JPH0965877A - 安定化されたグルコース６リン酸脱水素酵素 - Google Patents
安定化されたグルコース６リン酸脱水素酵素Info
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- JPH0965877A JPH0965877A JP7245244A JP24524495A JPH0965877A JP H0965877 A JPH0965877 A JP H0965877A JP 7245244 A JP7245244 A JP 7245244A JP 24524495 A JP24524495 A JP 24524495A JP H0965877 A JPH0965877 A JP H0965877A
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Abstract
(57)【要約】
【発明の名称】 安定化されたグルコース６リン酸脱水
素酵素 【目的】 安定化されたグルコース６リン酸脱水素酵素
を用いたる液状臨床検査測定試薬の提供。 【構成】 ロイコノストック属由来のグルコース６リン
酸脱水素酵素を２価性の、架橋試薬にて化学修飾するこ
とにより安定化する。安定化されたグルコース６リン酸
脱水素酵素をグルコース６リン酸の測定に採用すること
で、液状で保存可能な臨床検査測定試薬及びその方法を
提供可能とする。
素酵素 【目的】 安定化されたグルコース６リン酸脱水素酵素
を用いたる液状臨床検査測定試薬の提供。 【構成】 ロイコノストック属由来のグルコース６リン
酸脱水素酵素を２価性の、架橋試薬にて化学修飾するこ
とにより安定化する。安定化されたグルコース６リン酸
脱水素酵素をグルコース６リン酸の測定に採用すること
で、液状で保存可能な臨床検査測定試薬及びその方法を
提供可能とする。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はグルコース６リン酸脱水
素酵素を用いた臨床検査法において、グルコース６リン
酸脱水素酵素を化学修飾により安定化する方法と、およ
び安定化されたグルコース６リン酸脱水素酵素からなる
安定性のより高い臨床検査用測定試薬とその測定方法に
関する。
素酵素を用いた臨床検査法において、グルコース６リン
酸脱水素酵素を化学修飾により安定化する方法と、およ
び安定化されたグルコース６リン酸脱水素酵素からなる
安定性のより高い臨床検査用測定試薬とその測定方法に
関する。
【０００２】
【従来の技術】グルコース６リン酸酸脱水素酵素は、補
酵素ＮＡＤ又はＮＡＤＰの存在下でグルコース６リン酸
及びＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨを生成する反応、あるいは
この逆の反応を触媒する性質の酵素で、動植物界に広く
分布している。この性質を利用してグルコース６リン酸
脱水素酵素は分析試料中のグルコース関連物質の定量や
関連酵素の酵素活性等に使用されているが安定性に問題
がある。
酵素ＮＡＤ又はＮＡＤＰの存在下でグルコース６リン酸
及びＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨを生成する反応、あるいは
この逆の反応を触媒する性質の酵素で、動植物界に広く
分布している。この性質を利用してグルコース６リン酸
脱水素酵素は分析試料中のグルコース関連物質の定量や
関連酵素の酵素活性等に使用されているが安定性に問題
がある。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、グルコース
６リン酸脱水素酵素を用いたグルコース６リン酸を生成
物とする液状臨床検査試薬において該酵素の安定性を向
上させる技術を提供することを目的とする。
６リン酸脱水素酵素を用いたグルコース６リン酸を生成
物とする液状臨床検査試薬において該酵素の安定性を向
上させる技術を提供することを目的とする。
【０００４】
【問題点を解決するための手段】本発明者らは、上記従
来の問題点に鑑みグルコース６リン酸脱水素酵素（以下
Ｇ６ＰＤと略す）について鋭意研究の結果、乳酸菌の一
種であるロイコノストック属由来のＧ６ＰＤにおいて、
２価性架橋試薬にて化学修飾することにより、該酵素の
安定性を向上させる技術を見いだし、グルコース６リン
酸（以下Ｇ６Ｐと略す場合もある）を生成物とする液状
臨床検査試薬とその測定系方法を完成するに至った。
来の問題点に鑑みグルコース６リン酸脱水素酵素（以下
Ｇ６ＰＤと略す）について鋭意研究の結果、乳酸菌の一
種であるロイコノストック属由来のＧ６ＰＤにおいて、
２価性架橋試薬にて化学修飾することにより、該酵素の
安定性を向上させる技術を見いだし、グルコース６リン
酸（以下Ｇ６Ｐと略す場合もある）を生成物とする液状
臨床検査試薬とその測定系方法を完成するに至った。
【０００５】本発明のグルタルアルデヒド修飾による安
定化されたＧ６ＰＤの作製方法の一例を以下に示した。
定化されたＧ６ＰＤの作製方法の一例を以下に示した。
【０００６】１）ロイコノストック・メセントロイデス
由来精製Ｇ６ＰＤ、６ｍｇ蛋白を２．４ｍｌの２０ｍＭ
Ｋ−ＰＯ4緩衝液（ｐＨ７．０，０．２Ｍ ＮａＣ
ｌ，０．５ｍＭ ＥＤＴＡを含む）に溶解した。つい
で、ミキサーにて激しく攪拌しながら最終濃度０．０５
％になるように１２μｌの１０％グルタルアルデヒド溶
液（和光純薬社製、電子顕微鏡用）を滴下した。その後
２５℃にて３０分間静置した。
由来精製Ｇ６ＰＤ、６ｍｇ蛋白を２．４ｍｌの２０ｍＭ
Ｋ−ＰＯ4緩衝液（ｐＨ７．０，０．２Ｍ ＮａＣ
ｌ，０．５ｍＭ ＥＤＴＡを含む）に溶解した。つい
で、ミキサーにて激しく攪拌しながら最終濃度０．０５
％になるように１２μｌの１０％グルタルアルデヒド溶
液（和光純薬社製、電子顕微鏡用）を滴下した。その後
２５℃にて３０分間静置した。
【０００７】２）先のグルタルアルデヒド反応液に対し
て等量の０．２Ｍ グリシン溶液（ｐＨ７．０）添加混
合し、架橋化反応を停止した。その後さらに３０分間静
置した。
て等量の０．２Ｍ グリシン溶液（ｐＨ７．０）添加混
合し、架橋化反応を停止した。その後さらに３０分間静
置した。
【０００８】３）最終的に淡黄色を呈した反応混合液か
ら、低分子量のものを除去するために、市販カラム（バ
イオラッド社製、Ｂｉｏｇｅｌ−１０ＤＧ）を用いて１
０ｍＭ Ｋ−ＰＯ4緩衝液（ｐＨ７．０、０．５ｍＭ
ＥＤＴＡ、０．０２％ＮａＮ3を含む）にて脱塩処理を
行った。もしくは、脱塩操作の代わりに上記リン酸緩衝
液中にて透析を行っても良い。
ら、低分子量のものを除去するために、市販カラム（バ
イオラッド社製、Ｂｉｏｇｅｌ−１０ＤＧ）を用いて１
０ｍＭ Ｋ−ＰＯ4緩衝液（ｐＨ７．０、０．５ｍＭ
ＥＤＴＡ、０．０２％ＮａＮ3を含む）にて脱塩処理を
行った。もしくは、脱塩操作の代わりに上記リン酸緩衝
液中にて透析を行っても良い。
【０００９】４）さらには、架橋化反応液から安定化さ
れたＧ６ＰＤのみを得ることを目的とし、未修飾酵素や
架橋が不十分に行われたものを失活させ除去するため
に、上記の２）の段階、もしくは３）の段階で熱処理操
作を行っても良い。また、イオン交換クロマトグラフィ
ー等の分離精製手段を３）の段階以降に講じても良い。
もちろん熱処理とクロマトグラフィー操作とを組み合わ
せることもできる。また、２価性架橋試薬によるＧ６Ｐ
Ｄ架橋化反応時に、酵素活性部位を保護する目的で用い
た２価性架橋試薬とは実質上反応しえない基質及び基質
アナログ、もしくは阻害剤を添加しても良い。
れたＧ６ＰＤのみを得ることを目的とし、未修飾酵素や
架橋が不十分に行われたものを失活させ除去するため
に、上記の２）の段階、もしくは３）の段階で熱処理操
作を行っても良い。また、イオン交換クロマトグラフィ
ー等の分離精製手段を３）の段階以降に講じても良い。
もちろん熱処理とクロマトグラフィー操作とを組み合わ
せることもできる。また、２価性架橋試薬によるＧ６Ｐ
Ｄ架橋化反応時に、酵素活性部位を保護する目的で用い
た２価性架橋試薬とは実質上反応しえない基質及び基質
アナログ、もしくは阻害剤を添加しても良い。
【００１０】ロイコノストック属由来のＧ６ＰＤとは、
菌体培養より精製して得られた酵素標品でも、ロイコノ
ストック属由来のＧ６ＰＤ遺伝子を大腸菌等に形質導入
して得られた組換え酵素であっても良い。
菌体培養より精製して得られた酵素標品でも、ロイコノ
ストック属由来のＧ６ＰＤ遺伝子を大腸菌等に形質導入
して得られた組換え酵素であっても良い。
【００１１】本発明に係る細菌性ロイコノストック属に
ついてロイコノストック・メンセントロイデス等任意の
ものを使用すればよい。又この微生物の代表菌株とし
て、ロイコノストック・メンセントロイデスはＡＴＣＣ
１２２９１である。
ついてロイコノストック・メンセントロイデス等任意の
ものを使用すればよい。又この微生物の代表菌株とし
て、ロイコノストック・メンセントロイデスはＡＴＣＣ
１２２９１である。
【００１２】Ｇ６ＰＤの酵素活性は、分光光学的に算出
し３０℃における１分間あたり１μｍｏｌｅのＮＡＤＨ
生成量を酵素活性（１単位）とした。
し３０℃における１分間あたり１μｍｏｌｅのＮＡＤＨ
生成量を酵素活性（１単位）とした。
【００１３】 測定機器 ：日立分光光度計Ｕ，２０００型 測定温度 ：３０℃ 測定波長 ：３４０ｎｍ 基質反応液組成：０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ７．８） ３ｍＭ ＭｇＣｌ2 ３ｍＭ Ｇ６Ｐ ２ｍＭ ＮＡＤ+
【００１４】上述したグルタルアルデヒド修飾によるＧ
６ＰＤの安定化操作中の各工程段階での総活性値及びに
収率を表１に示した。
６ＰＤの安定化操作中の各工程段階での総活性値及びに
収率を表１に示した。
【００１５】
【表１】 ──────────────────────────────── 処理工程 総活性値（Ｕ） 収率（％） ──────────────────────────────── 初期出発材料 ４,９９０ １００ グルタルアルデヒド修飾反応 １,１６７ ２３.４ ５０℃、１５分間の熱処理 ８３３ １６.７ ＤＥＡＥ−５ＰＷカラムによる分画 ９２４ １８.５ ────────────────────────────────
【００１６】グルタルアルデヒド修飾により安定化した
Ｇ６ＰＤの熱安定性の測定方法については例えば下記の
要領で簡単に試験することが可能である。
Ｇ６ＰＤの熱安定性の測定方法については例えば下記の
要領で簡単に試験することが可能である。
【００１７】 熱処理温度 ：４５、５０、５５℃ 熱処理時間 ：０、２、５、１０、２０、３０分間目にサンプリング 添加酵素濃度 ：０．２Ｕ／ｍｌ 緩衝液 ：５０ｍＭ Ｋ−ＰＯ4（ｐＨ７．０） ０．５ｍＭ ＥＤＴＡ ０．１％ ＢＳＡ ０．０２％ ＮａＮ3 熱安定性度合の算出法：初期Ｇ６ＰＤ活性値に対する熱処理後の残存活性の割 合を熱処理時間に対してプロットし、安定化されたＧ６ ＰＤＨの半減期を求める。
【００１８】グルタルアルデヒド修飾により安定化した
Ｇ６ＰＤの酵素的な性状をゲル濾過法による架橋化酵素
のの分子量の測定や基質であるＧ６Ｐに対する反応度合
より、未処理酵素との比較分析を行った。Ｇ６Ｐに対す
るＫｍ値測定のための組成について、上記したＧ６ＰＤ
酵素活性試薬組成に準じたものと、臨床化学（１９９
０）第１９巻第２号１８５−２０８記載のＣＫ（クレア
チンキナーゼ）活性を測定する為の最終反応液組成に準
じて行った。得られた比較分析結果を表２に示した。
Ｇ６ＰＤの酵素的な性状をゲル濾過法による架橋化酵素
のの分子量の測定や基質であるＧ６Ｐに対する反応度合
より、未処理酵素との比較分析を行った。Ｇ６Ｐに対す
るＫｍ値測定のための組成について、上記したＧ６ＰＤ
酵素活性試薬組成に準じたものと、臨床化学（１９９
０）第１９巻第２号１８５−２０８記載のＣＫ（クレア
チンキナーゼ）活性を測定する為の最終反応液組成に準
じて行った。得られた比較分析結果を表２に示した。
【００１９】
【表２】 ─────────────────────────────── 酵素的性状 未修飾Ｇ６ＰＤ 修飾Ｇ６ＰＤ ─────────────────────────────── 分子量（ゲル濾過法） １３０ＫＤ １３０ＫＤ Ｇ６Ｐに対するＫｍ値 （３０℃、ｐＨ７．８、 ０．１ｍＭ ０．１５ｍＭ ２ｍＭ ＮＡＤ+測定時）1) （３７℃、ｐＨ６．７、 ０．１ｍＭ 約０．２ｍＭ ＣＫ活性測定試薬組成中）2) ───────────────────────────────
【００２０】本発明においてＧ６ＰＤの安定化の為に使
用される２価性の架橋試薬は種々の物が挙げられる。そ
の一例と共に、修飾酵素の熱安定性試験結果を表３に示
した。また、下表に挙げた架橋試薬以外にも、ジスクニ
ミジルグルタレート（ＤＳＧ）、ジスクシニミジルタル
タレート（ＤＳＴ）等が挙げられる。
用される２価性の架橋試薬は種々の物が挙げられる。そ
の一例と共に、修飾酵素の熱安定性試験結果を表３に示
した。また、下表に挙げた架橋試薬以外にも、ジスクニ
ミジルグルタレート（ＤＳＧ）、ジスクシニミジルタル
タレート（ＤＳＴ）等が挙げられる。
【００２１】架橋化試薬によるＧ６ＰＤの修飾反応条
件； Ｇ６ＰＤ ：ロイコノストック属由来 １．４ｍｇ蛋白／ｍｌ（約１０００Ｕ／ｍｌ） 架橋化試薬濃度：５ｍＭ 反応液組成 ：２０ｍＭ Ｋ−ＰＯ4緩衝液（ｐＨ７．０） ０．２ｍＭ ＮａＣｌ ０．５ｍＭ ＥＤＴＡ ０．０２％ ＮａＮ3 反応条件 ：２５℃、２０分間 反応停止剤 ：０．１Ｍ グリシン（ｐＨ７．０）を添加混合後、 １５分間静置する
件； Ｇ６ＰＤ ：ロイコノストック属由来 １．４ｍｇ蛋白／ｍｌ（約１０００Ｕ／ｍｌ） 架橋化試薬濃度：５ｍＭ 反応液組成 ：２０ｍＭ Ｋ−ＰＯ4緩衝液（ｐＨ７．０） ０．２ｍＭ ＮａＣｌ ０．５ｍＭ ＥＤＴＡ ０．０２％ ＮａＮ3 反応条件 ：２５℃、２０分間 反応停止剤 ：０．１Ｍ グリシン（ｐＨ７．０）を添加混合後、 １５分間静置する
【００２２】
【表３】 ──────────────────────────────────── Ｇ６ＰＤ修飾に用いた２価性 架橋化反応後の 修飾酵素の熱安定性 架橋試薬（反応液中５ｍＭで使用） 酵素活性回収率 （５０℃、２０分間） ──────────────────────────────────── 未修飾 １００％ ３８.５％ グルタルアルデヒド ９.７ ７１.５ ジメチルアジピン酸 ８７.５ ４０.６ ジメチルスベルイミデート ８１.２ ３９.２ ジスクニミジルスベレート ３３.９ ５０.５ ジチオビススキシニミジルプロ ＜＜１.０ −− ピオネート ジメチルジチオビスプロピオン ５８.３ ４２.２ イミデート エチレングリコビススクシニミ ＜＜１.０ −− ジルスクシネート ────────────────────────────────────
【００２３】以下に本発明を実施例にて更に詳しく説明
する。なお、本発明は実施例に限定されるものではな
い。
する。なお、本発明は実施例に限定されるものではな
い。
【００２４】
【実施例１】 １）ロイコノストック・メセンテロイデス由来精製Ｇ６
ＰＤ、６ｍｇ蛋白を２．４ｍｌの２０ｍＭ Ｋ−ＰＯ4
緩衝液（ｐＨ７．０、０．２ｍＭ ＮａＣｌ、０．５ｍ
Ｍ ＥＤＴＡを含む）に溶解した。ついで、ミキサーに
て激しく攪拌しながら最終濃度０．０５％になるように
１２μｌの１０％グルタルアルデヒド溶液）和光純薬社
製、電子顕微鏡用）を滴下した。その後、２５℃にて３
０分間静置した。
ＰＤ、６ｍｇ蛋白を２．４ｍｌの２０ｍＭ Ｋ−ＰＯ4
緩衝液（ｐＨ７．０、０．２ｍＭ ＮａＣｌ、０．５ｍ
Ｍ ＥＤＴＡを含む）に溶解した。ついで、ミキサーに
て激しく攪拌しながら最終濃度０．０５％になるように
１２μｌの１０％グルタルアルデヒド溶液）和光純薬社
製、電子顕微鏡用）を滴下した。その後、２５℃にて３
０分間静置した。
【００２５】２）先のグルタルアルデヒド反応液に対し
て等量の０．２Ｍ グリシン溶液（ｐＨ７．０）添加混
合し、架橋化反応を停止した。その後さらに３０分間静
置した。
て等量の０．２Ｍ グリシン溶液（ｐＨ７．０）添加混
合し、架橋化反応を停止した。その後さらに３０分間静
置した。
【００２６】３）最終的に淡黄色を呈した反応混合液か
ら、低分子量のものを除去するために、市販カラム（バ
イオラッド社製、Ｂｉｏｇｅｌ−１０ＤＧ）を用いて１
０ｍＭ Ｋ−ＰＯ4緩衝液（ｐＨ７．０、０．５ｍＭ
ＥＤＴＡ、０．０２％ＮａＮ3を含む）にて脱塩処理を
行った。
ら、低分子量のものを除去するために、市販カラム（バ
イオラッド社製、Ｂｉｏｇｅｌ−１０ＤＧ）を用いて１
０ｍＭ Ｋ−ＰＯ4緩衝液（ｐＨ７．０、０．５ｍＭ
ＥＤＴＡ、０．０２％ＮａＮ3を含む）にて脱塩処理を
行った。
【００２７】４）また、上記２）の段階のグルタルアル
デヒド架橋化反応混合液中には、架橋化反応が形成され
なかった未修飾酵素及び不十分な状態にあるものなどが
混在しているため、安定化されたＧ６ＰＤのみを得るこ
とを目的とし、上記２）の反応混合液に対して５５℃、
１５分間の熱処理を行った。
デヒド架橋化反応混合液中には、架橋化反応が形成され
なかった未修飾酵素及び不十分な状態にあるものなどが
混在しているため、安定化されたＧ６ＰＤのみを得るこ
とを目的とし、上記２）の反応混合液に対して５５℃、
１５分間の熱処理を行った。
【００２８】以降の実施例の中で上述３）の段階までの
ものを修飾酵素（＃１）と称し、架橋化反応後あわせて
熱処理を行ったものを修飾酵素（＃２、熱処理）と表記
することにした。
ものを修飾酵素（＃１）と称し、架橋化反応後あわせて
熱処理を行ったものを修飾酵素（＃２、熱処理）と表記
することにした。
【００２９】
【実施例２】グルタルアルデヒド修飾により安定化した
Ｇ６ＰＤの熱安定性の測定方法については下記の要領で
試験した。
Ｇ６ＰＤの熱安定性の測定方法については下記の要領で
試験した。
【００３０】 熱処理温度 ：４５、５０、５５℃ 熱処理時間 ：１５分間 添加酵素濃度 ：０．２Ｕ／ｍｌ 酵素熱処理用緩衝液 ：２０ｍＭ Ｋ−ＰＯ4（ｐＨ７．０） ０．５ｍＭ ＥＤＴＡ ０．２Ｍ ＮａＣｌ ０．１％ ＢＳＡ ０．０２％ ＮａＮ3 熱安定性度合の算出法：初期Ｇ６ＰＤ活性値に対する熱処理後の残存活性の割 合を各種処理温度に対して図示した。
【００３１】
【実施例３】実施例１で安定化した修飾Ｇ６ＰＤのＣＰ
Ｋ活性測定試薬組成中における保存安定性を下記の要領
で調査した。結果を図２に示した。
Ｋ活性測定試薬組成中における保存安定性を下記の要領
で調査した。結果を図２に示した。
【００３２】 保存温度 ：４℃及び３７℃ 保存日数 ：０、３、６、９日目にサンプリング 添加Ｇ６ＰＤ濃度 ：０．２Ｕ／ｍｌ 溶解用緩衝液 ：１００ｍＭ イミダゾール酢酸緩衝液（ｐＨ６．７） ２ｍＭ ＥＤＴＡ １０ｍＭ 酢酸マグネシウム 試薬組成 ：２．５ｍＭ ＡＤＰ ２５ｍＭ ＮＡＣ ６．２５ｍＭ ＡＭＰ １２．５μＭ ＡＰ5Ａ ２．５ｍＭ ＮＡＤＰ+ グルコース無添加もしくは、２０ｍＭ グルコース添加 熱安定性度合の算出法：初期Ｇ６ＰＤ活性値に対する保存活性の割合を保存日数 に対してプロットし、残存活性率から見た安定化Ｇ６Ｐ ＤＨの半減期を求める。
【００３３】
【実施例４】実施例１で安定化した修飾Ｇ６ＰＤのＣＰ
Ｋ活性測定時における追随酵素性能を下記の要領で調査
した。ＣＰＫ活性測定するために組み立てた試薬組成
は、臨床化学（１９９０）第１巻第２号１８５−２０８
ページ記載のＣＫ（クレアチンキナーゼ）活性を測定す
るための最終反応液組成に準じて行った。結果を図３に
示した。
Ｋ活性測定時における追随酵素性能を下記の要領で調査
した。ＣＰＫ活性測定するために組み立てた試薬組成
は、臨床化学（１９９０）第１巻第２号１８５−２０８
ページ記載のＣＫ（クレアチンキナーゼ）活性を測定す
るための最終反応液組成に準じて行った。結果を図３に
示した。
【００３４】 検体 ：市販コントロール血清 （Ｂａｘｔｅｒ社製 Ｍｏｎｉ−ＴｒｏｌｌＩＩ） 検体ブランク ：０．９％ ＮａＣｌ水溶液 測定機器 ：コーバスファラ 測定温度 ：３７℃ 検体と測定試薬との添加 ：検体：純水：第１試薬：第２試薬＝ 比率 ６： ４： ２４０：６０ （μｌ） ＣＰＫ活性値の算出 ：検体と測定試薬を添加混合し反応を開始させた後、 ２．５〜３．５分までの１分間におけるレートアッ セイから△Ａ３４０／ｍｉｎを求めた。 ＣＰＫ活性測定値とＧ６ ：反応開始からのタイムコースから求めた見かけの△ ＰＤＨ追随能との関係 Ａ３４０／ｍｉｎを第１試薬組成中に添加したＧ６ ＰＤＨ酵素量との関係としてプロットした。 ＣＰＫ活性測定試薬溶解 ：１００ｍＭ イミダゾール酢酸緩衝液（ｐＨ６．７ ） 緩衝液 ２ｍＭ ＥＤＴＡ １０ｍＭ 酢酸マグネシウム ２０ｍＭ グルコース 第１試薬 ：２．５ｍＭ ＡＤＰ ２５ｍＭ Ｎ−アセチルシステイン ６．２５ｍＭ ＡＭＰ １２．５μＭ ＡＰ5Ａ ２．５ｍＭ ＮＡＤＰ+ ３Ｕ／ｍＬ ＨＫ 第２試薬 ：１５０ｍＭ クレアチンリン酸
【００３５】
【実施例５】修飾Ｇ６ＰＤを用いたＣＰＫ活性測定時に
おける検量線を作成した。
おける検量線を作成した。
【００３６】 検体 ：ウサギ骨格筋由来クレアチンキナーゼ ２，０００Ｕ／Ｌに溶解したものを５段階希釈して用いた ＣＫ溶解緩衝液：１％ ＢＳＡ １０ｍＭ ＮＡＣ ０．０５％ ＮａＮ3 ５０ｍＭ Ｔｒｉｓ塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）
【００３７】ウサギ骨格筋由来クレアチンキナーゼを用
いたＣＰＫ検量線の作成に際しては、第１試薬組成中に
２Ｕ／ｍｌの安定化されたＧ６ＰＤを添加した。それ以
外のＣＰＫ活性測定条件は実施例４と同様に行った。結
果を図４に示した。
いたＣＰＫ検量線の作成に際しては、第１試薬組成中に
２Ｕ／ｍｌの安定化されたＧ６ＰＤを添加した。それ以
外のＣＰＫ活性測定条件は実施例４と同様に行った。結
果を図４に示した。
【００３８】
【発明の効果】本発明は、グルコース６リン酸を生成物
とする生体物質の測定方法に用いる液状臨床検査測定試
薬において、２価性架橋試薬にて化学修飾されたＧ６Ｐ
Ｄを用いることで、該酵素の安定性を顕著に向上させる
ことができる。
とする生体物質の測定方法に用いる液状臨床検査測定試
薬において、２価性架橋試薬にて化学修飾されたＧ６Ｐ
Ｄを用いることで、該酵素の安定性を顕著に向上させる
ことができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 グルタルアルデヒド架橋試薬によるロイコノ
ストックＧ６ＰＤの熱安定化を示す図表である。
ストックＧ６ＰＤの熱安定化を示す図表である。
【図２】 （イ）はグルコース無添加時の、（ロ）は２
０ｍＭ グルコース添加時の、架橋化処理により安定化
されたＧ６ＰＤのＣＰＫ活性測定試薬組成における保存
安定性を示す図表である。
０ｍＭ グルコース添加時の、架橋化処理により安定化
されたＧ６ＰＤのＣＰＫ活性測定試薬組成における保存
安定性を示す図表である。
【図３】 架橋化処理により安定化されたＧ６ＰＤのＣ
ＰＫ活性測定時における追随酵素性能を示す図表であ
る。
ＰＫ活性測定時における追随酵素性能を示す図表であ
る。
【図４】 架橋化処理により安定化されたＧ６ＰＤを用
いたＣＰＫ活性測定試薬の検量線を示す図表である。
いたＣＰＫ活性測定試薬の検量線を示す図表である。
Claims (3)
- 【請求項１】２価性架橋試薬にて化学修飾することを特
徴とする安定化されたグルコース６リン酸脱水素酵素 - 【請求項２】ロイコノストック属由来の酵素であること
を特徴とする請求項１記載の安定化されたグルコース６
リン酸脱水素酵素。 - 【請求項３】安定化されたグルコース６リン酸脱水素酵
素を用いたグルコース６リン酸脱水素酵素を生成物とす
る生体成分の測定方法および測定試薬。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP07245244A JP3143050B2 (ja) | 1995-08-31 | 1995-08-31 | 安定化されたグルコース６リン酸脱水素酵素 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP07245244A JP3143050B2 (ja) | 1995-08-31 | 1995-08-31 | 安定化されたグルコース６リン酸脱水素酵素 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0965877A true JPH0965877A (ja) | 1997-03-11 |
| JP3143050B2 JP3143050B2 (ja) | 2001-03-07 |
Family
ID=17130809
Family Applications (1)
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| JP (1) | JP3143050B2 (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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1995
- 1995-08-31 JP JP07245244A patent/JP3143050B2/ja not_active Expired - Fee Related
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|---|---|---|---|---|
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