JPH0961426A

JPH0961426A - ハプテンを利用した血液検体用乾式測定用具

Info

Publication number: JPH0961426A
Application number: JP25002995A
Authority: JP
Inventors: Hiroshi Yamamoto; 博司山本; Masao Kono; 昌雄河野; Shigeru Doi; 茂土井
Original assignee: KDK Corp; Kyoto Daiichi Kagaku KK
Current assignee: Arkray Inc
Priority date: 1995-08-23
Filing date: 1995-08-23
Publication date: 1997-03-07

Abstract

(57)【要約】【構成】１個の支持体上に、以下のｉからｉｖの構成
すなわちｉ）溶血剤と、変性剤と、抗ヘモグロビンＡ
_ｌｃ抗体のエピトープを含むハプテンのポリマー（ポリ
ハプテン）とを塗布した溶血層ｉｉ）抗ヘモグロビンＡ_ｌｃ抗体が固定化されている微
粒子を塗布した凝集層ｉｉｉ）凝集微粒子を捕捉する機能を有する測定層ｉｖ）凝集微粒子を捕捉する測定層を含む構造物と、以下のｖからｖｉの構成すなわちｖ）溶血剤を塗布した溶血層ｖｉ）ヘモグロビンＡを捕捉する測定層を含む構造物とが並列に設置してあり、展開後の展開残
液を吸収する吸収層が上記測定層のまわりを囲んでい
る、血液検体用乾式測定用具。【効果】大型の分析装置を用いず、しかも溶血および
／または変性処理操作を必要とせず、簡単な操作でヘモ
グロビンＡ_ｌｃを直接測定できる。また、色素等で抗体
を標識する必要がなく、標識化による抗体の変性の危険
性もなく、検体はむらなく均一に展開される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ＨｂＡとＨｂＡ
_ｌｃを同時に測定することにより、ＨｂＡ量に対するＨ
ｂＡ_ｌｃ量の比率を簡易測定するための乾式の測定用具
に関する。

【０００２】

【従来の技術】血中のヘモグロビンに糖が結合したグリ
コヘモグロビンは、その濃度が過去１〜２ケ月間の平均
的な血中糖濃度を反映するために、糖尿病の診断あるい
は糖尿病の経過観察に適した指標として広く利用されて
いる。

【０００３】グリコヘモグロビンを測定する場合には、
全体のヘモグロビン量を対照とした際のグリコヘモグロ
ビン量の比率で示される。この場合、ヘモグロビンの種
類（ヘモグロビンＡ，Ｓ，ＣおよびＥ）のうち、ヘモグ
ロビンＡ（ＨｂＡ）中の特定のグリコヘモグロビンであ
る、ヘモグロビンＡ_ｌｃ（ＨｂＡ_ｌｃ）の割合を指標と
して用いることが臨床的に一般化されており、ＨｂＡに
対するＨｂＡ_ｌｃの比率で示すと、通常約４〜６％がそ
の目安とされている。

【０００４】ＨｂＡ_ｌｃ測定法としては、電気泳動法，
ボロン酸アフィニティクロマトグラフィー法，イオン交
換クロマトグラフィー法，イムノアッセイ法などが知ら
れているが、所要時間や分離性などの点からイオン交換
クロマトグラフィー法が主流となっている。しかし、最
近では特異性の高い抗体を用いたイムノアッセイ法でも
測定されるようになって来ている。

【０００５】このイムノアッセイ法は、用いる抗体の特
異性が高いためイオン交換クロマトグラフィー法におい
て問題とされる不安定型グリコヘモグロビン、カルバミ
ル化ヘモグロビン、アセトアルデヒド化ヘモグロビンお
よびアセチル化ヘモグロビンなどの影響を受けず、迅速
かつ検体処理能力が高いという長所がある。

【０００６】しかし、グリコヘモグロビンに対する特異
抗体はヘモグロビンと化学構造の相違する部位（つまり
糖が結合した部分）をエピトープとしており、さらにＨ
ｂＡ_ｌｃの場合ではその部位は十分露出していないた
め、イムノアッセイ法を行う際、多くの場合その部位を
露出させるための変性操作が必要である。

【０００７】従来のイオン交換クロマトグラフィー法お
よびイムノアッセイ法では、比較的大型の分析装置を必
要とし、大きな病院検査室または検査センターでのみ測
定が行なわれている。

【０００８】一方、イムノアッセイ法を応用したもの
で、血中のヘモグロビンＡ、Ｓ、ＣおよびＥの種類判定
を目視でできる使い捨てタイプの乾式検査具（Ｓｃｒｅ
ｅｎｉｎｇ３，６７〜７６，１９９４）も知られてい
る。この検査具は患者自身で測定することが可能である
が、前処理として溶血操作を必要とする上に、ＨｂＡ
_ｌｃといったグリコヘモグロビンを測定するものではな
い。前処理を患者自身が行う場合、操作の煩雑さの他に
汚染も問題である。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】ＨｂＡ_ｌｃといったグ
リコヘモグロビンを測る事ができ、かつ検体を前処理す
ることなしに測定可能な乾式試験具が開発されればその
メリットは極めて大きい。そこで本発明は、大型の分析
装置を用いず、しかも溶血および／または変性処理操作
を必要とせず、検体数の少ない中小病院や開業医、また
は患者自身でも小型機器を用いて、簡単な操作でＨｂＡ
とＨｂＡ_ｌｃとを同時に直接測定できる乾式測定用具を
提供することを目的とする。

【００１０】

【課題を解決するための手段】上記目的は、全体が液体
を移送しうる材質で形成されており、展開液を用いるこ
とで血中のＨｂＡに対するＨｂＡ_ｌｃの量を測定するた
めの乾式試験具であって、１個の支持体上に、以下のｉ
からｖｉの構成すなわちｉ）溶血剤と、変性剤と、抗ＨｂＡ_ｌｃ抗体のエピトー
プを含むハプテンのポリマー（ポリハプテン）とを塗布
した溶血層ｉｉ）抗ＨｂＡ_ｌｃ抗体が固定化されている微粒子を塗
布した凝集層ｉｉｉ）展開層ｉｖ）凝集微粒子を捕捉する機能を有する測定層ｖ）展開層ｖｉ）凝集微粒子を捕捉する測定層が順に積層された構造物と、以下のｖからｉｘの構成す
なわちｖｉｉ）溶血剤を塗布した溶血層ｖｉｉｉ）展開層ｉｘ）ＨｂＡを捕捉する測定層が順に積層された構造物とが並列に設置してあり、展開
後の展開残液を吸収する吸収層が上記測定層のまわりを
囲んでいる、血中ＨｂＡ_ｌｃ測定用乾式測定用具を用い
て、血液検体を点着して展開させた後光学的方法により
測定してＨｂＡとＨｂＡ_ｌｃの量を同時に求め、それぞ
れの値からＨｂＡに対するＨｂＡ_ｌｃの比率を算出する
ことにより、達成できる。なお、このときに使用される
血液検体としては、全血は勿論のこと、分離された赤血
球でも良い。

【００１１】免疫凝集反応は、市販の着色ビーズを用い
るので、色素等で抗体を標識する必要がない。また、目
的物質を標識しないので、標識化による抗体の変性の危
険性もない。さらに、検体は展開液とともに上から下へ
展開するために、液がむらなく均一に展開される。本発
明の原理は、いわゆる「免疫阻害法」である。以下具体
的に述べる。

【００１２】

【発明の実施の形態】図１は、支持体１の上に、ＨｂＡ
_ｌｃを捕捉するための構造物と、ＨｂＡを捕捉するため
の構造物を有する、本発明による測定用具の断面図であ
る。ＨｂＡを捕捉するための構造物は、支持体１の上に
抗ＨｂＡ抗体またはイオン交換物質を固定化した測定層
２を有し、その測定層の上に液を展開可能な材質からな
る展開層３を有し、その展開層の上に溶血剤を塗布した
溶血層４を有している。これらの構成要素は、検体と展
開液を供給するための穴を有するカバー６で覆われてお
り、積層されると同時に支持体へ固定されている。測定
層２の周囲には、展開残液を吸収させる吸収剤からなる
吸収層５が設けてある。

【００１３】ＨｂＡ_ｌｃを捕捉するための構造物は、支
持体１の上に凝集微粒子のみを捕捉しうる濾過膜ででき
た測定層７を有し、その測定層７の上にそれぞれ液を展
開可能な材質からなる展開層８を有し、その展開層８の
上に抗ＨｂＡ_ｌｃ抗体が固定化されている微粒子を塗布
した凝集層９を有し、その凝集層９の上に液を展開可能
な材質からなる展開層１０を有し、その展開層１０の上
に溶血剤，変性剤および抗ＨｂＡ_ｌｃ抗体のエピトープ
を含むハプテンのポリマー（ポリハプテン）を塗布した
溶血層１１を有している。これらの構成要素は、穴を有
するカバー１３で覆われており、積層されると同時に支
持体へ固定されている。測定層の周囲には、展開残液を
吸収させる吸収剤からなる吸収層１２が設けてある。

【００１４】使用する際には、まず測定用具の溶血層４
と溶血層１１へ血液検体を同量づつ点着することにより
始まる。溶血層４において血液検体が溶血され、次いで
展開液を溶血層４に加えてＨｂＡを展開させる。展開さ
れたＨｂＡは測定層２に固定化されている抗ＨｂＡ抗体
又はイオン交換物質に捕捉され、展開残液は吸収層５に
吸収される。一方、溶血層１１において血液検体は溶血
と同時に変性される。引き続き展開液を溶血層１１に加
えると、検体とポリハプテンは展開される。このポリハ
プテンは、抗ＨｂＡ_ｌｃ抗体のＨｂＡ_ｌｃエピトープを
含むペプチドのポリマーなので、凝集層９における抗Ｈ
ｂＡ_ｌｃ抗体を固定化した微粒子が、ポリハプテンと反
応して凝集する。

【００１５】ところが、ここで検体中にＨｂＡ_ｌｃが存
在すると、抗体結合微粒子に対して、ポリハプテンとＨ
ｂＡ_ｌｃが競合し、その結果、凝集が定量的に少なくな
る。ＨｂＡ_ｌｃが多ければ多いほど、凝集は少なくな
る。このとき、ＨｂＡ_ｌｃが全く存在しない場合の凝集
度をあらかじめ調べておき、どれだけＨｂＡ_ｌｃが存在
すれば凝集度がどれだけ低下するかを確認しておく。凝
集している微粒子には着色が施してあるので、凝集に伴
う濃度の判定が容易にできる。凝集した微粒子は、捕捉
機能を有する測定層７に捕捉され、凝集していない微粒
子を含む展開残液は吸収層１２に吸収される。測定層２
に捕捉されたＨｂＡの着色度と、測定層７に捕捉された
微粒子自身（ＨｂＡ_ｌｃに相当）の着色度とを光学的方
法によって測定する。その結果からそれぞれＨｂＡおよ
びＨｂＡ_ｌｃ量を求めた後、ＨｂＡに対するＨｂＡ_ｌｃ
の比率を算出する。

【００１６】ここで、各構成要素の機能と材料を以下に
示す。基本的に、材料は公知のもので構わない。

【００１７】支持体は光透過性の物質が好ましく、本発
明では展開終了後の光学的測定を支持体下部から行うた
めに、測定層の下部は必ず光透過性でなくてはならな
い。また、支持体は一枚板である必要はなく、例えば支
持体全体が光非透過性であり、測定層下部に貫通孔を有
していてもよい。材質は、ある程度の強度を有するもの
で、例えばガラス，ポリスチレン，ポリエステル，ポリ
エチレンテレフタレート，酢酸セルロースなどが挙げら
れる。

【００１８】展開層をなす展開膜は、吸着反応や免疫凝
集反応を行わせるための場として、またその反応の速度
を調節するためにある。また、この展開層の一部へ溶血
剤等を塗布して溶血層を、抗体を塗布して凝集層を設け
る。本発明では、液を通すことの出来る材質を「展開
膜」と呼び、その展開膜へ溶血層や凝集層などの構成層
を設けたものを「展開層」と呼ぶことにする。材質とし
ては、酢酸セルロース、ニトロセルロース、セルロー
ス、ガラスファイバーなどの、液体と微粒子が通りやす
い物質であることが必要である。

【００１９】溶血層に含まれる溶血剤としてはサポニン
が有力であるが、界面活性剤も使用できる。その界面活
性剤の種類としては、ポリソルベート、ポリエチレング
リコール−ｐ−イソオクチルエーテルなどが挙げられ
る。その中でも溶血能の点から、トリトンＸ−１００が
市販品として特に望ましい。同時に溶血層に塗布される
変性剤は、ＨｂＡ_ｌｃを変性させてＨｂＡとの化学構造
の相違する部位（つまり糖部分）を露出させ、抗ＨｂＡ
_ｌｃ抗体が免疫的に認識し易くする役割を有する。よっ
て、ヘモグロビンＡを捕捉するための構造物には特に必
要ない。種類としては、チオシアン酸塩のような酸や、
プロテアーゼのような加水分解酵素が好ましく、単に酸
性にするのみでも良い。

【００２０】溶血層中の、抗ＨｂＡ_ｌｃ抗体のエピトー
プを含むハプテンは、一端にバリンを有するポリペプチ
ドのバリン部分へグルコース一個を結合させたものであ
る。抗ＨｂＡ_ｌｃ抗体のエピトープを含むハプテンのポ
リマー（ポリハプテン）は、該ハプテン中のカルボキシ
ル基を、リジンを数個含んで表面にアミノ基を有するポ
リペプチドと結合させて、ポリペプチド表面へ該ハプテ
ンを導入することで得られる。又は、該ハプテン中のア
ミノ基を、グルタミン酸を数個含んで表面にカルボキシ
ル基を有するポリペプチドと結合させて、ポリペプチド
表面へハプテンを導入することで得られる。

【００２１】凝集層に含まれる、抗ＨｂＡ_ｌｃ抗体を固
定化するための微粒子は、通常の免疫凝集法で使用され
るものと同じでよく、免疫凝集反応で使用される市販の
着色ラテックスや、着色または無着色金属コロイド
（金、銀、銅）なども使用できる。ただし、これら微粒
子の着色は、ヘモグロビンの色（赤色）と光学的に区別
して測定できるものでなければならない。その微粒子へ
抗体を固定化する方法としては、二者を混合して物理的
に吸着させる他に、微粒子へアミノ基を導入しておき、
抗体側のカルボキシル基と反応させる方法や、カップリ
ング剤で結合する方法等がある。

【００２２】捕捉する機能を有する測定層は、濾過を利
用することにより凝集した微粒子を捕捉し得る孔径を有
する多孔性マトリックスが望ましい。濾過膜の例は、ポ
リテトラフルオロエチレン、ポリスルオン、ポリプロピ
レン、ポリビニリデンジフロライド、セルロース混合エ
ステルなどが挙げられる。また、ここで捕捉された微粒
子の呈色を観察するために、その呈色とは波長の異なる
色をした膜が好ましい。好ましくは白色である。捕捉の
方法は、濾過することが望ましくて一般的であるが、抗
体やイオン交換樹脂を使用する方法もある。

【００２３】吸収剤の条件としては、展開残液を吸収す
るのに十分な細孔容積を有する多孔性マトリックスか、
十分な液吸収能を有する乾燥ゲルが挙げられる。例とし
ては、セルロース、酢酸セルロース、ポリアクリル酸、
ポリビニールアルコールなどがある。

【００２４】展開に用いる展開液としては、通常のイム
ノアッセイ法に使用されるような、少量の蛋白質、塩、
界面活性剤を含む緩衝液が望ましく、１例としては、
０．１％ウシ血清アルブミンと、０．０１％トリトンＸ
−１００と、０．９％塩化ナトリウムを含む０．１Ｍリ
ン酸緩衝液が挙げられる。

【００２５】ＨｂＡを捕捉するための構造物において
は、測定層でＨｂＡとＨｂＡ_ｌｃを区別する必要がな
く、凝集した微粒子もないので、測定層には抗ＨｂＡ抗
体やイオン交換樹脂（例としては、ジエチルアミノエチ
ルセルロース，カルボキシメチルセルロース）などを含
ませておけばよい。抗ＨｂＡ抗体は、ＨｂＡとＨｂＡ
_ｌｃの両方に結合する。

【００２６】溶血層と凝集層と測定層は、展開膜に各種
試薬を含浸・塗布または結合させることで作製するが、
手法としては当業者間で公知の方法で良く、施すべき物
質を１種以上の含浸溶液中へ溶かし込み、塗り付けるこ
とで含浸したり、インクジェットプリンターで噴霧した
り、化学的に結合する（「酵素免疫測定法」医学書院、
１９８７年）ことができる。いずれにしても、最終的に
は乾燥させる。

【００２７】支持体上へ各層を配置する方法としては、
円形に加工した各々の層の膜を重ね合わせ，カバーと支
持体とを物理的に（例えば接着剤で）固定する。もちろ
ん、円形である必要は特にない。その際のカバーの材質
の例は、ポリエチレン，ポリプロピレン，ポリスチレ
ン，メタクリル樹脂，ポリカーボネートなどが挙げられ
る。

【００２８】

【発明の効果】本発明を用いると、大型の分析装置を用
いず、しかも溶血および／または変性処理操作を必要と
せず、検体数の少ない中小病院や開業医、または患者自
身でも小型機器を用いて、簡単な操作でＨｂＡとＨｂＡ
_ｌｃとを同時に直接測定できる。また、色素等で抗体を
標識する必要がなく、標識化による抗体の変性の危険性
もない。さらに、検体は展開液とともに上から下へ展開
するために、液がむらなく均一に展開される。

【００２９】

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の測定用具の縦断面図である。

【符号の説明】１：支持体２，７：測定層５，１２：吸収層３，８，１０：展開層９：凝集層４，１１：溶血層６，１３，：カバー

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】全体が液体を移送しうる材質で形成されて
おり、展開液を用いることで血液検体中のヘモグロビン
Ａ（ＨｂＡと略する）に対するヘモグロビンＡ_ｌｃ（Ｈ
ｂＡ_ｌｃと略する）の量を測定するための乾式試験具で
あって、１個の支持体上に、以下のｉからｖｉの構成す
なわちｉ）溶血剤と、変性剤と、抗ＨｂＡ_ｌｃ抗体のエピトー
プを含むハプテンのポリマー（ポリハプテン）とを塗布
した溶血層ｉｉ）抗ＨｂＡ_ｌｃ抗体が固定化されている微粒子を塗
布した凝集層ｉｉｉ）展開層ｉｖ）凝集微粒子を捕捉する機能を有する測定層ｖ）展開層ｖｉ）凝集微粒子を捕捉する測定層が順に積層された構造物と、以下のｖｉｉからｉｘの構
成すなわちｖｉｉ）溶血剤を塗布した溶血層ｖｉｉｉ）展開層ｉｘ）ＨｂＡを捕捉する測定層が順に積層された構造物とが並列に設置してあり、展開
後の展開残液を吸収する吸収層が上記測定層のまわりを
囲んでいる、血液検体用乾式測定用具。
【請求項２】測定層での凝集微粒子の捕捉方法が、濾過
材による濾過作用によるものである、特許請求の範囲第
１項に記載の測定用具。
【請求項３】微粒子が、ヘモグロビンの色と光学的に区
別して測定し得る色に着色されている、特許請求の範囲
第１又は２項に記載の測定用具。
【請求項４】測定層における光学的測定のために、支持
体の全体又は一部分が光透過性であるか、又は測定層の
下部に穴を開けたものである、特許請求の範囲第１から
３項のいずれかに記載の測定用具。