JPH09512630A - 診断マーカーとしてのヒト好中球リポカリン（ｈｎｌ）の使用および抗−ｈｎｌ−抗体調製物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 細菌感染によって引き起こされる炎症のごとき、特に炎症診断用の、ヒト疾病用の診断マーカーとしてのヒト好中球リポカリン(ＨＮＬ)の使用。ポリクローナル・ウサギ抗-ＨＮＬ抗体以外の抗-ＨＮＬ抗体調製物。

Description

【発明の詳細な説明】 診断マーカーとしてのヒト好中球リポカリン(ＨＮＬ)の使用 および抗-ＨＮＬ-抗体調製物 技術分野および背景 本発明は、特に細菌起源を有し得る炎症に関連した診断用の、診断マーカーと してのヒト好中球リポカリン(ＨＮＬ)の使用に関する。患者からの試料における ＨＮＬレベルの決定は、細菌およびウイルス感染の間の識別を補助する。 ヒト好中球の主な機能は、侵入する微生物、特に化膿性細菌を感知し、近づき 破壊することである。侵入する微生物は、好中球からの種々の顆粒蛋白質の脱顆 粒およびエキソサイトーシスを引き起こす(Ｈenson,Ｊ.Ｉmmunol.107(1971)1535 -46)。好中球から放出される顆粒蛋白質の決定は、感染および炎症における好中 球活性化の指標として長い間用いられてきている(Ｓchmekelら，Ｉnflam.14(199 0)447-54；およびＬashら，Ｂlood 61(1983)885-8)。Ｃ-反応性蛋白質(ＣＲＰ) は、肝臓中で産生される急性期反応物であり、その測定は細菌感染症の早期診断 に用いられている。 本明細書に示す結果は、ＨＮＬとヒト好中球２４ｋＤ Ｎ-ホルミル-ペプチド 結合蛋白質である２５ｋＤ α-２-ミクログロブリン-関連蛋白質(Ｔriebelら， ＦＥＢＳ Ｌett.314(1992)386-)および好中球ゲラチナーゼ-関連リポカリン(Ｎ ＧＡＬ)(Ｋjeldsenら，Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.268(1993)10425-)との間の配列同一性を 示す。ＨＮＬの予備的単離は公開されている(Ｖengeら,Ｊ.Ｌeukocyte Ｂiol.増 刊１(1990)28)。前年の間に、ヒト好中球リポカリンの完全な精製／特徴付けお よびアッセイが公開された(Ｘuら，Ｓcand.Ｊ.Ｌab.Ｉnvest.54(1994)365-76お よびＸuら，Ｊ.Ｉmmunol.Ｍeth.171(1994)245-52)。 発明の目的 細菌感染症用の新規な診断マーカー、およびウイルス感染症から細菌感染症を 識別するマーカーに対する要望が存在する。また、この形の診断に改善された特 異性を供するマーカーおよび方法に対する要望が存在する 本発明は、これらの要望を満たす手段を提供する。 発明 驚くべきことには、ここに本発明者らは、例えば炎症に関連して好中球が活性 化された場合に、好中球に特異的に由来するＨＮＬが該好中球から増量して放出 されることを見出した。炎症状態はレベルの上昇に反映される一方、好中球活性 の低下は正常より劣るレベルを反映するであろう。 かくして、本発明は、その最大限広い態様において、好中球を含有する液体試 料中の好中球活性についての診断マーカーとしてのＨＮＬの使用である。 用いる方法は： (i)診断すべき個人由来の適当な試料中のＨＮＬのレベルを測定し、ついで (ii)測定値レベルと、明らかに健康な個人(正常個人)について対応するレベル( 正常レベル、正常濃度範囲)とを比較する工程よりなることを特徴とする。 測定値レベルが正常レベルから逸脱する場合、これは、個人がある異常な状態 となっていることの兆候である。レベルの上昇は、好ましくはウイルス感染症を 排除した、細菌起原の可能性の非常に高い感染によって引き起こされる炎症の兆 候であろう。また、レベルの上昇は、ＨＮＬを放出するように好中球が外来性表 面(例えば、プラスチックまたはガラス表面、カテーテルおよび生体外配置)と接 触した場合にも試料中に見出され得る。正常より劣るレベルは、骨髄移植および 白血病、または好中球の数が減少する他の場合に関連して見出され得る。そのこ とは、骨髄移植患者からの試料中のＨＮＬにおける変化をモニターすることが、 移植の成功もモニターするであろうことに従う(正常より劣るレベルから正常レ ベルへの前進的上昇は移植の機能の兆候であろう)。 例えば、喘息性憎悪(asthmatic exacerbation)の間のような正確な治療法を決 定するためには、細菌およびウイルス感染症の間を識別し得ることが重要である 。 該試料は、ヒト個人に由来し、好中球および／またはＨＮＬを含有する。好中 球は全身的に存在することにより、候補試料は気管支肺胞洗液、(血清および血 漿試料を含む)血液、尿、髄液および鼻液である。例えば、血液試料は、全血液 、血清および血漿試料が好ましい。 ＨＮＬの測定は、原則的に、満足すべき感度、精度、特異性ほかを供するいず れの方法によっても行い得る。しかしながら、実験セクションに示すごとく、イ ムノアッセイが最も好ましい方法であると考えられる。 イムノアッセイは、ＨＮＬおよび抗-ＨＮＬ抗体よりなる免疫複合体を形成し 得る条件下、アッセイ培地中にて、異常なレベルのＨＮＬを含む予想試料を、Ｈ ＮＬに特異的な抗体(抗-ＨＮＬ抗体)と接触させることを特徴とする。その後に 、形成した複合体を実質的に公知である方法によって決定して、アッセイ培地中 のＨＮＬレベルの定量的または定性的測定値、換言すると、試料中のＨＮＬレベ ルの測定値も得る。これらの形態のアッセイにおいては、複合体をそのままで測 定し得、あるいは、それを分析的に検出可能な物質(標識物)で標識した生体特異 的親和性反応物の補助によって測定し得、該反応物(およびその標識物)は該複合 体に特異的に取り込まれるようになり得る。標識し得る適当な生体特異的親和性 反応物の例は、抗-ＨＮＬ抗体、ＨＮＬ自体、形成された複合体中に存在する抗 体の定常領域に対して向けられた抗-抗体(抗-抗-ＨＮＬ抗体)、プロテインＡお よびＧほかである。使用し得る検出可能な物質(標識物)の例は、蛍光物質、発色 団、蛍光団、酵素、酵素基質、補因子、補酵素ほか、放射性同位体、(金属性、 非金属性の)粒子、(アビジンとその反応によって検出される)ビオチンほかであ る。該免疫複合体に取り込まれるようになる場合、ある種の標識物はそのシグナ ルを変化させるが、他のものは変化しない。前者の型の標識物は、複合体に取り 込まれなかった標識物から取り込まれた標識物を分離する必要がなんらない均一 な免疫アッセイを提供する。後者の型の標識物は、例えば、標識物が取り込まれ る、または取り込まれるべき複合体を不溶化することによって、分離する必要が ある(不均一アッセイ)。標識物を含む複合体の不溶化を達成するために、ポリエ チレングリコールならびに該複合体に結合する不溶化および不溶性の生体特異的 親和 性反応物のごとき沈殿剤を使用し得る。もちろん、この後者の型は、標識した生 体特異的親和性反応物自体を不溶化する必要はない。 当業者であれば、例えば、添加およびインキュベーション工程の均一または不 均一な変形、順序および形態ほかのような適当なイムノアッセイプロトコールを 選択し得る。主なポイントは、添加する反応物の量が、複合体に取り込まれるか 、または取り込まれない標識物の量が試料中のＨＮＬレベルを反映するようでな ければならないことである。 通常のアッセイ条件は、非分配性の(non-disturbing)水混和性共溶媒が入って いるか入っていない水性培地、０-４０℃の範囲内の温度、および４-１０の範囲 内のｐＨ値である。 用いる抗-ＨＮＬ抗体は、他の抗体についてよく知られている標準的な技術に よって調製し得る。該語には、ポリクローナル抗体、および組換え技術によって 作製されるモノクローナル抗体が包含される。抗-ＨＮＬ抗体なる語は、ＨＮＬ ユニークな決定基およびエピトープを示す単量体ＨＮＬの二量体、多量体または ヘテロマー形態および／またはフラグメントに包含されるような単量体形態のご とき、ＨＮＬと特異的に反応する抗体調製物を意味する。本発明の診断方法で用 いるべき抗-ＨＮＬ抗体は、試料またはアッセイ培地中に存在し得る他の成分、 特に、ミエロペルオキシダーゼ、カテプシンＧ、ラクトフェリン、リソザイムお よびエラスターゼのごとき他の好中球蛋白質、または好酸球カチオン性蛋白質( ＥＣＰ)、好酸球蛋白質Ｘ(ＥＰＸ)のごとき好酸球蛋白質とは実質的に反応しな い。「実質的に反応しない」なる句は、抗体が意図する目的の妨害反応性(例え ば、アッセイ)を有しないことを意味する(実験セクションをさらに参照)。 特に断らない限り、前記の抗体概念、特に抗-ＨＮＬ抗体概念は、Ｆａｂ、Ｆ( ａｂ)₂、Ｆｖ、一本鎖抗体ほか、およびＨＮＬに特異的に結合するほかのいずれ の生体特異的親和性反応物を包含する、抗体活性フラグメントおよび誘導体をも 含む。 ウサギ抗-ＨＮＬ抗体は、ポリクローナル変異体(Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.268(1993)10 425-10432)を除いて新規である。ウイルス感染症から細菌感染症の識別におい て抗体を使用することの予期せぬ利点に鑑みて、ポリクローナルウサギ変異体を 除いてすべての抗-ＨＮＬ抗体は、特許請求されるもので、本発明の１つの態様 を形成する。かくして、本発明のこの態様は、マウス、ラット、イヌ、ヒト、ネ コ、ウシ、ヒツジほか起源の哺乳動物抗体、ならびに爬虫類および鳥類の(例え ば、サンショウウオ、ニワトリまたはセキセイインコ起源の)抗体を含む。抗体 調製の通常の技術(ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体および組換え法)を 適用し得る。 優先日に進展した最良の様式を実験セクションに示す。 昨年末に、商業的な観点から最良の様式のプロトコールは、試料からＨＮＬを 捕捉するための固体支持体に連結した抗-ＨＮＬ抗体および酵素標識抗-ＨＮＬ抗 体使用して、固体支持体に捕捉されたＨＮＬを検出／定量すると考えていた。こ の様式において好ましい固体支持体および酵素基質は、各々、多孔性セルロース マトリックスおよび蛍光源性基質(fluorogenic substrate)と考えられた。 本発明を添付する請求の範囲にさらに規定し、実験セクションで説明する。 実験セクション ヒト好中球リポカリン(ＨＮＬ)の単離および精製 顆粒の単離： 顆粒は、正常なヒト血液から得た顆粒球の軟膜から調製した。約３Ｌの軟膜を 、リン酸緩衝液セーライン(Ｄulbecco緩衝液、カルシウムおよびマグネシウムを 含まない)中の２％デキストラン Ｔ-５００の等容量と共に、計測シリンダー中 で混合した。顆粒球-リッチな血漿を採取する前に、室温にて約１時間、赤血球 細胞を沈殿させた。顆粒球を該緩衝液中にて２回、０.３４Ｍシュークロース中 にて１回、４００×ｇにて１０分間遠心することによって洗浄し、ついでＰotte r-Ｅlvehjemホモジナイザーでホモジナイズした。ホンジナイズは、位相差顕微 鏡によってチェックし、約９０％の顆粒球が破砕されたら終了した。ついで、該 ホモジネートを等容量の０.３４Ｍシュークロース、０.３Ｍ ＮａＣlと混合し、 ４℃、４５０×ｇにて２０分間遠心して全細胞、細胞膜および核を除去した。上 清を１０,０００×ｇにて２０分間遠心し、顆粒を沈殿させた。１サイクルの凍 結および解凍の後、４℃にて１時間、顆粒ペレットを５容量の０.０５Ｍ酢酸、 ｐＨ４.５で抽出した。ついで、等容量の０.４Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ４.０を 添加し、４℃にて３時間、マグネチックスターラーによって抽出操作を続けた。 顆粒抽出物を１２,０００×ｇにて３０分間遠心し、顆粒蛋白質を含有する上清 を採取し、ＹＭ-１０(Ａmicon,Ｕ.Ｓ.Ａ.)フィルターを用いて、さらに精製する ために約５ｍlに濃縮した。 クロマトグラフィー操作： 濃縮した顆粒蛋白質をＳephadex^R Ｇ-75カラム(Ｐharmacia Ｂiotech ＡＢ， Ｕppsala,Ｓweden)上のゲル濾過クロマトグラフィーに付した(図１参照)。クロ マトグラフィー図のピークの蛋白質を図に示されているごとく保存し(保存１、 ２、３および４)、ＹＭ-１０フィルターを用いることによって濃縮した。各保存 液ならびに顆粒抽出物を、先に記載のごとく(Ｏlssonら，Ｂlood 44(1974)235-; およびＪohansson，Ｊ.Ｃlin.Ｌab.Ｉnvest.29 増刊号(1974)124-)精製アガロー ス上の分析用アガロース電気泳動に付した。第３および第４の保存液からの蛋白 質を、プレパックカラム中の強力な陽イオン交換樹脂Ｍono-Ｓを用いたＦＰＬＣ^R (Ｐharmacia Ｂiotech ＡＢ,Ｓweden)の手段によるイオン交換クロマトグラフ ィーに付すと、３本のピーク(Ａ、ＢおよびＣ)で出現する蛋白質が出現した(図 ２参照)。最後に、中間のピーク(Ｂ)を、ＦＰＬＣ^Rの手段によるＳuperose^R １ ２ＨＲカラム上のゲル濾過クロマトグラフィーに付すと、クロマトグラフィー図 中には１本のピークのみが出現した(図３)。 ＳＤＳ-ＰＡＧＥによる分析： ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミド電気泳動(ＳＤＳ-ＰＡＧＥ)は、 Ｌaemmli(Ｎature 220(1970)680-)に従って１５％ポリアクリルアミド上で行っ た。非還元および還元した両方の試料(１２ｍＭジチオトレイトールで９５℃に て７分間処理したもの)を電気泳動に付した。非還元試料は、ジチオトレイトー ルを省略する以外は還元試料と同条件下で処理した。蛋白質は、銀染色によって 視覚化した。銀染色したゲルは、蛋白質が明らかに均一に精製され、非還元状態 で約４５ｋＤ、還元状態で２４ｋＤの分子量を有することを示した。このデータ は、該蛋白質が、２本の明らかに同一の鎖(サブユニット)よりなることを示し、 このことは、クロマトフォーカシングおよび等電点電気泳動で得られたデータと も一致した。 雑務： プロテイナーゼインヒビターであるフッ化フェニルメチルスルホニル(PMSF)( １００μｇ/ｍl)およびダイズ・トリプシンインヒビター(SBTI)(１００μｇ/ｍl )をホモジナイズ工程から最初のイオン-交換クロマトグラフィーまでのすべての 緩衝液に添加した。 単離ＨＮＬの等電点は、クーマシーブルー染色を用いたＭultiphor^RIIユニッ ト(Ｐharmacia Ｂiotech ＡＢ,Ｓweden)上のＡmpholine^RＰＡＧプレート上の等 電 点電気泳動(ｐＨ3.5-9.5)により測定したところ約ｐＨ８.４０(示さず)であった 。 好中球顆粒放出産物およびポスト-核上清の調製 ヒト好中球は、前記のごとく軟膜から単離した。残っている赤血球は、低張溶 解(hypotonic lysis)によって除去した。簡単には、細胞懸濁液６ｍlに水１８ｍ lを３０秒間添加した。張力は３.６％ＮａＣl６ｍlで回復した。細胞は、Ｄulbe ccoリン酸緩衝液セーライン中、３７℃にて１０⁷-１０⁸細胞/ｍlで平衡化した。 平衡化後に、１μｇ/ｍlミリスチン酸ホルボール酢酸(ＰＭＡ)で５分間処理する ことによって細胞を刺激して脱顆粒させ、遠心によってペレット化した。得られ た上清を収集した。ポスト-核上清は、前記した破砕ヒト好中球から調製した。 アミノ酸分析： 自動化アミノ酸配列分析(Ｗilhelmら，Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.264(1989)17213-)は、 オン-ラインPTHアナライザーを備えたＡＢＩ４７７Ａアミノ酸シークエンサー( Ａpplied Ｂiosystems，Ｕ.Ｓ.Ａ.)で行った。蛋白質をトリプシンで処理し、そ の消化物を２.１ｍｍ×３０ｍｍ ＲＰ１８カラム上の逆相クロマトグラフィー( 水中のアセトニトリルの勾配で溶出する、両方の溶媒は０.１％トリフルオロ酢 酸を含む)によって分離した。収集したフラクションは、ＢioＩon質量分析器(Ａ pplied Ｂiosystems)上の脱プラズマ質量分析(ＰＤＭＳ，Ｅdman Ｐら，Ｅur.Ｊ .Ｂiochem.1(1967)80-)によって分析した。質量分析は、さらなる配列分析用の フラクションを選択するため、および決定した配列の対照用に用いた。 蛋白質データベースは、Ｐir-Ｐrotein(91/9リリース)およびＳwissＰrot(92/ 5リリース)、ＵＷＧＣＧソフトウェア(Ｐearsonら，Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.Ｕ ＳＡ 85(1988)2444-)を用いた論理式ＦＡＳＴＡ(Ｓundqvistら,Ｍass Ｓpectrom .Ｒev.4(1985)421-)を使用することによって検索した。 ＨＮＬの６２アミノ酸を含むＮ-末端アミノ酸配列および４つのトリプシン性 フラグメントを分析した。結果は、ヒト好中球の２４ｋＤＮ-ホルミル-ペプチド 結合蛋白質、２５ｋＤアルファ-２-ミクログロブリン-関連蛋白質(Ｔriebel ら，ＦＥＢＳ Ｌett.314(1992)386-)および好中球ゼラチナーゼ-関連リポカリン (ＮＧＡＬ)(Ｋjeldsenら，Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.268(1993)10425-)との配列同一性を 示した。後者の２種の蛋白質は、２つの他のグループによって最近同定されたも ので、彼らは該蛋白質が１２５または１３５ｋＤヘテロ二量体複合体を形成する ゼラチナーゼと共有結合していることを示した(Ｔriebelら,ＦＥＢＳ Ｌett.314 (1992)386-；およびＫjeldsenら，Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.268(1993)10425-)。本発明者 らは、非-還元 ポスト-核上清の本発明者らのイムノブロッティングによって検 出した１４０ｋＤのバンドが、ゼラチナーゼとＨＮＬとのヘテロの二量体を示し ていると考える。ヒト好中球２４ｋＤ Ｎ-ホルミル-ペプチド結合蛋白質、２５ ｋＤ アルファ-２-ミクログロブリン-関連蛋白質、好中球ゼラチナーゼ-関連リ ポカリンおよび本発明者らのＨＮＬは、同一蛋白質のようである。 ＨＮＬの免疫化学的特性： 二重免疫拡散法(Ｄevereuxら，Ｎucleic Ａcid research 12(1984)387-)は、 蛋白質が、他の好中球蛋白質(カテプシンＧ、エラスターゼ、ミエロペルオキシ ダーゼ、ライソザイムおよびラクトフェリン)、好酸球蛋白質(ＥＣＰ、ＥＰＸ／ ＥＤＮおよび好酸球ペルオキシダーゼ)に対するポリクローナル抗体と反応しな いことを示していた。 抗体の産生： ポリクローナル抗体 ＨＮＬに対する抗体は、フロイント完全および不完全アジュバント中に均一化 した(Ｓuperose^R 12HRを付けたカラムからの)精製蛋白質合計７２μｇをウサギ に多部位皮内注射することによってウサギに生起させた。抗体の特異性は、アガ ロース中の二重免疫拡散法(Ｄevereuxら,Ｎucleic Acid research 12(1984)387- )によって評価し、好中球顆粒の抽出物および以下の精製蛋白質：カテプシンＧ 、エラスターゼ、ミエロペルオキシダーゼ、ライソザイム、ラクトフェリン、好 酸球-カチオン性蛋白質(ＥＣＰ)および好酸球蛋白質Ｘ(ＥＰＸ／ＥＤＮ)に対し て 試験した。抗体は、ＨＮＬとのみ反応した。 モノクローナル抗体： 免疫化：２-３週齢のメスＢalb/cマウスをＨＮＬで皮下的に免疫化した。初回 免疫は、フロイント完全アジュバントと混合した未精製ＨＮＬ５０μｇを注射す ることによって行った。３回追加免疫は、ＰＢＳ(リン酸緩衝液セーライン)中の 精製または未精製ＨＮＬ５０、５０および３２μｇ(異なるマウス)で行った。こ れらは、初回免疫の４、８および１８週後に投与した。３の前融合追加免疫は融 合の数日前に投与した。融合は３匹のマウスからの脾臓細胞での１回目の免疫化 の１９-３０週間後に行ったが、４匹目のマウスからの脾臓は将来使用するため に凍結した。 た(Ｎature 266(1977)550-552)。脾臓からのリンパ球は、密度勾配上(Ｐercoll^R ,Ｐharmacia Ｂiotech ＡＢ；パンフレット「Ｐercoll^R：Ｍethodology and Ａp plications」および「Ｉnstructions for use」参照)にて赤血球から分離した。 その後に、融合は、Ｓｐ 2/0ミエローマ細胞とで行った。ポリエチレングリコー ル(ＰＥＧ)1500(製品番号29575 ＢＤＨ Ｌimited，Ｐoole,Ｅngland)を融合剤と して使用した。融合細胞は、０.２-０.８×１０⁵/ウェルのミエローマ細胞濃度 で播いた。 スクリーニング：培養上清は、ウェルにコートした抗原１μｇを使用したELISA 技術で試験した。未精製ＨＮＬに対するスクリーニングにより、３回の融合後、 各々、１０１／２／１０９個の陽性ハイブリドーマが明らかになった。２個のみ の陽性クローンが得られたマウスは、精製ＨＮＬ(第１回目免疫化から離した)で 追加免疫したが、他の２匹のマウスは未精製ＨＮＬで追加免疫した。未精製ＨＮ Ｌに対して反応性であることが判明した抗体も、精製ＨＮＬで試験した。このさ らなるスクリーニングにより、１８／０／９個の陽性ハイブリドーマが明らかと なった。２７個のハイブリドーマのうちの２３個がＩｇＧ１サブクラスで、よっ て興味深い。すべてのＨＮＬ陽性クローンを、ＭＰＯとの交差反応につき試験す ると、１個を除いてすべてが陰性であることが判明した。 ＢＬＡcore^Rでの実験：これらの２３個のハイブリドーマからの上清を、ＢＬＡc ore^R(Ｐharmacia Ｂiosensor ＡＢ，Ｕppsala,Ｓweden)中の未精製および精製Ｈ ＮＬの両方に対する特異性につきスクリーニングした。また、部分エピトープマ ッピングもＢＩＡcor^Rで行った。 アッセイにおける試験：精製ＨＮＬに対する特異性を考察した後に、精製ＨＮＬ とのＥＬＩＳＡにおいてエピトープマッピングを行い、希釈曲線を作成し、¹²⁵ Ｉ-ＨＮＬ標識した精製ＨＮＬでＨＮＬ Ｐharmacia ＲＩＡで試験する(競合アッ セイ：水性相中にて¹²⁵Ｉ-ＨＮＬおよびＨＮＬの混合物を、機能的に不足量の抗 -ＨＮＬ抗体と反応させ、つづいてアガロース粒子に結合した抗-マウス抗体と沈 降させ、分離し、該アガロース粒子に結合した¹²⁵Ｉ-ＨＮＬを測定する)前に、 ４個のハイブリドーマをクローン化し、増殖させ、精製した。選抜した２個のモ ノクローナル抗体(ｍａｂ₁およびｍａｂ₂)は、(ａ)試料ＨＮＬと一次抗-ＨＮＬ モノクローナル抗体(ｍａｂ₁)を運搬する多孔性の積分マトリックスとをインキ ュベートし、(ｂ)分離し、(ｃ)ＨＮＬ用のプロトタイプＰharmacia ＣＡＰ ＲＩ Ａ(Ｐharmacia Ｄiagnostics ＡＢ,Ｓweden)中において、マトリックスと二次抗 -ＨＮＬモノクローナル抗体(ｍａｂ₂；標識されており、マトリックス結合モノ クローナル抗体とは異なる)とをインキュベートする工程よりなることを特徴と するアッセイで良好に行うことが判明した。 イムノブロッティング： イムノブロッティングのために、Ｐhast^Rsystem(Ｐharmacia Ｂiotech ＡＢ, Ｓweden)上にて、該蛋白質を８-２５勾配ゲル中のＳＤＳ-ＰＡＧＥから０.２μ ｍニトロセルロースフィルター(Ｂio-Ｒad Ｌaboratories,Ｒichmond,ＣＡ,ＵＳ Ａ)に移した。さらなる結合サイトは、該ニトロセルロースフィルターを０.５Ｍ ＮａＣl、ｐＨ７.５を含む２０ｍＭ トリス緩衝液中の３％ゼラチン中にて２時 間インキュベートすることによってブロックした。トリス緩衝液、０.１％Ｔwee n^R中にて３回洗浄した後、トリス緩衝液、１％ゼラチン、０.１％Ｔween^R中に１ ：１０００に希釈した(ＨＮＬに対して向けられた)一次抗体と該ブロットとを２ 時間インキュベートした。ゲルに付着した一次抗体を、トリス緩衝液、１％ゼラ チン、０.１％Tween^R中に希釈したペルオキシダーゼ-結合ブタ抗-ウサギ抗体(Si gma)で標識し、１時間インキュベートした。ついで、該フィルターをトリス緩衝 液、０.１％Ｔween^R中で３回洗浄し、ＭgＳＯ₄ ６０ｍｇ、ベータ-ナフチルホス フェート(Ｓigma)２５ｍｇおよびテトラアゾ化ｏ-ジアニシジン(Ｓigma)を含有 する０.０６Ｍ四ホウ酸ナトリウム緩衝液ｐＨ９.７ ５０ｍl中に展開した。 好中球からの放出産物およびポスト-核上清抗体との反応による抗体の特異性 の試験には、イムノブロッティング法を適用した。非-還元ポスト-核上清の幾つ かのバンドが、１４０-２４０ｋＤ、４３-４５ｋＤおよび２４ｋＤのおおよその 分子量に検出された。還元後には、２４ｋＤの分子量に１のみのバンドが認めら れた。非-還元放出物質では、＞２００ｋＤ、４５ｋＤおよび２４ｋＤの見かけ の分子量で３本のバンドが認められた。放出物質を還元した後には、２４ｋＤの 見かけの分子量に１本のみのバンドが認められた。これらの知見は、抗体は蛋白 質を特異的に同定するが、該蛋白質は細胞中に存在し、細胞外放出後には複数の 形態で存在することを示唆している。 ラジオイムノアッセイ Ａ．操作(二重抗体ラジオイムノアッセイ) ＨＮＬは、クロラミン-Ｔ法(Ｈunterら，Ｎature 194(1962)495-)によって¹²⁵ Ｉ(Ａmersham,Ｕ.Ｋ.)で標識した。遊離¹²⁵Ｉは、Ｓephadex G-75カラム上のゲ ル濾過によって標識蛋白質から分離し、その標識蛋白質は４℃にて保存した。標 識蛋白質の特異活性は２.２９ＭＢｑ/μｇＨＮＬであった。蛋白質標準(４-２５ ６μｇ/Ｌ)を精製蛋白質から調製し、アッセイ緩衝液(後記参照)中で希釈し、使 用するまで-７０℃にて保存した;それらは再-凍結しなかった。試料または標準 のいずれかの溶液５０μlを、(希釈緩衝液中で８μｇ/Ｌに希釈した)標識ＨＮＬ ５０μl、アッセイ-緩衝液((０.０８Ｍ ＮａＣl、０.０１Ｍ Ｎａ-ＥＤＴＡ、０ .２％(ｗ/ｖ)ウシ血清アルブミン、０.０２(ｗ/ｖ)ＮａＮ₃、０.２％(ｗ/ｖ)Ｃ ＴＡＢ(臭化 Ｎ-セチル-Ｎ,Ｎ,Ｎ,-トリメチルアンモニウム)および０.５％(ｖ/ ｖ)Ｔween^R２０(ＫＥＢＯ ＡＢ,Ｓweden)を含有する０.０５Ｍ リン酸ナトリウ ム、ｐＨ７.４))および０.５％(ｖ/ｖ)Ｔween^R２０(ＫＥＢＯ ＡＢ,Ｓweden)と 逐次混合し、室温にて３時間インキュベートした。その後に、ヒツジで生起させ 、Ｓepharose^R(Ｐharmacia Ｄiagnostics ＡＢ,Ｓweden)に共有結合した抗-ウサ ギＩｇＧを含むデカンテーション懸濁液２ｍlを添加し、室温にて３０分間イン キュベーションを続けた。ＨＮＬ／ＨＮＬ-¹²⁵Ｉと抗-ＨＮＬ抗体との間の複合 体は、Ｓepharoseに結合するようになり、つづいて、１８℃、３,０００ｒｐｍ にて１０分間遠心の手段によって分離し、ペレット化し得た。デカンテーション 後に、ガンマカウンター中、１分間/チューブで放射活性を測定した。 Ｂ．血液試料： 血清試料は、血液を室温にて６０分間凝固させ、つづいて１３５０×ｇにて１ ０分間２回遠心することによって調製した。ＥＤＴＡ-含有血漿は、１３５０× ｇにて１０分間２回遠心する方法によってペレット化する血液により調製した。 Ｃ．統計的評価： Ｍan-Ｗhitney Ｕ試験、Ｓtudent試験および回帰分析を用いた。すべての統計 計算は、統計パッケージＳtatistica(Ｓtatsoft，ＵＳＡ)の方法によってパーソ ナルコンピューター上で行った。 Ｄ．測定値の特異性および範囲： ライソザイム(３.７-９００μｇ/Ｌ)、ラクトフェリン(１.９-４２６μｇ/Ｌ) 、ミエロペルオキシダーゼ(８-１０００μｇ/Ｌ)、エラスターゼ(２.９-７５０ μｇ/Ｌ)、ＥＣＰ(２-２００μｇ/Ｌ)およびＥＰＸ(３-４００μｇ/Ｌ)との交差 反応をアッセイにおいて試験して検出不可能であると判明したことは、抗体およ びアッセイの両方の高い特異性を示している。測定範囲は４-２５６μｇ/Ｌで、 検出限界は４μｇ/Ｌ未満であった。標準曲線および希釈について得られた曲線 の間の平行性を試験するために、血清を逐次希釈した。平行性はほぼ完全であっ た。 Ｅ．回収率および再現性： ４種の異なる濃度(４-３２μｇ/Ｌ)の精製ＨＮＬを正常血清に添加した場合に 、平均回収率１０２.５％(１００.４０-１０６.６６％の範囲)が得られた。アッ セイ内およびアッセイ間の変動係数は、各々６％(ｎ＝１０)および１０％(ｎ＝ １０)より低かった。 Ｆ．循環中のＨＮＬの正常レベル： 血清および血漿中のＨＮＬの正常レベルは、各々、７８.４０±２３.７０μｇ /Ｌ(±ＳＤ)(３７.９５-１９０.８７μｇ/Ｌの範囲)および５０.６５±１１.４ ３μｇ/Ｌ(±ＳＤ)(３０.５１-１０５.８０μｇ/Ｌの範囲)であった。性別およ び年令による相違はなく、血清中のレベルは血漿中のものよりも顕著に高い(ｐ ＜０.００１)が、よく相関していた(ｒ＝０.６８４、ｐ＜０.００１)。 Ｇ．患者研究： 患者群は、臨床的に診断された急性細菌およびウイルス感染症に感染した、６ １人の患者よりなり、３１人の女性および３０人の男性、７から８６歳まで、平 均４７歳の年令よりなる。細菌感染症にかかった３４人の患者群において、１６ 人が肺炎、１人が胸膜炎(pleuritis)、１０人が急性上部尿管感染症、５人が細 菌性腸炎、３人が扁桃炎、２人が軟皮膚(soft skin)感染症および２人が敗血症 である。抗生物質療法を開始する前に０日目の血液試料を採血し、その後、連続 して毎日採血した。急性ウイルス感染症にかかった２６人の患者において、５人 がインフルエンザＡ、１人がインフルエンザＢ、３人がはしか、５人がウイルス 性髄膜炎、４人が通常のかぜ、３人が急性伝染性単球増加症、１人が水痘症、１ 人がＲＳＶ-感染症で１人がウイルス性胃腸炎にかかっていた。血液試料は、(入 院および外来患者の両方とも)病院に入院後１〜２４時間に採血した。実験して いるすべての患者は入院時に３８℃を超える熱を有し、免疫抑制の治療または疾 病にかかった患者は全くいなかった。証明された細菌およびウイルス感染の両方 にかかった患者は排除した。包括的な臨床的または研究室診断は全く確立できな かったからである。２種の陽性細菌培養を有する患者は含めた。 細菌診断は、血液、液体および便、首部、生検および傷の臨床検査および/ま たは陽性培養によって確立した。 ウイルス診断は、血清学(４倍の抗体が生起するか、またはＩｇＭ陽性)、ウイ ルス分離によるか、またはウイルス抗原のイムノフルオレッセンス検出、または 臨床的兆候、履歴および病原性細菌に関する陰性培養によって確認した。 Ｃ-反応性蛋白質(ＣＲＰ)の分析は、臨床化学の日常的な部署における免疫比 濁分析によって行った。 Ｈ．患者実験の結果： 細菌またはウイルスにより急性感染した患者からの血清および血漿をＨＮＬに ついて測定した。(治療前に)ウイルスおよび細菌により感染した患者の血清およ び血漿中のＨＮＬ濃度は、各々、血清中にて９３.７８±４５.３０μｇ/Ｌ(±Ｓ Ｄ)および４０４.１４±３５５.０２μｇ/Ｌ(±ＳＤ)、および血漿中にて４７. ８１±１８.１８μｇ/Ｌ(±ＳＤ)および１４５.４６±１９４.３２μｇ/Ｌ(±Ｓ Ｄ)であった。レベルの上昇は細菌に感染した患者の血清および血漿中に見出さ れたが、ウイルスに感染した患者のものには見出されなかった。ウイルスおよび 細菌に感染した患者の血清中のＣＲＰ濃度は、各々、３６.５±３２.６ｍｇ/Ｌ( ±ＳＤ)および１５５.０±１２３.４ｍｇ/Ｌ(±ＳＤ)であって、有意差がある( ｐ＜０.００１)。血清中のＨＮＬレベルは、血漿中のものと有意に相関していた 。治療の間の臨床的な検査に４人の患者を３日間追跡した。かれらのレベルは徐 々に低下した。 ＣＲＰおよびＨＮＬの個別の決定の陽性および陰性試験の感度、特異性および 予想値を表に示す。 ＣＲＰについての最適切除は５０ｍｇ/Ｌのようであった。このレベルにおい て、予想値は約８０％である。ＨＮＬについては、最適レベルは１５５μｇ/Ｌ で、９８％の陽性予想値および８９％の陰性予想値であった。 結果のディスカッション 細菌によって感染された患者の血清および血漿において見出された顕著な上昇 レベルは、細菌感染症の早期指標としてのＨＮＬレベルの値を示している。 適当な抗生物質で治療した後、ＨＮＬレベルは下降した。動力学的研究は、Ｈ ＮＬの測定が治療効果をモニターするのに有用となり得ることを示している。血 清および血漿におけるＨＮＬレベルは、ウイルス感染の間は上昇しなかった。し たがって、ＨＮＬレベルはウイルス感染症および細菌感染症の間を識別するのに 有用となり得る。ウイルスおよび細菌感染した患者の間を識別するために、１９ ０μｇ/Ｌ、１５５μｇ/Ｌおよび１００μｇ/Ｌの３種の区別(cut-off)値をＨＮ Ｌについて試験した。正常血清ＨＮＬレベルの上限である１９０μｇ/Ｌの区別 値は最も高い感度を示したが最も低い特異性であり、平均正常血清レベルプラス そのＳＤである１００μｇ/Ｌは最も低い感度および最も高い特異性を示した。 平均正常血清レベル±約３ＳＤである１５５μｇ／Ｌの区別値を設定した場合、 ９２％の感度および９６％の特異性が得られた。正常血清ＨＮＬレベルは３７. ９５〜１９０.８７μｇ/Ｌ(平均＝７８.４０±２３.７０μｇ/Ｌ、ｎ＝１００) の範囲である。１対象を除いて、正常血清のすべてのＨＮＬレベルは１５５.０ ０μｇ/Ｌ未満であった。細菌感染における３４血清試料のうちでは、１の例外( 正常平均血清ＨＮＬレベルよりずっと低い４３.００μｇ/Ｌのレベルを有するこ の患者は胸膜炎と診断された)を除いて３３血清ＨＮＬレベルが約１５５.００μ ｇ/Ｌより上であった。このことに関する説明は、好中球顆粒の部分ＨＮＬ-不全 であり得た。ウイルス感染した患者の２６の血清試料の中で、３つの血清ＨＮＬ レベルは１５５.００μｇ/Ｌより上であった。麻疹に感染したこれらの患者のう ちの１人は、細菌感染により重複感染しているようであった。なぜならば、白 血球細胞(ＷＢＣ)およびＣＲＰも非常に上昇していたからである。 ＣＲＰに比して、血清におけるＨＮＬの測定は、細菌およびウイルス感染の間 を識別する点で勝っている。かくして、ＨＮＬに近付くＣＲＰを有する感度を得 るために、区別を１００ｍｇ/Ｌとした。しかしながら、このレベルにおいては 、特異性は明らかに容認しがたいものとなった。 予備的実験において、本発明者らは、肝臓疾患にかかった個人および骨髄移植 患者における正常より劣るＨＮＬレベルを見出した。後者の場合、移植が許容さ れた場合には、ＨＮＬ-レベルは正常レベルに達した。 図面の説明 図１．健全な血液ドナーから得た顆粒抽出物のＳephadex G-75上のゲル濾過クロ マトグラフィー カラム(２.５×９０ｃｍ)は０.２Ｍ ＮａＡｃ ｐＨ４.５で平衡化した。試料 容量は５ｍlであり、２.５ｍlフラクションを５ｍl/ｈの流速で回収した。蛋白 質は２８０ｎｍにおけるその吸収によって測定した。ＨＮＬのラジオイムノアッ セイからの結果はクロマトグラム(フラクション６０−９０)に含まれている。ピ ークの蛋白質を、クロマトグラムの底と示して保存した(保存１、２、３および ４)。上右の挿入図は、顆粒抽出物(Ｅ)およびゲル濾過からの保存１-４の電気泳 動パターンを示している。電気泳動は、精製アガロース中、ｐＨ８.６で行った 。カソードは上端にある。水平破線は出発位置を示している。 図２．Ｓephadex G-75ゲル濾過からの蛋白質含有保存液のＭono-Ｓプレパック カラム上のイオン交換クロマトグラフィー Ｍono-Ｓカラムは、０.１Ｍ ＮａＡｃ、ｐＨ５.６７で平衡化した。試料緩衝 液は、ＰＤ-１０カラム上で、０.１Ｍ ＮａＡｃ、ｐＨ５.６７と交換した。試料 をＭono-Ｓカラムに適用し、０.１から０.５のＮａＡｃ、ｐＨ５.６７の線形グ ラジエントによって溶出した。フラクションは０.５ｍl/分の流速で回収した。 ＨＮＬは、ピークＢに存在し、これを同カラム上で再クロマトグラフィーに付し た。 図３．Ｓuperose 12HRカラム上の再-イオン交換クロマトグラフィーからのＨＮ Ｌ含有ピークのゲル濾過クロマトグラフィー 蛋白質は、０.１Ｍ ＮａＡｃ、０.１５Ｍ ＮａＣl、ｐＨ５.６７で溶出した。 フラクションは、０-５ｍl/分の流速で回収した。蛋白質は１のピーク中に純粋 な蛋白質として溶出された。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/50 0276−2Ｊ Ｇ０１Ｎ 33/569 Ｚ 33/569 0276−2Ｊ 33/577 Ｂ 33/577 9282−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｃ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．細菌感染によって引き起こされる炎症のごとき、特に炎症診断用の、ヒト 疾病用診断マーカーとしてのヒト好中球リポカリン(ＨＮＬ)の使用。 ２．ＨＮＬを測定し、測定値を用いて細菌およびウイルス感染症の間を識別す ることを特徴とする請求項１記載の使用。 ３．(i)診断すべき個人由来の適当な試料中のＨＮＬレベルを測定し、ついで (ii)測定値レベルと、明らかに健康(正常)な個人について対応するレベル(正 常レベル、正常濃度範囲)とを比較することによって、ＨＮＬを疾病に関連付け る(該正常レベルから逸脱した該測定値レベルは、個人が疾病にかかっているこ との兆候とする)ことを特徴とする請求項１または２いずれか１項記載の使用。 ４．レベルの上昇を、細菌感染によって引き起こされる炎症に個人がかかって いる可能性が高いことの指標とすることを特徴とする請求項１-３いずれか１項 記載の使用。 ５．試料が、血漿もしくは血清試料のごとき血液試料または気管支肺胞洗液の ごとき血液試料であることを特徴とする請求項３または４記載のいずれか１項記 載の使用。 ６．ＨＮＬのレベルを、生体特異的親和性に基づくイムノアッセイほかのいず れかのアッセイによって測定することを特徴とする請求項１-５いずれか１項記 載の使用。 ７．ポリクローナル・ウサギ抗-ＨＮＬ抗体以外の抗-ＨＮＬ抗体調製物。 ８．モノクローナル抗-ＨＮＬ抗体調製物。