JPH0959294A - 蛍光標識オリゴヌクレオチド - Google Patents
蛍光標識オリゴヌクレオチドInfo
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- JPH0959294A JPH0959294A JP23618395A JP23618395A JPH0959294A JP H0959294 A JPH0959294 A JP H0959294A JP 23618395 A JP23618395 A JP 23618395A JP 23618395 A JP23618395 A JP 23618395A JP H0959294 A JPH0959294 A JP H0959294A
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Abstract
(57)【要約】
【解決手段】酸アミド結合によって５’端に蛍光物質を
導入した１０〜４０塩基からなる蛍光標識オリゴヌクレ
オチド、並びに該蛍光標識オリゴヌクレオチドを用い
る、遺伝子のシーケンシング法。 【効果】本発明により、チェインターミネーター法によ
る遺伝子シーケンシングのためのプライマーとして使用
できる蛍光標識オリゴヌクレオチドが提供され、さらに
この蛍光標識オリゴヌクレオチドを使用することにより
蛍光標識オリゴヌクレオチドの近傍からの塩基の読み取
りが可能となる。
導入した１０〜４０塩基からなる蛍光標識オリゴヌクレ
オチド、並びに該蛍光標識オリゴヌクレオチドを用い
る、遺伝子のシーケンシング法。 【効果】本発明により、チェインターミネーター法によ
る遺伝子シーケンシングのためのプライマーとして使用
できる蛍光標識オリゴヌクレオチドが提供され、さらに
この蛍光標識オリゴヌクレオチドを使用することにより
蛍光標識オリゴヌクレオチドの近傍からの塩基の読み取
りが可能となる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、蛍光標識オリゴヌ
クレオチドに関する。さらにこの蛍光標識オリゴヌクレ
オチドを用いる遺伝子のシーケンシングに関する。この
遺伝子のシーケンシング法はＤＮＡやＲＮＡの検出に有
用である。
クレオチドに関する。さらにこの蛍光標識オリゴヌクレ
オチドを用いる遺伝子のシーケンシングに関する。この
遺伝子のシーケンシング法はＤＮＡやＲＮＡの検出に有
用である。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】従来
は、オリゴヌクレオチドの５’端にアミノ基を導入し、
フルオレセインイソチオシアネート塩（ＦＩＴＣ）と反
応させることにより、オリゴヌクレオチドの５’端を蛍
光標識している。上記のように合成したフルオレセイン
イソチオシアネート標識オリゴヌクレオチドを遺伝子シ
ーケンシングに用いた場合は、反応により生成した二本
鎖を分離するためのホルムアミド処理により、フルオレ
セインとオリゴヌクレオチドの結合が切断され、遊離の
フルオレセインが生ずる。このため、シーケンシング反
応後の電気泳動において、未反応のフルオレセインイソ
チオシアネート標識オリゴヌクレオチド近辺に遊離フル
オレセインの大きなバンドが生じることになり、フルオ
レセインイソチオシアネート標識オリゴヌクレオチドの
近傍の約３０塩基弱の読みとりが困難となる。そこで、
本発明の目的はホルムアミド熱変性のような厳しい条件
下でも、蛍光物質を遊離させない安定な蛍光標識オリゴ
ヌクレオチドを提供することにある。本発明の第２の目
的はかかる蛍光標識オリゴヌクレオチドを用いた遺伝子
のシーケンシング法を提供することにある。
は、オリゴヌクレオチドの５’端にアミノ基を導入し、
フルオレセインイソチオシアネート塩（ＦＩＴＣ）と反
応させることにより、オリゴヌクレオチドの５’端を蛍
光標識している。上記のように合成したフルオレセイン
イソチオシアネート標識オリゴヌクレオチドを遺伝子シ
ーケンシングに用いた場合は、反応により生成した二本
鎖を分離するためのホルムアミド処理により、フルオレ
セインとオリゴヌクレオチドの結合が切断され、遊離の
フルオレセインが生ずる。このため、シーケンシング反
応後の電気泳動において、未反応のフルオレセインイソ
チオシアネート標識オリゴヌクレオチド近辺に遊離フル
オレセインの大きなバンドが生じることになり、フルオ
レセインイソチオシアネート標識オリゴヌクレオチドの
近傍の約３０塩基弱の読みとりが困難となる。そこで、
本発明の目的はホルムアミド熱変性のような厳しい条件
下でも、蛍光物質を遊離させない安定な蛍光標識オリゴ
ヌクレオチドを提供することにある。本発明の第２の目
的はかかる蛍光標識オリゴヌクレオチドを用いた遺伝子
のシーケンシング法を提供することにある。
【０００３】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記の状
況に鑑み、ホルムアミド熱変性のような厳しい条件下で
も蛍光物質を遊離しない蛍光標識オリゴヌクレオチドを
開発すべく種々検討を行ったところ、蛍光物質の反応性
エステルとオリゴヌクレオチドのアミノ基とを反応させ
ることにより形成される酸アミド結合が、ホルムアミド
熱変性のような厳しい条件下でも安定であり、得られる
蛍光標識オリゴヌクレオチドは遺伝子シーケンシングに
極めて有用であることを見いだした。本発明はかかる知
見に基づきさらに研究を進めて完成するに至ったもので
ある。
況に鑑み、ホルムアミド熱変性のような厳しい条件下で
も蛍光物質を遊離しない蛍光標識オリゴヌクレオチドを
開発すべく種々検討を行ったところ、蛍光物質の反応性
エステルとオリゴヌクレオチドのアミノ基とを反応させ
ることにより形成される酸アミド結合が、ホルムアミド
熱変性のような厳しい条件下でも安定であり、得られる
蛍光標識オリゴヌクレオチドは遺伝子シーケンシングに
極めて有用であることを見いだした。本発明はかかる知
見に基づきさらに研究を進めて完成するに至ったもので
ある。
【０００４】即ち、本発明の要旨は（１） 酸アミド結
合によって５’端に蛍光物質を導入した１０〜４０塩基
からなる蛍光標識オリゴヌクレオチド、（２） オリゴ
ヌクレオチドが、Ｍ１３ＤＮＡベクターのＤＮＡ導入部
位の近傍の配列に相補的な配列を有するものである蛍光
標識オリゴヌクレオチド、（３） 酸アミド結合が蛍光
物質のカルボキシル基のエステルとオリゴヌクレオチド
のアミノ基との反応により形成されるものである上記
（１）または（２）記載の蛍光標識オリゴヌクレオチ
ド、（４） エステルがスクシンイミジルエステルであ
る上記（３）記載の蛍光標識オリゴヌクレオチド、
（５） 蛍光物質が５−カルボキシフルオレセインまた
は６−カルボキシフルオレセインである上記（１）〜
（４）いずれかに記載の蛍光標識オリゴヌクレオチド、
並びに（６） 上記（１）〜（５）いずれかに記載の蛍
光標識オリゴヌクレオチドを用いる遺伝子のシーケンシ
ング法、に関する。
合によって５’端に蛍光物質を導入した１０〜４０塩基
からなる蛍光標識オリゴヌクレオチド、（２） オリゴ
ヌクレオチドが、Ｍ１３ＤＮＡベクターのＤＮＡ導入部
位の近傍の配列に相補的な配列を有するものである蛍光
標識オリゴヌクレオチド、（３） 酸アミド結合が蛍光
物質のカルボキシル基のエステルとオリゴヌクレオチド
のアミノ基との反応により形成されるものである上記
（１）または（２）記載の蛍光標識オリゴヌクレオチ
ド、（４） エステルがスクシンイミジルエステルであ
る上記（３）記載の蛍光標識オリゴヌクレオチド、
（５） 蛍光物質が５−カルボキシフルオレセインまた
は６−カルボキシフルオレセインである上記（１）〜
（４）いずれかに記載の蛍光標識オリゴヌクレオチド、
並びに（６） 上記（１）〜（５）いずれかに記載の蛍
光標識オリゴヌクレオチドを用いる遺伝子のシーケンシ
ング法、に関する。
【０００５】
【発明の実施の形態】以下に本発明を詳細に説明する。
本発明の蛍光標識オリゴヌクレトチドは、１０〜４０塩
基、好ましくは１５〜２５塩基からなるオリゴヌクレオ
チドの５’末端にアミノ基を導入したものが出発原料と
して用いられる。
本発明の蛍光標識オリゴヌクレトチドは、１０〜４０塩
基、好ましくは１５〜２５塩基からなるオリゴヌクレオ
チドの５’末端にアミノ基を導入したものが出発原料と
して用いられる。
【０００６】１０〜４０塩基からなるオリゴヌクレオチ
ドとしては、例えば、チェインターミネーター法による
遺伝子シーケンシングにおいて用いられるプライマーと
しての、あるいはポリマーチェインリアクション（ＰＣ
Ｒ）において用いられるターゲット遺伝子のプライマー
としての塩基配列を有するものが本発明において特に好
ましく用いられる。従って、遺伝子シーケンシングにお
いては、通常Ｍ１３ＤＮＡベクターのＤＮＡ導入部位の
近傍の配列に相補的な配列を有するものが選択され、Ｐ
ＣＲ法においては標的遺伝子と相補的な１０〜４０塩基
の配列が選択される。
ドとしては、例えば、チェインターミネーター法による
遺伝子シーケンシングにおいて用いられるプライマーと
しての、あるいはポリマーチェインリアクション（ＰＣ
Ｒ）において用いられるターゲット遺伝子のプライマー
としての塩基配列を有するものが本発明において特に好
ましく用いられる。従って、遺伝子シーケンシングにお
いては、通常Ｍ１３ＤＮＡベクターのＤＮＡ導入部位の
近傍の配列に相補的な配列を有するものが選択され、Ｐ
ＣＲ法においては標的遺伝子と相補的な１０〜４０塩基
の配列が選択される。
【０００７】かかるアミノ化オリゴヌクレオチドの化学
合成は、常法により行うことができる。例えば、サイク
ロンプラスＤＮＡ合成装置（ミリジェン／バイオリサー
チ社製）を用い、β−シアノエチルフォスホルアミダイ
ト法（Nucleic Acids Res.,12, 4539-4557 (1984)、Ｕ
ＳＰ４４２５６７７）により合成することができる。合
成したオリゴヌクレオチドの精製は、Ｃ１８逆相カラム
を用いた高速液体クロマトグラフィーで行うことができ
る。
合成は、常法により行うことができる。例えば、サイク
ロンプラスＤＮＡ合成装置（ミリジェン／バイオリサー
チ社製）を用い、β−シアノエチルフォスホルアミダイ
ト法（Nucleic Acids Res.,12, 4539-4557 (1984)、Ｕ
ＳＰ４４２５６７７）により合成することができる。合
成したオリゴヌクレオチドの精製は、Ｃ１８逆相カラム
を用いた高速液体クロマトグラフィーで行うことができ
る。
【０００８】本発明に用いられる蛍光物質としては、特
に限定されるものではないが、エオシン、フルオレセイ
ン、ロダミンＢ等のカルボキシル基を有する蛍光物質が
好ましい。
に限定されるものではないが、エオシン、フルオレセイ
ン、ロダミンＢ等のカルボキシル基を有する蛍光物質が
好ましい。
【０００９】本発明に用いられる蛍光物質のエステルと
しては、反応性の高いものが好ましいが、さらに、１分
子内に２個のカルボキシル基を有するフルオレセインの
場合は５位または６位のカルボキシル基のみがエステル
を形成しうるように、バルキーなアルコール類とのエス
テルを選択することが好ましい。例えば、５−カルボキ
シフルオレセイン スクシンイミジルエステル、６−カ
ルボキシフルオレセイン スクシンイミジルエステル、
エオシンスクシンイミジルエステル、ロダミンＢ スク
シンイミジルエステル、５−カルボキシフルオレセイン
インダニルエステル、 ６−カルボキシフルオレセイ
ン インダニルエステル、エオシン インダニルエステ
ル、ロダミンＢ インダニルエステル、５−カルボキシ
フルオレセイン インデニルエステル、 ６−カルボキ
シフルオレセイン インデニルエステル、エオシン イ
ンデニルエステル、ロダミンＢ インデニルエステル等
が挙げられる。
しては、反応性の高いものが好ましいが、さらに、１分
子内に２個のカルボキシル基を有するフルオレセインの
場合は５位または６位のカルボキシル基のみがエステル
を形成しうるように、バルキーなアルコール類とのエス
テルを選択することが好ましい。例えば、５−カルボキ
シフルオレセイン スクシンイミジルエステル、６−カ
ルボキシフルオレセイン スクシンイミジルエステル、
エオシンスクシンイミジルエステル、ロダミンＢ スク
シンイミジルエステル、５−カルボキシフルオレセイン
インダニルエステル、 ６−カルボキシフルオレセイ
ン インダニルエステル、エオシン インダニルエステ
ル、ロダミンＢ インダニルエステル、５−カルボキシ
フルオレセイン インデニルエステル、 ６−カルボキ
シフルオレセイン インデニルエステル、エオシン イ
ンデニルエステル、ロダミンＢ インデニルエステル等
が挙げられる。
【００１０】蛍光物質のエステルとアミノ化オリゴヌク
レオチドとの反応による酸アミド結合の形成は、通常、
弱アルカリ性緩衝液の条件下、室温付近で行うことがで
きる。蛍光物質のエステルが水に難溶の場合は、ジメチ
ルホルムアミド、テトラヒドロフラン、ジメチルスルホ
キシド等に溶解して反応液に添加してもよい。反応精製
物の精製は、常法により、ゲル濾過ついで高速液体クロ
マトグラフィーで行うことができる。
レオチドとの反応による酸アミド結合の形成は、通常、
弱アルカリ性緩衝液の条件下、室温付近で行うことがで
きる。蛍光物質のエステルが水に難溶の場合は、ジメチ
ルホルムアミド、テトラヒドロフラン、ジメチルスルホ
キシド等に溶解して反応液に添加してもよい。反応精製
物の精製は、常法により、ゲル濾過ついで高速液体クロ
マトグラフィーで行うことができる。
【００１１】こうして得られる本発明の蛍光標識オリゴ
ヌクレオチドは、チェインターミネーター法による遺伝
子シーケンシングのためのプライマーとして使用する
と、合成された二本鎖ＤＮＡを変性させるためのホルム
アミド熱処理にも安定である為、シーケンシング反応後
の電気泳動図の読みとりにおいて、遊離のフルオレセイ
ンによる妨害を受けず、蛍光標識オリゴヌクレオチド近
傍の読みとりも可能となる。従って、本発明の蛍光標識
オリゴヌクレオチドを用いる遺伝子シーケンシング法
は、従来から使用されているフルオレセインイソチオシ
アネート標識オリゴヌクレオチドを用いる方法に比べ
て、極めて優れているということができる。
ヌクレオチドは、チェインターミネーター法による遺伝
子シーケンシングのためのプライマーとして使用する
と、合成された二本鎖ＤＮＡを変性させるためのホルム
アミド熱処理にも安定である為、シーケンシング反応後
の電気泳動図の読みとりにおいて、遊離のフルオレセイ
ンによる妨害を受けず、蛍光標識オリゴヌクレオチド近
傍の読みとりも可能となる。従って、本発明の蛍光標識
オリゴヌクレオチドを用いる遺伝子シーケンシング法
は、従来から使用されているフルオレセインイソチオシ
アネート標識オリゴヌクレオチドを用いる方法に比べ
て、極めて優れているということができる。
【００１２】
【実施例】以下、実施例により本発明をさらに詳しく説
明するが、本発明はこれらの実施例によりなんら限定さ
れるものではない。
明するが、本発明はこれらの実施例によりなんら限定さ
れるものではない。
【００１３】実施例１ （１）アミノ化オリゴヌクレオチドの合成 大腸菌Ｍ１３ｍｐ系ベクターの塩基配列より、配列番
号：１に示される配列を選択し、それと相補的な配列を
もち５’端にアミノ基を導入したオリゴヌクレオチド
（配列番号：２）を化学合成した。合成は、サイクロン
プラスＤＮＡ合成装置（ミリジェン／バイオリサーチ社
製）を用い、β−シアノエチルフォスホルアミダイト法
により行った。即ち、第一の保護ヌクレオシド（５’−
ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）−Ｎ4 −ベンゾイル−ｄ
シチジン）で誘導体化された固体支持体を反応カラムに
入れ、このカラム中に試薬と溶媒とをポンプで注入・通
過せしめ、保護ヌクレオチドモノマー（ホスホルアミダ
イト）を常法により逐次付加させた（ＵＳＰ４４２５６
７７）。使用したホスホルアミダイトは、５’−ＤＭＴ
−ｄシチジン（Ｎ4 −ベンゾイル）−β−シアノエチル
ホスホルアミダイト、５’−ＤＭＴ−ｄアデノシン（Ｎ
6 −ベンゾイル）−β−シアノエチルホスホルアミダイ
ト、５’−ＤＭＴ−ｄグアノシン（Ｎ2 −イソブチリ
ル）−β−シアノエチルホスホルアミダイト、および
５’−ＤＭＴ−ｄチミジン−β−シアノエチルホスホル
アミダイト、並びに５’−末端のヌクレオチドとして
５’−アミノｄシチジン（Ｎ4 −ベンゾイル）−β−シ
アノエチルホスホルアミダイトであった。使用量は各サ
イクルについて１０ｍｇであった。
号：１に示される配列を選択し、それと相補的な配列を
もち５’端にアミノ基を導入したオリゴヌクレオチド
（配列番号：２）を化学合成した。合成は、サイクロン
プラスＤＮＡ合成装置（ミリジェン／バイオリサーチ社
製）を用い、β−シアノエチルフォスホルアミダイト法
により行った。即ち、第一の保護ヌクレオシド（５’−
ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）−Ｎ4 −ベンゾイル−ｄ
シチジン）で誘導体化された固体支持体を反応カラムに
入れ、このカラム中に試薬と溶媒とをポンプで注入・通
過せしめ、保護ヌクレオチドモノマー（ホスホルアミダ
イト）を常法により逐次付加させた（ＵＳＰ４４２５６
７７）。使用したホスホルアミダイトは、５’−ＤＭＴ
−ｄシチジン（Ｎ4 −ベンゾイル）−β−シアノエチル
ホスホルアミダイト、５’−ＤＭＴ−ｄアデノシン（Ｎ
6 −ベンゾイル）−β−シアノエチルホスホルアミダイ
ト、５’−ＤＭＴ−ｄグアノシン（Ｎ2 −イソブチリ
ル）−β−シアノエチルホスホルアミダイト、および
５’−ＤＭＴ−ｄチミジン−β−シアノエチルホスホル
アミダイト、並びに５’−末端のヌクレオチドとして
５’−アミノｄシチジン（Ｎ4 −ベンゾイル）−β−シ
アノエチルホスホルアミダイトであった。使用量は各サ
イクルについて１０ｍｇであった。
【００１４】先ず、第一のヌクレオシドの３’−水酸基
を炭化水素スペーサーを介してＣＰＧ（Controlled por
e glass ）支持体に共有結合させた。支持体に結合した
ヌクレオシドの５’−水酸基をジクロロ酢酸でデトリチ
レートした後、乾燥アセトニトリルに溶解した第２の保
護ホスホルアミダイトを反応カラムに導入した。ジイソ
プロピルアミン基が脱離し易くなるように、カラム導入
直前に弱酸であるテトラゾールを用いてホスホルアミダ
イトを活性化した。添加したモノマーはホスファィトト
リエステル結合により結合する。リン結合を安定化する
ためにヨード溶液を添加して５価に酸化した。未反応の
５’−水酸基を反応系外に除去するためアセチルキャッ
ピング処理をした後、鎖延長が完結するまでサイクルを
繰り返した。最後に５’−アミノｄシチジン（Ｎ4 −ベ
ンゾイル）−β−シアノエチルホスホルアミダイトを結
合させた。反応はすべて室温で行った。
を炭化水素スペーサーを介してＣＰＧ（Controlled por
e glass ）支持体に共有結合させた。支持体に結合した
ヌクレオシドの５’−水酸基をジクロロ酢酸でデトリチ
レートした後、乾燥アセトニトリルに溶解した第２の保
護ホスホルアミダイトを反応カラムに導入した。ジイソ
プロピルアミン基が脱離し易くなるように、カラム導入
直前に弱酸であるテトラゾールを用いてホスホルアミダ
イトを活性化した。添加したモノマーはホスファィトト
リエステル結合により結合する。リン結合を安定化する
ためにヨード溶液を添加して５価に酸化した。未反応の
５’−水酸基を反応系外に除去するためアセチルキャッ
ピング処理をした後、鎖延長が完結するまでサイクルを
繰り返した。最後に５’−アミノｄシチジン（Ｎ4 −ベ
ンゾイル）−β−シアノエチルホスホルアミダイトを結
合させた。反応はすべて室温で行った。
【００１５】各サイクルは、上記のようにデトリチレー
ション、活性化、カップリング、酸化、およびキャッピ
ングの工程からなる。過剰の試薬および反応副生物を除
去するため、これら工程の間に洗浄工程を置いた。鎖延
長が完了した後に、合成したオリゴマーを支持体から除
去し、完全に脱保護するため２５％アンモニア水を用い
室温において２４時間処理した。得られたオリゴヌクレ
オチドは、Ｃ１８逆相カラムを用いた高速液体クロマト
グラフィーで精製した。高速液体クロマトグラフィーの
条件は下記のとおりであった。 ＨＰＬＣの条件 装置：島津ＬＣ−６Ａ カラム：Cosmosil C18 サイズ：４．６×１５０ｍｍ 流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ 溶離液Ａ：５％ＣＨ3 ＣＮ，１００ｍＭ酢酸トリエチル
アンモニウム（ｐＨ７．０） 溶離液Ｂ：５０％ＣＨ3 ＣＮ，１００ｍＭ酢酸トリエチ
ルアンモニウム（ｐＨ７．０） グラジエント：Ａ→Ｂ２０分（リニアグラジエント） 検出：２５４ｎｍ こうして配列番号：２に示すオリゴペプチド８０ｎｍｏ
ｌを得た。
ション、活性化、カップリング、酸化、およびキャッピ
ングの工程からなる。過剰の試薬および反応副生物を除
去するため、これら工程の間に洗浄工程を置いた。鎖延
長が完了した後に、合成したオリゴマーを支持体から除
去し、完全に脱保護するため２５％アンモニア水を用い
室温において２４時間処理した。得られたオリゴヌクレ
オチドは、Ｃ１８逆相カラムを用いた高速液体クロマト
グラフィーで精製した。高速液体クロマトグラフィーの
条件は下記のとおりであった。 ＨＰＬＣの条件 装置：島津ＬＣ−６Ａ カラム：Cosmosil C18 サイズ：４．６×１５０ｍｍ 流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ 溶離液Ａ：５％ＣＨ3 ＣＮ，１００ｍＭ酢酸トリエチル
アンモニウム（ｐＨ７．０） 溶離液Ｂ：５０％ＣＨ3 ＣＮ，１００ｍＭ酢酸トリエチ
ルアンモニウム（ｐＨ７．０） グラジエント：Ａ→Ｂ２０分（リニアグラジエント） 検出：２５４ｎｍ こうして配列番号：２に示すオリゴペプチド８０ｎｍｏ
ｌを得た。
【００１６】（２）オリゴヌクレオチドの蛍光標識 アミノ化オリゴヌクレオチド４ｎｍｏｌを９３μｌの炭
酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．０）に溶解した。一方、
５−カルボキシフルオレセインスクシンイミドエステル
（モレキュラプローブ社製）１ｍｇを７μｌのジメチル
ホルムアミドに予め溶解しておき、この溶液を上記のオ
リゴヌクレオチド溶液に添加し、攪拌したのち２５℃で
一晩反応させた。ついでＰＤ−１０カラム（ファルマシ
ア社製）によるゲル濾過を行ったのち、前記と同様にＣ
１８逆相カラムを用いた高速液体クロマトグラフィーに
より、得られた蛍光標識オリゴヌクレオチドの精製を行
った。得られた本発明の蛍光標識オリゴヌクレオチドの
物性は以下のとおりであった。Ｅｘ＝４９５ｎｍ、Ｅｎ
＝５１５ｎｍ。
酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．０）に溶解した。一方、
５−カルボキシフルオレセインスクシンイミドエステル
（モレキュラプローブ社製）１ｍｇを７μｌのジメチル
ホルムアミドに予め溶解しておき、この溶液を上記のオ
リゴヌクレオチド溶液に添加し、攪拌したのち２５℃で
一晩反応させた。ついでＰＤ−１０カラム（ファルマシ
ア社製）によるゲル濾過を行ったのち、前記と同様にＣ
１８逆相カラムを用いた高速液体クロマトグラフィーに
より、得られた蛍光標識オリゴヌクレオチドの精製を行
った。得られた本発明の蛍光標識オリゴヌクレオチドの
物性は以下のとおりであった。Ｅｘ＝４９５ｎｍ、Ｅｎ
＝５１５ｎｍ。
【００１７】実施例２ 蛍光標識オリゴヌクレオチドを用いたシーケンシング テンプレートとしてＭ１３ｍｐ１８の１ｐｍｏｌ、２μ
ｌの蛍光標識オリゴヌクレオチド（１ｐｍｏｌ／μ
ｌ）、２μｌの１０×反応バッファー（１００ｍＭのＭ
ｇＣｌ2 を含む１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．
６））および滅菌水からなる１４μｌの反応液を調製し
た。まず、６５℃で５分間、３７℃で２０分間、室温で
１０分間のアニーリング処理を行った後、この反応液に
ジチオスレイトール溶液（３２４ｍＭのジチオスレイト
ールおよび４０ｍＭのＭｎＣｌ2 を含む３０４ｍＭのク
エン酸緩衝液（ｐＨ７．５））１μｌ、ジメチルスルホ
キシド３μｌとＴ−７ポリメラーゼ（ファルマシア社
製）を４ユニット加え、全量を２０μｌとし、そのうち
４．５μｌずつを４本の容器に分注した。各容器には基
質溶液（４種のデオキシヌクレオチド２．５ｎｍｏｌお
よび１種のジデオキシヌクレオチド１２．５ｐｍｏｌを
含む）２．５μｌを予め加えておいた。
ｌの蛍光標識オリゴヌクレオチド（１ｐｍｏｌ／μ
ｌ）、２μｌの１０×反応バッファー（１００ｍＭのＭ
ｇＣｌ2 を含む１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．
６））および滅菌水からなる１４μｌの反応液を調製し
た。まず、６５℃で５分間、３７℃で２０分間、室温で
１０分間のアニーリング処理を行った後、この反応液に
ジチオスレイトール溶液（３２４ｍＭのジチオスレイト
ールおよび４０ｍＭのＭｎＣｌ2 を含む３０４ｍＭのク
エン酸緩衝液（ｐＨ７．５））１μｌ、ジメチルスルホ
キシド３μｌとＴ−７ポリメラーゼ（ファルマシア社
製）を４ユニット加え、全量を２０μｌとし、そのうち
４．５μｌずつを４本の容器に分注した。各容器には基
質溶液（４種のデオキシヌクレオチド２．５ｎｍｏｌお
よび１種のジデオキシヌクレオチド１２．５ｐｍｏｌを
含む）２．５μｌを予め加えておいた。
【００１８】ついで３７℃で１０分間シーケンシング反
応を行った。反応の停止には、４．０μｌの９５％ホル
ムアミド水溶液を添加した。シーケンシング反応により
得られた反応物を９５℃で３分間熱変性させ、ついで、
ＤＮＡシーケンサーＤＳＱ−１０００（島津社製）で分
析したところ、第１図に示す結果が得られた。
応を行った。反応の停止には、４．０μｌの９５％ホル
ムアミド水溶液を添加した。シーケンシング反応により
得られた反応物を９５℃で３分間熱変性させ、ついで、
ＤＮＡシーケンサーＤＳＱ−１０００（島津社製）で分
析したところ、第１図に示す結果が得られた。
【００１９】この図によれば、フルオレセインイソチオ
シアネートで蛍光標識したオリゴヌクレオチドを用いた
シーケンシング（Ｂ図）では、ホルムアミド熱変性によ
って生じた遊離のフルオレセインによって蛍光標識オリ
ゴヌクレオチド近傍ではシーケンスの読みとりが不可能
であった。一方、本発明の蛍光標識オリゴヌクレオチド
を用いたシーケンシング（Ａ図）では遊離の蛍光物質が
ほとんど生じないため蛍光標識オコゴヌクレオチド近傍
（１０数塩基後）から読みとりが可能であった。
シアネートで蛍光標識したオリゴヌクレオチドを用いた
シーケンシング（Ｂ図）では、ホルムアミド熱変性によ
って生じた遊離のフルオレセインによって蛍光標識オリ
ゴヌクレオチド近傍ではシーケンスの読みとりが不可能
であった。一方、本発明の蛍光標識オリゴヌクレオチド
を用いたシーケンシング（Ａ図）では遊離の蛍光物質が
ほとんど生じないため蛍光標識オコゴヌクレオチド近傍
（１０数塩基後）から読みとりが可能であった。
【００２０】
【発明の効果】本発明により、チェインターミネーター
法による遺伝子シーケンシングのためのプライマーとし
て使用できる蛍光標識オリゴヌクレオチドが提供され、
さらにこの蛍光標識オリゴヌクレオチドを使用すること
により蛍光標識オリゴヌクレオチドの近傍からの塩基の
読み取りが可能となる。
法による遺伝子シーケンシングのためのプライマーとし
て使用できる蛍光標識オリゴヌクレオチドが提供され、
さらにこの蛍光標識オリゴヌクレオチドを使用すること
により蛍光標識オリゴヌクレオチドの近傍からの塩基の
読み取りが可能となる。
【００２１】
配列番号：1 配列の長さ：24 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA ハイポセティカル配列：ＮＯ アンチセンス：ＮＯ 起源：Ｍ１３ＤＮＡベクター 配列の特徴 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 GTCGTGACTG GGAAAACCCT GGCG 24
【００２２】配列番号：2 配列の長さ：24 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 ハイポセティカル配列：ＹＥＳ アンチセンス：ＮＯ 配列の特徴 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 NH2 −CGCCAGGGTT TTCCCAGTCA CGAC 24
【図１】図１は、チェインターミネーター法によりシー
ケンシング反応を行った後の反応物の電気泳動図であ
る。
ケンシング反応を行った後の反応物の電気泳動図であ
る。
Claims (3)
- 【請求項１】 酸アミド結合によって５’端に蛍光物質
を導入した１０〜４０塩基からなる蛍光標識オリゴヌク
レオチド。 - 【請求項２】 酸アミド結合が蛍光物質のカルボキシル
基のエステルとオリゴヌクレオチドのアミノ基との反応
により形成されるものである請求項１記載の蛍光標識オ
リゴヌクレオチド。 - 【請求項３】 請求項１または請求項２記載の蛍光標識
オリゴヌクレオチドを用いる遺伝子のシーケンシング
法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP23618395A JPH0959294A (ja) | 1995-08-21 | 1995-08-21 | 蛍光標識オリゴヌクレオチド |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP23618395A JPH0959294A (ja) | 1995-08-21 | 1995-08-21 | 蛍光標識オリゴヌクレオチド |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0959294A true JPH0959294A (ja) | 1997-03-04 |
Family
ID=16997011
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP23618395A Pending JPH0959294A (ja) | 1995-08-21 | 1995-08-21 | 蛍光標識オリゴヌクレオチド |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0959294A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114736274A (zh) * | 2022-01-25 | 2022-07-12 | 伊莱瑞特(武汉)生物技术有限公司 | 新冠病毒s蛋白总抗体elisa检测试剂盒及其制备方法 |
-
1995
- 1995-08-21 JP JP23618395A patent/JPH0959294A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114736274A (zh) * | 2022-01-25 | 2022-07-12 | 伊莱瑞特(武汉)生物技术有限公司 | 新冠病毒s蛋白总抗体elisa检测试剂盒及其制备方法 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Effective date: 20050223 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20050623 |