JPH0954092A

JPH0954092A - 免疫学的活性物質単量体、重合体および免疫学的活性物質測定試薬

Info

Publication number: JPH0954092A
Application number: JP14580496A
Authority: JP
Inventors: Hidejiro Sakaki; 秀次郎榊; Satoshi Yamada; 智山田; Kenshirou Shiyudou; 健志郎首藤; Yasuyoshi Koinuma; 康美鯉沼
Original assignee: Nippon Oil and Fats Co Ltd
Current assignee: NOF Corp
Priority date: 1995-06-09
Filing date: 1996-06-07
Publication date: 1997-02-25

Abstract

(57)【要約】【課題】対応する免疫学的活性物質（抗体または抗
原）を高感度で再現性よく測定する。【解決手段】免疫学的活性物質に、Ｒ¹-(Ｘ)m-Ｒ
²（Ｒ¹は免疫学的活性物質中の官能基と結合可能な官能
基、Ｒ²はラジカル重合可能な重合性基、Ｘは２価の有
機残基、ｍは０または１）で示される修飾剤を反応さ
せ、Ａ-[(Ｙ)k-(Ｘ)m-Ｒ ²]ｎ（Ａは免疫学的活性物質の
残基、Ｙは免疫学的活性物質中の官能基とＲ¹の官能基
とから形成された基、ｋは０または１、ｎは１以上の
数）で示される免疫学的活性物質単量体を得、さらにこ
の単量体を重合して免疫学的活性物質重合体を得る。こ
の重合体を測定試薬として使用し、比検物質と抗原抗体
反応を行った後、反応生成物を比濁法または比ろう法に
より測定する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、免疫学的活性物質
重合体、これを重合するための単量体、前記重合体から
なる免疫学的活性物質測定試薬およびこの試薬を用いた
免疫学的活性物質の測定方法に関する。本発明の免疫学
的活性物質測定試薬は、臨床検査の分野における免疫学
的活性物質（抗原または抗体）の定性または定量に利用
するためのものである。

【０００２】

【従来の技術】近年、各種疾患と関連して生体中に出現
する蛋白質等の免疫学的活性物を、免疫反応（抗原抗体
反応）を利用して検出し、診断に利用することが広く行
われている。このような抗原抗体反応を利用した測定法
としては、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法
（ＥＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、ラテックス比
濁法、免疫比濁法（ＴＩＡ）などの各種の方法が開発さ
れている。これらＲＩＡ、ＥＩＡ、ＦＩＡはいずれの場
合も抗原抗体反応により生成した反応生成物を分離する
ことが必要とされるため測定には一般に時間と手間が必
要とされるが、定量性に優れているなどの理由で広く利
用されている。

【０００３】近年は、抗原抗体反応に伴って起きる光学
的な変化を測定する比濁法（turbidimetry）または比ろ
う法（nephelometry）が注目されてきている。これらの
方法は、抗体（または抗原）と被検物質とが反応すると
反応の前後において、その被検物質量に応じて反応液の
濁度に変化が生じるため、この濁度の変化を光散乱法、
吸光度法等の適当な手段で測定するものである。このよ
うな比濁法または比ろう法は放射免疫測定法、酵素免疫
測定法、蛍光免疫測定法などに比べて操作が簡便である
が、高感度で再現性よく測定することが難しいという問
題点がある。

【０００４】このような問題点を解決するため、抗体ま
たは抗原を、担体となるラテックス粒子に担持させて用
いるラテックス比濁法が提案されているが、この方法で
は抗体または抗原を担体に担持させる必要があるため操
作が煩雑になる。また凝集助剤等の添加剤を添加した比
濁法用の測定試薬も知られている。例えば、特公昭６０
−４９３８号には、免疫学的活性物質、ポリエチレング
リコールおよび非イオン表面活性剤を含有し、ＨＬＢ価
が約０．７〜１．７の免疫学的測定試薬が記載されてい
る。また特開昭５９−４３３６２号には、免疫学的活性
物質および特定の構造を有する界面活性剤を含有する免
疫学的測定試薬が記載されている。

【０００５】しかし、上記のような添加剤を含む測定試
薬を用いて免疫学的活性物質を測定しても、検体中に共
存する被検物質でない他の物質による濁りを生ずるいわ
ゆる非特異反応が起きて誤差が生じたり、高濃度の被検
物質が存在するにも拘らず測定結果が低濃度に出るいわ
ゆるプロゾーン現象が生じたり、あるいは低濃度領域で
測定結果が不正確になるなどの問題点がある。このた
め、免疫学的活性物質を高感度で再現性よく測定するこ
とが可能な免疫学的測定試薬および免疫学的活性物質の
測定方法の開発が望まれている。

【０００６】ところで、「有機合成化学」第４２巻第４
号２８３〜２９２頁（１９８４）には、Ｎ−（ｍ−ベン
ゾイルオキシ）スクシンイミドなどの蛋白質の修飾剤を
用いて蛋白質を選択的に修飾し、反応性を有する修飾蛋
白質を製造する方法が記載されている。しかし、この方
法で得た修飾蛋白質は、その反応性を利用してさらに酵
素で標識して酵素免疫測定法に利用するための修飾蛋白
質であり、修飾蛋白質同士を重合することは記載されて
いない。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、対応
する免疫学的活性物質と高い特異性で抗原抗体反応を起
こす特性を維持したまま、分子量を高分子化した免疫学
的活性物質重合体、およびその製造原料となる単量体を
提供することである。本発明の他の目的は、上記免疫学
的活性物質重合体からなり、対応する免疫学的活性物質
を高感度で再現性よく測定することができる免疫学的活
性物質測定試薬、およびこの試薬を用いた測定方法を提
案することである。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明は次の免疫学的活
性物質単量体、これを重合してなる免疫学的活性物質重
合体、この重合体を含む免疫学的活性物質測定試薬、お
よびこの試薬を用いた免疫学的活性物質の測定方法であ
る。（１）免疫学的活性物質に、一般式（１）Ｒ¹−(Ｘ)m−Ｒ² …（１）（式中、Ｒ¹は免疫学的活性物質中の官能基と結合可能
な官能基、Ｒ²はラジカル重合可能な重合性基、Ｘは２
価の有機残基、ｍは０または１を示す。）で表わされる
修飾剤を反応させて得られる、一般式（２）Ａ−［(Ｙ)k−(Ｘ)m−Ｒ²］n …（２）（式中、Ａは免疫学的活性物質の残基、Ｙは免疫学的活
性物質中の官能基と前記Ｒ¹の官能基とから形成された
基、ｋは０または１、Ｘは２価の有機残基、ｍは０また
は１、Ｒ²はラジカル重合可能な重合性基、ｎは１以上
の数を示す。）で表わされる免疫学的活性物質単量体。（２）上記（１）記載の免疫学的活性物質単量体を重合
してなる免疫学的活性物質重合体。（３）上記（２）記載の免疫学的活性物質重合体を含む
ことを特徴とする免疫学的活性物質測定試薬。（４）被検物質となる免疫学的活性物質を含む検体と、
上記（３）記載の免疫学的活性物質測定試薬とを接触さ
せ、検体中の被検物質と免疫学的活性物質測定試薬中の
免疫学的活性物質重合体とを抗原抗体反応させた後、反
応生成物を測定することを特徴とする免疫学的活性物質
の測定方法。（５）反応生成物を比濁法（turbidimetry）または比ろ
う法（nephelometry）で測定する上記（４）記載の測定
方法。

【０００９】本発明において、「免疫学的活性物質」と
は「抗体および／または抗原」を意味する。また「免疫
学的活性物質重合体」とは「抗体および／または抗原の
単独重合体および／または共重合体」を意味する。また
「（メタ）アクリ」は「アクリおよび／またはメタク
リ」を意味する。

【００１０】前記一般式（１）においてＲ¹で表わされ
る官能基としては、免疫学的活性物質中の官能基と結合
可能な官能基であれば特に限定されるものではないが、
水酸基、カルボキシル基、アルデヒド基、アミノ基、メ
ルカプト基、スクシニミジルオキシカルボニル基、イミ
ドエステル基、ハロゲノニトロアリル基、ピリジノジス
ルフィド基、マレイミド基、フタルイミドチオ基、ハロ
ゲノメチルカルボニル基、ハロゲノカルボニル基、ハロ
ゲノスルホニル基、ニトロアジドフェニル基、ジアゾト
リフルオロアセチル基、イソシアネート基などがあげら
れる。これらの中では、免疫学的活性物質中のアミノ基
との結合が容易な、スクシニミジルオキシカルボニル
基、イソシアネート基、ハロゲノカルボニル基、ハロゲ
ノスルホニル基などが好ましい。

【００１１】前記一般式（１）または（２）においてＲ
²で表わされるラジカル重合可能な重合性基としては、
ラジカル重合可能な不飽和結合を含む基であれば特に限
定されるものではないが、アクリロイル基、メタクリロ
イル基、マレイミド基、スチリル基、ビニル基などがあ
げられる。これらの中では、一般式（２）で表わされる
化合物同士、または一般式（２）で表わされる化合物と
他のモノマーとの重合性がよい、アクリロイル基、メタ
クリロイル基、マレイミド基、スチリル基などのエチレ
ン性不飽和結合を含む基が好ましくあげられる。

【００１２】前記一般式（１）または（２）においてＸ
で表わされる２価の有機残基は特に限定されるものでは
ないが、アミド基、エステル基、チオエステル基、エー
テル基、アルキレン基、オキシアルキレン基、ポリオキ
シアルキレン基、アルキレンウレタン基、スルホニル基
などがあげられる。

【００１３】前記一般式（１）で表わされる修飾剤の具
体的なものとしては、次のものが例示される。Ｒ²が
（メタ）アクリロイル基である重合性基を有する修飾剤
としては、（メタ）アクリル酸、（メタ）アクロレイ
ン、（メタ）アクリル酸クロリド、（メタ）アクリロイ
ルイソシアネート、（メタ）アクリロイルオキシエチル
イソシアネート、２−ヒドロキシエチル（メタ）アクリ
ルアミド、２−ヒドロキシエチル（メタ）アクリレー
ト、６−（（メタ）アクリロイルアミノ）カプロン酸、
３−（（メタ）アクリロイルアミノ）プロピオン酸など
をあげることができる。これらの中では、免疫学的活性
物質との反応が容易な（メタ）アクリル酸クロリド、
（メタ）アクリロイルイソシアネートなどが好ましい。

【００１４】またＲ²がマレイミド基である重合性基を
有する修飾剤としては、Ｎ−（６−マレイミドカプロイ
ルオキシ）スクシンイミド、Ｎ−（４−マレイミドブチ
リルオキシ）スクシンイミド、Ｎ−（８−マレイミドカ
プリルオキシ）スクシンイミド、Ｎ−（１１−マレイミ
ドウンデカノイル）スクシンイミド、Ｎ−（６−マレイ
ミドカプロイルオキシ）スルホスクシンイミドナトリウ
ム塩、Ｎ−（４−マレイミドブチリルオキシ）スルホス
クシンイミドナトリウム塩、Ｎ−（８−マレイミドカプ
リルオキシ）スルホスクシンイミドナトリウム塩、Ｎ−
（１１−マレイミドウンデカノイル）スルホスクシンイ
ミドナトリウム塩、Ｎ，Ｎ′−オキシジメチレンジマレ
イミド、Ｎ，Ｎ′−ｏ−フェニレンジマレイミド、Ｎ，
Ｎ′−ｐ−フェニレンジマレイミド、スクシニミジル
４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カ
ルボキシレート、スルホスクシニミジル４−（Ｎ−マ
レイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレー
ト、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシ
ンイミドエステル、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒ
ドロキシスルホスクシンイミドエステル、スクシニミジ
ル４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート、スル
ホスクシニミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブ
チレートなどをあげることができる。これらの中では、
水溶性を有し、免疫学的活性物質との反応が容易な、Ｎ
−（６−マレイミドカプロイルオキシ）スルホスクシン
イミドナトリウム塩、Ｎ−（４−マレイミドブチリルオ
キシ）スルホスクシンイミドナトリウム塩、Ｎ−（８−
マレイミドカプリルオキシ）スルホスクシンイミドナト
リウム塩、Ｎ−（１１−マレイミドウンデカノイル）ス
ルホスクシンイミドナトリウム塩などが好ましい。

【００１５】さらに、Ｒ²がスチリル基である重合性基
を有する修飾剤としては、カルボキシスチレン、ホルミ
ルスチレン、ヒドロキシスチレン、アミノスチレン、ス
チレンカルボン酸クロリド、スチレンスルホン酸クロリ
ドなどをあげることができる。これらの中では、免疫学
的活性物質との反応が容易なスチレンカルボン酸クロリ
ド、スチレンスルホン酸クロリドなどが好ましい。

【００１６】前記一般式（１）で表わされる修飾剤と反
応させる免疫学的活性物質（以下、被修飾物質という場
合がある）は、水酸基、カルボキシル基、アミノ基、各
種糖鎖を開環させたアルデヒド基等の反応性官能基を有
し、抗体または抗原となり得うるものである。このよう
な被修飾物質としては、例えばＣ反応性蛋白質（ＣＲ
Ｐ）、リューマチ因子（ＲＦ）、トランスフェリン等の
血漿蛋白に対する抗体；甲状腺刺激ホルモン（ＴＳ
Ｈ）、トリヨードサイロニン（Ｔ₃）、サイロキシン
（Ｔ₄）、チロキシン結合性蛋白（ＴＢＧ）、サイログ
ロブリン、インスリン、エストリオール（Ｅ₃）、絨毛
性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）、ヒト胎盤性ラクトーゲン
（ＨＰＬ）等のホルモンに対する抗体；癌胎児性抗原
（ＣＥＡ）、Ｂ₂−マイクログロブリン、α−フェトプ
ロテイン（ＡＦＰ）等の腫瘍関連物質に対する抗体；Ｈ
Ｂｓ抗原、ＨＢｓ抗体、ＨＢｅ抗原、ＨＢｅ抗体等のウ
イルス肝炎の抗原または抗体に対する抗体または抗原；
ムンプス、ヘルペス、麻疹、風疹、サイトメガロ等のウ
イルス、抗エイズ抗体（ＨＩＶ）等の各種生体成分に対
する抗体または抗原；フェノバルビタール、アセトアミ
ノフェノン、サリチル酸、シクロスポリン等の各種薬剤
に対する抗体；酵素等の蛋白質；酵素に対する抗体など
があげられる。上記免疫学的活性物質としての酵素は、
免疫学的活性という性質を有する蛋白質として用いるも
のであり、生体触媒作用という性質を有する蛋白質とし
て用いるものではない。すなわち免疫活性物質としての
酵素は、酵素活性を発揮させるために用いるのではな
い。なお、上記抗体または抗原に対する抗原または抗体
が、後述の免疫学的活性物質測定試薬または測定方法に
おける測定対象の免疫学的活性物質（被検物質）にな
る。

【００１７】上記のような免疫学的活性物質（被修飾物
質）に前記一般式（１）で表わされる修飾剤を反応させ
ることにより、免疫学的活性物質中の前記官能基と修飾
剤中の前記反応性官能基とが結合し、前記一般式（２）
で表わされる免疫学的活性物質単量体が得られる。

【００１８】前記一般式（２）においてＡで示される基
は、前記被修飾物質の残基である。前記一般式（２）に
おいてＹで示される基は、前記被修飾物質中の官能基と
修飾剤中との官能基（Ｒ¹）とから形成される基（結
合）であり、具体的なものとしてはアミド基、ジカルバ
ミド結合、ウレア結合、ウレタン結合、ジスルフィド結
合、イミド酸アミド結合、３−チオスクシンイミド基
（マレイミド基にチオール基が反応して形成された結
合）などがあげられる。

【００１９】前記一般式（２）においてｎは１以上の
数、好ましくは免疫学的活性物質の種類にもよるが１〜
９０、さらに好ましくは１〜１０である。ｎが９０を超
えると、免疫学的活性物質の種類にもよるが、免疫学的
活性が低下する場合がある。なお、合成した免疫学的活
性物質単量体中のｎの数は、合成した免疫学的活性物質
単量体中の官能基を定量することにより決定することが
できる。例えば、この官能基がアミノ基の場合、反応前
および反応後の単量体中のアミノ基を定量し、修飾剤に
より修飾されたアミノ基の割合（修飾率）を求め、この
修飾率からｎの数を決定することができる。

【００２０】免疫学的活性物質と前記一般式（１）で表
わされる修飾剤との反応は、次のようにして行うことが
できる。例えば、リン酸緩衝液、炭酸緩衝液、酢酸緩衝
液、トリス／塩酸緩衝液または各種生理食塩水等に免疫
学的活性物質を溶解した溶液に、水、メタノール、エタ
ノール、プロパノール、ジメチルホルムアミド、テトラ
ヒドロフランまたはこれらの混合液等に修飾剤を溶解し
た溶液を加え、反応温度０〜５０℃、好ましくは４〜２
５℃、反応時間１５分間〜２４時間、好ましくは１〜１
２時間反応させる。反応生成物は精製することなく免疫
学的活性物質単量体として使用することができるし、必
要により透析、塩析、ゲルろ過などの方法により精製す
ることもできる。

【００２１】このようにして得られた免疫学的活性物質
単量体は、ラジカル重合可能な重合性基を有しているた
め、容易に重合可能である。このため免疫学的活性物質
重合体を製造するための単量体として使用することがで
きる。

【００２２】本発明の免疫学的活性物質重合体は、前記
一般式（２）で表わされる免疫学的活性物質単量体をラ
ジカル重合してなるものであり、免疫学的活性物質単量
体の単独重合体または２種以上の共重合体、あるいは１
種または２種以上の免疫学的活性物質単量体と他のモノ
マーとの共重合体である。

【００２３】本発明の免疫学的活性物質重合体は、下記
一般式（３）で表される構造単位を有している。

【化１】（式中、Ｒ³は一般式（２）のＲ²がラジカル重合するこ
とにより形成された基であって、Ｒ²の残基を示す。ｑ
は１以上の数、ｒは０以上の数であり、ｑ＋ｒ＝ｎを満
たす。ここでｎは一般式（２）のｎと同じである。Ａ、
Ｒ²、Ｘ、Ｙ、ｍ、およびｋは一般式（２）と同じもの
である。）

【００２４】前記一般式（３）においてＲ³で表される
基は、前記一般式（２）で表される免疫学的活性物質単
量体をラジカル重合することにより、Ｒ²から形成され
た基であって、Ｒ²の残基である。すなわちＲ³は、Ｒ²
の中に存在する重合性不飽和結合がラジカル重合した結
果形成される基である。Ｒ³の具体的なものとしては下
記のものが例示されるが、これらに限定されない。

【００２５】

【化２】上記の基はそれぞれアクリロイル基、メタクリロイル
基、マレイミド基、スチリル基およびビニル基（これら
の基はＲ²としてすでに例示した基である）から形成さ
れる基である。

【００２６】免疫学的活性物質単量体と共重合する他の
モノマーとしてはラジカル共重合可能なモノマーであれ
ば特に限定されるものではないが、例えば（メタ）アク
リル酸ブチル、（メタ）アクリル酸メチル、（メタ）ア
クリル酸エチル、（メタ）アクリル酸ヘキシル、２−ヒ
ドロキシエチルメタクリレート等の（メタ）アクリル酸
エステル、（メタ）アクリル酸アミド、Ｎ−ヒドロキシ
（メタ）アクリル酸アミド、Ｎ，Ｎ−ジアルキル（メ
タ）アクリル酸アミド、Ｎ，Ｎ−ジアルキルアミノエチ
ル（メタ）アクリル酸アミド、（メタ）アクリル酸、ポ
リエチレングリコールモノ（メタ）アクリル酸エステ
ル、ピロリドン、スチレン、α−メチルスチレン、メチ
ル核置換スチレン、クロロ核置換スチレン、ハロゲン核
置換スチレン、スチレンスルホン酸ナトリウム、塩化ビ
ニル、塩化ビニリデン、エチレン、プロピレン、イソブ
チレン、酢酸ビニル、プロピオン酸ビニル、エチルビニ
ルエーテル、ｎ−ブチルビニルエーテル、ジエチルイタ
コネート、ジ−ｎ−ブチルイタコネート等のビニル系モ
ノマーなどがあげられる。これらは１種単独で使用する
こともできるし、２種以上を混合して使用することもで
きる。他のモノマーとしては、水溶性ビニル系モノマー
が好ましい。

【００２７】本発明の免疫学的活性物質重合体の重合度
は、通常２〜１０００、好ましくは２〜１００である。
免疫学的活性物質重合体の分子量は出発原料となる免疫
学的活性物質の種類により一般的に規定することはでき
ないが、例えば抗体の重合体の場合は平均分子量３００
０００〜１００００００程度である。また免疫学的活性
物質重合体中に占める免疫学的活性物質単量体の割合は
特に限定されるものではないが、０．０１〜１００モル
％で、好ましくは０．１〜９０モル％である。

【００２８】本発明の免疫学的活性物質重合体は、例え
ば一般式（２）で表わされる免疫学的活性物質単量体お
よび必要により用いられる他のモノマーを、開始剤の存
在下にラジカル重合させることにより製造することがで
きる。上記開始剤としては、通常のラジカル開始剤が制
限されることなく使用できる。具体的なものとしては、
２，２′−アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）、
過酸化ベンゾイル、ジイソプロピルペルオキシジカーボ
ネート、ｔ−ブチルペルオキシ−２−エチルヘキサノエ
ート、ｔ−ブチルペルオキシピバレート、ｔ−ブチルペ
ルオキシジイソブチレート、２，２′−アゾビス［２−
（５−メチル−２−イミダゾリン−２−イル）プロパ
ン］ジヒドロクロリド、２，２′−アゾビス［２−（２
−イミダゾリン−２−イル）プロパン］ジヒドロクロリ
ド、２，２′−アゾビス［２−（４，５，６，７−テト
ラヒドロ−１Ｈ−１，３−ジアジピン−２−イル）プロ
パン］ジヒドロクロリド、２，２′−アゾビス［２−
（３，４，５，６−テトラヒドロピリミジン−２−イ
ル）プロパン］ジヒドロクロリド、過硫酸塩および過硫
酸一亜硫酸水素塩などがあげられる。開始剤の使用量
は、全モノマー１００重量部に対して０．０１〜１０重
量部、好ましくは０．１〜５重量部とするのが望まし
い。

【００２９】免疫学的活性物質重合体を製造する際、ア
ルキルメルカプタン、アルキルジチオールなどの重合度
調整剤を使用することもできる。具体的なものとして
は、エチルメルカプタン、メルカプトエタノール、メル
カプト酢酸、アミノエタンチオール、エタンジチオール
などがあげられる。重合度調整剤の使用量は全モノマー
１００重量部に対して０．０１〜１００重量部、好まし
くは０．１〜１０重量部とするのが望ましい。

【００３０】重合反応は免疫学的活性物質単量体の活性
を低下させない反応媒体中で行うのが好ましい。反応媒
体としては、例えばリン酸緩衝液、炭酸緩衝液、酢酸緩
衝液、トリス／塩酸緩衝液等の緩衝液；水；メタノー
ル、エタノール、プロパノール、ｔ−ブタノール、ベン
ゼン、トルエン、ジメチルホルムアミド、テトラヒドロ
フラン、クロロホルム等の有機溶媒などがあげられる。
有機溶媒は免疫学的活性を失活させない濃度、例えば
０．１〜４０体積％の濃度になるように緩衝液と混合し
て使用するのが好ましい。

【００３１】また重合反応は、重合系を不活性ガス、例
えば窒素、アルゴン、ヘリウムなどで置換して行うのが
好ましい。反応条件は、重合温度１５〜７０℃、好まし
くは２０〜６０℃、重合時間２〜９６時間程度、好まし
くは５〜７２時間とするのが望ましい。このようにして
得られる免疫学的活性物質重合体の重合度（分子量）
は、重合温度、重合時間、開始剤の種類または使用量、
重合度調整剤の種類または使用量などを選択することに
より調整することができる。反応終了後は、必要により
透析、塩析、ゲルろ過などの方法により精製することが
できる。

【００３２】本発明の免疫学的活性物質測定試薬は、上
記のようにして得られる免疫学的活性物質重合体を含む
ものであり、免疫学的活性物質重合体だけからなってい
ても、他の添加剤が配合されていてもよい。また本発明
の測定試薬は、固体ないし粉体のような乾燥状態で保管
し、使用時に適当な媒体に溶解して使用することもでき
るし、始めから溶液の形態で試薬とすることもできる。

【００３３】上記添加剤としては、従来から抗原抗体反
応を利用した測定試薬に用いられている添加剤が制限な
く使用できる。具体的なものとしては、ドデシル硫酸ナ
トリウム、Ｔｗｅｅｎ２０（ＩＣＩ社製、商標）、ポリ
エチレングリコール等の界面活性剤；メタノール、エタ
ノール、アセトン、Ｎ，Ｎ′−ジメチルホルムアミド、
テトラヒドロフラン等の有機溶媒などがあげられる。

【００３４】また免疫学的活性物質重合体を溶解する媒
体としては、活性を低下させないで溶解することができ
る液であれば制限なく使用することができ、具体的には
リン酸緩衝液、炭酸緩衝液、酢酸緩衝液、トリス／塩酸
緩衝液等の緩衝液；水；これらの緩衝液または水と、メ
タノール、エタノール、プロパノール、ｔ−ブタノー
ル、ベンゼン、トルエン、ジメチルホルムアミド、テト
ラヒドロフラン、クロロホルム等の有機溶媒との混合
液、例えば有機溶媒濃度が０．１〜４０体積％の混合液
などがあげられる。

【００３５】本発明の測定試薬が溶液状態である場合、
免疫学的活性物質重合体の濃度は０．００１〜１００ｍ
ｇ／ｍｌ、好ましくは０．０１〜１０ｍｇ／ｍｌとする
のが望ましい。

【００３６】本発明の測定試薬を用いて被検物質を測定
する場合の測定系は特に限定されず、公知の放射免疫測
定法、酵素免疫測定法、蛍光免疫測定法、比濁法または
比ろう法などが採用できる。これらの中では、抗原抗体
反応生成物を含む反応液の透過光を測定する比濁法また
は散乱光の強度を測定する比ろう法が好ましい。いずれ
の測定系を採用した場合にも、被検物質となる免疫学的
活性物質を含む検体と本発明の測定試薬とを接触させ、
検体中の被検物質と本発明の測定試薬中の免疫学的活性
物質重合体とを抗原抗体反応させた後、反応生成物を採
用した測定系に応じて測定する。これにより被検物質の
定量または定性を行うことができる。

【００３７】抗原抗体反応を行う際の反応系の免疫学的
活性物質重合体の濃度は０．００１〜１００ｍｇ／ｍ
ｌ、好ましくは０．０１〜１０ｍｇ／ｍｌ、反応温度は
０〜７０℃、好ましくは免疫学的活性物質重合体または
被検物質が失活しない４〜４０℃、反応系のｐＨは２〜
１３、好ましくは４〜１１とするのが望ましい。反応時
間は０．１分間〜１時間、好ましくは１分間〜２０分間
とするのが望ましい。

【００３８】反応媒体としては、本発明の測定試薬を溶
液状態の試薬とする場合に使用する媒体として例示した
前記緩衝液、水またはこれらと有機溶媒との混合液と同
様のものが使用できる。また反応系には、本発明の測定
試薬に添加することができる添加剤と同様の添加剤を添
加することができる。

【００３９】測定系として比濁法または比ろう法を採用
した場合、反応終了後の反応液の濁度または散乱光を濁
度計または吸光光度計などの公知の手段により測定する
ことにより、抗原抗体反応生成物を測定することができ
る。この場合、本発明の測定試薬は免疫学的活性物質が
重合されて高分子化されているので、高感度で再現性よ
く濁度または散乱光を測定することができる。このた
め、従来のようなラテックス等の担体に免疫学的活性物
質を担持する操作は省略することができる。

【００４０】

【発明の効果】本発明の免疫学的活性物質単量体は、ラ
ジカル重合可能な重合性基を有しているので、免疫学的
活性を維持したまま容易に重合することができ、重合免
疫学的活性物質重合体の製造原料として使用することが
できる。

【００４１】本発明の免疫学的活性物質重合体は上記免
疫学的活性物質単量体をラジカル重合して得られる重合
体であり、対応する免疫学的活性物質と高い特異性で抗
原抗体反応を起こす特性を維持したまま高分子量化され
ているので、高感度で再現性のよい免疫学的活性物質測
定試薬として使用することができる。

【００４２】本発明の免疫学的活性物質測定試薬は上記
免疫学的活性物質重合体からなっているので、担体など
に担持しなくても、対応する免疫学的活性物質を高感度
で再現性よく測定することができる。

【００４３】本発明の免疫学的活性物質の測定方法は上
記測定試薬を用いているので、簡単な操作で、対応する
免疫学的活性物質を高感度で再現性よく測定することが
できる。このような効果は、測定系として比濁法または
比ろう法を採用した場合に最も発揮される。

【００４４】

【発明の実施の形態】以下、本発明を、実施例および比
較例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに
限定されるものではない。実施例１−１（マレイミド基修飾抗体の調製）１００ｍＭ炭酸ナトリウム／炭酸水素ナトリウム緩衝液
（ｐＨ９．０）に溶解した５０ｍｇ／ｍｌ濃度のヤギ抗
Ｃ反応性蛋白質抗体（Goat Anti ＣＲＰＩｇＧ、分
子量約１５万、以下Ｃ反応性蛋白質をＣＲＰという場合
がある）１２００μｌに、ジメチルホルムアミドに溶解
した５０ｍｇ／ｍｌ濃度のＮ−（６−マレイミドカプロ
イルオキシ）スクシンイミド（ＥＭＣＳ、同仁化学社
製、商標）２３．１μｌを修飾剤として加え、４℃で１
２時間、暗所でインキュベートし、抗体中の遊離アミノ
基と修飾剤中のスクシニミジルオキシカルボニル基とを
反応させ、抗体中に修飾剤をアミド結合により導入し
た。

【００４５】反応終了後、反応液を、１００ｍＭリン酸
水素二ナトリウム／リン酸二水素ナトリウム緩衝液（ｐ
Ｈ６．０）で平衡化したSephadex−Ｇ２５（Pharmacia
LKBBiotechnology社製、商標）充填カラム（カラムサイ
ズ：内径１３ｍｍ×３９０ｍｍ）に、流速０．５ｍｌ／
ｍｉｎで通液して分画した（分画体積＝１．０ｍｌ／各
分画）。各分画を２８０ｎｍの吸光度を測定することに
より、マレイミド基修飾ヤギ抗Ｃ反応性蛋白質抗体およ
び未反応の修飾剤のピークを確認し、収分画番号２２〜
３３を分取して、下式（４）で表わされるマレイミド基
修飾ヤギ抗Ｃ反応性蛋白質抗体を得た。

【化３】（Ａはヤギ抗Ｃ反応性蛋白質抗体の残基を示す。ｎは
７．３である。）

【００４６】抗体中の遊離アミノ基が修飾剤中のスクシ
ニミジルオキシカルボニル基とアミド結合を形成した割
合（修飾率（％））を、グリシン溶液を標準液、未修飾
の抗体の修飾率を０％として、遊離アミノ基の定量法
（Analytical Biochemistry 14,328-336(1966)）により
求めた。その結果、修飾率は８．１％であり、ｎは７．
３となった。また、上記マレイミド基修飾ヤギ抗Ｃ反応
性蛋白質抗体をドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に供したとこ
ろ、マレイミド基修飾ヤギ抗Ｃ反応性蛋白質抗体は、未
修飾のヤギ抗Ｃ反応性蛋白質抗体の分子量と比較するこ
とにより、会合または重合などの高分子化は起きていな
いことが確認された。

【００４７】実施例１−２（メタクリロイル基修飾抗体
の調製）実施例１−１の修飾剤溶液の代わりに、脱水１，４−ジ
オキサンに溶解した２５ｍｇ／ｍｌ濃度のメタクリロイ
ルオキシエチルイソシアネート溶液１６．７μｌを用い
た以外は実施例１−１と同様にして、下式（５）で表わ
されるメタクリロイル基修飾ヤギ抗Ｃ反応性蛋白質抗体
を得た。このメタクリロイル基修飾抗体の修飾率を実施
例１−１と同様にして求めたところ７．８％であり、ｎ
は７．０となった。またメタクリロイル基修飾抗体は、
未修飾の抗体の分子量と比較することにより、会合また
は重合などの高分子化は起きていないことが確認され
た。

【化４】（Ａはヤギ抗Ｃ反応性蛋白質抗体の残基を示す。ｎは
７．０である。）

【００４８】実施例１−３（アクリロイル基修飾抗体の
調製）実施例１−１の修飾剤溶液の代わりに、脱水１，４−ジ
オキサンに溶解した２５ｍｇ／ｍｌ濃度のアクリル酸ク
ロリド溶液１３．６μｌを用いた以外は実施例１−１と
同様にして、下式（６）で表わされるアクリロイル基修
飾ヤギ抗Ｃ反応性蛋白質抗体を得た。このアクリロイル
基修飾抗体の修飾率を実施例１−１と同様にして求めた
ところ８．０％であり、ｎは７．２となった。またアク
リロイル基修飾抗体は、未修飾の抗体の分子量と比較す
ることにより、会合または重合などの高分子化は起きて
いないことが確認された。

【化５】（Ａはヤギ抗Ｃ反応性蛋白質抗体の残基を示す。ｎは
７．２である。）

【００４９】実施例１−４（スチリル基修飾抗体の調
製）実施例１−１の修飾剤溶液の代わりに、脱水１，４−ジ
オキサンに溶解した５０ｍｇ／ｍｌ濃度のｐ−スチレン
スルホン酸クロリド溶液１５．２μｌを用いた以外は実
施例１−１と同様にして、下式（７）で表わされるスチ
リル基修飾ヤギ抗Ｃ反応性蛋白質抗体を得た。このスチ
リル基修飾抗体の修飾率を実施例１−１と同様にして求
めたところ７．７％であり、ｎは６．９となった。また
スチリル基修飾抗体は、未修飾の抗体の分子量と比較す
ることにより、会合または重合などの高分子化は起きて
いないことが確認された。

【化６】（Ａはヤギ抗Ｃ反応性蛋白質抗体の残基を示す。ｎは
６．９である。）

【００５０】実施例２−１実施例１−１で調製したマレイミド基修飾ヤギ抗Ｃ反応
性蛋白質抗体を１００ｍＭリン酸水素二ナトリウム／リ
ン酸二水素ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解し、
２５ｍｇ／ｍｌ濃度の重合用抗体溶液を得た。またこれ
とは別に、他の共重合モノマーとしてのメタクリルアミ
ドを上記リン酸緩衝液に溶解し、１６０．０ｍｇ／ｍｌ
のメタクリルアミド溶液を得た。さらに、ラジカル重合
開始剤としての２，２′−アゾビス［２−（２−イミダ
ゾリン−２−イル）プロパン］ジヒドロクロリドを上記
リン酸緩衝液に溶解し、７．２ｍｇ／ｍｌ濃度の開始剤
溶液を得た。

【００５１】上記重合用抗体溶液８００μｌに、メタク
リルアミド溶液１００μｌおよび開始剤溶液１００μｌ
を加え、窒素雰囲気下に、３５℃で３日間、暗所で振と
うしながらインキュベートし、重合用抗体とメタクリル
アミドとを共重合させた。反応終了後、反応液を３０ｍ
Ｍリン酸水素二ナトリウム／リン酸二水素ナトリウム緩
衝液（ｐＨ７．５）１００ｍｌに対して、４℃において
暗所で透析し、開始剤を除去した。

【００５２】透析終了後、ＴＳＫ−ＧＥＬＧ４０００
ＳＷＸＬ（ＴＯＳＯＨ社製、商標）の充填カラム、およ
びＴＳＫ−ＧＥＬＧ３０００ＳＷＸＬ（ＴＯＳＯＨ社
製、商標）の充填カラムをこの順序で直列に接続し、こ
れを用いて分析した。すなわち透析した反応液を、０．
３ＭＮａＣｌ、５０ｍＭリン酸水素二ナトリウム／リ
ン酸二水素ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化し
た上記カラムに、流速＝１．０ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温
度＝４０℃、サンプル体積＝５０μｌ、サンプル濃度＝
１．０ｍｇ／ｍｌの条件で通液した。その結果、チオグ
ロブリン（分子量＝６６９，０００）以上にピークが確
認され、抗体共重合体が調製されたことが確認された。

【００５３】実施例２−２実施例２−１において、重合用抗体として実施例１−２
で得たメタクリロイル基修飾抗体を用いた以外は実施例
２−１と同様にして行った。その結果、チオグロブリン
（分子量＝６６９，０００）以上にピークが確認され、
抗体共重合体が調製されたことが確認された。

【００５４】実施例２−３実施例２−１において、重合用抗体として実施例１−３
で得たアクリロイル基修飾抗体を用い、またメタクリル
アミド溶液の代りに１３３．６ｍｇ／ｍｌ濃度のアクリ
ルアミド溶液１００μｌを用いた以外は実施例２−１と
同様にして行った。その結果、チオグロブリン（分子量
＝６６９，０００）以上にピークが確認され、抗体共重
合体が調製されたことが確認された。

【００５５】実施例２−４実施例２−１において、重合用抗体として実施例１−４
で得たスチリル基修飾抗体を用いた以外は実施例２−１
と同様にして行った。その結果、チオグロブリン（分子
量＝６６９，０００）以上にピークが確認され、抗体共
重合体が調製されたことが確認された。

【００５６】実施例３−１実施例１−１で調製したマレイミド基修飾ヤギ抗Ｃ反応
性蛋白質抗体を１００ｍＭリン酸水素二ナトリウム／リ
ン酸二水素ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解し、
２５ｍｇ／ｍｌ濃度の重合用抗体溶液を得た。またこれ
とは別に、ラジカル重合開始剤としての２，２′−アゾ
ビス［２−（２−イミダゾリン−２−イル）プロパン］
ジヒドロクロリドを上記リン酸緩衝液に溶解し、２．０
ｍｇ／ｍｌ濃度の開始剤溶液を得た。

【００５７】上記重合用抗体溶液８００μｌに、開始剤
溶液２００μｌを加え、窒素雰囲気下に、３５℃で３日
間、暗所で振とうしながらインキュベートし、重合用抗
体を重合させた。反応終了後、反応液を３０ｍＭリン酸
水素二ナトリウム／リン酸二水素ナトリウム緩衝液（ｐ
Ｈ７．５）１００ｍｌに対して、４℃において暗所で透
析し、開始剤を除去した。透析終了後、実施例２−１と
同様にして分析を行った。その結果フェリチン（分子量
＝４４０，０００）以上、チオグロブリン（分子量６６
９，０００）以下にピークが確認され、抗体重合体が調
製されたことが確認された。

【００５８】実施例３−２実施例３−１において、重合用抗体として実施例１−２
で得たメタクリロイル基修飾抗体を用いた以外は実施例
２−１と同様にして行った。その結果、フェリチン（分
子量＝４４０，０００）以上、チオグロブリン（分子量
６６９，０００）以下にピークが確認され、抗体重合体
が調製されたことが確認された。

【００５９】実施例３−３実施例３−１において、重合用抗体として実施例１−３
で得たアクリロイル基修飾抗体を用いた以外は実施例３
−１と同様にして行った。その結果、フェリチン（分子
量＝４４０，０００）以上、チオグロブリン（分子量６
６９，０００）以下にピークが確認され、抗体重合体が
調製されたことが確認された。

【００６０】実施例３−４実施例３−１において、重合用抗体として実施例１−４
で得たスチリル基修飾抗体を用いた以外は実施例３−１
と同様にして行った。その結果、フェリチン（分子量＝
４４０，０００）以上、チオグロブリン（分子量６６
９，０００）以下にピークが確認され、抗体重合体が調
製されたことが確認された。

【００６１】実施例４−１多項目選択機能を持つシングルマルチ方式の自動分析機
（日立製作所社製、商品名「日立７０７０自動分析
機」）を用いて、比濁法によりＣ反応性蛋白質（ＣＲ
Ｐ）の測定を行った。まず標準血清溶液（０ｍｇ／ｄ
ｌ、０．０５ｍｇ／ｄｌ、０．２ｍｇ／ｄｌ、０．８ｍ
ｇ／ｄｌ；予めＣＲＰを除いた溶液に所定量のＣＲＰを
加えて調製したもの）２０μｌ、および表１に示す試薬
１を３００μｌ添加し、３７℃で５分間インキュベート
した。次いで実施例２−１にて調製したヤギ抗ＣＲＰ抗
体共重合体を含む表１に示す試薬２を５０μｌ添加し、
３７℃で５分間インキュベートした。その後、主波長３
４０ｎｍおよび副波長７００ｎｍの差を測定カウント
（３４０ｎｍ−７００ｎｍ）とした。各濃度の測定カウ
ント数は表２に示した。

【００６２】実施例４−２ないし４−４実施例４−１において、実施例２−１で調製したヤギ抗
ＣＲＰ抗体重合体の代わりに、実施例２−２、実施例２
−３または実施例２−４で調製したヤギ抗ＣＲＰ抗体共
重合体を用いた以外は実施例４−１と同様にして測定を
行った。結果を表２に示した。

【００６３】実施例５−１ないし５−４実施例４−１において、実施例２−１で調製したヤギ抗
ＣＲＰ抗体重合体の代わりに、実施例３−１、実施例３
−２、実施例３−３または実施例３−４で調製したヤギ
抗ＣＲＰ抗体重合体を用いた以外は実施例４−１と同様
にして測定を行った。結果を表２に示した。

【００６４】比較例１実施例４−１において、ヤギ抗ＣＲＰ抗体共重合体の代
わりに、重合していない抗ＣＲＰ抗体を用いた以外は実
施例４−１と同様にして測定を行った。結果を表２に示
した。

【００６５】

【表１】＊１日本油脂（株）社製、マクロゴール６０００（ポリエチレングリコールＭｗ８８００）、商標＊２実施例２−１ないし２−４および実施例３−１ないし３−４で調製した抗ＣＲＰ抗体（共）重合体、あるいは抗ＣＲＰ抗体

【００６６】

【表２】

【００６７】表２の結果から、ヤギ抗ＣＲＰ抗体（共）
重合体を含む測定試薬を用いた各実施例は、重合してい
ない抗ＣＲＰ抗体を含む測定試薬を用いた比較例と比較
すると明らかに測定カウントが高くなり、高感度な測定
が可能であることが分かる。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】免疫学的活性物質に、一般式（１）Ｒ¹−(Ｘ)m−Ｒ² …（１）（式中、Ｒ¹は免疫学的活性物質中の官能基と結合可能
な官能基、Ｒ²はラジカル重合可能な重合性基、Ｘは２
価の有機残基、ｍは０または１を示す。）で表わされる
修飾剤を反応させて得られる、一般式（２）Ａ−［(Ｙ)k−(Ｘ)m−Ｒ²］n …（２）（式中、Ａは免疫学的活性物質の残基、Ｙは免疫学的活
性物質中の官能基と前記Ｒ¹の官能基とから形成された
基、ｋは０または１、Ｘは２価の有機残基、ｍは０また
は１、Ｒ²はラジカル重合可能な重合性基、ｎは１以上
の数を示す。）で表わされる免疫学的活性物質単量体。
【請求項２】請求項１記載の免疫学的活性物質単量体
を重合してなる免疫学的活性物質重合体。
【請求項３】請求項２記載の免疫学的活性物質重合体
を含むことを特徴とする免疫学的活性物質測定試薬。
【請求項４】被検物質となる免疫学的活性物質を含む
検体と、請求項３記載の免疫学的活性物質測定試薬とを
接触させ、検体中の被検物質と免疫学的活性物質測定試
薬中の免疫学的活性物質重合体とを抗原抗体反応させた
後、反応生成物を測定することを特徴とする免疫学的活
性物質の測定方法。
【請求項５】反応生成物を比濁法（turbidimetry）ま
たは比ろう法（nephelometry）で測定する請求項４記載
の測定方法。