JPH09512715A

JPH09512715A - ヒトｄｎａｓｅ

Info

Publication number: JPH09512715A
Application number: JP7528905A
Authority: JP
Inventors: クレイグエイ．ローゼン，; スティーブンルベン，; マークディー．アダムス，
Original assignee: Human Genome Sciences Inc
Current assignee: Human Genome Sciences Inc
Priority date: 1994-05-05
Filing date: 1994-05-05
Publication date: 1997-12-22
Also published as: WO1995030428A1; EP0817839A1; EP0817839A4; AU6782894A

Abstract

(57)【要約】本発明は、ヒトDNaseポリペプチドおよびこのようなポリペプチドをコードするDNA（RNA）を開示する。ヒトDNaseポリペプチドは、組換えDNA技術により生産され得、そして種々の疾患の処置に対して有用である。このような処置において、ヒトDNaseポリペプチドは、適切な薬学上のキャリアまたは、希釈剤を用いて投与され、このような疾患に対して治療的効果を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】ヒトDNASE 本発明は、新たに同定したポリヌクレオチド配列、このような配列によりコードされるポリペプチド、このようなポリヌクレオチドおよびポリペプチドの使用、ならびにこのようなポリヌクレオチドおよびポリペプチドの生産に関する。より特定すると、本発明のポリペプチドは、ヒトデオキシリボヌクレアーゼ（DNas e）である。本発明はまた、このようなポリペプチドの作用を阻害することに関する。 DNaseは、ポリデオキシリボ核酸を加水分解し得るホスホジエステラーゼである。これは、DNAに作用して、DNAを広範囲にかつ非特異的に分解し、そしてこの点に関して、DNaseは、相対的に限定され、配列特異的な制限エンドヌクレアーゼと区別される。上記の分解活性は、非特異的である。しかし、DNaseはまた、２本鎖DNAを分解して、5'オリゴヌクレオチドを生成する。DNaseＩおよびDNaseI Iの２つのタイプのDNaseが存在する。DNaseＩは、中性付近に至適pHを有し、２価カチオンを必須的に要求し、そしてDNAの加水分解に際して5'リン酸化ヌクレオチドを生成する。DNaseIIは、酸性の至適pHを示し、２価カチオンにより活性化され得、そしてDNAの加水分解に際して3'リン酸化ヌクレオチドを生成する。複数の分子形態のDNaseＩおよびDNaseIIもまた、知られている。 DNaseＩは、主として、消化性酵素である。しかし、DNaseＩと同様な活性が、他の組織において見出されている。このことは、他の機能を有し得ることを示唆する（Laskowski、参照1971）。例えば、DNaseは、アクチンの多量体化(polimer ization)において役割を果たし得ると考えられてきた（Suckら、参照1981）。原核生物細胞におけるDNaseは、種々の代謝機能に関与し、それには、遺伝子組み換え、DNA損傷の修復、外来DNAの制限およびDNAの細胞内への輸送が挙げられる。種々の種由来のDNaseが、種々の程度に精製されてきた。ウシDNase A、B、C、およびDが精製され、そして1973年という初期に完全に配列決定が行われた（Lia oら、J．Biol．Chem. 248：１489[1973]）。ブタおよびウシのDNaseが精製され、そして完全に配列決定された（Paudelら、J．Biol．Chem. 261：16001[1986] ）。ヒト尿のDNaseを電気泳動的に均一状態にまで精製し、そしてＮ末端アミノ酸がロイシンであると観測されたことが報告された；他の配列は報告されなかった（Itoら、J．Biol．Chem．95：1399[1984]）。近年、PCT国際出願番号PCT/US89/05744（Genentic，Inc.により出願された）に示されるように、ウシおよびヒトのDNaseＩ遺伝子がクローン化され、そして発現された。これは、ヒトDNaseが膵臓から単離されたことを開示している。 Shieldsらの参考文献は、ウシDNaseＩの遺伝子の一部分の発現クローニング(e xpression cloning)ならびに、E.coliでの生物学的および免疫学的に活性である融合タンパク質の発現を記載した（Biochem．Soc．Trans. 16：195[1988]）。しかし、ShieldsらのDNase産物は、宿主細胞に対して毒性的であり、そして誘導性プロモーターの使用により得られ得たに過ぎなかった。さらに、いずれか一方のクローンからプラスミドDNAを単離する試みにおいて、大きな困難（クローン由来のDNsaeの構成的なレベルの発現に起因する障害）に遭遇した。その結果、これらの著者は、DNaseをコードする核酸の配列を決定し得なかった。Shieldsらによれば、プラスミドが回収できないことは、プロモーターが低温で抑制されている場合でさえも、DNaseの構成的な発現の結果であった。このことは、相当の障害を生み出した。なぜなら、Shieldsらは発現クローニングにより確認したにすぎないが、このことは、何らかの性質のプロモーターの制御下にDNaseを配置することを必然的に要求する。 DNaseは、多くの公知の利用性を見出し、そして治療目的のために使用されてきた。おもな治療使用は、肺炎、嚢胞性線維症のような疾患における肺分泌物の粘性を減少させ、それによって呼吸気道の清掃(cleaning)を援助することである。分泌物による気道の閉塞は、呼吸困難を引き起こし得、そして場合によっては、呼吸不全および死に至らし得る。本発明の１つの局面によれば、DNaseである新規なポリペプチド、ならびにそのアナログおよび誘導体が提供される。本発明のDNaseは、ヒト起源である。本発明の別の局面によれば、このようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（DNAまたはRNA）が提供される。本発明のさらに別の局面によれば、このようなポリペプチドを組換え技術により生成する手順が提供される。本発明のなおさらなる局面によれば、このようなポリペプチド、またはこのようなポリペプチドをコードするDNA配列を、治療の目的で（例えば、気管支肺の分泌物の粘性を酵素的に改変するために）利用するプロセスが提供される。本発明のこれらの局面および他の局面は、本明細書中の教示により当業者には明らかであるべきである。以下の図面は、本発明の実施態様の例示であり、そして請求の範囲により含まれる本発明の範囲を限定することを意図しない。図１は、本発明のヒトDNaseのアミノ酸配列およびDNA配列を示す。アミノ酸配列を、それらの標準的な１文字略号により示す。示されたタンパク質は、プロセス前の形態のタンパク質である。図２は、異なる時間間隔で、可溶性画分と対照的に、細菌発現系のペレット画分から遊離したDNaseの量を示す。図３は、異なる培地における、そして異なるpHでのDNaseの精製の成功の割合を示す。図４は、ノーザンブロット分析の使用によるDNaseの組織分布を示す。これは、DNaseが、肺および心臓で優勢であることを示す。図５は、２本鎖DNAを消化するDNaseの能力を示す。図６は、DNase活性を示す。DNAを、³²P-dCTPで標識した。次いで、DNaseを、所定量の標識DNAと共にインキュベートし、そしてサンプルを取り出して液体シンチレーションにより計数した。図７は、pQE-9ベクターの模式図である。本発明の１つの局面によれば、図１の図面に記載するようなDNA配列（および対応するRNA配列）および／または図１の図面の配列と同じポリペプチドをコードするDNA（RNA）配列、ならびにこのような配列のフラグメント部分、誘導体、アナログ、およびすべての対立遺伝子変異体が提供される。図１のポリペプチドは、プロセス前の形態のタンパク質であって、リーダー配列を有する。プロセス形態または成熟形態は、アミノ酸19で始まる。本発明の別の局面によれば、1993年８月４日に寄託された、ATCC寄託番号7551 5として寄託されたcDNAクローンのポリヌクレオチドと同じポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および／またはこのようなポリヌクレオチドのフラグメント、アナログ、誘導体または対立遺伝子変異体が提供される。ポリヌクレオチド（DNAまたはRNA、好ましくはDNA）は、ポリペプチドのコード部分を少なくとも含み、このコード部分は、寄託したクローンにおける部分と同一であり得るか、または同一のポリペプチドもしくはその対立遺伝子変異体についてコードされる場合、寄託したクローンにおける部分と異なり得る。コード部分は、好ましくは、本発明のポリペプチドの成熟形態を少なくともコードする。本発明はさらに、配列間に少なくとも50％、および好ましくは少なくとも70％の同一性がある場合、本明細書中上記のポリヌクレオチド配列にハイブリダイズするポリヌクレオチド配列に関する。好ましい別の実施態様において、本発明は、本明細書中上記のポリヌクレオチド配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド配列に関する。本明細書中で用いられる用語「ストリンジェントな条件」は、ハイブリダイゼーションが、セグメント間に少なくとも95％、および好ましくは少なくとも97％の同一性がある場合に生じることを意味する。従って、本発明は、図１のDNAによりコードされるペプチドの対立遺伝子変異体の形態をコードするDNA（RNA）配列を包含する。従って、本発明は、天然に存在するヒトポリペプチド（これはDNaseである）、ならびにその対立遺伝子変異体をコードする単離されたDNA（RNA）を提供する。DNA（RNA）は、好ましくは、精製された形態および単離された形態で提供される。本発明はさらに、DNaseであり、そして図１に示す構造を有するポリペプチド、ならびにその対立遺伝子変異体、およびそのアナログ、そのフラグメント、その誘導体およびその対立遺伝子変異体、および天然に存在するポリペプチドと同一の機能を有するポリペプチドに関する。本発明はさらに、1993年８月４日に、ATCC番号75515として寄託されたクローン中に含有されるDNAによりコードされるポリペプチド、ならびにそのアナログ、そのフラグメント、その誘導体、およびその対立遺伝子変異体に関する。これらの寄託物は、特許手続きの目的のための微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の条件下に維持される。これらの寄託物は、当業者に便宜上のみ提供されるだけであり、そして米国特許法第112条の下で寄託が必要とされることを容認するものではない。寄託物に含まれるポリヌクレオチドの配列、ならびにそれによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列は、本明細書中に参考として援用され、そして本明細書中の配列の記載とのいかなる不一致の事象においても管理されている。寄託物を製造し、使用し、または販売するためには実施許諾が必要とされ得、そしてこのような実施許諾は本明細書によって与えられるわけではない。本発明のポリペプチドは、好ましくは単離された形態で提供され、そして好ましくは精製される。用語「単離された」は、物質がその本来の環境（例えば、天然に存在する場合は、天然の環境）から取り出されていることを意味する。例えば、生きている動物に存在する天然のポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、単離されていないが、天然系において共存する物質の幾らかまたは全部から分離された同一のポリヌクレオチドまたはDNAまたはポリペプチドは、単離されている。このようなポリヌクレオチドは、ベクターの一部であり得、および／またはこのようなポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、組成物の一部であり得、そしてさらにこのようなベクターまたは組成物がその天然の環境の一部ではないため単離されている。好ましい実施態様において、DNaseは、全長の成熟ヒトDNaseまたはその対立遺伝子変異体またはそのグリコシル化変異体である。ポリヌクレオチドはまた、成熟タンパク質のようにプロセスされ、そして哺乳動物細胞から分泌されるプレタンパク質をコードし得る。プレタンパク質は、プロセスされ、成熟タンパク質として哺乳動物細胞から分泌される。本発明のポリヌクレオチド配列は、ポリペプチドの成熟体をコードし得るか、またはリーダー配列をコードし得る。例えば、所望のDNA配列は、同じリーディングフレーム内で、ポリペプチドの発現および分泌を補助するDNA配列（例えば、宿主細胞からのポリペプチドの輸送を制御するための分泌配列として機能するリーダー配列）に融合され得る。リーダー配列を有するタンパク質は、プレタンパク質であり、そして宿主細胞により切断されて、成熟形態のタンパク質を形成するリーダー配列を有し得る。本発明のポリヌクレオチドはまた、本発明のポリペプチドの精製を可能にするマーカー配列（例えば、ヘキサヒスチジンタグ）にインフレームで融合され得る。従って、本発明のポリペプチドは、本発明のDNaseの成熟形態であり得る；または、プレタンパク質もしくはプレポリペプチドの形態であり得る（ここで、DN aseは、リーダー配列もしくは分泌配列を含有する）；または、融合タンパク質の形態であり得る（ここで、例えばポリペプチドの精製において援助する付加的なアミノ酸が、その3'末端もしくは5'末端のいずれかで、成熟タンパク質もしくはプレタンパク質に融合される）。好ましい実施態様において、マーカー配列はヘキサヒスチジンタグであり、これは、プラスミドpQE-9により供給される。本明細書上記のように、本発明はまた、図１のDNAによりコードされるポリペプチドの変異体または、および寄託されたクローン中に含有されるDNAの変異体（DNaseであるようなポリペプチドの定性的な活性を保持する）を含む。変異体は、置換(substitutional)変異体、または挿入変異体、または欠失変異体であり得る。このような変異体は、天然に存在する対立遺伝子変異体（例えば、アミノ酸レベルでの異なるグリコシル化パターンまたはアミノ酸レベルでの置換またはアミノ酸レベルでの欠失を有する変異体）であり得る。このような変異体はまた、部位特異的変異誘発により産生され得る。置換変異は、保存アミノ酸の置換または非保存アミノ酸の置換であり、そして好ましくは保存アミノ酸であり得る。本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、以下の組織の１つから調製した１つ以上のライブラリーから入手し得る：心臓、肺、幼児の脳、および胎盤。本ヌクレオチドは298アミノ酸のオープンリーディングフレームを含有し、これは、ヒト膵臓DNaseと非ヒト膵臓DNaseの両方に対していくらかの相同性を示す、プロセス前の形態をコードする。最高の組合せ(match)においては、以下の通りである：282アミノ酸の広がり(stretch)にわたって、ヒト膵臓DNaseに対して、34％の同一性および53％の類似性。コード配列はまた、ブタ由来のDNas eＩに60％の同一性および75％の類似性の領域を含有し、そして全体で54％の類似性性である。アミノ酸組成に基づいて予想される分子量は、33kDaである。宿主細胞は、本発明の発現ベクターを用いて形質転換され、そしてプロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、またはDNase遺伝子を増幅するために適切に改変した従来の栄養培地中で培養される。培養条件（例えば、温度、pHなど）は、発現のために選択される宿主細胞で以前に使用された条件であり、そして当業者には明らかである。「形質転換」は、DNAを生物中に導入し、その結果、DNAは、染色体外エレメントとしてか、または染色体への組込みによるかのいずれかで、複製可能であることを意味する。特に示さない限り、宿主細胞の形質転換のために本明細書中で使用される方法は、Graham，F.およびdan der Eb，A.、Virology 52：456-457(197 3)の方法である。しかし、DNAを細胞に導入する他の方法（例えば、核注入による、またはプロトプラスト融合による）もまた、使用され得る。実質的に細胞壁構築物を含む、１つまたは複数の原核生物細胞を使用する場合、トランスフェクションの好ましい方法は、Cohen，F.N.ら、Proc．Natl．Acad．Sci. (USA)、69 ：2110(1972)の記載のような、塩化カルシウムを用いるカルシウム処理である。「トランスフェクション」は、任意のコード配列が最終的に発現されるかどうかに関係なく、DNAを宿主細胞中に導入することを示す。細胞は、自然には、DNA を取り込まない。従って、種々の技術的な「トリック」を利用して、遺伝子導入を可能にしてきた。多くの方法のトランスフェクションが、当業者には公知である（例えば、CaPO₄およびエレクトロポレーション）。宿主細胞の形質転換は、首尾良くいくトランスフェクションの証である。本発明のポリヌクレオチドは、組換え技術によりポリペプチドを生成するために用いられ得る。従って、例えば、ポリヌクレオチド配列は、ポリペプチドを発現するための種々の発現ベクターまたはプラスミドのいずれか１つに含まれ得る。このようなベクターは、染色体、非染色体、および合成DNA配列を包含し、例えば、SV40の誘導体；細菌のプラスミド；ファージDNA；酵母プラスミド；プラスミドおよびファージDNAの組み合わせに由来するベクター、ワクシニア、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、および仮性狂犬病のようなウイルスDNAである。適切なDNA配列は、種々の手順によりベクターに挿入され得る。一般的に、DNA 配列は、当該分野で公知の手順により適切な制限エンドヌクレアーゼ部位（１つまたは複数）に挿入される。このような手順および他の手順は、当業者に公知の範囲内であると考えられる。発現ベクター中のDNA配列は、適切な発現制御配列（プロモーター）（１つまたは複数）に作動可能に連結され、mRNAの合成を指示する。このようなプロモーターの代表的な例としては、以下が挙げられ得る：LTRまたはSV40プロモーター、E.coli lacまたはtrp、λファージPLプロモーター、および原核細胞または真核細胞あるいはそれらのウイルス内で遺伝子の発現を制御することが公知である他のプロモーター。発現ベクターはまた、翻訳開始のためのリボソーム結合部位、および転写ターミネーターを含有する。ベクターはまた、発現を増幅するための適切な配列を含有し得る。さらに、発現ベクターは、好ましくは、形質転換された宿主細胞の選択のための表現型特性（例えば、真核細胞培養物についてはジヒドロ葉酸レダクターゼ耐性またはネオマイシン耐性、またはE．coliにおけるテトラサイクリン耐性またはアンピシリン耐性）を提供する１つの遺伝子を含有する。本明細書中上記のような、適切なDNA配列ならびに適切なプロモーター配列または制御配列を含むベクターは、適切な宿主を形質転換して宿主にタンパク質を発現させるために用いられ得る。細菌の発現系（例えば、E.coli）から発現されるような本発明のヒトDNaseを、図２および図３（レーン５）に示す。適切な宿主の代表的な例としては、以下が挙げられ得る：細菌細胞（例えば、E．coli、S almonella typhimurium）；真菌細胞（例えば、酵母）；動物細胞（例えば、Cos -7細胞、CHO、またはBowes黒色腫）；植物細胞など。適切な宿主の選択は、本明細書中の教示により当業者の範囲内であると考えられる。本発明のDNaseを、ヘキサヒスチジンタグに対して高い親和性を有するニッケルキレート樹脂の使用によりE.coli宿主より精製した。さらに特定すると、本発明はまた、上で広範に記載した１つ以上の配列を含む組換え構築物を包含する。構築物は、ベクター（例えば、プラスミドベクターまたはウイルスベクター）を包含し、このベクターの中には本発明の配列が正方向または逆方向に挿入されている。この実施態様の好ましい局面において、構築物はさらに、配列に作動可能に連結された調節配列（例えば、プロモーターを包含する）を含む。多数の適切なベクターおよびプロモーターが当業者には公知であり、そして購入可能である。以下のベクターが例として提供される。細菌性：pQ E-9（Qiagen）、pBs、phagescript、pD10、PsiXI74、pbluescript SK、pBsKS、P NH8A、PNE16A、PNH18A、PNH46A（Stratagene）；Ptrc99a、PKK223-3、PKK233-3 、PDR540、PRIT5（Pharmacia）。真核性：pWLneo、PSV2CAT、POG44、PXTI、pSG （Stratagene）、PSVK3、PBPV、PMSG、PSVL（Pharmacia）。また、宿主において複製可能で、そして生存可能である限り、任意の他のプラスミドまたはベクターも使用され得る。プロモーター領域は、CAT（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ）ベクターまたは選択可能なマーカーを有する他のベクターを使用して、任意の所望の遺伝子から選択され得る。２つの適切なベクターは、PKK232-8およびPC M7である。特に示される細菌プロモーターには、lacl、lacZ、T3、T7、gpt、λP_R 、およびtrcが挙げられる。真核プロモーターには、CMV即時型初期、HSVチミジンキナーゼ、初期SV40および後期SV40、レトロウイルス由来のLTR、およびマウスメタロチオネインＩが挙げられる。適切なベクターおよびプロモーターの選択は、十分に当業者のレベル内にある。さらなる実施態様では、本発明は上記の構築物を含有する宿主細胞に関する。宿主細胞は、高等真核細胞（例えば、哺乳動物細胞）または下等真核細胞（例えば、酵母細胞）であり得るか、または宿主細胞は、原核細胞（例えば、細菌細胞）であり得る。構築物の宿主細胞への導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、DEAEデキストラン媒介トランスフェクション、またはエレクトロポレーションにより達成され得る（Davis，L.、Dibner，M.、Battey，I.、Basic Metho ds in Molecular Biology 、1986）。宿主細胞中の構築物は、組換え配列によりコードされる遺伝子産物を産生するために、従来の方法で使用され得る。あるいは、コードされるポリペプチドは、従来のペプチド合成機により合成的に生成され得る。成熟タンパク質は、哺乳動物細胞、酵母、細菌、または他の細胞中で適切なプロモーターの制御下で発現され得る。無細胞翻訳系もまた、このようなタンパク質を生成するために、本発明のDNA構築物に由来するRNAを使用して用いられ得る。原核宿主および真核宿主で使用される適切なクローニングベクターおよび発現ベクターは、Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第２版（ Cold Spring Harbor、N.Y.、（1989）に記載され、この開示は、本明細書中に参考として援用される。本発明のポリペプチドをコードするDNAの高等真核生物による転写は、ベクターにエンハンサー配列を挿入することにより増大される。エンハンサーはDNAのシス作用因子であり、通常は約10〜約300bpであり、これはプロモーターに作用してその転写を増大させる。例としては、複製起点の後期側のSV40エンハンサー（bp100〜270）、サイトメガロウイルスの初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーが挙げられる。一般に、組換え発現べクターは、複製起点および宿主細胞の形質転換を可能とする選択マーカー（例えば、E．coliのアンピシリン耐性遺伝子およびS．cerevi siae のTRP1遺伝子）および下流の構造配列の転写を指示する高発現遺伝子に由来するプロモーターを含有する。このようなプロモーターは、特に解糖酵素（例えば、3-ホスホグリセリン酸キナーゼ（PGK）、α因子、酸性ホスファターゼ、または熱ショックタンパク質など）をコードするオペロンに由来し得る。異種構造配列は、翻訳開始配列および翻訳終止配列、および好ましくは翻訳されたタンパク質をペリプラズマ空間または細胞外の培地へ分泌することを指示し得るリーダー配列と適切な相内で組立てられる。細菌での使用に有用な発現ベクターは、機能的なプロモーターを伴う作動可能な読みとり相で、所望のタンパク質をコードする構造DNA配列を適切な翻訳開始シグナルおよび翻訳終止シグナルと共に挿入することにより構築される。ベクターは、１つ以上の表現型選択マーカー、ならびに、ベクターの維持を保証するため、および所望により宿主内での増幅を提供するために複製起点を含有する。形質転換のために適切な原核宿主には、E．coli、Bacillus subtilis、Salmonella typhimurium 、ならびにPseudomonas属、Streptomyces属、およびStaphylococcu s属の種々の種が挙げられるが、他の種もまた選択対象として用いられ得る。代表的であるが、限定しない例として、細菌での使用に有用な発現ベクターは、周知のクローニングベクターPBR322（ATCC 37017）の遺伝エレメントを含む市販のプラスミドに由来する選択マーカーおよび細菌の複製開始点を含有し得る。このような市販のベクターは、例えば、PKK223-3（Pharmacia Fine Chemicals、 Uppsala、Sweden）およびGEM1（Promega Biotec、Madison、WI、USA）が挙げられる。これらのPBR322「骨格」部分は、適切なプロモーターおよび発現されるべき構造配列と組み合わされる。適切な宿主株の形質転換および適切な細胞密度への宿主株の増殖に続いて、選択されたプロモーターは、適切な手段（例えば、温度シフトまたは化学的誘導）により脱抑制され、そして細胞はさらなる期間培養される。細胞は、代表的には遠心分離により集められ、物理的手段または化学的手段により破砕され、そして得られた粗抽出物はさらなる精製のために保持される DNaseは、ヒト、ウシ、ヒツジ、またはブタDNaseについてそれ以前に使用された方法により、組換え細胞培養物から精製される。この方法には、硫安沈殿またはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、リン酸セルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー（例えば、固体担体上のDNAまたはヌクレオチドを用いる）、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィーが挙げられる。さらに、逆相HPLCおよび抗DNase抗体を用いるクロマトグラフィーは、DNaseの精製に有用である。以前に記載（Priceら、J ．Biol．Chem. 、244：917[1969]）のように、精製の間に存在する低濃度（約0.1 〜5mM）のカルシウムイオンを有することが好ましい。DNaseを安定化させる他の２価陽イオンもまた、同様に利用される。DNaseは、PMSFのようなプロテアーゼインヒビターの存在下で精製され得る。種々の哺乳動物細胞の培養系もまた、組換えタンパク質を発現するために用いられ得る。哺乳動物発現系の例には、Gluzman、Cell、23：175（1981）に記載されているサル腎臓繊維芽細胞のCOS-7株、および適合性のベクターを発現し得る他の細胞株（例えば、C127、3T3、CHO、HeLa、およびBHK細胞株）が挙げられる。哺乳動物発現ベクターは、複製起点、適切なプロモーターおよびエンハンサー、ならびにまた、任意の必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナー部位およびスプライスアクセプター部位、転写終止配列、および５’ フランキング非転写配列を含有する。SV40ウイルスゲノム（例えば、SV40オリジン部位、初期プロモーター部位、エンハンサー部位、スプライス部位、およびポリアデニル化部位）由来のDNA配列は、必要な非転写遺伝エレメントを提供するために使用され得る。細菌培養で産生する組換えタンパク質は、通常、細胞ペレットから最初に抽出することにより単離され、続いて１回以上の塩析、水性のイオン交換クロマトグラフィー工程またはサイズ排除クロマトグラフィー工程が行われる。必要に応じて、タンパク質の再折りたたみ（refolding）工程が、成熟タンパク質の配置を完全にするために使用され得る。最終的に、高速液体クロマトグラフィー（HPLC ）が、最終精製工程に用いられ得る。タンパク質の発現に用いた細菌細胞は、凍結融解の繰り返し、超音波、機械的破砕、または細胞溶解剤の使用を含む、任意の従来方法により破砕され得る。本発明のポリペプチドは、天然の精製された産物、または化学合成手順の産物であり得るか、あるいは原核宿主または真核宿主（例えば、培養物中の細菌、酵母、高等植物、昆虫、および哺乳動物細胞）から、本発明のポリヌクレオチド配列の組換え技術により生成され得る。組換え産生手順に用いられる宿主に依存して、本発明のポリペプチドは、哺乳動物の炭水化物または他の真核性の炭水化物でグリコシル化され得るか、あるいはグリコシル化され得ない。本発明のポリペプチドはまた、開始メチオニンアミノ酸残基を（１位に）含有し得る。ポリペプチドの天然に存在する対立遺伝子形態に加えて、本発明はまた、そのアナログおよびフラグメントを包含する。従って、例えば、ポリペプチドの１つ以上のアミノ酸残基は、保存アミノ酸残基により置換され得る。本発明の精製DNaseを用いて、上記のような方法で粘液の粘性を酵素的に低減し得る。この活性に基づき、肺疾患を有する患者の処置に特に有用である。このような患者は、急性または慢性の気管支肺疾患（感染性肺炎、気管支炎、または気管気管支炎、気管支拡張、襄胞性腺維種、ぜん息、TB、またはカビ感染）、気管または気管支の衝撃による肺拡張不全および気管切開による合併症のような状態で、異常な、粘稠性の、稠厚性の気管支分泌物を有する。このような治療のために、ヒトDNaseの溶液または細かく分けた乾燥調製物を、例えば、DNase溶液のエアロゾル投与により、気管支内に従来の方式で注入する。これらの直接的な使用に加えて、DNaseは、密閉空間の感染、気種、髄膜炎、腹膜炎、副鼻腔炎、耳炎、歯周炎、膵炎、胆石症、エンドクロジティス(endocro ditis)、および敗血性関節炎の膿腫の管理のために、ならびに種々の炎症および感染性損傷（例えば、皮膚および／または粘膜の感染性損傷）、外傷、潰瘍性損傷および火傷における局所的処置での補助的な処置を有する。ヒトDNaseは、体腔を連絡する医療的導管において流れを維持することにおいて有用性を見出す。このような導管は、外科的ドレナージ管、尿カテーテル、腹膜透析ポート、および気管内酸素カテーテルを包含する。本発明のDNaseはまた、感染において抗生物質の効率を改善し得る。DNaseはまた、薬学的調製物中のDNA混入物の分解において有用であり得る。最後に、DNase は、細胞破片（細胞DNAを含む）が蓄積する非感染状態の処置において有用であり得る。例えば、腎孟腎炎および尿細管間質性腎臓病(tubulo-interstitial kid ney disease)の処置における系統的な投与後、DNaseは有用である。本発明のポリペプチドはまた、本発明に従って、インビボでのこのようなポリペプチドの発現により使用され得る。これはしばしば「遺伝子治療」と呼ばれる。従って、例えば、細胞（例えば、肺細胞および心臓細胞）は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド(DNAまたはRNA)を用いてエキソビボで形質導入され得、次いで、形質導入細胞はこのポリペプチドで処置されるべき患者に提供される。このような方法は当該分野で周知である。例えば、細胞は、本発明のポリペプチドをコードするRNAを含有するレトロウイルス粒子の使用により、当該分野で公知の手順によって形質導入され得る。同様に、細胞の形質導入は、インビボでのポリペプチドの発現のために、例えば、当該分野で公知の手順によりインビボで達成され得る。当該分野で公知のように、本発明のポリペプチドをコードするRNAを含有するレトロウイルス粒子を産生するための産生細胞は、インビボで形質導入およびインビボでのポリペプチドの発現のために患者に投与され得る。このような方法により本発明のポリペプチドを投与するためのこれらの方法および他の方法は、本発明の教示から当業者には明らかであるはずである。例えば、形質導入する細胞のための発現ビヒクルは、レトロウィルス粒子以外、例えばアデノウィルスであり得る。例えば、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、アデノウィルスベクター内に連結される。次いで、アデノウィルスベクターは送達ベヒクル（例えば、エアロゾル散布）中にパッケージされ得、そして鼻腔または口腔を通じて肺内へ噴霧することにより患者に投与され得る。次いで、細胞は、本発明のポリペプチドをコードするDNA配列によりインビボでトランスフェクトされてDNa seを産生する。この方法では、DNaseは、例えば肺炎において、肺中の過剰に分泌された粘液を分解して、呼吸を容易にする。本発明のポリペプチドは、適切な薬学的キャリアと組み合わせて用いられ得る。このような組成物は、治療有効量のタンパク質、および薬学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤を包含する。このようなキャリアは、生理食塩液、緩衝化生理食塩液、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、およびそれらの組み合わせを包含するが、これらに限定されない。処方物は、投与の態様に適合させるべきである。例えば、本発明のヒトDNaseは、必要とする補助因子とともに、治療的処方物に置かれる。DNaseの処方物は液体、凍結乾燥粉末であり得るか、またはDNaseはフッ素化炭素の処方物および計量用量吸入器を用いてエアロゾル化され得るか、または凍結乾燥粉末および製粉粉末として吸入され得る。本発明のDNaseが、上記のように薬剤として使用される場合、例えば、少なくとも約10μg／kg体重の適切な用量で投与される。そしてほとんどの場合、１日当たり約８mg／kg体重を超えない量で、例えば、投与経路、病状などを考慮して、約2.5mg／人／日の用量で投与される。本発明はまた、本発明の薬学的組成物の１つ以上の成分で満たされた１つ以上の容器を含有する薬学的パックまたはキットを提供する。このような容器は、薬剤または生物学的製品の製造、使用、または販売を統制する政府機関により規定された形式の通知と関連し得る。この通知はヒトへの投与についての製造、使用、または販売における機関による認可を反映する。さらに、本発明のポリペプチドは、他の治療用化合物と併用して用いられ得る。本明細書中で同定されたcDNA配列のそれぞれまたはその一部分は、ポリヌクレオチド試薬として様々な方法で使用され得る。この配列は、特定の細胞タイプにおける特異的なmRNAの存在についての診断プローブとして使用され得る。さらに、これらの配列は、遺伝子連鎖分析（多型）における使用に最適な診断プローブとして使用され得る。本発明の配列はまた、染色体の同定に有益であり得る。この配列は、個々のヒト染色体上の特定の位置を特異的に標的化し、そしてその位置でハイブリダイズし得る。さらに、現在は染色体上の特定の部位を同定する必要がある。現在、染色体位置の標識に利用可能な実際の配列データ（反復多型）に基づいた染色体標識試薬はほとんどない。本発明によるcDNAの染色体へのマッピングは、これらの配列と疾患に関する遺伝子との相関付けにおいて重要な、第１の工程である。簡略に述べれば、配列は、cDNAからPCRプライマー（好ましくは15〜25bp）を調製することにより染色体にマップされ得る。cDNAのコンピューター解析は、ゲノムDNA内で１つより多いエキソンにまたがらず、したがって増幅プロセスを複雑化しないプライマーを迅速に選択するために使用される。次いで、これらのプライマーは、個々のヒト染色体を含有する体細胞ハイブリッドのPCRスクリーニングに使用される。プライマーに対応するヒト遺伝子を含有するハイブリッドのみが増幅フラグメントを生じる。体細胞ハイブリッドのPCRマッピングは、特定の染色体に特定のDNAを割り当てるための迅速な手順である。同じオリゴヌクレオチドプライマーと共に本発明を使用して、特定の染色体由来のフラグメントのパネルまたは類似の様式の大きなゲノムクローンのプールを用いて部分的位置決め(sublocalization)が達成され得る。染色体にマップするために同様に使用され得る他のマッピング戦略は、ハイブリダイゼーション、フローサイトメトリーで選別した（flowsorted）標識染色体を用いるプレスクリーニング、および染色体特異的cDNAライブラリーを構築するためのハイブリダイゼーションによるプレ選択を包含する。 cDNAクローンの中期染色体展開物への蛍光インサイチュハイブリダイゼーション(FISH)は、１工程で正確な染色体位置を提供するために使用され得る。この技術は、500または600塩基ほどの短いcDNAで使用され得る；しかし、2,000bpよりも大きいクローンの方が、簡便な検出では十分なシグナル強度で独特の染色体位置に結合しやすい。FISHは、ESTが由来するクローンの使用を必要とし、そしてこのクローンは長いほど好ましい。例えば、2,000bpが良好であり、4,000bpはより良好であり、そして4,000bpを超える長さは、時間の合理的な割合で（a reson able percentage of the time）良好な結果を得るためにおそらく必ずしも必要でない。この技術の総説については、Vermaら、Human Chromosomes：a Manual o f Basic Techniques 、Pergamon Press、New York(1988)を参照のこと。一旦配列が正確な染色体位置にマップされると、染色体上での配列の物理的な位置を遺伝的地図のデータと相関させ得る。（このようなデータは、例えば、V. McKusick、Mendelian Inheritance in Man に見出される（Johns Hopkins Univ ersity Welch Medical Libraryからオンラインで入手可能である））。次いで、同一の染色体領域にマップされている遺伝子と疾患との関係が、連鎖解析（物理的に隣接した遺伝子の同時遺伝）により同定される。次に、罹患個体と非罹患個体との間のcDNAまたはゲノム配列の差異を決定する必要がある。変異が、いくつかまたはすべての罹患個体に観察されるが、正常な個体には観察されない場合、この変異は疾患の原因因子であると思われる。物理的マッピングおよび遺伝的マッピング技術の現在の解像度では、疾患に関する染色体領域に正確に位置決めされたcDNAは、50と500との間の潜在的原因遺伝子の１つであり得る。（これは、１メガ塩基のマッピング解像度で、そして20 kbあたり１遺伝子と仮定する。）罹患個体と非罹患個体との比較は、一般に、まず染色体の構造変化（例えば、染色体展開物から目視可能であるか、あるいはそのcDNA配列に基づくPCRを使用して検出可能である欠失または転座）を探す工程を包含する。最終的には、変異の存在を確認し、そして変異を多型から区別するために、数個体由来の遺伝子を完全に配列決定する工程が必要とされる。このタンパク質、そのフラグメントまたは他の誘導体、またはそれらのアナログ、あるいはそれらを発現する細胞は、それらに対する抗体を生成させるための免疫原として使用され得る。これらの抗体は、例えば、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体、キメラ抗体、単鎖抗体、Fabフラグメント、またはFab発現ライブラリーの産物であり得る。当該分野で公知の種々の手順が、このようなポリクローナル抗体の生成のために使用され得る。本発明の配列に対応するポリペプチドに対して生成される抗体は、動物へのポリペプチドの直接注射により、または動物へのポリペプチドの投与により得られ得る。この動物は、好ましくはヒトではない。次いで、このようにして得られた抗体は、ポリペプチド自体に結合する。この方法では、ポリペプチドのフラグメントのみをコードする配列でさえも、天然のポリペプチド全体に結合する抗体を生成するために使用され得る。次いで、このような抗体は、ポリペプチドを発現する組織からそのポリペプチドを単離するために使用され得る。さらに、このような抗体（非常に数多くのポリペプチドに特異的な）のパネルを用いて、このような組織を同定し得、そして区別し得る。モノクローナル抗体の調製のために、連続的な細胞株培養により産生される抗体を提供する任意の技術が使用され得る。例としては、ハイブリドーマ技術（Ko hlerおよびMilstein、1975、Nature、256：495-497）、トリオーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Kohlerら、1983、Immunology Today 4:72）、およびヒトモノクローナル抗体を生成するためのEBVハイブリドーマ技術（Coleら、198 5、Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy、Alan R．Liss，Inc.、77-96頁）が挙げられる。単鎖抗体を生成するために記載された技術（米国特許第4,946,778号）を、本発明の免疫原性ポリペプチド産物に対する単鎖抗体を生成するために適合させ得る。抗体は、本発明のタンパク質配列の局在化および活動度に関連する方法において、例えば、適切な生理学的サンプルにおいてこれらのタンパク質を画像化し、それらのレベルを測定するためになど、使用され得る。本発明を以下の実施例を参照にしてさらに記載するが、本発明はこのような実施例に限定されないことを理解されたい。すべての部分または量は、他に明記しない限り重量基準である。以下の実施例の理解を容易にするために、頻繁に現れる特定の方法および／または用語を記載する。「プラスミド」は、小文字のｐの前および／または後の大文字および／または数字により示される。本明細書中の出発プラスミドは、市販であるか、制限基準なく公的に入手可能であるか、または公表された手順に従って入手可能なプラスミドから構築され得るかのいずれかである。さらに、記載されるプラスミドと等価なプラスミドが当該分野で公知であり、そして当業者には明らかである。 DNAの「消化」は、DNA中の特定の配列でのみ作用する制限酵素でそのDNAを触媒反応的に切断することをいう。本明細書中で使用される種々の制限酵素は、市販されており、そしてそれらの反応条件、補助因子、および他の必要条件は当業者に公知のものが使用された。分析目的には、代表的には１μgのプラスミドまたはDNAフラグメントを、約20μlの緩衝溶液中で約２単位の酵素とともに使用する。プラスミド構築のためのDNAフラグメントを単離する目的のために、代表的には５〜50μgのDNAを、より大きな容量中で20〜250単位の酵素で消化する。特定の制限酵素に関する適切な緩衝液および基質量は、製造者により特定される。 37℃での約１時間またはそれより長いインキュベーション時間が通常使用されるが、これは供給者の説明書に従って変化し得る。消化後、反応物をアガロースゲルで直接電気泳動して所望のフラグメントを単離する。切断されたフラグメントのサイズ分離は、0.8〜2.0％ポリアガロースを使用して行われる。（Maniatis）「オリゴヌクレオチド」は、１本鎖ポリデオキシヌクレオチドまたは２つの相補的なポリデオキシヌクレオチド鎖のいずれかをいい、これらは化学的に合成され得る。このような合成オリゴヌクレオチドは、５’リン酸を有さず、従ってキナーゼの存在下でリン酸とATPとを添加しなければ別のオリゴヌクレオチドに連結しない。合成オリゴヌクレオチドは、脱リン酸化されていないフラグメントに連結する。「連結」は、２つの２本鎖核酸フラグメントの間でリン酸ジエステル結合を形成するプロセスをいう（Maniatis，T.ら、前出、146頁）。他に提供しない限り、連結は、ほぼ等モル量の連結されるべきDNAフラグメント0.5μgあたり10単位のT 4 DNAリガーゼ（「リガーゼ」）で、公知の緩衝液および条件を用いて達成され得る。実施例１ヒトDNaseの細菌発現および精製ヒトDNaseをコードするDNA配列（pBLSKDNase（ATCC # 75515））を、DNA配列の５'および３'末端に対するPCRオリゴヌクレオチドプライマーを用いて最初に増幅して、挿入フラグメントを合成する。５'オリゴヌクレオチドプライマーは、配列 GACGCCGGATCCCACTACCCAACTGCAを有し、BamHI制限酵素部位を含み、その後ろに開始コドンに続くDNaseコード配列の15ヌクレオチドを含む；３'配列（5' -GGCTGCTCTAGACAGCGTAGTCTGGCAGGTCGTATGGGTACTTCAGCTCCACCTCCACGGGGTAG-3'）は、XbaI部位に対する相補的配列を含み、そして、この遺伝子の3'非翻訳領域内にある。制限酵素部位は、細菌発現ベクターpQE-9（Qiagen，Inc．9259 Eton Av enue, Chatsworth，CA，91311）上の制限酵素部位に対応する。プラスミドベクターは、抗生物質耐性（Amp^r）、細菌の複製開始点（ori）、IPTG制御可能なプロモーター／オペレーター（P/O）、リボゾーム結合部位（RBS）、6-ヒスチジンタグ（6-His）および制限酵素クローニング部位をコードする。pQE-9ベクターを、BamHIおよびXbaIで消化し、次いで挿入フラグメントを細菌性RBSで始まるリーディングフレームを有するpQE-9ベクター内に連結した。図７に、この配置の模式図を示す。次いで連結混合物を用いて、m15/rep4の商標でQiagenから入手可能なE.coli株を形質転換した。M15/rep4は多コピーのプラスミドpREP4を含む。pRE P4は、lacIリプレッサーを発現し、そしてさらにカナマイシン耐性（Kan^r）を付与する。形質転換体を、AmpおよびKanの両方を含有するLBプレート上で増殖するそれらの能力により同定した。所望の構築物を含有するクローンを、Amp（100μ g/ml）およびKan（25μg/ml）の両方を補充したLB培地での液体培養で一晩（O/N ）増殖させた。O/N培養物を用いて、1:100〜1:250の比で大規模培養に播種する。細胞を、0.4と0.6との間の600nmでの光学密度（O.D.⁶⁰⁰）まで増殖させた。次いてIPTG（「イソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド」）を、１mMの最終濃度で添加した。IPTGは、lacIリプレッサーを不活性化し、P/Oリーディング(lead ing)を解放（clearing）して遺伝子発現の増大を導く。細胞をさらに２〜４時間増殖させた。次いで細胞を遠心分離により採集した。DNaseの発現を、一部のE.coliを可溶化し、そしてSDSポリアクリルアミドゲルで分析することにより試験した。誘導後の33kdに対応する新しいタンパク質の存在は、DNaseの発現を表す。（図２）。タンパク質の精製を、pQE-9ベクターによりDNase配列に加えられたヘキサヒスチジン配列を利用することにより達成した。細胞の誘導後、E.coliペレットを６Ｍ塩酸グアニジン中で可溶化した。DNaseを、ヘキサヒスチジンタグに対して高い親和性を有するニッケルキレート樹脂カラムを用いて精製した。（Hachuli，E .ら、Genetic Engineering，Principle and Methods、12：87-98 Plenum Press 、New York(1990)）。次いでカラムを洗浄し、そしてDNaseをpH ５で溶出した。塩酸グアニジンからのタンパク質の再生を、いくつかのプロトコルで実施し得た。（Jaenicke，R.ら、Protein Structure - a practical approach IRL Press、 New York(1990)）。最初に、透析工程を用いて、GnHClを除いた。あるいは、Ni キレートカラムからの精製タンパク質単離物は、第２のカラムに結合し得る。このカラムに、減少する直線勾配のGnHClを流す。タンパク質を、カラムに結合させたままで再生し、続いてGnHCl（pH 5.0）で溶出する。最後に、可溶性タンパク質を、140mM NaCl、20mM NaPO₄および10％ w/vグリセロール(Glyconol)を含有する保存緩衝液に対して透析する。精製タンパク質を、SDS-PAGEにより分析した。実施例２ COS細胞におけるDNaseの発現発現プラスミド（soCMVDNase HA）は、以下を含むベクターSoCMVIN/Ampに由来する：１)SV40複製開始点、βグロビンイントロン、２)アンピシリン耐性遺伝子、３)E.coli複製開始点、４)CMVプロモーター、それに続くポリリンカー領域、S V40イントロンおよびポリアデニル化部位である。（Ruben，S.ら、Molecular an d Cellular Biology 、444-454(1992)）。完全なDNaseおよびその３'末端にインフレームで融合したHAタグをコードするDNAフラグメントを、ベクターのポリリンカー領域にクローン化した。従って、組み換えタンパク質発現は、CMVプロモーター下の支配を受ける。HAタグは、以前に記載されたインフルエンザ血球凝集素タンパク質由来のエピトープ（MYPYDVPDYA）に対応する（I．Wilsonら、Cell 37 ：767(1984)）。本発明者の標的タンパク質に対するHAタグの融合は、HAエピトープを認識する抗体を用いる組み換えタンパク質の安易な検出を可能にする。プラスミド構築ストラテジーを以下に記す： DNA挿入物を、２つのプライマーを用いて、元のEST上でPCRにより構築した：５' プライマー配列（GACGCCGGATCCCACTACCCAACTGCA）は、BamHI部位およびその後に開始コドンから始まるDNaseコード配列の15ヌクレオチドを含有する；３'配列（ GGCTGCTCTAGACAGCGTAGTCTGGCAGGTCGTATGGGTACTTCAGCTCCACCTCCACGGGGTAG）は、X BaI部位、翻訳ストップコドン、HAタグ、および膵臓のDNase末端残基に相当する DNaseコード領域の23ヌクレオチド（ストップコドンを含まない）に対して相補的な配列を含有する。従って、PCR産物は、BamHI部位、DNaseコード配列、インフレームに融合したHAタグ、それに続くHAタグに隣接する翻訳停止ストップコドン、およびXbaI部位を含有する。PCR増幅DNAフラグメントおよびベクター（SoCM VIN/amp）を、BamHIおよびXbaI制限酵素で消化し、そして連結した。連結混合物を、SUREの商標で入手可能なE.coli株に形質転換した。形質転換培養物をアンピシリン培地プレート上に塗布して、そして耐性コロニーを選択した。プラスミド DNAを、形質転換体から単離して、正しいフラグメントの存在に対する制限分析により試験した。組み換えDNaseの発現のために、COS細胞を、DEAEデキストラン法により発現ベクターでトランスフェクトした（J．Sambrook、E．Fritsch、T. Maniatis、Molecular Cloning：A Laboratory Manual 、Cold Spring Laboratory Press、1989）。DNase-HAタンパク質の発現を、放射性標識法および免疫沈降法により検出した。細胞を、トランスフェクションの２日後に³⁵S-システインで８時間標識した。（E．Harlow、D．Lane、Antibodies：A Laboratory Manual、Col d Spring Harbor Laboratory Press、(1988)）。次いで培養培地を採集し、そして細胞を界面活性剤で溶解した（RIPA緩衝液（150mM NaCl、１％NP-40、0.1％SD S、１％NP-40、0.5％DOC、50mM Tris、pH 7.5））（I．Wilsonら、前出37：767( 1984)）。細胞溶解物および培養培地の両方を、HA特異的モノクローナル抗体で沈澱させた。沈澱したタンパク質を、15％SDS-PAGEゲルで分析した。実施例３ DNaseの組織分布 DNaseの組織分布を示すために、ノーザンブロット分析を行った。全RNAを種々のヒト組織から調製し、そして変性アガロースゲルで電気泳動した。RNAを、ナイロン膜に上にブロットし、そしてランダムプライミングにより調製したpBLSKD NaseのEcoRI〜XhoIフラグメントに対応するDNase cDNAプローブでプローブした。フィルムへのブロットの感光により、DNaseは心臓および肺由来の組織において最も多く、脾臓においていくらかの発現を示した（図４）。全細胞RNAサンプルを、RNAzol^TMBシステム（Biotecx Laboratories，Inc.、6023 South Loop Eas t、Houston、TX 77033）を用いて単離した。ヒトの特定化した各組織から単離された約10μgの全RNAを、１％アガロースゲルで分離し、そしてナイロンフィルター上にブロットした（Sambrook、Fritsch、およびManiatis、Molecular Cloning 、Cold Spring Harbor Press、(1989)）。標識反応を、Stratagen Prime-itキットに従って、pBL sle DNase DNAフラグメントのEcoRI〜XhoIフラグメントの50ng を用いて行った。標識DNAを、Seclect-G-50カラムで精製した。（3 Prime-3 Pri me,Inc．5603 Arapahoe Road、Boulder、CO 80303）。次いでフィルターを、放射性標識した全長のトロンビンインヒビター遺伝子を用いて、0.5Ｍ NaPO₄および７％SDS中の1,000,000cpm/mlで、一晩、65℃でハイブリダイズした。0.5×SSC 、0.1％SDSを用いて、室温で２回、そして60℃で２回洗浄した後、次いでフィルターを増感スクリーンを用いて-70℃で一晩感光させた。（図４）。実施例４ DNase活性のアッセイいくつかのアッセイが、DNase活性を測定するために利用可能である。第１のアッセイは、³²P標識DNAの加水分解を測定する。 ³²P-DNAの分解物を、³²P-dCTP、非放射性dGTP、dTTP、dATPおよびExo(-)クレノウ酵素を用いるランダムプライム標識キット（StrategeneのPrime It II）を用いて調製した。１μlのテンプレート（25ng）、10μlのランダムオリゴヌクレオチドプライマーおよび23μlの水を混合し、そして100℃で５分間インキュベートした。10μlの５×dCTPプライマー緩衝液、５μlの³²P-dCTP（3,000Ci/mMole）および１μlのExo(-)クレノウ酵素（５U/μl）を反応混合物に加え、そして37℃ で15分間インキュベートした。遊離のヌクレオチドを、セファデックスG-50カラムにより遠心分離によって、標識DNAから分離した。次いで、100μlの総容量でDNase緩衝液（40mM TRIS-HCl(pH 7.6)、50mM NaCL 、0.1mM DTT、6mM MgCl₂、1mM CaCl₂）中に、５×10⁵cpmの³²P-DNAおよび20μl のタンパク質をインキュベートすることにより、DNase活性を測定した。時間点０およびその後の各時間点について、20μlを取り出した。 TCA沈澱のカウントを用いて、％活性を測定した。（図６）。 20μlのDNaseアッセイ反応混合物に、20μlの10％TCAを添加し、混合した。20 μlを、ガラスフィルターディスク上にスポットした（非取り込みカウント）。残りの20μlに、10％TCAをさらに200μl加え、次いで真空マニホルド上の予め湿らしたガラスフィルターディスクに添加し、減圧した。ディスクを、３mlの10％ TCAで２回、次いで３mlの100％エタノールで２回洗浄した。そしてフィルターを乾燥させた。次いで、フィルターディスクを、３mlの液体シンチレーションカクテルを含有する液体シンチレーションバイアル内に入れ、そして³²Pのカウントを液体シンチレーションカウンターで測定した。取り込みパーセント＝取り込みカウント／非取り込みカウント。第２のアッセイは、２本鎖DNAをニックし、そして消化するDNaseの能力を利用する。スーパーコイル状プラスミドDNAをDNaseとともにインキュベートし、そしてサンプルを、DNaseの添加後の時間点で取り出す。サンプルをアガロースゲルで電気泳動し、そしてスーパーコイルから弛緩型DNAへの変換を、DNaseを添加して、観測する（図５）。迅速なプレートDNaseアッセイもまた、使用し得る。このアッセイでは、試験寒天はDNAおよびメチルグリーンの両方を含む。トランスフェクト細胞由来の精製タンパク質または上清を、標準量のウシDNaseとともに、プレート上にスポットする。プレート上の透明帯の大きさを可視化することにより、DNase活性を測定する。本発明の種々の改変および変化が、上記教示に照らして可能であり、従って、添付した請求の範囲内で、本発明は、特記された以外にも実施され得る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＡ６１Ｋ 38/46 ＡＢＥ 9284−4ＣＡ６１Ｋ 39/395 ＡＣＤＤ 39/395 ＡＣＤ 8615−4ＣＣ０７Ｈ 21/04 ＢＣ０７Ｈ 21/04 9356−4ＨＣ０７Ｋ 16/40 Ｃ０７Ｋ 16/40 8827−4ＢＣ１２Ｎ 9/22 Ｃ１２Ｎ 5/10 7823−4ＢＣ１２Ｑ 1/68 Ａ 9/22 9282−4ＢＣ１２Ｎ 5/00 ＢＣ１２Ｑ 1/68 9051−4ＣＡ６１Ｋ 37/54 ＡＢＥ //(Ｃ１２Ｎ 9/22 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者ルベン，スティーブンアメリカ合衆国メリーランド 20832, オルニー，ヘリテージヒルズドライブ 18528 (72)発明者アダムス，マークディー. アメリカ合衆国メリーランド 20878, ノースポトマック，ダフィーフドライブ 15205

Claims

【特許請求の範囲】１．少なくとも図１のDNA配列と同一の成熟ポリペプチドまたはその対立遺伝子変異体をコードするDNAを包含する、単離されたDNA。２．前記DNAが、少なくとも図１の成熟ポリペプチドをコードする図１のDNAおよびその対立遺伝子変異体を包含する、請求項１に記載の単離されたDNA。３．請求項１に記載のDNA配列のいずれかに対応するRNAおよびその対立遺伝子変異体を包含する、単離されたRNA配列。４． ATCC寄託番号75515に含有されるDNA配列によりコードされる成熟ポリペプチドと同一の成熟ポリペプチドを少なくともコードするDNA配列およびその対立遺伝子変異体を包含する、単離されたDNA配列。５．前記DNAが成熟ポリペプチドをコードするATCC寄託番号75515に含有される DNAを少なくとも包含する、請求項４に記載の単離されたDNA。６．請求項４に記載のDNA配列に対応するRNAを包含する、単離されたRNA配列。７．請求項１に記載のDNA配列を含有する、発現ビヒクル。８．請求項４に記載のDNA配列を含有する、発現ビヒクル。９．請求項１に記載のDNA配列によりコードされるアミノ酸配列またはその活性なフラグメント、その誘導体またはその機能的アナログを包含するポリペプチド。１０．請求項４に記載のDNA配列によりコードされるアミノ酸配列またはその活性なフラグメント、その誘導体またはその機能的アナログを包含するポリペプチド。１１．請求項２に記載のDNA配列によりコードされるアミノ酸配列またはその活性なフラグメント、その誘導体またはその機能的アナログを包含するポリペプチド。１２．請求項５に記載のDNA配列によりコードされるアミノ酸配列またはその活性なフラグメント、その誘導体またはその機能的アナログを包含するポリペプチド。１３．ヒトDNaseポリペプチドを生産するためのプロセスであって、請求項１に記載のDNAの使用によりポリペプチドを発現させる工程を包含する、プロセス。１４．請求項９に記載のポリペプチドに対する抗体。１５．請求項１０に記載のポリペプチドに対する抗体。１６．請求項１に記載のDNAで遺伝子操作された細胞。１７．ポリペプチドを発現し得る細胞を生成するためのプロセスであって、請求項１に記載のDNAで細胞を遺伝子操作する工程を包含する、プロセス。１８． DNaseを必要とする患者の処置方法であって、該方法が請求項９に記載のポリペプチドの治療有効量を患者に投与する工程を包含する、方法１９． DNaseを阻害するための患者の処置方法であって、該方法が請求項１４に記載の抗体の治療有効量を患者に投与する工程を包含する、方法２０．請求項１に記載のDNA配列にハイブリダイズし得る、単離されたDNA。