JPH0961427A

JPH0961427A - ハプテンを利用した血液検体用乾式試験片

Info

Publication number: JPH0961427A
Application number: JP25003095A
Authority: JP
Inventors: Hiroshi Yamamoto; 博司山本; Masao Kono; 昌雄河野; Shigeru Doi; 茂土井
Original assignee: KDK Corp; Kyoto Daiichi Kagaku KK
Current assignee: Arkray Inc
Priority date: 1995-08-23
Filing date: 1995-08-23
Publication date: 1997-03-07

Abstract

(57)【要約】【構成】ｉ）溶血剤と、変性剤と、抗ヘモグロビンＡ
_１ｃ抗体のエピトープを含むハプテンのポリマー（ポリ
ハプテン）とを塗布した溶血層ｉｉ）抗ヘモグロビンＡ_１ｃ抗体が固定化されている微
粒子を塗布した凝集層ｉｉｉ）凝集微粒子を捕捉する機能を有する測定層ｉｖ）展開残液を吸収する吸収層ｉからｉｖをこの順序で有する一個の連続した展開層
と、ｖ）溶血剤を塗布した溶血層ｖｉ）ヘモグロビンＡを捕捉する測定層ｖｉｉ）展開残液を吸収する吸収層ｖからｖｉｉをこの順序で有する一個の連続した展開層
とが、一個の支持体上に並べて設置してあることを特徴
とする、血液検体用乾式試験片。【効果】大型の分析装置を用いず、しかも前処理を要
せずに患者自身が在宅でも簡単な操作でヘモグロビンと
グリコヘモグロビンとを同時に測定できる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、血中のグリコヘモ
グロビンを簡易測定するための乾式の用具に関し、特に
ヘモグロビンＡと、そのグリコヘモグロビンの一種であ
るヘモグロビンＡ_１ｃとを同時に測定するために有用な
試験片に関する。

【０００２】

【従来の技術】血中のヘモグロビンに糖が結合（グリコ
シル化）したグリコヘモグロビンは、その濃度が過去１
〜２ケ月間の平均的な血中糖濃度を反映するため、糖尿
病の診断あるいは糖尿病の経過観察に適した指標として
広く利用されている。

【０００３】グリコヘモグロビンを測定する場合には、
全体のヘモグロビン量を対照とした際のグリコヘモグロ
ビン量の比率で示される。ヘモグロビンの種類（ヘモグ
ロビンＡ，Ｓ，ＣおよびＥ）のうち、ヘモグロビンＡ
（ＨｂＡと略する）中の特定のグリコシル化ヘモグロビ
ンである、ヘモグロビンＡ_１ｃ（ＨｂＡ_１ｃと略する）
の割合を指標として用いることが臨床的に一般化されて
おり、ＨｂＡ全体に対するＨｂＡ_１ｃの比率で示すと、
通常約４〜６％がその目安とされている。

【０００４】このグリコヘモグロビンの測定法として
は、電気泳動法，イオン交換クロマトグラフィー法，ボ
ロン酸アフィニティクロマトグラフィー法，イムノアッ
セイ法などが知られているが、中でも所要時間や分離性
などの点からイオン交換クロマトグラフィー法が主流と
なっている。これらイオン交換クロマトグラフィー法は
比較的大型の分析装置を必要とし、大きな病院の検査室
や検査センターで測定が行なわれている。

【０００５】一方、最近では特異性の高い『抗体』を用
いたイムノアッセイ法でも測定されるようになってき
た。イムノアッセイ法は、使用する抗体の特異性が高い
ため、イオン交換クロマトグラフィー法において問題と
される不安定型グリコヘモグロビン，カルバミル化ヘモ
グロビン，アセトアルデヒド化ヘモグロビン，およびア
セチル化ヘモグロビンなどの影響を受けず、迅速かつ検
体処理能力が高いという長所がある。イムノアッセイ法
もまた、比較的大型の分析装置を必要とし、大きな病院
の検査室や検査センターで測定が行なわれている。

【０００６】しかし、グリコヘモグロビンに対する特異
抗体は、ヘモグロビンとの化学構造の相違する部位（つ
まりヘモグロビンに糖の結合した部分）をエピトープと
している上に、特にＨｂＡ_１ｃの場合はその部位が十分
に露出していないため、イムノアッセイ法を行う際、多
くの場合その部位を露出させるための溶血および／又は
変性操作が必要である。

【０００７】イムノアッセイ法を応用したもので、血中
Ｈｂ（ヘモグロビンＡ、Ｓ、ＣおよびＥ）を目視により
判定する使い捨てタイプの乾式検査具（Ｓｃｒｅｅｎｉ
ｎｇ３，６７〜７６，１９９４）も知られている。この
乾式検査具は患者自身でも測定することが可能である
が、前処理として溶血操作を必要とし、ＨｂＡ_１ｃ等の
グリコヘモグロビンの測定用ではない。前処理を患者自
身が行う場合、操作の煩雑さの他に汚染も問題である。

【０００８】ＨｂＡ_１ｃといったグリコヘモグロビンを
測ることができ、かつ検体を前処理せずに測定可能な乾
式の試験用具が開発されればそのメリットは極めて大き
いわけであるが、現在まだ知られていない。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、溶血
および／又は変性の前処理操作を必要とせず、大型の分
析装置を使わずに小型機器を用いて、検体数の少ない中
小の病院や開業医、又は患者自身でも簡単な操作でＨｂ
ＡとＨｂＡ_１ｃとを同時に直接測定できる乾式の試験片
を提供することを目的とする。

【００１０】

【課題を解決するための手段】上記目的は、以下の構成
すなわちｉ）溶血剤と、変性剤と、抗ＨｂＡ_１ｃ抗体のエピトー
プを含むハプテンのポリマー（ポリハプテン）とを塗布
した溶血層ｉｉ）抗ＨｂＡ_１ｃ抗体が固定化されている微粒子を塗
布した凝集層ｉｉｉ）凝集微粒子を捕捉する機能を有する測定層ｉｖ）展開残液を吸収する吸収層をこの順序で有する一個の連続した展開層と、以下のｖ
からｖｉｉの構成すなわちｖ）溶血剤を塗布した溶血層ｖｉ）ＨｂＡを捕捉する測定層ｖｉｉ）展開残液を吸収する吸収層をこの順序で有する一個の連続した展開層とが、一個の
支持体上に並べて設置してあり、ｉからｉｖまでの間並
びにｖからｖｉｉまでの間を液体が移動しうる乾式試験
片で解決できる。

【００１１】血液検体を各展開層の溶血層へ同量ずつ点
着し、展開液等で展開させた後、測定層において光学的
に測定してＨｂＡとＨｂＡ_１ｃの量を求め、それぞれの
値を用いてＨｂＡに対するＨｂＡ_１ｃの比率を算出す
る。本発明の測定用具で測定する際の血液検体として
は、全血は勿論のこと、分離された赤血球も使用でき
る。

【００１２】免疫凝集反応は、市販の着色ビーズを使用
するので、抗体を標識するための色素を使わない。目的
物質を標識しないので、標識物質による抗体の変性の危
険性もない。本発明の原理は、いわゆる「免疫阻害法」
である。

【００１３】

【発明の実施の形態】本発明の具体的な実施態様につい
ては、以下に述べる。

【００１４】第１図は本発明による試験片の実施態様の
平面図と側面図である。支持体１の上に、展開可能な材
質からなる２つの展開層２および３が装着されている。
一方の展開層２には順次、展開開始点Ｐと，溶血剤を塗
布した溶血層４と，抗Ｈｂ抗体またはイオン交換物質を
固定化した測定層５と，展開残液を吸収させる吸収剤か
らなる吸収層６とが設けられている。他方の展開層３に
は順次，展開開始点Ｐ’と，溶血剤と変性剤とポリハプ
テンを塗布した溶血層７と，抗ＨｂＡ_１ｃ抗体を固定化
した微粒子を塗布した凝集層８と，凝集微粒子のみを捕
捉しうる濾過膜でできた測定層９と，展開残液を吸収さ
せる吸収剤からなる吸収層１０とが設けられている。本
発明では、液を通すことの出来る材質を「展開膜」と呼
び、その展開膜へ溶血層や凝集層などの構成層を設けた
ものを「展開層」と呼ぶことにする。

【００１５】使用する際には、まず試験片の溶血層４と
溶血層７へ血液検体を同量づつ点着することにより始ま
る。溶血層４において血液検体が溶血され、次いで展開
液を展開開始点Ｐに加えてＨｂＡを展開させる。展開さ
れたＨｂＡは測定層５に固定化されている抗ＨｂＡ抗体
又はイオン交換物質に捕捉され、展開残液は吸収層６に
吸収される。一方、溶血層７において血液検体は溶血と
同時に変性される。引き続き展開液を展開開始点Ｐ’に
加えると、検体とポリハプテンは展開される。このポリ
ハプテンは、抗ＨｂＡ_１ｃ抗体のＨｂＡ_１ｃエピトープ
を含むペプチドのポリマーなので、凝集層における抗Ｈ
ｂＡ_１ｃ抗体を固定化した微粒子が、ポリハプテンと反
応して凝集する。ところが、ここで検体中にＨｂＡ_１ｃ
が存在すると、抗体結合微粒子に対して、ポリハプテン
とＨｂＡ_１ｃが競合し、その結果、凝集が定量的に少な
くなる。ＨｂＡ_１ｃが多ければ多いほど、凝集は少なく
なる。このとき、ＨｂＡ_１ｃが全く存在しない場合の凝
集度をあらかじめ調べておき、どれだけＨｂＡ_１ｃが存
在すれば凝集度がどれだけ低下するかを確認しておく。
凝集している微粒子には着色が施してあるので、凝集に
伴う濃度の判定が容易にできる。凝集した微粒子は濾過
膜である測定層９に捕捉され、凝集していない微粒子を
含む展開残液は吸収層１０に吸収される。測定層５に捕
捉されたＨｂＡの着色度と、測定層９に捕捉された微粒
子自身（ＨｂＡ_１ｃに相当）の着色度とを光学的方法に
よって測定する。その結果からそれぞれＨｂＡおよびＨ
ｂＡ_１ｃ量を求めた後、ＨｂＡに対するＨｂＡ_１ｃの比
率を算出する。

【００１６】ここで、各構成の材質としてはいずれも公
知の物質でよいが、具体的には次のようなものである。

【００１７】支持体は、光透過性でも光非透過性でも良
いが、展開終了後の測定を支持体下から行うのであるな
らば、透明なもの、たとえばポリエチレンテレフタレー
トなどが望ましい。その他の例；ポリスチレン、ポリエステル、酢酸セルロ
ースなど

【００１８】液をクロマトさせる、展開膜全体を形成し
ている材質は、液を通しやすい物質が望ましい。例え
ば、濾紙といったセルロースの集合体、酢酸セルロー
ス、ニトロセルロース、ガラスファイバーなどがある。

【００１９】吸収剤の条件としては、展開残液を吸収す
るのに十分な細孔容積を有するマトリクッス的な物質
か、乾燥ゲルといった吸水性に優れた物質が好ましい。その他の例：セルロース、酢酸セルロース、ポリアクリ
ル酸、ポリビニールアルコールなど

【００２０】凝集した微粒子を捕捉するための測定層
は、濾過することで捕捉することが一般的であるが、抗
体やイオン交換樹脂を使用する方法もある。濾過する際
の測定層の材質の例としては、ポリテトラフルオロエチ
レン、ポリスルオン、ポリプロピレン、ポリビニリデン
ジフロライド、セルロース混合エステルなどがある。

【００２１】抗ＨｂＡ_１ｃ抗体を固定化した微粒子は、
通常の免疫凝集法で使用されるものと同じでよく、市販
の着色ラテックスや、着色または無着色金属コロイド
（金、銀、銅）など（着色は、ヘモグロビンの色と光学
的に区別して測定できるもの）がある。微粒子へ抗体を
固定化する方法としては、二者を混合して物理的に吸着
させる他に、微粒子へアミノ基を導入しておき、抗体側
のカルボキシル基と反応させる方法や、カップリング剤
で結合する方法等がある。

【００２２】その他、使用する抗体は、抗ＨｂＡ_１ｃ抗
体と抗ＨｂＡ抗体ともに、ポリクローナル抗体，モノク
ローナル抗体から選ばれる。イオン交換物質はジエチル
アミノエチルセルロース，カルボキシメチルセルロース
などが使用できる。

【００２３】支持体上へ展開膜を配置する方法として
は、細長くテープ状に加工した展開膜を両面テープや接
着剤やホットメルトを用いて物理的に固定する。テープ
状に加工する際の幅・長さもまた、クロマトグラフ技術
に準ずる。

【００２４】溶血剤としてはサポニンが有力であるが、
さらに界面活性剤も使用でき、その種類としては、ポリ
ソルベート、ポリエチレングリコール−ｐ−イソオクチ
ルエーテルなどが挙げられる。その中でも溶血能の点か
ら、トリトンＸ−１００が市販品として特に望ましい。

【００２５】溶血層に塗布される変性剤は、ＨｂＡ_１ｃ
を変性させてＨｂＡとの化学構造の相違する部位（つま
り糖部分）を露出させ、抗ＨｂＡ_１ｃ抗体が免疫的に認
識し易くする役割を有する。チオシアン酸塩のような酸
や、プロテアーゼのような加水分解酵素が好ましいが、
環境を単に酸性にするのみでも良い。ＨｂＡを捕捉する
側の展開層においては、糖部分を露出させる必要もない
ので、変性剤を入れる必要も特にない。

【００２６】展開に用いる展開液としては、通常のイム
ノアッセイ法に使用されるような、少量の蛋白質、塩、
界面活性剤などを含む緩衝液が望ましく、１例として
は、０．１％ウシ血清アルブミンと、０．０１％トリト
ンＸ−１００と、０．９％塩化ナトリウムとを含む０．
１Ｍリン酸緩衝液が挙げられる。

【００２７】抗ＨｂＡ_１ｃ抗体のエピトープを含むハプ
テンは、一端にバリンを有するポリペプチドのバリン部
分へグルコースー個を結合させたものである。抗ＨｂＡ
_１ｃ抗体のエピトープを含むハプテンのポリマー（ポリ
ハプテン）は、該ハプテン中のカルボキシル基を、リジ
ンを数個含んで表面にアミノ基を有するポリペプチドと
結合させて、ポリペプチド表面へハプテンを導入するこ
とで得られる。又は、該ハプテン中のアミノ基を、グル
タミン酸を数個含んで表面にカルボキシル基を有するポ
リペプチドと結合させて、ポリペプチド表面へハプテン
を導入することで得られる。

【００２８】展開層に各層を設けるために、展開膜へ各
種試薬を含浸・塗布または結合させる。手法としては当
業者間で公知の方法で良く、施すべき物質を１種以上の
溶液に溶かし込み、塗り付けることで含浸したり、イン
クジェットプリンターで噴霧したり、化学的に結合する
（「酵素免疫測定法」医学書院、１９８７）ことがされ
る。いずれにしても、最終的には乾燥させる。

【００２９】

【発明の効果】本発明による乾式試験片を用いると、大
型の分析装置を用いず、しかも前処理を要せずに患者自
身が在宅でも簡単な操作でＨｂＡとＨｂＡ_１ｃとを同時
に測定できる。

【００３０】

【図面の簡単な説明】

図１は、本発明による乾式試験片の正面図と側面図であ
る。（符号の説明）１；支持体２，３；展開層４，７；溶血層５，９；測定層６，１０；吸収層８；凝集層Ｐ，Ｐ’；展開開始点

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】血液検体中のヘモグロビンＡ（ＨｂＡと略
する）量に対するヘモグロビンＡ_１ｃ（ＨｂＡ_１ｃと略
する）量を測定するための乾式試験片であって、以下の
ｉからｉｖの構成すなわちｉ）溶血剤と、変性剤と、抗ＨｂＡ_１ｃ抗体のエピトー
プを含むハプテンのポリマー（ポリハプテン）とを塗布
した溶血層ｉｉ）抗ＨｂＡ_１ｃ抗体が固定化されている微粒子を塗
布した凝集層ｉｉｉ）凝集微粒子を捕捉する機能を有する測定層ｉｖ）展開残液を吸収する吸収層をこの順序で有する一個の連続した展開層と、以下のｖ
からｖｉｉの構成すなわちｖ）溶血剤を塗布した溶血層ｖｉ）ＨｂＡを捕捉する測定層ｖｉｉ）展開残液を吸収する吸収層をこの順序で有する一個の連続した展開層とが、一個の
支持体上に並べて設置してあることを特徴とする、血液
検体用乾式試験片。
【請求項２】測定層での凝集微粒子の捕捉の方法が、濾
過材による濾過によるものである、特許請求の範囲第１
項に記載の試験片。
【請求項３】凝集層における微粒子が、ヘモグロビンと
光学的に区別して検出しうる色に着色されている、特許
請求の範囲第１又は２項に記載の試験片。