JPH09512424A - 細胞周期調節蛋白質およびそれに関する使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、真核生物細胞、特に哺乳類細胞における細胞周期調節性蛋白質（「ＣＣＲ蛋白質」）の新規のファミリーの発見に関する。本明細書に記載されるように、このファミリーの蛋白質は、１６ｋＤａの見かけの分子量を有するポリペプチドおよび約１５ｋＤａの見かけの分子量を有するポリペプチドを含み、その各々は細胞周期の進行、およびそのため最終的には細胞成長のインヒビターとして作用することができる。従って、ｐ５３チェックポイントに対するｐ２１の役割に類似し、表題ＣＣＲ蛋白質は細胞周期調節性蛋白質である網膜芽細胞腫（ＲＢ）と共同的に機能することがある。それに加え、ＣＣＲ蛋白質ファミリーは、１３．５ｋＤａの見かけの分子量を有する蛋白質（本明細書では今後「ｐ１３．５」と称する）を含む。ｐ１３．５の仮想的役割はｐ１６およびｐ１５同様、細胞周期の調節におけるものである。

Description

【発明の詳細な説明】 細胞周期調節蛋白質およびそれに関する使用 新生物は、脱調節化された細胞成長および分裂を特徴とする。必然的に、細胞 成長を制御する分子経路は細胞分裂を制御する分子経路と相互作用する必要があ る。しかしながらつい最近になるまでは、そのような関連性を解明するための実 験的証拠は得られてはいなかった。サイクリンＡが、ウイルス形質転換化細胞中 のアデノウイルス腫瘍蛋白質Ｅ１Ａ結合することが見いだされた（Ｇｉｏｒｄｏ ｎａ ｅｔ ａｌ． Ｃｅｌｌ ５８：９８１（１９８９）；およびＰｉｎｅｓ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ ３４６：７６０（１９９０））。初期の原発性 肝細胞癌ではヒトサイクリンＡ遺伝子がＢ型肝炎ウイルスの断片の組込み部位で あり、このことによりサイクリンＡ転写の活性化、ならびにインビトロでは分解 されないキメラウイルス性サイクリンＡ蛋白質がもたらされることが判明した（ Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ ３４３：５５５（１９９０））。これ までに腫瘍形成性において最も強い関連性が示唆されている細胞周期遺伝子はヒ トサイクリンＤ１である。これはもともとはイーストＧ₁サイクリン欠陥株（Ｘ ｉｏｎｇ ｅｔ ａｌ． Ｃｅｌｌ ６５：６９１（１９９１）：およびＬｅｗ ｅｔ ａｌ． Ｃｅｌｌ ６６：１１９７（１９９１））の遺伝子相補作用を 通して、マウスマクロファージ内でＣＳＦ−１によりその転写が刺激化される細 胞性遺伝子として（Ｍａｔｓｕｓｈｉｎｅ ｅｔ ａｌ． Ｃｅｌｌ ６５：７ ０１（１９９１））、および副甲状腺腫瘍内で再配列される仮 想的癌遺伝子ＰＲＡＤ１として（Ｍｏｎｔｏｋｕｒａ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕ ｒｅ ３５０：５１２（１９９１））単離された。その後には２つの追加的ヒト Ｄ−タイプのサイクリン、つまりサイクリンＤ２およびＤ３が、ＰＣＲおよび低 緊縮性ハイブリダイゼーション技術（Ｉｎａｂａ ｅｔ ａｌ． Ｇｅｎｏｍｉ ｃ １３：５６５（１９９２）；およびＸｉｏｎｇ ｅｔ ａｌ． Ｇｅｎｏｍ ｉｃｓ １３：５７５（１９９２））を使用して同定された。サイクリンＤ１は 遺伝子的にはｂｃｌ−１癌遺伝子と関連しており、その遺伝子座はある種のＢ細 胞リンパ腫および白血病の際には免疫グロブリン遺伝子エンハンサーへの転座に より活性化され、かつヒトの乳癌の内の１５〜２０％ならびに頭部および頸部起 源の扁平上皮細胞癌の内の２５〜４８％における遺伝子増幅の部位に位置する。 しかしながら突然変異体癌遺伝子の作製は腫瘍形成にとって必要とされる必要 条件の内のほんの一つに過ぎず：腫瘍形成性は更に第二の種類の重要な遺伝子の 追加的不活化も必要とするようであり：それらはすなわち「抗腫瘍遺伝子」もし くは「腫瘍抑制性遺伝子」である。天然の状態ではそれらの遺伝子が作用して細 胞増殖を抑制する。このような遺伝子に対する損傷によりこの抑制の喪失がもた らされ、そしてこのことにより腫瘍形成性がもたらされる。従って細胞成長の脱 調節化は、腫瘍遺伝子の活性化もしくは腫瘍抑制遺伝子の不活化のいずれかによ り媒介されることがある（Ｗｅｉｎｂｅｒｇ，Ｒ．Ａ．、（Ｓｅｐｔ １９８８ ） Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒ． ｐｐ４４−５１）。 腫瘍遺伝子および腫瘍抑制性遺伝子は、顕著な基本特性を有する。これまでに 同定された腫瘍遺伝子は体細胞内においてのみ生じており、そ してそのためそれらの効果をその宿主動物の生殖細胞系に伝達することは不可能 であった。それとは対照的に腫瘍抑制性遺伝子における突然変異は生殖細胞系細 胞内において同定することが可能であり、かつそのため動物の子孫に伝播可能で ある。 遺伝性癌の古くからの例は小児の網膜芽細胞腫である。網膜芽細胞腫の症例は 腫瘍抑制遺伝子である網膜芽細胞腫（ＲＢ）遺伝子により決定される（Ｗｅｉｎ ｂｅｒｇ，Ｒ．Ａ．、（Ｓｅｐｔ １９８８）Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒ ． ｐｐ４４−５１；Ｈａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｔｒｅｎｓ Ｇ ｅｎｅｔ ４：１２５−１２８）。ＲＢ対立遺伝子の内の一つの中に、ある病変 を伴って出生した個体は網膜芽細胞腫の小児初期発症の疾病素因を示す。これら 感受性個体の体細胞の内の一つにおける第二ＲＢ対立遺伝子の不活化もしくは突 然変異が腫瘍形成をもたらす分子的現象であるように思われる（Ｃａｖｅｎｅｅ ｅ ｅｔ ａｌ．（１９８３）Ｎａｔｕｒｅ ３０５：７９９−７８４；Ｆｒｉ ｅｎｄ ｅｔ ａｌ．（１９８７）ＰＮＡＳ ８４：９０５９−９０６３）。 ＲＢ腫瘍抑制性遺伝子はヒトの第１３染色体上に位置している。突然変異体は 冒された個体の生殖細胞系を通して容易に伝播することができる（Ｃａｖｅｎｅ ｅ，ｅｔ ａｌ．（１９８６） Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ ３１４：１２ ０１−１２０７）。この腫瘍抑制性遺伝子の２本の天然に存在する対立遺伝子の 内のたった一本のみに突然変異を有する個体は網膜芽細胞腫に対する疾病素因を 示す。しかしながらその二本の対立遺伝子の内の第二のものの不活化が腫瘍形成 には必要となる（Ｋｕｎｄｓｏｎ （１９７１） ＰＮＡＳ ６８：８２０−８ ２３）。 第二の腫瘍抑制性遺伝子はｐ５３遺伝子である（Ｇｒｅｅｎ （１９８９） Ｃｅｌｌ ５６：１−３；Ｍｏｗａｔ ｅｔ ａｌ（１９８５ Ｎａｔｕｒｅ ３１４：６３３−６３６）。ｐ５３遺伝子によりコードされる蛋白質は、ＳＶ４ ０の巨大Ｔ抗原およびアデノウイルスＥ１Ｂ ５５ｋｄ蛋白質の両方と安定な複 合体を形成する核蛋白質である。ｐ５３遺伝子産物はこれらの蛋白質への結合に より不活化されることがある。 ｐ５３突然変異体の原因および効果分析に基づくと、「細胞周期チェックポイ ント」としてのｐ５３の機能的役割、特にＧ１期からＳ期内への細胞の進行を制 御することに関しての役割は、ｐ５３が細胞周期機構に直接もしくは間接的に影 響を及ぼすことが可能であるということに関連していた。ｐ５３と細胞周期との 間の特異的生化学的関連についての最初の確固たる証拠は、ｐ５３が第二蛋白質 ｐ２１（この蛋白質が、例えばＧ１からＳ期への細胞周期を通して細胞を稼働さ せるのに必要なサイクリン−依存的キナーゼ（ＣＤＫ）（複数）を阻害する）の 発現を調節するようであるという所見である。例えば、一例ではｐ５３腫瘍抑制 因子の欠失突然変異により少なくとも部分的には生じるもののような非ウイルス 性形質転換が、サイクリン／ＣＤＫ複合体からｐ２１の喪失をもたらすことがあ り得ることが既に証明されている。Ｘｉｏｎｇら（１９９３） Ｎａｔｕｒｅ ３６６：７０１−７０４が記載するように、ｐ５３に応答してのｐ２１の誘導は 、ＤＮＡ損傷に応答する細胞周期拘束を実施するためのもっともらしいメカニズ ムであり、そしてｐ５３の喪失はｐ２１細胞周期インヒビターの喪失により増殖 を脱調節化することがある。 細胞周期制御の際の腫瘍抑制性蛋白質としてのＲＢの役割はｐ５３のものに類似 すると考えられる。しかしながらｐ５３は一般的にはＤＮＡ損傷のような固有な 環境的手掛かりに応答するものと考えられる一方で、ＲＢ蛋白質は、例えば拡散 性成長インヒビターのように通常は細胞に増殖を停止させる外因性刺激物と共に 細胞成長を調整することに関わっているようである。正常細胞ではＲＢは細胞周 期全体にわたって発現されながらも、その周期の内の所定の段階に特異的な多重 リン酸化形態で存在する。より高度にリン酸化された形態がＳおよびＧ₂／Ｍ間 に見いだされる一方で、非リン酸化形態はＧ₁および増殖拘束化状態において見 いだされる主な種である。これらの所見に基づき、ＲＢが細胞周期における調節 的（抑制的）活性を有する場合には、この活性は翻訳後レベルで調節されるはず であるということが議論されてきている。従って、非リン酸化ＲＢは成長抑制性 活性を伴う形態であるようであり、それはその形態がＧ₁および増殖拘束化細胞 に優先的に存在するためである。 この目的のためには、例えばＴＧＦ−βファミリーのメンバーのような様々な パラクリン性成長インヒビターがＲＢのリン酸化を阻止し、かつ細胞を後期Ｇ₁ に拘束することが特筆される。最近のモデルにより、Ｇ₁中はサイクリン依存性 キナーゼおよび特にサイクリンＤ結合化キナーゼ、すなわちＣＤＫ４およびＣＤ Ｋ６が網膜芽細胞腫感受性遺伝子の産物をリン酸化し、そしてそのためその成長 阻害性効果から細胞を解放することが示唆されている。ＴＧＦ−β処理により、 リン酸化不全状態にあるＲＢの蓄積、およびＴＧＦ−β誘導化細胞周期拘束を阻 止するＲＢ−不活化用ウイルス性腫瘍蛋白質の発現が生じる。類似様式で、例え ばアクチビンのような他の関連分化因子が、Ｇ₁期での拘束に関連する 非リン酸化ＲＢの蓄積を誘導する。 最近では、ＲＢ蛋白質は、ＣＤＫ４およびＣＤＫ６の両方にとってのリン酸化 基質であることが既に証明されている（Ｓｅｒａｎｏ ｅｔ ａｌ．（１９９３ ） Ｎａｔｕｒｅ ３６６：７０４−７０７：Ｋａｔｏ ｅｔ ａｌ．（１９９ ３） Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ ７：３３１−３４２；およびＭｅｙｅｒｓｏｎ ｅ ｔ ａｌ．（１９９４） Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １４：２０７７−２０ ８６）。しかしながら本発見の以前には、ＲＢのＣＤＫリン酸化が負の方向に調 節されるという、その様式に関わる情報は殆ど存在しなかった。 発明の要約 本発明は真核生物細胞、特に哺乳類細胞における新規の細胞周期調節蛋白質（ 「ＣＣＲ蛋白質」）ファミリーの発見に関する。本明細書に記載されるように、 この蛋白質ファミリーは、１６ｋＤａの見かけの分子量を有するポリペプチド、 および約１５ｋＤａの見かけの分子量を有するポリペプチドを含み、それら各々 のポリペプチドが細胞周期の進行の、そしてそのため最終的には細胞増殖のイン ヒビターとして機能することができる。従って、ｐ５１チェックポイントへのｐ ２１の役割に類似し、表題ＣＣＲ蛋白質は細胞周期調節蛋白質である網膜芽細胞 腫（ＲＢ）と同調して作用することがある。その上このＣＣＲ蛋白質ファミリー は、１３．５ｋＤａの見かけの分子量を有する蛋白質（本明細書では今後「ｐ１ ３．５」とする）を含む。ｐ１３．５の仮想的役割は、ｐ１６およびｐ１５同様 、細胞周期の調節におけるものである。 本発明のある態様は、細胞周期調節（ＣＣＲ）蛋白質もしくはその断片の実質 的に純粋な調製物、１２〜２０ｋＤ、好ましくは１３ｋＤ〜１ ８ｋＤの範囲にわたる見かけの分子量を有するＣＣＲ蛋白質の全長形態を特徴と する。好ましい態様ではＣＣＲ蛋白質の全長形態は、約１３．５ｋＤ、１５ｋＤ 、１５．５ｋＤ、もしくは１６ｋＤの見かけの分子量を有する。好ましい態様で は：ポリペプチドは配列番号２、４、６、もしくは８の内の一つに表されるアミ ノ酸に少なくとも６０％相同なアミノ酸配列を有し：ポリペプチドは配列番号２ 、４、６、もしくは８の内の一つに表されるアミノ酸に少なくとも８０％相同な アミノ酸配列を有し；ポリペプチドは配列番号２、４、６、もしくは８の内の一 つに表されるアミノ酸に少なくとも９０％相同なアミノ酸配列を有し；ポリペプ チドは配列番号２、４、６、もしくは８の内の一つに表されるアミノ酸と同一の アミノ酸配列を有する。ある好ましい態様では；断片は配列番号２、４、６、も しくは８の内の少なくとも５つの連続的アミノ酸残基を含み；断片は配列番号２ 、４、６、もしくは８の内の少なくとも２０の連続的アミノ酸残基を含み；断片 は配列番号２、４、６、もしくは８の内の少なくとも５０の連続的アミノ酸残基 を含む。例えばＣＣＲ蛋白質は一般式： により表されるアミノ酸配列を含むことができる。例えばＣＣＲ蛋白質は配列： もしくは配列： もしくは更に別の態様では配列： により表すことができる。好ましい態様ではＣＣＲ蛋白質は、特異的にＣＤＫ、 例えばＧ₁期のＣＤＫ、例えばＣＤＫ４および／またはＣＤＫ６に結合する。Ｃ ＣＲ蛋白質は哺乳類細胞、例えばヒト細胞、例えばマウス細胞からクローン化す ることができる。 本発明の他の態様は、ＣＣＲ蛋白質ファミリーのポリペプチドを特徴とし、そ れらのポリペプチドは細胞周期調節のアゴニストかもしくは細 胞調節のアンタゴニストかのいずれかの役割の内の一つとして機能する。好まし い態様では：表題ＣＣＲ蛋白質は特異的にサイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ） に結合し、例えばＣＤＫ４に特異的に結合し；例えばＣＤＫ６に特異的に結合し ；例えばＣＤＫ４のキナーゼ活性を阻害し；ＣＤＫ６のキナーゼ活性を阻害し； 例えばＣＤＫ４によるＲＢ蛋白質のリン酸化を阻害する。より好ましい態様では ：ＣＣＲ蛋白質は真核生物の細胞周期、例えば哺乳類の細胞周期、例えばヒトの 細胞周期を阻害し；ＣＣＲ蛋白質はＧ１期からＳ期への真核生物細胞、例えばヒ ト細胞の増殖／細胞成長を阻害し；ＣＣＲ蛋白質はＧ１期からＳ期への真核生物 細胞の進行を阻害し、例えば哺乳類細胞のＧ１期からＳ期への進行を阻害し、例 えばヒト細胞のＧ１期からＳ期への進行を阻害し；ＣＣＲ蛋白質はサイクリン依 存性キナーゼ（ＣＤＫ）、例えばＧ１期で活性を示すＣＤＫ、例えばＣＤＫ４の キナーゼ活性を阻害し；ＣＣＲ蛋白質は、例えば腫瘍細胞中、例えば損なわれて いないＲＢもしくはＲＢ−様蛋白質チェックポイントを有する腫瘍細胞中での腫 瘍成長を抑制する。それに加え、本発明のＣＣＲ蛋白質は更に生物学的活性をも 有することがあり、それらは：細胞外因子およびサイトカインに応答する細胞周 期進行を調節する能力、例えば細胞成長および／または分化のパラクリン性もし くはオートクリン性の調節において機能する能力；例えばトランスフォーミング 成長因子−β（ＴＧＦ−β）、あるいは関連する成長、分化、もしくは形態形成 因子に応答するＣＤＫ活性化を阻害する能力が含まれる。 本発明の更に別の態様は、複数の配列番号の内の一つにより表されるアミノ酸 配列に相同なアミノ酸配列を有するポリペプチドに関する。 本発明の更に別の態様は、本発明のＣＣＲ蛋白質もしくはその断片を 免疫学的調製物内に含む免疫原に関し、その免疫原はＣＣＲ蛋白質に特異的な免 疫応答（例えば液性応答（例えば抗体応答）；例えば細胞性応答）を誘発するこ とが可能である。 本発明の他の態様は、好ましくは：配列番号２、４、６、もしくは８の内の一 つに表されるアミノ酸配列に少なくとも６０％相同な；配列番号２、４、６、も しくは８の内の一つに表されるアミノ酸配列に少なくとも８０％相同な；配列番 号２、４、６、もしくは８の内の一つに表されるアミノ酸配列に少なくとも９０ ％相同な；配列番号２、４、６、もしくは８の内の一つに表されるアミノ酸配列 と同一なアミノ酸配列を有する組換えＣＣＲ蛋白質もしくはその断片を特徴とす る。好ましい態様では：断片は配列番号２、４、６、もしくは８の内の少なくと も５つの連続的アミノ酸残基を含み；断片は配列番号２、４、６、もしくは８の 内の少なくとも２０の連続的アミノ酸残基を含み；断片は配列番号２、４、６、 もしくは８の内の少なくとも５０の連続的アミノ酸残基を含む。好ましい断片で は、組換えＣＣＲ蛋白質は細胞周期調節のアゴニストもしくは細胞周期調節のア ンタゴニストの内のいずれか一つとして機能する。より好ましい態様では：ＣＣ Ｒ蛋白質は特異的にサイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）に結合し、例えば特異 的にＣＤＫ４に結合し；例えば特異的にＣＤＫ６に結合し；例えばＣＤＫ４のキ ナーゼ活性を阻害し；ＣＤＫ６のキナーゼ活性を阻害し；例えばＣＤＫ４による ＲＢ蛋白質のリン酸化を阻害する。より好ましい態様では：ＣＣＤ蛋白質は真核 生物の細胞周期、例えば哺乳類の細胞周期、例えばヒトの細胞周期を阻害し；Ｃ ＣＲ蛋白質は真核生物細胞、例えばヒト細胞の増殖／細胞成長を阻害し；ＣＣＲ 蛋白質はＧ１期からＳ期内への真核生物の進行を阻害し、 例えばＧ１期からＳ期内への哺乳類細胞の進行を阻害し、例えばＧ１期からＳ期 内へのヒト細胞の進行を阻害し；ＣＣＲ蛋白質はサイクリン依存性キナーゼ（Ｃ ＤＫ）、例えばＧ１期において活性を示すＣＤＫ、例えばＣＤＫ４のキナーゼ活 性を阻害し；ＣＣＲ蛋白質は腫瘍成長、例えば腫瘍細胞内での腫瘍成長、例えば 損なわれていないＲＢもしくはＲＢ−様蛋白質チェックポイントを有する腫瘍細 胞内での腫瘍成長を抑制する。 更に別の好ましい態様では、組換えＣＣＲ蛋白質は、配列番号２、４、６、も しくは８の蛋白質に無関係の蛋白質からのアミノ酸配列を有する第二ポリペプチ ド部分を更に含む融合蛋白質である。そのような融合蛋白質は二重ハイブリッド アッセイにおいて機能を示すことができる。 本発明の他の態様は、配列番号２、４、６、もしくは８の内の一つに少なくと も６０％は相同なアミノ酸配列を有するＣＣＲ蛋白質もしくはその断片をコード するヌクレオチド配列を有する実質的に純粋な核酸を提供する。更に好ましい態 様では：核酸は配列番号２に少なくとも８０％相同な、より好ましくは配列番号 ２に少なくとも９０％相同な、そして最も好ましくは配列番号２に少なくとも９ ５％相同なアミノ酸配列を有する蛋白質をコードし；核酸は配列番号６に少なく とも８０％相同な、より好ましくは配列番号６に少なくとも９０％相同な、そし て最も好ましくは配列番号６に少なくとも９５％相同なアミノ酸配列を有する蛋 白質をコードする。この核酸はサイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）に特異的に 結合する；例えばＣＤＫ４に特異的に結合する；例えばＣＤＫ６に特異的に結合 する；例えばＣＤＫ４のキナーゼ活性を阻害する：例えばＣＤＫ４によるＲＢ蛋 白質のリン酸化を阻害するＣＣＲ蛋白質をコー ドすることが好ましい。 他の態様では、核酸は、配列番号１の少なくとも１２の連続的ヌクレオチド； より好ましくは配列番号１の少なくとも２０の連続的ヌクレオチド；更に好まし くは配列番号１の少なくとも４０の連続的ヌクレオチドに相当する核酸プローブ に緊縮条件下でハイブリダイズする。 別の態様では、核酸は、配列番号３の内の少なくとも１２の連続的ヌクレオチ ド；より好ましくは配列番号３の内の少なくとも２０の連続的ヌクレオチド；更 に好ましくは配列番号３の内の少なくとも４０の連続的ヌクレオチドに相当する 核酸プローブに緊縮条件下でハイブリダイズする。 更に別の態様では、核酸は、配列番号５の内の少なくとも１２の連続的ヌクレ オチド；より好ましくは配列番号５の内の少なくとも２０の連続的ヌクレオチド ；更に好ましくは配列番号５の内の少なくとも４０の連続的ヌクレオチドに相当 する核酸プローブに緊縮条件下でハイブリダイズする。 更に別の態様では、核酸は、配列番号７の内の少なくとも１２の連続的ヌクレ オチド；より好ましくは配列番号７の内の少なくとも２０の連続的ヌクレオチド ；更に好ましくは配列番号７の内の少なくとも４０の連続的ヌクレオチドに相当 する核酸プローブに緊縮条件下でハイブリダイズする。 それに加え所定の態様では、ＣＣＲ核酸はその組換えＣＣＲ遺伝子配列を、あ る発現ベクター内での使用に適するようにさせるようにＣＣＲ遺伝子配列に操作 可能に連結される転写調節配列、例えば少なくとも一つの転写プロモーターもし くは転写エンハンサー因子を含むであろう。 本発明は更に形質転換非ヒト動物、例えばマウスをも特徴とし、その非ヒト動 物は外因性ＣＣＲ遺伝子（例えばヒトに由来するもの）を発現するか、あるいは それ自体のＣＣＲ遺伝子を過誤発現するか（たとえば、ｐ１６、ｐ１５、もしく はｐ１３．５の発現が破壊されている）のいずれかを行う。このような形質転換 動物は、細胞性障害を研究するための、突然変異を生じさせてあるかもしくは過 誤発現化されたＣＣＲ対立遺伝子を含む動物モデルとして作用することができる 。 本発明は更に実質的に精製されたオリゴヌクレオチドを含むプローブ／プライ マーをも提供し、そのオリゴヌクレオチドは配列番号１、３、５、もしくは７、 あるいは天然に存在するそれらの突然変異体の内の一つのセンスもしくはアンチ センス配列の内の少なくとも１０の連続的ヌクレオチドと緊縮条件下でハイブリ ダイズするオリゴヌクレオチド配列の領域を含む。好ましい態様では、このプロ ーブ／プライマーは更にそれらに連結しかつ検出可能なラベル基を含み、そのラ ベル基は例えば、放射性同位体、蛍光化合物、酵素、および酵素補助因子からな る群より選択される。このようなプローブを形質転換細胞を同定するための診断 検査用キットの一部分として用いることができ、そのキットとは例えば、患者か ら単離された細胞の試料中のｐ１６、ｐ１５、もしくはｐ１３．５をコードする 核酸のレベルを測定するため；例えば細胞内のｍＲＮＡレベルを測定するか、あ るいはそのゲノムＣＣＲ遺伝子が突然変異もしくは欠失を受けているかどうかを 決定するためのものである。 本発明は更に、野生型のＣＣＲ−蛋白質機能の喪失を特徴とする所望されない 細胞成長を有する動物を治療するための方法をも提供し、その方法はＣＤＫ（例 えば、ＣＤＫ４）のキナーゼ活性を阻害することが可 能な作用物質の治療学的有効量を投与することを含む。ある態様では、その方法 は、ＣＣＲ蛋白質、例えば、ｐ１６、ｐ１５、もしくはｐ１３．５、例えば配列 番号２、４、６、もしくは８の内の一つに表されるポリペプチドをコードする核 酸構築物を、その構築物がＣＣＲ欠陥細胞内に組込まれ、かつそのポリペプチド が例えば遺伝子療法技術により発現される条件下で投与することを含む。他の態 様では、この方法は、ＣＤＫに結合しかつそれを阻害するＣＣＲ疑似物（例えば ペプチド疑似物）を投与することを含む。 本発明の他の態様は、被検体（例えば、ヒト患者）が所望されない細胞増殖を 特徴とする障害の危険性にさらされているかどうかを決定するための方法を提供 し、その方法は、その被検体の組織内で、（ｉ）配列番号２、４、６、もしくは ８、またはその相同体の内の一つにより表される蛋白質をコードする遺伝子の突 然変異；あるいは（ｉｉ）ＣＣＲ遺伝子（例えば、ｐ１６、ｐ１５、もしくはｐ １３．５遺伝子）の過誤発現、の内の少なくとも一つを特徴とする遺伝子病変の 存在もしくは非存在を検出することを含む。好ましい態様では：遺伝子病変の検 出が、前記遺伝子からの一つもしくは複数のヌクレオチドの欠失、前記遺伝子へ の一つもしくは複数のヌクレオチドの添加、前記遺伝子の一つもしくは複数のヌ クレオチドの置換、前記遺伝子の総体的染色体再配列、前記遺伝子のメッセンジ ャーＲＮＡ転写物のレベルの変化、前記遺伝子のメッセンジャーＲＮＡの非野生 型スプライシングパターンの存在、もしくは前記蛋白質の非野生型レベル、の内 の少なくとも一つの存在を確認することを含む。例えば、遺伝子病変の検出は、 （ｉ）配列番号１、３、５、もしくは７、あるいは天然に存在するその突然変異 体の内の一つのセン スもしくはアンチセンス配列、あるいはＣＣＲ遺伝子に天然の状態で連結する５ ’もしくは３’フランク配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列の領域を含 むオリゴヌクレオチドを含むプローブ／プライマーを提供すること；（ｉｉ）そ のプローブ／プライマーをその組織の核酸に露出すること；および（ｉｉｉ）そ のプローブ／プライマーのその核酸へのハイブリダイゼーションにより遺伝子病 変の存在もしくは非存在を検出することを含むことができ；例えば、この場合病 変の検出は、ＣＣＲ遺伝子および場合によってはフランク核酸配列のヌクレオチ ド配列を決定するためにそのプローブ／プライマーを利用することを含み；例え ば、病変の検出はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）にそのプローブ／プライマー を利用することを含み；例えば、病変の検出は連結連鎖反応（ＬＣＲ）にそのプ ローブ／プライマーを利用することを含む。別の態様では、前記蛋白質のレベル は免疫アッセイで決定される。 本発明の更に別の態様は、ＣＣＲ蛋白質（例えば、ｐ１５もしくはｐ１６）に 結合し、そしてＣＤＫ（例えば、ＣＤＫ４もしくはＣＤＫ６）へのその蛋白質の 結合を阻害するペプチド疑似物に関する。例えば、好ましいペプチド疑似物は、 配列ＶＡＥＩＧ（Ｖ／Ｅ）ＧＡＹＧ（Ｔ／Ｋ）−Ｖ（Ｆ／Ｙ）ＫＡＲＤを有する ペプチドのアナログであるが、そのペプチド疑似物が６量体ペプチドＶ（Ｆ／Ｙ ）ＫＡＲＤのアナログであることがより好ましく、そしてそのペプチド疑似物が ４量体ペプチドＫＡＲＤのアナログであることが更に一層好ましい。同様に、Ｃ ＤＫ４／ＣＤＫ６の他の好ましいペプチドアナログは配列ＳＲＴＤＲＥ（Ｉ／Ｔ ）Ｋ（Ｖ／Ｌ）ＴＬＶＦＥＨＶＤＱＤＬ（Ｒ／Ｔ）ＴＹＬＤＫ（Ａ／Ｖ）ＰＰＰ Ｇ（Ｌ／Ｖ）に対応するペプチドもしくはペプチド疑似物を含む が、そのペプチド疑似物が６量体ペプチドＦＥＨＶＤＱもしくはＥＨＶＤＱＤの アナログであることが更に好ましく、そしてそのペプチド疑似物が４量体ペプチ ドＨＶＤＱもしくはＥＨＶＤのアナログであることが更に一層好ましい。そのよ うな残基の非ハイブリダイズ性ペプチドアナログを、例えば、ベンゾジアゼピン 、アゼピン、置換化ガンマーラクタム環、ケト−メチレンシュードペプチド、β −ターンペプチドコア、もしくはβ−アミノアルコールを用いて作製することが できる。 本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な記述から、および請求の範囲か ら明らかになるであろう。本発明の実施は他に記載がない限り、細胞生物学、細 胞培養法、分子生物学、形質転換生物学法、微生物額、組換えＤＮＡ、および免 疫学の通常の技術（これらは当業者の技術範囲内に含まれる）を利用するであろ う。このような技術は刊行物に全般的に説明されている。例えば、Ｍｏｌｅｃｕ ｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、２ｎｄ Ｅｄ．、ｅｄ ｂｙ Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｆｒｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｍａｎｉａ ｔｉｓ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒ ｅｓｓ：１９８９）；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ ａｎｄ ＩＩ（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ ｅｄ．、１９８５）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔ ｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ ｅｄ．、１９８４）；Ｍｕｌ ｌｉｓ ｅｔ ａｌ． 米国特許第４，６８３，１９５号；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａ ｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｊ．Ｈｉ ｇｇｉｎｓ ｅｄｓ．１９８４）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｒ ａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｄ ｓ． １９８４） ；Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅ ｙ、Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．、１９８７）：Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ Ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、 １９８６）； Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ、Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕ ｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ （１９８４）；ｔｈｅ ｔｒｅａｔｉｓｅ，Ｍｅｔｈ ｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ ．、Ｎ．Ｙ）；Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｆｏｒ Ｍａｍ ｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｈ．Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏ ｓ ｅｄｓ．、１９８７、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒ ａｔｏｒｙ）；Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌｓ． １ ５４ ａｎｄ １５５（Ｗｕ ｅｔ ａｌ． ｅｄｓ．）、Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅ ｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｃｓｌｌ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （Ｍａｙｅｒ ａｎｄ Ｗａｌｋｅｒ，ｅｄｓ．、Ａｃａｄｅ ｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｌｏｎｄｏｎ、１９８７）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ Ｏｆ Ｅ ｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌｕｍｅ Ｉ−ＩＶ（Ｄ ．Ｍ．Ｗｅｉｒ ａｎｄ Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ、ｅｄｓ．、１９８６） ；Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ、（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８６）、を参照されたい。 図面の説明 図１Ａ−１Ｂはｐ１６ ｃＤＮＡの概略図であり、エキソン境界およ び本発明に用いられるＰＣＲプライマーの位置を示す。 図２Ａおよび２Ｂはエキソン１のためのゲノム核酸配列およびエキソン１を直 接フランクする非コーディング配列である。この配列は数々のプライマーからの 複合配列である。図２Ｃはエキソン２のためのゲノム配列である。 図３Ａ〜３Ｄはエキソン３のためのゲノム核酸配列およびエキソン３を直接フ ランクする非コーディング配列である。この配列は数々のプライマーからの複合 配列である。 図４は正常ヒト対照および他のヒト腫瘍と比較した際の、数々のヒト腫瘍細胞 のゲノムからのｐ１６の喪失を説明する。 図５はマウスｐ１６遺伝子についての制限マップを説明する。 図６はＣＣＲ蛋白質 ｐ１６、ｐ１５、およびｐ１３．５の高度に保存される 部分の配列アラインメントである。 図７はサイクリン依存性キナーゼの部分の配列アラインメントである。 発明の詳細な記述 細胞周期を通る進行状況は、正確な細胞複製に必要な個別の役割を分離させる 一連の不可逆的移行により特徴付けられる。これらの移行は、特別な条件が満た されるまではその細胞周期を拘束するシグナルにより負の方向に調節されている 。有糸分裂への移入は例えば、不完全に複製されたＤＮＡもしくはＤＮＡ損傷に より阻害される。細胞周期の進行におけるこれらの抑制は、細胞分裂中の遺伝子 情報の精度を保存するには不可欠である。一方でＧ₁〜Ｓ期への移行は環境的な 合図により細胞増殖を調節し、その後には細胞周期の進行についてのチェックが 細胞を自律的にさせることになる。中でもＧ₁中に細胞周期の進行を制約するシ グナルは、細胞増殖を阻害する細胞外蛋白質、成長因子もしくはアミノ酸枯渇、 および細胞−細胞接触である。これらのシグナル伝達経路の破壊により環境的制 御からの細胞性応答の脱共役が生じ、そしてこのことにより非抑制化細胞増殖が もたらされることがある。 一般的に真核生物細胞は、Ｇ₁を通る進行およびＳ期への移入のためにはサイ クリン依存性キナーゼ（ＣＤＳ）（複数）を必要とする。例えば哺乳類細胞では 、Ｄ−およびＥ−タイプの両方のサイクリンがＧ₁からＳへの移行のための律速 段階となっており、そしてその両者共が、除去はしないもののマイトジェン成長 因子についての細胞要求性を減少させる。しかしながら本発明の以前には、これ らのサイクリンおよびＣＤＫ（複数）が細胞増殖を阻害する細胞内もしくは細胞 外シグナルのいずれかにより負の調節を受けることによる様式に関する情報は殆 ど存在していなかった。 本発明は、典型的には有糸分裂を通して細胞の増殖を制限するように機能し、 かつ減数分裂を通る進行過程を制御する際に関与するらしい関連性細胞周期調節 蛋白質のファミリー（本明細書では今後「ＣＣＲ蛋白質」として引用される）の 発見に関する。このファミリーのメンバーは、「ｐ１６」（「ｐ１６^INK4a」と も称される）と表示される配列番号２に表される約１６ｋｄの蛋白質に進化的に は関与する。このファミリーは例えば、１５ｋｄのおおよその分子量を有するポ リペプチド（「ｐ１５」と称される）、および１３．５ｋｄのポリペプチド（「 ｐ１３．５」と称される）を含む。ヒトｐ１６、ヒトｐ１５、マウスｐ１３．５ 、およびマウスｐ１５のコーディング配列のためのヌクレオチド配列が、配列番 号１、３、５、および７に各々提供される。対応するアミノ酸配列 が、配列番号２、４、６、および８に各々表される。それに加え、ハイブリダイ ゼーションおよび免疫沈降実験からのデータにより、ＣＣＲ蛋白質ファミリーの 更に他のメンバーが存在することが示され、これらには進化的に互いに異なる配 列と特異的スプライシングを受けた変異体との両方を表す蛋白質が含まれる。 細胞周期調節の際のこのファミリーの蛋白質のメンバーの一つの機能は、細胞 周期の様々な段階中におけるサイクリン／ＣＤＫ複合体の活性を調節することで あり、これらには特にＧ₁期において活性を示すＣＤＫ（例えば、ＣＤＫ４もし くはＣＤＫ６）が含まれる。説明すると、ｐ１６とｐ１５との両方はこれ以降に 、サイクリン／ＣＤＫ複合体、特にＣＤＫ４もしくはＣＤＫ６を含むものの活性 に阻害的効果を示すことが示されている。例えば、各蛋白質はサイクリンＤ１／ ＣＤＫ複合体の活性をインビボで阻害することが可能である。一般的に知られる ようにサイクリンＤ１は多種多様の増殖性疾患に関連している。その結果本発明 は、サイクリンＤ１の腫瘍遺伝子発現によりもたらされる細胞増殖の有望なイン ヒビターを同定する。その上、ＣＣＲ蛋白質ファミリーの多様なメンバーは多様 なＣＤＫ同様、このファミリーの各メンバーの個別の役割を示唆しており、この ような役割とは組織タイプもしくは細胞タイプ特異的であるか、細胞周期の様々 な地点で生じるか、細胞外もしくは細胞内シグナル伝達経路の部分として生じる か、あるいはそれらの組み合わせ物であることがある。 以下の実施例に示されるように、所定のＣＣＲ蛋白質が腫瘍（例えば、肺、乳 、脳、骨、皮膚、前立腺、腎臓、卵巣、もしくはリンパ球に由来するもの）内で は高頻度での欠失もしくは突然変異を受けることが既に 示されている。その結果、従って本出願に記載されるように、遺伝子療法、ある いはＣＣＲ疑似物、あるいはＣＤＫ４もしくはＣＤＫ６活性の直接阻害によるＣ ＣＲ蛋白質機能の置換がそのような増殖性障害を治療するための有望な治療法と なる。その上、このデータにより、ｐ１５発現はトランスフォーミング成長因子 −ベータ（ＴＧＦ−β）での処理による調節を受けることが示され、このことに よりｐ１５が、ＣＤＫ４もしくはＣＤＫ６キナーゼの阻害を介してＴＧＦ−β媒 介性細胞周期拘束のエフェクターとして機能することがあることが示唆される。 ＴＧＦ−βに対する応答性の減少は多くの増殖性障害における成長制御の喪失に おける重要な現象であるかもしれないということを示す最近の所見を考慮すると 、ＣＣＲ疑似物もしくはＣＣＲ遺伝子療法によるか、あるいはキナーゼそれ自体 のインヒビターに基づくメカニズムによりＣＤＫ４／６活性を調節するための研 究方法が、そのような増殖性障害を治療するのには更に一層魅力的である。 従って本発明により、例えば細胞の腫瘍形成性形質転換、あるいは他の過形成 性もしくは新形成性形質転換過程から生じる増殖性障害、ならびに例えば組織の 変性（一例では、神経変性）のような分化的障害を検出および治療するための診 断および治療用アッセイ、ならびに試薬が使用可能となる。例えば本発明により 、改変化複合体形成、および／または改変化レベルのＣＣＲ蛋白質発現、および ／またはＣＣＲ遺伝子欠失もしくは突然変異を形質転換化細胞を同定する目的で 検出するための試薬（例えば、抗体および核酸プローブ）が利用可能となる。そ の上本発明は、多種多様の病理学的細胞増殖症状を治療する方法を提供し、その 方法は例えば、表題ＣＣＲ蛋白質をコードする組換え遺伝子構築物を利 用する遺伝子療法によるか、あるいは異常増殖性細胞の阻害である一般的な手法 によりＣＣＲ疑似物を提供することによる。 表題蛋白質を、ＣＤＫ（例えば、ＣＤＫ４もしくはＣＤＫ６）に結合するＣＣ Ｄ蛋白質の能力を減少させ、そしてそのことによりサイクリン／ＣＤＫ複合体の 阻害を解除するか、あるい別法ではＣＤＫ活性化のＣＣＲ媒介性阻害を作動させ るかもしくは擬態するかのいずれかである作用物質を同定するためのアッセイ系 内で用いることもできる。後者の場合、例えばＣＣＲ疑似物の場合では、サイク リン／ＣＤＫ複合体（例えばサイクリンＤ／ＣＤＫ４）の阻害的活性化の結果は 、細胞周期を通って細胞が進歩しなくなることであり、この阻害により究極的に は細胞死がもたらされ得る。一方でＣＤＫ／サイクリン複合体の再活性化は、形 質転換化細胞内で生じる細胞性現象を破壊するか、もしくはそうでなくともそれ らの現象を非平衡化させ得る。このような作用物質は、例えば腫瘍ウイルスによ り形質転換させた細胞におけるＣＤＫ複合体を治療的に活性化させるための使用 用のものであり得る。そのような細胞の処理により、あるチェックポイント（例 えば、網膜芽細胞腫（ＲＢ）チェックポイント）を通過する時期尚早の進行が生 じ、そして有糸分裂破局（細胞死）もしくはアポトーシスの誘導がもたらされ得 る。 本明細書で用いられる場合には用語「核酸」は、例えばデオキシリボ核酸（Ｄ ＮＡ）のようなポリヌクレオチド、および適切な場合にはリボ核酸（ＲＮＡ）を 意味する。この用語は、ヌクレオチドアナログ、ならびに記載される態様に適用 可能である場合には一本（センスもしくはアンチセンス）および二本鎖のポリペ プチドでできたＲＮＡもしくはＤＮＡのいずれかのアナログを等価物として含む ことも理解されるべきであ る。 本明細書で用いられる場合には用語「遺伝子」、「組換え遺伝子」、および「 遺伝子構築物」は、本発明の細胞周期調節蛋白質をコードする読み取り枠を含む 核酸を意味し、その核酸はエキソンおよび（場合によっては）イントロン配列の 両方を含む。好ましい態様では、核酸はＤＮＡもしくはＲＮＡである。例示的組 換え遺伝子は、配列番号２に表されるｐ１６蛋白質、配列番号４および８に表さ れるｐ１５蛋白質、あるいは配列番号６に表されるｐ１３．５蛋白質の全部もし くはＣＤＫ結合性部分コードする核酸を含む。用語「イントロン」は蛋白質には 翻訳されず、かつ一般的にはエキソン間に見いだされる所定のＣＣＲ遺伝子内に 存在するＤＮＡ配列を意味する。 「相同性」は、２本のペプチド間もしくは２つの核酸分子の間で類似する配列 を意味する。相同性は、比較の目的で整列させられることがある各配列の位置を 比較することにより決定することができる。比較されている配列中のある位置が 同一の塩基もしくはアミノ酸で占められる場合には、それらの分子はその位置に おいては相同となる。配列間の相同性の程度は、それらの配列により共有される 適合するすなわち相同な位置の数の関数となる。 用語「トランスフェクション」は、核酸（例えば、発現ベクター）のレシピエ ント細胞内への、核酸媒介性遺伝子移送による組込みを意味する。本明細書に用 いられる際には「形質転換」は、細胞の遺伝子型が外因性ＤＮＡもしくはＲＮＡ の細胞性取り込みの結果として変化を受ける過程を意味し、そして例えば形質転 換化細胞は表題細胞周期調節蛋白質（例えば、ｐ１６、ｐ１５、もしくはＰ１３ ．５）の内の一つの組換え 形態を発現する。 「細胞」もしくは「細胞培養物」、あるいは「組換え宿主細胞」もしくは「宿 主細胞」は、文脈から明確になるであろうように互換的に用いられることがしば しばである。これらの用語は本発明の細胞周期調節蛋白質を発現する直接の表題 細胞、および当然のことながらその子孫をも含む。全ての子孫がその親細胞と厳 密に同一であるわけではなく、それは突然変異もしくは環境の違いを受ける機会 に起因する。しかしながらこのような改変化子孫は、その子孫がもともとの形質 転換化細胞に付与されたものに関連する特徴を保持する限りはそれらの意味内に 含まれる。この事例の場合には、そのような特徴は組換えＣＣＲ蛋白質を産生す る能力であろう。 本明細書で使用される際には用語「ベクター」は、、既に連結されている他の 核酸を輸送することが可能な核酸分子を意味する。用語「発現ベクター」は、そ のベクターにより保持される各組換え遺伝子によりコードされる表題ＣＣＲ蛋白 質を合成することが可能なプラスミド、コスミド、もしくはファージを含む。好 ましいベクターは、連結される核酸の自律的複製および／または発現が可能であ るものである。本明細書では「プラスミド」および「ベクター」は互換的に用い られるが、それはプラスミドが最も一般的に用いられるベクターの形態であるた めである。それに加え本発明は、等価機能を作用させ、かつ本明細書の精読の後 には当該技術分野に知られるようになる他の形態の発現ベクターを含むことが意 図される。 「転写調節配列」は、例えば、開始シグナル、エンハンサー、およびプロモー ター、ならびにポリアデニル化部位のようなＤＮＡ配列（この 配列は、操作可能に連結される蛋白質コーディング配列の転写を誘導もしくは制 御する）を意味するために本明細書を通して用いられる遺伝子用語である。好ま しい態様では組換えＣＣＲ遺伝子の転写は、発現が意図される細胞タイプの組換 え遺伝子の発現を制御するプロモーター配列（もしくは他の転写調節配列）の制 御下に置かれる。組換え遺伝子は、天然に存在する形態の調節蛋白質の転写を制 御する配列と同一もしくは異なる転写調節配列の制御下に存在し得ることも理解 されるであろう。 用語「組織特異的プロモーター」は、プロモーターとして作用する、すなわち そのプロモーターに操作可能に連結される選択されたＤＮＡ配列の発現を制御し 、かつ例えばニューロン系列の細胞（例えば神経膠細胞）あるいは別法では上皮 細胞（例えばメラニン形成細胞）のような組織の特異的細胞内で選択されたＤＮ Ａ配列の発現を実施するＤＮＡ配列を意味する。説明的態様では、神経膠細胞特 異的プロモーターを利用する遺伝子構築物を遺伝子療法の一部分として用いて、 神経膠腫細胞内での表題ＣＣＲ蛋白質の内の一つの組換え形態の発現を生じさせ ることができ、この場合その遺伝子構築物の特徴は神経膠細胞内のみにおいて表 題蛋白質の発現を指令するための組織特異的プロモーターとなる。この用語は更 に、選択されたＤＮＡの発現をもともとは、ある組織内で調節するが、他の組織 での発現も生じるいわゆる「リーキー」プロモーターをも含む。 本明細書で用いられる際には「形質転換動物」はいずれかの動物、好ましくは ヒトの介入（例えば、当該技術分野で熟知される形質転換技術）により組込まれ る異種核酸をその動物の一つもしくは複数の細胞が含む非ヒト動物である。核酸 は細胞に、直接的もしくは間接的に、細胞の前 駆体内への組込みによるか、意図的遺伝子操作（例えば、マイクロインジェクシ ョン）によるか、あるいは組換えウイルスでの感染により組み込まれる。用語「 遺伝子操作」は古典的雑種形成もしくはインビトロ受精は含まず、むしろ組換え ＤＮＡ分子の組込みが意図される。この分子は染色体内に組込まれることがある か、もしくは染色体外複製性ＤＮＡであることがある。本明細書で記載される典 型的形質転換動物では、トランスジーンにより細胞が組換え形態の表題ＣＣＲ蛋 白質（例えば、アゴニスト形態もしくはアンタゴニスト形態のいずれか）を発現 するようになるか、あるいはその動物内では内因性ＣＣＲ遺伝子が既に破壊され ているかである。しかしながら組換えＣＣＲ遺伝子がサイレントである形質転換 動物もやはり企画されており、その例は以下に記載されるＦＬＰもしくはＣＲＥ レコンビナーゼ依存性構築物である。本発明の「非ヒト動物」には、例えば、齧 歯類、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、両生類、爬虫類などの脊椎動物が含 まれる。好ましい非ヒト動物は、ラットおよびマウスを含む齧歯類科から選択さ れ、そしてマウスが最も好ましい。用語「キメラ動物」は本明細書では、組換え 遺伝子が見いだされる動物、もしくは組換え体がその動物の全細胞ではなく一部 の細胞において発現される動物を意味するのに用いられる。用語「組織特異的キ メラ動物」は、組換えＣＣＲ遺伝子が一部の組織において存在および／または発 現されるかあるいは破壊されているが、他の組織ではそうではないことを意味す る。 本明細書に用いられる際には用語「形質導入」は、その形質導入動物もしくは 組込みが施される細胞に対して部分的もしくは完全に異種、すなわち外来性であ るか、あるいはその形質導入動物もしくは組込みが施 される細胞の内因性遺伝子に対して相同であるが、挿入が施される細胞のゲノム を変化させるようにその動物のゲノム内に挿入されるように設計されるかもしく は挿入される（例えば、天然の遺伝子のものとは異なる位置に挿入が施されるか 、あるいはその挿入によりノックアウトがもたらされる）核酸配列（例えば、Ｃ ＣＲポリペプチドをコードするもの）を意味する。形質導入遺伝子は、選択され た核酸の至適発現に必要であることがある一つもしくは複数の転写調節配列およ びいずれかの他の核酸（例えばイントロン）を含むことができる。 本明細書に用いられる際には用語「トランスフォーミンング成長因子−ベータ 」および「ＴＧＦ−β」は、脊椎動物中に偏在的に見いだされる構造的に関連す るパラクリン性ポリペプチドのファミリー、かつ後生動物の成長、分化、および 形態形成因子の巨大ファミリーの原型である（例えば総説については、Ｍａｓｓ ａｑｕｅ ｅｔ ａｌ．（１９９０） Ａｎｎ Ｒｅｖ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ６：５９７−６４１；およびＳｐｏｒｎ ｅｔ ａｌ．（１９９２） Ｊ．Ｃｅ ｌｌ Ｂｉｏｌ． １１９：１０１７−１０２１、を参照されたい）。 用語「進化的に関連する」は、ＣＣＲ蛋白質をコードする核酸配列に関しては 、ある生物体内で既に天然に生じている核酸配列を意味し、それには天然に存在 する突然変異体も含まれる。一般的にはｐ１６蛋白質に進化的に関連する蛋白質 をコードする遺伝子は、アンキリン様反復構造の一般的特徴、およびサイクリン 依存性キナーゼに結合する能力により認識することができる。それに加え、用語 「進化的に関連する」は更に、天然に存在するＣＣＲ蛋白質に由来すると同時に 突然変異誘発（例えば、以下に記載される組み合わせ突然変異誘発技術）により 既に改変 を受けていながらも、依然としてＣＣＲ蛋白質の内の少なくとも一つの活性を有 するポリペプチドをコードする核酸配列をも意味する。例えば、ｐ１６の配列を 、ｐ１５および／またはｐ１３．５配列とのアラインメントにより取得されるア ミノ酸置換に基づく突然変異誘発により変化させることができる。 本発明の一つの態様は、ＣＣＲ蛋白質をコードするヌクレオチド配列を含む単 離された核酸、ＣＣＲ蛋白質の少なくとも一つの生物学的活性を有するポリペプ チドをコードするそれらの断片、および／またはそのような核酸の等価物に関す る。本明細書に用いられる際には用語「核酸」は、そのような断片および等価物 を含むことが意図される。用語「等価物」は、機能的に等価なＣＣＲ蛋白質、も しくは例えば本明細書に記載されるようなＣＣＲ蛋白質の一つの活性を有する機 能的等価ペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むことが理解される。等価 ヌクレオチド配列は、一つもしくは複数のヌクレオチド置換、添加、もしくは欠 失により異なる配列（例えば、対立遺伝子変異体）を含むであろうし；かつ配列 番号２により表される表題ｐ１６蛋白質、もしくは配列番号４および８により表 されるｐ１５蛋白質、もしくは配列番号６により表されるｐ１３．５蛋白質をコ ードするヌクレオチド配列とは、遺伝子コードの縮重により異なる配列を含むこ ともあろう。等価物は更に緊縮条件下（すなわち、約１Ｍの塩中に形成されるＤ ＮＡ二重らせんの融点（Ｔ_m）以下の約２０〜２７℃に等価である）で、配列番 号１、３、５、もしくは７に示されるＣＣＲ遺伝子のヌクレオチド配列にハイブ リダイズするヌクレオチド配列をも含むであろう。ある態様では等価物は更に、 配列番号１、３、５、もしくは７の内の一つに示されるヌクレオチド配列か ら取得され、かつそれらに進化的に関連する核酸配列を含むであろう。 本明細書に記載される際には用語「単離された」は、例えばＤＮＡもしくはＲ ＮＡのような核酸に関しては、各々がその巨大分子の天然の源中に存在する他の ＤＮＡ（複数）もしくはＲＮＡ（複数）から分離される分子を意味する。例えば 、表題ＣＣＲ蛋白質の内の一つをコードする単離された核酸は、ゲノムＤＮＡ中 でそのＣＣＲ遺伝子を天然の状態で直にフランクする１０キロベース（ｋｂ）を 上回る核酸配列を含むことが好ましく、その核酸はより好ましくはそれが５ｋｂ を上回ることがないそのような天然に存在するフランク配列、および最も好まし くは１．５ｋｂを下回るそのような天然に存在するフランク配列である。用語「 単離された」は本明細書に用いられる際には更に、組換えＤＮＡ技術により産生 される場合には細胞性物質もしくは培養培地を、あるいは化学的に合成される際 には化学的前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まない核酸もしくはペプチ ドをも意味する。それに加え「単離された核酸」は、断片としては天然には存在 せず、かつ天然の状態では見いだされることがないであろう核酸断片を含むこと が意味される。 細胞周期調節蛋白質の活性を有するとして本明細書に引用されるポリペプチド は、配列番号２に示されるｐ１６蛋白質の全部もしくは一部のアミノ酸配列と相 同であり、かつそれに対応するアミノ酸配列を有することが好ましい。例示的蛋 白質には、配列番号４もしくは８のいずれかに示されるｐ１５蛋白質、あるいは 配列番号６に示されるｐ１３．５蛋白質、あるいはそれらの蛋白質の内の一つの 異性体（これには特異的スプライシング変異体が含まれる）が含まれる。好まし い態様では、ＣＣＲ蛋白質の生物学的活性は一つもしくは複数の以下の能力を含 む：（ｉ） 真核生物の細胞周期、例えば哺乳類の細胞周期、例えばヒトの細胞周期を調節す る能力；（ｉｉ）真核生物細胞、例えば哺乳類細胞、例えばヒト細胞の増殖／細 胞成長を阻害する能力；（ｉｉｉ）真核生物細胞のＧ１期からＳ期への進行を阻 害する、例えば哺乳類細胞のＧ１期からＳ期への進行を阻害する、例えばヒト細 胞のＧ１期からＳ期への進行を阻害する能力、および／または（ｉｖ）サイクリ ン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）、例えばＧ１期で活性なＣＤＫ、例えばＣＤＫ４、 例えばＣＤＫ６のキナーゼ活性を阻害する能力；例えばサイクリン依存性キナー ゼによる網膜芽細胞腫（ＲＢ）もしくは網膜芽細胞腫様蛋白質のリン酸化を阻害 する能力。それに加え、本発明のＣＣＲ蛋白質は更に、以下の能力を含む生物学 的活性を有することがあり、それらは：例えば損なわれていないＲＢ蛋白質を有 する腫瘍中での腫瘍成長を抑制する能力；例えば細胞成長および／または分化の パラクリン性もしくはオートクリン性調節の際に機能する細胞外因子およびサイ トカインに応答して細胞周期の進行を調節する、例えばトランスフォーミング成 長因子−β（ＴＧＦ−β）、あるいは関連する成長、分化、もしくは形態形成因 子に応答してＣＤＫ活性化を阻害する能力、である。これに関しては本発明のＣ ＣＲ−蛋白質は更に、細胞／組織の脱分化を阻止するように機能することもある 。表題ＣＣＲ蛋白質の他の生物学的活性は本明細書に記載されるか、あるいは本 開示を参照にすれば当業者には当然明白になるであろう。 それに加え、所定の条件下では、特別なＣＣＲ蛋白質の天然に存在する形態の 相同物（これは、その蛋白質の生物学的活性の内のただ一つのサブセットのアゴ ニストもしくはアンタゴニストのいずれかである）を提供することが有利であろ うことが一般的には認識されるであろう。従っ て特異的生物学的効果を、限定された機能の相同物での処理により、その蛋白質 の全生物学的活性に向けられるアゴニストもしくはアンタゴニストでの処理と比 較してより少ない副作用を伴いながら誘導することができる。例えば、ＣＤＫ４ に結合し、かつその活性化を阻害しながらも、実質的にはＣＤＫ６の活性化を妨 害することがないｐ１６相同物を作製することができる。 ある態様では本発明の核酸は、ｐ１６蛋白質のアゴニストもしくはアンタゴニ ストであるペプチドをコードし、かつ配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む 。好ましい核酸は、ｐ１６蛋白質活性を有し、かつ配列２に示されるアミノ酸配 列と少なくとも６０％相同、より好ましくは７０％相同、そして最も好ましくは ８０％相同なペプチドをコードする。ｐ１６蛋白質の活性を有し、かつ配列番号 ２に示される配列との少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９５％ 、そして最も好ましくは少なくとも約９８〜９９％の相同性を有するペプチドを コードする核酸も本発明の範囲内に含まれる。 他の態様では本発明の核酸は、ｐ１５蛋白質のアゴニストもしくはアンタゴニ ストであり、かつ配列番号４に示されるアミノ酸配列を含むペプチドをコードす る。好ましい核酸は、ｐ１５蛋白質活性を有し、かつ配列番号４および８の内の 一つもしくは両方に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％相同、より好まし くは７０％相同、そして最も好ましくは８０％相同であるペプチドをコードする 。ｐ１５蛋白質の活性を有し、かつ配列番号４もしくは８に示される配列との少 なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９５％、および最も好ましくは 少なくとも約９８〜９９％の相同性を有するペプチドをコードする核酸も本発明 の 範囲内に含まれる。代表的な態様では核酸は、配列番号３もしくは７に示される ｐ１５蛋白質をコードする核酸配列の少なくとも一部分を含むｃＤＮＡ分子であ る。配列番号３もしくは７に示されるｃＤＮＡ分子の好ましい部分は、その分子 のコーディング領域を含む。 更に他の態様では本発明の核酸は、ｐ１３．５蛋白質の活性を有し、かつ配列 番号６に示されるアミノ酸配列を含むペプチドをコードする。好ましい核酸はｐ １３．５蛋白質活性を有し、かつ配列番号６に示されるアミノ酸配列と少なくと も６０％相同、より好ましくは７０％相同、および最も好ましくは８０％相同で あるペプチドをコードする。ｐ１３．５蛋白質の活性（例えば、ＣＤＫに結合す る能力）を有し、かつ配列番号６に示される配列との少なくとも約９０％、より 好ましくは少なくとも約９５％、そして最も好ましくは少なくとも約９８〜９９ ％の相同性を有するペプチドをコードする核酸も本発明の範囲内に含まれる。核 酸が配列番号５に示されるｐ１３．５蛋白質をコードするヌクレオチド配列の少 なくとも一部分を含むｃＤＮＡ分子であることが好ましい。配列番号５に示され るｃＤＮＡ分子の好ましい部分には、その分子のコーディング領域が含まれる。 本発明の他の態様は、高緊縮性もしくは低緊縮性条件下で、配列番号２、４、 ６、もしくは８の内の一つに示されるアミノ酸配列の全部もしくは一部分を有す るＣＣＲポリペプチドをコードする核酸にハイブリダイズする核酸を提供する。 ＤＮＡハイブリダイゼーションを亢進させる適切な緊縮条件（例えば、６．０× 塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）、約４５℃下、およびその後の ２．０×ＳＳＣの５０℃での洗浄）は当業者に知られているか、もしくはＣｕｒ ｒｅｎｔ Ｐｒｏ ｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌ ｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｎ．Ｙ．（１９８９）、６．３．１−６．３．６、に見い だすことができる。例えば洗浄段階の塩濃度を、約２．０×ＳＳＣ、５０℃の低 緊縮性から約０．２×ＳＳＣ、５０℃の高緊縮性までより選択することができる 。それに加え洗浄段階の温度を室温（約２２℃）の低緊縮性条件から約６５℃の 高緊縮性条件までに増加させることができる。 遺伝子コードの縮重により、配列番号１、３、５、もしくは７の内の一つに示 されるヌクレオチド配列とは異なる単離された核酸も本発明に含まれる。例えば 多数のアミノ酸が一つを上回るトリプレットにより表示される。同一アミノ酸を 特定するコドンすなわち同義コドン（例えば、ＣＡＵおよびＣＡＣはヒスチジン に対する同義コドンである）により、その蛋白質のアミノ酸配列には影響を及ぼ すことがない「サイレント」突然変異体をもたらすことがある。しかしながら、 表題ＣＣＲ蛋白質のアミノ酸配列の変化をもたらすＤＮＡ配列多形性が真核生物 細胞中に存在するであろうことが予測される。当業者は、天然の対立遺伝子変異 体に起因して、所定の種の個体中にはＣＣＲ蛋白質ファミリーの内の特別なメン バーをコードする核酸の一つもしくは複数のヌクレオチドにこれらの変異（その ヌクレオチドの内最高約３〜４％）が存在することがあることを認識するであろ う。いずれかおよび全てのそのようなヌクレオチド変異体および得られるアミノ 酸多形性は本発明の範囲内に含まれる。 表題ＣＣＲ蛋白質の生物学的活性部分をコードする核酸の断片も本発明の範囲 内に含まれる。本明細書内で用いられる場合には「ＣＣＲ蛋白質の活性部分をコ ードする核酸の断片」は、例えば配列番号２、４、６、 もしくは８に示されるＣＣＲ蛋白質の全長アミノ酸配列をコードするヌクレオチ ド配列よりも少ないヌクレオチドを有するヌクレオチド配列を意味し、かつその 断片は本明細書に特定される全長蛋白質の生物学的活性の内の少なくとも一部分 を保持するペプチド（すなわち、ＣＤＫに結合することが可能なペプチド）をコ ードするか、あるいは別法ではその断片は全長蛋白質の生物学的活性のアンタゴ ニストとして機能する。本発明の範囲内に含まれる核酸断片には、高緊縮性もし くは低緊縮性条件下で他の種からの核酸とハイブリダイズすることが可能なもの が含まれ、それは例えば表題ＣＣＲ蛋白質の相同物を検出するためのスクリーニ ングプロトコールでの使用のためのものである。本発明の範囲内に含まれる核酸 は更に、リンカー配列、改変化制限エンドヌクレアーゼ部位、およびそのような 組換えペプチドの分子クローニング、発現、もしくは精製に有用な他の配列も含 むことがある。 以下に記載される実施例により示されるように、ＣＣＲ蛋白質の活性を有する ペプチドをコードする核酸は、本明細書に記載されるプロトコールならびに当業 者に一般的に知られるプロトコールに従って多数の真核生物細胞の内のいずれか に存在するｍＲＮＡもしくはゲノムＤＮＡから取得されることがある。ＣＣＲ蛋 白質をコードするｃＤＮＡは例えば、ある細胞、例えば哺乳類細胞、例えばヒト の細胞からの総ｍＲＮＡを単離することにより取得することができる。その後に は二本鎖ｃＤＮＡをその総ＲＮＡから調製し、そしてその後にそれを多数の既知 の技術の内のいずれか一つを用いて適切なプラスミドもしくはバクテリオファー ジベクター内に挿入することができる。ＣＣＲ蛋白質をコードする遺伝子を更に 、本発明により提供されるヌクレオチド配列情報に従って、既に 確立されているポリメラーゼ連鎖反応技術を用いてクローン化することもできる 。別法では添付される実施例に記載される二重ハイブリッドアッセイを用いて他 のｐ１６相同物、例えばアンキリン様反復構造を有し、かつサイクリン依存性キ ナーゼ（例えば、ＣＤＫ６）に結合する相同物を同定することができる。 好ましい核酸は、配列番号１に示される配列に相同なｃＤＮＡである。他の好 ましい核酸は、配列番号３に示される配列を含むｃＤＮＡである。更に他の好ま しい核酸は、配列番号５に示される配列を含むｃＤＮＡである。 本発明の他の態様は、「アンチセンス」療法における単離された核酸の使用に 関する。本明細書に用いられる際には「アンチセンス」療法は、細胞性条件下で 、ＣＣＲ蛋白質をコードする細胞性ｍＲＮＡおよび／またはゲノムＤＮＡと特異 的にハイブリダイズし（例えば、結合し）、その結果その蛋白質の発現を阻害す る（これは例えば、転写および／または翻訳の阻害による）オリゴヌクレオチド プローブもしくはそれらの誘導体の投与もしくはインサイチュー産生を意味する 。この結合は通常の塩基対相補性によるか、あるいは例えばＤＮＡ二重らせんへ の結合の場合には、その二重ヘリックスの主溝内での特異的相互作用を介するこ とがある。一般的には「アンチセンス」療法は当該技術分野で一般的に利用され る技術の範囲を意味し、かつオリゴヌクレオチド配列への特異的結合を頼みとす るいずれかの療法を含む。 本発明のアンチセンス構築物は例えば、細胞内で転写される場合には、ＣＣＲ 蛋白質をコードする細胞性ｍＲＮＡの少なくとも独特な部分に相補的なＲＮＡを 産生する発現プラスミドとして輸送され得る。別法では このアンチセンス構築物はエックスビボで作製され、かつ細胞内に組込ませる際 にはその表題ＣＣＲ蛋白質の内の一つをコードするｍＲＮＡおよび／またはゲノ ム配列とハイブリダイズすることにより発現の阻害を生じるオリゴヌクレオチド プローブである。そのようなオリゴヌクレオチドプローブは、内因性ヌクレアー ゼ（例えば、エキソヌクレアーゼおよび／またはエンドヌクレアーゼ）に対する 耐性を示し、かつそのためインビボで安定である改変化オリゴヌクレオチドであ ることが好ましい。アンチセンスオリゴヌクレオチドとしての使用のための例示 的核酸分子は、ＤＮＡのホスホルアミダイト、ホスホルチオエート、およびメチ ルホスホネートアナログである（例えば、米国特許第５，１７６，９９６号；第 ５，２６４，５６４号；および第５，２５６，７７５号、を参照されたい）。追 加的にはアンチセンス療法に有用なオリゴマーを構築するための一般的研究法が 例えばｖａｎ ｄｅｒ ｋｒｏｌら（１９８８） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：９５８−９７６；およびＳｔｅｉｎら（１９８８） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅ ｓ． ４８：２６５９−２６６８、により総説として既にまとめられている。 従って本発明の改変化オリゴマーは、治療的、診断的、および研究的状況にお いて有用である。治療的適用法では、オリゴマーが一般的にはアンチセンス療法 に適する様式で利用される。このような療法のためには本発明のオリゴマーを、 全身的および局所的すなわち局在化投与を初めとする様々な投与様式用に製剤す ることができる。技術および製剤法は一般的には、Ｒｅｍｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ 、Ｍｅａｄｅ Ｐｕｂｌｉｓ ｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、において見いだすことができる。全身 性投与のた めには、筋肉内、静脈内、腹膜内、および皮下注入を初めとする注入が好ましく 、注入のために本発明のオリゴマーを液体溶液、好ましくは生理学的適合性緩衝 液、例えばハンクス（Ｈａｎｋ’ｓ）溶液もしくはリンゲル（Ｒｉｎｇｅｒ’ｓ ）溶液中で製剤することができる。それに加え、これらのオリゴマーを固形形態 で製剤し、かつ使用直前に再溶解もしくは懸濁させることがある。凍結乾燥形態 もこれに含まれる。 全身性投与は更に、経粘膜的もしくは経皮的手法によるものであり得るか、あ るいはその化合物を経口的に投与することができる。経粘膜的もしくは経皮的投 与のためには、浸透予定の関門に適切な浸透剤がその製剤内に用いられる。この ような浸透剤は当該技術分野において一般的に知られており、かつ例えば胆汁酸 塩およびフシジン酸誘導体の経粘膜投与を含む。それに加え、界面活性剤を用い て浸透を促進させることがある。経粘膜投与は鼻噴霧を通するかもしくは座薬を 用いるものであることがある。経口投与のためにはオリゴマーは、例えばカプセ ル剤、錠剤、および強壮剤のような通常の経口投与形態内中に製剤される。局所 投与のためには本発明のオリゴマーは、当該技術分野で一般的に知られる軟膏（ ｏｉｎｔｍｅｎｔ）、軟膏（ｓａｌｖｅ）、ゲル、もしくはクリームに調剤され る。 好ましいアンチセンスオリゴヌクレオチドはＣＣＲ遺伝子の全部もしくは独特 な断片を含む。例えばその断片は、長さ１０、２０、５０、７５、もしくは１０ ０のヌクレオチドであり得る。選択された配列の独特な特徴は他の全ての非ＣＣ Ｒ遺伝子に関与することがあり得、例えばそのアンチセンス配列が生理学的条件 下で数々のＣＣＲ遺伝子／メッセージにハイブリダイズするであろうし、あるい はその構築物を、例えば様 々なＣＣＲ遺伝子の中でさえも独特な配列を選択することによりＣＣＲ遺伝子の 内の唯一の、もしくはその遺伝子の独特なサブセットに独特な様式でハイブリダ イズするように選択することができる。 この療法における使用に加え本発明のオリゴマーを、特異的に結合する標的Ｄ ＮＡもしくはＲＮＡ配列の存在もしくは非存在を検出するための診断用試薬とし て用いることがある。このような診断用検査は以下にその詳細が記載される。 本発明は更に、表題細胞周期調節蛋白質をコードし、かつ少なくとも一つの調 節配列に操作可能に連結されるヌクレオチド配列を含む発現ベクターをも提供す る。「操作可能に連結される」は、そのヌクレオチド配列が、そのヌクレオチド 配列の発現を可能にさせる様式で調節配列に連結されることを意味することが意 図される。調節配列は当業者に認識されるものであり、かつＣＣＲ蛋白質の活性 を有するペプチドの発現を指令するように選択される。従って用語「調節配列」 は、プロモーター、エンハンサー、および他の発現制御因子を含む。例示的な調 節配列が、Ｇｏｅｄｄｅｌ；Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌ ｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５、Ａｃａｄｅｍ ｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ（１９９０）、に記載される。例 えば、あるＤＮＡ配列に操作可能に連結された際にはその配列の発現を制御する いずれかの多種多様の発現制御配列が、本発明のＣＣＲ蛋白質をコードするＤＮ Ａ配列を発現させるためのこれらのベクター内に用いられることがある。このよ うな有用な発現制御配列は例えば、ＳＶ４０の初期および後期プロモーター、ア デノウイルスもしくはサイトメガロウイルスの前初期プロモーター、ｌａｃ系、ｔｒｐ 系、 ＴＡＣもしくはＴＲＣ系、その発現がＴ７ ＲＮＡポリメラーゼにより指令され るＴ７プロモーター、ファージラムダーの主要オペレーターおよびプロモーター 領域、ｆｄコート蛋白質のための制御領域、３−ホスホグリセレートキナーゼお よび他の糖分解酵素のためのプロモーター、酸ホスファターゼのプロモーター（ 例えば、Ｐｈｏ５）、イーストのα−接合因子のプロモーター、バキュロウイル ス系のポリヘドリンプロモーター、および原核生物もしくは真核生物細胞の遺伝 子またはそれらのウイルスの発現を制御することが知られている他の配列、なら びに様々なそれらの組み合わせ物を含む。発現ベクターの設計は、形質転換予定 の宿主細胞の選択および／または発現が所望される蛋白質のタイプのような因子 に依存することがあることが理解されるはずである。それに加え、ベクターのコ ピー数、そのコピー数を制御する能力、およびベクターによりコードされるいず れかの他の蛋白質（例えば、抗生物質マーカー）の発現も考慮されるべきである 。 明らかになるであろうが、表題遺伝子構築物を用いて精製の目的で、例えば融 合蛋白質もしくはペプチドを初めとする蛋白質もしくはペプチドを産生するため に、培養物中で継代される細胞内での表題ＣＣＲ蛋白質の発現をもたらすことが できる。それに加え、表題ＣＣＲ蛋白質もしくはそのアゴニスト形態の培養化細 胞中での組換え発現が、インビトロでの細胞の脱分化を阻止するのに有用であり 得る。説明すると、インビトロニューロン培養系は、神経発達の研究および神経 栄養因子の同定のための基本的かつ不可欠な道具となろうことが既に判明してい る。ニューロン細胞が一旦最終分化を遂げると、それは典型的には他の最終分化 細胞タイプには変化しないであろう。しかしながらニューロン細胞はそ れにもかかわらず、容易にそれらの分化段階を喪失することができる。このこと は、それらを成体組織から培養物中で成長させる際、そしてそれらが再生中に再 生芽を形成する際に共通に観察される。 例えばｐ１６もしくはｐ１５の発現（もしくは過剰発現）を維持させることな どにより表題ＣＣＲ蛋白質の機能を作動させることにより、様々な分化段階にニ ューロン細胞を維持する目的での十分な制約的環境を確実に保証する手段が提供 され、そしてこの手段を例えば、栄養因子の比活性を検査するために設計される 細胞培養物に利用することができる。分化の維持に必要な他の組織培養系は当業 者には容易に明らかになるであろう。このことに関しては、ＣＤＫ４およびＣＤ Ｋ６のＣＣＲ阻害のアゴニストおよびアンタゴニストの各々をエックスビボ組織 産生に用いることができ、それは例えば移植術のための人工軟骨装置の作製を亢 進させるためのものである。 これとは逆に、野生型ＣＣＲ蛋白質の活性を拮抗させること、例えば拮抗性相 同物、アンチセンス構築物の発現、もしくはＣＣＲ蛋白質のＣＤＫとの結合を破 壊することが可能な作用物質での処理により、培養細胞が所定の分化経路をたど ることを阻止することができ、かつ重要なことに培養物中での細胞の形質転換を もたらすことができる。類似様式では以下に記載される負の優性ＣＤＫ４および ＣＤＫ６突然変異体を用いて細胞性形質転換をもたらすことができ、それはそれ らの各ＣＤＫ突然変異体がｐ１６阻害に対して非感受性であり、かつｐ１６の効 果的アンタゴニストであるためである。ＣＣＲアンタゴニストが細胞成長を亢進 させる能力は、ヒト細胞をインビトロで成長させることが明らかに困難であると いう所見を考慮すると特に有意となる。従ってこのような試薬 はそのため初期細胞培養物から細胞を形質転換させるのに有用であり、かつ所定 の事例ではそのような細胞を固定化させるのに有用である。 それに加え、表題遺伝子構築物を、ある細胞成長がＣＣＲ蛋白質の調節機能に もはや依存しないかどうかを決定するため（例えば、形質転換を生じた細胞の表 現型を決定する際）の診断用アッセイに利用することもできる。説明すると、組 織からの細胞試料を患者から取得し、そして適切な細胞培養培地内に分散させる ことができ、その試料中の細胞の一部分に例えばｐ１６、ｐ１５、もしくはｐ１ ３．５発現ベクターでのトランスフェクションにより組換えＣＣＲ蛋白質を発現 させ、そしてその後に細胞の成長を評定することができる。細胞がＣＣＲ蛋白質 の発現にもかかわらず増殖する能力は、ＣＣＲ蛋白質に関与する細胞調節経路（ 例えば、ＲＢ媒介性チェックポイント）への依存性の欠如を意味する。目的の組 織の性質に依存し、その試料は例えば、血液試料、剥脱化細胞試料、極細注射針 吸引試料、もしくは生検組織試料から単離された細胞形態をとることができる。 初期試料が固形塊である場合には、当該技術分野で知られる要領でその組織試料 を挽くか、もしくはそうでなくば破壊してその細胞を細胞を培養できるようにさ せる。このような知識により予知的および治療的利益の両方を兼ね合わせること ができる。 本発明は更に、ＣＣＲ蛋白質の活性を有するポリペプチドを発現させる目的で 組換えＣＣＲ遺伝子でトランスフェクトさせた宿主細胞にも関する。この宿主細 胞はいずれかの原核生物もしくは真核生物の細胞であることがある。例えば本発 明のＣＣＲ蛋白質を、一例では大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）のような細菌性細胞、 昆虫細胞（バキュロウイルス）、イースト、もしくは哺乳類細胞内で発現させる ことがある。他の適切な宿 主細胞が当業者に知られている。 本発明の他の態様は、真核生物生物体、例えば哺乳類、例えばヒトから取得さ れる遺伝子によりコードされ、かつＣＣＲ蛋白質の少なくとも一つの生物学的活 性を有する組換えＣＣＲ蛋白質、あるいは天然に存在するその突然変異体である 組換えＣＣＲ蛋白質に関する。用語「組換え蛋白質」は、組換えＤＮＡ技術によ り作製される本発明の蛋白質を意味し、この場合一般的にＣＣＲ蛋白質をコード するＤＮＡは適切な発現ベクター内に挿入され、そして次にはそのベクターを用 いて宿主細胞を形質転換させて異種蛋白質を産生させる。それに加え成句「〜に 由来する」は、組換えＣＣＲ蛋白質をコードする組換え遺伝子に関しては「組換 え蛋白質」の意味の内に、天然のＣＣＲ蛋白質のアミノ酸配列、あるいはある生 物体の天然に存在するＣＣＲ蛋白質の置換および欠失を含む突然変異により生じ るそれに類似するアミノ酸配列を有する蛋白質を含むことが意味される。説明す ると、天然のｐ１５もしくはｐ１３．５蛋白質に加え、本発明により好まれる組 換え蛋白質は、配列番号２、４、６、もしくは８に示されるアミノ酸配列と少な くとも６０％相同、より好ましくは７０％相同、そして最も好ましくは８０％相 同である組換え的に産生された蛋白質である。ＣＣＲ蛋白質の活性を有し（例え ば、ＣＤＫ結合性）、かつ配列番号２、４、６、もしくは８に示される配列と少 なくとも約９０％、より好ましくは約９５％、そして最も好ましくは約９８〜９ ９％の相同性を有するポリペプチドも本発明の範囲内に含まれる。他の好ましい 態様では組換えＣＣＲ蛋白質は、アンキリン様反復構造、およびサイクリン依存 性キナーゼ（例えば、ＣＤＫ４もしくはＣＤＫ６）に結合する能力を特徴とする ことができる。従って本発明は、ある生物 体に由来する遺伝子によりコードされ、かつ配列番号２、４、６、もしくは８の 内の一つにより表されるＣＣＲ蛋白質に進化的に関連するアミノ酸配列を有する 組換えＣＣＲ蛋白質に関し、この場合「〜に進化的に関連する」は、天然に生じ るアミノ酸配列を有するＣＣＲ蛋白質（例えば、対立遺伝子変異によるか、もし くは特異的スプライシングによる）、および例えば組み合わせ突然変異誘発によ り取得されるＣＣＲ蛋白質の突然変異的変異体を意味する。 本発明は更に、表題ＣＣＲ蛋白質を産生する方法に関する。例えば、表題ＣＣ Ｒ蛋白質の内の一つをコードする発現ベクターでトランスフェクトさせた宿主細 胞を、そのペプチドの発現が生じることを可能にさせる適切な条件下で培養する ことができる。このペプチドは、細胞およびそのペプチドを含む培地から分泌お よび単離されることがある。別法ではこのペプチドは細胞質内に保持され、かつ その細胞を回収し、溶解し、そしてその蛋白質を単離することがある。細胞培養 物は、宿主細胞、培地、および他の副産物を含む。細胞培養に適する培地は当該 技術分野において熟知されている。このペプチドは、細胞培養培地、宿主細胞、 もしくはその両者から、蛋白質を精製するための当該技術分野に知られる技術を 用いて単離することができ、その技術には、イオン交換クロマトグラフィー、ゲ ル濾過クロマトグラフィー、限外濾過、電気泳動、および表題ＣＣＲ蛋白質の特 別なエピトープに特異的な抗体での免疫親和性精製が含まれる。好ましい態様で はＣＣＲ蛋白質は、その精製を容易にさせるドメインを含む融合蛋白質（例えば 、ｐ１６−ＧＳＴ、ｐ１５−ＧＳＴ、もしくはｐ１３．５−ＧＳＴ融合蛋白質） である。 従って本発明のＣＣＲ蛋白質のクローニングから取得されるヌクレオ チド配列は、その蛋白質の全部もしくは選択された部分を含み、これを用いて微 生物的もしくは原核生物細胞的方法を介して、その蛋白質の組換え形態を産生さ せることができる。ある遺伝子構築物（例えば、発現ベクター）内へのポリヌク レオチド配列の連結、および真核生物（イースト、鳥類、昆虫、もしくは哺乳類 ）または原核生物（細菌性細胞）のいずれかである宿主内への形質転換もしくは トランスフェクトは、他の熟知される蛋白質（例えば、インスリン、インターフ ェロン、ヒト成長ホルモン、ＩＬ−１、およびＩＬ−２など）を産生する際に用 いられる標準方法である。類似方法もしくはその改変法を利用して、本発明に従 う微生物学的手法もしくは組織培養技術により組換えＣＣＲ蛋白質もしくはその 部分を調製することができる。 組換えＣＣＲ蛋白質は、クローン化遺伝子もしくはその一部分を、原核生物細 胞、真核生物細胞、もしくはその両方のいずれかにおける発現に適するベクター 内に連結させることにより産生することができる。組換えＣＣＲ蛋白質の産生用 の発現媒介体にはプラスミドおよび他のベクターが含まれる。例えば表題ペプチ ドの発現に適するベクターには、原核生物細胞（例えば、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌ ｉ ））内での発現のためのタイプのプラスミドが含まれ、それらは：ｐＢＲ３２ ２由来のプラスミド、ｐＥＭＢＬ由来のプラスミド、ｐＥＸ由来のプラスミド、 ｐＢＴａｃ由来のプラスミド、およびｐＵＣ由来のプラスミドである。 イースト内での組換え蛋白質の発現用には多数のベクターが存在する。例えば 、ＹＥＰ２４、ＹＩＰ５、ＹＥＰ５１、ＹＥＰ５２、ｐＹＥＳ２、およびＹＲＰ １７がクローニングされ、かつこのような発現媒介体は遺伝子構築物のＳ．ケレ ビシアエ（Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）内への 組込みに有用である（例えば、Ｂｒｏａｃｈ ｅｔ ａｌ．（１９８３）、Ｅｘ ｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒ ｅｓｓｉｏｎ内、ｅｄ． Ｍ．Ｉｎｏｕｙｅ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、 ｐ．８３、を参照されたい（これは引用により本明細書に取り込まれる））。こ れらのベクターは、ｐＢＲ３２２ ｏｒｉの存在に起因し大腸菌（Ｅ． ｃｏｌ ｉ ）内で、そしてイーストの２ミクロンプラスミドの複製決定基に起因してＳ． ケレビシアエ（Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）内で複製することができる。それ に加え、例えばアンピリシンのような薬剤耐性マーカーを用いることができる。 好ましい哺乳類発現ベクターは、細菌内でのベクターの継代を容易にさせるた めの原核生物性配列と、真核生物細胞内で発現される一つもしくは複数の真核生 物性転写単位との両方を含む。ｐｃＤＮＡＩ／ａｍｐ、ｐｃＤＮＡＩ／ｎｅｏ、 ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＳＶ２ｇｐｔ、ｐＳＶ２ｎｅｏ、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ、ｐＴ ｋ２、ｐＲＳＶｎｅｏ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＴ７、ｐｋｏ−ｎｅｏ、およびｐＨｙ ｇ由来のベクターは、真核生物細胞のトランスフェクションに適する哺乳類発現 ベクターの例である。これらのベクターの内の幾つかを細菌性プラスミドからの 配列（例えばｐＢＲ３２２）で改変させて、原核生物および真核生物の両細胞内 での複製および薬剤耐性選択を容易にさせる。別法では、ウイルスの誘導体（例 えば、ウシパピローマウイルス（ＢＰＶ−１）もしくはエプスタイン−バールウ イルス（ｐＨＥＢｏ、ｐＲＥＰ由来のもの、およびｐ２０５））を、真核生物細 胞内での蛋白質の一過性発現のために用いることができる。他のウイルス性（レ トロウイルスを含む）発現系の例は、遺伝子療法誘導系の記載において以下に見 いだすことができる。プラスミ ドの調製および宿主生物体の形質転換に利用される様々な方法は当該技術分野に おいて熟知されている。原核生物および真核生物の両細胞に適切な他の発現系、 ならびに一般的組換え方法については、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、２ｎｄ Ｅｄ．、Ｓａｍｂｒｏｏｋ 、Ｆｒｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓによる編集（Ｃｏｌｄ Ｓｏｒｉ ｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ：１９８９）、第１６ 章および１７章を参照されたい。幾つかの事例では、バキュロウイルス発現系の 使用により組換えＣＣＲ蛋白質を発現させることが所望されることがある。その ようなバキュロウイルス発現系の例には、ｐＶＬ由来のベクター（例えば、ｐＶ Ｌ１３９２、ｐＶＬ１３９３、およびｐＶＬ９４１）、ｐＡｃＵＷ由来のベクタ ー（例えば、ｐＡｃＵＷ１）、ならびにｐＢｌｕｅＢａｃ−由来のベクター（例 えば、β−ｇａｌ含有性ｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩ）が含まれる。 全長ＣＣＲ蛋白質のカルボキシ末端断片の発現が所望される場合には（すなわ ち、切断突然変異体）、開始コドン（ＡＴＧ）を、発現が予定される所望の配列 を含むオリゴヌクレオチド断片に添加する必要があることがある。Ｎ−末端位置 のメチオニンが酵素メチオニンアミノペプチダーゼ（ＭＡＰ）の使用により酵素 的に開裂され得ることは当該技術分野において熟知されている。ＭＡＰは、大腸 菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）（Ｂｅｎ−Ｂａｓｓａｔ ｅｔ ａｌ．（１９８７） Ｊ ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １６９：７５１−７５７）およびサルモネラ チフィ ムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）から既にクローン 化されており、そしてそのインビトロ活性が組換え蛋白質について既に 証明されている（Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８７） ＰＮＡＳ ８４： ２７１８−１７２２）。従って所望される場合には、Ｎ−末端メチオニンの除去 を、インビボではＭＡＰを産生する宿主内（例えば、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ） もしくはＣＮ８９もしくはＳ． ケレビシアエ（Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ） ）でそのような組換えポリペプチドを発現させることによるか、あるいはインビ トロでは精製化ＭＡＰの使用によるか（例えば、Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．の 方法）のいずれかにより達成することができる。 別法ではそのポリペプチドのコーディング配列を、異なるポリペプチドをコー ドするヌクレオチド配列を含む融合遺伝子の一部分として組込ませることができ る。この種の発現系は、表題ＣＣＲ蛋白質の内の一つの免疫学的断片を産生する ことが所望される条件下では有用であり得る。例えばレトロウイルスのＶＰ６カ プシド蛋白質を、単量体形態もしくはウイルス粒子の形態のいずれかで、ポリペ プチドの部分のための免疫学的担体蛋白質として用いることができる。抗体を作 製したＣＣＲ蛋白質の部分に相当する核酸配列を、後期ワクシニアウイルス構造 蛋白質のためのコーディング配列を含む融合遺伝子構築物内に組込ませて、ビリ オンの部分としてその蛋白質の一部分を含む融合蛋白質を発現する一連の組換え ウイルスを産生させることができる。Ｂ型肝炎の表面抗原も同様にこの役割に利 用することができる。同様に、ＣＣＲ蛋白質の一部分およびポリオウイルスカプ シド蛋白質を含む融合蛋白質をコードするキメラ構築物を作製して免疫原性を亢 進させることができる（例えば、欧州特許出願公開第０２５９１４９号；および Ｅｖａｎｓ ｅｔ ａｌ．（１９８９） Ｎａｔｕｒｅ ３３９：３８５；Ｈｕ ａｎｇ ｅｔ ａｌ． （１９８８） Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． ６２：３８５５；およびＳｃｈｌｉｅｎｇｅ ｒ ｅｔ ａｌ．（１９９２） Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：２、を参照されたい） 。 ＣＣＲ蛋白質の所望される部分がオリゴマー分岐性リシンコア上へのペプチド の有機化学合成法から直接取得される場合には、ペプチドに基づく免疫化のため の多重抗原ペプチド（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ）系 を利用することができる（例えば、Ｐｏｓｎｅｔｔ ｅｔ ａｌ．（１９８８） ＪＢＣ ２６３：１７１９およびＮａｒｄｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．（１９９２ ） Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４８：９１４、を参照されたい）。ＣＣＲ蛋白質 の抗原決定基も細菌性細胞により発現および呈示され得る。 免疫原性を亢進させるための融合蛋白質の利用に加えて、融合蛋白質もやはり 蛋白質の発現を亢進させ得ることが広く認識されている。例えば、本発明のＣＣ Ｒ蛋白質をグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合蛋白質として 作製することができる。このようなＧＳＴ融合蛋白質をＣＣＲ蛋白質の簡便な精 製のために用いることができ、それは例えばグルタチオン由来のマトリックスの 使用を介することなどによる（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、ｅｄｓ． Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（Ｎ．Ｙ．：Ｊｏｈｎ．Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、１９９１、を参照 されたい）。 他の態様では、例えば組換え蛋白質の所望される部分のＮ−末端にポリ−（Ｈ ｉｓ）／エンテロキナーゼ開裂部位配列のような精製用リーダー配列をコードす る融合蛋白質によりＮｉ²⁺金属樹脂を用いる親和性ク ロマトグラフィーによる発現化融合蛋白質の精製が可能となり得る。その後にこ の精製用リーダー配列をエンテロキナーゼでの処理により除去して、精製化ＣＣ Ｒ蛋白質を提供することができる（例えば、Ｈｏｃｈｕｌｉ ｅｔ ａｌ．（１ ９８７） Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ４１１：１７７；およびＪａｎ ｋｎｅｃｈｔ ｅｔ ａｌ． ＰＮＡＳ ８８：８９７２、を参照されたい）。 融合遺伝子を作製するための技術は熟知されている。本質的には、異なるポリ ペプチド配列をコードする様々なＤＮＡ断片の連結を通常の技術に従い、連結用 の平滑末端および食い違い末端、適切な末端を提供するための制限酵素消化、適 切な場合には付着性末端の充填、所望されない連結を回避するためのアルカリ性 ホスファターゼ処理、ならびに酵素的連結を利用して実施される。他の態様では 、その融合遺伝子を、自動化ＤＮＡ合成機を含む通常の技術により合成すること ができる。別法では遺伝子断片のＰＣＲ増幅をアンカープライマーを用いて実施 することができ、このことにより２本の連続的遺伝子断片の間に相補的オーバー ハングが生じ、これをその後にアニールさせてキメラ遺伝子配列を作製すること ができる（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕ ｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、ｅｄｓ． Ａｕｓｕｂｅｌ ｅt ａｌ． Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ：１９９２、を参照されたい）。 本発明は更に、単離された形態であるか、あるいはそうでなくば通常はＣＣＲ 蛋白と結合する他の細胞外蛋白質、特に細胞周期蛋白質（例えば、ＣＤＫ（複数 ）、サイクリン、ｐ２１、ｐ１９、もしくはＰＣＮＡ）を実質的に含まない表題 ＣＣＲ蛋白質の単離化および／または精製化形 態を取得可能にする。用語「他の細胞性蛋白質（本明細書内では「混入性蛋白質 」としても引用される）を実質的に含まない」は、例えば２０％（乾燥重量）を 下回る混入性蛋白質、そして好ましくは５％を下回る混入性蛋白質を含むｐ１６ 、ｐ１５、もしくはｐ１３．５調製物を包含するとして特定される。ＣＣＲ蛋白 質の機能形態は、本明細書に記載されるクローン化遺伝子を用いることによる精 製化調製物として初めて調製することができる。「精製化」によってはポリペプ チドについて言及する場合には、示される分子が他の生物学的巨大分子（例えば 、他の蛋白質（特に、例えばＣＤＫ４もしくはＣＤＫ６のような他の細胞周期蛋 白質、ならびに他の混入性蛋白質）が実質的非存在の状態で存在することが意味 される。本明細書で用いられる場合には用語「精製された」は、好ましくは少な くとも８０乾燥重量％、より好ましくは９５〜９９重量％の範囲内の、そして最 も好ましくは少なくとも９９．８重量％の同一タイプの生物学的巨大分子が存在 することを意味する（しかし、水、緩衝液、および他の小分子、特に５０００を 下回る分子量を有する分子は存在し得る）。用語「純粋な」は本明細書で用いら れる際には、直前の「精製された」と同様の数値的制限を有することが好ましい 。「単離された」および「精製された」は、それらの天然の状態での天然の物質 もしくは構成成分に既に分離されている（例えば、アクリルアミドゲル中で）が 、純粋な（例えば、混入性蛋白質、もしくは例えば変性剤およびポリマー（一例 ではアクリルアミドもしくはアガロース）を含まない）物質もしくは溶液として は取得されてはいない天然の物質のいずれをも含まない。 しかしながら、表題ポリペプチドは更に、様々な投与様式（これには、 全身的および局所的すなわち局在化投与が含まれる）に製剤するための薬剤学的 に許容される担体中で提供され得る。技術および製剤法は一般的には、Ｒｅｍｍ ｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ 、Ｍｅａｄ ｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｂｇ Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、中に見いだされる。 例示的態様では、このＣＣＲポリペプチドは経粘膜的もしくは経皮的輸送用に提 供される。このような投与のためには透過予定の関門に適切な浸透剤がＣＣＲポ リペプチドを含む製剤中に用いられる。このような浸透剤は当該技術分野におい て一般的に知られており、かつこれらには例えば経粘膜投与については胆汁酸塩 およびフシジン酸誘導体が含まれる。それに加えて洗剤を用いて浸透を亢進させ ることがある。経粘膜投与は鼻噴霧を通してか、あるいは座薬を用いてのもので あることがある。局所投与については、本発明のオリゴマーは当該技術分野に一 般的に知られる要領で、軟膏（ｏｉｎｔｍｅｎｔ）、軟膏（ｓａｌｖｅ）、ゲル 、もしくはクリーム状態に製剤される。 本発明の他の態様は、全長ＣＣＲ蛋白質に由来するペプチドに関する。表題Ｃ ＣＲ蛋白質の単離化ペプチジル部分は、そのようなペプチドをコードする核酸の 対応断片から組換え的に産生されるペブチドをスクリーニングすることにより取 得することができる。それに加え、断片を当該技術分野において知られる技術（ 例えば、通常のメリフィールド（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ）固相ｆ−Ｍｏｃもしく はｔ−Ｂｏｃ化学法）を用いて化学的に合成することができる。例えば本発明の ＣＣＲ蛋白質は、断片が重複を全く生じることのないように所望の長さの断片に 任意に分断される、もしくは好ましくは所望の長さの重複断片に分断されること が ある。これらの断片を産生（組換え的もしくは化学合成により）および検査して 、例えばマイクロインジェクションアッセイにより、例えばＣＤＫ４活性化のア ゴニストもしくはアンタゴニストのいずれかとして機能し得るペプチジル断片を 同定することができる。説明的態様では、表題ＣＣＲ蛋白質のペプチジル部分を ＣＤＫ結合性活性、ならびに例えば各々がＣＣＲ蛋白質の個別の断片を含むチオ レドキシン融合蛋白質としての発現による阻害能力について検査することができ る（例えば、米国特許第５，２７０，１８１号および第５，２９２，６４６号； ならびに国際公開第９４／０２５０２号を参照されたい）。 治療的もしくは予防的効果、または安定性（例えば、エックスビボでの貯蔵寿 命およびインビボでの蛋白質分解に対する耐性）を亢進させる目的で表題ＣＣＲ 蛋白質の構造を改変することも可能である。このような改変化ポリペプチドは、 天然に存在する形態の蛋白質の少なくとも一つの活性を保持するように設計され ている場合には、本明細書に一層詳しい詳細が記載される細胞周期調節蛋白質の 機能的等価物と見なされる。このような改変化ポリペプチドは、例えばアミノ酸 置換、欠失、もしくは添加により産生することができる。 それに加えて例えば、ロイシンのイソロイシンもしくはバリンでの、アスパラ ギン酸のグルタミン酸での、スレオニンのセリンでの、もしくはあるアミノ酸の 構造的に関連するアミノ酸での単離された置換（すなわち、保存的突然変異）は 、得られる分子の生物学的活性には主要な効果を持たないであろうことが予測さ れることが道理にかなっている。保存的置換は、それぞれの側鎖に関連するアミ ノ酸ファミリー内で生じるものである。遺伝子的にコードされるアミノ酸は以下 の４つのファミリ ーに分割することができ、それらは：（１）酸性＝アスパラギン酸、グルタミン 酸；（２）塩基性＝リシン、アルギニン、ヒスチジン；（３）非極性＝アラニン 、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン 、トリプトファン；および（４）非荷電極性＝グリシン、アスパラギン、グルタ ミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシン、である。フェニルアラニン 、トリプトファン、およびチロシンは時としては一緒に芳香族性アミノ酸として 分類されることがある。類似の様式でアミノ酸レパートリーを以下のように分類 することができ、それらは（１）酸性＝アスパラギン酸、グルタミン酸；（２） 塩基性＝リシン、アルギニン、ヒスチジン；（３）脂肪性＝グリシン、アラニン 、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン（この場合、セリンと スレオニンとは場合によっては脂肪性−ヒドロキシルとして個別に分類される） ；（４）芳香族性＝フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン；（５）アミ ド＝アスパラギン、グルタミン；ならびに（６）硫黄含有性＝システインおよび メチオニン、である（例えば、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２ｎｄ ｅｄ． Ｅ ｄ． ｂｙ Ｌ．Ｓｔｒｙｅｒ、ＷＨＦ ｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．：１９ ８１、を参照されたい）。ペプチドのアミノ酸配列の変化が機能的相同体をもた らすか否かは、野生型蛋白質に類似する様式での細胞内での応答を産生するその 変異体ペプチドの能力を評定することにより容易に決定することができる。例え ばｐ１６のそのような変異体形態を、ｐ１６欠陥細胞を補うそれらの能力につい て評定することができる。一つを上回る置換が生じているペプチドを、同様の様 式で容易に検査することができる。 本発明は更に、本ＣＣＲ蛋白質の組み合わせ突然変異体ならびに切断 突然変異体の各セットを作製する方法をも企画し、そして特にＣＤＫ、特にＣＤ Ｋ４もしくはＣＤＫ６に対する結合の際に機能を示す有望な変異体配列（例えば 、相同体）を同定するのに有効である。このような組み合わせライブラリーをス クリーニングする目的は、例えばアゴニストもしくはアンタゴニストのいずれか として作用することができるか、あるいは別法では新規の活性を一まとめに保持 する新規のｐ１６、ｐ１５、もしくはｐ１３．５相同体を作製することである。 説明すると、ｐ１６および／またはｐ１５相同体を本方法により工学的に作製し て、天然に存在する形態の蛋白質と比較するＣＤＫ４に対する一層効果的な結合 を提供すると同時にＣＤＫ６に対する結合親和性を依然として低下させておくこ とができる。このようにして、天然に存在するＣＣＲ蛋白質に関連する選択され た能力を有する組み合わせライブラリー由来の相同体を作製することができる。 組換えＤＮＡ構築物から発現される場合にはこのような蛋白質を遺伝子療法プロ トコールに用いることができる。 同様に、突然変異誘発により、対応する野生型蛋白質とは劇的に異なる細胞内 半減期を有するＣＣＲ相同体を取得することができる。例えば、改変化蛋白質を 、ＣＣＲ蛋白質の破壊か、あるいはそうでなくば不活化をもたらす蛋白質分解も しくは他の細胞性過程に対する安定性をより高くするかもしくはより低くするか のいずれかを行うことができる。このような相同体およびそれらをコードする遺 伝子を利用して、その蛋白質の半減期を調節することによりｐ１６、ｐ１５、も しくはｐ１３．５発現物のエンベロープを変化させることができる。例えば、短 い半減期により一層短い一過性の生物学的効果を取得することができ、そして誘 導性発現系の一部である際にはそのことにより細胞内での組換えＣＣＲ蛋 白質レベルのより強固な調節が可能となり得る。先に記載するように、そのよう な蛋白質、および特にそれらの組換え核酸構築物を遺伝子療法プロトコールに用 いることができる。 類似の様式で、ＣＣＲ相同物を本組み合わせ式研究方法により作製して、対応 する野生型蛋白質が細胞増殖を調節する能力を妨害することが可能であるという 意味でのアンタゴニストとして作用させることができる。 この方法の代表的態様では、ＣＣＲ蛋白質相同体の集団のためのアミノ酸配列 を、好ましくは可能な最高の相同性が亢進されるように整列させる。このような 変異体集団は例えば、一つもしくは複数の種からのｐ１６および／またはｐ１５ 相同体、あるいは同一種からではあるが突然変異により異なる相同体を含むこと ができる。整列させた配列の各位置に出現するアミノ酸が組み合わせ配列の縮重 セットを作製するために選択される。特別な変異体の整列配列からのアミノ酸の 存在もしくは非存在は対照配列（これは実際の配列もしくは人工配列であり得る ）の選択される共通の長さに関連する。配列のアラインメントにおいて最高の相 同性を保持させる目的でその対照配列と比較して変異体の配列中の欠失をアミノ 酸空白（＊）により表すことができる一方で、その対照配列と比較して変異体中 の挿入突然変異を無視し、かつ整列させた場合にはその変異体の配列外に外して おくことができる。 説明すると、ｐ１６、ｐ１５、およびｐ１３．５配列の調査の際に（図６を参 照せよ）、この３本のＣＣＲ蛋白質の内部断片は高度に保存されていることが特 筆された。これらのアラインメントに基づいて、組み合わせライブラリーをこの 部分から作製することができ、そのライブラリ ーのメンバーをＣＣＲ蛋白質の他の部分の非存在下でか、もしくはその蛋白質の 他の部分が静止状態（例えば、各々残基Ｍｅｔ−５２〜Ｇｌｙ−１３５、もしく はＭｅｔ−５４〜Ｇｌｙ１３７のみが組み合わせ突然変異誘発により変化してい るｐ１６もしくはｐ１５蛋白質）であるＣＣＲ蛋白質の一部分として発現させる ことができる。例えば、ＣＣＲ相同体のライブラリーを、縮重式： ［式中、各Ｘａａ（１）〜Ｘａａ（２４）は、配列番号２、４、６、もしくは８ での同一位置のアミノ酸残基の内の一つから選択される］ により表されるアミノ酸配列を有するようにヒトｐ１６およびｐ１５蛋白質の配 列に基づいて作製することができる。 組み合わせライブラリーの更なる伸長は、例えば一つもしくは複数の縮重位置 の保存的突然変異となるであろうアミノ酸を介入させることにより作製すること ができる。このような保存的突然変異の介入により先の式により表される有望な 細胞周期調節配列のライブラリーを取得することができるが、ただし式中、Ｘａ ａ（１）はＳｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、もしくはＧｌｎを表し；Ｘａａ（２）はＧ ｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、もしくはＩｌｅを表し；Ｘａａ（３）はＡｒｇ 、Ｌｙｓ、もしくはＨｉｓを表し；Ｘａａ（４）はＧｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌ ｅｕ、Ｉｌｅ、Ａｓｐ、もしくはＧｌｕを表し；Ｘａａ（５）はＧｌｙ、Ａｌａ 、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ａｓｎ、もしくはＧｌｎを表し；Ｘａａ（６） はＡｒｇ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ｔｙｒ、もしくはＰｈｅを表し；Ｘａａ（７）はＡ ｓｐもしくはＧｌｕを表し；Ｘａａ（８）はＰｒｏ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、もしくは Ｔｈｒを表し；Ｘａａ（９）はＧｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ａｓ ｐ、もしくはＧｌｕを表し；Ｘａａ（１０）はＧｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ 、Ｉｌｅ、もしくはアミノ酸ギャップを表し；Ｘａａ（１１）はＧｌｙ、Ａｌａ 、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ、もしくはＴｈｒを表し；Ｘａａ（１２）は Ｐｈｅ、Ｔｈｙ、Ｔｒｐ、もしくはアミノ酸ギャップを表し；Ｘａａ（１３）は ＳｅｒもしくはＴｈｒを表し；Ｘａａ（１４）はＧｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅ ｕ、Ｉｌｅ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、もしくはＨｉｓを表し；Ｘａａ（１５）はＧｌｙ 、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ、もしくはＴｈｒを表し；Ｘａａ（ １６）はＧｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、もしくはＩｌｅを表し；Ｘａａ（１ ７）はＧｌｘを表し；Ｘａａ（１８）はＧｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌ ｅ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、もしくはＡｒｇを表し；Ｘａａ（１９）はＡｒｇもしくは Ｇｌｎを表し；Ｘａａ（２０）はＧｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、もしくはＩ ｌｅを表し；Ｘａａ（２１）はＧｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、もしくはＩｌ ｅを表し；Ｘａａ（２２）はＧｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｌｙ ｓ、Ｈｉｓ、もしくはＡｇｒを表し；Ｘａａ（２３）はＧｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ 、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｈｒ、もしくはＳｅｒを表し；Ｘａａ（２４）はＧｌｙ、 Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、もしくはアミノ酸ギャップ を表し、この状況ではアミノ酸ギャップは、そのポリペプチドからのそのアミノ 酸位置の欠失を意味することが理解される。別法では縮重位置でのアミノ酸置換 は、アミノ酸側鎖の極性もしくは電 荷に関係することなく静的基準（例えば、等配電子置換）に基づくことができる 。同様に、一つもしくは複数の変異体位置（Ｘａａ）の完全にランダムな突然変 異誘発を実施することができる。 好ましい態様では組み合わせＣＣＲライブラリーは、各々が可能なＣＣＲ蛋白 質配列の少なくとも一つの部分を含むポリペプチドのライブラリーをコードする 遺伝子の縮重ライブラリーにより作製される。例えば、合成オリゴヌクレオチド の混合物を、有望なＣＣＲヌクレオチド配列の縮重セットが個別のポリペプチド としてか、あるいは別法ではＣＣＲ蛋白質配列セットを含むより大きな融合蛋白 質セット（例えば、ファージ呈示のため）として発現可能となるように酵素的に 遺伝子配列内に連結させることができる。 有望なＣＣＲ相同物のライブラリーを縮重オリゴヌクレオチド配列から作製す ることができる多くの方法が存在する。縮重遺伝子配列の化学合成は、自動ＤＮ Ａ合成機内で実施することができ、かつその後に合成遺伝子を発現のための適切 な遺伝子内に連結させる。遺伝子の縮重セットの目的は、一つの混合物中に有望 なＣＣＲ配列の所望されるセットをコードする全配列を提供することである。縮 重オリゴヌクレオチドの合成は当該技術分野において熟知されている（例えば、 Ｎａｒａｎｇ，ＳＡ（１９８３） Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ３９：３；Ｉｔａ ｋｕｒａ ｅｔ ａｌ．（１９８１） Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮΛ、Ｐｒ ｏｃ ３ｒｄ Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ Ｓｙｍｐｏｓ．Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌ ｅｓ、ｅｄ．ＡＧ Ｗａｌｔｏｎ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ：Ｅｌｓｅｖｉｅｒ ｐ ｐ２７３−２８９；Ｉｔａｋｕｒａ ｅｔ ａｌ．（１９８４） Ａｎｎｕ．Ｒ ｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ． ５３：３２３；Ｉｔ ａｋｕｒａ ｅｔ ａｌ．（１９８４） Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８：１０５６： Ｉｋｅ ｅｔ ａｌ．（１９８３） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ． １１：４７７、を参照されたい）。このような技術は他の蛋白質の特異的発生中 において既に利用されている（例えば、Ｓｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．（１９９０） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：３８６−３９０；Ｒｏｂｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ．（ １９９２） ＰＮＡＳ ８７：２４２９−２４３３；Ｄｅｖｌｉｎ ｅｔ ａｌ ． （１９９０） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９、４０４−４０６；Ｃｗｉｒｌａ ｅｔ ａｌ． （１９９０） ＰＮＡＳ ８７：６３７８−６３８２；ならびに 米国特許第５，２２３，４０９号、第５，１９８，３４６号、および第５，０９ ６，８１５号を参照されたい）。 点突然変異誘発により作製された組み合わせライブラリーの遺伝子産物のスク リーニング、および更に言えば所定の特性を有する遺伝子産物のためのｃＤＮＡ ライブラリーのスクリーニングのためには広範囲にわたる技術が当該技術分野に 知られている。そのような技術は一般的にはＣＣＲ相同体の組み合わせ突然変異 誘発により作製される遺伝子ライブラリーの迅速スクリーニングに適用されるで あろう。巨大遺伝子ライブラリーをスクリーニングするために最も広く用いられ ている技術は典型的には、複製可能発現ベクター内へのその遺伝子ライブラリー のクローニング、得られるベクターライブラリーでの適切な細胞の形質転換、お よび所望の活性の検出が、その産物が検出される遺伝子をコードするベクターの 比較的簡便な単離を容易にさせる条件下での組み合わせ遺伝子の発現を含む。以 下に記載される説明的アッセイの各々は、組み合わせ突然変異誘発技術により作 製される多数の縮重配列をスクリーニングす ることが必要な場合の高処理量分析に対応する。 スクリーニングアッセイの説明的態様では、候補組み合わせ遺伝子産物は細胞 の表面上に呈示され、そしてこの遺伝子産物を介してＣＤＫ（例えば、ＣＤＫ４ もしくはＣＤＫ６）に結合する特別な細胞もしくはウイルス粒子の能力が「パニ ングアッセイ」で検出される。例えば遺伝子ライブラリーを細菌性細胞の表面膜 蛋白質のための遺伝子内にクローン化し（Ｌａｄｎｅｒ ｅｔ ａｌ．、国際公 開第８８／０６６３０号；Ｆｕｃｈｓ ｅｔ ａｌ．（１９９１） Ｂｉｏ／Ｔ ｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：１３７０−１３７１；およびＧｏｗａｒｄ ｅｔ ａ ｌ．（１９９２） ＴＩＢＳ １８：１３６−１４０）、そして得られる融合蛋 白質を、例えば有望な機能性ＣＣＲ相同物を評定するためのＣＣＲ蛋白質に結合 する蛍光ラベル化分子（例えば、ＦＩＴＣ−ＣＤＫ４）を用いるパニングにより 検出することができる。細胞は肉眼で調査し、そして蛍光顕微鏡下で分離するか 、あるいは細胞の形態が許す場合には蛍光活性細胞分別機により分離することが できる。 類似様式で遺伝子ライブラリーを、ウイルス粒子の表面上に融合蛋白質として 発現させることができる。例えば線維状ファージ系では外来性ペプチド配列を感 染性ファージの表面上に発現させ、そのことにより２つの有意な利益を付与する ことができる。第一には、それらのファージは非常に高い濃度では親和性マトリ ックスに適用することができるため、多数のファージを一度にスクリーニングす ることができる。第二には、各感染性ファージはその表面に組み合わせ遺伝子産 物を呈示するため、特別のファージが低い収率で親和性マトリックスから回収さ れる場合には、もう一度感染周期を繰り返すことによりそのファージを増幅させ る ことができる。ほぼ同一である大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）線維状ファージＭ１３ 、ｆｄ、およびｆｌがファージ呈示ライブラリーとして最も頻繁に用いられてお り、それはファージｇＩＩＩもしくはｇＶＩＩＩのいずれかのコート蛋白質を用 いてウイルス粒子の最終パッケージング状態を破損することなく融合蛋白質を作 製することができるためである（Ｌａｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．、国際公開第９０ ／０２０９０号；Ｇａｒｒａｒｄ ｅｔ ａｌ．、国際公開第９２／０９６９０ 号；Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．（１９９２） Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２６ ７：１６００７−１６０１０；Ｇｒｉｆｆｔｈｓ ｅｔ ａｌ．（１９９３） ＥＭＢＯ Ｊ １２：７２５−７３４；Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９ ９１） Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４−６２８；およびＢａｒｂａｓ ｅｔ ａｌ．（１９９２） ＰＮＡＳ ８９：４４５７−４４６１）。 説明的態様では、組換えファージ抗体系（ＲＰＡＳ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｃ ａｔａｌｏｇｎ ｕｍｂｅｒ ２７−９４００−０１）を、本発明のＣＣＲ組み 合わせライブラリーの発現およびスクリーニングの際の使用のために容易に改変 することができる。例えば、ＲＰＡＳキットのｐＣＡＮＴＢ５ファゲミドは、フ ァージｇＩＩＩコート蛋白質をコードする遺伝子を含む。ＣＣＲ組み合わせ遺伝 子ライブラリーを、そのライブラリーがｇＩＩＩ融合蛋白質として発現されるで あろうように、ｇＩＩＩシグナル配列の近辺でそのファゲミド内にクローン化す ることができる。連結後、そのファゲミドを用いてコンピテント大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ ）ＴＧ１細胞を形質転換する。その後には形質転換化細胞をＭ１３ＫＯ ７ヘルパーファージで感染させてそのファゲミドおよびその候 補ＣＣＲ遺伝子挿入断片を救済する。得られる組換えファージは、特異的候補Ｃ ＣＲ蛋白質をコードするファゲミドＤＮＡを含み、かつ一つもしくは複数のコピ ーの対応する融合コート蛋白質を呈示する。例えばＣＤＫに結合することが可能 なファージ呈示化候補蛋白質をパニングにより選択もしくは濃縮する。例えば、 ファージライブラリーをグルタチオンで固定化させたＣＤＫ−ＧＳＴ融合蛋白質 上でパニングし、そして非結合ファージをその細胞から洗い落とすことができる 。その後に結合化ファージを単離し、そして組換えファージが少なくとも一つの コピーの野生型ｇＩＩＩコート蛋白質を発現する場合には、それらは大腸菌（Ｅ ． ｃｏｌｉ）を感染する能力を保持しているであろう。従って、連続周期の大 腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）の再感染およびパニングによりＣＣＲ相同体（例えば、 ｐ１６、ｐ１５、もしくはＰ１３．５相同体）が高度に濃縮されるであろうし、 これをその後に、アゴニストとアンタゴニストとを区別する目的で更に詳細な生 物学的活性に関してスクリーニングすることができる。例えばそのライブラリー からの縮小化変異体セットの後続選択は、単純なＣＤＫ結合性能力よりはむしろ 一層意味深い基準に基づくものであることがある。例えば、細胞内半減期もしく は阻害能が第二スクリーニングの際の選択基準になることがあり得る。 本開示を考慮すると、一般的に応用可能な他の形態の突然変異誘発が、既述の 組み合わせ突然変異誘発に加えて当業者には明らかになるであろう。例えば、ｐ １６、ｐ１５、ｐ１３．５相同体（アゴニストおよびアンタゴニストの両形態、 および断片を含む）を、一例ではアラニンスキャニング突然変異誘発など（Ｒｕ ｆ ｅｔ ａｌ．（１９９４） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３３：１５６５− １５７２；Ｗａｎｇ ｅｔ ａ ｌ．（１９９４） Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２６９：３０９５−３０９９； Ｂａｌｉｎｔ ｅｔ ａｌ．（１９９３） Ｇｅｎｅ １３７：１０９−１１８ ；Ｇｒｏｄｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．（１９９３） Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ ． ２１８：５９７−６０１；Ｎａｇａｓｈｉｍａ ｅｔ ａｌ．（１９９３） Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２６８：２８８８−２８９２；Ｌｏｗｍａｎ ｅ ｔ ａｌ．（１９９１） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３０：１０８３２−１０ ８３８；およびＣｕｎｎｉｎｇｈａｍ ｅｔ ａｌ．（１９８９） Ｓｃｉｅｎ ｃｅ ２４４：１０８１−１０８５）を用いるか、リンカースキャニング突然変 異誘発（Ｇｕｓｔｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９９３） Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９３ ：６５３−６６０；Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．（１９９２） Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １２：２６４４−２６５２；ＭｃＫｎｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．（ １９８２） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３２：３１６）によるか；飽和突然変異誘発（ Ｍｅｙｅｒｓ ｅｔ ａｌ．（１９８６） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３２：６１３） によるか；ＰＣＲ突然変異誘発（Ｌｅｕｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９８９） Ｍｅ ｔｈｏｄ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １：１１−１９）によるか；もしくは ランダム突然変異誘発（Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９２） Ａ Ｓｈｏ ｒｔ Ｃｏｕｒｓｅ ｉｎ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．；およびＧｒ ｅｅｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９４） Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｉｎ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ７：３２−３４）により作製およびスクリーニングすることができ る。 その結果本発明は更に、本物のＣＣＲ蛋白質のサイクリン依存性キナ ーゼ（例えば、ＣＤＫ４および／またはＣＤＫ６）への結合を模倣することが可 能な疑似物（例えば、ペプチドもしくは非ペプチドである作用物質）を作製する ための表題ＣＣＲ蛋白質の還元法をも提供する。先に記載される突然変異的技術 、およびチオレドキシン系は、例えば表題ＣＣＲ蛋白質のＣＤＫへの結合に関与 する蛋白質−蛋白質相互作用に携わるＣＣＲ蛋白質の決定基をマッピングするの に特に有用でもある。説明すると、ＣＤＫ４の分子認識に関与する表題ＣＣＲ蛋 白質の正確な残基を決定し、そしてそれを用いてＣＤＲ４もしくはＣＤＲ６に結 合し、かつ本物のＣＣＲ蛋白質のようにキナーゼの活性化を阻害するＣＣＲ由来 のペプチド疑似物を作製することができる。例えば、サイクリン依存性キナーゼ に結合する際に関与する特別なＣＣＲ蛋白質のアミノ酸残基をマッピングするの にスキャニング突然変異誘発を利用することにより、キナーゼへの結合の点でそ れらの残基を模倣するペプチド疑似物化合物（例えば、ジアゼピンもしくはイソ キノリン誘導体）を作製することができる。例えば、そのような残基の非加水分 解性ペプチドアナログを、ベンゾジアゼピン（例えば、Ｆｒｅｉｄｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇ ｙ中、Ｇ．Ｒ．Ｍａｒｓｈａｌｌ ｅｄ．、ＥＳＣＯＭ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ： Ｌｅｉｄｅｎ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ、１９８８、を参照されたい）、アゼピ ン（例えば、Ｈｕｆｆｍａｎ ｅｔ ａｌ．、Ｐｅｐｔｉｄｅｓ；Ｃｈｅｍｉｓ ｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ中、 Ｇ．Ｒ．Ｍａｒｓｈａｌｌ ｅｄ．、Ｅ ＳＣＯＭ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ：Ｌｅｉｄｅｎ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ、１９ ８８、を参照されたい）、置換化ガンマーラクタム環（Ｇａｒｖｅｙ ｅｔ ａ ｌ．、Ｐｅｐｔｉｄｅｓ中；Ｃ ｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ、 Ｇ．Ｒ．Ｍａｒｓｈａｌｌ ｅ ｄ．、ＥＳＣＯＭ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ；Ｌｅｉｄｅｎ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄ ｓ、１９８８）、ケト−メチレンシュードペプチド（Ｅｗｅｎｓｏｎ ｅｔ ａ ｌ．（１９８６） Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ ２９：２９５；およびＥｗｅｎｓｏ ｎ ｅｔ ａｌ．、Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｕｎｃ ｔｉｏｎ中（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ ９ｔｈ Ａｍｅｒｉｃａ ｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ） Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．Ｒｏｃｋｌａｎｄ、ＩＬ、１９８５）、β−ターンジペプチドコア（Ｎ ａｇａｉ ｅｔ ａｌ．（１９８５） Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ ２ ６：６４７；およびＳａｔｏ ｅｔ ａｌ．（１９８６） Ｊ Ｃｈｅｍ Ｓｏ ｃ Ｐｅｒｋｉｎ ｔｒａｎｓ １：１２３１）、ならびにβ−アミノアルコー ル（Ｇｏｒｄｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８５） Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙ ｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ １２６：４１９；およびＤａｎｎ ｅｔ ａｌ．（ １９８６） Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ １３４ ：７１）を用いて作製することができる。 類似様式で、ＣＣＲ蛋白質への結合を実施するＣＤＫ４および／またはＣＤＫ ６における突然変異体の同定法を用いて、ＣＣＲ蛋白質に競合的に結合し、かつ ＣＤＫを阻害するＣＣＲ蛋白質の能力を妨害することができるＣＤＫ４／ＣＤＫ ６の有望なペプチジル断片を同定することができる。以下に記載されるように、 我々はｐ１５およびｐ１６による結合を排除し、そしてその結果それらのＣＣＲ 蛋白質による阻害に対して非感受性となるキナーゼを提供するＣＤＫ４に対する 突然変異の特徴決 定を既に行っている。これらの突然変異は実際のところ、ＣＤＫ４とＣＤＫ６と の間に保存されるアミノ酸残基の連続部分内に生じる。従ってＣＤＫ４／ＣＤＫ ６のこれらの部分に基づくペプチド疑似物は、それらがＣＣＲ蛋白質への結合に ついてＣＤＫ４もしくはＣＤＫ６と競合することが予測されるという点で、ＣＣ Ｒ蛋白質のアンタゴニストとして有用であるかもしれない。好ましい態様では、 このＣＣＲアンタゴニストはアミノ酸配列ＶＡＥＩＧ（Ｖ／Ｅ）ＧＡＹＧ（Ｔ／ Ｋ）−Ｖ（Ｆ／Ｙ）ＫＡＲＤのペプチドもしくは非ペプチドアナログであるが、 アミノ酸配列Ｖ（Ｆ／Ｙ）ＫＡＲＤのペプチド疑似物が一層好ましく、そしてテ トラペプチドＫＡＲＤが更に一層好ましい。同様に、ＣＤＫ４／ＣＤＫ６の他の 好ましいペプチドアナログが、配列ＳＲＴＤＲＥ（Ｉ／Ｔ）Ｋ（Ｖ／Ｌ）ＴＬＶ ＦＥＨＶＤＱＤＬ（Ｒ／Ｔ）ＴＹＬＤＫ（Ａ／Ｖ）ＰＰＰＧ（Ｌ／Ｖ）に相当す るペプチドもしくはペプチド疑似物を含むが、そのペプチド疑似物がヘキサペプ チドＦＥＨＶＤＱもしくはＥＨＶＤＱＤのアナログであることが一層好ましく、 そしてテトラペプチドＨＶＤＱもしくはＥＨＶＤのアナログであることが更に一 層好ましい。そのような残基の非ハイブリダイズ性ペプチドアナログを、例えば ベンゾジアゼピン、アゼピン、置換化ガンマーラクタム環、ケトメチレンシュー ドペプチド、β−ターンジペプチドコア、もしくはβ−アミノアルコールを用い て作製することができる。ＣＤＫのこれらおよび他のペプチジル部分を、ＣＣＲ 蛋白質（例えば、ｐ１５もしくはｐ１６）への結合について、一例では先に記載 されるチオレドキシン融合蛋白質構築物を用いて検査することができる。 本発明の他の態様は、表題ＣＣＲ蛋白質の内の一つと特異的に反応す る抗体に関する。例えば、表題ｐ１６蛋白質のｃＤＮＡ配列に基づくペプチドを 用いることにより、抗−ｐ１６抗血清もしくは抗−ｐ１６モノクローナル抗体を 標準方法を用いて作製することができる。同様に、抗−ｐ１３．５および抗−ｐ １５抗体を作製することができる。例えば、マウス、ハムスター、もしくはウサ ギのような哺乳類をそのペプチドの免疫原性形態（例えば、抗体応答を誘導する ことが可能な抗原性断片）で免疫化することができる。蛋白質もしくはペプチド に免疫原性を付与するための技術には、担体への複合体形成もしくは当該技術分 野で熟知されている他の技術が含まれる。例えば、配列番号２、４、６、もしく は８の内の一つにより表される蛋白質のペプチジル部分をアジュバントの存在下 で投与することができる。免疫化の進行は血漿および血清中の抗体力価の検出に よりモニターすることができる。標準的ＥＬＩＳＡもしくは他の免疫アッセイを 抗原としてこの免疫原と共に用いて抗体のレベルを評定することができる。 免疫化後には、抗−ＣＣＲ抗血清を取得することができ、そして所望される場 合にはポリクローナル抗−ＣＣＲ抗体をその血清から単離することができる。モ ノクローナル抗体を作製するには、抗体産生性細胞（リンパ球）を免疫化動物か ら回収し、そして標準的体細胞融合方法により不滅性細胞（例えば、骨髄腫細胞 ）と融合させてハイブリドーマ細胞を取得することができる。このような技術は 当該技術分野において熟知されており、そしてそれらには例えば、ヒトＢ細胞ハ イブリドーマ技術（Ｋｏｚｂａｒ ｅｔ ａｌ．（１９８３） Ｉｍｍｕｎｏｌ ｏｇｙ Ｔｏｄａｙ、４：７２）としてのハイブリーマ技術（もともとは、Ｋｏ ｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５） Ｎａｔｕｒｅ、２５６ ：４９５−４９７、により開発された）、およびヒトモノクローナル抗体を産生 するためのＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ．、（１９８５ ） Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔ ｈｅｒａｐｙ、Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ． ｐｐ．７７−９６）が含ま れる。ハイブリドーマ細胞は、目的のＣＣＲ蛋白質および単離されたモノクロー ナル抗体と特異的に反応する抗体の産生について免疫学的にスクリーニングする ことができる。 用語「抗体」は本明細書で用いられる際には、ＣＣＲ蛋白質との特異的反応性 をやはり示すその抗体（例えば、抗−ｐ１６、抗−ｐ１５、もしくは抗−ｐ１３ ．５抗体）の断片を含むことが意図される。抗体は通常の技術を用いて断片化す ることができ、そしてそれらの断片を全抗体について既述のものと同一の様式で の利用についてスクリーニングすることができる。例えば、Ｆ（ａｂ’）₂断片 は、ペプシンでの抗体の処理により作製することができる。得られるＦ（ａｂ’ ）₂断片をジスルフィド架橋を還元するように処理してＦａｂ’断片を産生する ことができる。本発明の抗体は更に、二重特異的かつキメラ性の分子を含むこと が意図される。 表題ＣＣＲ蛋白質に対して作製されるモノクローナルおよびポリクローナルの 両抗体（Ａｂ）、ならびに例えばＦａｂ’およびＦ（ａｂ’）₂のような抗体断 片を使用して、特別なＣＣＲの作用を遮断し、そして細胞周期もしくは細胞増殖 の研究を可能にすることができる。 抗−ＣＣＲ抗体の一つの適用法は、発現ベクター（例えば、λｇｔ１１、λｇ ｔ１８−２３、λＺＡＰおよびλＯＲＦ８）中に構築されるｃＤＮＡライブラリ ーの免疫学的スクリーニングにおけるものである。 このタイプのメッセンジャーライブラリーは正しい読み取り枠および配向で挿入 されたコーディング配列を有するため、融合蛋白質を産生することができる。例 えば、λｇｔ１１は、アミノ末端がβ−ガラクトシダーゼアミノ酸配列でできて おり、かつカルボキシ末端が外来性ポリペプチドでできている融合蛋白質を産生 するであろう。その後には、ＣＣＲ蛋白質の抗原性エピトープ（例えば、ｐ１６ 、ｐ１５、ｐ１３．５に抗原的に関連する蛋白質）を抗体で検出することができ るが、それは例えば、感染させたプレートからはがし取ったニトロセルロースフ ィルターを抗−ＣＣＲ抗体と反応させて実施する。このアッセイにより評定され たファージを、その後には感染化プレートから単離することができる。従って、 ＣＣＲ相同体（例えば、ｐ１６、ｐ１５、もしくはｐ１３．５相同体）の存在を 他の源から検出およびクローン化することができる。 本発明の一つもしくは複数のＣＣＲ蛋白質と特異的免疫反応性を示す抗体を、 ＣＣＲ蛋白質ファミリーもしくはその特別なメンバーの量および発現パターンを 評定する目的で、組織試料の免疫化学的染色に用いることもできる。抗−ＣＣＲ 抗体を免疫沈降法および免疫ブロッティッングに診断的に用いて、臨床検査方法 の部分として、組織もしくは体液から単離された細胞中の一つもしくは複数のＣ ＣＲ蛋白質のレベルを検出および評定することができる。例えばこのような測定 は、腫瘍の発症もしくは進行の予防的評定に有用であり得る。同様に、ある個体 中の所定のＣＣＲ蛋白質レベルをモニターする能力により、そのような障害に冒 されている個体についての所定の治療方法の効果の決定が可能となり得る。抗− ＣＣＲ抗体（例えば、抗−ｐ１６もしくは抗−ｐ１５抗体）を用いる診断アッセ イは例えば、新形成性もしくは過形成性障害（例えば、 試料中の癌性細胞の存在）の初期診断を援助する、例えば、ＣＣＲ遺伝子の病変 が出現している細胞を検出するために設計された免疫アッセイを含むことができ る。 それに加えて、ヌクレオチドプローブを表題ＣＣＲ蛋白質のクローン化配列か ら作製することができ、このヌクレオチドプローブは、ＣＣＲ蛋白質をコードす るｍＲＮＡの存在について未処理組織および組織試料の組織学的スクリーニング を考慮するものである。抗−ＣＣＲ蛋白質抗体の診断的使用に類似して、ＣＣＲ 蛋白質をコードするｍＲＮＡもしくはゲノムＣＣＲ遺伝子配列に対するプローブ の使用を、例えば新形成性もしくは過形成性障害（例えば、所望されない細胞成 長）として顕在するであろう対立遺伝子突然変異の予防的および治療的の両方の 評定のために用いることができる。抗−ＣＣＲ蛋白質抗体免疫アッセイと組み合 わせて用いると、このヌクレオチドプローブは、ＣＣＲ蛋白質の発現（もしくは その欠失）に関わる幾つかの異常に関与することがある発達性障害についての分 子的基準の決定を容易にすることを手助けすることができる。例えば、ＣＣＲ蛋 白質合成における変異体を、コーディング配列中の突然変異体から識別すること ができる。 従って本方法は、被検体が所望されない細胞増殖を特徴とする障害の危険にさ らされているかどうかを決定するための方法を提供する。好ましい態様では、方 法は一般的には、以下の（ｉ）ＣＣＲ蛋白質（例えばｐ１６、ｐ１５、もしくは ｐ１３．５）をコードする遺伝子の突然変異、もしくは（ｉｉ）ＣＣＲ遺伝子の 過誤発現、の内の少なくとも一つを特徴とする遺伝子病変の存在もしくは非存在 を、前記被検体の組織中で検出することを含むことを特徴とすることができる。 説明すると、そのよ うな遺伝子病変は、（ｉ）ＣＣＲ遺伝子からの一つもしくは複数のヌクレオチド の欠失、（ｉｉ）ＣＣＲ遺伝子への一つもしくは複数のヌクレオチドの添加、（ ｉｉｉ）ＣＣＲ遺伝子の一つもしくは複数のヌクレオチドの置換、（ｉｖ）ＣＣ Ｒ遺伝子の総体的染色体再構成、（ｖ）ＣＣＲ遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ転 写物のレベルの総体的変化、（ｖｉ）ＣＣＲ遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ転写 物の非野生型スプライシングパターンの存在、および（ｖｉｉ）ＣＣＲ蛋白質の 非野生型レベル、の内の少なくとも一つの存在の確認により検出することができ る。本発明の一つの態様では、配列番号１、３、５、もしくは７の内のいずれか のセンスもしくはアンチセス配列、または天然に存在するその突然変異体、ある いは表題ＣＣＲ遺伝子に天然の状態で連結する５’もしくは３’フランク配列ま たはイントロン性配列、あるいは天然に存在するそれらの突然変異体にハイブリ ダイズすることが可能なヌクレオチド配列の一つの領域を含むオリゴヌクレオチ ドを含むプローブ／プライマーが提供される。このプローブが組織試料の核酸に 露出され；そしてそのプローブの、試料核酸に対するハイブリダイゼーションが 検出される。所定の態様では病変の検出は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（ 例えば、米国特許第４，６８３，１９５号および第４，６８３，２０２号を参照 されたい）、もしくは別法では連結連鎖反応（ＬＣＲ）（例えば、Ｌａｎｄｅｇ ｒａｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：１０７７−１０ ８０；およびＮａｋａｚａｗａ ｅｔ ａｌ．（１９４４） ＰＮＡＳ ９１： ３６０−３６４、を参照されたい）においてそのプローブ／プライマーを利用す ることを含み、これらの内の後者は、ＣＣＲ遺伝子中の点突然変異を検出するの に特に有用であり得る。別法では ＣＣＲ蛋白質のレベルを免疫アッセイにおいて検出することができる。 その上、アンチセンス技術（例えば、アンチセンス分子のマイクロインジェク ション、もしくはその転写物が所定のＣＣＲ ｍＲＮＡに関してアンチセンスと なるプラスミドでのトランスフェクション）の使用を用いて、その蛋白質の内因 性産生を阻害することにより、制御化条件下で細胞周期および細胞増殖における 特別なＣＣＲ蛋白質（例えばｐ１６、ｐ１５、もしくはｐ１３．５）の役割を調 査することができる。このような技術を細胞培養に利用することができるが、更 にこれを形質転換動物の創製にも用いることができる。 本発明の他の態様は形質転換非ヒト動物を特徴とし、その形質転換非ヒト動物 は、本発明の異種ＣＣＲ遺伝子を発現するか、あるいはその動物の組織もしくは 細胞タイプの内の少なくとも一つにおいて一つもしくは複数のゲノムＣＣＲ遺伝 子の破壊を既に受けている。例えば、ｐ１３．５遺伝子座での破壊を受けている 形質転換マウスが実施例５に記載される。 他の態様では本発明は、過誤発現されるＣＣＲ対立遺伝子を有する発達性障害 のための動物モデルを特徴とする。例えば、ｐ１６もしくはｐ１５対立遺伝子が 欠失しているか、あるいはｐ１６エキソンの全てあるいは一つもしくは複数の部 分が欠失しているマウスを育種することができる。その後にはこのようなマウス モデルを用いて、過誤発現されたｐ１６遺伝子から生じる障害を研究することが できる。 従って本発明は、本発明のトランスジーンを含む細胞（その動物の）を含んで なり、かつ動物内の一つもしくは複数の細胞内で外因性ＣＣＲ蛋白質を発現する ことが好ましい（場合によってではあるが）形質転換 動物に関する。このＣＣＲトランスジーンは野生型形態の蛋白質をコードするこ とができるか、あるいはその相同体（これには、アゴニストおよびアンタゴニス トの両方が含まれる）、ならびにアンチセンス構築物をコードすることができる 。好ましい態様ではトランスジーンの発現は、例えば所望されるパターンでの発 現を制御するシス−作用性配列を利用して、細胞、組織の特異的サブセット、も しくは特異的発達段階に限定される。本発明では、表題蛋白質のそのようなモザ イク発現は多くの形態の株の分析にとって必須であり得、かつ追加的には、他の 点では正常な胎仔内の組織の小片における発達を総体的に変化させることがある ＣＤＫ（複数）の例えばｐ１６およびｐ１５阻害の欠失の効果を評定する手段を 提供することができる。この目的のためには、組織特異的調節配列および条件的 調節配列を用いて、所定の空間的パターン内でのトランスジーンの発現を制御す ることができる。それに加え、一過性発現パターンを、例えば条件的組換え系も しくは原核生物性転写調節配列により提供することができる。 トランスジーンの発現をインビボでの部位特異的遺伝子操作を介して調節する ことができることを考慮する遺伝子技術が、当業者に知られている。例えば、標 的配列の遺伝子組換えの触媒作用を行うレコンビナーゼの調節化発現を考慮する 遺伝子系を利用することが可能である。本明細書で用いられる際には成句「標的 配列」は、レコンビナーゼにより遺伝子的に組換えられるヌクレオチド配列を意 味する。この標的配列はレコンビナーゼ認識配列によりフランクされ、かつ一般 的にはレコンビナーゼ活性を発現する細胞内で切り出されるかもしくは逆位をと るかのいずれかとなる。組換え現象の触媒反応を行うレコンビナーゼを、標的配 列の組換えが、表題ＣＣＲポリペプチドの発現の活性化もしくは抑制のいずれか をもたらすように設計することができる。例えば、組換えＣＣＲ遺伝子の発現を 妨害する標的配列の切り出しが、その遺伝子の発現を活性化するように設計する ことができる。その蛋白質の発現の妨害は、例えばプロモーター因子もしくは内 部停止コドンからのＣＣＲ遺伝子の空間的分断のような様々なメカニズムから生 じ得る。それに加え、その遺伝子のコーディング配列がレコンビナーゼ認識配列 によりフランクされ、かつそのプロモーター因子に関して３’〜５’方向で細胞 内にもともとはトランスフェクトされているトランスジーンを作製することがで きる。そのような事例では標的配列の逆位は、プロモーター因子に関する方向に コーディング配列の５’末端を配置することにより表題遺伝子を再配向するであ ろうし、そのことはプロモーター稼働性の転写活性化を考慮してのものである。 説明的態様では、バクテリオファージＰ１のｃｒｅ／ｌｏｘＰレコンビナーゼ 系（Ｌａｋｓｏ ｅｔ ａｌ．（１９９２） ＰＮＡＳ ８９：６２３２−６２ ３６；Ｏｒｂａｎ ｅｔ ａｌ （１９９２） ＰＮＡＳ ８９：６８６１−６ ８６５）、あるいはサッカロミセス ケレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅ ｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＦＬＰレコンビナーゼ系（Ｏ’Ｇｏｒｍａｎ ｅ ｔ ａｌ．（１９９１） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１：１３５１−１３５５；国際 公開第９２／１５６９４号）のいずれかを用いてインビボでの部位特異的遺伝子 組換え系を作製することができる。Ｃｒｅレコンビナーゼは、ｌｏｘＰ配列間に 位置する介在性標的配列の部位特異的組換えの触媒反応を行う。ｌｏｘＰ配列は ３４塩基対のヌクレオチド反復配列であり、この配列にＣｒｅ レコンビナーゼが結合し、かつこの配列はＣｒｅレコンビナーゼ媒介性遺伝子組 換えに必要とされる。ｌｏｘＰ配列の向きが、Ｃｒｅレコンビナーゼが存在する 際に（Ａｂｒｅｍｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（１９８４） Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ． ２５９：１５０９−１５１４）その介在性標的配列が切り出されるかもしく は逆位をとるかを決定し、これはすなわち；ｌｏｘＰ配列が正の向きの反復配列 として配向する場合には標的配列の切り出しの触媒反応が生じ、そしてｌｏｘＰ 配列が逆位の反復構造として配向する場合には標的配列の逆位での組換えの触媒 反応が生じるということである。 従って標的配列の遺伝子組換えはＣｒｅレコンビナーゼの発現に依存する。レ コンビナーゼの発現は、外部から添加された作用物質による調節的制御（例えば 、組織特異的、発達段階特異的、誘導性、もしくは抑制性のもの）に供されるプ ロモーター因子により調節され得る。この調節下制御は、レコンビナーゼ発現が プロモーター因子により媒介される細胞内においてのみ、標的配列の遺伝子組換 えをもたらすであろう。従ってＣＣＲ蛋白質の活性化発現をレコンビナーゼ発現 を介して調節することができる。 組換えＣＣＲ蛋白質（例えば、ｐ１５もしくはｐ１６）の発現を調節するため のｃｒｅ／ｌｏｘＰレコンビナーゼ系の使用は、Ｃｒｅレコンビナーゼと表題蛋 白質との両方をコードするトランスジーンを含む形質転換動物の構築を必要とす る。Ｃｒｅレコンビナーゼと組換えＣＣＲとの両遺伝子を含む動物は、「二重」 形質転換動物の構築を通して供給され得る。このような動物を提供するための通 常の方法は、各々がトランスジーン（例えば、ＣＣＲ遺伝子およびレコンビナー ゼ遺伝子）を含む ２匹の形質転換動物を交雑させることである。 レコンビナーゼ媒介性発現性フォーマットとしてＣＣＲトランスジーンを含む 形質転換動物を最初に構築することによりもたらされる一つの利点は、その表題 蛋白質がその形質転換動物中での発現の際に有害になるであろう可能性に由来す る。このような事例では、表題トランスジーンが全組織中でサイレントとなる創 始細胞集団を継代および維持することができる。この創始細胞集団の個体を、例 えば一つもしくは複数の組織内でレコンビナーゼを発現する動物と交雑すること ができる。従って、例えば拮抗性ｐ１５トランスジーンがサイレントである創始 細胞集団の作製により、特別な組織内もしくは発達段階でのｐ１５による細胞周 期調節の破壊が一例では致命的表現型をもたらすであろう創始細胞からの子孫の 研究が可能となるであろう。 類似の制御的トランスジーンを、そのトランスジーンの発現を容易にさせる目 的で、原核生物蛋白質を同時に発現させることを要求する原核生物プロモーター 配列を用いて提供することができる。例示的なプロモーターおよび対応するトラ ンス作用性原核生物蛋白質が、米国特許第４，８３３，０８０号に示されている 。それに加えて、その制御的トランスジーンの発現を、トランス活性化蛋白質（ 例えばリコンビナーゼ、もしくは原核生物性蛋白質）をコードする遺伝子がその 組織に輸送され、そして発現を生じる（例えば、細胞タイプ特異的様式で）遺伝 子療法様の方法により誘導することができる。この方法によっては、そのＣＣＲ トランスジーンは、そのトランス活性化因子の組込みにより「スイッチオン」に なるまでは成体になってもサイレントのままでい続ける。 例示的態様では本発明の「形質転換非ヒト動物」は、非ヒト動物の生 殖細胞系内、のトランスジーンの組込みにより産生される。様々な発達段階の胎 仔標的細胞を用いてトランスジーンを組込ませることができる。その胎仔標的細 胞の発達の段階に依存して、異なる方法が用いられる。接合体はマイクロインジ ェクションにとっての最高の標的である。マウスではオスの前核は直径約２０マ イクロメーターのサイズに至り、このことにより１〜２ｐｌのＤＮＡ溶液の再現 的挿入が可能となる。遺伝子輸送のための標的としての接合体の使用は、多くの 事例においては挿入されたＤＮＡが最初の分裂以前に宿主遺伝子内に組込まれる であろうという点での主要な利点を有する（Ｂｒｉｎｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（ １９８５） ＰＮＡＳ ８２：４４８３−４４４２）。その結果、形質転換化非 ヒト動物の全細胞が組込まれたトランスジーンを保持するであろう。このことは 一般的にはそのトランスジーンの創始細胞の子孫への効率的伝播にも反映される であろうが、それは生殖細胞の５０％がそのトランスジーンを保持するであろう からである。接合子のマイクロインジェクションは本発明を実施する際にトラン スジーンを組込ませるための好ましい方法である。 レトロウイルス感染を用いて非ヒト動物内にトランスジーンを組込ませること もできる。発育中の非ヒト胎仔をインビトロで胞胚段階にまで培養することがで きる。この期間中、この分割細胞をレトロウイルス感染の標的とすることができ る（Ｊａｅｎｉｃｈ，Ｒ． （１９７６） ＰＮＡＳ ７３：１２６０−１２６ ４）。この分割細胞の効率的感染は、透明帯を除去するための酵素処理により取 得される（Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ、Ｈ ｏｇａｎ ｅｄｓ．（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔ ｒｙ Ｐｒ ｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、１９８６）。トランスジーン を組込ませるのに用いられるウイルス性ベクター系は典型的には、そのトランス ジーンを保持する複製欠陥レトロウイルスである（Ｊａｈｎｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９８５） ＰＮＡＳ ８２：６９２７−６９３１；Ｖａｎ ｄｅｒ Ｐｕｔ ｔｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９８５） ＰＮＡＳ ８２：６１４８−６１５２）。 トランスフェクションは、ウイルス産生性細胞の単層上で分割細胞を培養するこ とにより簡便かつ効果的に取得される（Ｖａｎ ｄｅｒ Ｐｕｔｔｅｎ）上述； Ｓｔｅｗａｒｔ ｅｔ ａｌ．（１９８７） ＥＭＢＰ Ｊ． ６：３８３−３ ８８）。別法では、感染をより後期段階で実施することができる。ウイルスもし くはウイルス産生性細胞を分割腔内に注入することができる（Ｊａｈｎｅｒ ｅ ｔ ａｌ．（１９８２） Ｎａｔｕｒｅ ２９８：６２３−６２８）。大半の創 始細胞はトランスジーンに関してモザイクとなるであろうが、それは挿入が形質 転換非ヒト動物を形成する細胞のサブセット内のみで生じるためである。それに 加えて創始細胞はゲノム内の様々な位置にトランスジーンの様々なレトロウイル ス挿入断片を含むことがあり、その挿入断片は一般的にはその子孫内では離脱す るであろう。それに加え、トランスジーンを、妊娠中期の胎仔の子宮内レトロウ イルス感染により生殖細胞内に組込ませることも可能である（Ｊａｈｎｅｒ ｅ ｔ ａｌ．（１９８２）、上述）。 トランスジーン組込みのための第三のタイプの標的細胞は胎仔幹細胞（ＥＳ） である。ＥＳ細胞はインビトロで培養した移植前胎仔から取得され、そして胎仔 と融合させられる（Ｅｖａｎｓ ｅｔ ａｌ．（１９８１） Ｎａｔｕｒｅ ２ ９２：１５４−１５６；Ｂｒａｄｌｅｙ ｅ ｔ ａｌ．（１９８４） Ｎａｔｕｒｅ ３０９：２５５−２５８；Ｇｏｓｓ ｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８６） ＰＮＡＳ ８３：９０６５−９０６９；お よびＲｏｂｅｒｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８６） Ｎａｔｕｒｅ ３２２： ４４５−４４８）。トランスジーンは、ＤＮＡトランスフェクションによるかも しくはレトロウイルス媒介性形質導入によりＥＳ細胞内に効率的に組込まれ得る 。このように形質転換させたＥＳ細胞を、その後には非ヒト動物からの肺胞と結 合させることができる。このＥＳ細胞はその後には胎仔のコロニー形成を生じ、 そしてその生殖細胞系がキメラ動物を生じるのに貢献する。総説については、Ｊ ａｅｎｉｓｃｈ，Ｒ．（１９８８） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１４６８−１４ ７４、を参照されたい。 ノックアウトもしくは破壊形質転換動物を作製する方法も一般的に知られてい る。例えば、Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ、 （Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ 、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８６）を参照された い。レコンビナーゼ依存性ノックアウト動物を、例えば、組織特異的および／ま たはＣＣＲ遺伝子の不活化の一過性制御が既述の要領で制御され得るように標的 配列を挿入するための相同組換えにより作製することもできる。 本発明の更に別の態様は、異常な成長制御にも拘わらず依然として細胞成長に ＣＤＫ４もしくはＣＤＫ６を必要とする細胞から生じる増殖性および／または分 化的障害を治療する方法に関する。本発明のＣＣＲ遺伝子構築物およびＣＣＲ疑 似物が治療的利潤を提供することができる多種多様の病理学的細胞増殖条件が存 在し、その一般的手法は異常な細胞 増殖の阻害である。例えば、本発明の遺伝子構築物を遺伝子療法プロトコールの 一部分として使用することができ、それは例えば、ＣＣＲ蛋白質（例えば、ｐ１ ６、ｐ１５、もしくはｐ１３．５）の機能を、その蛋白質が過誤発現されるか、 もしくはそのＣＣＲ蛋白質の上流のシグナル伝達経路が機能不全を呈する細胞内 で再構築するために使用される。説明すると、ＣＣＲ蛋白質の機能の内の少なく とも一部分に恐らく依存して病理学的もしくは異常な成長を示す細胞のタイプに は、様々な癌および白血病、乾癬、骨疾患、線維増殖性障害（例えば、結合組織 に関与するもの）、アテローム性動脈硬化症、および他の平滑筋増殖性疾患、な らびに慢性炎症が含まれる。増殖性障害に加え、例えば有糸分裂への不全性再移 入を伴う事がある（場合によって）組織の脱分化から生じる分化性障害の治療が 提供される。このような変性性障害には、神経系の慢性神経変性性疾患（これに は、アルツハイマー（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ）病、パーキンソン（Ｐｅｒｋｉ ｎｓｏｎ’ｓ）病、ハンチントン（Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ’ｓ）舞踏病、および 筋萎縮性側索硬化症などが含まれる）、ならびに脊髄小脳性変性が含まれる。他 の変性性障害には、例えば結合組織に関連する障害（一例では、軟骨細胞もしく は骨細胞の脱分化に起因して生じることがある）、ならびに血管障害（これは内 皮組織および平滑筋細胞の脱分化に起因して生じることがある）、腺細胞におけ る変性性変化を特徴とする胃潰瘍、および分化の喪失を特徴とする腎臓症状（例 えば、ウイルムス（Ｗｉｌｍ’ｓ）腫瘍）が含まれる。表題ＣＣＲ蛋白質の遺伝 子療法構築物（例えば、アゴニストおよびアンタゴニスト形態）の一過性使用に より、組織のインビボ再構成を、例えば臓器の発達および維持の際に達成するこ とができることも明白になる であろう。様々な細胞についての増殖および分化能を制御することにより、表題 遺伝子構築物を用いて、損傷を受けた組織を再構築するか、もしくは移植した組 織の接着および形態を改善することができる。例えばＣＣＲアゴニストおよびア ンタゴニストを治療的に利用して、物理的、化学的、もしくは病理学的障害の後 に臓器を調節することができる。例えば、遺伝子療法を、部分的肝臓摘出術の後 の肝臓修復の際に利用することができるか、あるいは肺気腫の治療の際の肺組織 の修復を亢進させるのに利用することができる。 例えば以下の実施例に記載されるように、細胞の形質転換は特別なＣＣＲ遺伝 子に対する機能喪失突然変異（例えば、点突然変異から遺伝子の総体的欠失にま で至る）に一部は起因することがあり得る。それに加えて、添付される実施例に 提供される他のデータにより、ＣＣＲアゴニストでの治療に感受性である障害に は、ＣＣＲ蛋白質発現を誘導する能力を喪失してしまっている細胞から生じるも のが含まれる。例えば正常な細胞増殖は一般的には、負のオートクリン性もしく はパラクリン性成長調節因子（例えば、ＴＧＦ−βファミリーのメンバー、例え ばＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、もしくはＴＧＦ−β３）ならびに関連性ポリペ プチド成長インヒビター（例えば、アクチビン、インヒビン、ムレリア 因子、およびｖｇ１（例えば、末端分化誘導因子）への反応性を特徴とする。通 常ではこのような成長調節因子による細胞増殖の制御、特に上皮細胞および造血 細胞におけるものは、成長阻害の形態をとる。これは一般的には有糸分裂後表現 型への細胞の分化を伴う。しかしながら、これらの細胞タイプに由来する有意な パーセンテージのヒトの癌が、成長 調節因子（例えば、ＴＧＦ−β）に対する応答性の減少を示すという所見が既に 得られている。例えば、結腸直腸、肺上皮、および表皮起源の幾つかの腫瘍は、 それらの正常相対物と比較すると、ＴＧＦ−βの成長阻害性効果に対する感受性 および耐性の低下を示す。この状況では、数々の網膜芽細胞腫細胞株の顕著な特 性は、検出可能なＴＧＦ−βレセプターの非存在である。ＣＣＲアゴニスト（例 えば、遺伝子療法により輸送されるＣＣＲ蛋白質、あるいはＣＣＲ疑似物）での そのような腫瘍の治療により、ＲＢ媒介性チェックポイントの機能の回復の機会 が提供される。 しかしながら表題方法を用いて、一般的にはＲＢもしくはＲＢ様蛋白質には拘 わりなくＧ₁において活性を示すサイクリン依存性キナーゼ（例えば、ＣＤＫ４ もしくはＣＤＫ６）に関して依然としてサイレントである細胞の増殖を阻害する ことができる。 表題方法に従うと、表題ＣＣＲ蛋白質の発現構築物をいずれかの生物学的に効 果的な担体（例えば、組換えＣＣＲ遺伝子でインビボで細胞を効率的にトランス フェクトすることが可能な製剤もしくは組成物）中で投与されることがある。研 究方法には、組換えレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連性ウイルス、 および単純庖疹ウイルス−１を初めとするウイルス性ベクター、あるいは組換え 細菌性プラスミドもしくは組換え真核生物性プラスミド内への表題遺伝子の挿入 が含まれる。ウイルス性ベクターを用いて細胞を直接トランスフェクトすること ができ；プラスミドＤＮＡを、例えば陽イオン性リポソーム（リポフェクション ）、あるいは誘導化させた（例えば、抗体複合体形成させた）ポリリシン複合体 、グラミシジンＳ、人工ウイルス包膜、もしくは他のそのような 細胞内担体、ならびにインビボで実施される遺伝子構築物もしくはＣａＰＯ₄沈 殿物の直接挿入の助けを借りて輸送することができる。適切な標的細胞の形質導 入は遺伝子療法の重要な第一段階であるため、特別な遺伝子輸送系の選択は、例 えば意図される標的の表現型および投与の形態（例えば、局所的もしくは全身的 ）のような因子に依存するであろうことが認識されるであろう。 表題蛋白質の内の一つをコードする核酸の、細胞内へのインビボ組込みのため の好ましい研究方法は、その遺伝子産物をコードする核酸（例えば、ｃＤＮＡ） を含むウイルス性ベクターの使用による。ウイルス性ベクターでの細胞の感染は 、その標的細胞の大半部分がその核酸を受け取るという利点を有する。追加的に 、例えばそのウイルス性ベクター内に含まれるｃＤＮＡによりウイルスベクター 内にコードされる分子は、ウイルスベクターの核酸を取り込んでいる細胞内では 効率的に発現される。 レトロウイルスベクターおよびアデノ関連性ウイルスベクターは一般的には、 インビボ、特にヒト内への外因性遺伝子の輸送のためのえり抜きの組換え遺伝子 輸送系であるとして理解されている。これらのベクターは細胞内への遺伝子の効 率的な輸送法を提供し、かつ転移された核酸は宿主の染色体ＤＮＡ内に安定に組 込まれる。レトロウイルスの使用のための主な事前必須事項は、それらの使用の 安全性、特にその細胞集団内での野生型ウイルスの伝播の可能性に関する安全性 を確認することである。複製欠陥性レトロウイルスのみを産生する特殊化された 細胞株（「パッケージング細胞」と称される）の開発により遺伝子療法のための レトロウイルスの利用性が増大しており、かつ欠陥レトロウイルスは遺 伝子療法の目的のための遺伝子転移における使用について詳細にその特徴が決定 されている（総説に関しては、Ｍｉｌｌｅｒ，Ａ．Ｄ．（１９９０） Ｂｌｏｏ ｄ ７６：２７１、を参照されたい）。従って、レトロウイルスコーディング配 列の部分（ｇａｌ、ｐｏｌ、ｅｎｖ）が予め表題ＣＣＲ蛋白質の内の一つをコー ドする核酸により置換され、そのレトロウイルスの複製を欠陥的なものにさせて ある組換えレトロウイルスを構築することができる。その後にこの複製欠陥性レ トロウイルスをビリオン内にパッケージングし、そしてこれを用いて、標準的技 術によるヘルパー細胞の使用を通して標的細胞を感染することができる。組換え レトロウイルスを産生するため、およびインビトロもしくはインビボでそのよう なウイルスを用いて細胞を感染するためのプロトコールは、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐ ｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ 、Ａｕｓｕｂｅ ｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．） Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、（１９８９）、Ｓｅｃｔｉｏｎｓ ９．１０−９．１４ 、および他の標準的研究室用手引書に見いだすことができる。適切なレトロウイ ルスの例には、当業者に熟知されているｐＬＪ、ｐＺＩＰ、ｐＷＥ、およびｐＥ Ｍが含まれる。環境栄養性および両栄養性の両方のレトロウイルス系を調製する のに適切なパッケージングウイルス株の例には、ΨＣｒｉｐ、ΨＣｒｅ、Ψ２、 およびΨＡｍが含まれる。レトロウイルスは、様々な遺伝子を多くの異なる細胞 タイプ内にインビトロおよび／またはインビボで組込ませるのに用いられており 、それらの細胞には、神経性細胞、上皮細胞、内皮細胞、リンパ球、筋芽細胞、 肝細胞、骨髄細胞が含まれる（例えば、Ｅｇｌｉｔｉｓ，ｅｔ ａｌ．（１９８ ５） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０ ：１３９５−１３９８；Ｄａｎｏｓ ａｎｄ Ｍｉｌｌｉｇａｎ（１９８８） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５：６４６０−６４６４ ；Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５：３０１４−３０１８；Ａｒｍｅｎｔａｎｏ ｅｔ ａ ｌ．（１９９０） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８７： ６１４１−６１４５；Ｈｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９１） Ｐｒｏｃ．Ｎａ ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８８：８０３９−８０４３；Ｆｅｒｒｙ ｅｔ ａｌ．（１９９１） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８８：８３７７−８３８１；Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ ｅｔ ａｌ．（１９９１） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４：１８０２−１８０５；ｖａｎ Ｂｅｕｓｅｃｈｅｍ ｅｔ ａｌ．（１９９２） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳ Ａ ８９：７６４０−７６４４；Ｋａｙ ｅｔ ａｌ．（１９９２） Ｈｕｍａ ｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ３：６４１−６４７；Ｄａｉ ｅｔ ａｌ．（ １９９２） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：１０８ ９２−１０８９５；Ｈｗｕ ｅｔ ａｌ．（１９９３） Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５０：４１０４−４１１５；米国特許第４，８６８，１１６号、米国特許第 ４，９８０，２８６号、国際公開第８９／０７１３６号；国際公開第８９／０２ ４６８号；国際公開第８９／０５３４５号；および国際公開第９２／０７５７３ 号、を参照されたい）。 表題ＣＣＲ遺伝子のための遺伝子輸送系としてのレトロウイルスベクターを選 択する際には、大半のレトロウイルスによる標的細胞の感染を成功させるため、 およびそのため組換えＣＣＲ遺伝子の安定な組込みを 成功させるための事前必須事項は、標的細胞が分裂していなければならないとい うことであることを特筆することは重要である。一般的にはこの必須事項はＣＣ Ｒ遺伝子構築物を輸送するためのレトロウイルスベクターの使用に対する妨害物 とはならないであろう。実際のところ感染におけるこのような制約は、その標的 細胞を取り囲む組織（例えば、非形質転換化細胞）が徹底的な細胞分裂を受けず 、かつそのためレトロウイルスベクターでの感染に不応答性である状況では有益 であり得る。 それに加え、レトロウイルス、およびその結果レトロウイルスを基にするベク ターの感染スペクトラムを、そのウイルス粒子の表面上でのウイルスパッケージ ング蛋白質を改変することにより制限することが可能であることが既に示されて いる（例えば、国際公開第９３／２５２３４号、国際公開第９４／０６９２０号 、および国際公開第９４／１１５２４号を参照されたい）。例えば、レトロウイ ルスの感染スペクトラムの改変用の手法には以下のものが含まれる：細胞表面抗 原に特異的な抗体をウイルス性ｅｎｖ蛋白質にカップリングさせる手法（Ｒｏｕ ｘ ｅｔ ａｌ．（１９８９） ＰＮＡＳ ８６：９０７９−９０８３；Ｊｕｌ ａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９２） Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ ７３：３２５１− ３２５５；およびＧｏｕｄ ｅｔ ａｌ．（１９８３） Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １ ６３：２５１−２５４）；もしくは細胞表面リガンドをウイルス性ｅｎｖ蛋白質 にカップリングさせる手法（Ｎｅｄａ ｅｔ ａｌ．（１９９１） Ｊ Ｂｉｏ ｌ Ｃｈｅｍ ２６６：１４１４３−１４１４６）。カップリングは、ある蛋白 質もしくは他の様々なもの（例えば、ｅｎｖ蛋白質をアシアロ糖蛋白質に転化さ せるためのラクトース）との化学的架橋の形態で、ならびに融合蛋白質を作製す ることに より（例えば、一本鎖抗体／ｅｎｖ融合蛋白質）行うことができる。この技術は 所定の組織タイプに感染を制限するか、もしくはそうでなくとも感染を指向化さ せるのに有用であると同時に、更に環境栄養性ベクターを両栄養性ベクターに転 化するのにも用いることができる。 それに加え、レトロウイルス性遺伝子輸送法の使用は更に、そのレトロウイル スベクターのＣＣＲ遺伝子の発現を制御する組織もしくは細胞特異的転写調節配 列により亢進させることができる。 本発明に有用な他のウイルス遺伝子輸送系はアデノウイルス由来のベクターを 利用する。アデノウイルスのゲノムを、そのゲノムが目的の遺伝子産物をコード するが、そのウイルスが通常の溶菌性ウイルス生命環で複製する能力に関しては 不活化されるように操作することができる（例えば、Ｂｅｒｋｎｅｒ ｅｔ ａ ｌ．（１９８８） ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：６１６；Ｒｏｓｅｎｆｅ ｌｄ ｅｔ ａｌ．（１９９１） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：４３１−４３４； およびＲｏｓｅｎｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．（１９９２） Ｃｅｌｌ ６８：１４ ３−１５５、を参照されたい）。アデノウイルス株Ａｄタイプ５ ｄｌ３２４も しくは他のアデノウイルス株（例えば、Ａｄ２、Ａｄ３、Ａｄ７など）に由来す る適切なアデノウイルスベクターが当業者に熟知されている。組換えアデノウイ ルスは、それらが非分裂性細胞を感染することが不可能であること、および多種 多様の細胞タイプを感染するのに用いることができるという点で所定の状況下で は有利であり得、それらの細胞タイプには、気道上皮（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ ｅ ｔ ａｌ．（１９９２）、先に引用される）、内皮細胞（Ｌｅｍａｒｃｈａｎｄ ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． Ｕ ＳＡ ８９： ６４８２−６４８６）、肝細胞（Ｈｅｒｚ ａｎｄ Ｇｅｒａｒｄ （１９９３ ） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：２８１２−２８ １６）、および筋肉細胞（Ｑｕａｎｔｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９９２） Ｐｒｏ ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：２５８１−２５８４）が含 まれる。更に、このウイルス粒子は比較的安定であり、かつ精製および濃縮に適 応し、そして既述のように感染のスペクトラムに影響を及ぼすように改変するこ とができる。それに加え、組込まれたアデノウイルスＤＮＡ（およびそこに含ま れる外来性ＤＮＡ）は宿主細胞のゲノム内には組込まれはしないが、エピソーム に留まり、そのことにより、導入されたＤＮＡが宿主ゲノム（例えば、レトロウ イルスＤＮＡ）内に組込まれるという状況下での挿入性突然変異誘発の結果とし て生じる得る可能性のある問題が回避される。それに加え、外来性ＤＮＡについ てのアデノウイルスゲノムの保持能力は他の遺伝子輸送ベクターに比較して大き い（最高８キロベースまで）（Ｂｅｒｋｎｅｒ ｅｔ ａｌ．、上述；Ｈａｊ− Ａｈｍａｎｄ ａｎｄ Ｇｒａｈａｍ（１９８６） Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５７：２ ６７）。現在使用されており、かつそのため本発明にも好ましい大半の複製欠陥 アデノウイルス性ベクターは、ウイルス性Ｅ１およびＥ３遺伝子の全部もしくは 部分を欠失しているが、それでもアデノウイルス性遺伝子物質の内の８０％程を 保持している（例えば、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（１９７９） Ｃｅｌｌ １ ６：６８３；Ｂｅｒｋｎｅｒ ｅｔ ａｌ．、上述；およびＧｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ． ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ 、Ｅ．Ｊ．Ｍｕｒｒａｙ、Ｅｄ．（Ｈｕｍａｎａ、Ｃｌｉｆｔｏｎ、ＮＪ、１９ ９１） ｖｏｌ． ７．ｐｐ．１ ０９−１２７、を参照されたい）。挿入されたＣＣＲ遺伝子の発現は、例えばＥ １Ａプロモーター、主要後期プロモーター（ＭＬＰ）、および関連するリーダー 配列、Ｅ３プロモーター、もしくは遺伝子外に添加されたプロモーター配列の制 御下に置かれ得る。 表題ＣＣＲ遺伝子の輸送に有用な更に他のウイルス性ベクター系は、アデノ関 連性ウイルス（ＡＡＶ）である。アデノ関連性ウイルスは、効率の良い複製およ び生産的生命環のためのヘルパーウイルスとして他のウイルス（例えば、アデノ ウイルスもしくはヘルペスウイルス）を必要とする天然に存在する欠陥ウイルス である（総説に関しては、Ｍｕｚｙｃｚｋａ ｅｔ ａｌ． Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ ｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏ． ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９２） １５８ ：９７−１２９、を参照されたい）。このウイルスは、非分裂性細胞内にそのＤ ＮＡを組込ませることがあり、かつ高頻度の安定な組込みを示す数少ないウイル スの内の一つでもある（例えば、Ｆｌｏｔｔｅ ｅｔ ａｌ．（１９９２） Ａ ｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． ７：３４９−３５６； Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（１９８９） Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． ６３：３８ ２２−３８２８；およびＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９８９） Ｊ ．Ｖｉｒｏｌ． ６２：１９６３−１９７３、を参照されたい）。ＡＡＶの内の 僅か３００塩基対を含むベクターをパッケージングすることができ、かつそれが 組込みを行うことができる。外因性ＤＮＡのための空間は約４．５ｋｂに限定さ れている。例えばＴｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９８５） Ｍｏｌ．Ｃ ｅｌｌ．Ｂｉｏｌ． ５：３２５１−３２６０に記載されるようなＡＡＶベクタ ーを用いてＤＮＡを細胞内に導入することができる。様々な核酸が ＡＡＶベクターを用いて様々な細胞タイプ内に導入されている（例えば、Ｈｅｒ ｍｏｎａｔ ｅｔ ａｌ．（１９８４） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ． ＵＳＡ ８１：６４６６−６４７０；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ． （１９８５） Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ． ４：２０２７−２０８１；Ｗｏ ｎｄｉｓｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．（１９８８） Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ ． ２：３２−３９；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９８４） Ｊ．Ｖ ｉｒｏｌ． ５１：６１１−６１９；およびＦｌｏｔｔｅ ｅｔ ａｌ．（１９ ９３） Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２６８：３７８１−３７９０、を参照され たい）。 遺伝子療法における適用法を有する他のウイルス性ベクター系が、ヘルペスウ イルス、ワクシニアウイルス、および数々のＲＮＡウイルスから既に取得されて いる。具体的にはヘルペスウイルスベクターは、中枢神経系および眼の組織の細 胞内での組換えＣＣＲ遺伝子の存続のための独特な手法を提供することがある（ Ｐｅｐｏｓｅ ｅｔ ａｌ．（１９９４） Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏ ｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ ３５：２６６２−２６６６）。 先に説明されるようなウイルス性転移法に加え、非ウイルス方法を利用して、 ある動物の組織内にＣＣＲ蛋白質の発現をもたらすこともできる。遺伝子転移の 大半の非ウイルス法は、巨大分子の取り込みおよび細胞内輸送のための哺乳類細 胞により用いられる通常のメカニズムを頼みとしている。好ましい態様では本発 明の非ウイルス性遺伝子輸送系は、標的細胞による表題ＣＣＲ遺伝子の取り込み のためのエンドサイトーシス経路を頼みとしている。このタイプの例示的遺伝子 輸送系には、リポソーム輸送系、ポリリシン複合体、および人工ウイルス包膜が 含まれる。 代表的態様では、表題ＣＣＲ蛋白質の内の一つをコードする遺伝子を、その表 面に陽性荷電を有するリポソーム内に捕獲することができ（例えば、リポフェク ション）、そして（場合によっては）これにその標的組織の細胞表面抗原に対す る抗体を標識化させる（Ｍｉｚｕｎｏ ｅｔ ａｌ．（１９９２） Ｎｏ Ｓｈ ｉｎｋｅｉ Ｇｅｋａ ２０：５４７−５５１；国際公開第９１／０６３０９号 ；日本特許出願第１０４７３８１号；および欧州特許出願公開第４３０７５号） 。例えば、神経膠腫細胞のリポフェクションを、膠腫関連性抗原に対するモノク ローナル抗体を標識化させたリポソームを用いて実施することができる（Ｍｉｚ ｕｎｏ ｅｔ ａｌ．（１９９２） Ｎｅｕｒｏｌ．Ｍｅｄ．Ｃｈｉｒ． ３２ ：８７３−８７６）。 更に他の説明的態様では、遺伝子輸送系は、例えばポリリシンのような遺伝子 結合性作用物質に架橋形成させてある抗体もしくは細胞表面リガンドを含む（例 えば、国際公開第９３／０４７０１号、国際公開第９２／２２６３５号、国際公 開第９２／２０３１６号、国際公開第９２／１９７４９号、および国際公開第９ ２／０６１８０号、を参照されたい）。例えば表題ＣＣＲ遺伝子構築物を用いて 、ポリカチオン（例えば、ポリリシン）に複合体形成させたアシアロ糖蛋白質を 含む可溶性ポリヌクレオチド担体を用いてインビボで肝細胞をトランスフェトす ることができる（米国特許第５，１６６，３２０号を参照されたい）。媒介され るエンドサイトーシスを介する表題核酸構築物の効率的輸送を、エンドソーム構 造からの遺伝子の逸脱を亢進させる作用物質を用いて改善することができること も認識されるであろう。例えば、完全なアデノウイルス、もしくはインフルエン ザＨＡ遺伝子産物の融合誘導ペプチドを、ＤＮＡ 含有性エンドソームの効率的破壊を誘導する輸送系の部分として用いることがで きる（Ｍｕｌｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９３） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０ −９２６；Ｗａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９２） ＰＮＡＳ ８９：７９３ ４；およびＣｈｒｉｓｔｉａｎｏ ｅｔ ａｌ．（１９９３） ＰＮＡＳ ９０ ：２１２２）。 臨床的状況下では、遺伝子輸送系は多数の方法の内のいずれかにより患者内に 導入することができ、それら各方法は当該技術分野で熟知されている。例えば、 遺伝子輸送系の薬剤学的調製物を全身的に、一例では静脈内注入により導入する ことができ、そして標的細胞内での特異的形質導入が、その遺伝子輸送用伝達体 により提供されるトランスフェクションの特異性、その遺伝子の発現を制御する 転写調節配列に起因する細胞タイプもしくは組織タイプ特異的発現、もしくはそ れらの組み合わせにより優先的に生じる。他の態様では組換え遺伝子の初期の輸 送は一層制約の強いものとなり、それは動物内への極度に局在化される導入とな る。例えば遺伝子輸送用伝達体をカテーテルによるか（米国特許第５，３２８， ４７０号を参照されたい）、あるいは定位注入（例えば、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ ．（１９９４） ＰＮＡＳ ９１：３０５４−３０５７）により導入することが できる。 それに加え、薬剤学的調製物は本質的には許容される稀釈剤中に含まれる遺伝 子輸送系からできていることができるか、あるいは遺伝子輸送伝達体が包埋され ている徐放性マトリックスを含むことができる。別法では、完全な遺伝子輸送系 を組換え細胞（例えば、レトロウイルスパッケージ）から未処理の状態で産生さ せることができる場合には、その薬剤学的調製物はその遺伝子輸送系を産生する 一つもしくは複数の細胞を 含むことができる。後者の場合には、ウイルスパッケージング細胞を導入する方 法が、例えば再充填可能かもしくは生物分解性の装置により提供されることがあ る。最近では薬剤（これには、蛋白質性生物的製剤が含まれる）の制御化輸送に ついて様々な徐放性ポリマー装置が既に開発およびインビボで検査されており、 そしてそれらをポリマー性組成物および泡状物の操作を通すウイルス粒子の放出 に適用することができる。生物分解性かつ非分解性の両方のポリマーを初めとす る様々な生物適合性ポリマー（これには、ハイドロゲルが含まれる）を用いて、 特別な標的部位に移植される細胞によるウイルス粒子の持続性放出のための移植 片を形成することができる。本発明のこのような態様を、遺伝子外精製化ウイル ス（これは、予めポリマー性装置内に取り込ませてある）の輸送のためか、もし くはポリマー性装置内に被包化される細胞により産生されるウイルス粒子の輸送 のために用いることができる。 モノマー組成物もしくは重合化技術の選択により、水の量、孔径、およびその 結果生じる透過性特性を制御することができる。形状、サイズ、ポリマー、およ び移植術の方法の選択は、治療予定の障害および個々の患者の応答性に従い、個 体毎に決定することができる。このような移植片の作製は当該技術分野において 一般的に知られている。例えば、Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ ＆ Ｄｅｎｔａｌ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ、ｅｄ． ｂｙ Ｄａｖｉｄ Ｗｉｌｌｉａｍｓ（ＭＩＴ Ｐｒｅｓｓ：Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、 ＭＡ、１９９０）；およびＳａｂｅｌ ｅｔ ａｌ．米国特許第４，８８３，６ ６６号、を参照されたい。移植片の他の態様では、組換えウイルスを産生する細 胞の源は移植用中空線維内に被包化される。そのような線維を予 め紡いでおき、そしてその後にウイルス性源を充填することができるか（Ａｅｂ ｉｓｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．米国特許第４，８９２，５３８号；Ａｅｂｉｓｃｈ ｅｒ ｅｔ ａｌ．米国特許第５，１０６，６２７号Ｈｏｆｆｍａｎ ｅｔ ａ ｌ． （１９９０） Ｅｘｐｔ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ． １１０：３９−４４； Ｊａｅｇｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９９０） Ｐｒｏｇ．Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ． ８２：４１−４６；およびＡｅｂｉｓｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９１） Ｊ．Ｂｉｏｃｈ．Ｅｎｇ． １１３：１７８−１８３）、あるいはウイルスパッ ケージング細胞についてのポリマー性コートを形成するように作用するポリマー と共に同時押し出し成型することができる（Ｌｉｍ 米国特許第４，３１９，９ ０９号；Ｓｅｆｔｏｎ 米国特許第４，３５３，８８８号；Ｓｕｇａｍｏｒｉ ｅｔ ａｌ．（１９８９） Ｔｒａｎｓ．Ａｍ．Ａｒｔｉｆ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｏ ｒｇａｎｓ ３５：７９１−７９９；Ｓｅｆｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８７） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ． ２９：１１３５−１１４３；および Ａｅｂｉｓｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９１） Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ １２：５０−５５）。再度記載するが、ポリマーの操作を、ウイルス粒子の至適 放出を提供するために実施することができる。 表題方法の使用を更に詳細に説明するために、ＣＣＲ遺伝子の治療的適用法（ 例えば、遺伝子療法による）を神経膠腫の治療に用いることができる。神経膠腫 は人間の全年齢における脳腫瘍の４０〜５０％を占める。悪性神経膠腫のための 外科手術後の放射線療法、化学療法、および時としては免疫療法の使用の増加に も拘わらず、死亡率および罹患率は実質的には改善されていない。しかしながら 、有意な数の神経膠腫につ いてＴＧＦ−β応答性の喪失が、成長制御の喪失における重要な現象であるとい う強まりつつある実験的および臨床的な証拠が存在する。応答性の減少の原因に も拘わらず（例えば、ｐ１５の機能喪失、もしくは他のＴＧＦ−βシグナル伝達 蛋白質の喪失）、その細胞内でのｐ１５（もしくは他のＣＣＲ蛋白質）の外因性 発現を効果的に用いて細胞増殖を阻害することができる。 組換え蛋白質の発現のために遺伝子療法を用いて神経膠腫細胞を標的化できる ことが既に証明されている（Ｍｉｙａｏ ｅｔ ａｌ．（１９９３） Ｊ．Ｎｅ ｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ． ３６：４７２−４７９；Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（１ ９９４） ＰＮＡＳ ９１：３０５４−３０５７；およびＴａｋａｍｉｙａ ｅ ｔ ａｌ．（１９９３） Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ． ７９：１０４−１１０） 。従ってＣＣＲ蛋白質を発現するための遺伝子構築物を腫瘍内に輸送することが でき、それは好ましくは定位依存的手法により行われる。好ましい態様では、遺 伝子輸送系はレトロウイルス性ベクターである。迅速に成長する正常細胞は成体 ＣＮＳでは稀であるため、神経膠腫細胞を組換えレトロウイルスで特異的に形質 導入することができる。例えば、レトロウイルス粒子を外科手術後にオマヤ（Ｏ ｍｍａｙａ）管を通して腫瘍腔内に輸送することができるか、あるいは別法では 回収可能な免疫分離的伝達体内に被包化されるパッケージング繊維芽細胞を腫瘍 腔内に導入することができる。レトロウイルス媒介性遺伝子療法の有効性を増加 させかつその副作用を減少させる目的で、神経膠腫特異的プロモーターを用いて ＣＣＲ遺伝子の発現を調節することができる。例えば、組換え遺伝子構築物の神 経膠細胞特異的発現を指令する目的では、神経膠線維酸性蛋白質（ＧＦＡＰ）お よびミエリン塩基性蛋白質（ＭＢＰ）のプロモーター領域を操作的にその組換え 遺伝子に連結させることができる。 他の態様では遺伝子療法を、様々な癌の治療の際に表題ＣＣＲ蛋白質と組み合 わせて用いることができる。癌の中でも、ＴＧＦ−β応答性と、悪性腫瘍の性質 の増大および増殖性細胞核抗原指数の増加の両方との間に強い相関が観察されて いる（Ｃｏｆｆｅｒｙ ｅｔ ａｌ．（１９８８） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ４ ８：１５９６−１６０２：Ｍａｓｕｉ ｅｔ ａｌ．（１９８６） ＰＮＡＳ ８３：２４３８−２４４２；およびＫｎａｂｂｌｅ ｅｔ ａｌ．（１９８７） Ｃｅｌｌ ４８：４１７−４２８）。代表的な態様では、レトロウイルス性ベ クター中に表題ＣＣＲ遺伝子を含む遺伝子療法系を用いて所定の乳癌を治療する 。好ましい態様では、表題ＣＣＲ蛋白質遺伝子の発現は少なくとも哺乳類特異的 プロモーターにより部分的に制御され、多くのそのようなプロモーターが利用可 能である（総説についてはＨａｎｎｉｇｈａｕｓｅｎ（１９９０） Ｐｒｏｔｅ ｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ １：３−８ ；およびＧｏｎｚｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．（１９９２） Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ ２８３：６２５−６３２、を参照されたい）。 類似様式で、表題ＣＣＲ遺伝子の輸送に関わる遺伝子療法プロトコールを悪性 黒色腫の治療に用いることができ、このプロトコールは形質転換における進行性 ＴＧＦ−β耐性についてのモデルとしても作用する。好ましい態様では、黒色腫 の治療のための遺伝子療法プロトコールは、レトロウイルス輸送によるＣＣＲ遺 伝子構築物の輸送法に加え、その遺伝子の薬剤学的調製物の直接注入による輸送 法を含む。例えば米国特許 第５，３１８，５１４号は表皮細胞内への遺伝子の電気穿孔のための適用法を開 示しており、そしてそれを本発明に従って用いることができる。 表題ＣＣＲ遺伝子構築物を、過剰増殖性血管性障害（例えば、平滑筋過形成（ 一例では、アテローム性動脈硬化症）もしくは再狭窄）、ならびに線維症を特徴 とする他の障害（例えば、リューマチ性関節炎、インシュリン依存性糖尿病、腎 炎、肝硬変、および強皮症、特にＴＧＦ−βのオートクリン性もしくはパラクリ ン性シグナル伝達の喪失が暗示される増殖性障害）の治療に用いることができる 。 例えば再狭窄は、既に利用されている様々な機械的および薬剤学的介入法にも 拘わらず、経皮経管冠動脈形成術の効果を制約し続ける。平滑筋細胞の脈管内膜 増殖の正常制御に関わる重要なメカニズムは、平滑筋細胞内でのオートクリン性 およびパラクリン性ＴＧＦ−β阻害性ループの誘導であるように思われる（Ｓｃ ｏｔｔ−Ｂｕｒｄｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９４） Ｔｅｘ Ｈｅａｒｔ Ｉｎ ｓｔ J ２１：９１−９７；Ｇｒａｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９３） Ｃ ａｒｄｉｏｖａｓｃ Ｒｅｓ． ２７：２２３８−２２４７；およびＧｒａｉｎ ｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９３） Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ ２９４：１０９−１ １２）。ＴＧＦ−βに対する感受性の喪失、もしくは別法では例えばＰＤＧＦ自 己刺激化によるこの圧倒的阻害性刺激が、再狭窄における異常な平滑筋増殖に起 因する因子であり得る。従って、本発明のＣＣＲ遺伝子構築物での遺伝子療法の 使用により再狭窄を治療もしくは予防することが可能であるかもしれない。ＣＣ Ｒ遺伝子構築物は、ウイルス性もしくはリポソーム性輸送用組成物を用いて、例 えば経皮経管遺伝子移送により輸送することができる（Ｍａｚｕｒ ｅｔ ａｌ ．（１９９４） Ｔ ｅｘ Ｈｅａｒｔ Ｉｎｓｔ Ｊ ２１：１０４−１１１）。例示的アデノウイ ルス媒介性遺伝子移送技術、ならびに心臓もしくは血管の平滑筋の治療のための 組成物が、国際公開第９４／１１５０６号に提供される。 トランスフォーミング成長因子−βは更に、ヒトの腎臓発達および疾患におけ る局所的糸球体および間質性部位において重要な役割を担っていることも理解さ れている。その結果表題方法は、糸球体症および他の腎臓増殖性障害を治療およ び阻害し、腎臓組織内での表題ＣＣＲ蛋白質のインビボ輸送および組換え発現を 含む方法を提供する。 表題方法を用いて、網膜芽細胞腫遺伝子（ＲＢ）自体が損なわれているのでは ない（例えば、ＲＢチェックポイントの事実上の損傷がＲＢのＣＤＫ４リン酸化 を制御しないことの結果となっている）網膜芽細胞腫を治療することもできる。 従って外因性ＣＣＲ遺伝子を網膜芽細胞腫細胞内で発現させ、そのことによりＣ ＤＫ４活性化の阻害を生じさせ、かつＲＢリン酸化を負の方向に調節することが できる。説明すると、組換えレトロウイルスを構築してｐ１６もしくはｐ１５の 発現を促進させ、そして網膜芽細胞腫細胞に特異的な抗体（例えば、網膜のＳ抗 原に対する抗体）でｅｎｖ蛋白質を誘導化させることにより網膜芽細胞腫細胞の 感染性を亢進させることができる（Ｄｏｒｏｓｏ ｅｔ ａｌ．（１９８５） Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ ２６：５６０−５７２； 更にＬｉａｏ ｅｔ ａｌ．（１９８１） Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １１ ：４５０−４５４をも参照されたい；および米国特許第４，４４４，７４４号） 。 更に別の態様では、表題ＣＣＲ遺伝子を肉腫（例えば、骨肉腫もしく はカポジ（Ｋａｐｏｓｉ’ｓ）肉腫）に輸送する。代表的態様では、遺伝子がウ イルス性ベクター内に提供され、そして骨肉腫細胞に対して免疫選択性を示す抗 体で既に誘導化させてあるウイルス性粒子により輸送される（例えば、米国特許 第４，５６４，５１７号および第４，４４４，７４４号；ならびにｓｉｎｇｈ ｅｔ ａｌ．（１９７６） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ３６：４１３０−４１３６ 、を参照されたい）。 更に別の態様では、表題ＣＣＲ遺伝子は、所望されない脱分化を特徴とし、か つ所望されないアポトーシスをも受けることがある組織内で組換え法により発現 される。例えば、多くの神経学的障害が、神経性因子の個別の集団の変性に関与 している。例えば、アルツハイマー（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ）病は数々の神経 伝達系（新皮質に対する放出を行う伝達系および皮質と共に存在する伝達系の両 方）における欠損に関与している。例えば、アルツハイマー（Ａｌｚｈｅｉｍｅ ｒ’ｓ）病の患者の基底核は、年齢が対応する対照と比較するとかなりの（７５ ％）ニューロン喪失を示すという所見が得られた。アルツハイマー（Ａｌｚｈｅ ｉｍｅｒ’ｓ）病はこれまでのところ痴呆の最も一般的な形態であるものの、数 々の他の症害も痴呆を生じることができる。多くのものは加齢関連性であり、若 年者と比較すると老齢者においてはるかに高い頻度で生じる現象である。これら の内の数々のものは、中枢神経系、特に大脳皮質の様々な部分におけるニューロ ン死を特徴とする変性性疾患である。しかしながら一部の形態の痴呆は視床、も しくは大脳皮質の下層を成す白質の変性に関連している。この場合には認識不全 は、遠心性および求心性神経の変性による皮質領域の離脱により生じる。ハンチ ントン（Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ’ｓ）病は、線条体内および皮質性のコリン作動 性 ニューロンおよびＧＡＢＡ作動性ニューロンの変性に関与する。ピック（Ｐｉｃ ｋ’ｓ）病は前頭葉および前側頭葉の新皮質内の数々のニューロン変性であり、 時としては線条内でのニューロン死を伴うことがある。従って、表題ＣＣＲ遺伝 子を遺伝子療法技術により、冒された組織に輸送することができる。発現ベクタ ー、細胞性およびウイルス性トランスジーン担体の構築、ならびに神経性遺伝子 療法の標的細胞の特徴決定においては多大な進歩が既に見られており、かつそれ らを表題ＣＣＲ遺伝子の輸送に容易に適応することができることが特筆される（ 例えば、Ｓｕｈｒ ｅｔ ａｌ．（１９９３） Ａｒｃｈ Ｎｅｕｒｏｌ ５０ ：１２５２−１２６８；Ｊｉａｏ ｅｔ ａｌ．（１９９３） Ｎａｔｕｒｅ ３６２：４５０−４５３；Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ（１９９２） Ａｎｎ Ｍｅｄ ２４：４１１−４１７；およびＦｒｅｅｓｅ ｅｔ ａｌ．（１９９１） Ｎｕ ｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ １９：７２１９−７２２３、を参照されたい）。 変性誘導性痴呆に加えて、表題遺伝子治療系を都合良く振顫および不随意運動 を発症する神経変性性障害の治療に適用することができる。例えばパーキンソン （Ｐｅｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ）病は、最初に皮質下構造が冒され、そして黒質線状 体経路、縫線核、青斑核、および迷走神経運動核の変性を特徴とする。バリズム は、視床下核に対する損傷に典型的には関連しており、これは急性の血管障害に 起因することがよくある。最終的には末梢神経系の体細胞分裂を冒し、そして神 経筋性障害として発症する神経性かつ筋障害性疾患もこれらに含まれる。例には 、慢性萎縮症（例えば、筋萎縮性側索硬化症、ギラン−バレー（Ｇｕｉｌｌａｉ ｎ−Ｂａｒｒｅ）症候群、および慢性末梢神経障害）、ならびに進行性 の延髄麻痺もしくは脊髄性筋萎縮症として発症することがある他の疾患が含まれ る。それに加え、ＣＣＲ遺伝子療法構築物の使用は、筋緊張低下もしくは運動失 調をもたらす小脳の障害（例えば、その病変の同側性葉辺における障害を産生す る小脳内の病変）の治療に適用可能である。例えば、ｐ１６もしくはｐ１５遺伝 子構築物を用いて、例えばアルコール依存症患者において共通に存在する前頭葉 （小脳虫部および脚部）に関与する限定的形態の小脳皮質変性を治療することが できる。 それに加え、表題ＣＣＲ遺伝子を、末梢神経系の自律神経障害の治療にも用い ることができ、この障害には、平滑筋および内分泌組織（例えば、腺状組織）の 神経支配を冒す障害が含まれる。例えば、遺伝子療法による組換えｐ１６もしく はｐ１５の発現を用いて、心臓の横紋筋の神経支配の変性症状から生じることが ある頻脈もしくは心房不整脈を治療することができる。 本発明の更に別の態様は、表題ＣＣＲ蛋白質の内の一つもしくは複数の阻害的 制御に対して非感受性であるＣＤＫ４およびＣＤＫ６突然変異体に関する。細胞 周期制御に関し、これらの突然変異体はＣＣＲ蛋白質の作用に拮抗し、そして好 ましい態様ではそれらの突然変異体は、それらが有糸分裂制御から所定の細胞周 期チェックポイント（例えば、ＲＢもしくはＲＢ様蛋白質により媒介されるチェ ックポイント）を除去するという点では優性ネガティブ突然変異体である。例示 的なＣＤＫ４およびＣＤＫ６突然変異体が配列番号９（ＣＤＫ４）および配列番 号１０（ＣＤＫ６）において表され、これらの配列中、各々位置２４および３１ におけるＸａａは野生型酵素ではＡｒｇであり、これが突然変異を生じてＣＣＲ 蛋白質による阻害に対して非感受性とさせる。好ましい態様では、 Ｘａａはアルギニン以外のアミノ酸であるが、より好ましくは塩基性側鎖を有さ ないアミノ酸である（例えば、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、もしくはＨｉｓではない）。好 ましい態様ではこのアルギニンがシステインに変化している。 ｐ１６に結合する能力を喪失している他のＣＤＫ４突然変異体が以下の実施例 １０に記載されている。従って、ＣＤＫ４の位置２２のＸａａ（ＣＤＫ６の残基 ２９）はリシン以外のアミノ酸であることができ、好ましくは塩基性側鎖もしく は非極性側鎖を有するアミノ酸であり：ＣＤＫ４の位置９５のＸａａ（ＣＤＫ６ の残基１００）は、ヒスチジン以外のアミノ酸であることができ、かつ酸性もし くは非極性もしくは疎水性側鎖を有するアミノ酸であることが好ましく；そして 位置９７のＸａａ（ＣＤＫ６の残基１０２）はアスパラギン酸以外のアミノ酸で あることができ、かつ塩基性側鎖もしくは非極性側鎖を有するアミノ酸であるこ とが好ましい。そのようなＣＤＫ４／ＣＤＫ６突然変異体は先の突然変異体の内 のいずれかの一つもしくは複数を含むことができることが認識される。 突然変異体ＣＤＫ４およびＣＤＫ６蛋白質、そのような蛋白質をコードする遺 伝子、およびそのような蛋白質に特異的な抗体を、ＣＣＲ蛋白質の各々について 既述されるいずれかの態様に類似の様式で提供することができる。例えば、突然 変異体キナーゼをコードする核酸を、多数の内のいずれかの形態（例えば、組換 え発現ベクターならびにプローブとして）で提供することができる。その酵素の 単離形態および組換え形態の両方、ならびに各々のキナーゼの突然変異体形態に 特異的に結合する抗体が具体的に企画されている。それに加え、本適用法がＣＣ Ｒアンタ ゴニストについての利用法を記載する場合には必ず、表題ＣＤＫ突然変異体を利 用することができることが認識されるであろう。 それに加え、ＣＤＫ４のＡｒｇ→Ｃｙｓ突然変異体が黒色腫患者からの細胞内 で発見され、かつ後続のＣＤＫ４／ＣＤＫ６突然変異体をこの突然変異体に基づ くＣＤＫ４の分子モデルの分析から単離した一方で（実施例１０を参照されたい ）、先に記載されるもののような突然変異誘発技術を利用して、ＣＣＲ蛋白質阻 害に耐性を示す更に他のＣＤＫ４およびＣＤＫ６突然変異体を単離することがで きる。例えば、スキャニング突然変異誘発もしくはランダム突然変異誘発を使用 して、ＣＤＫ４もしくはＣＤＫ６阻害に対する感受性を示すアッセイを利用して 、優性ネガティブ突然変異体についてのスクリーニングを行うことができるＣＤ Ｋ突然変異体のライブラリーを作製することができる。例えば、ＣＤＫ４突然変 異体のライブラリーを、ｐ１６を過剰発現し、かつ結果として静止状態を取る細 胞内へトランスフェクトすることができる。ｐ１６／ｐ１５からＣＤＫ４突然変 異体を脱共役させる突然変異体の非存在下では、細胞は静止状態でい続けるであ ろう。それとは対照的に、ｐ１６からそれ自体の活性を脱共役させるキナーゼに 対する突然変異体は、ＣＤＫ４のその突然変異体を発現する細胞の増殖をもたら すであろう。類似の態様では、リン酸化ＲＢのレベルを用いてＣＤＫ４の優性ネ ガティブ突然変異体を、例えば、リン酸化ＲＢの免疫検出か、もしくはその発現 がＲＢのリン酸化状態に依存するＲＢ感受性レポーター構築物の使用により検出 することができる（例えば、Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ．（１９９４） Ｊ Ｂｉｏ ｌ Ｃｈｅｍ ２６９：６０８３−６０８８；Ｏｕｅｌｌｅｔｔｅ ｅｔ ａｌ ．（１９９２） Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ７：１０７ ５−１０８１；およびＳｌａｃｋ ｅｔ ａｌ．（１９９３） Ｏｎｃｏｇｅｎ ｅ ８：１５８５−１５９１、を参照されたい）。ＣＤＫ４のｐ１６／ｐ１５阻 害を脱共役させる突然変異体は、その細胞中に一層高レベルのリン酸化ＲＢ蛋白 質を蓄積させるであろう。 本発明の他の態様は、ＣＤＫ４／ＣＤＫ６のＣＣＲ結合性ポケットの発見に関 する。以下の実施例１０に記載されるように、我々は点突然変異および分子モデ リングにより、ＣＤＫ４の残基 Ｋ２２、Ｒ２４、Ｈ９５、およびＤ９７（ＣＤ Ｋ６のＫ２９、Ｒ３１、Ｈ１００、およびＤ１０２）によって少なくとも部分的 に決定される表面が、ＣＣＲ蛋白質（例えばｐ１６）のための結合性ポケットを 特定することを証明した。この結合性ポケットはＣＤＫ４の小突出部内に存在し 、そのキナーゼのためのＡＴＰ結合性部位に非常に近接しており、ｐ１６による そのポケットへの結合は、ＣＤＫ４／ＣＤＫ６のＡＴＰ結合性部位を遮断もしく は破壊するようである。従って本発明は、ＣＤＫ蛋白質の三次元分子モデル、お よびそのキナーゼの少なくとも一つの生物学的活性を阻害することが可能な作用 物質の設計のための鋳型としてのそれらの使用に関する。ＣＤＫ４もしくはＣＤ Ｋ６のＣＣＲ様インヒビターを設計するための研究方法への最初の段階は、ｐ１ ６結合部位へのＣＣＲ蛋白質の結合を模倣することを基にする合理的薬剤設計に より薬剤用支持体を設計するのに用いることができるキナーゼのコンピューター グラフィックモデルの構築を必要とする。例えば、至適状態でキナーゼと相互作 用するためのインヒビターについては、そのインヒビターは一般的には、その酵 素のｐ１６結合性部位のものに少なくとも部分的には相補的である形状を有する ことが所望されるであろう。追加的には、静電的相互作用、水素結 合、疎水性相互作用、脱溶媒効果、ならびにリガンドと酵素との共同的運動を初 めとする他の因子も全てその結合性効果に影響を及ぼし、かつ生物活性性インヒ ビターを設計することを試みる際には考慮に入れられるべきである。 表題酵素のコンピューター作製化分子モデルを作製することができる。好まし い態様では、ＣＤＫ４もしくはＣＤＫ６の少なくともＣα−炭素の位置を特別な 座標値パターン（例えば、ＣＤＫ２の座標値）（ＤｅＢｏｎｄｔ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｎａｔｕｒｅ ３６３：５９５−６０２；Ｅｎｄｉｃｏｔｔ ｅ ｔ ａｌ．（１９９４） Ｐｒｏｔ Ｅｎｇ ７：２４３−２５３；およびＭｏ ｒｇａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９４） Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ ｌ ６：２３９−２４６）に対して相同性モデリングによりマッピングし、そし てそのキナーゼの構造および各原子の回転数を、ドッキングシュミレーションが 決定される予定のシュミレーション温度（Ｔ_o）下で算出する。典型的にはその ようなプロトコールは第一にはモデル化キナーゼにおける側鎖立体配座の予測を 必要とすると同時に、例えばＣＤＫ２構造により提供される三次構造から得られ る主鎖トレースの仮定を行う。エネルギー最小化ルーチンを実施するためのコン ピュータープログラムが分子モデルを作製するのに一般的に用いられている。例 えば、ＣＨＡＲＭＭ（Ｂｒｏｏｋｓ ｅｔ ａｌ．（１９８３） Ｊ Ｃｏｍｐ ｕｔ Ｃｈｅｍ ４：１８７−２１７）およびＡＭＢＥＲ（Ｗｅｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８１） Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ｃｈｅｍ．１０６：７６５）の両方 のアルゴリズムは、分子システムのセットアップ、力の場の計算、および分析の 全てを処理する（Ｅｉｓｅｎｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．（１９９１） Ａｍ Ｊ ＰｈｙＳｉｏｌ ２６１：Ｃ３７６−３８６；Ｌｙｂｒａｎｄ （ １９９１） Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｂｅｌｇ ４６：４９−５４；Ｆｒｏｉｍｏｗｉ ｚ （１９９０） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ８：６４０−６４４；Ｂｕｒ ｂａｍ ｅｔ ａｌ．（１９９０） Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ７：９９−１１１；Ｐ ｅｄｅｒｓｅｎ （１９８５） Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｈｅａｌｔｈ Ｐｅｒｓｐｅ ｃｔ ６１：１８５−１９０；およびＫｉｎｉ ｅｔ ａｌ．（１９９１） Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｔｒｕｃｔ Ｄｙｎ ９：４７５−４８８、も参照された い）。これらのプログラムのハートがサブルーチンのセットである時点では、こ れらのプログラムはそのモデル中の全ての原子の位置が供給されれば、そのシス テムの全ポテンシャルエネルギーおよび各原子における力を算出する。これらの プログラムは、原子座標値のスターティングセット（例えば、ＣＤＫ２のための モデル座標値）、ポテンシャルエネルギー関数の様々な項のためのパラメーター 、および分子トポロジーの記載（共有結合型構造）を利用することがある。この ような分子モデリング法の一般的な特徴には：水素結合および他の拘束力を処理 するための手段；周期的境界条件の使用；および温度、圧力、体積、拘束力、も しくは他の外部的に制御される条件を保持もしくは変化させる目的で位置、回転 数、もしくは他のパラメーターを臨時に調節するための手段、が含まれる。 大半の通常のエネルギー最小化法は先に記載されるインプットデータおよびポ テンシャルエネルギー関数はカーテシアン（Ｃａｒｔｅｓｉａｎ）座標値の明示 の微分可能関数であるという事実を用いて、分子の位置のいずれかのセットにつ いてのポテンシャルエネルギーおよびその勾配（これにより、各原子における力 が得られる）を算出する。この情報 を用いて、総体的ポテンシャルエネルギーを減少させる試みの際に新規の座標値 セットを作製することができ、そしてこの過程を幾度も反復することにより、所 定の外部条件のセット下でその分子構造を至適化することができる。これらのエ ネルギー最小化法をルーチンで、ＣＤＫ４およびＣＤＫ６に類似する分子、なら びに核酸、ポリマー、およびゼオライトに適用させる。 一般的にはエネルギー最小化法を、ドッキングシュミレーション温度Ｔ_oとは 異なるであろう所定の温度Ｔ_iについて実施することができる。Ｔ_iでの分子のエ ネルギー最小化の際には、そのシステム中の全原子の座標地および回転数がコン ピューターにより算出される。それに加え、このシステムの通常モードが算出さ れる。各通常モードは集団的周期的運動であり、このシステムの全部分は位相中 を互いに移動し合い、かつ分子の運動は全通常モードの累積であることは当業者 により認識されるであろう。所定の温度については、特別なモードにおける運動 の平均二乗振幅はそのモードについての有効力定数に逆比例し、その結果その分 子の運動は低周波の振動により支配されることがよくあるであろう。 分子モデルのエネルギー最小化をＴ_iにて実施した後には、このシステムを、 シュミレーション温度Ｔ_oにまで「加熱」させるかもしくは「冷却させる」が、 それは所望される温度Ｔ_oが達成されるまで原子の回転数が段階的様式で概算さ れる平衡作動を実施することにより行われる。このシステムを、そのシステムの 所定の特性（例えば、平均熱エネルギー）が定常状態に留まるまで特異的期間の 間、更に平衡化させる。その後に各原子の座標値および回転数が平衡化システム から取得される。 更に進んだエネルギー最小化法を実施することができる。例えば、第 二の種類の方法は、蛋白質についての拘束ＥＯＭに対しておおよその回答を算出 することを必要とする。これらの方法は、ラグランジェ（Ｌａｇｒａｎｇｅ）乗 数を解くための反復方法を用い、そして典型的には必要とされる修正が小さけれ ば僅かな反復のみを必要とするに過ぎない。このタイプの最も一般的な方法であ るＳＨＡＫＥ（Ｒｙａｃｋａｅｒｔ ｅｔ ａｌ．（１９７７） Ｊ Ｃｏｍｐ ｕｔ Ｐｈｙｓ ２３：３２７；およびＶａｎ Ｇｕｎｓｔｅｒｅｎ ｅｔ ａ ｌ．（１９７７） Ｍｏｌ Ｐｈｙｓ ３４：１３１１）は容易に実施すること ができ、かつ拘束数が増加するに連れてＯ（Ｎ）としての概算を行う。従ってこ の方法を目的のＣＤＫ蛋白質のような巨大分子に適用することができる。別の方 法であるＲＡＴＴＬＥ（Ａｎｄｅｒｓｏｎ（１９８３） Ｊ Ｃｏｍｐｕｔ Ｐ ｈｙｓ ５２：２４）は、バーレット（Ｖｅｒｌｅｔ）アルゴリズムの回転数変 法に基づく。ＳＨＡＫＥ同様、ＲＡＴＴＬＥは反復アルゴリズムであり、そして これを用いて表題蛋白質のモデルのエネルギー最小化を行うことができる。 結晶解析により既に解明されている有望な薬剤用支持体分子の生物巨大分子構 造の有用性が増加することにより、分子設計のための様々な直接的コンピュータ ー方法の開発が促進され、そのような方法では基質結合性部位の立体的および電 子的特性を用いてＣＤＫ４および／またはＣＤＫ６の有望なインヒビターの設計 が指示される（Ｃｏｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９０） Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃａｍ． ３３：８８３−８９４；Ｋｕｎｔｚ ｅｔ ａｌ．（１９８２） Ｊ．Ｍｏｌ ．Ｂｉｏｌ． １６１：２６９−２８８；ＤｅｓＪａｒｌａｉｓ（１９８８） Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃａｍ． ３１：７２２−７２９：Ｂａｒｔｌｅｔｔ ｅｔ ａｌ ． （１９８９）（Ｓｐｅｃ．Ｐｕｂｌ．、Ｒｏｙ．Ｓｏｃ．Ｃｈｅｍ）７８：１８ ２−１９６；Ｇｏｏｄｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．（１９８５） Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃａ ｍ． ２８：８４９−８５７；ＤｅｓＪａｒｌａｉｓ ｅｔ ａｌ． Ｊ．Ｍｅ ｄ．Ｃａｍ． ２９：２１４９−２１５３）。直接法は一般的には２つの範疇に 分類され、それらは：（１）既知の分子の３−Ｄ構造（例えば、結晶解析データ ベースからのもの）を酵素構造にドッキングさせ、そして適合度についての概算 を行う分析法による設計；および（２）リガンドモデルを酵素中で部分的に構成 するデノボ設計、である。後述の研究方法は具体的には、キナーゼＣＣＲ結合性 部位に結合するように特別に設計された新規の分子の開発を容易にさせることが できる。 説明的態様では、有望なＣＤＫ４／ＣＤＫ６インヒビターの設計はｐ１６結合 性部位に相補的な形状の一般的調査から始まり、そしてその標的結合性部位内に 幾何学的に適合する候補物について既知の三次現構造の小分子のデータベースを スキャンすることが可能な調査用アルゴリズムが利用される。形状調査で見いだ された分子自体が必ず最善のものであろうということは期待されず、それはこの 最初の調査では必要とされる化学的相互作用の評定が全く行われていないためで ある。むしろ、そのような候補物は更に別の設計のための骨格として役立つこと があり、適切な原子置換を行うことができる分子骨格を提供することが予期され る。当然のことながら、これらの分子の化学的相補性を評価することができるが 、原子タイプを交換すればその酵素との静電的、水素結合的、および疎水性相互 作用が最小限になるであろうことが予期される。このタイプの大半のアルゴリズ ムにより、表題キナーゼのｐ１６結合性部位 の形状に相補的である多種多様の化学構造を発見するための方法が提供される。 特別なデータベース（例えば、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａ ｐｈｉｃ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ（ＣＣＤＢ）（Ａｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９ ７３） Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｄｏｃ． １３：１１９）からの各セットの小分子を個 別に、ドッキングアルゴリズムを用いて多数の幾何学的に許容される配向でその キナーゼのｐ１６結合性部位にドッキングさせる。好ましい態様ではＤＯＣＫと 称されるコンピューターアルゴリズムセットを用いてＣＤＫ蛋白質のｐ１６認識 表面から陥入および溝の形状の特徴決定をすることができる（Ｋｕｎｔｚ ｅｔ ａｌ．（１９８２） Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． １６１：２６９−２８８）。 このプログラムは更に、その形状がその酵素のｐ１６結合性部位に相補的である 鋳型のための小分子のデータベースを検索することもできる（ＤｅｓＪａｒｌａ ｉｓ ｅｔ ａｌ．（１９８８） Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ ３１：７２２−７２ ９）。これらの鋳型は通常は、良好な化学的および静電的相互作用を達成するた めの改変を必要とする（ＤｅｓＪａｒｌａｉｓ ｅｔ ａｌ．（１９８９） Ａ ＣＳ Ｓｙｍｐ Ｓｅｒ ４１３：６０−６９）。しかしながらこのプログラム は形状拘束にのみ基づくインヒビターについての既知の補助因子を的確に配置す るに過ぎないことが既に示されている。 配向は適合度について評定され、そして最善のものを分子メカニズムプログラ ム（例えば、ＡＭＢＥＲもしくはＣＨＡＲＭＭ）を用いる更に詳細な検査用に保 存しておく。このようなアルゴリズムは既に、レセプター−酵素の所定の結合性 部位に、形状的に相補性を示す様々な分子を見いだすのに成功していることが既 に判明しており、かつ数々の魅力的 特性を有することが既に示されている。第一に、このようなアルゴリズムは顕著 に多様化した分子構築物を検索することができる。第二に、最高の構造は他の蛋 白質に対して事前に適用させる際に、延長された表面領域にわたり印象的な形状 相補性を有することが既に示されている。第三に、この総体的研究方法は候補原 子の位置決定における微細な不確定性に関しては非常に大きな許容量を持つもの であるように思われる。 Ｇｏｏｄｆｏｒｄ（１９８５、Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ ２８：８４９−８５７ ）およびＢｏｏｂｂｙｅｒら（１９８９、Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ ３２：１０８ ３−１０９４）は、探索を行って結合部位の分子表面上で様々な化学基（プロー ブと称される）に対する高親和性の領域を決定するコンピュータープログラム（ ＧＲＩＤ）を既に産生している。従ってＧＲＩＤは、結合性を亢進させるであろ う既知のリガンド（例えば、ｐ１６など）への改変を示唆するための道具を提供 する。高親和性の領域としてＧＲＩＤにより識別された部位の内の幾つかは、一 連の既知のリガンドから推論的に決定された「薬剤用支持体パターン」に相当す ることが予期されることがある。本明細書で用いられる場合には「薬剤用支持体 パターン」は、結合性にとって重要であると考えられる予期されるリガンドの特 性の幾何学的配置である。従って、表題ＣＣＲ蛋白質の短い重複性ペプチジル部 分を、ＣＤＫ４もしくはＣＤＫ６について特定されるｐ１６結合性部位に結合す る能力についてスキャンすることができる。 本発明の更に別の態様は、立体化学的に許容され、かつ候補分子と周辺アミノ 酸残基との間の好ましい化学的相互作用を達成する高い確率を有するという両方 が満たされる様式でレセプター結合性部位内に配向す ることができる小分子についてＣＣＤＢのようなデータベースを検索するコンピ ューターアルゴリズム（例えば、ＣＬＩＸ）を利用する。この方法は、異なる化 学基に好ましいアンサンブルの結合位置に関するキナーゼのｐ１６結合性部位の 特徴決定、およびその後の、そのアンサンブルのメンバーと個々の候補化学基の 至適空間一致を生じる候補分子の配向についての検査に基づく。現在利用可能な コンピューターパワーは、新規のリガンドについてのコンピューターを基にする 調査が幅至上手法をとることを要求する。幅至上手法は、上昇ストリンジェント 基準の適用により有望な候補検索空間のサイズを徐々に減らすことが目的であり 、一つの候補物の最大限に詳しい分析を次の過程の以前に実施する奥行き至上手 法とは相反する。ＣＬＩＸは、その結合性分析が基本的なものであるという点で この手法に一致し、ＣＬＩＸは、好ましい結合性相互作用が実際に生じる十分な 条件を課すことなく、立体化学的に適合し、かつ結合性にとっての「正しい」位 置に個々の基が配置される必要条件を満たすような探索を行う。分子の好ましい 配向で整列させた「ショートリスト」がコンピューターグラフィックスおよびよ り洗練された分子モデリング技術を用いて産生され、これをその後に分子毎に調 査することができる。ＣＬＩＸは更に、そのキナーゼのｐ１６結合性ポケットに 対する結合性を亢進させるでかもしれない候補分子の置換用化学基に対する変化 を示唆することも可能である。 ＣＬＩＸのアルゴリズムの詳細は、Ｌａｗｅｒｅｎｃｅら（１９９２） Ｐｒ ｏｔｅｉｎｓ １２：３１−４１において記載されており、そしてＣＬＩＸアル ゴリズムを以下のようにまとめることができる。ＧＲＩＤプログラムは、多種多 様の代表的化学基について、そのキナーゼのｐ １６結合性部位中の個別の好ましい相互作用配置（標的部位と称される）を決定 するのに用いられる。ＣＣＤＢにおける各候補リガンドについては、その蛋白質 の結合部位における空間的意味において、候補物の置換用化学基のペアとＧＲＩ Ｄにより提唱される対応する好ましい相互作用部位のペアとを一致させるための 徹底的な試みが行われる。リガンド基のペアとＧＲＩＤ部位のペアとの全可能な 組み合わせが、この操作中には考慮される。このような一致位置の決定の際には 、このプログラムはその２対の基に関して候補リガンドを回転させ、そして立体 化学的障害および適切な標的部位と他の候補原子団との一致についてのチェック を行う。結合性部位において良好な幾何学的適合性を示し、かつ原子団がＧＲＩ Ｄと十分な一致を示す特別な候補物／配向性の組み合わせを確保する。 幅至上手法に一致して、この研究方法は仮説を単純化させることを必要とする 。蛋白質および小分子の硬質幾何学的配置が全体を通して維持される。最初の近 似として硬質幾何学的配置が容認されるが、それはＣＤＫ４もしくはＣＤＫ６の 演繹構造のエネルギー最小化座標値は局在的なものであるにも拘わらずその分子 にとってのエネルギー最小値を示すためである。ＣＬＩＸに内在する更に詳細な 仮説は、有望なリガンドは、それがキナーゼのｐ１６結合性部位内に導入される 際には、その蛋白質の立体化学もしくは部分的帯電分布における変化を誘導し、 そしてそのためＧＲＩＤ相互作用エネルギーマップがコンピューター的に算出さ れたベースを変化させることがないということである。ＧＲＩＤにより予測され る相互作用部位は位置的およびタイプ的な意味においてのみ用いられるに過ぎず 、すなわち候補原子団がＧＲＩＤにより好ましいとして 予測された部位に配置される際には、結合の幾何学的配置、プロトン化の状態、 もしくは部分的帯電分布がその蛋白質とその基との間の強固な相互作用を確実に 有利にさせているということについてのチェックは全く行われないということも 強調すべきである。このような詳細な分析は、、ＣＬＩＸショートリストにおい て同定された候補物の一層高度なモデリングの部分から取得すべきである。 ＣＤＫ４もしくはＣＤＫ６の特異的インヒビターを同定するためのコンピュー ター関連の分子設計法の更に他の態様は、その酵素のｐ１６結合性部位との所望 される構造的および静電的相補性を呈するであろう小分子断片のアルゴリズム的 結合による有望なインヒビターのデノボ合成を含む。この方法は小分子の巨大鋳 型セットを利用し、これがＣＤＫ４／ＣＤＫ６ ｐ１６結合性部位のモデルにお いて互いに連続的につなぎ合わされる。リガンド成長の各段階は、分子メカニズ ムを基にするエネルギー関数に従って評定され、この関数は、ファンデルワール ス（ｖａｎ ｄｅｒ Ｗａａｌｓ）およびクーロン相互作用、伸長化させたリガ ンドの内部歪みエネルギー、ならびにリガンドと酵素の両方の脱溶媒化を考慮す る。調査空間は、その結合性基準に従う簡潔化による制御下に保持されるデータ ツリーの使用により管理することができる。 説明的態様ではこの調査空間は、分子構築用ブロックとしてのアミノ酸および アミノ酸アナログのみを考慮するに限定される。このような方法は一般的にアミ ノ酸立体配座の巨大鋳型セットを利用するが、これを２０の天然アミノ酸のみに 限定する必要はなく、それはその鋳型セットは医薬品分野の化学者にとっての目 的となる他の関連する断片（例えば、アミノ酸アナログ）を含むように簡便に拡 張することができるためであ る。この構築法から得られる仮想的リガンドは、典型的には薬剤設計研究の目標 である小有機分子よりはむしろ、ペプチドおよびペプチド様化合物となる。この ペプチド構築研究法の魅力は、ペプチドが有望な薬剤学的作用物質としては有機 物よりも好ましいということではなく、むしろ：（１）それらを比較的迅速にデ ノボで作製することができ；（２）それらのエネルギーを詳細にパラメーターが 決定されている力の場の方法により検査することができ；（３）それらは大半の 有機物と比較するとその合成がはるかに容易であり；そして（４）それらをペプ チド疑似性インヒビター設計、蛋白質−蛋白質結合性研究のため、および更には 既述のより一般的に用いられる３Ｄ有機物データベース調査研究法における形状 鋳型として、多様な方法で用いることができるということである。それに加え、 本明細書に記載されるＣＣＲ蛋白質配列に実質的には由来するであろうペプチジ ル断片を利用することができる。 このようなデノボペプチド設計法はＧＲＯＷと称されるソフトウエアーパッケ ージ内に取り込まれている（Ｍｏｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９１） Ｐｒｏｔｅ ｉｎｓ １１：３１４−３２８）。典型的な設計セッションでは、標準的相互作 用のグラフィックモデリング方法を利用して、ＧＲＯＷが操作される構造的環境 が特定される。例えば、この環境はＣＤＫ４のｐ１６結合性部位であるか、ある いはユーザーがペプチド様分子（例えば、ＣＤＫ４の残基Ｋ２２、Ｒ２４、Ｈ９ ５、およびＤ９７）を結合することを希望する蛋白質表面における特性セットで あることがある。その後にＧＲＯＷプログラムを作動させて、有望なリガンド分 子セットを作製する。その後に相互モデリング法が、得られた分子の調査のため 、および更に進んだ精製のためのそれらの内の一つもしくは複数 の選択のために再度作動し始める。 説明すると、ＧＲＯＷは、ユーザーにより作製された原子座標ファイルについ て、相互作用モデル形成セッションで作動し、その座標値とは例えば、ＣＤＫ４ の相同性モデリングにより提供される座標値、もしくはペプチド成長のための出 発地点を提供するためにｐ１６結合部位内に配置される小断片（例えばアセチル 基）を伴うｐ１６結合部位の単純な座標値である。これらは各々「部位」原子お よび「種」原子として引用される。ユーザーにより提供される第二ファイルは、 ペプチド成長を指示するための多数の制御パラメーターを含む（Ｍｏｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９１） Ｐｒｏｔｅｉｎｓ １１：３１４−３２８）。 ＧＲＯＷアルゴリズムの操作は概念的にはかなり単純である。ＧＲＯＷは反復 様式で進行して体系的に種断片を、事前に構築されているアミノ酸立体配置の大 きなライブラリー中の各アミノ酸鋳型に連結させる。鋳型が連結すると、レセプ ター部位への適合度が概算され、そしてその後にそのライブラリー中の次の鋳型 がその種に結合する。全鋳型が検査された後に、最高の概算値を記録したものの みを次のレベルの成長用に確保する。この過程が第二成長レベルについて反復さ れ；各ライブラリー鋳型が順次、第一段階から確保された結合化種／アミノ酸分 子の各々に連結され、そしてその後に概算が行われる。再度、得られる結合化種 ／ジペプチド分子の内の最高のもののみを第三レベルの成長用に確保する。ペプ チドの成長はＮからＣの方向にのみ、逆方向のみ、もしくは交互の方向で、ユー ザーにより供給された初期制御特定値に依存して進行することができる。従って 連続的成長レベルにより、一つの残基分伸長させたペプチドが作製される。この 過程はユーザーが特定したペプチド の長さが達成された時点で停止され、その際にユーザーは更に詳細な研究を行う 予定のものを構築されたペプチドから選択することができる。ＧＲＯＷ方法によ り提供された得られたデータは残基の長さおよび概算値のみでなく、レセプター 部位の原子の座標系に直接関連するそのペプチドの原子座標値をも含む。 更に他の態様では、有望な薬剤用支持体化合物を、ＣＤＫのｐ１６結合部位内 の官能基のエネルギー的に好ましい位置を決定するためのエネルギー最小化クエ ンチ型分子力学アルゴリズムに基づく方法を用いて決定することができる。この 方法は、既知のリガンドの改変もしくはデノボ構築によりそのような官能基を取 り込む分子の設計を目的とすることができる。 例えば、Ｍｉｒａｎｋｅｒら（１９９１） Ｐｒｏｔｅｉｎｓ １１：２９− ３４により記載される多重コピー同時調査方法（ＭＣＳＳ）を利用することがで きる。その蛋白質の力の場での官能基の局在的極小値を決定および特徴決定する ためには、選択された官能基の多重コピーを最初に目的のＣＤＫ蛋白質のｐ１６ 結合性部位内に分散させる。分子メカニズムもしくは量子力学によるこれらのコ ピーのエネルギー最小化により厳密な局在的極小値が得られる。その後にこれら の極小値の近傍をグリッドサーチもしくは条件付最小化により探索することがで きる。ある態様ではＭＣＳＳ法は、その蛋白質の力の場内の多くの同一の基を同 時に最小化もしくはクエンチさせるために古典的時間依存性ハーティー（Ｈａｒ ｔｅｅ）（ＴＤＨ）近似を用いる。 ＭＣＳＳアルゴリズムの実施は、官能基および各官能基からの分子メカニズム モデルの選択を必要とする。基は特徴決定および操作が容易で あるように十分に単純である必要があるが（３〜６原子、自由度がほとんど無い かもしくは上反角では自由度が全く存在しない）、キナーゼのｐ１６結合部位に 結合する際にその官能基が示すであろう立体的および静電的相互作用を近似する に十分な程には複雑である必要がある。好ましいセットは例えば、大半の有機分 子をそのような基の集合物として記載することができるものである（Ｐａｔａｉ ’ｓ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ ｔｈｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｆｕｎｃｔｉｏ ｎａｌ Ｇｒｏｕｐｓ、ｅｄ．Ｓ．Ｐａｔａｉ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ（１９８９））。これには、アセトニトリル、メ タノール、アセテート、メチルアンモニウム、ジメチルエーテル、メタン、およ びアセトアルデヒドが含まれる。 結合部位での局在的エネルギー極小値の決定は、多くの出発用位置がサンプリ ングされることを必要とする。このことは、例えば１，０００〜５，０００の基 をランダムに、その結合部位の中央に位置する球の内側に分布させることにより 達成することができ；蛋白質により占領されていない空間のみを考慮する必要が ある。所定の位置の特別な基の、その蛋白質との相互作用エネルギーが、所定の カットオフエネルギー（例えば、５．０ｋｃａｌ／モル）と比較して陽性となる 場合には、その基はその部位から棄却される。出発位置のセットを設定すれば、 全断片は、ＴＤＨ近似の使用により同時に最小化される（Ｅｌｂｅｒ ｅｔ ａ ｌ．（１９９０） Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ １１２：９１６１−９１７５ ）。この方法においては各断片にかかる力は、その内部力およびその蛋白質に起 因する力でできている。この方法の本質的要素は、断片間の相互作用が省略され 、かつその蛋白質にかかる力が、単一断片に起因 するものに標準化されていることである。このような方法で、その場におけるい ずれの数の官能基の同時最小化もしくは力学的処理を実施することができる。 最小化はランダムに配置された基の内のサブセット（例えば、１００の）にお いて連続的に実施される。所定の数の段階間隔（例えば、１，０００の間隔）後 に結果を調査して、同一最小値に収束する基を除去することができる。この過程 は最小化が完結するまで反復される（例えば、０．０１ｋｃａｌ／モル／ÅのＲ ＭＳ勾配）。従って、得られるエネルギー最小化分子セットは、有望な薬剤用支 持体を表す三次元での細切れ断片のセットに等しいものを含む。 従って次の段階は、その薬剤用支持体の断片を小化学物単位（原子、鎖、もし く環部分）から組み立てられるスペーサーと連結させることである。好ましい態 様では、例えば、ＮＥＷＬＥＡＤ（Ｔｓｃｈｉｎｋｅ ｅｔ ａｌ．（１９９３ ） Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ ３６：３８６３−３８７９）のようなコンピュータ ープログラムを用いて各々の細切れ断片をスペーサーに連結させて単一分子を作 製することができる。ＮＥＷＬＥＡＤにより採用される方法は、以下の一連のコ マンドを実施し、それらは、（１）２つの単離された部分の連結、（２）更に進 んだ処理のためのその中間体溶液の確保、（３）細切れ単位が見いだされなくな るまでのその中間体溶液の各々についての先の段階の反復、および（４）最終溶 液のアウトプット、であり、これら各々は単一分子である。このようなプログラ ムを例えば、３つのタイプのスペーサー、すなわち；ライブラリースペーサー、 単一原子スペーサー、および融合環スペーサーについて使用することができる。 ライブラリースペーサーは小分子（例 えば、エチレン、ベンゼン、およびメチルアミド）の構造を至適化させる。例え ばＮＥＷＬＥＡＤのようなプログラムにより産生されるアウトプットは、現時点 ではスペーサーにより連結されたもともとの断片を含む分子セットでできている 。インプット断片に属する原子は、空間内では各自のもともとの配向を維持して いる。これらの分子はスペーサーおよび官能基の単純成型物であるため化学的に はもっともらしく、かつファンデルワールス（ｖａｎ ｄｅｒ Ｗａａｌｓ）半 径禁則での溶液の拒絶のためエネルギー的に許容される。 本発明の更に他の態様は、ＣＣＲ蛋白質（例えば、ｐ１６もしくはｐ１５）に 対する感受性が予め付与されているＣＤＫ突然変異体に関する。例えば、通常は ｐ１６に結合しないＣＤＫ２もしくはＣＤＣ２が、そのキナーゼの所定の残基の 、ＣＤＫ４（これはｐ１６結合に関与する）からの対応残基との置換によりｐ１ ６阻害に対して感受性を示すようになる。例えば図７に説明されるように、β１ 、β２、β３、β４、β５、もしくはＬ７に対応するＣＤＫ４の部分を、ｐ１６ 感受性ＣＤＫを取得する目的でＣＤＫ２もしくはＣＤＣ２内に交換移入させるこ とができる。このような突然変異体を用いて、例えば、ＣＣＲ蛋白質の発現によ り細胞周期の他の地点での阻害をインビトロもしくはインビボのいずれかで行う ことができる組換え細胞を作製することができる。 実施例 本発明はこの場では一般的に記載されており、単に本発明の所定の特徴および 態様の説明の目的で含まれ、かつ本発明を制限することは意図されない以下の実 施例を参照することにより一層容易に理解されるであろう。 以前に記載されるように（米国特許第０８／１５４，９１５号、第０７／９９ １，９９７号、および第０７／９６３，３０８号、ならびにＸｉｏｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９３） Ｎａｔｕｒｅ ３６６：７０１；Ｘｉｏｎｇ ｅｔ ａｌ ． （１９９３） Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ ７：１５７２；Ｘｉｏｎｇ ｅｔ ａ ｌ． （１９９２） Ｃｅｌｌ ７１：５０５；およびＺｈａｎｇ ｅｔ ａｌ ．（１９９３） Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ４：８９７）、真核生物細胞内 で様々な有望な触媒的サブユニット（例えば、ＣＤＫ（複数）、例えばＣＤＫ２ 、ＣＤＫ４、およびＣＤＫ５）にサイクリンが関与することを確証するのに免疫 学的方法が用いられてきた。説明すると、ヒトサイクリンＤ１は多種多様な増殖 性疾患に関与している。ヒトの二倍体細胞、具体的にはヒト二倍体繊維芽細胞で は、サイクリンＤ１は多数の他の細胞性蛋白質と複合体形成している。中でもそ れらは、サイクリンサブユニットＣＤＫ２、ＣＤＫ４（以前はＰＳＫ−Ｊ３と呼 ばれていた）、ＣＤＫ５（ＰＳＳＡＬＲＥとも称される）、およびＣＤＫ６（Ｐ ＬＳＴＩＲＥ）である。それに加え、サイクリンＤ１と連結する２１ｋＤａおよ び３１ｋＤａのポリペプチドが同定された。この３１ｋＤａ蛋白質は増殖性細胞 核抗原（Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ Ｃｅｌｌ Ｎｕｃｌｅａｒ Ａｎｔｉｇ ｅｎ）ＰＣＮＡであることが示された。ＰＣＮＡはデルターポリメラーゼに対す る必須アクセサリー因子として既に記載されており、このデルターポリメラーゼ はリーディング鎖ＤＮＡ複製およびＤＮＡ修復に必要とされる。サイクリンＤ３ も、複数の蛋白質キナーゼ、ｐ２１およびＰＣＮＡと結合することが見いだされ た。従って、Ｄタイプのサイクリン、ＣＤＫ、ＰＣＮＡ、およびｐ２１の四重複 合体が存在すること、および 多くの組み合わせ変異体（サイクリンＤ１、Ｄ３と、ＣＤＫ２、４、５、および ６）がインビボで集結することがあるということが提唱された。 この四重複合体の重要性は、ＤＮＡ腫瘍ウイルスによる細胞性形質転換がサイ クリンＤ複合体ならびに他の細胞周期複合体（これには、サイクリンＡ、ＣＤＣ ２、ＣＤＫ２、ＣＤＫ４、およびＣＤＫ５複合体が含まれる）の選択されたサブ ユニット再構成に関わるという発見により強調されている。具体的には、ＳＶ４ ０ ＤＮＡ腫瘍ウイルスもしくはその腫瘍遺伝子産物である巨大Ｔ抗原の正常ヒ ト二倍体繊維芽細胞（ＨＤＦ）内への組込みにより、サイクリンＤと、ＰＣＮＡ 、ＣＤＫ（複数）（例えば、ＣＤＫ２、ＣＤＫ４、ＣＤＫ５、およびＣＤＫ６） と、ｐ２１との間の結合の破壊がもたらされる。例えば、サイクリンＤおよびｐ ２１からの解離の後には、ＣＤＫ４キナーゼは１６ｋＤａポリペプチド（ｐ１６ ）と結合するようになる。同様にＳＶ４０形質転換は、ＨＤＦでのｐ２１のサイ クリンＡとの結合の減少をもたらし；そしてアデノウイルス−（２９３細胞株） もしくはヒトパピローマウイルス−（ＨｅＬａ細胞株）で形質転換した細胞内で は、ｐ２１はサイクリンＡから完全に解離している。１９ｋＤａペプチドである ｐ１９がその後にサイクリンＡとの複合体として出現する。 従って、多くの形質転換細胞では、サイクリンおよびＣＤＫは二成分複合体と して結合し、この複合体は細胞周期調節機構のコアを形成する。正常細胞では、 サイクリンキナーゼの主要分画は２つの追加的サブユニット（ｐ２１およびＰＣ ＮＡ）を獲得し、そしてそのことにより四重複合体を形成する。昆虫細胞内での 四重複合体の再構成により、ｐ２１はサイクリンキナーゼの万能型インヒビター であることが示された。それ自 体ではｐ２１は哺乳類細胞中での過剰発現の際の細胞周期の進行および細胞増殖 を阻害する。欠陥ｐ５３を有する細胞の細胞周期キナーゼ複合体中でのｐ２１の 非存在が既に記載されているが、このことを合わせて考慮すると、これらの結果 により、ｐ２１は腫瘍抑制蛋白質ｐ５３の転写標的であることが示唆される。ｐ ５３の一つの機能は、細胞性シグナル伝達経路内で作用することであり、このこ とがＤＮＡ損傷の後の細胞周期拘束をもたらす（例えば、Ｋａｓｔａｎ ｅｔ ａｌ． Ｃｅｌｌ ７１：５８７−５９７、１９９３、を参照されたい）。従っ て、ｐ２１がｐ５３と細胞周期制御機構との間での重要な連結部を形成すること が示唆される。 サイクリンＤ／ＣＤＫ４キナーゼは、基質としてヒストンＨ１を利用すること が不可能である点で他のものとは異なる。今日までにはサイクリンＤ／ＣＤＫ４ キナーゼについて知られる唯一の基質はＲＢファミリーの「ポケット」蛋白質の メンバーのみである（Ｍａｔｓｕｓｈｉｍｅ ｅｔ ａｌ．、Ｃｅｌｌ ７１： ３２３−３３４（１９９２））。従ってｐ２１の効果は、サイクリンＤ／ＣＤＫ ４がＲＢをリン酸化する能力について検査される。サイクリンＤもしくはＣＤＫ ４を単独で含む昆虫細胞溶解物は、ＧＳＴ−ＲＢに対しては殆ど活性を示さない 。しかしながらサイクリンＤ／ＣＤＫ４二重複合体は実質的なＲＢリン酸化の触 媒作用を実施した。増加量のｐ２１の添加により、サイクリンＤ／ＣＤＫ４／ｐ ２１三重複合体の蓄積と共に対応するＲＢリン酸化の阻害が生じた。ＰＣＮＡの 関与は本質的には何の影響も及ぼさなかった。しかしながら機能性ｐ５３を欠失 する細胞はそれでも、内因性ｐ２１の欠失にも拘わらず特異的リン酸化を受ける 機能的ＲＢチェックポイントを保持す ることがある。 二重ハイブリッドスクリーニング系（Ｆｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕ ｒｅ ３４０：２５４（１９８９））が、ヒトＣＤＫ４と相互作用することがで きる蛋白質についての調査、およびより具体的にはｐ１６をコードするｃＤＮＡ を単離するのに利用された。二重ハイブリッドスクリーニングは２つの個別の融 合蛋白質からの機能的ＧＡＬ４活性化因子の再構成を頼りにしており；そしてＧ ＡＬ４活性化ドメインはＨｅＬａ ｃＤＮＡ、ＧＡＬ４ａｄ−ｃＤＮＡによりコ ードされる蛋白質に融合される。ＹＰＢ２がレシピエントイーストとして用いら れたが、それはそのイーストが２つの異なるＧＡＬ４依存性プロモーター：ＨＩ Ｓ３およびＬａｃＺの制御下に２本の染色体遺伝子を含む株であるためである。 ＹＰＢ２を各々がＧＡＬ４ｄｂ−ＣＤＫ４およびＧＡＬ４ａｄ−ｃＤＮＡ融合体 をコードする２つのプラスミドの混合物で形質転換させ；ヒスチジンの非存在下 で成長し、かつβ−ｇａｌの存在下で青色に変化する幾つかのクローンが取得さ れた。ＤＮＡ配列データから、各陽性クローンは同一遺伝子に由来するものの、 一つの群は短めの３’末端を有するｍＲＮＡであることが決定された。これらの ｃＤＮＡの配列はＧＡＬ４ａｄと同一相内に、１５，８４５ダルトンの予想分子 量を有する１４８アミノ酸からなる蛋白質をコードする読み取り枠を含む（例え ば、配列番号１および２を参照されたい）。ｐ１６の配列を標準法により現在利 用可能なデータバンク内に存在する配列と比較し、そして有意な相同性は全く見 いだされなかった。 ｐ１６が特異的にＣＤＫ４に結合するかどうかを検査するには、ＹＰＢ２をＧ ＡＬ４ａｄ−ｐ１６融合物ならびに、各々ｃｄｃ２、ＣＤＫ２、 ＣＤＫ４、ＣＤＫ５、ＰＣＮＡ、およびＳｎｆ１（分裂イーストキナーゼ）を含 む数々の標的ＧＡＬ４ｄｂ融合構築物と同時形質転換させた。形質転換化細胞を ヒスチジン存在下および非存在下でプレート培養した。ＧＡＬ４ｄｂ−ＣＤＫ４ 融合物のみがヒスチジンの非存在下で成長を可能にさせる程度にＧＡＬ４ａｄ− ｐ１６と相互作用し、このことにより融合蛋白質のこの組み合わせが特異的に機 能的ＧＡＫ４活性化因子（これはＨＩＳ３遺伝子の発現を亢進させることが可能 である）を再構成させた。β−ガラクトシダーゼ遺伝子の発現をトランス活性化 させる能力をアッセイした際に同一結果が得られた。 この相互作用の特異性は更に無細胞系内で証明されたが、それは翻訳された（³⁵ Ｓ）−ラベル化ＣＤＫを、ｐ１６（１７）に連結させたグルタチオン−Ｓトラ ンスフェラーゼ（ＧＳＴ）を含んでなる細菌産生性の精製化融合蛋白質とインビ トロで混合させることによる。ＧＳＴ−ｐ１６融合物をグルタチオン−セファロ ースビーズへの結合により回収し、そして各ＣＤＫの結合をゲル電気泳動により 分析した。先の所見と一致し、ＧＳＴ−ｐ１６はｃｄｃ２、ＣＤＫ２、もしくは ＣＤＫ５への結合と比較すると一層効果的にＣＤＫ４に結合した。 ｐ１６の予想分子量は１６Ｋｄに近いため、形質転換化細胞株（先を参照され たい）内に見いだされるＣＤＫ４結合化ｐ１６蛋白質としてのｐ１６の同一性が 決定された。１５ＫＤおよび１７ＫＤの２つのインビトロ翻訳産物がｐ１６ ｃ ＤＮＡから取得された。これらの産物、ならびにＨｅＬａ細胞からのＣＤＫ４− 結合化ｐ１６蛋白質をＮ−クロロスクシンイミドで処理した。１７ＫＤ ｃＤＮ Ａ由来の産物の部分的ＮＣＳ−蛋白質分解パターンは、ＨｅＬａ細胞からのＣＤ Ｋ４−結合化ｐ１ ６蛋白質に関して取得されるパターンに非常に類似しており、このことによりｐ １６ ｃＤＮＡが実際にｐ１６に対応することが強く示唆された。１７ＫＤ ｃ ＤＮＡ由来の産物およびｐ１６のＶ８プロテアーゼでの部分的消化によっても類 似のパターンが取得された。昆虫細胞内で過剰発現されるｐ１６蛋白質が１５Ｋ Ｄの電気泳動的移動度を有し、そしてそのＮＣＳ蛋白質分解マップが１５ＫＤ ｃＤＮＡ由来の産物に関して取得されるものと同一であることを特筆することは 興味深い。このことにより、ヒト細胞中に見いだされる実際のｐ１６および１７ ＫＤインビトロ翻訳産物は、翻訳後改変を受けた蛋白質に相当することが示唆さ れる。昆虫細胞内で過剰発現されるｐ１６蛋白質がＣＤＫ４と相互作用するとい う事実により、この改変はその相互作用に必須ではないことが示唆される（以下 を参照されたい）。 ｐ１６と、ＣＤＫ４−結合化蛋白質ｐ１６との同一性を更に、精製化ＧＳＴ− ｐ１６融合蛋白質に対して作製した抗体を用いて確認した。この実験のためには 数々のヒト細胞株を用い、それらは：正常細胞株ＷＩ３８（正常な肺繊維芽細胞 から取得される）；ＳＶ４０ Ｔ−抗原での形質転換によりＷＩ３８から取得さ れるＶＡ３８細胞株；およびＨｅＬａ細胞であった。先に記載したように、ＷＩ ３８の抗−ＣＤＫ４免疫沈降により、ＣＤＫ４のサイクリンＤ１、ＰＣＮＡ、ｐ ２１、およびｐ１６との結合が示された。それとは対照的に、ＶＡ１３およびＨ ｅＬａ細胞中ではＣＤＫ４はｐ１６とのみ結合したに過ぎなかった。抗−ｐ１６ 免疫沈降物は１６ＫＤの見かけの分子量を有する蛋白質を含み、この蛋白質は２ つの形質転換化細胞株、ＶＡ１３およびＨｅＬａにおいては容易に検出されたが 、正常細胞株ＷＩ３８では検出強度は劣っていた。こ の蛋白質は抗−ＣＤＫ４血清で同時免疫沈降させたｐ１６蛋白質と同一の電気泳 動的移動度を示すばかりでなく、同一のＮＣＳ部分蛋白質分解パターンを有して いた。ｐ１６に加え、３３Ｋｄの蛋白質が抗−ｐ１６同時免疫沈降物中に観察さ れ、この蛋白質はＶ８−蛋白質分解マッピングによりＣＤＫ４と同一であること が示された。 ＷＩ３８およびＶＡ１３内に存在する転写物のノザン分析により、ｐ１６ ｍ ＲＮＡはＶＡ１３細胞に比較してＷＩ３８細胞中ではその量がおおよそ数倍低下 しているということが示された。この違いはその２つの細胞株間のｐ１６蛋白質 の量において見いだされる違いにほぼ対応しており、このことによりｐ１６発現 が転写もしくは転写後レベルで調節されているかもしれないという可能性が示唆 された。実際のところ、ウイルスで形質転換させていない細胞株内ではｐ１６の 発現はゲル上での過剰露出後でさえも検出することができなかった。 ｐ１６とＣＤＫ４との相互作用の生化学的結果を検討するために、活性を示す ＣＤＫ４−サイクリンＤ複合体を標準プロとコールにより予めインビトロで再構 成させた（Ｋａｔｏ ｅｔ ａｌ． Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｒ ７：３３１（１９９ ３）；およびＥｗｅｎ ｅｔ ａｌ． Ｃｅｌｌ ７３：４８７（１９９３）） 。３つの関連する構成成分、ＣＤＫ４、ｐ１６、およびサイクリンＤ１がバキュ ロウイルス感染化昆虫細胞内で発現された。抽出物は、ｐ１６、ＣＤＫ４、もし くはサイクリンＤ１を個別に過剰発現する代謝的（³⁵Ｓ）−ラベル化昆虫細胞か ら、ならびにＣＤＫ４およびサイクリンＤ１の両方を過剰発現する細胞から調製 した。増加量のｐ１６に応答して、ＲＢをリン酸化するＣＤＫ４の能力の付随的 減少が観察された。この阻害は、免疫沈降により検出したとこ ろによるとｐ１６とＣＤＫ４との間の結合に関連していた。ＣＤＫ２−サイクリ ンＤ２複合体を類似アッセイに用いた際には阻害は全く観察されなかった。ＣＤ Ｋ４の阻害がｐ１６に起因することを確認するために、Ｈｉｓ−標識化ｐ１６融 合蛋白質（Ｈｉｓ−ｐ１６）を、６つのヒスチジン残基の領域を含む２０のアミ ノ酸のアミノ末端伸長部分を有するように作製した。この融合蛋白質をバキュロ ウイルス感染化昆虫細胞内で過剰発現させ、そしてニッケル−アガロースビーズ に対するヒスチジン領域の高親和性結合により精製した。このＨｉｓ−ｐ１６蛋 白質調製物は＞９０％の純度を示し、そして全溶解物による阻害について用いた ものと類似の条件下でＣＤＫ４−サイクリンＤ１複合体の活性を阻害した。 網膜芽細胞腫遺伝子産物（ＲＢ）の役割は、ある段階の蛋白質の原因である転 写因子を少なくとも封鎖するように作用するように思われる細胞周期チェックポ イントとしてのものであると思われる。多くの癌ではｐ５３機能が突然変異もし くは欠失により失われている。一方でＲＢは明らかに変化を受けていないことが 殆どである。しかしながらｐ１６はＣＤＫ４／サイクリンＤ複合体（これはＲＢ をリン酸化するように作用する）を負の方向に調節するため、本明細書では所定 の癌におけるｐ１６の喪失がＲＢチェックポイントの効果を緩和し、そして別の 表現ではｐ５３喪失に類似するチェックポイント欠損症となり得る。ｐ１６の喪 失によりＲＢのより効果的なリン酸化がもたらされ、そしてそのため細胞周期の ＲＢ媒介性阻害が除去されるであろう。この概念と一致して、これ以降に、様々 なヒトの癌細胞（例えば、Ｄタイプのサイクリン（一例では、サイクリンＤ１も しくはＤ２）を過剰発現する細胞）ではｐ１６遺伝子がその細胞から喪失されて いる（例えば、ホモ接合性の欠失を 生じている）。 それに加えて以下の実施例に記載されるように、ｐ１６遺伝子はヒトの領域９ ｐ２１−２２（これは既知の黒色腫遺伝子座である）にマップされることが見い だされている（Ｗａｌｋｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９４） Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ９：８１９；Ｃｏｌｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９４） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅ ｓ ５４：３４４；Ｃｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９３） Ｃａｎｃｅｒ Ｒ ｅｓ． ５３：４７６１；およびＣａｎｎｏｎ−Ａｌｂｒｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ ．（１９９２） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５８：１１４８）。染色体マッピングは更 に、ＰＣＲ増幅（図２Ａのプライマーｅｘ１Ａおよびｅｘ１３を用いる）を通し ての体細胞ハイブリッドの分析により確認した。ヒト第１９染色体を含む体細胞 ハイブリッドにより陽性ＰＣＲ産物の増幅がもたらされた。 ヒトｐ１６のｃＤＮＡ配列（配列番号１）から作製されたプライマー（これは 図１に示される）を利用して、ゲノムｐ１６遺伝子の部分的配列決定を行って、 イントロン／エキソン境界を決定した。エキソン１およびエキソン２（図１を参 照されたい）をフランクする核酸のおおよその配列を各々図２Ａおよび２Ｂ、な らびに３Ａ〜Ｄに示す。 ゲノムＤＮＡを様々なヒト腫瘍株から単離し（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎ ｕａｌ、ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ （１９８９））、そしてｐ１６配列の存在もしくは非存在についてＰＣＲ反応に よる探索を行った。具体的にはプライマーｅｘ１Ａおよびｅｘ１３（図２Ａ）を 用いてｐ１６のエキソン１についての評定を行い、そしてプライマーｅｘ１４お よびｅｘ１５を同 様に用いてｐ１６のエキソン２を検出した。図４に示されるように、ｐ１６遺伝 子は様々な腫瘍細胞株内では破壊されており、このことによりｐ１６が実際に所 定の癌細胞における細胞形質転換にとって重要であるらしいことが確認された。 それに加え、全長ｐ１６ ｃＤＮＡ（配列番号１）でのこれらの細胞株の探索に より、これらの細胞の内の少なくとも３つは明らかにｐ１６遺伝子の一部分を欠 失しており、その全遺伝子が実際には非存在であった。 抗−ｐ１６抗体での免疫沈降実験、ならびにオリゴヌクレオチドハイブリダイ ゼーションアッセイに基づき、配列番号２により表されるｐ１６蛋白質は関連す る細胞周期調節蛋白質の巨大ファミリーの内の単なる一メンバーに過ぎないこと が明らかになった。例えば、高緊縮性条件下でさえも、様々な組織タイプからの ｍＲＮＡのサザンハイブリダイゼーション実験により、約４つの密接に関連する 転写物が産生されることが示された。これらのｐ１６相同体はＣＣＲ蛋白質ファ ミリーのメンバーであり、遺伝子重複（例えば、個別の遺伝子から生じるＣＣＲ 蛋白質）によるか、もしくはｍＲＮＡレベルでの別のエキソンスプライシングか らか、あるいはそれらの組み合わせ物から生じたのかもしれない。 ヒトｐ１６遺伝子のコーディング領域でできているプローブを用いることで、 我々はマウス胎仔幹細胞ライブラリーのスクリーニングを行い、そして先に記載 されるヒトｐ１６遺伝子のマウス相同物のためのコーディング領域を含むゲノム クローンを単離した。このクローンは低緊縮性から中程度の緊縮性条件下（１× ＳＳＣ、５０℃）で単離された。このＤＮＡ（１４ｋＢ）を２つの個別の断片と してクローン化し、９の制限エンドヌクレアーゼについての制限マップ作製を実 施した（図５を参照さ れたい）。マウスＣＣＲ遺伝子の完全な配列決定を実施し、そしてコーディング 領域はサザン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ）ハイブリダイゼーションによると制限マップ 内に位置するわずか２つのエキソンでできているらしい。マウスＣＣＲ蛋白質の 見かけの分子量は１３．５ｋＤａであり、そしてそのマウスＣＣＲ蛋白質（本明 細書では「ｐ１３．５」と称される）の核酸およびアミノ酸配列が各々配列番号 ５および６に示される。 それに加え、ヒトｐ１６クローンとマウスｐ１３．５クローンとの間（例えば 、ヒトｐ１６の残基Ｍｅｔ−５２〜Ｇｌｙ−１３５と、マウスｐ１３．５のＭｅ ｔ−１〜Ｇｌｙ−８３との間）で最も高度に保存される配列に基づく縮重プロー ブを利用することで、我々は多数のヒトおよびマウスｐ１６相同体（例えば、マ ウスｐ１５相同体（配列番号７および８））を単離した。 それに加え、ＴＧＦ−β処理により、リン酸化不全状態のＲＢの蓄積、および ＴＧＦ−β誘導性細胞周期拘束を妨害するＲＢ不活化ウイルス性癌蛋白質の発現 が生じることが既に特筆されている（Ｌａｉｈｏ ｅｔ ａｌ．（１９９０） Ｃｅｌｌ ６２：１７５−１８５；およびＰｉｅｔｅｎｐｏｌ ｅｔ ａｌ．（ １９９０） Ｃｅｌｌ ６１：７７７−７８５）。従来の刊行物は、ＴＧＦ−β 処理がＣＤＫ４発現の負の調節をもたらすことを示唆しているが（Ｅｗｅｎ ｅ ｔ ａｌ．（１９９３） Ｃｅｌｌ ７４：１００９−１０２０）、このデータ は我々にとってはＴＧＦ−βがＲＢリン酸化の抑制を通して機能することを示唆 しており、かつＴＧＦ−β処理の内の一つの結果はサイクリン依存的キナーゼの 阻害であるかもしれない可能性を示している。 従って、ＴＧＦ−βが細胞増殖を阻害するメカニズムを調査するため に、我々はＴＧＦ−βへの露出により予めＧ１で拘束させてあるヒト表皮細胞か らの抗−ＣＤＫ免疫沈降物を調査した。顕著なことに、２つのＧ１特異的サイク リンキナーゼ、ＣＤＫ４およびＣＤＫ６の免疫沈降物は低分子量の幾つかの結合 化蛋白質を含んでいた。これらにはｐ１６、ならびに約１５および１５．５ｋＤ ａの２つの追加的蛋白質が含まれていた。これらの蛋白質はＣＤＣ２もしくはＣ ＤＫ２免疫沈降物中では同時には回収されなかったが抗−ｐ１６免疫沈降物中で は回収され、このことによりｐ１５、ｐ１５．５、およびｐ１６は関連している かもしれないことが示唆される。このことをＣＤＫ４およびＣＤＫ６免疫沈降物 のウエスタンブロットにより確認し、この実験によりｐ１５およびｐ１５．５が ｐ１６抗血清と弱い交差反応性を示すことが証明された。 仮想的ｐ１６関連物をコードするクローンを単離するために、我々はＴＧＦ− β拘束化ＨａＣａＴ細胞（Ｂｏｕｋａｍｐ ｅｔ ａｌ． （１９８８） Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １０６：７６１−７７１）からｃＤＮＡライブラリーを構 築し、そしてそのライブラリーを低緊縮性下でｐ１６コーディング配列（配列番 号１）を用いて探索した。このスクリーニングで取得された一つのクローンはｐ １６との相同性を示す１３７アミノ酸蛋白質（予想分子量、１４．７ｋＤａ）を コードしていた。この相同性および以下に記載される生化学的特性に基づき、我 々はこの蛋白質をｐ１５と命名した。ｐ１５およびｐ１６の最初の５０アミノ酸 は約４４％の相同性を共有する。この後には約９７％同一な８１アミノ酸領域が 続き（図６を参照されたい）、この後にはｐ１５およびｐ１６の配列は分岐する 。ｐ１５の配列は４つのアンキリン反復構造に分断することができ、このことに よりこの構造モチーフがＣＣＲ蛋白質ファミリ ー内で保存されることが示唆される。ｐ１５ ｃＤＮＡのインビトロ翻訳により 、ＴＧＦ−β拘束化ＨａＣａＴ細胞からのＣＤＫ４、ＣＤＫ６、およびｐ１６免 疫沈降物内に存在するｐ１５バンドと正確に同時遊走する蛋白質が産生された。 これらの蛋白質の同一性は、プロテアーゼおよび化学的開裂マッピングにより確 認された。 ｐ１５とｐ１６との機能的類似性を調査するために、我々はｐ１５を細菌内で 融合蛋白質として発現させ、そしてそれがサイクリン依存的キナーゼに結合しか つ阻害する能力を検査した。ｐ１５は特異的にＣＤＫ４およびＣＤＫ６に結合し たが、ＣＤＣ２、ＣＤＫ２、もしくはＣＤＫ５とは感知できる程の結合を示さな かった。結合性の結果を評価するためにｐ１５を昆虫細胞内で発現される活性サ イクリン／ＣＤＫ複合体に添加した。ｐ１５はサイクリンＤ／ＣＤＫ４およびサ イクリンＤ／ＣＤＫ６酵素を特異的に阻害したが、ＣＤＫ２／サイクリンＡキナ ーゼには何の効果も及ぼさなかった。従ってｐ１５はＣＣＲ蛋白質ファミリーの 機能的メンバーである。更に、ｐ１５遺伝子のＦＩＳＨマッピングにより、この 遺伝子が９ｐ２１ではｐ１６遺伝子に近接して存在することが示された。 我々は最初にＴＧＦ−βの存在下での血清枯渇および再刺激化によりＧ１で予 め拘束させてあるＨａＣａＴ細胞からの免疫沈降物中のｐ１５について記載した が、比較により我々は、非同調性で迅速増殖性のＨａＣａＴ細胞はＣＤＫ４およ びＣＤＫ６免疫沈降物中にかなり低レベルのｐ１５を含むことを見いだした。Ｔ ＧＦ−β処理の効果をＧ１拘束の効果から分離するために、非同調性培養物を様 々な期間ＴＧＦ−βで処理し、その後にＣＤＫ４およびＣＤＫ６結合化蛋白質の パターンを調査し た。ＴＧＦ−β添加後４時間という短時間では、ｐ１５レベルはＣＤＫ４および ＣＤＫ６免疫沈降物中で上昇し、６〜８時問後にピークレベルに到達した。それ とは対照的に、ＣＤＫ結合化ｐ１６レベルはＴＧＦ−βによる影響は受けなかっ た。同時に処理した培養物からのＲＮＡのノザンブロット分析により、ＣＤＫ４ 結合化ｐ１５の増加はｐ１５ ｍＲＮＡの量の増加を反映することが明らかにな った。ＴＧＦ−β処理後２時間目にｐ１５ ｍＲＮＡが上昇し始め、そして６〜 ８時間後には約３０倍のピーク誘導に至った。それとは対照的に、ｐ１６ ｍＲ ＮＡレベルは変化を示さなかった。 ＴＧＦ−β媒介性細胞周期拘束についての他の２つのメカニズムが既に報告さ れている。ＭｖｌＬｕ細胞ではＴＧＦ−β処理はＣＤＫ４合成を抑制した。これ は細胞がＣＤＫ４の構造的過剰発現によりＴＧＦ−βに対して耐性を示すように なったために生じたものと思われる。ＨａＣａＴ細胞ではＴＧＦ−β処理はＣＤ Ｋ４蛋白質もしくはｍＲＮＡレベルに何の影響も及ぼさなかった。ｐ１５の特徴 に基づき我々は、ＣＤＫ４の過剰発現はｐ１５ ＣＤＫ４／ＣＤＫ６インヒビタ ーを滴定することによりＨａＣａＴ細胞をＴＧＦ−β耐性にさせることがあるこ とも予測していた。ＴＧＦ−β拘束化細胞から精製されたＣＤＫインヒビターで あるｐ２７も更に、ＴＧＦ−βと細胞周期制御との間の関連物質であるとして既 に提唱されている。しかしながらＨａＣａＴ細胞ではＴＧＦ−β処理はｐ２７ ｍＲＮＡレベルには何の効果も及ぼさなかった。従って、ｐ２７が示すかもしれ ないこれらの細胞中でのＴＧＦ−β媒介性細胞周期拘束へのいずれかの寄与は、 翻訳後レベルでの調節により生じるに違いない。 まとめて考えると、我々のデータはｐ１５が、ＣＤＫ４およびＣＤＫ６キナー ゼの阻害を介するＴＧＦ−β媒介性細胞周期拘束のエフェクターとして機能する かもしれないことを示唆している。ｐ１５は一部の細胞におけるＴＧＦ−β誘導 化拘束の単一の媒介物であるかもしれないし、あるいは他のＴＧＦ−β反応性経 路と共同作用を行うかもしれない。ＴＧＦ−βは一部の細胞タイプでは分化を調 節することができ、そしてＴＧＦ−βがｐ１５を通して細胞周期の進行に影響を 与える能力もやはりそれらの過程に寄与することがある。 その上、９ｐ２１での細胞遺伝学的異常は多くのタイプのヒトの腫瘍に共通で あり、このことによりこの遺伝子座での腫瘍抑制遺伝子の存在が示唆される。黒 色腫への疾病素因を生じる遺伝性癌症候群も９ｐ２１にマップされる。本明細書 、ならびに米国特許第０８／２４８，８１２号および第０８／２２７，３７１号 に示される我々のデータに加え、ｐ１６はもともと細胞株内でのｐ１６欠失およ び点突然変異の分析に基づき、それらの活性の両方についての候補物として提唱 されている。しかしながら９ｐ２１におけるｐ１６ファミリーの第二の機能的メ ンバーの存在により、腫瘍抑制の喪失がいずれかもしくは両方の遺伝子の不活化 に関与するかもしれない可能性が浮上してきている。ウイルス性癌蛋白質に対す るｐ１６の応答により、ｐ１６が細胞内成長調節経路内で機能するかもしれない ことが示される一方で、本明細書に示される結果はｐ１５が細胞外成長阻害シグ ナルを変換するかもしれないことを示唆している。従って両方の遺伝子を除去す る９ｐ２１の欠失（もしくは両方の遺伝子を不活化する他の突然変異）は２つの 主要な増殖制御経路を同時に無効にするかもしれない。これに関連して、ＴＧＦ −βが成長拘束を 誘導する能力が、多くの新生物的形質転換を生じている細胞株では減少もしくは 喪失されている。具体的にはメラニン形成細胞はＴＧＦ−βによる成長阻害に対 して感受性を示すが、多くの転移性黒色腫細胞はＴＧＦ−β耐性である。 実施例１ ＤＮＡ腫瘍ウイルスもしくはその癌遺伝子産物による細胞性形質転換に関連する 細胞周期複合体の選択的サブユニット再構成の証明 （ｉ）細胞周期複合体のサブユニット再構成に関連するＤＮＡ腫瘍ウイルスＳＶ ４０での細胞性形質転換 ［³⁵Ｓ］メチオニン−ラベル化細胞溶解物の調製およびポリアクリルアミドゲ ルは先に記述される要領および国際公開第９２／２０７９６号に記載される要領 であった。細胞溶解物を、ヒト正常二倍体繊維芽細胞ＷＩ３８もしくはＤＮＡ腫 瘍ウイルスＳＶ４０形質転換化ＷＩ３８細胞であるＶＡ１３のいずれかから調製 した。細胞溶解物は各細胞周期遺伝子産物に対する抗体で免疫沈降化させた。 （ｉｉ）２つの異なる対細胞株での細胞周期複合体のサブユニット再構成 細胞溶解物の調製のための方法は先に記載したものと同一である。２つの異な る対細胞株をこれらの実験に用いた。ＨＳＦ４３は正常なヒト二倍体繊維芽細胞 株であり、そしてＣＴ１０（正式名称はＣＴ１０−２Ｃ−Ｔ１である）はＳＶ４ ０巨大腫瘍抗原により形質転換させたＨＳＦ４３の誘導体である。ＣＶ−１はア フリカングリーンモンキー（Ａｆｒｉｃａｎ ｇｒｅｅｎ ｍｏｎｋｅｙ）の腎 臓細胞株であり、そしてＣＯＳ−１はＳＶ４０により形質転換させたＣＶ−１の 誘導体である。 （ｉｉｉ）細胞周期複合体のＰＣＮＡサブユニットの再構成に関連するＤＮＡ腫 瘍ウイルスＳＶ４０による細胞性形質転換 細胞溶解物の調製、電気泳動、およびウエスタン（Ｗｅｓｔｅｒｎ）ブロット 条件は先に記載されたものと同一であった。正常ヒト二倍体繊維芽細胞株および それらのＳＶ４０形質転換化細胞株は先に記載されるものである。各抗体に由来 する免疫沈降物をポリアクリルアミドゲル上で分離し、そして抗−ＰＣＮＡ抗体 でブロットした。 （ｉｖ）細胞周期複合体のＣＤＫ４サブユニットの再構成に関連するＤＮＡ腫瘍 ウイルスＳＶ４０による細胞性形質転換 細胞溶解物の調製、電気泳動、およびウエスタン（Ｗｅｓｔｅｒｎ）ブロット 条件は先に記載されたものと同一である。正常ヒト二倍体繊維芽細胞株およびそ れらのＳＶ４０形質転換化細胞株は先に記載されるものである。各抗体に由来す る免疫沈降物をポリアクリルアミドゲル上で分離し、そして抗−ＣＤＫ４抗体で ブロットした。 実施例２ ＣＤＫ４活性のインヒビターであるｐ１６のクローニング （ｉ）二重ハイブリッドアッセイを用いるｐ１６のクローニング サッカロミセス ケレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉ ｓｉａｅ ）ＹＰＢ２細胞を、ＧＡＬ４ｄｂ−ｐ１６融合物を含むプラスミド、な らびに各々ｃｄｃ２（ＣＤＫ１）、ＣＤＫ２、ＣＤＫ４、ＣＤＫ５、ＰＣＮＡ（ 増殖性細胞核抗原）に融合させたＧＡＬ４ａｄ、および分裂イーストキナーゼＳ ｎｆ１を含むプラスミドで同時に形質転換させた。両方のプラスミドについて選 択的な培地（マイナス トリプトファンかつマイナス ロイシン）中で細胞を成 長させた後、２つ のコロニーをランダムに拾いあげ、そしてヒスチジンを含むかもしくは欠損する かのいずれかのプレート内で画線培養した。ヒスチジンの非存在下で成長する能 力はＧＡＬ４応答性プロモーター下に存在するＨＩＳ３遺伝子の発現に依存し、 そしてそのため機能的ＧＡＫ４活性化因子が、ｐ１６とそれに対応する標的蛋白 質との相互作用を通して再構成されたことが示される。 （ｉｉ）ｐ１６ ＣＤＫの相互作用 精製した細胞産生性ＧＳＴｐ１６融合蛋白質を（³⁵Ｓ）−ラベル化したインビ トロ翻訳化ｃｄｃ２、ＣＤＫ２、ＣＤＫ４、およびＣＤＫ５と混合した。混合物 は、０．５μｇの精製化ＧＳＴ−ｐ１６および等量のインビトロ翻訳化蛋白質（ ０．５〜５μｌの間；ＴＮＴ Ｐｒｏｍｅｇａ社）を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｈ Ｃｌ ｐＨ８、１２０ｍＭ ＮａＣｌ、および０．５％ Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ− ４０を含む最終容積２００μｌの緩衝液中に含んでいた。４℃で１時間の後、１ ５μｌのグルタチオン−アガロースビーズを添加し、そしてインキュベーション を追加的に１時間再開した。ビーズを遠心分離により回収し、インキュベーショ ン緩衝液で４回洗浄し、そして標準的蛋白質−ゲルローディング緩衝液と混合し た。試料を１５％ポリアクリルアミドゲルにかけ、そして（³⁵Ｓ）−ラベル化蛋 白質を蛍光光度法により検出した。ＧＳＴｐ１６融合蛋白質をｐＧＥＸ−ＫＧベ クター内で過剰発現させ、そして標準的技術により精製した。インビトロ翻訳鋳 型はｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）により稼働さ せた。 （ｉｉｉ）ｐ１６の蛋白質分解的マッピング インビトロで翻訳させた（³⁵Ｓ）−ラベル化ｐ１６（ＴＮＴ Ｐｒｏ ｍｅｇａ社）は、鋳型としてｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター（Ｓｔｒａｔａｇ ｅｎｅ社）内にクローン化されたｐ１６ ｃＤＮＡを用いて取得し、そしてＣＤ Ｋ４結合化ｐ１６蛋白質を、代謝的に（³⁵Ｓ）−ラベル化したＨｅＬａ細胞溶解 物から抗−ＣＤＫ４血清で同時免疫沈降化させた。部分的蛋白質分解は緩衝液中 での徹底的な平衡化後に対応するゲルスライスについて実施し、そして消化は様 々な濃度でのＮＣＳの添加により達成した。これらの産物を１７．５％のポリア クリルアミドゲル上で泳動させ、そしてホスホルイメージャー Ｆｕｊｉｘ ２ ０００上で検出した。 （ｉｖ）ＣＤＫ４−サイクリンＤ複合体におけるｐ１６の効果の検出 ｐ１６、ＣＤＫ４、サイクリンＤ１か、もしくはＣＤＫ４とサイクリンＤ１と の両方を一緒に過剰発現するバキュロウイルス感染化昆虫細胞を代謝的に（³⁵Ｓ ）−ラベル化した。様々なインキュベーション混合物は、ｐ１６、ＣＤＫ４、サ イクリンＤ１、およびＣＤＫ４とサイクリンＤ１との両方を含む抽出物からでき ており、そしてこれらを抗−ｐ１６血清、いずれの予備インキュベーションをも 行わない抗−ＣＤＫ４血清、ならびに抗血清および抗−サイクリンＤ１血清を作 製するのにもともと用いたペプチドで予備インキュベートした抗−ＣＤＫ血清で 免疫沈降化させた。その後に免疫沈降物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。 実施例３ ｐ１６の染色体マッピング ヒトｐ１６遺伝子のゲノムクローンを、λＦＩＸＩＩヒトゲノムライブラリー （Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ社）の緊縮性スクリーニング（６８℃下、０．１×ＳＳ Ｃ洗浄）によりｃＤＮＡプローブを用いて単離した。 単離したファージクローンを高緊縮性サザン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ）ハイブリダイ ゼーションおよび／または部分的配列分析により確認した。精製化全ファージＤ ＮＡを蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）分析のためにラ ベル化した。 ＦＩＳＨ分析は確立された方法（Ｄｅｍｅｔｒｉｃｋ ｅｔ ａｌ．（１９９ ４） Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｔ ６６：７２−７４；Ｄｅｍ ｅｔｒｉＣｋ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ １８：１４４−１ ４７：およびＤｅＭａｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ．（１９９１） Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｏｌ Ｍｕｔａｇｅｎ １８：２２２−２２３）を用い、メトトレキセートも しくはチミジンで同調化させ、フィトヘマグルチニンで刺激化させた正常末梢リ ンパ球上で実施した。バックグラウンドを下げるには超音波処理を施したヒトＤ ＮＡおよびｃｏｔ１ ＤＮＡの混合物での抑制が必要であった。染色したスライ ドをヨウ化プロピジウム（Ｒバンド形成パターンについて）もしくはＤＡＰＩお よびアクチノマイシンＤ（ＤＡ−ＤＡＰＩバンド形成パターンについて）で逆染 色し、フェージング防止用培地中に包埋し、そしてＺｅｉｓｓ Ａｘｉｐｈｏｔ 顕微鏡を用いて可視化させた。３０〜１００の間の有糸分裂細胞を各遺伝子座に ついて調査した。冷却したＣＣＤカメラを用いて写真撮影を行った。３つのカラ ー蛍光のアラインメントをトリプルバンドパスフィルター（ｔｒｉｐｌｅ ｂａ ｎｄｐａｓｓ ｆｉｌｔｅｒ）（ＦＩＴＣ／Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ／ＤＡＰＩ）を 通す直接的可視化状況下で実施した。ｐ１６遺伝子は可視化の結果、９ｐ２１− ２２にマップされた。 実施例４ マウスＣＣＲ蛋白質のクローニング ヒトｐ１６遺伝子のコーディング領域を含んでなるプローブを用いて我々はマ ウス胎仔幹細胞ライブラリーのスクリーニングを行い、そして先に記載されるヒ トｐ１６遺伝子のマウス相同物のためのコーディング領域を含むゲノムクローン を単離した。このクローンを低緊縮性から中程度の緊縮性条件下（１×ＳＳＣ、 ５０℃）で単離した。このＤＮＡ（１４ｋＢ）を２つの個別の断片としてクロー ン化し、そして９の制限エンドヌクレアーゼについて制限マップ作製を実施した （図５を参照されたい）。このマウスＣＣＲ遺伝子の配列を完全に決定し、そし てコーディング領域は、サザン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ）ハイブリダイゼーションに よる制限マップ内に位置しているわずか２つのエキソンでできているらしい。マ ウスＣＣＲ蛋白質の見かけの分子量は１３．５ｋＤａであり、そしてこのマウス ｐ１６相同物（本明細書では「ｐ１３．５」と称される）の核酸およびアミノ酸 配列が各々配列番号５および６に示される。 マウスｐ１３．５クローンのＭｅｔ１〜Ａｒｇ８０（図６を参照されたい）の 保存領域のヌクレオチド配列に基づくプローブを利用して、ｐ１９胎仔癌ライブ ラリー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を高緊縮性条件下で探索した。そのライブラ リーから数々のクローンを単離したところ、それらはｐ１３．５クローンと有意 に相同であった。マウスクローンの内の一つ（その配列は、配列番号７および８ に提供される）の配列比較により、それはｐ１５のマウス相同物であることが示 される（以下の実施例５に記載される）。 実施例５ ヒト細胞からのｐ１５のクローニング ｐ１５ ｃＤＮＡの配列が、その蛋白質の演繹アミノ酸配列と共に、各々配列 番号３および４に示される。ｐ１５の演繹アミノ酸配列をｐ１６のものと比較し （例えば、図６を参照されたい）、そして相同性領域をＢＬＡＳＴプログラムを 用いて同定した。 （ｉ）細胞培養 ＨａＣａＴ細胞は、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含むＤＭＥＭＥ（Ｂｏｕ ｋａｍｐ ｅｔ ａｌ．（１９８８） Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １０６：７ ６１−７７１）中で常時保持した。ＴＧＦ−β拘束についてはＨａＣａＴ細胞を 、１０％ ＦＢＳを含むＤＭＥＭ中で密集状態になるまで成長させ、そしてその 後に０．１％ ＦＢＳを含むＤＭＥＭ中で３日間の血清枯渇を施した。細胞を、 １０％のＦＢＳおよび２ｎｇ／ｍｌ ＴＧＦ−β（ヒト血小板から精製されたも の、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社）を含む新鮮な培地の添加により再刺激化させた。 ライブラリーの構築のためにはＲＮＡを再刺激化後２２時間目に調製した。免疫 沈降化実験のためには、細胞をＴＧＦ−βの存在下で³⁵Ｓ−メチオニンで、再刺 激化後１９時間目から開始して４時間ラベル化した。 （ｉｉ）ライブラリーの構築およびスクリーニング ＲＮＡをＴＧＦ−β処理化細胞および血清枯渇を施した細胞から調製し、そし てその後に製造業者の説明事項に従ってＲＮＡＺＯＬ Ｂを用いてＴＧＦ−βの 非存在下で再刺激化させた。ｐ１５クローンを単離するのに用いられたｃＤＮＡ ライブラリーを処理化および非処理化細胞に由来するＲＮＡの混合物から構築し た。メッセンジャーＲＮＡ調製およびｃＤＮＡ合成は、従来記載されているのと 全く同様であった（Ｈａｎｎｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９３） Ｇｅｎｅｓ Ｄ ｅｖ． ７：２３ ７８−２３９１）。二本鎖ｃＤＮＡを製造業者の説明事項に従ってλ−ＺａｐＩ Ｉアーム内に連結させた。低緊縮性ハイブリダイゼーションを５０℃下、５００ ｍＭ ＮａＰＯ₄、ｐＨ７．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１５％ ホルムアミド、７ ％ ＳＤＳ、０．１％ ウシ血清アルブミン中で実施した（洗浄：１×ＳＳＣ、 ５０℃）。ｐ１５ ｃＤＮＡもヒト哺乳類上皮細胞ライブラリーから単離した。 細胞溶解、免疫沈降、およびプロテアーゼマッピングは従来記載されているのと 全く同様に実施した（Ｘｉｏｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９３） Ｎａｔｕｒｅ ３６６：７０１−７０４）。キモトリプシン消化のためには７μｇか１．５μｇ かのいずれかの酵素を用いた。キモトリプシンマッピング用のゲルは０．１％の ＳＤＳを含んでいた。 実施例６ ＣＤＫ４およびＣＤＫ６の特異的インヒビターであるｐ１５ 細菌からのＧＳＴ−ｐ１６融合蛋白質の調製法は先に記載される。ＧＳＴ−ｐ １５は同様に調製した。 （ｉ）ＣＤＫ４およびＣＤＫ６と結合するｐ１５ インビトロで翻訳させたＣＤＫ（複数）は、ＴＮＴ−溶解物インビトロ翻訳キ ット（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を製造業者の説明事項に従って用いて調製した。結合 アッセイのためには、ＧＳＴ−ｐ１５もしくはＧＳＴ−ｐ１６（２５０ｎｇ）を インビトロで翻訳させたＣＤＫ（複数）（例えば、³⁵Ｓ−ラベル化ＣＤＣ２、Ｃ ＤＫ２、ＣＤＫ４、ＣＤＫ５、もしくはＣＤＫ６）と共に、３０℃下で、２０ｍ Ｍ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０、１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂、１ｍＭ ＥＧＴＡを含む３ ０μｌ中で３０分間インキュベートした。インキュベーション後、混合物をＩＰ 緩衝液（５ ０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．５％ ＮＰ−４０ ）中で２５０μｌに希釈し、そして１２．５μｌのグルタチオンセファロースと 共に１時間インキュベートした。結合化蛋白質をグルタチオンセファロース上で 回収し、１ｍｌのＩＰ緩衝液で４回洗浄し、そしてその後にＳＤＳゲル試料用緩 衝液中での沸騰により放出させた。結合化蛋白質は１７．５％ ＰＡＧＥゲル中 での電気泳動により分析した。比較用にＧＳＴ−ｐ１６を用いる類似実験を実施 した。 （ｉｉ）サイクリンＤ／ＣＤＫ４キナーゼを阻害するｐ１５結合 バキュロウイルス感染化昆虫細胞の溶解物中に存在する活性サイクリンＤ／Ｃ ＤＫ４キナーゼを増加量のＧＳＴ−ｐ１５と共に３０分間、３０℃でインキュベ ートした。活性サイクリンＤ／ＣＤＫ４キナーゼを含むバキュロウィルス溶解物 の調製法は先に記載される。活性サイクリンＤ／ＣＤＫ６を含む溶解物を同様に 調製した。キナーゼアッセイのためには１０μｌのバキュロウイルス溶解物を、 約０、１０ｎｇ、２０ｎｇ、５０ｎｇ、もしくは１００ｎｇのＧＳＴ−ｐ１５も しくはＧＳＴ−ｐ１６と共に混合し、そして３０℃下で３０分間、２０ｍＭ Ｔ ｒｉｓ、ｐＨ８．０、１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂、１ｍＭ ＥＧＴＡを含む３０μｌ の総容積中でインキュベートした。インキュベーション後、０．５μｇ ＧＳＴ −ＲＢおよび０．５μｌのγ−³²Ｐ−ＡＴＰ（５μＣｉ、３０００Ｃｉ／ｍモル ）を基質として１０分間、３０℃下で添加した。反応は２５０μｌのＩＰ緩衝液 および１５μｌのグルタチオンセファロースの添加により停止させた。４℃下で の更に１時間のインキュベーションの後にビーズをＩＰ緩衝液で４回洗浄し、そ の後に結合化蛋白質を放出させ、そして次に電気泳動にかけた。ｐ１６と同様、 ｐ１５−ＧＳＴ融合 蛋白質もやはりＣＤＫ４のキナーゼ活性を阻害した。 （ｉｉｉ）サイクリンＤ／ＣＤＫ６キナーゼを阻害するｐ１５ サイクリンＤ／ＣＤＫ６複合体をバキュロウイルス感染化昆虫細胞中で産生さ せ、そして先に記載の要領で増加量のＧＳＴ−ｐ１５およびＧＳＴ−ｐ１６と共 にインキュベートした。インキュベーション後、これらの複合体がＧＳＴ−ＲＢ リン酸化の触媒反応を行う能力を決定した。ｐ１５およびｐ１６の両方がＣＤＫ ６キナーゼ活性を阻害する能力を示した。 実施例７ ｐ１５とＣＤＫ４およびＣＤＫ６との結合を増加させるＴＧＦ−β処理 ＨａＣａＴ細胞を先に記載の要領で培養した。ＴＧＦ−β処理はＴＧＦ−βを ２ｎｇ／ｍｌになるまで現存培地に添加することにより開始した。ＴＧＦ−β処 理の最終２時間の間、細胞を³⁵Ｓ−メチオニンでラベル化した。細胞のラベル化 のためには、培地を、２ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ−β、１０％の透析化ＦＢＳ、およ び０．５ｍＣｉ／ｍｌの³⁵Ｓ−メチオニン／システイン（ｔｒａｎｓ−ｌａｂｅ ｌ、ＮＥＮ社）を含むＤＭＥＭマイナスメチオニン（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ社）に 交換した。細胞を溶解し、そして蛋白質を抗−ＣＤＫ４もしくは抗−ＣＤＫ６抗 体のいずれかを用いて免疫沈降化させた。細胞溶解および免疫沈降化は先の要領 で実施した。同時にＴＧＦ−βで処理したＨａＣａＴ培養物をＤＡＰＩで染色し 、そしてＦＡＣＳにより分析した。ＴＧＦ−β添加後８時間の間はＧ₁細胞のパ ーセンテージには認識可能な変化は全く存在しなかった。１４時間後にＧ₁集団 が増加し始めた。Ｇ₁でのＨａＣａＴ細胞の拘束（約８５％のＧ₁細胞）は、非同 調性細胞の処理後少なくとも２４時 間を必要とした。 実施例８ ｐ１５ ｍＲＮＡを誘導するＴＧＦ−β処理 非同調性ＨａＣａＴ培養物を指示される期間、ＴＧＦ−βで処理した。総ＲＮ Ａを処理化細胞から調製し、そしてｐ１５に特異的なプローブ（例えば、この遺 伝子の第一コーディングエキソンでできており、かつＰＣＲにより調製されたプ ローブ）を用いるノザン（Ｎｏｔｈｅｒｎ）ブロットに用いた。ノザンブロット に用いたハイブリダイゼーション条件は、２００ｍＭ ＮａＰＯ₄、ｐＨ７．０ 、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１５％ ホルムアミド、７％ ＳＤＳ、０．１％ウシ血清 アルブミン、６５℃；洗浄：０．２×ＳＳＣ、６５℃であった。ｐ１５プローブ は、約０．８、２．２、および３．２Ｋｂの３つのｐ１５ ｍＲＮＡを認識した 。ノザンシグナルを、Ｆｕｊｉ ＢＡＳ２０００ホスホルイメージャー上で定量 化し、そしてプロットすることで結果のグラフ表示を行った。ＲＮＡの量を質量 により標準化し、そしてそのブロットのヒトアクチンプローブでの重複探索によ るとレーン間のＲＮＡの量の分散は１０％程度であることが示唆された。 ｐ１５プローブパネルにおいて用いられたものと同一のＲＮＡも、ｐ１６に特 異的な断片で探索した。それに加え、ＴＧＦ−β処理化ＨａＣａＴ細胞からのＲ ＮＡをヒトＣＤＫ４コーディング配列の断片もしくはｐ２７ ｃＤＮＡの断片の いずれかに由来するオリゴヌクレオチドで探索した。 実施例９ 形質転換マウスｐ１３．５ノックアウトの作製 破壊性構築物は、ｐ１３．５遺伝子をフランクする約３〜４Ｋｂの２つのＤＮ Ａ領域により形成される。これらのＤＮＡ断片を、トランスフェクション後にこ のＤＮＡ内に組込まれているマウス胎仔幹（ＥＳ）細胞を選択するのに用いるで あろう遺伝子マーカーの両脇にクローン化する。ｐ１６遺伝子座に相同な領域を 次には他のマーカーによりフランクするが、このマーカーにより非相同性組換え （例えば、マウスｐ１３．５遺伝子のもの以外の遺伝子座でのもの）による破壊 性ベクターを組込んでいる細胞に対する選択が可能となる。挿入が適切な位置で 生じている細胞をマウス未分化胚芽細胞内に挿入し、そして標準的プロトコール に従い適切なメスマウス内に移植する（Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍ ｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ、（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏ ｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ． 、１９８６；およびＪａｅｎｉｓｃｈ （１９８８） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０ ：１４６８−１４７４）。 工学的処理を施した未分化胚芽細胞から得られるキメラ幼仔は、形質転換させ たＥＳ細胞に特異的な外被カラーマーカー（野鼠色）により同定することができ る。キメラ現象の度合いが高いマウスを交雑させてキメラ生殖細胞を有するもの を同定し、かつ非キメラ性ヘテロ接合性破壊体を作製する。ホモ接合性破壊体は 非キメラ性ヘテロ接合体を繁殖させることにより取得される。 実施例１０ ＣＣＲ非感受性ＣＤＫ４突然変異体の特徴決定 ＣＤＫ４の突然変異体は黒色腫患者からの細胞内で発見され、そしてその突然 変異体酵素の配列が決定された。その配列から、その遺伝子が Ａｒｇ→Ｃｙｓを位置２４に含むことが決定された（配列番号９を参照されたい ）。 我々はその突然変異体をＣＤＫ４をクローニングすることにより再単離し（例 えば、Ｍａｔｓｕｓｈｉｍｅ ｅｔ ａｌ．（１９９２） Ｃｅｌｌ ７１：３ ２３−３３４）、そしてオリゴヌクレオチドプライマー突然変異誘発によるシス テイン突然変異体を作製した。その突然変異体の効果の性質を決定するために、 我々は多数の異なる基準に基づき、その突然変異体と野生型酵素とを比較したが 、それらの基準には、固有の活性（例えば、その突然変異体は構成的にＣＤＫ４ を活性化した）ならびに他の調節性蛋白質がＣＤＬ４活性化を制御する能力が含 まれる。簡潔に述べると我々は、様々な蛋白質を過剰発現させるための一連のバ キュロウイルス発現系を作製した。具体的には、Ｓｆ９細胞溶解物（Ｄｅｓａｉ ｅｔ ａｌ．（１９９２） Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ３：５７１−５８ ２、および先の実施例６）を、突然変異体、ならびに野生型のＣＤＫ４、サイク リンＤ１、ｐ１６、ｐ１５、ｐ２１、およびｐ２７について取得した（Ｐｏｌｙ ａｋ ｅｔ ａｌ．（１９９４） Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ ８：９−２２；および Ｔｏｙｏｓｈｉｍａ ｅｔ ａｌ．（１９９４） Ｃｅｌｌ ７８：６７−７４ 、を参照されたい）。ＣＤＫ４キナーゼ活性を検出するための基質としてＧＳＴ −ＲＢ融合蛋白質（実施例６）を用いることで、溶解物の様々な組み合わせ物を 混合し、そしてＣＤＫ４活性化／阻害について検査した。 突然変異体ＣＤＫ４をＳｆ９細胞内で単独に発現させた際には、ＲＢ基質の認 識可能なリン酸化は全く検出されず、それは野生型酵素の事例においても同様で あり、このことによりこの突然変異はＣＤＫ４の構成 的活性化はもたらされなかったことが示される。Ｓｆ９溶解物中のＣＤＫ４およ びサイクリンＤ１の過剰発現も突然変異体および野生型の両キナーゼについては 同一であり、それは各々がサイクリンＤ１の存在下で活性されることが示された ためである。しかしながらＣＤＫ４／サイクリンＤ混合物への増加量のｐ１６含 有性もしくはｐ１５含有性溶解物のいずれかの添加の際には、野生型ＣＤＫ４は 阻害されたにも拘わらず、突然変異体ＣＤＫ４は比較的影響を受けておらず、こ のことにより突然変異は、その活性がｐ１５もしくはｐ１６のいずれかに対して 非感受性であるキナーゼを生じることが示される。それに加え免疫沈降により、 ｐ１５もしくはｐ１６のいずれもがその突然変異体に結合することができないこ とが示され、それはそれらが明らかに、通常は野生型ＣＤＫ４に関して観察され る複合体から喪失されているためである。最終的にはｐ２１およびｐ２７に関し て実施した類似実験により、特別な突然変異体Ａｒｇ２４−Ｃｙｓはそれらの蛋 白質のいずれの結合性もしくは阻害性能力にも影響を及ぼさないことが示された 。ＣＤＫ６のＡｒｇ３１に対する類似突然変異（配列番号１０；および野生型遺 伝子についてはＢａｔｅｓ ｅｔ ａｌ．（１９９４） Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ９ ：７１−７９）が同一効果を有することが予期される。 対照地点としてＡｒｇ−２４残基を利用することで、我々は更に、ｐ１６／ｐ １５の認識にも関わることがある他の残基を分子モデリングすることにより同定 した。ＣＤＫ２についての座標値を利用することで（ＤｅＢｏｎｄｔ ｅｔ ａ ｌ．（１９９３） Ｎａｔｕｒｅ ３６３：５９５−６０２；Ｅｎｄｉｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．（１９９４） Ｐｒｏｔ Ｅｎｇ ７：２４３−２５３；および Ｍｏｒｇａｎ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ６：２３９−２４６ ））、我々はＣＤＫ４についてのモデルを構築した。Ａｒｇ−２４の空間的近傍 に存在する残基、およびＣＤＫ４とＣＤＫ６との間に保存される残基（ただし、 ＣＤＫ２もしくはＣＤＣ２とは異なる）に注意を向けながら、我々は多数の新規 のＣＤＫ４突然変異体を組換え的に作製し、かつｐ１６に結合するそれらの能力 についての分析を行った。これらの突然変異体およびそれらのｐ１６結合性能が 以下の表１にまとめられている（図７も参照されたい）。 ３つの変化によりｐ１６との相互作用が消失した。これらの変化を三次元構造 上で可視化した際には、これらの残基が溶媒にアクセス可能な４つのアミノ酸残 基のクラスターを形成することが明白であった。これらの残基 Ｋ２２、Ｒ２４ 、Ｈ９５、およびＤ９７はＣＤＫ４の小突出部の表面を特定し、この部位はＡＴ Ｐ結合性部位には非常に近い近傍に存在するが、サイクリン結合性部位もしくは 基質結合性部位からは遠く離れている。この表面はＣＤＫ４（およびＣＤＫ６に おいても類似している）内に存在するｐ１６／ｐ１５認識表面の少なくとも一部 分であるらしい。従ってＣＤＫ４／ＣＤＫ６のｐ１６／ｐ１５阻害についての魅 力的モデルにより、ＣＣＲ蛋白質の結合の際のＡＴＰ結合性部位への効果の閉塞 もしくは歪曲効果が提供され、その結果ＡＴＰがＣＤＫ４に結合しなくなるか、 もしくはリン酸塩ドナーとして用いられるべき適切な位置に存在しないかのいず れかが生じる。 先に引用される全引用文献および刊行物は、引用により本明細書に取り込まれ る。 等価物 当業者は、通常の実験程度のものを利用することで本明細書に記載される本発 明の具体的態様に対する多くの等価物を認識するか、もしくは確認することがで きるであろう。そのような等価物は以下に記載される請求の範囲により包含され ることが意図される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ０７Ｋ 16/18 0276−2Ｊ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ Ｃ１２Ｑ 1/68 9051−4Ｃ Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＤＵ Ｇ０１Ｎ 33/53 9051−4Ｃ 37/52 (31)優先権主張番号 ０８／３０６，５１１ (32)優先日 1994年９月14日 (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ０８／３４６，１４７ (32)優先日 1994年11月29日 (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，ＪＰ，ＫＲ (72)発明者 セラノ， マニユエル アメリカ合衆国ニユーヨーク州11765ミル ネツク・ミルヒルロード297 (72)発明者 ハノン， グレゴリー・ジエイ アメリカ合衆国ニユーヨーク州11743ハン テイントン・サミスストリート92

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． アンキリン様反復構造を特徴とするアミノ酸配列を含む単離されたもし くは組換え細胞周期調節ポリペプチドであって、そのポリペプチドがサイクリン 依存性キナーゼ（ＣＤＫ）に結合するが、ただし前記ポリペプチドはアミノ酸配 列では配列番号２と同一ではない、上記ポリペプチド。 ２． 前記ＣＤＫがＧ１期ＣＤＫである、請求の範囲１のポリペプチド。 ３． 前記ＣＤＫがＣＤＫ４もしくはＣＤＫ６である、請求の範囲１のポリペ プチド。 ４． ポリペプチドがＳＤＳ−ＰＡＧＥによる１２ｋＤ〜２０ｋＤの範囲内の 見かけの分子量を有するか、もしくはＳＤＳ−ＰＡＧＥによる１２ｋＤ〜２０ｋ Ｄの範囲内の分子量を有する全長蛋白質のＣＤＫ結合性断片である、請求の範囲 １のポリペプチド。 ５． ポリペプチドがＣＤＫへの結合から配列番号２により表示される蛋白質 を競合的に解離させる、請求の範囲１のポリペプチド。 ６． 細胞周期調節（ＣＣＲ）蛋白質もしくはその断片の実質的に純粋な調製 物であって、そのＣＣＲ蛋白質がサイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）に特異的 に結合し、前記ＣＣＲ蛋白質の全長形態が１２ｋＤ〜２０ｋＤの範囲内のおおよ その分子量を有するが、ただし前記ＣＣＲ蛋白質は配列では配列番号２と同一で はない、上記調製物。 ７． 蛋白質が配列番号２に表されるアミノ酸配列と少なくとも６０％相同で あるアミノ酸配列を含む、請求の範囲６のＣＣＲ蛋白質。 ８． 蛋白質が配列番号４に表されるアミノ酸配列と少なくとも６０ ％相同であるアミノ酸配列を含む、請求の範囲６のＣＣＲ蛋白質。 ９． 蛋白質が配列番号８に表されるアミノ酸配列と少なくとも６０％相同で あるアミノ酸配列を含む、請求の範囲６のＣＣＲ蛋白質。 １０． 蛋白質が一般式： により表されるアミノ酸配列を含む、請求の範囲６のＣＣＲ蛋白質。 １１． 蛋白質が、細胞周期調節のアゴニストかもしくは細胞周期調節のアンタ ゴニストかのいずれかの役割の内の一つとして機能する、請求の範囲６のＣＣＲ 蛋白質。 １２． 配列番号２と少なくとも６０％相同であるアミノ酸配列を含むｐ１６相 同体ポリペプチドもしくはその断片の実質的に純粋な調製物であるが、ただし前 記ポリペプチドは配列では配列番号２と同一ではない、上記調製物。 １３． 一般式： により表されるアミノ酸配列を含む、請求の範囲１２のポリペプチド。 １４． 前記ポリペプチドが、細胞周期調節のアゴニストかもしくは細胞周期調 節のアンタゴニストかのいずれかの役割の内の一つとして機能する、請求の範囲 １２のポリペプチド。 １５． 配列番号４に少なくとも６０％相同なアミノ酸配列を含むｐ１５ポリペ プチドもしくはその断片の実質的に純粋な調製物であるが、ただし前記ポリペプ チドは配列では配列番号２と同一ではない、上記調製物。 １６． 一般式： により表されるアミノ酸配列を含む、請求の範囲１５のポリペプチド。 １７． 前記ポリペプチドが、細胞周期調節のアゴニストかもしくは細胞周期調 節のアンタゴニストかのいずれかの役割の内の一つとして機能する、請求の範囲 １５のポリペプチド。 １８． 配列番号２、４、もしくは８の内の一つもしくは複数に表されるアミノ 酸に相同なアミノ酸配列を含む単離されたもしくは組換えポリペプチドであって 、そのポリペプチドが細胞周期依存性キナーゼ４（ＣＤＫ４）と特異的に相互作 用し、その特異的相互作用がＣＤＫ４の残基 Ｋ２２、Ｒ２４、Ｈ９５、および Ｄ９７による影響を受けるが、ただ し前記ＣＣＲ蛋白質は配列では配列番号２と同一ではない、上記ポリペプチド。 １９． ポリペプチドがＣＤＫ４により媒介されるホスホリル転移反応を阻害す る、請求の範囲１８のポリペプチド。 ２０． 請求の範囲６のＣＣＲ蛋白質のエピトープと特異的反応性を示す抗体調 製物。 ２１． 請求の範囲４のポリペプチドのエピトープと特異的反応性を示す抗体調 製物。 ２２． 請求の範囲８のポリペプチドのエピトープと特異的反応性を示す抗体調 製物。 ２３．配列番号２、４、もしくは８の内の少なくとも一つに表されるアミノ酸配 列に少なくとも６０％相同なアミノ酸配列を有する組換えポリペプチドであって 、ただし前記ＣＣＲ蛋白質が配列では配列番号２と同一ではない、上記ポリペプ チド。 ２４． ポリペプチドが、細胞周期調節のアゴニストかもしくは細胞周期調節の アンタゴニストかのいずれかの役割の内の一つとして機能する、請求の範囲２３ のポリペプチド。 ２５． ポリペプチドがサイクリン依存的キナーゼに結合する、請求の範囲２３ のポリペプチド。 ２６． サイクリン依存性キナーゼがＣＤＫ４であり、かつＣＤＫ４へのポリペ プチドの結合性がＣＤＫ４の残基 Ｋ２２、Ｒ２４、Ｈ９５、およびＤ９７によ る影響を受ける、請求の範囲２５のポリペプチド。 ２７． ポリペプチドがＣＤＫ４により媒介されるホスホリル転移反応を阻害す る、請求の範囲２６のポリペプチド。 ２８． 一般式： により表されるアミノ酸配列を含む、請求の範囲２３のポリペプチド。 ２９． 一般式： により表されるアミノ酸配列を含む、請求の範囲２３のポリペプチド。 ３０． 一般式： により表されるアミノ酸配列を含む、請求の範囲２３のポリペプチド。 ３１． ポリペプチドが、配列番号２、４、もしくは８の蛋白質に無関 係な蛋白質からのアミノ酸配列を有する第二ポリペプチド部分を更に含む融合蛋 白質である、請求の範囲２３のポリペプチド。 ３２． 前記融合蛋白質が二重ハイブリッドアッセイにおいて機能を示す、請求 の範囲３１のポリペプチド。 ３３． アンキリン様反復構造を特徴とするアミノ酸配列を含む細胞周期調節性 ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する実質的に純粋な核酸であっ て、そのポリペプチドがサイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）に結合するが、た だし前記ポリペプチドがアミノ酸配列では配列番号２と同一ではない、上記核酸 。 ３４． 前記ＣＤＫがＧ１期のＣＤＫである、請求の範囲３３の核酸。 ３５． 前記ＣＤＫがＣＤＫ４もしくはＣＤＫ６である、請求の範囲３３の核酸 。 ３６． ポリペプチドがＳＤＳ−ＰＡＧＥによる１２ｋＤ〜２０ｋＤの範囲内の 見かけの分子量を有するか、もしくはＳＤＳ−ＰＡＧＥによる１２ｋＤ〜２０ｋ Ｄの範囲内の分子量を有する全長蛋白質のＣＤＫ結合性断片である、請求の範囲 ３３の核酸。 ３７． サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）に特異的に結合する細胞周期調節 （ＣＣＲ）蛋白質もしくはその断片をコードするヌクレオチド配列を有する実質 的に純粋な核酸であって、前記ＣＣＲ蛋白質の全長形態は１２ｋＤ〜２０ｋＤの 範囲内のおおよその分子量を有するが、ただし前記ポリペプチドは配列では配列 番号２と同一ではない、上記核酸。 ３８． 前記ＣＣＲ蛋白質が配列番号２に表されるアミノ酸配列に少なくとも６ ０％相同であるアミノ酸配列を有する前記ヌクレオチド配列によりコードされる 、請求の範囲３７の核酸。 ３９． 前記ＣＣＲ蛋白質が配列番号４に表されるアミノ酸配列に少なくとも６ ０％相同であるアミノ酸配列を有する前記ヌクレオチド配列によりコードされる 、請求の範囲３７の核酸。 ４０． 前記ＣＣＲ蛋白質が配列番号８に表されるアミノ酸配列に少なくとも６ ０％相同であるアミノ酸配列を有する前記ヌクレオチド配列によりコードされる 、請求の範囲３７の核酸。 ４１． 前記ヌクレオチド配列によりコードされる前記ＣＣＲ蛋白質が、一般式 ： により表されるアミノ酸配列を有する、請求の範囲３７の核酸。 ４２． 前記ヌクレオチド配列によりコードされる前記ＣＣＲ蛋白質が、細胞周 期調節のアゴニストかもしくは細胞周期調節のアンタゴニストかのいずれかの役 割の内の一つとして機能する、請求の範囲３７の核酸。 ４３． 前記ヌクレオチド配列が緊縮条件下で、配列番号１、配列番号３、もし くは配列番号７の内の一つもしくは複数の内の少なくとも１２の連続的ヌクレオ チドに相当する核酸プローブにハイブリダイズする、請求の範囲３７の核酸。 ４４． 実質的に精製されたオリゴヌクレオチドを含むプローブ／プライマーで あって、前記オリゴヌクレオチドが、緊縮条件下で配列番号３もしくは７、また は天然に存在するそれらの突然変異体のセンスもしくはアンチセンス配列の内の 少なくとも１０の連続的ヌクレオチドにハイ ブリダイズするヌクレオチド配列のある領域を含む、上記プローブ／プライマー 。 ４５． 連結されかつ検出されることが可能なラベル基を更に含む、請求の範囲 ４４のプローブ／プライマー。 ４６． 前記ラベル基が、放射性同位元素、蛍光化合物、酵素、および酵素補助 因子からなる群より選択される、請求の範囲４５のプローブ／プライマー。 ４７． 請求の範囲４４のプローブ／プライマーを含み、患者から単離された細 胞の試料中で細胞周期調節蛋白質をコードする核酸のレベルを測定するための形 質転換細胞を同定するための診断用検査キット。 ４８． 細胞周期調節性（ＣＣＲ）ポリペプチドとサイクリン依存性キナーゼ（ ＣＤＫ）との相互作用を阻害するための検査用化合物をスクリーニングするため のアッセイであって、 ｉ ＣＤＫと、アンキリン様反復構造を特徴とするアミノ酸配列を含むＣ ＣＲポリペプチドとを結合させ、そのポリペプチドが、前記ＣＤＫと前記ポリペ プチドとが相互作用することが可能な条件下で前記ＣＤＫに結合し； ｉｉ 前記組み合わせ物を検査用化合物と接触させ；そして ｉｉｉ 前記ＣＤＫと前記ＣＣＲポリペプチドとを含む複合体の形成を検出す ることを含み、 前記検査用化合物の存在下での前記複合体の形成の減少が、ＣＤＫとＣＣＲポリ ペプチドとの間の相互作用のインヒビターを意味する、上記アッセイ。 ４９． ＣＣＲ蛋白質が真核生物細胞周期を調節する能力を破壊する作 用物質を同定する方法であって： ｉ （ａ）サイクリン依存的キナーゼ（ＣＤＫ）を含む第一蛋白質、および （ｂ）アンキリン様反復構造を特徴とするアミノ酸配列を含むＣＣＲポリペプチ ドを含む第二融合蛋白質、を含む二重ハイブリッドアッセイ系を提供し、そのポ リペプチドが、前記第一融合蛋白質のＣＤＫと前記第二ポリペプチドの前記ｐ１ ６^INK4ポリペプチドとの間の相互作用に対して前記二重ハイブリッドアセイが感 受性を示す条件下で前記ＣＤＫに結合し； ｉｉ 前記二重ハイブリッドアッセイ系を候補作用物質と接触させ； ｉｉｉ 前記融合蛋白質間の相互作用のレベルを前記候補作用物質の存在下で 測定し；そして ｉｖ 前記候補作用物質の存在下での前記融合蛋白質の相互作用のレベルを 、前記候補作用物質の非存在下での前記融合蛋白質の相互作用のレベルと比較す ることを含み、 前記候補作用物質の存在下での相互作用のレベルの減少が、ＣＣＲ蛋白質とサイ クリン依存性キナーゼとの相互作用の阻害を意味する、上記方法。 ５０． ある被検体が、所望されない細胞増殖を特徴とする障害についての危険 にさらされているかどうかを決定する方法であって、前記被検体の組織中で、 ＣＣＲ蛋白質をコードする遺伝子の突然変異、および前記遺伝子の過誤発現、 の内の少なくとも一つを特徴とする遺伝子病変の存在もしくは非存在を 検出することを含み、前記ＣＣＲ蛋白質がアンキリン様反復構造を特徴とするア ミノ酸配列を有し、かつそのポリペプチドがサイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ ）に結合する、上記方法。 ５１． 前記遺伝子病変の検出が ｉ． 前記遺伝子からの一つもしくは複数のヌクレオチドの欠失、 ｉｉ． 前記遺伝子への一つもしくは複数のヌクレオチドの添加、 ｉｉｉ． 前記遺伝子の一つもしくは複数のヌクレオチドの置換、 ｉｖ． 前記遺伝子の総体的染色体再構成、 ｖ． 前記遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ転写物のレベルの総体的変化、 ｖｉ． 前記遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ転写物の非野生型スプライシン グパターンの存在、 ｖｉｉ． 前記蛋白質の非野生型レベル、 の内の少なくとも一つの存在を確認することを含む、請求の範囲５０の方法。 ５２． 前記遺伝子病変の検出が、 ｉ． 配列番号１もしくは３、または天然に存在するそれらの突然変異体 のセンスもしくはアンチセンス配列、あるいは前記遺伝子に天然の状態で連結す る５’もしくは３’フランク配列またはイントロン配列にハイブリダイズするヌ クレオチド配列の内のある領域を含むオリゴヌクレオチドを含むプローブ／プラ イマーを提供し； ｉｉ． 前記組織の核酸に対し前記プローブ／プライマーを露出し； ｉｉｉ． 前記プローブ／プライマーの前記核酸へのハイブリダイゼ ーションにより前記遺伝子病変の存在もしくは非存在を検出することを含む、請 求の範囲５０の方法。 ５３． 前記病変の検出が、前記遺伝子、および場合によっては前記フランク核 酸配列のヌクレオチド配列を決定するための前記プローブ／プライマーを利用す ること含む、請求の範囲５０の方法。 ５４． 前記病変の検出が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）もしくは連結連鎖 反応（ＬＣＲ）において前記プローブ／プライマーを利用することを含む、請求 の範囲５０の方法。 ５５． 前記蛋白質のレベルが免疫アッセイにおいて検出される、請求の範囲５ １の方法。 ５６． ある細胞の細胞性形質転換の危険性を検出する方法であって、その細胞 中で、サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）と、アンキリン様反復構造を特徴と するアミノ酸配列を含むポリペプチドとの間の蛋白質複合体の存在を検出するこ とを含み、そのポリペプチドが前記ＣＤＫに結合するが、ただし前記ポリペプチ ドは配列では配列番号２と同一ではない、上記方法。