JPH09512421A

JPH09512421A - キメラｃｄ４レセプターを有する細胞によるｈｉｖ感染細胞を標的とする細胞傷害

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Publication number: JPH09512421A
Application number: JP7521213A
Authority: JP
Inventors: ブライアンシード; ババクバナポア; チャールズロミオ; バルデマーコラヌス
Original assignee: General Hospital Corp
Current assignee: General Hospital Corp
Priority date: 1994-02-14
Filing date: 1995-01-12
Publication date: 1997-12-16
Anticipated expiration: 2021-10-11
Also published as: EP0750457A4; JP3832850B2; DE69534589D1; KR100289253B1; US6284240B1; CA2182890C; CZ293969B6; ES2249766T3; AU690204B2; FI963150L; CN1146136A; MX9603384A; NZ279123A; CA2182890A1; EP0750457A1; NO963379L; PL315908A1; UA42760C2; US20030138410A1; ATE308888T1

Abstract

(57)【要約】哺乳類に、有効量の治療用細胞を投与することを含む、哺乳類におけるHIV感染細胞に対する細胞免疫反応を行う方法が開示される。該治療用細胞は、（a）HIV感染細胞を特異的に認識し、結合することができるが、HIV感染を媒介することがないCD4断片を含む細胞外部分、および（b）レセプター結合HIV感染細胞を破壊するようなシグナルを、該治療細胞に与えることができる細胞内部分、を含む膜結合型のタンパク質性キメラレセプターを発現する。また、キメラレセプターを発現する細胞、ならびにキメラレセプターをコードするDNAおよびベクターも開示される。

Description

【発明の詳細な説明】キメラCD4レセプターを有する細胞によるHIV感染細胞を標的とする細胞傷害発明の分野本発明は、国立衛生研究所より与えられた、契約番号AI27849による政府からの助成を受けて行われた。本発明に対し、政府は一定の権利を有する。本発明は、CD4断片と免疫細胞レセプターをもつ機能的キメラ分子に関する。このキメラは、免疫細胞にHIV感染細胞の破壊を指示するが、HIV感染に対する感受性をもたらさない。したがって、本発明は、新規な有効なHIV治療薬を提供する。発明の背景 T細胞のT細胞レセプターによる抗原認識は、一定の範囲における免疫学的現象の基礎になっている。T細胞は、いわゆる細胞性免疫を担う。これには免疫系細胞によって外来の組織や感染細胞を破壊することが含まれる。「ヘルパー」細胞や「サプレッサー」細胞のように免疫応答を調節する細胞や、異常な細胞を直接破壊する細胞傷害性（または「キラー」）細胞などの多様なT細胞が存在する。 T細胞は、他の細胞表面上に提示された固有の抗原を認識して結合すると活性化され、増殖できるようになる。そして、それが細胞傷害性細胞であれば、結合した細胞を破壊できるようになる。 HIVおよび免疫病理 1984年に、HIVがAIDSの病原体であることが明らかになった。それ以来、AIDS の診断基準に関する定義は何度も修正されている。しかし、診断学上のパラメーターの変動にも関わらず、AIDSの一見した共通の特徴は、HIV感染とそれに続く、持続性の全身症状、および、二次感染、腫瘍形成、神経性疾患などのAIDS特有症状の発生である。ハリソンの内科学原理、第12版、マグロウヒル社（1991）。 HIVは、レンチウイルスグループに属するヒトレトロウイルスである。確認されている４種のヒトレトロウイルスは、２つの別々のグループに属している。すなわち、ヒトTリンパ栄養性（白血病）レトロウイルスのHTLV-1とHTLV-2、およびヒト免疫不全ウイルスのHIV-1とHIV-2である。前者のウイルスは形質転換ウイルスであり、一方後者は細胞傷害性ウイルスである。 HIV-1は、世界中で、AIDSのもっとも普通の原因と認められている。HIV-1とHI V-2の配列の相同性は約40％で、HIV-2の方がサル免疫不全ウイルス（SIV）グループのいくつかのメンバーに密接に関連している。（Curran，J．et al.，Scien ce，329: 1357-1359（1985）；Weiss，R．et al.，Nature，324: 572-575（1986 ）参照）。 HIVは、レトロウイルスが普通にもつ遺伝子（env、gagおよびpol）と、ウイルスの複製その他の生物学的活性に関連した6個の特別の遺伝子をもつ。先に述べたように、AIDSに共通の特徴は、主に細胞性免疫を強度に免疫抑制することである。この免疫抑制は、特にある種の感染症や腫瘍形成などのさまざまな日和見症をもたらす。 AIDSにおける免疫不全の主要原因は、胸腺由来（T）リンパ球サブセットであるT4集団の、質的かつ量的な欠損であるとされてきた。このサブセットは、HIV に対する細胞レセプターであることが明らかになっているCD4表面分子が存在することによって、表現形質的に定義される（Dalgleish et al.，Nature 312:763 （1984））。T4細胞が、HIV感染を受ける主な細胞型ではあるが、本質的には、C D4分子を細胞表面で発現するヒト細胞であれば、いかなる細胞でもHIVによる結合を受け、感染する。以前からCD4⁺T細胞にはヘルパー／インデュサーの役割があることが指摘されており、それは、B細胞への活性化シグナルを提供する機能、または細胞傷害性／サプレッサー細胞になるための相互的なCD8マーカーをもつT型リンパ球を誘導する機能を意味する（Reinherz and Schlossman，Cell 19:821-827（1980）；Go ldstein et al.，Immunol．Rev．68:5-42（1982））。 HIVは、ウイルスエンベロープ（gp120）中のアミノ酸領域を通して、CD4分子のN末端近くに位置するV1部位に、特異的かつ高い親和性をもって結合する。結合した後、ウイルスは、標的細胞膜と融合して、細胞内に入り込む。一旦入り込むと、ウイルスは、逆転写酵素を用いて、そのゲノムRNAをDNAに転写して、細胞 DNAに取り込ませ、「プロウイルス」として細胞が生きている間存在する。プロウイルスは、潜伏したままか、mRNAおよびゲノムRNAを転写するために活性化されて、蛋白質合成、集合、新しいウイルス粒子形成、および細胞の表面からのウイルス出芽をもたらす。ウイルスが細胞死を誘導する正確なメカニズムは明らかになっていないが、ウイルスが大量に細胞表面から出芽するために、原形質膜が破壊されて、浸透圧が不均衡になることが主な機構と考えられている。感染が起きている間、宿主生物は、主要エンベロープ糖蛋白質であるgp120やg p41などのウイルス蛋白質に対する抗体を産生する。この体液性免疫が起きても、病気は進行して、死をきたす免疫抑制の特徴、すなわちさまざまな日和見感染症、寄生虫血症、痴呆を惹き起こし、死に至る。宿主の抗ウイルス抗体が、病気の進行を阻止できないことが、このウイルス感染の最も深刻で憂慮すべき局面である。だから、従来の方法に基づくワクチン作成はほとんど期待できない。免疫不全ウイルスに対する体液性応答の効力に関与する因子は二つある。ひとつは、他のRNAウイルス同様（特にレトロウイルスと同様）、免疫不全ウイルスも、宿主の免疫監視機構に対する反応において高い突然変異率を示すことである。もう一つは、エンベロープの糖蛋白質そのものが、高親和性抗体が結合するのに適したいくつかのエピトープを提示する、何重にもグリコシル化された分子であることである。ウイルスエンベロープが提示する抗原性の低い標的は、特異的な抗体の産生によってウイルス感染を制限するきっかけを与えない。 HIVウイルスが感染した細胞は、その表面にgp120糖蛋白質を発現する。gp120 は、ウイルスが非感染細胞に入るときと同じ反応によって、CD4+細胞同士の融合を媒介して、短寿命の多核巨大細胞を形成させる。融合細胞形成は、gp120エンベロープ糖蛋白質とCD4蛋白質との直接の相互作用に依存する（Dalgleish et al .，前掲;Klatzman，D．et al.，Nature 312:763（1984）；McDougal，J．S．et al.，Science 231: 382（1986）；Sodroski，J．et al.，Nature 322:470（1986 ）；Lifson，J．D．et al.，Nature 323:725（1986）；Sodroski，J．et al.，N ature 321:412（1986））。 CD4-gp120結合が、CD4抗原をもつ細胞へのウイルス感染に関与するという証拠の一つとして、gp120とCD4が特異的な複合体を形成するのが発見された（McDoug al et al.，前掲）。別の研究者は、HIVが感染できない細胞系を、ヒトCD4 cDNA 遺伝子で形質転換して、これを発現させると、感染細胞系に変わることを示した（Maddon et al.，Cell 46:333-348（1986））。可溶性CD4をウイルスの吸着と融合細胞媒介性細胞伝達を阻害するための受動的薬剤として用いる治療計画が、提案され、インビトロでは成功することが、多くのグループによって示された（Deen et al.，Nature 331:82-84（1988）；Fishe r et al.，Nature 331:76-78（1988）；Hussey et al.，Nature 331:78-81（198 8）；Smith et al.，Science 238:1704-1707（1987）；Traunecker et al.，Nat ure 331:84-86（1988））；そして、長い半減期と穏やかな生物活性をもったCD4 イムノグロブリン融合蛋白質が続いて作製された（Capon et al.，Nature 337:5 25-531（1989）；Traunecker et al.，Nature 339，68-70（1989）；Byrn et al .，Nature 344:667-670（1990）；Zettlmeissl et al.，DNA Cell Biol．9:347- 353（1990））。CD4イムノトキシン結合体または融合蛋白質は、インビボで感染細胞に対し強力な細胞毒性を示す（Chaudhary et al.，Nature 335:369-372（19 88）；Till et al.，Science 242:1166-1168（1988））が、免疫不全症候群には潜伏性があるため、一回投与による治療は、ウイルス負荷を除く上で有効とは考えられず、外来の融合蛋白質の抗原性によって、反復投与が必要となる治療の受容度が規定されやすい。サルにSIVを感染させて調べたところ、動物への投与が、顕著なCD4性血球減少症を伴わない場合には、SIVの力価を減少させ、骨髄の能力の、インビトロでの測定値を向上させることができる（Watanabe et al.，Nat ure 337:267-270（1989））。しかし、治療を中断した後に、ウイルスが速やかに再出現してくるのが観察されたため、免疫系の退化の進行を妨げるためには、生涯投与することが必要である可能性がある。 T細胞とFcレセプター T細胞抗原レセプター（TCR）の最もありふれた形態を細胞表面で発現させるには、少なくとも6種以上の別々のポリペプチド鎖の共発現が必要であり（Weiss e t al.，J．Exp．Med．160:1284-1299（1984）；Orloffhashi et al.，Nature 31 6:606-609（1985）；Berkhout et al.，J．Biol．Chem．263:8528-8536（1988）；Sussman et al.，Cell 52:85-95（1988））、それらはα／β抗原結合鎖、３つのポリペプチドからなるCD3複合体およびζである。これらのポリペプチド鎖のいずれが欠けても、残りのメンバーだけからなる複合体では、安定した発現を得ることができない。ζは、完全な複合体の表面発現を制限するポリペプチドで（Sussman et al.，Cell 52:85-95（1988））、レセプターによるリガンド認識で始まる細胞活性化プログラムの、少なくとも一部を媒介すると考えられている（Weissman et al.EMBO J.8;3651-3656（1989）;Frank et al.，Science 249:17 4-177（1990））。32kDaのタイプI膜内蔵ホモ二量体、ζ（ゼータ）は、N-結合型糖付加部位を含まない9残基の細胞外ドメイン、および112残基（マウス）または113残基（ヒト）の細胞内ドメインを有する（Weissman et al.，Science 238: 1018-1020（1988）；Weissman et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 85:9709-9 713（1988））。ζのアイソフォームであるη（エータ）（Baniyash et al.，J ．Biol．Chem．263:9874-9878（1988）；Orloff et al.，J．Biol．Chem．264:1 4812-14817（1989））は、選択的mRNAスプライシング経路によってでき（Jin et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 87:3319-3233（1990））、抗原レセプターを発現している細胞の中に少量存在する。ζ-ηヘテロ二量体は、イノシトールリン酸の形成を媒介し、アポトーシスと呼ばれる、レセプターによって開始されるプログラムされた細胞死を媒介すると考えられる（Mercep et al.，Science 2 42:571-574（1988）；Mercep et al.，Science 246:1162-1165（1989））。 ζとηのように、Fcレセプター結合γ鎖も、付加的なポリペプチドとともに細胞表面複合体として発現されるが、その一部はリガンド認識を媒介し、残りは未解明の機能を持っている。γ（ガンマ）は、ホモ二量体構造をもち、全体的な機構は、ζの機構によく似ており、また、肥満細胞／好塩基球の高親和性IgEレセプターでもある、少なくとも３つの異なったポリペプチド鎖からなるFcεRI（Bl ank et al.，Nature 337:187-189（1989）；Ra et al.，Nature 241:752-754（1 989））の構成成分であり、IgGに対する低親和性レセプターの一つでもある、マウスでは、FcγRIIαに代表され（Ra et al.，J．Biol．Chem．264:15323-15327 （1989））、ヒトでは、マクロファージおよびナチュラルキラー細胞によって発現されるCD16サブタイプであるCD16_TM（CD16トランスメンブレン）（Lanier et al.，Nature 342:803-805（1989）；Anderson et al.，Proc．Natl．Acad．Sci ．USA 87:2274-2278（1990））と、機能が明らかでないポリペプチドに代表されるレセプターの構成成分でもある（Anderson et al.，Proc．Natl．Acad．Sci． USA 87:2274-2278（1990））。最近になって、γが、マウスのT細胞系であるCTL によって発現され、γ-ζおよびγ-ηヘテロ二量体だけでなくホモ二量体も形成することが報告されている（Orloff et al.，Nature 347:189-191（1990））。 Fcレセプターは、免疫複合体の貧食作用、トランスサイトーシスおよび抗体依存的細胞傷害作用（ADCC）を媒介する（Ravetch and Kinet，Annu．Rev．Immuno l．9:457-492（1991）；Unkeless et al.，Annu．Rev．Immunol．6:251-281（19 88）；および、Mellman，Curr．Opin．Immunol．1:16-25（1988））。最近になって、マウス低親和性FcレセプターのアイソフォームであるFcRγIIIB1が、Igでコートされた標的を、クラスリンでコートされた窪みに取り込むのを媒介し、別の低親和性レセプターであるFcrγIIIAが、小ファミリー「トリガー分子」の１種以上のメンバーとの結合を通してADCCを媒介することが明らかにされた。（Mi ettinen et al.，Cell 58:317-327（1989）；Hunziker and Mellman，J．Cell B iol．109:3291-3302（1989））。 T細胞レセプター（TCR）ζ鎖、TCRη鎖、およびFcレセプターγ鎖などのこれらのトリガー分子は、異なった免疫系のレセプターのリガンド認識ドメインと相互作用して、凝集後の細胞傷害までを含む細胞のエフェクタープログラムを自律的に開始する（Samelson et al.，Cell 43:223-231（1985）；Weissman et al. ，Science 239:1018-1020（1988）；Jin et al.，Proc．Natl．Acad.Sci．USA 8 7:3319-3323（1990）；Blank et al.，Nature 337:187-189（1989）；Lanier et al.，Nature 342:803-805（1989）；Kurosaki and Ravetch，Nature 342:805-8 07（1989）；Hibbs et al.，Science 246:1608-1611（1989）；Anderson et al. ，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 87:2274-2278（1990）；Irving and Weiss，Cel l 64:891-901（1991））。ところが、マウスとヒトの低親和性Fcレセプターファミリーを比較したところ、ヒトのFcRγIIAとCアイソフォームに対応するものがマウスにはないことが明らかになった。これが理由の一つであるが、それらの機能は未だ明らかにされていない。 CD4のみに基づく体液性因子は、インビボでの有効性が限られているかもしれないので、まずHIVに対する細胞性免疫が増加する可能性を調べた。CD4の細胞外ドメインを、T細胞レセプター、IgG Fcレセプター、またはB細胞レセプターなどのシグナル伝達因子の膜貫通ドメインおよび／または細胞内ドメインに融合させた蛋白質キメラの調製物が同定されている（U.S.S.N．07/847,566および07/665,96 1、本明細書に参照として包含される）。細胞外CD4ドメインを含むキメラを発現している細胞傷害性T細胞は、HIVのエンベロープ蛋白質を発現している細胞性標的をMHC非依存的に強力に破壊することが分かった。この研究方法の極めて重要で新しい部分は、凝集するだけで細胞性応答を開始させることができる、単一の T細胞レセプター、FcレセプターおよびB細胞レセプター鎖を同定してきたことである。この方法を特に有用に応用したものの一つが、細胞傷害性T型リンパ球に、HIVのgp120を発現している細胞を認識し、それを破壊することを指示する、CD 4とζ、η、またはγとの間のキメラの発明である（U.S.S.N．07/847,566および 07/665,961、本明細書において参照として包含される）。発明の概要一般的に、本発明は、哺乳動物において、HIV感染細胞に対する細胞性免疫応答を誘導する方法を特徴とする。本発明は、哺乳動物に治療用細胞を有効量投与することを含むが、この治療用細胞は、（a）HIV感染細胞を特異的に認識して結合することができるが、HIV感染を媒介しない、CD4の断片を含む細胞外部分、および（b）レセプターに結合したHIV感染細胞を破壊するシグナルを治療用細胞に送ることができる細胞内部分を含む、膜結合型蛋白質キメラレセプターを発現している。関連する方法において、本発明は、HIV関連疾患を治療するための薬剤の製造において、（a）HIV感染細胞を特異的に認識して結合することができるが、HIV 感染を媒介しない、CD4の断片を含む細胞外部分、および（b）レセプターに結合したHIV感染細胞を破壊するシグナルを治療用細胞に送ることができる細胞内部分を含む、膜結合型蛋白質キメラレセプターを発現している治療用細胞を利用することを特徴とする。第二の局面において、本発明は、（a）HIV感染細胞を特異的に認識して結合することができるが、HIV感染を媒介しない、CD4の断片を含む細胞外部分、および（b）レセプターに結合したHIV感染細胞を破壊するシグナルを治療用細胞に送ることができる細胞内部分を含む、蛋白質性膜結合型キメラレセプターを発現する細胞を特徴とする。これら２つの局面の、好ましい態様において、CD4断片は、CD4の1〜394番目のアミノ酸、またはCD4の1〜200番目のアミノ酸である。；CD4断片は、図26に示されたCD7の膜貫通ドメインにより、または図25に示したヒトIgG1分子のヒンジ、C H2およびCH3ドメインにより、細胞内部分から分離されている。；レセプターは、CD7の膜貫通部分を含む。；レセプターは、CD5の膜貫通部分を含む。；レセプターは、CD34の膜貫通部分を含む。；CD4断片は、一つまたは複数の蛋白質のアルフアヘリックスにより、治療用細胞の細胞膜から分離されている。；CD4断片は、少なくとも48オングストローム、または少なくとも72オングストローム、治療用細胞の細胞膜から分離されている。；細胞内部分は、T細胞レセプター蛋白質（例えばζ）、B細胞レセプター蛋白質、またはFcレセプター蛋白質のシグナル伝達部位である。；治療用細胞は、（a）Tリンパ球、（b）細胞傷害性Tリンパ球、（c）ナチュラルキラー細胞、（d）好中球、（e）顆粒球、（f）マクロファージ、（g）肥満細胞、（h）ヒーラ細胞、および（i）胚性未分化細胞（ES）から成る群より選ばれる。別の局面において、本発明は、本発明のキメラレセプターをコードするDNAを特徴とし、また、そのキメラレセプターDNAを含むベクターを特徴とする。本発明の特別な態様は、CD4とゼータとのキメラであるが、例えば、顆粒球やB 型リンパ球のレセプターのように、これらの分子と類似の機能をもつレセプター鎖であれば、ここで開示されている目的のために用いることができよう。望ましい免疫細胞誘因分子に特徴的な性質には、自律的に発現できること（すなわち、一本鎖として）、細胞外CD4ドメインに融合して、その結果できたキメラが治療用細胞の表面に存在できること、および標的リガンドとの会合に次いで起こる凝集によって細胞エフェクタープログラムを開始できることが含まれる。今のところ、キメラを免疫系細胞に輸送するための最も便利な方法は、遺伝子治療の何らかの形による。しかし、細胞を、適当に可溶化した精製キメラ蛋白質と混合することにより、キメラレセプターをもつ免疫系細胞を再構築すると、HI V感染標的に応答することができる加工された細胞集団が形成される。例えば、治療目的でCD4分子を赤血球に導入するために、同様の方法が用いられている。この場合、加工された細胞集団は、自己再生できないこともある。本発明は、免疫細胞にHIV感染細胞を認識して破壊させることができる、CD4断片とT細胞レセプター、B細胞レセプター、またはFcレセプターのサブユニットとの間にできた、機能的で単純なキメラに関連する。哺乳動物において、細胞応答を誘導するための方法は、HIV感染細胞を認識して破壊することができる治療用細胞（例えば、細胞傷害性Tリンパ球）を有効量、哺乳動物に投与することを含む。本発明はまた、細胞傷害性Tリンパ球がHIV感染細胞を認識して破壊するよう誘導するキメラレセプター蛋白質、キメラレセプターを含むベクターによって形質転換された宿主細胞、およびキメラレセプターに対する抗体を含む。本発明の、これらおよびその他の無制限の態様は、以下の本発明に関する詳細な説明を読めば、当業者には明らかであろう。以下の詳細な説明において、分子生物学および免疫学の分野における当業者に知られたさまざまな方法論が参照されるであろう。参照された既知の方法論を示した出版物その他は、本明細書に、すべてが示されているものとして参照として包含される。組み換えDNA技術の一般原理を述べた標準的な参照文献には、「ワトソンら、遺伝子の分子生物学、第1巻および第2巻、ベンジャミン／カミングス出版社刊、カリフォルニア州メンロパーク（1987）」、「ダーネルら、分子細胞生物学、サイエンティフィックアメリカン出版社刊、ニューヨーク州ニューヨーク（1986）」、「レウイン、遺伝子II、ジョン・ウイリー・アンド・サンズ社刊、ニューヨーク州ニューヨーク（1985）」、「オールドら、遺伝子操作の原理:遺伝子工学への手引き、第二版、カリフォルニア大学出版部刊、カリフォルニア州バークレー（1981）」、「マニアティスら、分子クローニング:実験手引き、第二版、コールドスプリングハーバー研究所刊、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（1989）」、および「オースベルら、分子生物学最新プロトコール、ウイリー出版刊、ニューヨーク州ニューヨーク（1989）」などがある。定義「クローニング」とは、インビトロの組み換え技術を利用し、特定の遺伝子またはDNA配列をベクター分子に挿入することを意味する。「cDNA」とは、RNA依存性DNAポリメラーゼ（逆転写酵素）によって、RNAを鋳型にして作出された相補的DNAまたは複製DNAを意味する。したがって、「cDNAクローン」とは、クローンニングベクターにより運搬される、問題とするRNAに相補的な二本鎖DNA配列を意味する。「cDNAライブラリー」とは、cDNAライブラリー作製時に細胞によって発現されているmRNAのDNAコピーを含むcDNA挿入物を含む組換えDNA分子の集合を意味する。このようなcDNAライブラリーは、当業者に既知の、例えば、オースベルら（前掲）やマニアティスら（前掲）で説明されている方法にしたがって調製されるであろう。一般的に、まずRNAは、クローニングしようとしている特定の遺伝子が含まれているケノムをもつ生物の細胞から分離される。本発明の目的にとって好ましいのは、哺乳動物、特にヒトのリンパ球細胞系である。この目的にとって好ましいベクターは、今のところワクシニアウイルスのWR株である。「ベクター」とは、例えば、プラスミド、バクテリオファージ、または哺乳類もしくは昆虫のウイルスに由来するDNA分子に、DNA断片を挿入ないしクローニングしたものを意味する。ベクターは、一つ以上の一箇所切断の制限酵素部位をもち、クローン化した配列を一定の宿主や媒介生物の中で自律的に複製できる。したがって、「DNA発現ベクター」とは、組み換えペプチドの合成を行わせることができるいかなる自律的要素をも意味する。このようなDNA発現ベクターには、細菌のプラスミド、ファージ、および哺乳類や昆虫のプラスミドやウイルスが含まれる。「実質的に純粋な」とは、例えば、蛋白質やポリペプチド、抗体などの化合物が、本来それとともに存在する化合物を実質的に含まないことを意味する。一般的には、目的の化合物が試料中の全物質量の、少なくとも60％、好ましくは75％以上、最も好ましくは90％以上であれば、実質的に純粋であるという。純度は、カラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、HPLC分析などの適当な方法で測定できる。核酸に関して、「実質的に純粋な」とは、本発明のDNA が由来する生物の本来のゲノム中では、両方のコーディング配列に直接（すなわち、一方の5'端ともう一方の3'端が）連結しているが、どちらのコーディング配列とも直接には連結（すなわち、共有結合）していない核酸の配列、分節、または断片を意味する。本発明のcDNA配列のように、分子の「断片」とは、分子の連続的なヌクレオチドの部分集合を指すものとする。分子の「類似体」とは、自然に存在する分子の全体または断片と、実質的に類似した、自然には存在しない分子を指す。二つの分子のアミノ酸配列が実質的に同じであれば、ある分子は、もう一方の分子と「実質的に類似」しているといえる。実質的に類似したアミノ酸分子は、類似した生物学的活性をもつ。本明細書において用いられるように、ある分子が通常は持たない化学的構成部分を含んでいれば、その分子はもとの分子の「化学的誘導体」といえる。このような構成部分は、分子の可溶性や吸着性、生物学的半減期などを増加させよう。または、この構成部分は分子の毒性を軽減したり、分子の何らかの有害な副作用を除去したり、減少させたりするであろう。このような効果を媒介できる構成部分は、例えば「レミントンの薬剤学、第16版、マック出版社、ペンシルバニア州イーストン（1980）」に開示されている。本発明のレセプターキメラ遺伝子の「機能的誘導体」とは、塩基配列において「実質的に類似」し、例えば、T細胞、B細胞、Fcレセプターキメラと同じ活性をもつ分子をコードする遺伝子の「断片」ないし「類似体」を含むものとする。該誘導体は、野生型レセプターキメラの活性の、最も好ましくは90％、より好ましくは70％、好ましくは40％を有する。機能的キメラレセプター誘導体の活性には、HIV感染細胞に特異的に（細胞外CD4部位と）結合することと、その細胞を結果として破壊することが含まれる。さらに、キメラレセプターは、レセプターをもつ細胞にHIV感染に対する感受性をもたらさない。キメラレセプターの活性は、例えば、本明細書に記載の、いかなるアッセイ法を用いて測定してもよい。本発明のCD4レセプターのキメラをコードするDNA配列、またはその機能的誘導体を、通常の技術にしたがって、ベクターDNAに組み込ませてもよい。これらの技術には、ライゲーションのための平滑末端もしくは付着末端、適当な末端を提供するための制限酵素消化、適当な付着末端にするための補填、不要な結合を防ぐためのアルカリホスファターゼ処理、および適当なライゲースによるライゲーションが含まれる。このような操作のための技術は、マニアティスら（前掲）によって開示されており、当業者に周知である。 DNAのような核酸分子は、転写および翻訳を制御する情報を含む塩基配列を含み、この配列がポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と「機能的に連結」していれば、ポリペプチドを「発現することができる」といわれる。機能的な連結とは、制御のためのDNA配列と、発現させようとするDNA配列とを、遺伝子発現できるような方法で結びつけた連結をいう。遺伝子に必要とされる制御領域の厳密な性質は、生物によってさまざまであろうが、一般的には、プロモーター領域を含み、原核生物においては、プロモーター（RNA転写開始を促す）だけでなく、R NAに転写されてから蛋白質合成の開始のシグナルとなるDNA配列も含まれる。このような領域には通常、TATAボックス、キャッピング配列、CAAT配列など、転写および翻訳の開始に関わる5'非翻訳配列が含まれるであろう。必要であれば、蛋白質をコードする遺伝子配列の3'側非翻訳領域を、上述の方法によって得ることができる。この領域は、転写終結とポリアデニル化などの転写終結の制御配列として保持されているのかもしれない。したがって、蛋白質をコードするDNA配列に本来隣接している3'領域を保持することで、転写終結シグナルが提供されるかもしれない。発現宿主細胞で、転写終結シグナルが十分に機能しないときは、宿主細胞中で機能する3'領域に置き換えてもよい。二つのDNA配列（プロモーター領域の配列およびCD4レセプターのキメラをコードする配列）は、二つのDNA配列の間の結合の性質が、（1）フレームシフト突然変異を導入せず、（2）プロモーター領域の配列の、レセプターのキメラ遺伝子配列を転写を促す能力を阻害せず、（3）レセプターのキメラ遺伝子配列の、プロモーター領域配列によって転写される可能性を阻害しなければ、機能的に結合しているといわれる。プロモーター領域は、プロモーターがDNA配列の転写に効果をもたらすようであれば、そのDNA配列に機能的に連結されたことになるであろう。したがって、蛋白質を発現させるためには、転写および翻訳シグナルが適正な宿主によって認識されることが必要である。本発明には、CD4レセプターのキメラ蛋白質（またはその機能的誘導体）の、原核細胞または真核細胞における発現も含まれる。しかし、真核細胞（特にヒトリンパ球）で発現するものが好ましい。本発明による抗体は、さまざまな方法のうちの何れによって調製してもよい。例えば、CD4レセプターキメラ蛋白質、またはその機能的誘導体を発現している細胞を動物に投与すれば、キメラに結合できるポリクローナル抗体を含んだ血清の産生を誘導することができる。好ましい態様において、本発明による抗体はモノクローナル抗体である。このようなモノクローナル抗体は、ハイブリドーマの技術を用いて調製することができる（Kohler et al.，Nature 256:495（1975）；Kohler et al.，Eur．J．Immu nol．6:511（1976）；Kohler et al.，Eur．J．Immunol．6:292（1976）；Hamme rling et al.，モノクローナル抗体とT細胞ハイブリドーマ，Elsevier，N．Y.， pp．563-684（1981））。一般的に、このような処理過程には、CD4レセプターキメラ抗原で動物を免疫することが含まれる。この動物の脾細胞を抽出して、適当なミエローマ細胞株と融合させる。適当なミエローマ細胞系であれば如何なるものも、本発明にしたがって用いることができる。融合させた後、得られたハイブリドーマ細胞は、選択的にHAT培地中で維持され、ワンズら（Gastroenterology 80:225-232（1981））が述べているように、限られた希釈度で増殖される。それから、このような選択によって得たハイブリドーマ細胞を、キメラに結合できる抗体を分泌するクローンを同定するために調べる。また、本発明による抗体はポリクローナル抗体、または好ましくは領域特異的ポリクローナル抗体であってもよい。本発明によるCD4レセプターキメラに対する抗体は、患者におけるキメラレセプター（またはキメラレセプターをもつ細胞）の量を測定するために用いられうる。このような抗体は、フォワードサンドイッチアッセイ、リバースサンドイッチアッセイ、および同時サンドイッチアッセイなどのイムノメトリックまたは「サンドイッチ」アッセイを含む、当業者に知られている標準的な免疫診断アッセイに用いるのに適している。この抗体は、適当な特異性、感度、および精度をもつ免疫アッセイ法を作成するための不必要な実験を行わずに、当業者によって決められた、いくつもの組み合わせにおいて用いることができる。免疫学の一般原理について述べられた標準的な参照文献には、「ロイト、免疫学要論、第６版、ブラックウエル科学出版社刊、オクスフォード（1988）」、「キンボール、免疫学への手引き、第２版、マクミラン出版社刊、ニューヨーク（ 1986）」、「ロイトら、免疫学、ゴワー医学出版社刊、ロンドン（1985）」、「キャンベル、「モノクローナル抗体の技術」、バードンら編による生化学および分子生物学における実験技術、第13巻、エルスビア社刊、アムステルダム（1984 ）」、「クライン、免疫学：自己-非自己認識の科学、ジョンウイリー・アンド・サン社刊、ニューヨーク（1982）」、および「ケネットら編、モノクローナル抗体、ハイブリドーマ：生物学的解析の新次元、プレナムプレス社刊、ニューヨーク（1980）」が含まれる。「検出」とは、ある物質の存在の有無を判定または定量することを含むものとする。したがって、この語は、質的および量的な測定を行うために、本発明の物質、組成物、および方法を利用することに関連する。本発明の抗体および実質的に精製された抗原は、理想的にはキットの調製に適したものである。そのようなキットは、バイアルやチューブなどの一個以上の容器に密封された形で受け取るために区画化された輸送手段を含む。ただし、該容器にはそれぞれ、用いられるアッセイ法に必要な成分が別々に含まれている。キットという形に包含されうるアッセイ法のタイプはさまざまで、例えば、競合アッセイ法や非競合アッセイ法が含まれる。本発明の抗体を利用できる典型的な例は、放射性免疫アッセイ法（RIA）、酵素免疫アッセイ法（EIA）、固相酵素免疫アッセイ法（ELISA）、およびイムノメトリックないしサンドイッチ免疫アッセイ法である。「イムノメトリックアッセイ法」または「サンドイッチ免疫アッセイ法」とは、同時サンドイッチ、フォワードサンドイッチ、およびリバースサンドイッチ免疫アッセイ法を含むものとする。これらの語は、当業者に十分理解されている。また、当業者は、本発明による抗体が、現在知られている他の形のアッセイ法、または将来開発されるアッセイ法においても役に立つと評価することであろう。これらも本発明の範囲に含まれるものとする。「特異的に認識して結合する」とは、抗体が、キメラレセプターポリペプチドを認識して結合し、生物試料などの試料中の他の無関係な分子を実質的には認識しないことを意味する。「治療用細胞」とは、HIV感染細胞を認識して破壊するために、本発明のCD4レセプターキメラで形質転換された細胞を意味するが、好ましくはそのような細胞は、造血系の細胞である。「細胞外」とは、少なくとも分子の一部を細胞表面に露出させていることを意味する。「細胞内」とは、少なくとも分子の一部を治療用細胞の細胞質に露出させていることを意味する。「膜貫通」とは、少なくとも分子の一部が原形質膜に広がっていることを意味する。本明細書において用いられる、「細胞外部分」、「細胞内部分」および「膜貫通部分」とは、隣接する細胞区画の中に続く、隣接アミノ酸配列も含むものとする。「重合」とは、二量体、三量体、四量体、またはそれ以上の多量体を形成するために、他の蛋白質と複合体を作ることを意味する。このような多量体は、ホモ多量体またはヘテロ多量体であろう。「重合部位」とは、複合体（すなわち、多量体）を形成させる、分子の領域のことである。「細胞傷害性の」とは、細胞（例えば、HIV感染細胞）を破壊できること、または感染因子（例えば、HIVウイルス）を破壊できることを意味する。「免疫不全ウイルス」とは、野生型において、宿主霊長類のT4細胞に感染することができ、ウイルス形態形成を行い、レンチウイルス亜科の形態的特徴を有するレトロウイルスを意味する。この語には、HIVおよびSIVのあらゆる変異体、例えば、HIV-1、HIV-2、SIVmac、SIVagm、SIVmnd、SIVsmm、SIVman、SIVmand、SIV cpzなどを無制限に含む。「MHC非依存的」とは、細胞傷害応答に、標的細胞の表面にMHCクラスII抗原が存在しなくてもよいことを意味する。「機能的な細胞傷害シグナル伝達誘導体」とは、野生型分子の生物学的活性の少なくとも40％、より好ましくは70％、最も好ましくは90％以上を発揮できる機能的な誘導体（既に定義されている）を意味する。本明細書において用いられるように、「機能的な細胞傷害シグナル伝達誘導体」は、治療用細胞に、レセプターに結合した病原体または細胞を破壊するよう直接シグナルを送る作用をすることもあり（細胞内にキメラレセプター部位がある場合）、または治療用細胞の細胞傷害シグナル伝達蛋白質による重合を促進することによって間接的に作用することもある（例えば、膜貫通部位の場合）。そのような誘導体は、本明細書に記載のインビトロ測定法などを用いて、その有効性を調べてもよい。「機能的HIVエンベロープ結合誘導体」とは、HIVのいかなるエンベロープ蛋白質にも結合できる機能的な誘導体（既に定義されている）を意味する。機能的な誘導体は、例えば、ここにおいて述べられているインビトロ測定法を用いて同定されうる。治療用投与本発明の形質転換細胞は、免疫不全ウイルスの治療に用いられる。このような形質転換細胞を投与する最近の方法は、養子免疫治療法か細胞移入法を含む。これらの方法においては、形質転換された免疫系細胞を血流の中に戻す。ローゼンバーグ、サイエンティフィックアメリカン 62（1990、5月）；ローゼンバーグら、ニューイングランド医学誌 323（9）:570（1990）。本発明の薬剤学的組成物は、本発明の組成物がもたらす有益な効果を受けるであろう動物に投与される。そのような動物の中でもとりわけヒトが重要であるが、それに限定するものではない。詳細な説明まず、図面について説明する。図面の簡単な説明図１Aは、CD4（1〜369残基目）と異なったレセプター鎖との間の融合部位付近のアミノ酸配列を示す。下線部の配列は、融合蛋白質を構築するのに用いたBamH I部位がコードするアミノ酸の位置を示している。膜貫通ドメインが開始するところを縦線で示した。η配列は、アミノ末端でゼータ配列と一致しているが、カルボキシル末端では異なっている（Jin et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 8 7:3319-3323（1990））。図１Bは、CV1細胞中のCD4、CD4:ζ、CD4:γ、およびCD4:ηの表面発現をフローサイトメトリー分析した結果を示す。CD4キメラまたはCD16_PIを発現するウイルスを細胞に感染させ、37℃で９時問インキュベートして、フィコエリスリンを結合した抗CD4モノクローナル抗体Leu3Aで染色した。図２は、CD16_TMの表面発現を、CD16_TMのみ感染させた場合（詰まった点線）、 CD4:γを発現するウイルスと同時感染させた場合（鎖線）、CD4:ζを発現するウイルスと同時感染させた場合（実線）について示している。間隔が開いた点線は、CD4:ζのみを感染させた細胞を3G8で染色したものを示している（Fleit et al .，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 79:3275-3279（1982））（抗CD16 MAb）。図３は、CD16_TMを発現するウイルスと以下のζキメラとを同時感染させた細胞におけるCD16_TMの表面発現を示す。CD4:ζ（太線）、CD4:ζC11G（実線）、CD4: ζ（鎖線）、CD4:ζC11G/D15G（濃い点線）、同時感染なし（CD16_TMのみ、薄い点線）。細胞を抗CD16モノクローナル抗体3G8と、フィコエリスリンを結合した、マウスIgGに対するFab'₂ヤギ抗体とでインキュベートした。ζキメラの発現レベルは、解析に用いられた異なった変異体について、実質的に同じだった。また、CD16_TMとζキメラを発現するウイルスを細胞に同時感染させても、キメラの表面発現は、目に見える範囲では変化しなかった。図４A〜Dは、T細胞系のζキメラ変異体を架橋させた後の、遊離カルシウムイオンの細胞内での増加を示している。Jurkat E6細胞（Weiss et al.，J．Immuno l. 133:123-128（1984））を組み換えワクシニアウイルスに感染させ、フローサイトメトリーで解析した。CD4⁺集団のみをまとめたものについての結果を示す。そのため、関連のキメラ蛋白質を発現している細胞のみを解析している。紫と青のインド-1蛍光の平均比は、集団全体における細胞内の遊離カルシウム濃度を表す。また、反応細胞の割合は、予め決められた閾値率（無処理細胞の10％が陽性になるよう設定した）を上回る細胞の割合を表す。図４Aおよび図４Bは、CD4:ζ（実線）またはCD16:ζ（鎖線）を発現しているJur kat細胞を抗CD4モノクローナル抗体Leu3a（フィコエリスリン結合体）に曝してから、マウスIgGに対するヤギ抗体と架橋させた。点線は、非感染細胞の抗CD3モノクローナル抗体OKT3に対する反応を示す。図４Cおよび４Dは、図４Aおよび図４Bと同じように処理して解析された、CD4:ζD15G（実線）、CD4:ζCIIG/D15G（鎖線）、またはCD4:ζCIIG（点線）を発現しているJurkat細胞を表している。図５A〜Cは、CD4:ζ、CD4:ηおよびCD4:γレセプターが、細胞傷害性T型リンパ球（CTL）にHIV-1のgp120/41を発現している標的を破壊させることを示している。図５A：黒丸は、CD4:ζを発現しているCTLを、gp120/41を発現しているヒーラ細胞とインキュベートしたもの、白丸は、CD4:ζを発現しているCTLを、未感染ヒーラ細胞とインキュベートしたもの、黒四角は、非感染のCTLだけを、gp120 /41を発現しているヒーラ細胞とインキュベートしたもの、白四角は、非感染のCTLだけを、未感染のヒーラ細胞とインキュベートしたものである。図５B：黒丸は、C D4:ηを発現しているCTLを、gp120/41を発現しているヒーラ細胞とインキュベートしたもの、白丸は、CD4:γを発現しているCTLを、gp120/41を発現しているヒーラ細胞とインキュベートしたもの、白四角は、C11G/D15G二重変異体のCD4:ζ キメラを発現しているCTLを、gp120/41を発現しているヒーラ細胞とインキュベートしたものである。図５C：図５Bで用いられたCTLを使ったCD4発現のフローサイトメトリー解析である。標的のエフェクターに対する比率を補正するために、ヒストグラムに上乗せされる部分から見積もられた負の（非感染）集団を引き算して、CD4キメラを発現している細胞の百分率を決定したが、この図では、比較し易くするために、非感染細胞に適当な閾値を与えて、ヒストグラムの引き算をしたときのように、ほぼ同じ画分が他の細胞集団でも対応するようにした。図６A〜Bは、CD4が左右する細胞傷害の特異性を示す。図６A：黒丸は、CD16_PI を発現しているヒーラ細胞とともにインキュベートした、CD4:ζを発現している CTLで、白丸は、gp120を発現しているヒーラ細胞とともにインキュベートした、 CD4:ζを発現しているCTL、黒四角は、gp120/41を発現しているヒーラ細胞とともにインキュベートした、CD16:ζを発現しているCTL、白四角は、gp120/41を発現しているヒーラ細胞とともにインキュベートした、CD16_PIを発現しているCTL である。図６B：黒丸は、Raji（MHC class II⁺）細胞とともにインキュベートした、CD4:ζを発現しているCTLで、白丸は、RJ2.2.5（MHC class II^-Raji変異体）細胞とともにインキュベートした未感染のCTL、黒四角は、Raji（MHC class I I⁺）細胞とともにインキュベートした未感染のCTL、白四角は、RJ2.2.5（MHC cl ass II^-）細胞とともにインキュベートした、CD4:ζを発現しているCTLである。図７A〜Bは、CD16:ζキメラレセプターの特徴を示す。図７Aは、CD16:ζ融合蛋白質の略図解である。ホスファチジルイノシトールに結合した形のCD16単量体の細胞外部位を、ζ二量体と膜貫通ドメインのすぐ外側に連結した。融合部の蛋白質の配列が、一番下に示してある。図７Bは、CD16:ζキメラをTCRをもつ細胞系またはTCRをもたない細胞系の何れかと架橋させた後の、カルシウム移動のフローサイトメトリー分析を示す。抗体処理した0秒後からの、細胞集団の紫色光と青色光の平均比（相対的なカルシウムイオン濃度の測定値）が示されている。黒四角、抗CD3モノクローナル抗体OKT3に対するJurkat細胞の反応；黒三角、REX33A TCR^- 変異体中で架橋したときの、抗CD16モノクローナル抗体3G8に対するCD16:ζの反応；白四角、Jurkat TCR^-変異系統JRT3.T3.5中のCD16:ζ架橋に対する反応；白三角、Jurkat細胞中でのCD16:ζ架橋に対する反応；十字、Jurkat細胞のキメラでないCD16に対する反応；点線、REX33A TCR^-変異体系統中のキメラでないCD16 に対する反応。図８A〜Bは、細胞傷害能力のデリーション分析を示している。図８Aにζ欠失の終点の位置を示す。他と同じように、ここでも、ζにおける突然変異を元の残基-位置-変異残基で表す慣例法によって示した。つまり、例えば、D66*というのは66番目のアスパラギン酸を終止コドンで置き換えたことを意味する。図８Bに、欠失させてないCD16:ζと結果が異なったζ欠失変異体の細胞破壊測定結果を示す。CD16に対する表面抗体を発現しているハイブリドーマ細胞に⁵¹Crを結合させて、CD16:ζキメラを発現する組み換えワクシニアウイルスを感染させたヒト細胞傷害性リンパ球（CTL）の数を増やしながらインキュベートした。遊離した⁵ ¹ Crの割合を、エフェクター（CTL）の標的（ハイブリドーマ）細胞に対する比（ e/t）の関数としてプロットした。黒丸、CD16:ζ（mfi 18.7）を発現している細胞によって媒介される細胞傷害；黒四角、CD16:ζAsp66*（mfi 940.2）を発現している細胞によって媒介される細胞傷害；白四角、CD16:ζGlu60*（mfi 16.0）を発現している細胞によって媒介される細胞傷害；白丸、CD16:ζTyr51*（mfi 1 7.4）を発現している細胞によって媒介される細胞傷害；黒三角、CD16:ζPhe34* （mfi 17.8）を発現している細胞によって媒介される細胞傷害；白三角、キメラでないCD16（mfi 591）を発現している細胞によって媒介される細胞傷害。この実験では、CD16:ζAsp66*の発現が、他の融合蛋白質の発現と異なっていたが、同じ実験で、同程度にCD16:ζを発現している細胞による細胞傷害における結果と、CD16:ζAsp66を発現している細胞による細胞傷害とが本質的に同じであった。図９A〜Dは、膜貫通相互作用をする能力を取り除くと、ζの短い断片でも細胞傷害を媒介できることを明らかにしている。図９Aは、２つの部分または３つの部分からなる単量体キメラの概略図である。一番上は、６５残基目までをもつ欠失体で、膜貫通残基のシステインとアスパラギン酸残基をもたないCD16:ζ構築体である。その下は、CD16:CD5:ζおよびCD16:CD7:ζ構築体とそれに関連する対照である。細胞内ドメインのペプチド配列を下に示した。図９Bは、単量体キメラ欠失変異体の細胞傷害活性を示す。CD16:ζを発現する細胞の細胞傷害活性（黒丸；mfi 495）を、CD16:ζAsp66*を発現する細胞の活性（黒四角；mfi 527）またはCD16:ζCys11Gly/Asp15Gly/Asp66*変異体の活性（白四角；mfi 338）、CD16 :ζCys11Gly/Asp15Gly/Glu60*変異体の活性（黒三角；mfi 259）と比較した。図９Cは、３つの蛋白質を融合した蛋白質に媒介される細胞傷害活性を示す。黒三角、CD16:ζAsp66*；白四角、CD16:5:ζ（48-65）；黒四角、CD16:7:ζ（48-65 ）；白三角、CD16:7:ζ（48-59）；白丸、CD16:5；黒丸、CD16:7。図９Dは、TCR をもたないJurkat JRT3.T3.5変異細胞系における、変異体と３部分からなるキメラによるカルシウム移動を示したものである。白丸、二量体CD16:ζAsp66*を発現している細胞の反応；黒四角、CD16:ζCys11Gly/Asp15Gly/Asp66*を発現している細胞の反応；白四角、CD16:ζCys11Gly/Asp15Gly/Glu60*を発現している細胞の反応；黒三角、CD16:7:ζ（48-65）を発現している細胞の反応；白三角、CD 16:ζ（48-59）を発現している細胞の反応。図10A〜Fは、18残基のシグナル伝達モチーフ活性に対する各アミノ酸の寄与を示している。図10Aと10Bは、細胞傷害活性を、図10Cは、カルボキシル末端のチロシン（Y62）付近に点突然変異をもつキメラによって媒介されるカルシウムイオンの移動を示したものである。図10Aと10Bは、CD16:ζ融合蛋白質をそれぞれ少量または多量に発現する細胞について集めたデータである。カルシウム移動測定と、細胞傷害測定とは同じ記号が用いられており、右側に一文字コードが示されている。黒丸、CD16:ζを発現している細胞（mfi Aでは21; B、376）；黒四角、CD16:7:ζ（48-65）を発現している細胞（mfi A、31; B、82）；白四角、CD16 :7:ζ（48-65）Glu60Gln（mfi A、33; B、92）；十字、CD16:7:ζ（48-65）Asp6 3Asn（mfi A、30; B、74）；黒三角、CD16:7:ζ（48-65）Tyr62Phe（mfi A、24; B、88）；白丸、CD16:7:ζ（48-65）Glu61Gln（mfi A、20; B、62）；白三角、 CD16:7:ζ（48-65）Tyr62Ser（mfi B、64）。図10Dと10Eは、細胞傷害活性を、図10Fは、アミノ末端のチロシン（Y51）付近に点突然変異をもつキメラによるカルシウムイオンの移動を示したものである。カルシウム移動測定と細胞傷害測定とは同じ記号が用いられており、右側に示されている。黒丸、CD16:ζを発現している細胞（m fi Dでは21.2; Eでは672）；黒四角、CD16:7:ζ（48-65）を発現している細胞（ mfi D、31.3; E、179）；黒三角、CD16:7:ζ（48-65）Asn48Ser（mfi D、22.4; E、209）；白四角CD16:7:ζ（48-65）Leu50Ser（mfi D、25.0; E、142）；白三角、CD16:7:ζ（48-65）Tyr51Phe（mfiD、32.3; E、294）。図11A〜Bは、ζの内部反復配列と、細胞傷害を補助する能力の比較を示す。図 11Aは、ζの細胞内ドメインを３つに分けて、それらにCD16:7キメラの膜貫通ドメインをつけ加えて作り上げたキメラの略解図である。細胞内ドメインの配列を下に示しているが、共通の残基は線で囲み、関連するアミノ酸残基は星印を付けてある。図11Bは、ζの３つの分割したドメインの細胞傷害能力を示している。黒丸、CD16:ζを発現している細胞（mfi 476）；黒四角、CD16:7:ζ（33-65）（ mfi 68）；白四角、CD16:7:ζ（71-104）（mfi 114）；黒三角、CD16:7:ζ（104 -138）（mfi 104）。図12は、CD16:FcRγ11キメラの略解図である。図13A〜Bは、CD4:FcRγIIキメラ、およびCD16:FcRγIIキメラを架橋した後の、カルシウムの移動を示したものである。図13Aは、カルシウムを識別する蛍光体インド-1を含んだ細胞が放つ紫色光の青色光に対する比を、CD16の細胞外ドメインに抗体を架橋してからの時間の関数として表してある。図13Bも、同じように、抗体を架橋した後の、CD4:FcRγIIキメラを含む細胞の紫色光の青色光に対する比の増加を解析したものである。図14A〜Bは、CD4:FcRγIIキメラおよびCD16:FcRγIIキメラの細胞傷害測定を示している。図14Aは、抗CD16ハイブリドーマ（標的）細胞に、CD16:FcRγIIキメラ（エフェクター細胞）を発現している細胞傷害性T型リンパ球を増加させながら接触させたとき、ハイブリドーマ細胞から遊離する⁵¹Crの割合を示している。図14Bは、同様に、HIVエンベロープ糖蛋白質を発現している標的細胞に対する、CD4:FcRγIIキメラによって媒介される細胞傷害の解析結果を示している。図15A〜Eは、細胞傷害にとって重要なFcRγII Aテールの中の残基を同定を示す。図15Aは、欠失構造体の概略図である。図15Bと15Cは、CD16:FcRγII Aのカルボキシル末端側欠失変異体によるカルシウム移動と細胞傷害を示す。図15Dと15Eは、アミノ末端から次第に削っていったために、CD16:FcRγII Aの細胞内のテール部分が短くなった、３つの部分からなるキメラによるカルシウム移動と細胞傷害を示す。図16（配列番号:24）は、CD3デルタレセプター蛋白質のアミノ酸配列を示す。線で囲った配列は、好ましい細胞傷害シグナル伝達部位を表している。図17（配列番号:25）は、T3ガンマレセプター蛋白質のアミノ酸配列を示す。線で囲った配列は、好ましい細胞傷害シグナル伝達部位を表している。図18（配列番号:26）は、mb1レセプター蛋白質のアミノ酸配列を示す。線で囲った配列は、好ましい細胞傷害シグナル伝達部位を表している。図19（配列番号:27）は、B29レセプター蛋白質のアミノ酸配列を示す。線で囲った配列は、好ましい細胞傷害シグナル伝達部位を表している。図20A〜Eは、CD4キメラの略図を示す。分子「Ａ」は、CD4（D1-D4）:Ig:CD7；分子「Ｂ」は、CD4（DL、D2）:Ig:CD7；分子「Ｃ」は、CD4（D1-D4）:Ig:CD7:ζ ；分子「Ｄ」は、CD4（D1,D2）:Ig:CD7:ζ；分子「Ｅ」は、CD4:ζである。ヒト Ig配列にあたるcDNAをワクシニアウイルスの組み換え体で発現させたことを除けば、既に説明したようにして、（zettlmeissl et al.，DNA Cell Biol．9:347（ 1990））ヒトCD4分子の前駆体のアミノ酸1〜394に当たるCD4分子の細胞外ドメインを、ヒトIgG1のヒンジ、CH1およびCH2ドメインにBamHI部位で連結した。CD4前駆体cDNAの唯一のNheI部位（アミノ酸配列の200番目に当たる）にBamHIアダプターを挿入して、CD4キメラの２つのドメインをもつキメラを作製した。ヒト膜結合IgG1の第一エクソンの22残基からなる膜結合配列の後ろにCD7のアミノ酸残基1 46〜203をつないだ。ζの55から163までのアミノ酸を４つの部分からなる構築体のトリガーモチーフとして用いた（CおよびD）。ζ鎖を含む、４つの部分からなる構築体におけるζの細胞内発現については、購入可能な、細胞内ドメインに対する抗体を用いて行った記録がすでにある（Coulter社）。図21は、CD4に由来するさまざまなキメラをエフェクター分子として発現している細胞傷害性T細胞クローン油3によって媒介される、HIV-1エンベロープ糖蛋白質を発現している標的細胞の破壊を示す。細胞傷害性測定のために、ヒトCD8⁺ CD4^- HLA B44に限定されたT細胞系WH3を、本明細書で既に説明されているように、10 ％ヒト血清を添加したIMDMで維持した。ガンマ線照射（3000 rad）した、B44をもつ単核球と、1μg/mlの植物血液凝集素（PHA）で細胞を刺激した。刺激後1日経ったところで、新しい培地を加えてPHAを0.5μg/mlに希釈し、３日後には完全に培地を交換した。細胞傷害を測定するまで、少なくとも10日間は細胞を増殖させた。本明細書においてVPE16と表わされる適当な組み換えワクシニアウイルスを細胞に感染させた。完全培地中で、3〜4時間感染を継続させた後、遠心分離で回収して、1×10⁷/mlの密度になるよう再懸濁した。このうち100μlを、各ウエル毎に100μlの完全培地を入れたU底マイクロタイタープレートに加え、2回段階希釈した。各サンプルにつき２つのウエルにはリンパ球を入れないで、無作為にクロムを遊離させて、クロムの取り込み全体を測定した。ヒーラ亜系細胞S3（He La-S3、ATCC）を標的細胞として、上記のように、10 cmプレート中でVPE16に感染させた。10⁶個の感染細胞をPBSと１mM EDTAで剥離、遠心してから100μlの⁵¹C rクロム酸ナトリウム（PBS中１mCi/ml）で再懸濁し、37℃に１時間置いてからPB Sで３回洗浄した。標識した標的細胞を100μlずつ各ウエルに加えた。マイクロタイタープレートを750×gで1分間回転し、37℃で4時間インキュベートした。インキュベーション時間の最後に各ウエルの細胞を緩やかなピペッティングにより再懸濁し、全取り込みカウント数を測定するため、試料の一部を取ってから、マイクロタイタープレートを750×gで1分間回転した。上清の一部（100μl）を取って、ガンマ線シンチレーションカウンターで計測した。フローサイトメトリーによって測定された感染細胞の割合に合わせて、エフェクター:標的比を補正した。図22は、形質転換細胞系におけるHIV-1の複製を示している。野生型CD4とさまざまな組み換えキメラを安定して発現する細胞系を、ヒト胚腎細胞系293の亜系細胞から確立した。ヒトT細胞系C8166を指示細胞として用いた最終希釈分析で測定して、HIV-1IIIB単離物のウイルスストックをほぼ10⁶感染粒子/mlになるよう調製した。およそ１MOIで、37℃、8〜12時間感染を行なった。翌日、細胞をPBS で３回洗浄し、トリプシン処理して、新しいプレートに再び撒いて、培養上清は p24滴定（0日目とする）を行なうためにサンプリングした。その後、3〜4日間隔で細胞培養上清を回収して、p24分析を続けた。細胞には、濃度100μl/mlのハイグロマイシンBを含む新しい培地を補給した。市販のELISA法に基づくHIV-1 p24抗原測定キット（Coulter社）を、製造業者の提供する指示に従って用い、培養上清の解析を行なった。一つの期間について２回ずつ独立した実験を行なった結果を示した。図23は、CD4のD1-D4ドメイン（CD4 Bam）の塩基配列とアミノ酸配列を示す。図24は、CD4のD1-D2ドメイン（CD4 Nhe）の塩基配列とアミノ酸配列を示す。図25は、ヒトIgG1のヒンジ、CH2およびCH3ドメイン（Igh23 Bam）の塩基配列とアミノ酸配列を示す。図26は、CD7の膜貫通ドメイン（TM7 BamMlu）の塩基配列とアミノ酸配列を示す。図27は、ゼータの細胞内ドメイン（Zeta MluNot）の塩基配列とアミノ酸配列を示す。図28は、合成アルファヘリクスの塩基配列と主なアミノ酸配列を示す。実施例ＩヒトIgG1:レセプターキメラの構築 CH3ドメイン中の配列を、膜貫通型の抗体mRNAの3'末端からとったcDNA断片に結合させて、ヒトIgG1の重鎖配列を調製した。3'末端断片は、扁桃cDNAライブラリーを基質にして、目的のDNA断片の5'末端、3'末端それぞれに対応する次の配列をもつオリゴヌクレオチドを用いたPCR反応によって得た。CGC GGG GTG ACC G TG CCC TCC AGC AGC TTG GGC（配列番号:7）およびCGC GGG GAT CCG TCG TCC AG A GCC CGT CCA GCT CCC CGT CCT GGG CCT CA（配列番号:8）。5'側オリゴは、ヒトIgG1のCH1部位に相補的で、3'側オリゴは膜内ドメインをコードする配列の5' 端と相補的である。PCR産物をBstXIとBamHIで消化して、可変領域と定常領域をもつ半合成IgG1抗体遺伝子のBstXIとBamHI部位の間に結合させた。BstXIからBam HIまでの断片を挿入した後、構築物の増幅された部分のCH3のSmaI部位までを制限酵素断片と入れ換えて、SmaI部位と3'側オリゴの間の部分だけがPCR反応に由来するようにした。ヒトIgG1:ζキメラレセプターを作出するために、重鎖遺伝子のBamHI部位で終わる部分を、以下に説明するζキメラのBamHI部位に結合させて、抗体配列が細胞外部分を作るようにした。フローサイトメトリーによって、軽鎖cDNAをコードする発現プラスミドを共感染させると、キメラをコードするプラスミドを感染させたCOS細胞が抗体決定基を高レベルで発現し、この発現プラスミドを共感染させないと、抗体決定基の発現が少なくなることが分かった。ヒトIgG1にηまたはγを融合させたもの（下記参照）や、T細胞レセプターまたはFcレセプター蛋白質のシグナル伝達部位をもつような同様のキメラは、一般的に、上述したように分子生物学の標準的な技術を用いて構築することができる。軽鎖と重鎖の両鎖を一つのプロモーターから発現させる単一の転写ユニットを作出するために、重鎖と軽鎖をコードする配列と、grp78やBipとして知られる78 KDのグルコース制御蛋白質をコードするmRNAの5'非翻訳領域部分から２つのシストロンをもつmRNAをコードするプラスミドを作成した。grp78の配列は、以下の配列をもつプライマーを用いて、ヒトのゲノムDNAのPCRによって得られた。5'端のCGC GGG CGG CCG CGA CGC CGG CCA AGA CAG CAC（配列番号:9）、および3'端のCGC GTT GAC GAG CAG CCA GTT GGG CAG CAG CAG（配列番号:10）。これらのオリゴを用いたポリメラーゼチェーン反応は、10％ジメチルスルホキシド存在下で行なった。PCRによって得た断片をNotIとHincIIで制限酵素処理して、ヒトIgG1 をコードする配列の下流にあるNotIとHpaI部位の間に挿入した。次に、ヒトIgG カッパ軽鎖cDNAをコードする配列を、HincIIとベクター中の別の部位を用いて、 grp78のリーダー配列の下流部分に挿入した。これらの操作によってできた発現プラスミドは、半合成の重鎖遺伝子の後ろにgrp78のリーダー配列があり、その後ろにカッパ軽鎖cDNA配列があり、その後ろにSV40 DNA断片に由来するポリアデニル化シグナルがある。この発現プラスミドでCOS細胞を形質転換すると、重鎖決定基だけをコードするプラスミドで形質転換したものに較べて、重鎖決定基の発現が著しく促進された。重鎖／レセプターキメラと軽鎖を含む、２シストロン性の遺伝子を作製するために、重鎖の上流域配列を、本明細書に記載のいかなるキメラ重鎖／レセプター遺伝子と置き換えることもできる。実施例II CD4レセプターキメラの構築ヒトζ（Weissman et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 85:9709-9713（198 8b））およびγ（Kuster et al.，J．Biol．Chem．265:6448-6452（1990））cDN Aを、HPB-ALL腫瘍細胞系（Aruffo et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 84:857 3-8577（1987b））、またはヒトのナチュラルキラー細胞から調製されるライブラリーからポリメラーゼチェーン反応によって分離した。また、ηのcDNA（Jin et al.,Proc．Natl．Acad．Sci．USA 87:3319-3323（1990））は、マウス胸腺細胞ライブラリーから分離した。ζ、ηおよびγcDNAを、膜内ドメインの直上流に BamHI部位をもつように加工されたCD4（Aruffo et al.，Proc．Natl．Acad．Sci ．USA 84:8573-8577（1987b）；Zettlmeissl et al.，DNA Cell Biol．9347-353 （1990））の細胞外ドメインに結合させた。このドメインは、膜内ドメインの数塩基上流の近い位置にあるζおよびηcDNAに本来存在するBamHI部位に連結させたものである（配列番号:1、3、4および6）。γをもつ融合蛋白質を作るために、ほぼ同じ位置にBamHI部位を加工して配列の中に導入した（図1；配列番号:2および5）。遺伝子融合物を、大腸菌のgpt遺伝子を選択マーカーにもつワクシニアウイルス発現プラスミドに導入し、相同的組み換え、およびマイコフェノール酸中での増殖の選択によりワクシニアのWR株のゲノムに挿入した（Falkner et al. ，J．Virol．62:1849-1854（1988）；Boyle et al.，Gene 65:123-128（1988））。フローサイトメトリー分析によると、ワクシニア組換え体はCD4:ζとCD4:γ 融合蛋白質を細胞表面に大量に産生させたが、CD4:ηの発現は、実質的に弱くなった（図１B）。後者の発見は、ηcDNA発現プラスミドでマウスのハイブリドーマ細胞系を形質転換したものが、ζ発現プラスミドで同様に形質転換したものに較べて実質的に低い発現を示したという最近の報告（Clayton et al.，J．Exp． Med．172:1243-1253（1990））と矛盾しない。ワクシニアの組換え体を感染させた細胞の免疫沈降によって、融合蛋白質が共有結合して二量体を形成することが明らかになったが、これは天然のCD4抗原では異なる。CD4:ζとCD4:γ融合蛋白質の単量体と本来のCD4の分子量は、それぞれ63、55および53KDであることが分かった。融合蛋白質の分子量が大きいのは、細胞内の部分が長くなっているせいで、それぞれ、本来のCD4よりも75残基（CD4:ζ）または5残基（CD4:γ）長くなっている。実施例III CD4キメラは、他のレセプター鎖と結合できる形質転換体における、ヒトFc_γRIII（CD16_TM）のマクロファージ／ナチュラルキラー細胞形態の細胞表面での発現は、マウスγ（Kurosaki et al.，Nature 34 2:805-807（1989））またはヒトγ（Hibbs et al.，Science 246:1608-1611（19 89））との同時感染により、およびヒトζ（Lanier et al.，Nature 342:803-80 ５（1989））により促進される。これらの報告と符合して、CD16_TMを組み換えワクシニアウイルスとともに標的細胞に同時形質転換ないし同時感染して送り込むと、キメラ発現とともにCD16_TM も細胞表面で発現した（図２）。調べられた細胞系においては、ζによってCD16_TM の表面発現が促進される程度の方が、γによって促進される程度より著しかった（図２）が、CD4自体は、CD16_TMの表面発現を促進しなかった。実施例IV Aspζ変異体は、Fcレセプターと共結合しない現存する抗原やFcレセプターと結合しないキメラを作出するために、膜内のAs pとCys残基のいずれか、またはその両方を欠失した変異体ζ融合蛋白質を調製した。フローサイトメトリーにより、異なる変異体キメラによる細胞表面発現の強さと、変異していない前駆体の強さとの違いは観察できなかった。また、免疫沈殿実験によって、キメラの全発現量はほぼ同じであることが分かった。予想通り、膜貫通部分のシステイン残基を欠失した変異体キメラは、ジスルフィド結合による二量体を形成しないことが分かった。Aspを欠失した２つの変異体キメラは、CD16_TMの表面発現を維持できなかったが、一方、Aspをもち、Cysを欠失した単量体キメラは、元の二量体より効率は低かったが、CD16_TMを発現させた（図３）。実施例V 変異体レセプターはカルシウム応答を開始する能力を保持している融合蛋白質の架橋によって、T細胞抗原レセプターによって起きることが知られているような、細胞内の遊離カルシウムの蓄積が起きるか否かを判定するために、ヒトT細胞白血病系細胞のジャーカットE6（ATCC受託番号TIB 152、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、メリーランド州ロックビル）に、ワクシニア組換え体を感染させて、細胞外ドメインと抗体との架橋後の細胞質のカルシウムの相対濃度を測定した。カルシウム識別用染料インド-1を含む細胞を用いて、フローサイトメトリー測定を行なった（Grynkiewicz et al.，J．Biol．Chem ．260:3340-3450（1985）；Rabinovitch et al.，J．Immunol．137:952-961（19 86））。図４A〜Dは、CD4:ζおよびζのAsp^-、Cys^-変異体を感染させた細胞を用いたカルシウム移動実験結果を示している。キメラの架橋によって、細胞内カルシウムが再現的に増加した。CD4:ηおよびCD4:γを感染させた細胞では、同じように細胞内のカルシウムが蓄積した。ジャーカット細胞は、細胞表面でCD4を低レベルに発現するが、本来のCD4の架橋は、CD16:ζがあってもなくても細胞内のカルシウム量を変化させない（図４A〜B）。実施例VI CD4:ζ、η、およびγキメラは、HIVのgp120/41を発現している標的の細胞傷害を媒介するキメラレセプターが細胞傷害エフェクタープログラムを開始するかを調べるために、CD4がHIVエンベロープgp120/gp41複合体を認識することに基づく標的:エフェクター系のモデルを作製した。gp120/gp41を発現する組み換えワクシニアウイルスをヒーラ細胞に感染させ（Chakrabarti et al.，Nature 320:535-537（19 86）；Earl et al.，J．Virol．64:2448-2451（1990））、⁵¹Crで標識した。標識した細胞は、CD4:ζ、CD4:η、もしくはγキメラを発現するか、またはCD4:ζ Cys11Gly:Asp15Gly二重変異体キメラを発現するワクシニア組み換え体を感染させた同種異系特異的（CD8⁺、CD4^-）細胞傷害性T型リンパ細胞系の細胞とインキュベートした。図５A〜Cは、gp120/41を発現しているヒーラ細胞が、CD4キメラを発現している細胞傷害性Tリンパ細胞（CTL）によって特異的に破壊されることを示している。非感染のヒーラ細胞は、CD4:ζキメラをもつCTLの標的にはならなかった。また、非感染のCTLは、gp120/41を発現しているヒーラ細胞を認識しなかった。さまざまなキメラの効率を較べるためエフェクター対標的比を、CD4 キメラを発現しているCTL画分、およびgp120/41を発現しているヒーラ細胞画分に関して補正した。これらの画分はフローサイトメトリーで測定した。図５Cは、図５Aおよび図５Bで示した細胞傷害実験で用いたCTLによるCD4発現のサイトメトリー分析結果を示している。表面CD4:ζの平均密度は、CD4:ηの平均密度を大きく上回るが、どちらのキメラを発現している細胞も、細胞傷害効率はほぼ同じであった。gp120を発現している標的細胞画分に関する補正を行うと、CD4:ζ蛋白質とCD4:η蛋白質によって媒介される細胞傷害効率は、特異的T細胞レセプター標的:エフェクターの組み合わせについて報告された最も高い効率に匹敵した（CD4:ζを発現するT 細胞が50％遊離する場合のエフェクター:標的の平均比は、1.9±0.99、n=10）。 CD4:γ融合蛋白質は、膜通過部のAspとCysを欠いたCD4:ζと同じように活性が低かったが、どちらの場合にも、有意な細胞傷害が観察された（図５B〜C）。ワクシニア感染によってCTLによる認識が人為的に促進される可能性に関する対照をとるために、ホスファチジルイノシトールに結合したCD16（CD16_PI）を発現するワクシニア組み換え体を感染させ⁵¹Crで標識した標的細胞と、CD16_PIまたはCD16:ζを発現する対照用組み換え体を感染させたCTLを用いて、同様の細胞傷害実験を行なった。図６Aは、CD4以外のキメラを発現するT細胞は、本来のヒーラ細胞もgp120/41を発現しているヒーラ細胞も認識せず、同様に、CD4キメラを発現しているT細胞は、他のワクシニアにコードされる表面蛋白質を発現しているヒーラ細胞を認識しないことを示している。さらに、CD4以外のキメラを発現するCTLは、gp120/41を発現するヒーラ細胞をほとんど破壊しない（図６A）。実施例VII MHCクラスIIをもつ細胞は、キメラの標的にはならない CD4は、MHCクラスII抗原が発現する多形性のない配列と反応すると考えられている（Gay et al.，Mature 328:626-629（1987）；Sleckman et al.，Nature 32 8:351-353（1987））。CD4とMHCクラスII抗原との特異的な相互作用は、精製蛋白質を用いて証明されてはいないが、一定の条件の下では、CD4を発現する細胞とクラスII分子を発現する細胞とが接着することを示すことができる（Doyle et al.，Nature 330:256-259（1987）；Clayton et al.，J．Exp．Med．172:1243- 1253（1990）；Lamarre et al.，Science 245:743-746（1989））。次に、クラスIIをもつ細胞に対する傷害を検出できるかを調べた。図６Bは、大量にクラスI Iを発現しているRajiB細胞系に対してCD4:ζが特異的な細胞傷害を行わないことを示している。僅かな（約5％）細胞傷害は観察されたが、Raji細胞のクラスII をもたない変異体であるRJ2.2.5（Accolla，J．Exp．Med．157:1053-1058（1983 ））は、Raji細胞を非感染のT細胞とともにインキュベートしたときに示すのと同程度の感受性を示す。実施例VIII T細胞抗原/Fcレセプターゼータ鎖による細胞傷害の誘導に必要な配列 CD4とζのキメラによって、細胞傷害性T型リンパ細胞（CTL）は、HIVのgp120 を発現する標的細胞を破壊できるようになるが、ヒトT細胞系に導入されるゼータキメラの性質を明確に比較するために、CD4に代わるものを探した。そのような細胞系はCD4を発現することができるが、そのことによりカルシウム移動の型または程度と、異なるキメラの細胞傷害能力との間の相関関係を特に明確にするのを困難にする。これを回避するために、CD16の細胞外ドメインをζの膜通過配列と細胞内配列に連結させて、ζとCD16のキメラを作出した（図７A）。融合遺伝子は、大腸菌のgpt遺伝子を選択マーカーにもつ、ワクシニアウイルスの発現プラスミドに導入し、相同的組み換えによってワクシニアWR株に挿入して、マイコフェノール酸中での増殖によって選択した（Falkner and Moss，J．Virol．62 :1849（1988）；Boyle and Coupar，Gene 65:123（1988））。 T細胞系に、ワクシニア組み換え体を感染させ、細胞外ドメインを抗体で架橋した後、細胞質内の遊離カルシウムイオン相対的濃度を測定した。分光蛍光度計（集団全体）およびフローサイトメトリー（一個ずつの細胞）測定を、インド-1 染色した細胞を用いて行なった（Grynkiewicz et al.，J．Biol．Chem．260:344 0（1985）；Rabinovitch et al.，J．Immunol．137:952（1986））。図７Bに、C D16ζ融合蛋白質を発現するワクシニア組み換え体を感染させたジャーカットヒトT細胞白血病系の細胞から集めたデータの解析結果を示す。キメラの結合は、細胞内のカルシウムを再現的に増加させたが、キメラでないCD16を発現している細胞を同様に処理しても、ほとんど効果は見られなかった。REX33A（Breitmeyer et al.，J．IEunol．138:726（1987）；Sancho et al.，J．Biol．Chem．264:2 0760（1989））か、ジャーカット変異体JRT3.T3.5（Weiss et al.，J．Immunol ．135:123（1984））何れかの、抗原レセプターを欠いた変異体細胞系でキメラを発現させると、CD16抗体結合に対する強い反応が見られた。同様のデータが、 REX20A（Breitmeyer et al.,前掲，1987; Blumberg et al.，J．Biol．Chem．26 5: 14036（1990））変異細胞系と、本発明者らの実験室において確立されたCD3/Ti をもたない変異体についても集められた。CD16:ζを発現する組換え体を感染させても、抗CD3抗体に対する応答は回復しなかった。このことは、この融合蛋白質が細胞内のCD3複合鎖を回復するように作用しなかったことを示している。キメラの細胞性免疫を再指向する能力を評価するために、CD16キメラを発現するワクシニア組み換え体をCTLに感染させて、膜結合性抗CD16抗体を発現しているハイブリドーマ細胞を特異的に破壊するために用いた。このアッセイ法は、元来は、Fcレセプターをもつ細胞のエフェクター機構を解析するために作出されたハイブリドーマ細胞傷害測定法を敷衍したものである（Graziano and Fanger，J ．Immunol．138:945,1987; Granziano and Fanger，J．Immunol．139:35-36，19 87；Shen et al.，Mol．Immunol．26:959，1989; Fanger et al.，Immunol．Tod ay 10:92，1989）。図８Bは、細胞傷害性T型リンパ細胞においてCD16:ζを発現させると、CTLが3G8（抗CD16；Fleit et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 79: 3275，1982）ハイブリドーマ細胞を破壊できるようになるが、ホスファチジルイノシトールに結合したCD16を発現させてもCTLは不活性であることを示している。また、CD16:ζをもつCTLは、無関係の抗体を発現するハイブリドーマ細胞は破壊しない。細胞傷害に必要最小限のζ配列を同定するために、ζのカルボキシル末端から細胞内ドメインを連続的に削って、一連の欠失変異体を調製した（図８A）。ゼータの細胞内ドメインをほとんど削っても、細胞傷害能力にはほとんど影響しなかった。全長のキメラCD16:ζも、65残基目まで欠失したキメラCD16:ζAsp66*もほぼ同じ効果を示した（図８B）。ζの59残基目まで削ったとき（キメラCD16:ζ Glu60*）、細胞傷害性が実質的に減少し、さらに50残基目まで削ると、僅かに活性が落ちた。しかし、細胞内ドメインを3残基の膜貫通アンカーまで削っても、活性は完全にはなくならなかった（図８B）。 ζはジスルフィド結合する二量体であるため、内生ζが欠失キメラζとヘテロ二量体を形成して活性を回復するということで、細胞傷害活性の保持を説明することもできる。この説明を確かめるために、ζの11残基目と15残基目のAspとCys をGlyに変え（Cys11Gly/Asp15Gly）、免疫沈降を以下のようにして行なった。およそ2×10⁶個のCV1細胞に、組み換え体ワクシニアを、無血清DME培地中で1時間、感染多重度（moi）10以上で感染させた。感染後、6時間から8時間に、PBS/1 m M EDTAで細胞をプレートから剥離し、クラークおよびアインフィールドの方法（白血球タイピングII，pp 155-167，Springer-Verlag社，NY，1986）によって、ラクトペルオキシダーゼとH₂O₂を用いて、2×10⁶細胞当たり0.2 mCi¹²⁵Iで表面標識した。標識された細胞を遠心によって集め、1％ NP-40、0.1％SDS、0.15 M NaCl、0.05 M Tris PH 8.0、5 mM MgCl₂、5 mM KCl、0.2 Mヨードアセトアミド、１mM PMSFに溶解した。遠心分離で核を取り除き、CD16蛋白質を抗体3G8（Flei t et al.,前掲，1982; Medarex社）、抗マウスIgGアガロース（Cappel社，Durha m，NC）で免疫沈降させた。試料を、非還元条件下、8％ポリアクリルアミドゲル /SDSゲル、または還元的条件下、10％ゲルで電気泳動した。これらの免疫沈殿の結果、CD16:ζCys11Gly/Asp15Glyキメラは、ジスルフィド結合の二量体構造をとらないことが確認された。変異体レセプターの細胞傷害活性も調べた。65残基目まで削った変異キメラ（ CD16:ζCys11Gly/Asp15Gly/Asp66*）は、実験の条件にもよるが、変異を起こしていないキメラ（CD16:ζAsp66*）に較べて、細胞傷害実験で2倍から8倍活性が低かった。ただし、CD16:ζAsp66*は、通常CD16:ζの因子の一つ、または活性で区別することができないキメラである（図９B）。変異体キメラの活性の低下は、同様の構造をとるCD4キメラ（上記参照）で見られる低下と同程度であったが、これは、ζ単量体が、二量体に較べて効率が低いことに原因する可能性が最も高い。これに対して、59残基目まで欠失したAsp-Cys-変異キメラは、細胞傷害活性を示さなかった（図９B）が、このことは膜通過部のCysおよび／またはAsp残基によって媒介される他のペプチド鎖との結合が65残基目よりもアミノ末端側の欠失が細胞傷害活性の持続性を弱めることに関係があるという仮説の根拠になる。フローサイトメトリー実験によって、膜貫通部分のAsp残基およびCys残基を欠く欠失変異体でも、TCR-変異ジャーカット細胞系において、抗体結合に応答する細胞内の遊離カルシウムイオンの増加を促進できることが分かった（図９D）。同様の結果が、親株のジャーカット細胞系で発現されたキメラについても得られた。CD16:ζCys11Gly/Asp15Gly/Glu60*の場合の、これらに関するデータから、カルシウム応答性を媒介する能力と細胞傷害を補強する能力とは、突然変異によって分離できることが示された。 ζの膜貫通部分の残基が関与する可能性を明確に排除するために、ζの膜通過部と細胞質側の最初の17残基を、CD5またはCD7の膜内部分と細胞質側のそれぞれ最初の14または17残基をコードする配列に置き換えた（図９A）。その結果できた３つの部分からなる融合蛋白質CD16:5:ζ（48-65）およびCD16:7:ζ（48-65）は、膜貫通ドメインにシステイン残基がないため、より単純なCD16:ζキメラのようにジスルフィド結合して二量体を形成しない。３つの部分からなるキメラはどちらも、ジャーカットのTCRをもたない細胞系でカルシウムを動員することができ（図９D）、CTLで細胞傷害応答を開始できる（図９Cと本明細書に示していないデータ）。CD16:7:ζ（48-59）キメラのζの部分を59残基目まで削ると、３つの部分からなる融合蛋白質は、TCRをもつジャーカット細胞においても、TCRをもたないジャーカット細胞においてもカルシウム応答をさせられなくなり、成熟 CTLにおける細胞傷害も指示できなくなる（図９Cおよび９Dと本明細書に示していないデータ）。18残基モチーフ内の各残基の寄与を調べるため、部位特異的突然変異誘発によって、いくつかの変異体を調製して、キメラレセプターを少量発現する条件下（図10Aと10D）、または多量に発現する条件下（図10Bおよび10E）で、レセプター特異的細胞傷害を媒介する能力を評価した。図10A〜Fは、59残基から63残基の間でいくつか比較的に保存された置換（すなわち、酸性残基を同族のアミドで置き換えたり、チロシンをフェニルアラニンで置き換える）を行うと、細胞傷害効率は少し落ちたが、一般的にカルシウムを動員する能力は維持されたことを示している。しかし、まとめてみれば、これらの残基は、欠失すれば細胞傷害活性が失われる程度には重要な副モチーフを含む。Tyr62をPheまたはSer に変えると、細胞傷害応答もカルシウム応答もなくなった。18残基分節のアミノ末端で、Tyr51をPheに変えると、カルシウム移動も細胞傷害活性もなくなった。一方、50番目のLeuをSerに変えると、カルシウム応答はなくなったが、細胞傷害活性は僅かばかり残った。特定の仮説にこだわらなければ、Leu50Ser変異体が短時間のフローサイトメトリー分析でカルシウムを移動できなかったことは、より長い時間がかかる細胞傷害実験の期間中、細胞内の遊離カルシウムイオンの実質的増加を媒介する能力を必ずしも表すものではないと考えられる。しかし、カルシウム非感受性の細胞傷害活性がいくつかの細胞傷害性T細胞系について報告されており、同様の現象が、ここで述べた結果の基にある可能性を排除できなかった。Asn48をS erで置き換えると、実験によっては細胞傷害性が部分的に低くなったが、ほとんど影響ないものもあった。重複した配列要素が果たしうる役割を調べるために、ζの細胞内ドメインを、残基33から65、残基71から104、残基104から138の範囲の３つの部分に分けた。これらの部分をそれぞれ、CD7の細胞内ドメインの塩基性膜アンカー配列の末端にMluI部位を導入して、CD16:CD7キメラに接続した（下記参照；図11A）。この３つの要素の細胞傷害効力を比較すると、実質的には同等であった（図11B）。配列を比較すると（図11A）、２番目のモチーフでは２つのチロシンの間が11残基であるのに、１番目と３番目では10残基であった。 T細胞活性化プロセスの正確な説明はなされていないが、抗原レセプターの凝集、またはζの細胞内配列をもつレセプターキメラの凝集により、カルシウムの移動、サイトカインと顆粒の放出、および活性化を示す細胞表面マーカーの出現が開始することは明らかである。ζの活性部位は、短い一本のペプチド鎖で、固有の酵素活性を持つにはおそらく短すぎるので、細胞の活性化を媒介する一個か多くとも数個の蛋白質と相互作用すると考えられる。また、突然変異によって細胞傷害を媒介する能力とカルシウム蓄積を媒介する能力とを分離することができることから、遊離カルシウムの動員単独では細胞の活性化に不十分であることも明らかである。本明細書に示されているように、ζの細胞内ドメインの18残基を、２つの別の蛋白質の膜貫通ドメインと細胞内ドメインに付加すると、その結果できたキメラは、融合蛋白質の細胞外部位に結合する標的細胞に対する細胞傷害活性を再指向することができる。18残基モチーフをもつキメラは、全長ζをもつキメラに較べて約8倍活性が落ちるが、この活性低下は、正常ならば野生型ζにジスルフィド結合二量体を形成させる膜貫通部分の相互作用を失ったことに帰因しうる。すなわち、モチーフと同じカルボキシル末端をもち、膜貫通部分にCys残基およびAsp 残基をもたないζ欠失構造体は、典型的には、18残基モチーフのみをもつキメラに較べて僅かに低い活性を示した。本発明者らが注目した、細胞傷害反応能がある要素は、2個のチロシンをもつが、セリンもスレオニンももたず、リン酸化によって活性に寄与する可能性が制限されている。どちらのチロシンに変異を加えても、活性は損なわれる。ただし、予備実験では、18残基モチーフをもつキメラ表面抗原との結合の後、実際にチロシンのリン酸化が起きることは示されていないが、このようなリン酸化による関与が、低い水準でありうることは排除できない。2つのチロシン残基について言及された効果以外にも、モチーフのアミノ末端、カルボキシル末端のいくつかのアミノ酸を置き換えると、レセプター密度が低い条件下では活性が弱まる。 ζの活性モチーフと同じ配列が、CD3δおよびγ分子、表面IgM結合蛋白質のmb 1およびB29、または高親和性レセプターFcεRIのβ鎖およびγ鎖など、いくつかの膜貫通蛋白質の細胞質ドメインに見出されている（Reth，Nature 338:383，19 89）。これらの配列の機能は明らかではないが、十分に発現されれば、それぞれは自律的にT細胞を活性化できるので、この活性によって、ゼータをもたない変異細胞系に見られる残留TCR応答性を説明しうる（Sussman et al.，Cell 52:85 ，1988）。ゼータ自体はこのような配列をほぼ等間隔で３つもち、細胞内ドメインをおおまかに３等分した切片はそれぞれ、細胞傷害応答を開始することができる。選択的スプライシングによるζのアイソフォームであるη（Jin et al.，前掲，1990 ；Clayton et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 88:5202，1991）は、３番目のモチーフのカルボキシル側の半分をもたない。１番目のモチーフのカルボキシル側半分を除くと活性が失われるので、ηの生物学的効果のほとんどは、最初の２つのモチーフによると思われる。異なった測定をすれば、抗原媒介性のサイトカイン放出を促進する点（Bauer et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 88:3842， 1991）や、細胞傷害の対象変更（上記参照）を促進する点では、ζと同等の活性があるが、レセプター刺激に応答してリン酸化されることはない（Bauer et al. ，前掲，1991）。したがって、３つのモチーフすべての存在がリン酸化のために必要であるか、または３番目のモチーフがまだ同定されていないチロシンキナーゼのための好ましい基質になっている。実施例IX ヒトFcレセプターによる細胞傷害シグナル伝達異なったヒトFcレセプターサブタイプの作用を評価するために、ヒトCD4、CD5 またはCD16抗原に、FcRIIγA、B1、B2およびCサブタイプ（RavetchおよびKinet の命名法，Ann．Rev．Immunol．9:457，1991）の膜貫通および細胞内ドメインを連結させたキメラ分子を作出した。特に、既に述べたFcRIIA、B1およびB2アイソフォームの膜貫通および細胞内ドメインに相当するcDNA配列を、既にあるクローンPC23、またはヒトの扁桃cDNAライブラリー（標準的な技術によって作製したもの）から、以下の合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅した。CCC GG A TCC CAG CAT GGG CAG CTC TT（配列番号:18；FcRIIA順方向）；CGC GGG GCG G CC GCT TTA GTT ATT ACT GTT GAC ATG GTC GTT（配列番号:19；FcRIIA逆方向）；GCG GGG GGA TCC CAC TGT CCA AGC TCC CAG CTC TTC ACC G（配列番号:20；Fc RII B1およびFcRII B2順方向）；およびGCG GGG GCG GCC GCC TAA ATA CGG TTC TGG TC（配列番号:21；FcRII B1およびFcRII B2逆方向）。これらのプライマーは、それぞれ5'末端から６塩基が一方の鎖だけ欠けたBamHIとNotI酵素による切断部位を含んでいる。NotI部位のすぐ後は、アンチセンスがCTAかTTAという停止コドンになっている。すべてのプライマーは、目的の断片の5'および3'端に相補的な18個以上の塩基を含んでいる。FcRIIγAアイソフォームと１アミノ酸残基しか違わない（268残基目のPがLに変わっている）FcRIIγCの細胞内ドメインに相当するcDNA断片は、以下のプライマーを用いたオーバーラップPCRによる部位特異的突然変異誘発によって作製した。TCA GAA AGA GAC AAC CTG AAG AAA CCA AC A A（配列番号:22）およびTTG TTG GTT TCT TCA GGT TGT GTC TTT CTG A（配列番号:23）。PCR断片を、それぞれCD16またはCD4の細胞外ドメインを含むワクシニアウイルス発現ベクターに挿入し、続いて、目的の組み換え体の同定を効果的に行うため大腸菌のgptを一緒に取り込ませる選択法を用いて、チミジンキナーゼ遺伝子座での組み換えによって野生型ワクシニアに挿入した。すべてのアイソフォーム（図12に示す）の内容を、ジデオキシ配列決定法によって確認した。キメラレセプター蛋白質の産生は、さらに、免疫沈降実験によって確認した。およそ10⁷個のJRT3.T3.5細胞に、組み換え体ワクシニアを、無血清IMDM培地中で 1時間、感染多重度10以上で感染させた。感染12時間後に、細胞を回収して、ラクトペルオキシダーゼ／グルコースオキシダーゼ法を用いて、10⁷細胞あたり0.5 mCi¹²⁵Iで表面標識した（Clark and Einfeld，前掲）。標識された細胞を遠心によって集め、1％ NP-40、0.1 mM MgCl₂、5 mM KCl、0.2 Mヨードアセトアミド、1mM PMSFに溶解した。遠心分離で核を取り除き、CD16融合蛋白質を抗体4G8と抗マウスIgGアガロースで免疫沈殿させた。試料を、非還元条件下で電気泳動した。免疫沈降したキメラレセプター分子の分子量は、全て予想通りのものであった。キメラレセプターが細胞質の遊離カルシウムイオンの増加を媒介できるかを調べるために、組み換えウイルスを用いて、TCR^-変異体ジャーカット細胞系JRT3.T 3.5に感染させ（本明細書で既に説明した）、レセプターの細胞外ドメインにモノクローナル抗体3G8またはLeu-3Aを結合させて（本明細書で既に説明した）から、細胞の細胞質遊離カルシウムを測定した（本明細書で既に説明した）。これらの実験から、FcRγIIAおよびCの細胞内ドメインは、細胞外ドメインで架橋が起きた後細胞質の遊離カルシウムイオンの増加を媒介できるが、FcRγIIB1およびB2は、同じ条件では不活性であることが明らかになった（図13Aおよび13B）。 FcRγIIAのCD4、CD5およびCD16とのハイブリッドは、カルシウム応答を促進する点で実質的に同等の能力をもっていた（図13A〜B）。単球およびリンパ球系統のその他の細胞系も、細胞外ドメインの架橋によって開始されるシグナルに応答することができた。細胞傷害における、異なるFcRγIIの細胞内ドメインの関与を調べるために、C D16:FcRγIIA、B1、B2およびCキメラを発現する組換え体ワクシニアを、ヒト細胞傷害性Tリンパ球（CTL）に感染させた。そして、感染細胞を、CD16に対する細胞表面抗体を発現しているハイブリドーマ細胞（すなわち、3G8 10-2細胞）に⁵¹ Crを含ませた細胞とともに培養した。この実験において、CD16キメラの細胞外ドメインにリンパ球のエフェクター作用を活性化できる細胞内分節が結合してるとき、CD16キメラをもつCTLはハイブリドーマ標的細胞を破壊した（遊離⁵¹Crを放出した）。この細胞傷害実験については、後に詳述する。図14Aは、CD16:FcRγI IAおよびCをもつCTLは、細胞表面に抗CD-16抗体を発現している標的細胞を傷害できるが、CD16:FcRγIIB1およびB2はできないことを示している。特異的な細胞傷害がCD16の一部との相互作用による何らかの方法で起こるかもしれないという可能性を排除するために、CD4の細胞外ドメインにFcRIIの細胞内ドメインを結合させて、細胞傷害実験を行なった。この場合、標的細胞は、HIV エンベロープgp120/41蛋白質を発現しているヒーラ細胞（特に、ワクシニアベクターvPE16（国立アレルギーおよび感染症研究所AIDS保管所、メリーランド州ベセスダより入手可能）を感染させたヒーラ細胞）であった。CD16システムと同じように、HIVエンベロープを発現している標的細胞は、CD4:FcRγIIAキメラを発現するT細胞による細胞傷害に対して感受性であったが、CD4:FcRγIIB1およびB2 には感受性ではなかった（図14B）。 FcRγIIAおよびCの細胞内ドメインは、拡大されたFcRγ/TCRζファミリーのメンバーを含む何れの蛋白質とも一定の配列相同性をもたない。細胞傷害誘導に関与する配列要素を明らかにするために、細胞内ドメインをコードする配列（後述、また図15Aに示す）の5'側と3'側の欠失体を調製して、カルシウム動員と細胞傷害測定（本明細書で説明されている）における効果を評価した。細胞内ドメインのアミノ末端側を除いた実験において、FcRγIIの膜貫通ドメインを、無関係のCD7抗原の膜貫通ドメインに置き換えて、膜貫通ドメインによって相互作用が媒介される可能性を排除した。図15Bおよび15Cは、チロシン298を含む、カルボキシル末端側14残基を除去すると、細胞傷害能が全く失われ、カルシウム移動能力もかなり低減することを示している。さらに、チロシン282の直前まで欠失させても同一の表現型を生じた（図15Bおよび15C）。細胞内ドメインのN末端側から268残基目までを欠失させても、カルシウムプロフィールにも細胞傷害能力にも影響を与えなかったが、275 残基目まで欠失させると、遊離カルシウムの放出が著しく減少したが、細胞傷害にはほとんど影響しなかった（図15Dおよび15E）。さらに、282残基まで欠失させると、FcRγIIテールは、カルシウムを動員することも、細胞傷害の引き金を引くこともできなくなった（図15Dおよび15E）。これらの大まかな測定によって定義された「活性要素」は、比較的大きな（36アミノ酸）もので、16残基離れた 2つのチロシンを含んでいる。実施例X 感染を補助しないキメラCD4レセプターをもつリンパ球による、指向化された細胞傷害上述のように、MHC非依存的にCTLの細胞傷害活性の特異性を変えるエフェクター分子を作製した。例えば、ヒトCTLクローンWH3のζ鎖を融合したCD4の細胞外ドメインを含むキメラは、HIV-1の表面エンベロープ糖蛋白質gp120を発現している標的細胞を特異的に破壊する。しかし、CD4分子の細胞外ドメインがHIV感染に対する感受性を与えるため、これをもつCTLがウイルスの標的となり得るために、結局これらの細胞の傷害能力が減ぜられることになる（Dalgleish et al.，Na ture 312:767（1984）；Klatzmann et al.，Nature 312:767（1984））。このような結果を避けるために、特異的にHIV感染細胞を標的にして細胞性傷害効果をもつが、HIVによる感染に対しては感受性をもたないCD4を基本にして、キメラエフェクター分子を設計した。 CD4の細胞外ドメイン(図23)の遺伝子を、この場合、ヒトの膜結合IgG1の膜通過部分をコードする第一エクソンの位置に結合した、ヒトIgG1の重鎖のヒンジ、第二および第三定常ドメインの遺伝子と並べ(Zettlmeissl et al.，DNA Cell Bi ol．9:347(1990))(図25)、その後ろに、全Ig様ドメインと、膜通過ドメインに続く移行停止配列の間にある配列(Aruffo and Seed，EMBO J．6:3313(1987))(図26 )を含む、ヒトCD7抗原の一部を結合させて、3つの部分を融合した蛋白質を作出した。CD7分節の細胞外部分のアミノ酸の一次配列には、細胞表面からIg様ドメインを突出させる軸状構造の存在を示す、プロリンを多く含む領域がある（Aruf fo and Seed，EMBO J．6:3313（1987））（図26）。これと、本明細書に記載のこれに関連したキメラを発現させるために、組み換えワクシニアウイルスを調製した。特に、組み換えワクシニアウイルスは、CV-1細胞の中で相同的組み換えによって作成した。CV-1細胞で高濃度のストックを調製する前に、各ストック毎に、OKT4あるいはLeu3aによってプラークを可視化してからプラーク精製することを、少なくとも２回繰り返した。 3つの部分をもつキメラ（CD4（D1-D4）:Ig:CD7）（図20、分子「A」）は、効率的に細胞表面での発現を示たため、ワクシニアによるシンシチウム形成実験で HIVレセプターとして作用することができるかを調べた（Lifson et al.，Nature 3 23:725（1986）；Ashorn et al.，J．Virol．64:2149（1990））。HIV-1のエンベロープ糖蛋白質をコードする組み換えワクシニアウイルス（vPE16）を感染させたヒーラ細胞（Earl et al.，J．Virol．64:2448（1990））を、CD4、CD4:ζ またはCD4（D1-D4）:Ig:CD7を感染させたヒーラ細胞とともに培養した。６cmシャーレに入れられたヒーラ細胞（ATCC、メリーランド州ロックビル）が50％の集密状態のときに、無血清培地中、感染多重度（MOI）約10で1時間感染させた。この細胞をさらに5〜6時間、完全培地中でインキュベートしてから、１mM EDTAを含むリン酸緩衝食塩水（PBS）で剥離した。エンベロープとCD4キメラを発現する細胞を1:1の割合で混ぜて、再び完全培地とともに６cmシャーレに撒いた。共培養後6〜8時間経過したところでシンシチウムの数を数えて写真を撮った。 CD4とvPE16を共培養すると、容易に多核巨細胞が形成された。また、CD4の細胞外ドメインをTCRのζ鎖に融合したキメラ（図27）（CD4:ζ）は、シンシチウム形成を媒介できたが、CD4（D1-D4）:Ig:CD7を発現する細胞は、細胞融合の徴候を示さなかった。本発明者らはまた、別の研究で、HIVによる感染には、CD4のアミノ末端側の二つのドメインが必要だということが示されていた（Landau et al.，Nature 334:159（1988））ので、CD4の1番目と2番目のドメインだけ（図24 ）を発現する構築体、CD4（D1,D2）:Ig:CD7（図20、分子「B」）を試験した。この分子も、HIV誘導によるシンシチウム形成に非感受性であることが分かった。¹ ²⁵ I-標識した可溶性gp120を用いた結合実験で、CD4（D1-D4）:Ig:CD7もCD4（D1, D2）:Ig:CD7もgp120に強い親和性をもつことが確認された。次に、本発明者らは、シンシチウム形成をしなかったキメラ分子に、本明細書に記載したような誘因分子を与えれば、細胞傷害を行わせることができるようになるか否かを判定した。ζの細胞内ドメイン（図27）をCD4（D1-D4）:Ig:CD7とC D4（D1,D2）：Ig:CD7の3'側に融合して、これに関連する組み換えワクシニアウイルスを調製した。これらの構築物、CD4（D1-D4）:Ig:CD7:ζおよびCD4（D1,D2 ）:Ig:CD7:ζ（図20、分子「C」と「D」）を、ヒトCTLクローンWH3の中で発現させ、（本明細書に記載の方法を用いて）HIVの表面エンベロープ糖蛋白質を発現しているヒーラ細胞を標的にして破壊できるかを調べた。図21は、CD4（D1-D4） :Ig7:CDまたはCD4（D1,D2）:Ig:CD7に融合したζの細胞内ドメインが、細胞傷害能をもつが、ζ鎖を持たない構築物にはこの活性を媒介できないことを示している。正の対照であるCD4:ζは、僅かに効率的に細胞傷害を媒介し、CD4（D1,D2）:Ig: CD7:ζは、CD4（D1-D4）:Ig:CD7:ζよりも細胞傷害能力が少し低かった（図21）。しかしながら、CD4（D1-D4）:Ig:CD7:ζキメラおよびCD4（D1,D2）:Ig:CD7:ζ キメラ両方が、HIVのエンベロープ蛋白質を表面に発現している細胞を特異的に傷害できることは明らかである。この４つの部分からなるキメラは、どちらもワクシニアによるアッセイ法では、シンシチウム形成を媒介できなかった。本発明者らはまた、図11Aで示したように、ζモチーフが一個あれば、CD4（D1-D4）キメラに細胞傷害活性を与えるのに十分であることを明らかにした。放射性免疫沈降実験によって、融合分子が、完全ではないにしても主に二量体を形成していることが確かめられた。これらの実験においては、CD4（D1-D4）:I g:CD7:ζおよびCD4（D1,D2）:Ig:CD7:ζキメラを発現している組み換えワクシニアを感染させ、代謝を通じて標識したヒーラ細胞の可溶性抽出物を免疫沈殿させるためにプロテインAアガロースビーズを用いた。免疫沈殿した物質は、還元的条件下および非還元的条件下でポリアクリルアミドゲル電気泳動して分画した。特に、約5×10⁶個のヒーラS3細胞に、vPE16について既に説明したように、適当なワクシニアウイルスストックを感染させた。細胞は、200μCi/mlのTran³⁵S-ラベル（ICNラジオケミカルズ社、カリフォルニア州アーバイン）で、システインとメチオニン欠乏培地中、6〜8時間代謝標識して、１mM EDTA含有PBSで剥離した。続いて、細胞を沈殿させて、150 mM NaCl，50 mM Tris pH 7.5，5 mM EDTA，0 .5％ NP-40，0.1％ SDS，１mM PMSFで溶解した。遠心分離によって核を除去した後、各細胞抽出物の5分の1を、4℃で2時間、洗浄したプロテインA結合アガロースビーズに吸着させた。その後、1％ NP-40を含むPBSで洗い、メルカプトエタノールを含む、または含まないSDS試料用緩衝液に溶出させた。これらの実験の結果、CD4（D1-D4）:Ig:CD7:ζおよびCD4（D1,D2）:Ig:CD7:ζキメラの免疫沈殿物のほとんどは、非還元条件下で予想通りの二量体の分子量の位置に移動することが明らかになった。 CD4融合分子を発現している細胞がHIV感染を助長することができるかを直接に評価するために、本発明者らは、CD4（D1-D4）:Ig:CD7およびCD4（D1,D2）:Ig:C D7を発現する形質転換体について、長期間の感染実験を行なった。CD4（D1-D4） :Ig:CD7およびCD4（D1,D2）:Ig:CD7の安定した形質転換体とCD4を、形質転換が容易な、ヒト胚の腎臓に由来する293細胞の同系系統で調製した。キメラ分子を、単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼプロモーターによって制御されるハイグロマイシンB遺伝子をもつ二方向性ベクターにサブクローニングした。10 cm シャーレで60〜70％集密になった細胞を、このプラスミドDNAI0μgで、カルシウムリン酸共沈殿法によって形質転換した。形質転換の前に、プラスミドを一つしかないSfiI部位で切断して直鎖化し、T4DNAポリメラーゼで両末端を平滑化した。形質転換後24時間目に細胞を４倍に希釈し、48時間後にハイグロマイシンB（S igma社、ミズーリ州セントルイス）400μg/mlによる選抜を行なった。３日から４日毎に、細胞にハイグロマイシンを含む新しい培地を補給した。抵抗性コロニーを拾って展開し、その発現を、フルオロセイン結合抗ヒトIgG Fc（Organon Teknika社、ペンシルバニア州ウエストチェスター）、またはヒトC D4に反応する抗体のQ4120（Sigma）を用いた間接免疫蛍光法によって評価し、その後フローサイトメトリー（Coulter社、フロリダ州ハイアレア）を行なった。解析のために、他の細胞系によって示される細胞表面CD4の発現レベルに匹敵するレベルを示す構築物から、それぞれ独立したクローンを2個選抜した。図22は、HIVに曝された後、早くも感染後3日目にはCD4の安定した形質転換体の培地でp 24が検出されたことを示している。感染後5日目には、これらの培地中に、多核巨細胞と独特の風船状の細胞が存在するのが明らかになった。形質転換していない親細胞系や、CD4（D1-D4）:Ig:CD7およびCD4（D1,D2）:Ig:CD7の形質転換体から別々にとった2つの細胞分離株からは、32日後の培地中に、有意なレベルのp24 も、多核巨細胞の存在も検出されなかった（図22）。感染実験を完了するにあたって、細胞表面のCD4発現について細胞の解析を行なった。CD4を発現している感染細胞においては、CD4表面エピトープの密度がかなり減少したが、これはウイルスによる抑制調節と符合する。しかし、CD4（D1- D4）:Ig:CD7およびCD4（D1,D2）:Ig:CD7を発現している培養細胞では、この密度に変化はなかった。これらの実験によって、T細胞レセプターのζ鎖と融合すると、HIV感染細胞を標的にしてこれを傷害できるが、CD4によって媒介されるHIV 感染を補助しない、CD4の先端の2つのドメインをもつキメラ分子を作出できること確かめられた。補足実験によって、CD4分子の細胞外ドメインと脂質二重膜の間の物理的距離がHIV感染に対する抵抗性を付与するのだということが示唆された。最初の実験で、本発明者らは、CD7の軸部と膜貫通ドメインに欠失をもつキメラ分子を構築したが、この欠失によって、CD7の膜貫通部位にあるプロリンに富む領域が除去された。このドメインをCD4の細胞外ドメインと融合させたところ、CD4分子の細胞表面発現で測ると、CD4の細胞外ドメインを効果的に係留する能力が保持されていた（本明細書で説明されている）。しかし、HIVエンベロープの糖蛋白質に誘導されるシンシチウム形成を阻止する能力は失われた。したがって、α-ヘリックス構造をとると考えられる、CD7のプロリンに富む領域を欠失させると、CD4 の細胞外ドメインと脂質二重膜との間の距離がかなり縮まって、キメラはシンシチウム形成を阻止できなくなる。２番目の実験では、CD4の細胞外ドメインに対して膜貫通アンカーとして作用するが、HIVに誘導されるシンシチウム形成を阻止できないことが以前から報告されているCD4/CD5キメラに、HIVに誘導されるシンシチウム形成を阻止する能力を付与できるかもしれないことを明らかにした。この実験では、ヒトIgG1重鎖のヒンジ、CH2およびCH3ドメインをCD4/CD5分子に挿入した。この結果できたキメラは、シンシチウム形成を阻止したため、免疫グロブリンのドメインによって付与された距離が、HIVに誘導されるシンシチウム形成を阻止するのに十分であることがさらに示された。３番目の実験において、さまざまな長さの合成アルファヘリックスを用いて、 CD4ドメインの細胞膜からの距離をさまざまに延長させた。特に、二つのアラニン残基に隣接する、リジン残基とグルタミン酸残基の反復アルファヘリックスモチーフを表す合成オリゴヌクレオチドを設計した（塩基配列とアミノ酸配列の一次構造については図28参照）。以前の実験で、このようなアミノ酸配列が、高い頻度でアルファヘリックス中に存在することが分かっており、このことは、このような反復モチーフによってアルファヘリックス構造が形成され、このようなアルファヘリックスをCD4の膜貫通ドメインと細胞外ドメインの間に置くと、細胞膜からCD4を突き出させることができることを示している。アルファヘリックス部分の長さを変えて、HIVの侵入を阻止するのに必要な突出距離を、アルファヘリックスの高さと回転に関する既知の値に基づいて計算して決定した。これらの結果を表１に示す。この表において、「CD4」は、特別に注記しない限り、CD4（D1-D4）を表し、「H」、「CH2」、および「CH3」は、それぞれ、ヒトIgG1重鎖のヒンジ、CH2およびCH3領域を表す。「CD7tmおよびstk」は、CD7の膜貫通領域と軸部（stalk）領域を表す。「CD7tm（長いキメラ）」と「CD7tm（短いキメラ）」は、それぞれCD 7の膜貫通領域、およびプロリンに富むドメイン（上述）を欠失したCD7の膜貫通領域を表す。「CD5tm」は、CD5の膜貫通領域を表す。また、「CD34tm」は、CD34 の膜貫通領域を表す。項JからLでは、アルファヘリックス領域の長さをオングストロームで示してあるが、これらの値は、3.6残基毎にアルファヘリックスが一回転し、それに相当する距離が5.4 A（１残基当たり1.5A）であるという事実に基づいている。したがって、16残基のアルファヘリックスは、CD4の細胞外ドメインを約24オングストローム突出させる。48オングストロームと72オングストロームのアルファヘリックスは、BstY1断片を連続して鎖状につなぎ、断片にしかないBamHI部位（図28参照）に挿入して構築した後、正しい方向をもつクローンを選抜した。ワクシニアウイルスvPE-16構築体（上記参照）からのHIV-1エンベロープ糖蛋白質を発現するヒーラ細胞との共培養実験で、シンシチウム形成を計数した。 Thy-1発現は、以下のようにして測定した。HIV-1のhxb.2クローンの基にして活性のあるレトロウイルスベクターを作製した。このベクターにおいて、必須でないnef遺伝子を、ホスファチジルイノシトール結合によって膜に係留される細胞表面分子を効率よく発現するラットthy-1のコーディング配列に置換した。この分子クローンに由来する、hxb/thy-1と名付けられたウイルスには感染性があるが、このことは、細胞病理学的効果、および感染させたC8166細胞（ヒトCD4⁺ 白血病T細胞系）の培養上清にp24が産生されていることから明らかである。さらに、hxb/thy-1へ曝されると、CD4で一過的に形質転換されたヒーラ細胞は、nef と同様に制御を受けるメッセージについて予想されたように、早くも感染から18 時間でthy-1発現の徴候を示した。nef遺伝子によってコードされるメッセージは、通常、さまざまにスプライシングされ、rev応答因子を持たないウイルス制御蛋白質として分類される。これらのメッセージは、初期ウイルス遺伝子産物として、細胞質に定常的に蓄積しうる。thy-1のメッセージも同じように制御される、すなわちウイルスの生活環の初期に現れると予測された。簡単に述べると、この系によって、ウイルスの侵入に代わるものとしてthy-1発現を利用し、HIV侵入実験の効率を上げた。標準的なDEAE-デキストラン法を用いて、さまざまなCD4から作成したキメラで、ヒーラ細胞を一過的に形質転換した。形質転換細胞を、形質転換から48時間後にhxb/thy-1ウイルスに曝し、感染から24〜48時間後にthy-1の発現を測定した。表１に示した結果においては、thy-1の発現は、市販のThy-1モノクローナル抗体（Accurate社）を用いて、感染から24時間後に測定した。表１に示されたデータから、HIV-1の感染を阻止するためには、CD4の細胞外ドメインは細胞膜から少なくとも48オングストローム、好ましくは少なくとも72オングストローム突き出しているのが最適である。本明細書に開示された一般的な方法と同様の方法を用いて、抗HIVエンベロープ抗体に基づき、HIV感染細胞を標的とするキメラを作製することもできる。このような抗体の例は、ゴーニーら（Gorny et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 86:1624（1989））およびマラスコら（Marasco et al.，J．Clin．Invest．90: 1467（1992））によって開示されている。実施例XI さらなるT細胞レセプターおよびB細胞レセプター刺激タンパク質本発明によるその他の細胞内の、および膜貫通のシグナル伝達ドメインは、Ｔ細胞レセプタータンパク質であるCD3デルタおよびT3ガンマ、およびB細胞レセプタータンパク質であるmblおよびB29に由来してもよい。これらのタンパク質のアミノ酸配列を図16（CD3デルタ；配列番号24）、図17（T3ガンマ；配列番号25）、図18（mbl；配列番号26）、および図19（B29；配列番号27）に示す。細胞溶解シグナル伝達に十分な部分配列（そして、それゆえにおそらく本発明のキメラレセプターに含まれる）を枠内に示す。これらのタンパク質ドメインを含むキメラレセプターは、一般的に上述のように構築され、本発明の治療法において使用される。実施例XII 実験方法ワクシニア感染および放射免疫沈降法約5x10⁶のCV1細胞を無血清DME培地中で1時間、少なくとも10（CV1細胞上で測定された力価）の感染多重度（moi）で、組み換えワクシニアで感染させた。細胞は感染後、新鮮な培地に移し換え、メチオニンおよびシステインを含まないDMEM （Gibco;Grand Island,NY）中で6時間、200μCi/mlの³⁵S−メチオニンおよびシステイン（Tran³⁵S標識,ICN;Costo Mesa,CA）で代謝的に標識した。標識した細胞は、1mM EDTAを含むPBSで分離し、遠心により集め、1％ NP-40，0.1％ SDS，0 .15M NaCl，0.05M Tris（pH8.0），5mM EDTA，および1mM PMSFで溶解した。核を遠心により除去し、CD4タンパク質は、OKT4抗体および抗マウスIgGアガロース（ Cappel，Durham，NC）で免疫沈降した。試料は、非還元（NR）および還元（R）下で、８％ポリアクリルアミド/SDSゲルを通じて電気泳動した。³⁵S標識試料を含むゲルは、オートラジオグラフィー前に、「En³Hance（New England Nuclear ，Boston，MA）」で飽和した。膜貫通型CD16であるCD16_TMの促進された発現は、 CD16_TMで感染した単一のCV1細胞における発現とCD16_TMおよびζ又はγキメラをコードするウイルスで共感染した細胞における発現を比較することにより測定した。感染および6時間以上のインキュベーションの後、細胞は、PBS、1mM EDTAでプレートから分離し、CD16_TM又はキメラの発現は、間接蛍光抗体およびフローサイトメトリーにより測定した。カルシウム移動解析「Jurkat subline E6（Weiss et al.,J．Immunol．133：123-128（1984））」細胞は、無血清IMDM培地中で1時間、10のmoiで、組み換えワクシニアで感染させ、IMDM、10％ FBSで3〜9時間インキュベートした。細胞を遠心により集め、1mM インド-1アセトメトキシエステル（Grynkiewicz et al.,J.Biol.Chem.260:3340- 3450（1985））（Molecular probes）を含む完全培地中で3ｘ10⁶細胞/mlで再懸濁し、37℃で45分間インキュベートした。インド-1を加えた細胞を速心し、無血清IMDM中に1ｘ10⁶で再懸濁し、暗中で室温にて保存した。細胞は、フローサイトメトリーによる紫および青の蛍光放射の同時測定による遊離カルシウムイオンの解析を行った（Rabinovitch et al.,J．Immunol.137:952-961（1986））。カルシウム移動を開始するために、1μg/mlのフィコエリトリン（PE）結合Leu-3A（抗CD4）（Becton Dickinson，Lincoln Park，NJ）を細胞懸濁に加え、次いで10 μg/mlの非結合ヤギ抗マウスIgGを時間0に加えるか、又は1μg/mlの非結合3G8（抗CD16 ）モノクロナール抗体を細胞懸濁に加え、次いで10μg/mlのPE結合Fab₂'ヤギ抗マウスIgGを時間0に加えた。紫／青放射比のヒストグラムは、PE陽性（感染）細胞群から収集した。この細胞群は、概して全細胞の40〜80％に相当した。非感染細胞におけるT細胞抗原レセプター反応は、架橋なしで、抗体OKT3により刺激された。CD16キメラレセプターに関する実験では、（抗体なしで）低細胞内カルシウムの方へ移動する基線を示す試料は、解析から除外した。ヒストグラムデータは、続いて、「Write Hand Man（Cooper City，FL）」ソフトウェアを用いて、２つのデータをASCIIへ変換することにより解析し、さらに「FORTRAN」プログラムの収集で解析した。二次抗体試薬の添加前の紫／青放射比は、統一した標準初期値と残余群の10％が臨界を越えるようにした残余臨界比を確立するために用いた。細胞溶解アッセイヒトT細胞株WH3、CD8⁺CD4^-HLA B44制限細胞溶解株をIMDM、I00U/mlのIL-2を含む10％ヒト血清中で継代し、放射線照射した（3000rad）HLA-不適合末梢血リンパ球および1μg/mlのフィトヘマグルチニンで非特異的に、または放射線照射したB44を有する単核細胞で特異的に、周期的に刺激した。非特異的刺激の1日後、新鮮培地を添加することによりPHAを0.5μg/mlにまで希釈し、さらに3日後に培地を交換した。細胞は、刺激後、細胞傷害アッセイで使用するまで少なくとも10 日間培養した。細胞を、無血清培地中で1時間、少なくとも10の感染多重度で組換えワクニシアで感染させ、次に3時間完全培地中でインキュベーションした。細胞を遠心分離により回収し、1×10⁷細胞／mlの濃度で再懸濁させた。100μl／ウェルの完全培地を含むU底マイクロタイタープレートの各ウェルに、100μlを添加した。細胞を二重段階希釈した。各試料のうち2ウェルには、自発的なクロム放出と全クロム取り込みを測定するため、リンパ球を加えなかった。HeLa細胞亜株S3からの標的細胞を、6.0または10.0cmのプレートで、無血清培地中で、1時間およそ10のmoiで感染させ、続いて完全培地で３時間インキュベーションした。それらを、PBS、1mM EDTAから分離し、計数した。10⁶個の標的細胞（CD4キメラレセプター実験では、HeLa、Raji、またはRJ2.2.5細胞、CD16キメラレセプター実験では、3G8 10-2細胞；Shen et al.,Mol.Immunol.26:959（1989））を等分したものを遠心し、37℃で1時間、断続的に攪拌しながら50μlの無菌⁵¹Crナトリウムクロム酸（1mCi /ml,Dupont,Wilmington,DE）中に再懸濁させ、それからPBSで3回洗浄した。10⁵ 細胞／mlで培地中に再懸濁した標的細胞100μlを、各ウェルに添加した。Raji標的細胞およびRJ2.2.5標的細胞を、HeLa細胞と同様に標識した。マイクロタイタープレートを750×gで1分間遠心し、37℃で4時間インキュベーションした。インキュベーション時間の最後に、静かにピペッティングすることにより、各ウェルの細胞を再懸濁させ、総取り込み量を決定するために試料を取り出し、マイクロタイタープレートを750×gで1分間遠心した。100μlに等分した上清を取り出し、ガンマ線シンチレーション計数器で計数した。破壊率を、フローサイトメトリーにより測定した感染標的細胞の画分（通常50〜90％）に対して補正した。感染エフェクター細胞について、エフェクター：標的比を、感染した細胞の割合（通常、CD4キメラレセプター実験では20〜50％、CD16キメラレセプター実験では＞7 0％）に対して補正した。 ζ配列のインビトロ突然変異誘発 ζ配列のアミノ酸残基11およびまたは15に点突然変異を生じさせるため、ζ膜貫通ドメインの上流のBamHI部位から延びる合成オリゴヌクレオチドプライマーで、天然ζの残基11をCysからGlyに変換したもの（C11G）、残基15をAspからGly に変換したもの（D15G）、またはその両方を変換したもの（C11G/D15G）を調製し、変異断片を生成するためのPCR反応に用いて、その断片を野生型CD4：ζ構築体へと再び挿入した。 ζ欠失を作製するため、ζcDNA配列を、残基50、59、または65の後に停止コドン（UAG）を生じるように設計された合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いたPCRにより増幅した。プライマーは、通常、CGC GGG CGG CCG CTA（配列番号： 11）の配列中に5'末端から5または6残基一方の鎖が欠けた、酵素NotIの切断部位を含んでいた。該配列の最後の3残基は、停止アンチコドンに相当する。NotIおよび停止アンチコドン配列には、断片の望ましい3'末端に相補的な18以上の残基が続いていた。得られたキメラを、それぞれCD16：ζY51＊、CD16：ζE60＊、およびCD16：ζD66＊と名付けた。膜貫通ドメインの上流のBamHI部位、およびNotI 部位を断片を生成するために用い、その断片を野生型CD16：ζ構築体へと再挿入した。上述のAsp^-Cys^-CD4：ζ構築体をBamHIおよびSacIで消化して、ζ膜貫通配列および膜に近接する細胞内配列を作製し、断片をそれぞれCD16：ζE60＊、CD16： ζD66＊構築体中に挿入することにより、単量体ζキメラを作製した。三部からなるCD16：7：ζ（48-65）キメラおよびCD16：7：ζ（48-59）キメラの構築構築体CD16：ζD66＊を調製するため、膜貫通ドメインに相当するζcDNA配列およびそれに続く細胞質ドメインの17残基を、CD5およびCD7 cDNAから得た膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインの相当部分と置換した。CD5断片およびCD7断片は、PCR反応により作製した。PCRには、BamHI制限切断部位を含み、それぞれCD5 、CD7の膜貫通ドメインのすぐ上流の領域に相当する順向きオリゴヌクレオチドならびにそれぞれCD5、CD7配列、およびSacI制限切断部位を含むζ配列にオーバーラップする以下の逆向きオリゴヌクレオチドを用いた。 CD5およびCD7のPCR産物をBamHIおよびSacIで消化し、BamHIおよびSacIで消化したCD16：ζE6０＊とライゲーションし、BamHIからSacIまでのζ配列をCD7断片と置換した。構築体CD16：CD5およびCD16：CD7を作製するため、CD5断片およびCD7 断片をPCRにより得た。PCRには、NotI制限切断部位を含み、それぞれCD5、CD7の Gln416、Ala193残基の後に停止コドン（UAA）をコードするオリゴヌクレオチドを用いた。CD5およびCD7のPCR断片をBamHIおよびNotIで消化し、CD16：ζAsp66 ＊構築体中に挿入した。 ζ細胞溶解シグナル伝達モチーフ内のN末端残基のインビトロ突然変異誘発 ζモチーフ内のSacI部位から延びる合成オリゴヌクレオチドプライマーであり、本来の残基48がAsnからSerに変換したもの（N48S）、残基50がLeuからSerに変換したもの（L50S）、および残基51がTyrからPheに変換したもの（Y51F）を合成し、PCR反応に用いて断片を生成し、その断片を野生型CD16：7：ζ（48-65）構築体へと再び挿入した。 ζ細胞溶解シグナル伝達モチーフ内のC末端残基のインビトロ突然変異誘発 NotI部位の3'から停止コドンまで延びる合成オリゴヌクレオチドプライマーであり、本来の残基60がGluからGlnに変換したもの（E60Q）、残基61がGluからGln に変換したもの（E61Q）、残基62がTyrからPheまたはSerに変換したもの（Y62F またはY62S）、および残基63がAspからAsnに変換したもの（D63N）を合成し、PC Rに用いて断片を生成し、その断片を野生型CD16：ζD66＊構築体のBamHI部位からNotI部位までにサブクローニングした。 CD16：7：ζ（33-65）キメラ、CD16：7：ζ（71-104）キメラ、CD16：7：ζ（10 4-137）キメラの構築膜貫通ドメインと細胞内ドメインとの結合部にMluI部位とNotI部位を有するCD 7膜貫通断片を、以下の配列を有するオリゴヌクレオチドを用いてPCRにより得た。CGC GGG GCG GCC ACG CGT CCT CGC CAG CAC ACA（配列番号：14）。得られたP CR断片をBamHIおよびNotIで消化し、CD16：7：ζ（48-65）構築体へと再び挿入した。残基33から65、71から104、および104から137をコードするζ断片を、PCR 反応により得た。用いたプライマー対は、順向きプライマーの5'末端にMluI部位、および停止コドン、それに続く逆向きプライマーの5'末端にNotI部位を含む。各々の場合において、制限酵素切断を確実にするため、制限部位はプライマーの 5'末端から6残基一方の鎖が欠けていた。 FcRγIIA欠失変異体の構築全長構築体と同様な方法でPCRにより、カルボキシル末端FcRIIA欠失変異体を構築し、282位および298位のチロシンをコードする配列を停止コドン（TAA）に変換した。N末端欠失は、PCRにより、細胞内ドメインをコードする断片を増幅し、得られる断片を、すでに構築されている発現プラスミドのMluI制限部位とNotI 制限部位の間に挿入することができるオリゴヌクレオチドを用いることにより作製した。発現プラスミドは、CD7膜貫通ドメインに融合したCD16細胞外ドメインをコードし、CD7膜貫通ドメインはMluI部位、膜貫通ドメインと細胞内ドメインとの結合部で終了する。その他の態様上述の実施例により、ζ、η、またはγキメラの凝集が、T細胞における細胞溶解エフェクター細胞反応を開始するために十分であることが示された。Tリンパ球、ナチュラルキラー細胞、好塩基性顆粒球、マクロファージ、および肥満細胞を含む既知の範囲のζ、η、またはγの発現により、保存された配列モチーフが、造血系に由来する細胞に共通の知覚装置と相互作用するのかもしれないということ、および免疫系における宿主防御の重要な成分がレセプター凝集過程により媒介されるかもしれないということが示された。細胞溶解反応を起こすことができ、MHCクラスIIレセプターを有する標的細胞に対する反応を起こさないということは、ζ、η、またはγに基づいたキメラが、養子免疫治療によりAIDSを遺伝学的に防止するための基礎となることを示している。内因性ζおよびγは広範に分布し、γと相互作用したFcレセプターは異なる細胞型において細胞毒性を媒介するという証拠により（Fanger et al.,Immuno l.Today 10:92-99（1989））、様々な細胞をこの目的の対象とすることができる。例えば、循環系における寿命が非常に短い（約４時間）好中性顆粒球は非常に強い細胞溶解性で、キメラ発現のための都合のよい標的細胞である。好中球にHI Vが感染してもウイルス放出が起こる可能性は低く、これらの細胞は豊富である（白血球の中で最も多く存在する）ため、宿主の防御が促進される。宿主細胞として都合のよいもう一つの可能性は、現在レトロウイルスを用いた遺伝子工学により入手可能な細胞群、即ち成熟T細胞である（Rosenberg,S.A.Sci.Am.262:62-6 9（1990））。組換えIL-2の助けを借りることにより、T細胞群は、比較的容易に培地中で増殖させることができ、増殖した群は典型的に、再注入した際に限られた寿命をもつ（Rosenberg et al.,N.Engl.J.Med.323:570-578（1990））。適当な条件の下で、CD4キメラを発現する細胞によるHIV認識はまた、分裂促進刺激をも提供し、それにより武装細胞群はウイルス付加に対して劇的に反応することができる可能性がある。本発明者らは、本明細書において、細胞溶解性Tリンパ球における融合タンパク質の作用に焦点を当ててきたが、ヘルパーリンパ球におけるキメラの発現は、AIDSにおけるヘルパー細胞サブセットの破壊に対抗するHIV動貞性の（HIV-mobilized）サイトカイン源を提供しうる。ウイルス侵入以外の段階において感染に対して、遺伝子工学的に抵抗するためのいくつかの手段が最近開示されているが（Friedman et al.,Nature 335:452-454（1988）;Green e t al.,Cell 58:215-223（1989）;Malim et al.,Cell 58:205-214（1989）；Tron o et al.,Cell 59:113-120（1989）;Buonocore et al.,Nature 345:625-628（19 90））、それらは、CD4キメラを有する細胞が、細胞内の作用部位を有する適当な物質の発現により、ウイルス産生を妨害するために設計されうるということを示している。自律的なキメラによりTリンパ球へシグナルを伝達することができるため、レトロウイルス遺伝子工学により作製したリンパ球をインビボで調節することもできる。例えば、補体結合ドメインを除去する操作を受けた特異的IgM抗体により媒介されるような架橋刺激により、このようなリンパ球をインサイチューで増加させることができ、同様な（例えば、キメラ鎖中に挿入されたアミノ酸変異を認識する）特異的IgG抗体で処理することにより、変異を受けた群を選択的に減少させることができる。さらに、抗CD4 IgM抗体は、CD4：ζキメラを発現するジャーカット（Jurkat）細胞において、カルシウムを動員するためのさらなる架橋を必要としない。反復体外増幅に頼らずに細胞群を調節できるということは、現在提唱されている遺伝子工学によるT細胞の使用の範囲および効率を実質的に拡大しうる。本発明をその特定の態様との関連において開示してきたが、さらに修飾を加えることが可能であり、本願は、本発明の修飾、使用、または適用を含むものであり、また本発明が属する分野において本開示から行われ、本明細書または添付の請求の範囲に記載された本質的な特徴に適用される改良も含むということを理解すべきである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＡ６１Ｋ 39/00 9284−4ＣＡ６１Ｋ 39/21 ＡＤＹ 39/21 ＡＤＹ 9051−4Ｃ 48/00 48/00 8615−4ＣＣ０７Ｈ 21/04 ＢＣ０７Ｈ 21/04 9051−4ＣＡ６１Ｋ 37/02 Ｃ１２Ｎ 5/10 9282−4ＢＣ１２Ｎ 5/00 Ｂ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＦＩ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＲ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＵ，ＳＩ，ＵＡ (72)発明者ロミオチャールズアメリカ合衆国マサチューセッツ州ベルモントチェスターロード 45 (72)発明者コラヌスバルデマー独国ミュンヘンゴスウィンストラッセ７

Claims

【特許請求の範囲】 1.哺乳類に、有効量の治療用細胞を投与することを含む、哺乳類におけるHIV感染細胞に対する細胞免疫反応を行う方法において、該治療用細胞が、（a）HIV感染細胞を特異的に認識し、結合することができるが、HIV感染を媒介することがないCD4断片を含む細胞外部分、および（b）レセプター結合HIV感染細胞を破壊するようなシグナルを、該治療細胞に与えることができる細胞内部分、を含む膜結合型のタンパク質性キメラレセプターを発現するものである方法。 2.CD4断片が1〜394番目のアミノ酸または1〜200番目のアミノ酸を含む、請求の範囲1の方法。 3.CD4断片が、図26に示したCD7膜貫通ドメインにより、または図25に示したヒト IgG1分子のヒンジ、CH2、およびCH3ドメインにより、細胞内部分から分離されている、請求の範囲1の方法。 4.CD4断片が、少なくとも48オングストローム、または少なくとも72オングストローム、治療用細胞膜から分離されている、請求の範囲1の方法。 5.細胞内部分が、T細胞レセプタータンパク質、B細胞レセプタータンパク質、またはFcレセプタータンパク質のシグナル伝達部分である、請求の範囲1の方法。 6.T細胞レセプタータンパク質がζである、請求の範囲5の方法。 7.治療用細胞が、（a）Tリンパ球、（b）細胞毒性Ｔリンパ球、（c）ナチュラルキラー細胞、（d）好中球、（e）顆粒球、（f）マクロファージ、（g）肥満細胞、（h）ヒーラ細胞、および（i）胚性未分化細胞（ES）からなる群より選ばれる、請求の範囲1の方法。 8.レセプターが、CD7膜貫通部分、CD5膜貫通部分、またはCD34膜貫通部分を含む、請求の範囲1の方法。 9.CD4断片が、一つまたは複数のタンパク質性アルファヘリックスにより、治療用細胞の細胞膜から分離されている、請求の範囲1の方法。 10.（a）HIV感染細胞を特異的に認識し、結合することができるが、HIV感染を媒介することがないCD4断片を含む細胞外部分、および（b）レセプター結合HIV感染細胞を破壊するようなシグナルを、治療用細胞に与えることができる細胞内部分、を含むタンパク質性の膜結合型キメラレセプターを発現する細胞。 11.CD4断片が1〜394番目のアミノ酸または1〜200番目のアミノ酸を含む、請求の範囲10の細胞。 12.CD4断片が、図26に示したCD7膜貫通ドメインにより、または図25に示したヒトIgG1分子のヒンジ、CH2、およびCH3ドメインにより、細胞内部から分離されている、請求の範囲10の細胞。 13.CD4断片が、少なくとも48オングストローム、または少なくとも72オングストローム、治療用細胞の細胞膜から分離されている、請求の範囲10の細胞。 14.細胞内部分が、T細胞レセプタータンパク質、B細胞レセプタータンパク質、またはFcレセプタータンパク質のシグナル伝達部分である、請求の範囲10の細胞。 15.T細胞レセプタータンパク質がζである、請求の範囲14の細胞。 16.レセプターが、CD7膜貫通部分、CD5膜貫通部分、またはCD34膜貫通部分を含む、請求の範囲10の細胞。 17.CD4断片が、一つまたは複数のタンパク質性アルファヘリックスにより、治療用細胞の細胞膜から分離されている、請求の範囲10の細胞。 18.請求の範囲10のキメラレセプターをコードするDNA。 19.請求の範囲18のキメラレセプターDNAを含むベクター。