JPH0956385A - フラボノイドを配糖化する活性を有するタンパク質、該タンパク質をコードしているｄｎａ、該ｄｎａを含む組換えベクターおよび該ｄｎａの製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】 フラボノイド−３−グルコシル転移酵素活性
を有するタンパク質、該タンパク質をコードする遺伝
子、該遺伝子を含むベクターおよび該遺伝子の製法。 【解決手段】 フラボノイドの３位にグルコースを転移
する活性を有するタンパク質であって、実質的に配列番
号１に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコード
しているＤＮＡまたはその断片；前記ＤＮＡまたはその
断片を含む組換えベクター；前記タンパク質またはその
断片を含む融合タンパク質；および、フラボノイドの合
成を誘導した植物からｍＲＮＡを分離し、該ｍＲＮＡか
らｃＤＮＡライブラリーを作製し、該ｃＤＮＡライブラ
リーから、フラボノイドの合成を誘導しなかった植物に
由来するＤＮＡまたはその断片と反応するクローンを除
くことにより、フラボノイドの３位にグルコースを転移
する活性を有するタンパク質をコードしているｃＤＮＡ
を選択することを含む、ＤＮＡの製法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、植物の花弁等に存
在する主要な色素であるフラボノイド系化合物を修飾す
るグルコース転移酵素、該酵素をコードしているＤＮ
Ａ、該ＤＮＡを含む組換えベクター、および該ＤＮＡの
製法に関し、より詳細には、フラボノイド系化合物の３
位にグルコースを転移する活性を有する酵素、該酵素を
コードしているＤＮＡ、該ＤＮＡを含む組換えベクタ
ー、および該ＤＮＡの製法に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】植物の花・茎等に存在するフラボノイド
系化合物のうちアントシアンは、植物に黄、赤、青系統
の色をもたらすため、特に花卉の育種上、大きな関心を
集めてきた。また、他のフラボノイド系の無色の化合物
もまた、幾つかの生理的役割を持つことが知られてお
り、例えば、紫外線吸収するすることにより植物のUV障
害を軽減することや、植物病原菌からの防護物質（ファ
イトアレキシン）として働くことが知られている[ハー
ルブルックら(Hahlbrock) Annual Review of PlantPhys
iology and Molecular Biology 40, 347-369頁(198
9)]。それらの合成経路については詳細に研究されてい
るが[モルら(Mol) Plant Molecular Biology Reporter
6, 274-279頁 (1988)]、生合成産物は植物種によって、
更に様々の修飾酵素の作用を受けて変化している[フォ
ークマン(Forkmann) Plant Breeding 106,1-26頁 (199
1)]。例えば、メチル化[ジョンソンら(Jonsson) Theore
tical and Applied Genetics 68, 459-466頁 (1984)]、
アシル化[ハールブルック(Hahlbrock) FEBS Letters 2
8, 65-68頁(1972)]、及び配糖化等があり、その中でも
配糖化は様々の２次代謝産物の物性を変える点で重要と
されている。

【０００３】フラボノイドの一種であるフラボノール
は、ジヒドロフラボノールがジオキシゲナーゼの１種の
フラボノール合成酵素の作用により酸化した物であるが
[フォークマンら(Forkmann) Zeitschrift fur Naturfor
schung 41c, 179-186頁 (1986)]、フラボノールに変換
した後、配糖化の他、メチル化、亜硫酸化[バリンら(Va
rin)Plant Physiology 95, 1254-1258頁(1991)]等の修
飾を受けることが知られている。また、フラボノールの
顕著な働きとして、それが植物ホルモンであるオーキシ
ンの輸送に影響するので[ジャコブら(Jacobs) Science
241, 346-349 頁(1988)]、花粉管の成長が制御を受け、
結果的に稔性を制御するのに有用と言われている[WO 93
/18142]。即ち、フラボノールは花粉管の成長を促進す
るが、その配糖化物は成長促進活性がないため、配糖化
活性が高い植物では花粉管の成長が悪く、稔性も著しく
低下すると想像される[ポラックら(Pollak) Plant Phys
iology 102, 925-932 頁(1993)]。また、植物から抽出
したフラボノイド、特にフラボノール類は、前述のよう
にUV光等の蛍光からの防護物質としての役割を果たすこ
とから、色素の退色防止、有効成分の酸化防止を目的と
した食品添加物として広範に使用されている[高屋幾夫
New Food Industry 35, 7-16頁 (1993)]。しかし、天
然のフラボノールは疎水性が高く水に解けにくいため利
用しにくく、精製物質を微生物由来の酵素で配糖化させ
て使用しているのが現状である〔特開平０２−１７９８
３９〕。これを避けて、フラボノールの配糖化が進んだ
物質を植物体で生産するため、交雑育種によってこれら
の需用に答えることも原理的には不可能でない。しかし
ながら、このような古典的な植物育種法は、交雑育種に
用いる様々な植物種の組合せに依存した交配に関わる相
性の良さ、目的形質以外の望まざる形質が導入されるこ
となど多くの問題を内在している。

【０００４】一方、アントシアンは、言うまでもなく
赤、青等の様ざまの天然色素の主成分であるが、無色の
アントシアニジンが配糖化し、その後有色の安定な化合
物になる。その生合成の間、配糖化前のアントシアニジ
ンは非常に不安定な化合物とされ、配糖化のステップは
色素の形成上、重要な反応と考えられている。ところ
で、近年の植物遺伝子工学の発展により、遺伝子組換え
の手法を用いて植物に種々の有用形質を与えることが可
能になりつつある。その一例として、マイヤーら〔特開
平２−２３０５〕は、ペチュニア(Petunia hybrida)に
遺伝子組換えをおこない、シアニジン及びデルフィニジ
ン型色素の形成ができず、Ｂ環で４’位のみが水酸化さ
れた合成中間体であるジヒドロケンフェロールが蓄積す
る変異体に対して、トウモロコシ(Zea mays)由来のＤＦ
Ｒ（ジヒドロフラボノール−４−レダクターゼ）を導入
することにより、新規なレンガ色の花色のペチュニアを
作ることに成功した。このような手法を用いれば、フラ
ボノールの３位にグルコースを転移する酵素を種々の植
物に導入し、配糖化したフラボノールを持った植物を作
れる可能性がある。このような植物では配糖化されたフ
ラボノールが主体と成るので、花粉管の伸張は阻害さ
れ、稔性も低下している可能性がある。また、クロール
らは[(van der Krol) Nature 333, 866-869頁 (198
8)]、カルコン合成酵素(Chalcone synthase; CHS)遺伝
子のmRNAが逆向きに転写されるように（アンチセンス）
植物に導入し、CHS活性を著しく低下させ、フラボノイ
ドの生成量を下げることに成功した。この技術を応用す
れば、フラボノイドの糖転移酵素遺伝子をアンチセンス
で植物に導入し、配糖化が進んでいないフラボノイドを
主として生産する植物を作出することも可能であろう
[クルーンら(Kroon) Plant Journal 5, 69-90頁 (199
4)]。

【０００５】さて、フラボノイドの３位への配糖化につ
いてはトウモロコシの種子(E. C. 2.4.1.91)、キンギョ
ソウの花等を用いて詳細な研究が進められてきた。酵素
学的には、UDPglucoseをグルコースの供与体として、フ
ラボノイドのA環の３位に１分子のグルコースが転移さ
れると言われている（図１）。また、赤キャベツの実生
[サンら(Sun) Plant Physiology 95, 570-576 頁(199
1)]やペチュニアの花[ジョンソンら(Jonsson) Planta 1
60, 341-347頁 (1984)]由来の糖転移酵素について、主
として受容体の選択性に関する酵素学的な知見が得られ
てきた。しかしながら、受容体フラボノイドについてフ
ラボノールとアントシアンのどちらか、又は両方を配糖
化するかどうかについて、精製酵素を用いて厳密に調べ
た例は少なく、多くの場合、複数の配糖化酵素が共存す
る状態で測定したため、厳密な意味での基質の決定は明
確になっていないと思われる[ヘーゼル(Hosel) The Bio
chemistry of Plants 7, 725-753頁(1981)]。また、前
述のキャベツ及びペチュニア由来の酵素共、サブユニッ
トが２７−３０kDaの２量体とされており、トウモロコ
シ等の５０kDa型のものとは相当構造が異なっていると
思われる。フラボノイドへの配糖化酵素遺伝子の構造に
関しては、３位へのグルコース転移についてトウモロコ
シ種子[ラルストンら(Ralston) Genetics 119, 185-197
ページ(1988)]及びキンギョソウ[C.マーチン (Cathie
Martin)英国、ジョンイネス研究所；私信 ]で、並びに
３位へのラムノース転移についてペチュニア[クルーン
ら(Kroon)Plant Journal 5, 69-80 ページ(1994)]で突
然変異体の解析からコードしている遺伝子の機能が推定
されているが、この場合も遺伝子がコードする酵素の活
性は直接測定されていない。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】従って、本発明は、フ
ラボノイドの３位にグルコースを転移する活性を有する
酵素を発現しうる遺伝子を提供することを目的とする。
また、本発明は、該遺伝子を含む組換えベクター、該遺
伝子によりコードされている酵素および該遺伝子の製法
を提供することも目的とする。

【０００７】

【課題を解決するための手段】上記目的を達成するた
め、本発明者は、フラボノイドの合成を誘導したナス(S
olanum melongena)から、フラボノイドの３位にグルコ
ースを転移する活性を有するタンパク質をコードしてい
る遺伝子をクローニングし、該遺伝子を組み込んだ組換
えベクターで大腸菌を形質転換して該遺伝子を発現させ
たところ、フラボノイドの３位にグルコースを転移する
活性を有するタンパク質が産生されることを見出し、本
発明を完成させるに至った。すなわち、本発明は、フラ
ボノイドの３位にグルコースを転移する活性を有するタ
ンパク質であって、実質的に配列番号１のアミノ酸配列
を含むタンパク質をコードしているＤＮＡまたはその断
片を提供する。また、本発明は、前記ＤＮＡまたはその
断片を含む組換えベクターを提供する。さらに、本発明
は、フラボノイドの３位にグルコースを転移する活性を
有するタンパク質であって、実質的に配列番号１のアミ
ノ酸配列を含むタンパク質またはその断片、およびそれ
らの融合タンパク質を提供する。さらにまた、本発明
は、フラボノイドの合成を誘導した植物からｍＲＮＡを
分離し、該ｍＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを作製
し、該ｃＤＮＡライブラリーから、フラボノイドの合成
を誘導しなかった植物に由来するＤＮＡまたはその断片
と反応するクローンを除くことにより、フラボノイドの
３位にグルコースを転移する活性を有するタンパク質を
コードしているｃＤＮＡを選択することを含む、フラボ
ノイドの３位にグルコースを転移する活性を有するタン
パク質をコードしているＤＮＡの製法を提供する。

【０００８】以下、本発明を詳細に説明する。 １） フラボノイド系色素の誘導方法 本発明の主題である配糖化酵素遺伝子は、一般的にその
含量が少なくかつ不安定であるため、そのタンパク質を
精製するには、多大の労力を要すると思われた。そのた
め、タンパク質の精製を行わずに遺伝子をクローニング
する系が必須である。高等植物に適用できる方法の中で
最も確かな方法の一つは、トランスポゾンによる突然変
異を誘起して、色素の合成の変異体を単離し、次にその
挿入された遺伝子の機能を解析する方法であり、そのよ
うな方法でトウモロコシとキンギョソウの糖転移酵素遺
伝子が単離されている（ラルストンら(Ralston), Genet
ics 119, 185-197頁(1988)) 。また、それをプローブと
してキンギョソウの相同遺伝子も単離された (マーチン
ら(Martin), Plant J. 1, 37-49 頁(1991)) 。本発明の
配糖化酵素遺伝子はこれらの方法により単離することも
できる。

【０００９】また、それとは別に、色素の誘導を明確に
起こし、誘導のかかる遺伝子に対応するクローンとそう
でないものをハイブリダイゼーションにより区別する事
により選別する方法もある。そのような手法はトランス
ポゾンが使われていない植物でも可能であり、一般的に
は、誘導前および誘導後の組織から別々にｍＲＮＡをと
り、それぞれに対応する放射能標識したプローブを用い
たディファレンシャル・ハイブリダイゼーション、ある
いは、それを更に改良したサブトラクト・ハイブリダイ
ゼーションと呼ばれ、いくつかの成功例が報告されてい
る〔サンブルックら(Sambrook) ; Molecular Cloning,
second edition, 10.38-10.43頁 ; ColdSpring Harbor
Laboratory Press, New York (1989)〕。何れの手法を
取るにしても、目的の遺伝子が誘導前の組織で存在しな
いかあるいは誘導後に比べて極めて少ない事が重要であ
る。本発明では、先に、本発明者らがフラボノイド水酸
化酵素遺伝子を単離するのに開発した方法を適用すると
有効である〔特開平５−１８４３７０〕。以下、本発明
の配糖化酵素遺伝子を特開平５−１８４３７０に準じて
単離する方法を簡単に記すが、上述した他の方法によっ
て単離してもよい。

【００１０】フラボノイド系遺伝子の誘導が明確にかか
る系を探索し、デルフィニジン系の色素を生産するナス
(Solanum melongena)の種子を赤色光の下で約２週間栽
培し、次に白色とＵＶ光を混合したもの（以下では白色
光と呼ぶ）２日以上照射し栽培することにより、非常に
明確にフラボノイドの合成が誘導されることが見いださ
れた。白色光での誘導後５日間のアントシアン含量の変
化を見たところ約４８時間後に最大値の半分に達してい
た（図略）。この場合、従来、植物を生化学的に研究す
る際に頻用された、暗所から白色光の下へ移す操作で
は、誘導される遺伝子の大部分が光合性に関係したもの
であり、その中からフラボノイドに関するものを選ぶこ
とは極めて効率が悪いと考えられた。本発明の方法の場
合、ナスに限らず白色光下で栽培した時、実生にフラボ
ノイド化合物を蓄積する作物、例えばペチュニア、トウ
モロコシ等で行うことも可能である。

【００１１】この間の既知の遺伝子のｍＲＮＡの変化を
調べてみると、フラボノイド色素の合成系でフラボノイ
ドの水酸化反応の前後に位置するＣＨＳ（カルコン合成
酵素）および、ＤＦＲ（デヒドロフラボノール−４−レ
ダクターゼ）は、誘導前には検出できず、誘導後７時間
めから徐々に増えて行くことがわかった。また、ＣＨＳ
及びＤＦＲのｍＲＮＡは実生の中でも、胚軸に色素が強
く誘導されたので、その部分を用いる事が望ましい。更
に、光合成系の代表的な酵素であるＲｕＢｉｓＣＯ（リ
ブロース−１、５、−２リン酸カルボキシラーゼ・オキ
シゲナーゼ）のｍＲＮＡは、白色光の誘導の前と後でそ
の量がほとんど変わらなかったので、フラボノイド系よ
りはるかに多量に存在すると思われる光合成系の遺伝子
のｍＲＮＡに対応するクローンが、本方法のナスの実生
を使った系を利用することにより、それらが効率よく除
去できる事を意味する（データ略）。

【００１２】更に、フラボノイド−３−配糖化酵素（UD
Pglucose依存型）については、酵素活性を測ることもで
きる。たとえば、フラボノールを受容体とする場合、Ｓ
ｅｒｖａ社から発売されているケルセチンをエチレング
リコール−モノメチルエーテルに溶解したものを基質と
して用いることができる。これとは別に、植物材料とし
て例えば、光誘導後のナス胚軸の抽出液と反応させ、そ
の生成物を酢酸エチル層に分配後、減圧濃縮する。これ
を８０％メタノールに溶かし、セルロース系の薄層クロ
マトグラフィー（溶媒組成；１５％酢酸等）で展開す
る。本発明者らは、このような手法により、酵素反応生
成物であるケルセチン−３−グルコシドがナス実生由来
酵素から生成されることを確かめた。

【００１３】２） ｃＤＮＡライブラリーの作製と光誘
同性クローンの選抜 誘導をかけたナス胚軸からのＲＮＡ抽出及びその中から
のｍＲＮＡの濃縮は常法に従って行うことができる。２
本鎖のｃＤＮＡ合成は確立した技術であり、例えばＰｈ
ａｒｍａｃｉａ社、Ａｍｅｒｓｈａｍ社、Ｉｎｖｉｔｒ
ｏｇｅｎ社等から発売されているキットを使用すればよ
い。Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社の場合、業者の勧めに従っ
て２本鎖ｃＤＮＡを合成しＥｃｏＲＩアダプターをつ
け、制限酵素ＸｈｏＩで切断し、両末端が接着性となっ
たこの２本鎖ｃＤＮＡの中からアガロースゲル電気泳動
等の公知手段によって１千から４千塩基対のＤＮＡ断片
を分離することができる。ついで、例えばＳｔｒａｔａ
ｇｅｎｅ社が販売していλZAP IIなどのＥｃｏＲＩ／Ｘ
ｈｏＩ部位がクローニングしやすくなっているベクター
に導入した後ファージにパッケイジングし（Ｓｔｒａｔ
ａｇｅｎｅ社）ｃＤＮＡライブラリーを作ることができ
る。パッケイジングしたファージの感染に用いる宿主大
腸菌は、ファージが増殖できる任意の細胞を使いうる。
λZAP IIの場合には、ＰＬＫ Ｆ’等が好ましい。以上
のようなライブラリーの作製法は一例であり、ｃＤＮＡ
合成キット・アダプター・ベクター等は公知のものを適
宜選択できる。ｃＤＮＡライブラリーを作製した後、フ
ァージ・クローンに宿主大腸菌で溶菌斑（プラーク）を
形成させ、このプラーク中のＤＮＡを、公知の方法にし
たがってそれぞれ２または３枚ずつのナイロン・メンブ
レンへ転写し、それぞれ別個のプローブとハイブリッド
形成させて比較することにより目的のクローンを選抜す
る。例えば、ナスを赤色光および白色光の下で育て、そ
れぞれの組織から得たｍＲＮＡに対応する³²Ｐでラベル
したｃＤＮＡプローブを使って、後者のプローブと強力
にハイブリッド形成を行うが、誘導前の組織に由来する
前者のプローブとは反応しないことが判明したクローン
を選ぶことができる（ディファレンシャル・スクリーニ
ング）。また、さらに効率の良いスクリーニングを行な
うためには、誘導後の組織に存在するｍＲＮＡに対応す
る合成ｃＤＮＡプローブを、予め誘導前の組織に存在す
るｍＲＮＡとハイブリッド形成させ、両組織に共通して
存在するため２本鎖となったプローブを選択的に除去す
る（サブトラクト・プローブ）。２本鎖ＤＮＡの除去方
法としては、リン酸塩濃度勾配によるヒドロキシ・アパ
タイト・カラム・クロマトグラフィー（例えばＢｉｏ・
Ｒａｄ社）により１本鎖と２本鎖のＤＮＡを分離するこ
と、あるいは誘導前の組織に由来するｍＲＮＡを予めビ
オチン化し、ハイブリッド形成後ビオチン化したｍＲＮ
ＡおよびｍＲＮＡ・ｃＤＮＡのハイブリッド体にアビジ
ンを更に結合させ、その重合体をフェノール層に分配す
ることにより、ハイブリッド形成しなかったｃＤＮＡを
水層に回収する（例えばＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のキッ
トを使用する）ことによって実施できる。このようにし
て得たサブトラクト・プローブとディファレンシャル・
スクリーニングを同一プレートに由来する３枚のコピー
のナイロン膜に対して並行して行う事により、誘導のか
かったクローンを高い精度で得ることができる。以上の
ようにして得たクローンに対してはこのようなプローブ
を用いたスクリーニングを２度以上行うと精度が飛躍的
に高まり、白色光誘導性のクローンに富むライブラリー
・サブセットが得られる。このサブセットを、既知の遺
伝子ＣＨＳおよびＤＦＲでスクリーニングしたところ、
何れも、濃縮前の１０倍以上に頻度が増加していた。即
ち、濃縮前のライブラリー１０、０００クローン中のＣ
ＨＳ及びＤＦＲをスクリーニングするとそれぞれ２、及
び０クローン選抜できたのに対し、濃縮後では、１、０
００クローンからそれぞれ４、及び１クローン得られ
た。上記のようにして得たファージ・クローンをプラス
ミドにサブクローニングするためには、一般的には、フ
ァージＤＮＡを常法に従って精製した後、２本鎖ｃＤＮ
Ａのクローニングに用いた制限酵素と同じ酵素で挿入ｃ
ＤＮＡを切り出し、同一の酵素で切ったプラスミド（例
えばブルースクリプトＩＩ）にクローニングすることも
できる。λZAP IIの場合には、業者の勧めに従ってヘル
パーファージを用いる事により、直接サブクローニング
することもできる。また、ｃＤＮＡをより簡便に得るた
めにはクローニング・サイトの外側に存在するベクター
ＤＮＡに対応するプライマー、例えばユニバーサル及び
リバース・プライマーを組み合わせて行うＰＣＲ（ポリ
メラーゼ・チェーン・リアクション）反応による事もで
きる。ＰＣＲの反応方法は業者（Ｃｅｔｕｓ社）の勧め
に従って良い。このようにして得たＤＮＡは、常法に従
って電気泳動による挿入ＤＮＡの大きさの分析、及び目
的のＤＮＡ断片に対しては電気溶出することができる。
ついで、上記のようにして得たＤＮＡの相互関係につい
ては、クローン同志の交差ハイブリッド検定または適当
な制限酵素の切断パターンを比較することによって知る
事ができる。また、このようにして別々の遺伝子に由来
すると推定されたＤＮＡ断片が植物体中でどのように発
現しているかを知るために、誘導前後のナスの胚軸から
得たｍＲＮＡを、常法に従って電気泳動した後ナイロン
膜に転写し、³²Ｐでラベルした検定用ｃＤＮＡとハイブ
リッド形成させる、いわゆるノーザン分析に供すること
ができる。塩基配列の解析は常法に従って行う。その
際、前記プラスミド挿入体の制限酵素断片を適当なベク
ターにサブクローニングし、得られたクローンをサンガ
ー法［サンブルックら(Sambrook);前出］のような公知
の手法により塩基配列分析にかける。サブクローニング
に好適なベクターは、不要なｃＤＮＡ断片を除いたもの
を再び結合させるセルフ・アニーリングによって得られ
た２本鎖ＤＮＡ、あるいはＭ１３系の１本鎖ＤＮＡでも
行える。推定された塩基配列は、そのまま、あるいはタ
ンパク質に読みかえることができるものはそれに変換し
た後、ＧＥＮＥＴＹＸ等の解析ソフトを用いてEMBL等の
データ・ベースに登録された公知の配列との比較を行う
ことができる。

【００１４】３） クローンのフラボノイド−３−グル
コース転移酵素活性の同定 上記のような手段で得たクローンをランダムにシーケン
スすることにより種々の遺伝子情報が得られる。例え
ば、クローン名A４８はその推測されるアミノ酸配列が
前出のトウモロコシ種子由来のフラボノイド−３位−糖
転移酵素遺伝子と有意な相同性を示した。A４８の全塩
基配列を配列番号２に、それから予想されるアミノ酸配
列を配列番号１に示す。

【００１５】次に、A４８のコードするタンパク質の活
性については、大腸菌でタンパク質を生産させ、その産
物の活性を測ることができる。この場合の宿主として
は、そのほかの頻用される生物、例えば酵母あるいはタ
バコなどの植物でもよいことは言うまでもない。その場
合、タンパク質はA４８に由来する配列以外の余計な配
列を含まない構成の他、別の蛋白との結合物であっても
いい。A４８の発現については大腸菌のβ−ガラクトシ
ダーゼ由来タンパク（２８アミノ酸）をアミノ末端側に
含むタンパクとして大腸菌ＪＭ１０９株で発現させ、可
溶性タンパク質を抽出し、受容体としてケルセチンまた
はシアニジンを用いて、糖転移酵素の測定を行なった。
反応精製物は薄層セルロース板（ＴＬＣ）や高速液体ク
ロマトグラフィーにより推定することができる。この
際、標準品として例えばケルセチン−３−グルコシド又
はシアニジン−３−グルコシドを同時に分析して、比較
すると良い。ＴＬＣの場合３種類の溶媒系、例えば１５
％酢酸、水飽和フェノール及び蒸留水（以上フラボノー
ルを受容体とする場合）、又は、１％塩酸、酢酸：塩
酸：水＝１５：３：８２の混液、及びn-ブタノール：酢
酸：水＝４：１：５の混液（シアニジンを受容体とする
場合）で同時に比較検討することにより他の糖転移酵素
の産物と区別できる。このA４８のｍＲＮＡの発現パタ
ーンについては、ナスの実生では常法に従ってｍＲＮＡ
を取得し、A４８をプローブとするノーザン解析をする
と、図３に示すように約、１、６００塩基のｍＲＮＡが
光誘導後初めて検出されることがわかる。この光誘導性
は、先に述べたようにＣＨＳおよびＤＦＲなどでも顕著
であり、同時にクローニングした他の３種類の遺伝子
（A1, A54, CYP75）でも顕著に認められた。なお、これ
らのクローンのうち、CYP75はフラボノイドＢ環水酸化
酵素をコードしていることが推定されている。また、A
４８と類似の遺伝子がナスの染色体DNA中にあるかどう
かを調べるため、染色体DNAを適当な制限酵素で切断し
た後、アガロース電気泳動により分離し、ナイロン膜な
どのDNAを吸着しやすい性質を持つ膜に転写し、放射性
のリン等で標識したA４８の断片との反応性を調べた
（サザンハイブリダイゼーション；図４）。Hind III
（図４のレーン１）, Eco RV（レーン２）のいずれの場
合も１本の、また BamHI（レーン３）ではA４８のcDNA
中に１つ切断点が存在するので２本のバンドが検出さ
れ、その他のバンドは検出できなかった。

【００１６】以上の事をまとめると、 １．A４８に対応するｍＲＮＡは、ナスを材料とした
時、フラボノイド系のＣＨＳ，ＣＦＩ及びＤＦＲと同様
に白色光により胚軸で強く誘導され、誘導前には存在し
なかった。これは、フラボノイド系の遺伝子である事を
強く示唆する。 ２．A４８は、配列番号２に示すような塩基配列を持っ
ており、そこから推定されるアミノ酸配列（配列番号
１）はトウモロコシ及びキンギョソウのフラボノイド−
３−グルコース転移酵素と類似し、糖転移酵素をコード
していると推定される。

【００１７】３．A４８を大腸菌でタンパクとして発現
させ酵素活性を測定すると、ケルセチン及びシアニジン
の３位にグルコースを転移させる活性を有しており、フ
ラボノイド−３−グルコース転移酵素であることが証明
された。 ４．従って、A４８遺伝子を利用すると、配糖化が進ん
だフラボノイドが合成され、花粉稔性、水への溶解性、
色素の安定性が変化した物質が蓄積した植物の創出に大
きく役立つと思われる。

【００１８】本発明のフラボノイド−３−グルコシル転
移酵素は、実質的に配列番号１に示されるアミノ酸配列
を含む。「実質的に配列番号１に示されるアミノ酸配
列」とは、配列番号１に示されるアミノ酸配列に加え
て、フラボノイドの３位にグルコースを転移する活性を
有する限りにおいて、配列番号１に示されるアミノ酸配
列に幾つかのアミノ酸の欠失、置換、付加などがあって
もよいことを意味する。ここで、アミノ酸の欠失、置換
または付加は、周知の技術である部位特異的突然変異誘
発（例えば、サンブルックら, 前出, 15.1-15.113 頁を
参照のこと) により実施することができる。また、本発
明は、フラボノイドの３位にグルコースを転移する活性
を有する限りにおいて、実質的に配列番号１に示される
アミノ酸配列を含むタンパク質の断片も含む。さらに、
本発明は、上記のようなフラボノイド−３−グルコシル
転移酵素およびその断片と他のタンパク質との融合タン
パク質も包含する。他のタンパク質としては、β−ガラ
クトシダーゼ由来タンパク質、マルトース結合性タンパ
ク等を挙げることができる。上記の融合タンパク質は公
知の方法に従って生産することができる。例えば、本発
明のフラボノイド−３−グルコシル転移酵素遺伝子また
はその断片の読み枠を融合させる他のタンパク質のそれ
にあわせてから、他のタンパク質をコードする遺伝子に
結合することにより作製した融合遺伝子を宿主に導入
し、この宿主を適当な培地で培養すれば、他のタンパク
質に結合したフラボノイド−３−グルコシル転移酵素ま
たはその断片を発現させることができる。

【００１９】また、本発明のフラボノイド−３−グルコ
シル転移酵素遺伝子およびその断片は、実質的に配列番
号１に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコード
するＤＮＡであり、これには、自然界に存在するフラボ
ノイド配糖化酵素コードするＤＮＡ配列だけでなく、上
記のような変異配糖化酵素をコードするＤＮＡ配列をも
包含される。また、一般に、ＤＮＡ鎖があるアミノ酸配
列を持つポリペプチドをコードする場合、一つのアミノ
酸に対応する遺伝コード（コドン）が複数個存在する
（縮重異性体）。本発明のフラボノイド−３−グルコシ
ル転移酵素遺伝子およびその断片においても、任意の遺
伝コードを用いることができることは言うまでもない。
また、ＤＮＡ鎖またはその断片を発現させてそれがコー
ドするタンパク質もしくはポリペプチドを産生させるた
めには、そのアミノ酸配列に対応するＤＮＡ配列（コー
ディング領域）以外に、発現調節配列が必要である。従
って、本発明のフラボノイド−３−グルコシル転移酵素
遺伝子およびその断片は、このような発現調節配列を含
んでもよい。この発現調節領域の中で特に重要なのがコ
ーディング領域の上流のプロモーター配列、及び下流の
ポリＡ付加シグナルである。植物で発現させる場合のプ
ロモーター配列としては、カリフラワーモザイクウィル
ス３５Ｓプロモーター、ノパリン合成酵素プロモーター
などを使用することができ、ポリＡ付加シグナルとして
は、ノパリン合成酵素などを使用することができる。取
得したＤＮＡがゲノム遺伝子である場合には、ＤＮＡ配
列に発現調節領域が含まれていれば、それをそのまま用
いることもできる。本発明は、また、上述のフラボノイ
ド−３−グルコシル転移酵素遺伝子またはその断片を含
有する組換えベクターを包含する。この組換えベクター
は上述のフラボノイド−３−グルコシル転移酵素遺伝子
またはその断片をベクターに連結した物であり、ベクタ
ーとしては、ｐＢＩＮ１９、ｐＵＣ１９、λｇｔ１１な
どのプラスミド、ファージ等公知の物が使用できる。こ
の組換えベクターＤＮＡを、タバコ、ジャガイモ、イネ
などの適当な植物、あるいは微生物細胞に導入して発現
させる事により、宿主においてフラボノイド−３−グル
コシル転移酵素が産生される。

【００２０】

【発明の実施の形態】以下実施例を挙げて、本発明を更
に詳細に説明するが、本発明は、これらの実施例によっ
て限定されるものではない。また、色素の誘導関係の詳
細は、戸栗らPlant Molecular Biology 23, 933-946頁
(1993)及び特開平５−１８４３７０に記述してある。

【００２１】〔実施例１〕フラボノイド系色素の誘導 ナス種子（東北種苗社の品種 ’新佐土原茄子’）をバ
ーミキュライトに播種し２５℃の下、３００ルックスの
赤色光（赤色のアクリル板；メイバン社製、厚さ１mm）
を連続照射し２週間栽培した。次に、８０００ルックス
の白色の蛍光灯（東芝社、実生の位置で６Ｗ/ｍ2））お
よびＵＶ光（東芝社、ＦＬ−２０Ｓ Ｅ、ＦＬ−２０Ｓ
ＢＬＢ；０.５Ｗ/ｍ2）［この条件を本発明では白色
光と呼ぶ］を５日間照射した。植物体から、光源までの
距離は、１５から２５ｃｍであった。光質を変換したの
ち、アントシアン含量を測定するため、0.2 gの実生を
１％のメタノール塩酸で抽出し、５３０ｎｍの吸光度を
測定したところ、５日目の色素量を最大とした時２日目
で既に最大値の半分に達していた。また、並行してログ
マン［（J.Logemann) Analytical Biochemistry 163,1
6-20頁(1987)〕が記載した方法に従って、実生等の各部
分からｍＲＮＡ抽出を行い、ホルムアルデヒド入りの変
性下でのアガロース電気泳動後、Hybond N(Amersham社)
に業者の指示どうりに転写した。公知の配列であるペチ
ュニア花弁のＣＨＳおよびＤＦＲ、ならびにタバコの葉
のリブロース-1,5-2-リン酸カルボキシラーゼ（小サブ
ユニット）の全構造遺伝子を、それぞれ公知の塩基配列
を基にＤＮＡプライマーを合成し、業者の指示どうりに
ＰＣＲ法によりクローニングし、それをプローブとして
〔ファインバーグら（A. P. Feinberg）Analytical Bio
chemistry 132, 6-13頁(1983)および137, 266-267頁(19
83)〕、ナスのｍＲＮＡとハイブリダイズさせることに
より行うノーザン・ハイブリダイゼーションで観察し
た。ＣＨＳおよびＤＦＲは、白色光による誘導が顕著に
観察されたが、リブロース-1,5-2-リン酸カルボキシラ
ーゼでは誘導は２倍以下であった。

【００２２】〔実施例２〕フラボノイド系色素が濃縮さ
れたｃＤＮＡライブラリーの作製 ナス種子を、実施例１に従って赤色光のもとで２週間栽
培し、白色光による誘導を７２時間かけたものを材料と
して使用した。前記の方法に従ってｍＲＮＡを調整し、
Invirogen社のｃＤＮＡ合成キット（The Librarian II)
を用いて２本鎖ｃＤＮＡを得て、ラムダ・ザップII(Str
atagene社)のEcoRI/XhoIサイトに業者の説明書に従って
クローニングしｃＤＮＡライブラリーを作製した。 誘
導されたクローンの濃縮にあたっては、誘導をかけた組
織由来のｍＲＮＡから³²PでラベルしたｃＤＮＡプロー
ブを作り［20 uM dCTP,各200 uM のdGTP/dATP/dTTP, 20
mMDTT, 50mM Tris HCl(pH 7.5), 75mM KCl, 3mM MgCl,
100 ng ナス実生mRNA, 300 ug/ml oligo(dT)プライマ
ー, 300 uCi 32P-dCTP(Amarsham社, 3000Ci/mmol),及び
1 ul MMLV逆転写酵素（ＢＲＬ社、100U/ul); 37℃、１
時間反応］、このｃＤＮＡとあらかじめInvitrogen社の
勧めに従ってビオチン化した２０倍量の誘導前の組織由
来のｍＲＮＡを, ２０ ulの0.2％SDS, 50mM Hepes (pH
7.6), 0.5M NaCl, 2 mM EDTA, 50％(V/V)ホルムアミド
の液［(D.N.Crowell) Proceedings of National Academ
y of Science, 87, 8815-8819頁(1990)］中で４０℃、
４０時間ハイブリダイズさせた。反応終了後この液に８
０ulの50mM Hepes( pH7.6), 0.5MNaCl, 2 mM EDTA及び
10ug ストレプトアビジン（Vector社)の混合液を加え、
室温で１０分間反応後、１００ul のフェノール・クロ
ロホルム混液で抽出し上層を回収した。この液を、常法
に従って寒天培地上にはやしたファージ・ライブラリー
をＨｙｂｏｎｄ−Ｎに移したものをスクリーニングする
際のサブトラクトプローブとして使用し、陽性クローン
を選抜した。このプローブを用いるとディファレンシャ
ルスクリーニングより、はるかにシグナル／ノイズ比が
高くなることがわかった。

【００２３】〔実施例３〕フラボノイド配糖化酵素遺伝
子のクローニング、構造解析及びmRNAの発現パターンの
分析 上記実施例２の方法により３０, ０００クローンを繰り
返しスクリーニングすることにより７０クローンの誘導
性クローンから成るライブラリー・サブセットを得た。
これらをランダムに蛍光シーケンサー（アプライドバイ
オシステム社）にてシーケンスしたところ、トウモロコ
シの糖転移酵素等と有為な相同性を持つタンパク質をコ
ードしているクローンA４８があった（図２）。このク
ローンの全塩基配列は、適当な制限酵素で切断した後、
再結合することによる欠失処理により得た短いDNA断片
の構造を両側から読んだ情報を集約することによって決
定し、１５７８ｂｐからなるDNAであることを明らかに
した（配列番号２）。また、このcDNAはアミノ酸４３３
残基から成るタンパク質をコードしていることが明らか
になった（配列番号１）。本クローンをプローブとして
用いて、光誘導前後のナス胚軸由来のｍＲＮＡと、常法
に従いハイブリダイゼーションを行った結果、ナスの白
色光誘導をかけた組織で1.６kbの強いシグナルが観察さ
れた（図３）。同時にクローニングされた他の３種類の
遺伝子（A1, A54 およびCYP75)をプローブとして用いた
場合でも、同様に強いシグナルが観察された（図３）。
図３中、Ｒは赤色光下で２週間発芽させた実生から抽出
したｍＲＮＡを、Ｗはその後更に４８時間白色光で栽培
した実生から抽出したｍＲＮＡを示す。また、染色体DN
Aはムライの方法[Murray, Nucleic Acid Research 8, 4
321-4325頁 (1980)]に従って２０ｇの実生から調整し
た。得られたDNAから各１０μｇを制限酵素（宝酒造）B
am HI, Eco RV, Hind III （50 U、３７℃、１６時間）
で夫々切断した後、０、８％アガロースゲルで分離し
た。ゲルからDNAをナイロン膜（ハイボンドＮ+）に０、
４Ｍ NaOHで移した。A４８をプローブとするハイブリダ
イゼーションの結果を示す（図４）。なおここでは、洗
浄の条件を、２×ＳＳＣ（緩い条件、図４のａ）および
0.１×ＳＳＣ（厳しい条件、図４のｂ）の強弱２種類設
定した。図４中、レーン１、２および３は、それぞれ、
Hind III, Eco RVおよびBamHIで切断されたナスのゲノ
ムＤＮＡである。

【００２４】〔実施例４〕クローンの大腸菌での発現 上記クローンA４８はプラスミドBluescript SK(-)のポ
リリンカー部位に、5'側のEcoRI部位から3'側のXhoI部
位にかけてクローニングされているが、5'側のポリリン
カー中の SacIとEcoRIにより切断した後、Klenow酵素
（室温１０分； 1U）処理した後セルフライゲーション
をし、読み枠を上流にある大腸菌由来のβ−ガラクトシ
ダーゼにあわせた。これにより、β−ガラクトシダーゼ
由来の短いペプチド配列（２８残基）に結合したA４８
の配列が タンパク質に読まれることになる。

【００２５】そのようにして得られたプラスミドを大腸
菌ＪＭ１０９株に形質転換し、目的とするプラスミドの
塩基配列を確認した後、５ｍｌのＬＢ培地（５０ｍＭの
アンピシリンを含む）で６００ｎｍでの濁度が０、３に
なるまで培養した後（３７℃）、１ｍＭのイソプロピル
チオ−β−Ｄ−ガラクトシド(IPTG)でタンパク質の生産
を３時間誘導した。集菌後、菌体を100 mM Tris HCl(pH
8.0), 0.15 M NaCl,15 % Glycerolからなる液で懸濁
し、超音波処理（トミー精工、ハンディソニックUR-20
P：最大出力で３０秒を５回）し、１万×ｇで３０分遠
心分離して得た上清を酵素液とした。測定条件は、基質
として1.6 mM UDPglucose（糖の供与体; SIGMA社）及び
1 mM ケルセチン（糖の受容体；フナコシ社）を用い、
0.4M リン酸緩衝液に、大腸菌で発現させた酵素液を0.5
μl加え全量を３０μlとし、３０℃でｐＨ6.4 と7.4で
１０分間反応させた。反応生成物の分析はＴＬＣで行な
った。展開溶媒は１５％酢酸、水飽和フェノール、及び
蒸留水の３種類で行ない、標準品としてケルセチン−３
−O−グルコシド（イソケルシトリン)を用いた。その結
果、下記の表１に示すように、A４８に由来する酵素液
を含む反応液でイソケルシトリンと同一の移動度の生成
物が検出された。

【００２６】 表１．大腸菌での発現タンパク質のフラボノール糖転移活性測定（数字は相対移 動度を示す） １５％酢酸 水飽和フェノール 蒸留水 ケルセチン標準品 0 0.27 0 イソケルシトリン標準品 0.25 0.50 0.04 酵素 (+), pH6.4 0 ＆ 0.24 0.27 ＆ 0.50 0 ＆ 0.04 酵素 (-), pH6.4 0 0.27 0 酵素 (+), pH7.4 0 ＆ 0.24 0.27 ＆ 0.50 0 ＆ 0.04 酵素 (-), pH7.4 0 0.27 0

【００２７】またシアニジンを受容体とする反応は以下
のように行なった。0.2 M リン酸緩衝液、0.1 mM シア
ニジン、16 μM UDPglucose、酵素液５μlとし全量500
μlで30℃１０分間反応を行なった。反応生成物の分析
はＴＬＣで行い、展開溶媒としては、酢酸：塩酸：水＝
15：3：82、１％塩酸およびn-ブタノール：酢酸：水＝
4：1：5を用い、標準品として、シアニジン−３−グル
コシド(C-3-G)を用いた。その結果、下記の表２に示す
ように、A４８に由来する酵素液を含む反応液でシアニ
ジン−３−グルコシドと同一の移動度の生成物が検出さ
れた。

【００２８】 表２．大腸菌での発現タンパク質のアントシアン糖転移活性測定（数字は相対移 動度） 酢酸：塩酸：水 １％塩酸 n-ブタノール：酢酸：水 ＝15：3：82 ＝4：1：5 シアニジン 0.04 0 0.60 C-3-G 0.12 0.02 0.25 酵素液（＋） 0.12 0.02 0.25 酵素液（−） 0.04 0 0.60

【００２９】

【発明の効果】本発明により、植物の主要な色素である
フラボノイドの修飾酵素である、フラボノイド−３−グ
ルコシル転移酵素をコードするDNAが提供された。フラ
ボノールの配糖化はオーキシンの輸送活性を変え、花粉
管伸張を制御するので、この遺伝子を操作する事によっ
て、植物の自殖稔性を変える事ができ、植物の種子生産
上に大いに役立つ。また、アントシアニンを配糖化する
ことにより、有色色素が安定化される。

【００３０】

【配列表】 配列番号：１ 配列の長さ：４３３ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 起源 生物名：ナス(Solanum melongena) 株名：新砂土原茄子 配列 Met Thr Thr Ser Gln Leu His Ile Ala Phe Leu Ala Phe Pro Phe Gly Thr His 1 5 10 15 Ala Thr Pro Leu Leu Thr Leu Val Gln Lys Ile Ser Pro Phe Leu Pro Ser Ser 20 25 30 35 Thr Ile Phe Ser Phe Phe Asn Thr Ser Ser Ser Asn Ser Ser Ile Phe Ser Lys 40 45 50 Val Pro Asn Gln Glu Asn Ile Lys Ile Tyr Asn Val Trp Asp Gly Val Lys Glu 55 60 65 70 Gly Asn Asp Thr Pro Phe Gly Leu Glu Ala Ile Lys Leu Phe Ile Gln Ser Thr 75 80 85 90 Leu Leu Ile Ser Lys Ile Thr Glu Glu Ala Glu Glu Glu Thr Gly Val Lys Phe 95 100 105 Ser Cys Ile Phe Ser Asp Ala Phe Leu Trp Cys Phe Leu Val Lys Leu Pro Lys 110 115 120 125 Lys Met Asn Ala Pro Gly Val Ala Tyr Trp Thr Gly Gly Ser Cys Ser Leu Ala 130 135 140 Val His Leu Tyr Thr Asp Leu Ile Arg Ser Asn Lys Glu Thr Ser Leu Lys Ile 145 150 155 160 Pro Gly Phe Ser Ser Thr Leu Ser Ile Asn Asp Ile Pro Pro Glu Val Thr Ala 165 170 175 180 Glu Asp Leu Glu Gly Pro Met Ser Ser Met Leu Tyr Asn Met Ala Leu Asn Leu 185 190 195 His Lys Ala Asp Ala Val Val Leu Asn Ser Phe Gln Glu Leu Asp Arg Asp Pro 200 205 210 215 Leu Ile Asn Lys Asp Leu Gln Lys Asn Leu Gln Lys Val Phe Asn Ile Gly Pro 220 225 230 Leu Val Leu Gln Ser Ser Arg Lys Leu Asp Glu Ser Gly Cys Ile Gln Trp Leu 235 240 245 250 Asp Lys Gln Lys Glu Lys Ser Val Val Tyr Leu Ser Phe Gly Thr Val Thr Thr 255 260 265 270 Leu Pro Pro Asn Glu Ile Gly Ser Ile Ala Glu Ala Leu Glu Thr Lys Lys Thr 275 280 285 Pro Phe Ile Trp Ser Leu Arg Asn Asn Gly Val Lys Asn Leu Pro Lys Gly Phe 290 295 300 305 Leu Glu Arg Thr Lys Glu Phe Gly Lys Ile Val Ser Trp Ala Pro Gln Leu Glu 310 315 320 Ile Leu Ala His Lys Ser Val Gly Val Phe Val Thr His Cys Gly Trp Asn Ser 325 330 335 340 Ile Leu Glu Gly Ile Ser Phe Gly Val Pro Met Ile Cys Arg Pro Phe Phe Gly 345 350 355 360 Asp Gln Lys Leu Asn Ser Arg Met Val Glu Ser Val Trp Glu Ile Gly Leu Gln 365 370 375 Ile Glu Gly Gly Ile Phe Thr Lys Ser Gly Ile Ile Ser Ala Leu Asp Thr Phe 380 385 390 395 Phe Asn Glu Glu Lys Gly Lys Ile Leu Arg Glu Asn Val Glu Gly Leu Lys Glu 400 405 410 Lys Ala Leu Glu Ala Val Asn Gln Met Met Glu Val Gln Gln Lys Ile Ser Arg 415 420 425 430 Phe 433

【００３１】配列番号：２ 配列の長さ：１５７８ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 起源 生物名：ナス (Solanum melongena) 株名：新砂土原茄子 配列の特徴 特徴を表す記号：CDS 存在位置：13..1311 特徴を決定した方法：P 配列 AGAAGAAGAA GAATGACTAC TTCTCAACTT CATATTGCAT TTCTTGCTTT CCCTTTTGGA 60 ACCCATGCAA CTCCTCTACT CACACTTGTC CAAAAAATCT CACCATTTTT ACCCTCAAGC 120 ACAATTTTTT CCTTCTTCAA CACATCAAGT TCCAACTCCT CAATTTTCTC AAAAGTTCCA 180 AATCAAGAAA ACATCAAGAT TTACAATGTT TGGGATGGTG TCAAAGAAGG CAATGACACC 240 CCTTTTGGTC TTGAAGCCAT TAAACTCTTT ATACAATCAA CGCTACTAAT TTCGAAAATC 300 ACTGAAGAGG CAGAGGAGGA AACAGGGGTG AAATTTTCTT GCATTTTTAG TGATGCTTTT 360 TTATGGTGTT TCTTGGTGAA ATTGCCTAAG AAAATGAATG CCCCGGGGGT TGCTTACTGG 420 ACTGGTGGTT CTTGTTCATT GGCTGTCCAT TTATACACCG ATTTAATTCG ATCTAATAAG 480 GAAACATCGT TGAAAATCCC CGGATTTTCA TCGACTTTGA GTATTAATGA CATTCCACCT 540 GAAGTTACAG CAGAGGATTT AGAGGGGCCA ATGTCATCTA TGCTATACAA CATGGCATTA 600 AATTTGCACA AAGCTGATGC TGTTGTATTG AATTCTTTTC AGGAATTGGA TCGGGATCCA 660 TTAATCAACA AGGACCTCCA AAAAAACCTC CAAAAGGTAT TCAACATTGG CCCTTTAGTA 720 CTCCAATCAT CGAGGAAATT AGATGAAAGT GGATGCATCC AATGGCTTGA CAAACAAAAG 780 GAAAAATCAG TTGTGTATCT TAGTTTTGGC ACTGTAACAA CATTACCCCC TAACGAAATT 840 GGGTCGATAG CAGAAGCCTT AGAAACTAAA AAAACGCCTT TTATTTGGTC ATTAAGAAAT 900 AATGGTGTCA AGAATTTGCC TAAAGGATTT CTTGAAAGAA CAAAGGAGTT TGGGAAAATA 960 GTTTCTTGGG CACCCCAATT GGAAATCTTG GCACATAAGT CTGTTGGTGT TTTCGTAACG 1020 CATTGCGGAT GGAATTCGAT TTTGGAAGGC ATTTCATTTG GTGTGCCTAT GATATGTAGG 1080 CCTTTTTTTG GTGACCAAAA ATTGAATAGT AGAATGGTGG AAAGTGTTTG GGAAATTGGT 1140 TTGCAAATTG AAGGTGGGAT TTTTACTAAA AGTGGAATAA TTAGTGCTTT GGATACTTTC 1200 TTCAATGAGG AAAAAGGGAA GATATTAAGG GAAAATGTTG AAGGGCTAAA AGAAAAAGCA 1260 TTAGAAGCTG TGAACCAGAT GATGGAAGTT CAACAGAAAA TTTCAAGGTT CTAGTTGAGC 1320 TAGTTAAATG TCACAAGTCA ACTTAATATG TTATAATTGC ACCGGGTGAC TTTGCATCTA 1380 TGGTACAATA TATCTTTGTG ATCGGTTCTT TTCTCGAATT TGCGATTTGC AGGCTTTAGC 1440 ATATTATAAT TGCTATGGGC GACTTTGTGT ATTTTTAGCT GAAACTTTGC TCGAGTGTAT 1500 TGTAAATAAA TCCTCCTTGT ACTATTTTTT ACTGCAATTT ATTTGACCTA CTTTCTTTTT 1560 AAAAAAAAAA AAAAAAAA 1578

【図面の簡単な説明】

【図１】ケルセチンからケルセチン３−O−グルコシド
（イソケルシトリン）への配糖化反応図である。

【図２】クローンA４８のコードするアミノ酸配列とト
ウモロコシ及びキンギョソウのフラボノイド−３−糖転
移酵素のアミノ酸配列の一致性を示す。

【図３】A４８をプローブとして、光誘導前後のナス胚
軸由来のｍＲＮＡをハイブリダイゼーションにかけた結
果を示す電気泳動写真である。Rは赤色光下で２週間発
芽させた実生、Wはその後、更に４８時間白色光下で育
てた実生から、夫々抽出したｍＲＮＡを示す。

【図４】A４８をプローブとするナスのゲノムDNAに対す
るサザンハイブリダイゼーション分析の結果を示す電気
泳動写真である。洗浄条件は、2×SSC（緩い条件、ａ）
と 0.1×SSC（厳しい条件、ｂ）の２種類設定し、制限
酵素としては、レーン１から３で、夫々、Hind III, Ec
o RV, BamHIを用いた。

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】フラボノイドの３位にグルコースを転移す
   る活性を有するタンパク質であって、実質的に配列番号
   １に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードし
   ているＤＮＡまたはその断片。
2. 【請求項２】フラボノイドの３位にグルコースを転移す
   る活性を有するタンパク質をコードしているＤＮＡが、
   配列番号２の塩基配列を含むものである請求項１記載の
   ＤＮＡまたはその断片。
3. 【請求項３】請求項１記載のＤＮＡまたはその断片を含
   む組換えベクター。
4. 【請求項４】フラボノイドの３位にグルコースを転移す
   る活性を有するタンパク質であって、実質的に配列番号
   １に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質またはその
   断片。
5. 【請求項５】請求項４記載のタンパク質またはその断片
   を含む融合タンパク質。
6. 【請求項６】フラボノイドの合成を誘導した植物からｍ
   ＲＮＡを分離し、該ｍＲＮＡからｃＤＮＡライブラリー
   を作製し、該ｃＤＮＡライブラリーから、フラボノイド
   の合成を誘導しなかった植物に由来するＤＮＡまたはそ
   の断片と反応するクローンを除くことにより、フラボノ
   イドの３位にグルコースを転移する活性を有するタンパ
   ク質をコードしているｃＤＮＡを選択することを含む、
   フラボノイドの３位にグルコースを転移する活性を有す
   るタンパク質をコードしているＤＮＡの製法。