユニットへのプレリボソーム粒子のアセンブ
リーに関与する、非リボソーム核小体リンタンパク質である（W.Y.Chanら,Bioch
emistry,28:1033（1989）；R.A.Borer ら,Cell,56:379(1989)；M.S.Schmidt-Zac
hmannら,EMBO J.,6:1881（1987）;M.S.Schmidt-Zachmannら,Chromosoma.,96:417
（1988）；D.Hernandez-Verdun,J.Cell.Sci.,99:465(1991)）。それは一本鎖核
酸と高親和性で協力的に結合し、ＲＮＡヘリックス不安定化活性を示し、ほとん
どの成熟核小体プレリボソームリボ核タンパク質と共にみられる(T.S.Dumbarら,
Biochemistry,28:9495(1989))。ＮＰＭ転写物及びタ
ンパク質の相対的豊富さは細胞サイクル調節される。ＮＰＭ転写及び翻訳はＳ期
に細胞が入る直前にピークに達し、Ｇ２期の開始直前にベースラインまで下降す
る（N.Feuersteinら,J.Immunol.,139:1818(1987)；N.Feuersteinら,J.Biol.Chem
.,262;11389（1987）;N.Feuersteinら,J.Biol.Chem.,263;10608（1988）;N.Feue
rsteinら,J.Cell Biol.,107:1629(1988)；N.Feuersteinら,Exp.Cell Res.,194:2
89(1991)）。
ＮＰＭの公知構造ドメインのほとんどについてコードする配列は融合転写物中
に取り込まれていない（W.Y.Chanら,Biochemistry,28:1033(1989)；R.A.Borer
ら,Cell,56:379(1989)；M.Peter ら,Cell,60:791(1990)；P.K.Chanら,Biochem.J
.,270:549(1990)；R.Beckmannら,Eur.J.Biochem.,210:45(1992)）（図３Ｃ）。
我々は、ＮＰＭ遺伝子がｔ（２；５）を含むリンパ腫細胞でＡＬＫ触媒ドメイン
を発現させる上で活性プロモーターに関与しているとみている。ＮＰＭのこの役
割は重要であるように思え、ＡＬＫプロモーターはリンパ様細胞で通常休止して
いる。もしあるにしても、潜在的タンパク質キナーゼＣリン酸化部位（Ｓｅｒ43
及びＴｈｒ78）及び潜在的Ｃ‐Ｘ5‐Ｈ‐Ｘ4‐Ｈ金属結合モチーフ（残基１０４
‐１１５）についてコードするものを含めて、ＮＰＭ‐ＡＬＫ中に組み込まれた
アミノ末端ＮＰＭコード配列に関する発がん役割は確定されている。
悪性形質転換への異常活性化レセプターチロシンキナーゼの関与はよく認識さ
れている（J.Schlessingerら,Neuron,9:383(1992)；T.Pawson,Curr.Opin.Gen.De
v.,2:4(1992)）。例えば、ＴＲＫＡの悪性活性化はＮＰＭ‐ＡＬＫと類似した遺
伝子融合体から生じることがあり、その場合に酵素の細胞外ドメインは、非筋肉
トロポミオシン及びリボソームタンパク質Ｌ７ａの場合を含めて、他の遺伝子に
よりコードされるアミノ酸で置き換えられる（D.Martin-Zancaら,Nature,319:74
3(1986)；F.Coulier ら,Mol.Cell.Biol.,9:15(1989)；R.Oskam ら,Proc.Natl.
Acad.Sci.U.S.A.,85:2964(1988)；S.C.Kozma ら,EMBO J.,7:147(1988)；A.Ziemi
ecki ら,EMBO J.,9:191(1990)）。発がん性ＴＲＫＡ融合タンパク質と、ＢＣＲ
‐ＡＢＬ、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２／ＮＥＵ及びＣＳＦ‐１Ｒを含めた他のチロシン
キナーゼがん遺伝子の一致した特徴は、それら効力の多くが構成上活性な触媒ド
メインとなる変異又は遺伝子融合に関与しうることである（J.Schlessingerら,N
euron,9:383(1992)；T.Pawson,Curr.Opin.Gen.Dev.,2:4(1992)；D.Martin-Zanca
ら,Nature,319:743(1986)；F.Coulier ら,Mol.Cell.Biol.,9:15(1989)；R.Oskam
ら,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,85:2964(1988)；S.C.Kozma ら,EMBO J.,7:147(
1988)；A.Ziemiecki ら,EMBO J.,9:191(1990)）。このため、ＮＰＭ‐ＡＬＫ融
合タンパク質では、端部切取ＡＬＫキナーゼは調節解除され、細胞内基質をリン
酸化して、悪性形質転換を誘発すると予想している。退生大細胞リンパ腫は増殖
及び生存上ＩＬ‐２に依存している活性化Ｔリンパ球から生じるため（K.A.Smit
h,Science,240:1169(1988)）、ＮＰＭ‐ＡＬＫはＩＬ‐２レセプター媒介シグナ
ルに応答して通常リン酸化される基質をリン酸化して（E.M.Saltzmanら,J.Biol.
Chem.,263:6956(1988)；D.K.Ferrisら,J.Immunol.,143:870(1989)；I.D.Horak
ら,Proc.Natl.Acad.U.S.A.,88;1996(1991)；M.Hatakeyamaら,Science,252:1523(
1991)；N.Kobayashi ら,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,90:4201(1993)）、このシ
グナル形質導入経路の構成的活性化を起こす。
我々の発見は、未成熟（胸腺）免疫表現型の細胞で生じるＴ細胞リンパ腫及び
白血病の以前の分子遺伝子研究とは著しい対照をなす。リンパ芽球Ｔ細胞悪性系
における染色体転座は、染色体７、バンドｑ３４上のＴＣＲ β鎖座又は染色体
１４、バンドｑ１１上のα／δ座に含まれるエンハンサーに一致して影響を与え
ている（M.L.Cleary,Cell,66:619(1991)；T.H.Rabbitts,Cell,67:641(1991)）。
各場合において、Ｔ細胞始原細胞で高度に活性であるこれらのエンハンサーは、
相互染色体上のブレークポイントに位置する発育上調節される転写因子遺伝子（
例えば、ＴＡＬ／ＳＣＬ、ＬＹＬ１、ＲＨＯＭＢ／ＴＴＧ及びＨＯＸ１１）の調
節不全発現を起こす。大細胞リンパ腫における我々の観察では、成熟Ｔリンパ球
で悪性形質転換に至る経路が胸腺始原細胞の分化阻止及び増殖変化に関与するも
のとは異なることを示唆している。
【手続補正書】特許法第１８４条の８
【提出日】１９９５年１２月２０日
【補正内容】
請求の範囲
１． （ａ）核酸含有サンプルを第一増幅プライマー及び第二増幅プライマー
と接触させる（上記第一増幅プライマーはＮＰＭ／ＡＬＫ融合タンパク質に存在
するＮＰＭアミノ酸配列についてコードする核酸配列又はそれに相補的なヌクレ
オチド配列とハイブリッド形成することができ、上記第二増幅プライマーはＮＰ
Ｍ／ＡＬＫ融合タンパク質に存在するＡＬＫアミノ酸配列についてコードする核
酸配列又はそれに相補的な核酸配列とハイブリッド形成することができる）；
（ｂ）上記サンプル内でプライム化配列を増幅させる；
（ｃ）上記ＮＰＭ／ＡＬＫ融合体を含有した増幅配列を検出する；
ステップからなる、ヒトｔ（２；５）リンパ腫の検出方法。
２． 増幅プライマーがＳｅｑ．ＩＤ Ｎｏ．５、Ｓｅｑ．ＩＤ Ｎｏ．５の
逆相補体、Ｓｅｑ．ＩＤ Ｎｏ．６、Ｓｅｑ．ＩＤ Ｎｏ．６の逆相補体からな
る群より選択される、請求項１に記載の方法。
３． サンプルがｍＲＮＡを含有している、請求項１に記載の方法。
４． ａ）サンプルを２種の抗体と接触させる（第一抗体はＮＰＭと結合する
ことができ、第二抗体はＡＬＫと結合することができる）；及び
ｂ）上記第一及び上記第二抗体双方と結合する上記サンプル中のタンパク質の
存在を検出する；
ステップからなる、ヒトｔ（２；５）リンパ腫の同定方法。
５． ａ）サンプルを抗体と接触させる（その抗体はＳｅｑ．ＩＤ Ｎｏ．４
のアミノ酸配列内に存在するＮＰＭ／ＡＬＫ融合タンパク質の融合ジャンクショ
ンと結合できるが、非融合ＮＰＭ又はＡＬＫタンパク質と結合できない）；及び
ｂ）上記抗体と結合する上記サンプル中のタンパク質の存在を検出する；
ステップからなる、ヒトｔ（２；５）リンパ腫の検出方法。
６． 抗体がＳｅｑ．ＩＤ Ｎｏ．４のアミノ酸配列内に存在するエピトープ
と結合することができる、請求項５に記載の方法。
７． ａ）サンプルを２種の核酸プローブと接触させる（第一核酸プローブは
ＮＰＭタンパク質についてコードする核酸配列とハイブリッド形成することがで
き、第二核酸プローブはＡＬＫタンパク質についてコードする核酸配列とハイブ
リッド形成することができる）；及び
ｂ）上記第一及び上記第二核酸プローブ双方とハイブリッド形成する上記サン
プル中の核酸配列の存在を検出する；
ステップからなる、ヒトｔ（２；５）リンパ腫の検出方法。
８． 第一及び第二核酸プローブがＤＮＡ又はＲＮＡであり、サンプル中の核
酸がＤＮＡ又はＲＮＡである、請求項７に記載の方法。
９． ａ）サンプルを核酸プローブと接触させる（その核酸プローブはＮＰＭ
／ＡＬＫ融合タンパク質の融合ジャンクションについてコードする核酸配列とハ
イブリッド形成できる）；及び
ｂ）上記核酸プローブとハイブリッド形成する上記サンプル中の核酸配列の存
在を検出する；
ステップからなる、ヒトｔ（２；５）リンパ腫の検出方法。
１０． 核酸プローブがＤＮＡ及びＲＮＡからなる群より選択され、サンプル
中の核酸配列がＤＮＡ及びＲＮＡからなる群より選択される、請求項９に記載の
方法。
１１． 核酸プローブがＳｅｑ．ＩＤ Ｎｏ．２の核酸配列又はその断片から
本質的になる、請求項９に記載の方法。
１２． ａ）ＮＰＭタンパク質についてコードする核酸配列又はその相補的核
酸配列とハイブリッド形成できるプライマーを含有した第一容器；
ｂ）ＡＬＫタンパク質についてコードする核酸配列又はその相補的核酸配列と
ハイブリッド形成できるプライマーを含有した第二容器；
ｃ）下記のうち１種以上を含有した１以上の他の容器：洗浄試薬、増幅試薬、
及び増幅核酸配列の存在を検出できる試薬；
からなる、区画化されて１以上の容器をきっちりと収納した区画化キット。
１３． ａ）ＮＰＭ／ＡＬＫ融合タンパク質の融合ジャンクションに存在して
、非融合ＮＰＭ又はＡＬＫタンパク質に存在しないエピトープと結合できる抗体
を含有した第一容器；及び
ｂ）下記のうち１種以上を含有した１以上の他の容器：洗浄試薬、及び結合抗
体の存在を検出できる試薬；
からなる、区画化されて１以上の容器をきっちりと収納した区画化キット。
１４． ａ）ＮＰＭ／ＡＬＫ融合タンパク質の融合ジャンクションについてコ
ードする核酸配列とハイブリッド形成できる核酸プローブを含有した第一容器；
ｂ）下記のうち１種以上を含有した１以上の他の容器：洗浄試薬、及び上記第
一容器からの結合核酸プローブの存在を検出できる試薬；
からなる、区画化されて１以上の容器をきっちりと収納した区画化キット。
１５． ＮＰＭ／ＡＬＫ融合タンパク質の融合ジャンクションに存在するエピ
トープと結合できて、非融合ＮＰＭ又はＡＬＫタンパク質と結合できない抗体。
１６． 抗体がＳｅｑ．ＩＤ Ｎｏ．４のアミノ酸配列に存在するエピトープ
と結合できる、請求項１５に記載の抗体。
１７． ＡＬＫタンパク質と結合できる抗体。
１８． アミノ酸配列がＳｅｑ．ＩＤ Ｎｏ．３（部分的ＡＬＫタンパク質）
又はその断片とＳｅｑ．ＩＤ Ｎｏ．４（ＮＰＭ／ＡＬＫ融合タンパク質）又は
その断片からなる群より選択される単離ペプチド。
１９． ＮＰＭ及びＡＬＫタンパク質の部分を含んでなる単離融合タンパク質
。
２０． Ｓｅｑ．ＩＤ Ｎｏ．１のヌクレオチド配列、又はＳｅｑ．ＩＤ
Ｎｏ．１の３１〜２６０８連続塩基対のヌクレオチド配列を有したその断片を有
する単離核酸分子。
２１． Ｓｅｑ．ＩＤ Ｎｏ．２のヌクレオチド配列、又はＳｅｑ．ＩＤ Ｎ
ｏ．２の３１〜２４４０連続塩基対のヌクレオチド配列を有したその断片を有す
る単離核酸分子。
２２． 単離核酸分子がＮＰＭ／ＡＬＫ融合ジャンクションからなる、請求項
２１に記載の単離核酸分子。
２３． 単離核酸分子がＳｅｑ．ＩＤ Ｎｏ．９、Ｓｅｑ．ＩＤ Ｎｏ．１０
、Ｓｅｑ．ＩＤ Ｎｏ．９の逆相補体及びＳｅｑ．ＩＤ Ｎｏ．１０の逆相補体
からなる群より選択される配列を有している、請求項２２に記載の単離核酸分子
。
２４． Ｓｅｑ．ＩＤ Ｎｏ．３の配列を有するポリペプチドについてコード
する単離核酸分子。
２５． Ｓｅｑ．ＩＤ Ｎｏ．４の配列を有するポリペプチドについてコード
する単離核酸分子。
２６． ヒトｔ（２；５）リンパ腫で生じるｔ（２；５）（ｐ２３；ｑ３５）
染色体転座現象で再配列された核酸配列又はその相補配列とハイブリッド形成で
きる増幅プライマー。
２７． 増幅プライマーがＳｅｑ．ＩＤ Ｎｏ．１の１８〜３０連続ヌクレオ
チド又はＳｅｑ．ＩＤ Ｎｏ．１の逆相補体の１８〜３０連続ヌクレオチドから
なる、請求項２６に記載の増幅プライマー。
２８． 増幅プライマーがＳｅｑ．ＩＤ Ｎｏ．５、Ｓｅｑ．ＩＤ Ｎｏ．６
、Ｓｅｑ．ＩＤ Ｎｏ．５の逆相補体及びＳｅｑ．ＩＤ Ｎｏ．６の逆相補体か
らなる群より選択される配列を有している、請求項２６に記載の増幅プライマー
。
２９． 染色体２ｐ２３上のヒトＡＬＫ遺伝子についてコードする核酸配列又
はその相補的核酸配列とハイブリッド形成できる増幅プライマー。
３０． 増幅プライマーがＳｅｑ．ＩＤ Ｎｏ．２の１８〜３０連続ヌクレオ
チド又はＳｅｑ．ＩＤ Ｎｏ．２の逆相補体の１８〜３０連続ヌクレオチドから
なる、請求項２９に記載の増幅プライマー。
３１． 請求項２０、２１、２２、２３、２４又は２５に記載の核酸分子が挿
入されているベクターを含んでなるベクター組立体。
３２． 請求項３１に記載のベクター組立体で形質転換された宿主。
３３． ＮＰＭ／ＡＬＫ融合遺伝子とハイブリッド形成できるアンチセンスｍ
ＲＮＡ配列又はその断片。
３４． ヒトＮＰＭ／ＡＬＫ融合タンパク質を発現するように改変された非ヒ
トトランスジェニック哺乳動物。
３５． ヒトＡＬＫタンパク質を発現するように改変された非ヒトトランスジ
ェニック哺乳動物。
３６． 哺乳動物がＡＬＫ遺伝子の非ヒト相同体を発現しないように改変され
た非ヒトトランスジェニック哺乳動物。
３７． ａ）作用物質をＮＰＭ／ＡＬＫ融合タンパク質と接触させる；及び
ｂ）上記作用物質が上記ＮＰＭ／ＡＬＫ融合タンパク質と結合するかどうかを
調べる；
ステップからなる、ＮＰＭ／ＡＬＫ融合タンパク質と結合できる作用物質の同定
方法。
３８． ａ）作用物質をＮＰＭ／ＡＬＫ融合タンパク質と接触させる；及び
ｂ）上記作用物質が上記ＮＰＭ／ＡＬＫ融合タンパク質と結合するかどうかを
調べる；
ステップにより産生された、ペプチド、炭水化物及びビタミン誘導体からなる群
より選択される、ＮＰＭ／ＡＬＫ融合タンパク質と結合できる単離作用物質。
３９． ａ）作用物質をＡＬＫタンパク質と接触させる；及び
ｂ）上記作用物質が上記ＡＬＫタンパク質と結合するかどうかを調べる；
ステップからなり、単離作用物質がペプチド、炭水化物及びビタミン誘導体から
なる群より選択される、ＡＬＫタンパク質と結合できる作用物質の同定方法。
４０． ａ）作用物質をＡＬＫタンパク質と接触させる；及び
ｂ）上記作用物質が上記ＡＬＫタンパク質と結合するかどうかを調べる；
ステップにより産生された、ペプチド、炭水化物及びビタミン誘導体からなる群
より選択される、ＡＬＫタンパク質と結合できる単離作用物質。
４１． 作用物質がＡＬＫの天然リガンドである、請求項４０に記載の作用物
質。
４２． ＡＬＫタンパク質についてコードするｍＲＮＡを開裂できるリボザイ
ム。
４３． ＮＰＭ／ＡＬＫ融合タンパク質についてコードするｍＲＮＡを開裂で
きるリボザイム。
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(51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ
Ｃ１２Ｐ 21/02 7823−4Ｂ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ
Ｃ１２Ｑ 1/68 0276−2Ｊ Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｔ
Ｇ０１Ｎ 33/50 0276−2Ｊ 33/574 Ｚ
33/574 9282−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ
//(Ｃ１２Ｎ 5/10
Ｃ１２Ｒ 1:91）
(Ｃ１２Ｐ 21/02
Ｃ１２Ｒ 1:91）