JPH0954093A - 抗原や抗体の固相方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目 的】 この発明は、抗原抗体反応を利用したクロ
マト法による臨床検査キットを作成するに際して、熱に
不安定な抗原や抗体を支持体に固相化する方法として、
印字機構にピエゾ素子を有するインクジェット方式の印
刷機を使用する印刷方法に関するものである。 【構 成】 １）印字機構にピエゾ素子を有するインク
ジェット方式の印刷機を使用する。 ２）抗体や抗原を固相化するに際して、ニトロセルロー
ス膜等のように蛋白質吸着能を有する膜もしくは担体を
用いる。 【効 果】 簡便、かつ複数の情報が提供可能な臨床検
査キットが作成できる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、抗原抗体反応を利用し
た検査キットを作成するに際し、印刷機を用いて抗原や
抗体など熱に不安定な物質を膜面に固相化する方法に関
する。更に詳しくは、抗原や抗体の様に熱に不安定な物
質を固相化するに際して、印字機構としてピエゾ素子を
有する印刷機を用いて、好ましくは、ニトロセルロース
膜などのように、蛋白質類を吸着固定する能力を有する
膜に抗原や抗体を固相化する方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】従来より、臨床検査分野では抗原抗体反
応を利用した検査法が広く用いられている。なかでもエ
ライザ法は、抗原または抗体を支持体、例えば、ポリス
チレンよりなるマイクロプレートの底面に吸着固定し、
そのウェル内で抗原抗体反応を行う方法として広く用い
られている。しかしながら、この方法は反応操作に熟練
を要することや、測定に高価な器具が必要なことから大
規模な検査機関でしか利用できないという欠点を有して
いる。近年、抗原抗体反応を平板の膜面上で行う、いわ
ゆるクロマト法が注目されている。この方法は、血清中
の測定対象物と、その物質に特異的に反応する抗原また
は抗体（これらの抗原もしくは抗体にはあらかじめ、発
色団を結合させておく）とをまず反応せしめ、平板の膜
面上を移動させながら、事前に膜面上の中間部分に固相
化しておいた測定対象物に対する抗原もしくは抗体とを
反応せしめることにより、測定対象物の有無を判別する
もので、簡便でかつ迅速なために広い応用が期待されて
いる方法である。

【０００３】

【発明が解決しようとする問題点】このクロマト法にお
いて、平板の膜面上に抗原もしく抗体をあらかじめ固相
化する方法は極めて重要であり、精度の良い検査結果を
得るためには、再現性良く、一定量の抗原や抗体を正確
に所定の膜面上に固相化する必要がある。従来より使用
されている抗原抗体の固相化法としては、抗原もしくは
抗体を含有する溶液を小さなノズルから高圧で吹き付け
るスプレー方式や、ゴムスタンプのようなもので、一定
量を押しつけるスタンプ方式、抗原や抗体溶液を含浸さ
せた筆などで線を引く方法が一般的であった。しかしな
がら、スタンプや筆を用いる方法では大量処理は不向き
であり、再現性に乏しかった。また、スプレー方式では
直線が基本であり、単純な結果しか表現できず、複数の
情報、例えば、複数の抗原抗体反応をクロマトの膜面上
に表現したり、絵や文字のように高度な情報を表現する
ことは困難であった。

【０００４】

【問題解決の手段】本発明者らは前述の問題を解決すべ
く鋭意検討した結果、クロマト法を利用した検査キット
を作成するに際し、抗原や抗体の様に熱に不安定な物質
を支持体に固相化し、抗原抗体反応の結果を再現性良
く、かつ大量に処理する方法として、また、複数の抗原
抗体反応を同一の膜面上に表現したり、反応結果を絵や
文字で表現する方法として、コンピューター分野で広く
使用されている印刷機の利用が有効なことを見いだし
た。更に詳しくは、印刷機の印字機構として、ピエゾ素
子を有するインクジェット方式の印刷機を用いることに
よって、抗原や抗体の様に熱に不安定な物質を失活させ
ることなく、蛋白質類を吸着固定する能力を有する膜や
担体に固相化できることを見いだし発明を完成するに至
った。

【０００５】つぎに、本発明について詳細に説明する。
クロマト法を利用した検査キットを作成するに際し、抗
原抗体反応に使用する抗原や抗体の種類や起源は特に限
定されない。たとえば、種々のウイルスやその構成蛋
白、兎やマウスを免疫することによって得られた抗血
清、さらにはマウス腹水より得られたモノクローナル抗
体などが広く用いられる。ウイルスなどの抗原は密度勾
配超遠心分離法を組み合わせた精製法により、また、抗
体を含む血清や腹水はＤＥＡＥ−セルロースのクロマト
法など、一般的な方法によって精製されたものが好適に
用いられる。それらの精製した抗原や抗体を使用する際
の濃度は、１０μｇ／ｍｌから１０ｍｇ／ｍｌの範囲が
望ましく、５０μｇ／ｍｌから５ｍｇ／ｍｌが特に好ま
しい。

【０００６】クロマト法を行う支持体としては、グラス
ファイバー濾紙のような無機質の膜ややポリカーボネー
ト膜やニトロセルロース膜の様な合成膜もしくは再生膜
など、蛋白質や糖蛋白質の様な化合物に対して吸着性を
有するものであれば、特にその種類は問わない。この支
持体上に精製した抗原もしくは抗体を吸着固定し、抗原
抗体反応を行う。

【０００７】抗原もしくは抗体を定量的に、かつ絵や文
字など多くの情報を再現性良く支持体に表現する方法と
して、コンピューター用プリンターとして広く普及して
いる印刷機の利用を検討した。その結果、コンピュータ
ー用の印刷機には多くの種類があるが、そのなかでイン
クジェット方式は、インクの代わりに抗原もしくは抗体
を含む液をインクポットに入れることによって、インク
と同じように処理できるのでこの目的に適していた。た
だし、インクジェット方式のうちバブルジェット方式や
サーマルジェット方式のように印字機構として、インク
に熱を加え沸騰した気泡の圧力でインクをとばす方式の
ものは、蛋白質か熱により変性してしまい、印刷固定後
に抗原抗体反応が出来ず不適であった。一方、印字機構
としてピエゾ素子を有する方式のものはピエゾ素子の振
動によりインクを発するもので、インクに熱がかからな
いのが特徴である。このピエゾ素子方式のものは蛋白質
を変性させることなく膜面に固相化することが可能であ
った。この方式の印刷機であれば、メーカーは問わない
が、例えば、エプソン社製のＭＪ−７００Ｖ２ＣやＭＪ
−９００Ｃなどは好適に用いられる。

【０００８】このように、ピエゾ素子を有する印刷機を
用いることによって、抗原や抗体の様に熱に不安定な物
質を失活させることなく膜などの支持体に、直線や円形
などの単純な形だけでなく、漢字を含む文字やイラスト
など複雑な情報を印刷し固相化することが可能になっ
た。さらに、複数の抗原や抗体を別々のインクポットに
入れ、２種類以上の抗原や抗体を固相化し、同時に複数
の抗原抗体反応を行うことも可能になった。抗原や抗体
を吸着させた膜は、牛血清アルブミンやスキムミルク等
で未反応部分を処理して、副反応を抑えることが望まし
い。この様にして、抗原や抗体を吸着させた膜や担体は
それぞれ対応する抗体や抗原と特異的に反応するので、
抗体や抗原の検査に有効に利用出来るものであった。

【０００９】クロマト法による診断キットでは、抗原抗
体反応の結果を目視して判断するので、発色団と結合さ
せた２次抗原もしくは２次抗体が必要である。２次抗原
や２次抗体としては、膜面に固定した抗原や抗体と異な
る認識部位を有するものが望ましい。たとえば、異なっ
た認識部位を有するモノクローナル抗体などは好適に用
いられる。発色団としては金コロイドや有色のラテック
スビーズが一般的に用いられる。いずれも、抗原や抗体
の蛋白部分と強い結合力を有するので、高度に精製され
た抗原や抗体が用いられる。結合させる際の蛋白質濃度
としては０．０１〜１０ｍｇ／ｍｌが用いられる。抗原
もしくは抗体を金コロイドやラテックスビーズに結合さ
せた後、牛血清アルブミンやスキムミルクなどで未反応
部分を処理する事、いわゆるブロッキングが必要であ
る。また、これらの２次抗原や２次抗体と結合した金コ
ロイドやラテックス粒子は遠心分離等により精製し、所
定の濃度に調整する。さらに、このラテックスや金コロ
イド粒子と結合した抗原もしくは抗体液はグラスフィル
ターや濾紙に充分吸収させた後、乾燥しキットに組み合
わせて使用される。

【００１０】このようにして得られた抗原もしくは抗体
を固相化した膜を用いて検査キットを組み立てるには、
薄いプラスチックの板に両面テープ等で、順に血清吸収
用濾紙、抗原もしくは抗体で標識した金コロイド（もし
くは、ラテックス）含有濾紙、抗原または抗体を吸着さ
せたクロマト用支持体、および反応液吸収用濾紙を配置
し、検査キットが構成される。

【００１１】

【作用】このように構成された検査キット上の血清吸収
用濾紙に被検血清１００μｌを落とすとき、血清は膜上
を次第に展開し、反応液吸収濾紙に吸収される。その
際、血清中に測定対象の抗体もしくは抗原が存在すれ
ば、すなわち陽性であれば、第１段階として抗原もしく
は抗体で標識された金コロイド（もしくは、ラテック
ス）と結合し、複合体を形成しながら移動する。陰性で
あれば、金コロイド（もしくは、ラッテクス粒子）が単
独に移動する。次に、その複合体は展開途中に固相化さ
れている抗原もしくは抗体とさらに結合し停止する。そ
の結果、停止した位置に金コロイド（または有色のラテ
ックス）の色が線状にまたは、所定の模様に出現する。
陰性の場合は抗原との反応がないのでそのまま、展開を
続け、反応液吸収用濾紙に吸収されて、膜面上に変化は
ない。約１０〜２０分で反応が終了し、有色の線もしく
は模様の出現によって、陰性または陽性の判定がなされ
る。

【００１２】

【実施例】

【実施例１】 抗体の精製：猫白血病ウイルス（ＦｅＬＶ）により免疫
された兎の血清１ｍｌに無水硫酸ナトリウム０．１８ｇ
を加え、よく混合した。２０℃、２時間放置後、遠心分
離し沈澱を１７．５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．３）１
ｍｌに溶解した。つぎに、同じリン酸緩衝液中に透析
し、硫安を除いた。あらかじめリン酸緩衝液（ｐＨ６．
３）で平衡化しておいたＤＥＡＥ−セファデックスカラ
ムに通液し、非吸着画分を回収し精製抗体液とした。

【００１３】

【実施例２】 金コロイド−抗体複合体の作成：実施例１に従って精製
したＦｅＬＶ抗体（蛋白質濃度 ０．１ｍｇ／ｍｌ）５
ｍｌをｐＨ９．２に調整し、市販の金コロイドの溶液１
００ｍｌ（ｐＨ９）中に撹拌しながら滴下し、１０分間
感作させた。更に、１０％牛血清アルブミン水溶液１０
ｍｌを加えて、３０分間穏やかに撹拌した。つぎに、毎
分８０００回転で４５分間遠心分離し、上清を捨てた
後、２０ｍｌの０．１％牛血清アルブミンと０．１％ア
ジ化ナトリウムを含むトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．２）
に懸濁し、金コロイド−抗体液とした。

【００１４】

【実施例３】 抗体の固相化：エプソン社製のＭＪ−７００Ｖ２Ｃのイ
ンクポットを外し、実施例１の方法で精製した抗ＦｅＬ
Ｖモノクローナル抗体および抗マウス抗体をそれぞれ別
の容器に入れ、ＭＪ−７００Ｖ２Ｃにセットした。蛋白
質固相化用膜としてニトロセルロース膜を用いた。ワー
プロソフトの一太郎（ジャストシステム社製）を用い
て、抗ＦｅＬＶ抗体および抗マウス抗体の２本の線を行
をかえて同一膜面上に印刷した。冷蔵庫（４℃）で、１
８時間吸着固相化させた後、１％牛血清アルブミンを含
むリン酸緩衝液で室温３０分間穏やかに撹拌し、ブロッ
キングした。抗体を固相化した膜は水洗後真空乾燥し
た。

【００１５】

【実施例４】 試験キットの作成：塩化ビニル製のプラスチックプレー
ト上に両面テープを貼り、抗体を固相化したニトロセル
ロース膜を接着した。下端に金コロイド−抗体を含有し
たパットをニトロセルロース膜上に一部乗せて接着し
た。さらにその一部を重ねて血清吸収用濾紙を乗せた。
一方、ニトロセルロース膜の上端には反応液吸水用濾紙
を接着し、検査用キットとした。なお、本キットは３〜
５ｍｍ幅に切断して使用すると、検査に必要な血清量が
少なくて良く、好ましい。

【００１６】

【実施例５】 使用例：実施例４で示した試験キットの血清滴下パット
にＦｅＬＶ陽性の血清を０．１ｍｌ滴下するとき、血清
中のＦｅＬＶ由来のｐ２７蛋白質と金コロイド−抗体と
の反応が起こり、膜上を移動しながら５分後にはニトロ
セルロース膜上に、ｐ２７蛋白質を介して、金コロイド
−抗体が留まり、赤色のラインが出現した。さらに、抗
マウス抗体を塗布した部分にも赤色のラインが現れた。
これは、金コロイド−抗体と抗マウス抗体との結合によ
るもので、反応が正常に行われていることを示す指標と
して利用する事ができる。一方、ＦｅＬＶ陰性の血清で
は抗ＦｅＬＶ抗体を塗布した部分には変化は認められな
かったが、抗マウス抗体を塗布した部分には赤色のライ
ンが確認された。

【００１７】

【発明の効果】本発明によって、複数の抗原抗体反応を
一つのキットで行ったり、判定結果が文字や絵で表現で
きるので、利用者に分かりやすく、判読誤りの少ない検
査キットを提供できた。さらに、印刷機を使用するので
再現性良く、大量に処理ができ、工業的な処理が可能に
なった。また、この印刷機による方法は、酵素の様に熱
に不安定な蛋白質をも処理することが可能で、複数の酵
素を順次反応させたり、蛋白質を利用したスイッチング
機構や微細なバイオセンサーの回路を作成する際などに
も広く応用できるものである。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 印刷機を用いて抗原や抗体のように熱に
   不安定な物質を固相化用の支持体に固相化する方法
2. 【請求項２】 印刷機が印字機構部分にピエゾ素子を有
   することを特徴とする請求項１の固相化方法。