JPH0967399A - 抗ｍｃｐ−１ヒトモノクローナル抗体 - Google Patents
抗ｍｃｐ−１ヒトモノクローナル抗体Info
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- JPH0967399A JPH0967399A JP7221794A JP22179495A JPH0967399A JP H0967399 A JPH0967399 A JP H0967399A JP 7221794 A JP7221794 A JP 7221794A JP 22179495 A JP22179495 A JP 22179495A JP H0967399 A JPH0967399 A JP H0967399A
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- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 単球やマクロファージの走化性のこう進と活
性化を促すヒトＭＣＰ−１に結合してその働きを抑制す
る抗ＭＣＰ−１ヒトモノクローナル抗体、および該ヒト
モノクローナル抗体を産生する細胞株、ならびに該ヒト
モノクローナル抗体を含有する炎症を伴う疾患に対する
薬剤を提供する。 【解決手段】 抗ヒトＭＣＰ−１抗体を産生するヒトリ
ンパ球をＥＢＶで形質転換し、得られた形質転換細胞と
ヒトミエローマ細胞とを融合することにより、抗ＭＣＰ
−１ヒトモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ株ＭＡ
０１を得る。 【効果】 本発明のヒトモノクローナル抗体は、単球や
マクロファージの走化性のこう進と活性化に関与するＭ
ＣＰ−１に結合してその働きを抑制し、かつヒト由来で
ある為、ヒトに対し有用な、炎症を伴う疾患の治療・予
防剤となり得る。
性化を促すヒトＭＣＰ−１に結合してその働きを抑制す
る抗ＭＣＰ−１ヒトモノクローナル抗体、および該ヒト
モノクローナル抗体を産生する細胞株、ならびに該ヒト
モノクローナル抗体を含有する炎症を伴う疾患に対する
薬剤を提供する。 【解決手段】 抗ヒトＭＣＰ−１抗体を産生するヒトリ
ンパ球をＥＢＶで形質転換し、得られた形質転換細胞と
ヒトミエローマ細胞とを融合することにより、抗ＭＣＰ
−１ヒトモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ株ＭＡ
０１を得る。 【効果】 本発明のヒトモノクローナル抗体は、単球や
マクロファージの走化性のこう進と活性化に関与するＭ
ＣＰ−１に結合してその働きを抑制し、かつヒト由来で
ある為、ヒトに対し有用な、炎症を伴う疾患の治療・予
防剤となり得る。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ヒトモノクローナ
ル抗体に関するものである。詳しくは、本発明はヒト単
球走化活性化因子（以下ヒトＭＣＰ−１と称する）に対
して結合する能力を有するヒトモノクローナル抗体、ま
たは該ヒトモノクローナル抗体を含有する医薬組成物に
関するものである。
ル抗体に関するものである。詳しくは、本発明はヒト単
球走化活性化因子（以下ヒトＭＣＰ−１と称する）に対
して結合する能力を有するヒトモノクローナル抗体、ま
たは該ヒトモノクローナル抗体を含有する医薬組成物に
関するものである。
【０００２】
【従来の技術】単球走化活性化因子（ＭＣＰ−１）は、
１９８９年にMatsushimaら及びYoshimuraらによりクロ
ーニングされた分子であり、単球やマクロファージに作
用してその走化性のこう進と活性化を促すサイトカイン
のひとつである（例えばOppenheimら: Annu. Rev. Immu
nol., 9, 617 (1991)）。炎症部位の拡大には、局所へ
の白血球の走化と浸潤が認められる。例えば特発性肺繊
維腫では、肺胞浸潤液中に単球やマクロファージの浸潤
が認められ、これが炎症部位の拡大に寄与していると考
えられている。この肺胞浸潤液中にはＭＣＰ−１の高発
現が認められ、特発性肺繊維腫のこう進にＭＣＰ−１が
影響するものと考えられている。子球体腎炎において
は、その病巣部位でＭＣＰ−１の高発現と単球やマクロ
ファージの浸潤が認められており、腎炎のこう進にＭＣ
Ｐ−１が関与していることが推定されている。また、動
脈硬化においては、酸化等の修飾を受けた低密度リポ蛋
白質がマクロファージに取り込まれ、やがて泡沫化して
硬化巣を形成することが知られているが、このマクロフ
ァージの走化にＭＣＰ−１が関与していると考えられて
いる。
１９８９年にMatsushimaら及びYoshimuraらによりクロ
ーニングされた分子であり、単球やマクロファージに作
用してその走化性のこう進と活性化を促すサイトカイン
のひとつである（例えばOppenheimら: Annu. Rev. Immu
nol., 9, 617 (1991)）。炎症部位の拡大には、局所へ
の白血球の走化と浸潤が認められる。例えば特発性肺繊
維腫では、肺胞浸潤液中に単球やマクロファージの浸潤
が認められ、これが炎症部位の拡大に寄与していると考
えられている。この肺胞浸潤液中にはＭＣＰ−１の高発
現が認められ、特発性肺繊維腫のこう進にＭＣＰ−１が
影響するものと考えられている。子球体腎炎において
は、その病巣部位でＭＣＰ−１の高発現と単球やマクロ
ファージの浸潤が認められており、腎炎のこう進にＭＣ
Ｐ−１が関与していることが推定されている。また、動
脈硬化においては、酸化等の修飾を受けた低密度リポ蛋
白質がマクロファージに取り込まれ、やがて泡沫化して
硬化巣を形成することが知られているが、このマクロフ
ァージの走化にＭＣＰ−１が関与していると考えられて
いる。
【０００３】この様に、ＭＣＰ−１は単球及びマクロフ
ァージに作用して、炎症局所への走化性のこう進と活性
化を促す役割を担っており、いくつかの炎症反応の進展
に関わっていると考えられている。従って、ＭＣＰ−１
の作用を抑制するような物質がこれら炎症反応の予防あ
るいは治療に役立てられると考えられ、ＭＣＰ−１に対
するモノクローナル抗体はそのひとつの候補と考えられ
る。ＭＣＰ−１に対して結合するマウスモノクローナル
抗体は、例えばYoshimuraら（Yoshimuraら: J. Immuno
l., 147, 2229 (1991)）あるいは特開平６−２０５６９
０号公報に記載されている。すなわち、抗原としてヒト
ＭＣＰ−１をマウスに免疫した後、そのマウスから得ら
れた脾臓細胞とミエローマ細胞とを細胞融合してハイブ
リドーマを作製し、該ハイブリドーマから抗ＭＣＰ−１
マウスモノクローナル抗体を得ている。しかし、これら
の報告では、ヒト以外の動物由来の抗ＭＣＰ−１モノク
ローナル抗体は記載されているものの、ヒト由来の抗Ｍ
ＣＰ−１モノクローナル抗体に関しては何等記載されて
いない。
ァージに作用して、炎症局所への走化性のこう進と活性
化を促す役割を担っており、いくつかの炎症反応の進展
に関わっていると考えられている。従って、ＭＣＰ−１
の作用を抑制するような物質がこれら炎症反応の予防あ
るいは治療に役立てられると考えられ、ＭＣＰ−１に対
するモノクローナル抗体はそのひとつの候補と考えられ
る。ＭＣＰ−１に対して結合するマウスモノクローナル
抗体は、例えばYoshimuraら（Yoshimuraら: J. Immuno
l., 147, 2229 (1991)）あるいは特開平６−２０５６９
０号公報に記載されている。すなわち、抗原としてヒト
ＭＣＰ−１をマウスに免疫した後、そのマウスから得ら
れた脾臓細胞とミエローマ細胞とを細胞融合してハイブ
リドーマを作製し、該ハイブリドーマから抗ＭＣＰ−１
マウスモノクローナル抗体を得ている。しかし、これら
の報告では、ヒト以外の動物由来の抗ＭＣＰ−１モノク
ローナル抗体は記載されているものの、ヒト由来の抗Ｍ
ＣＰ−１モノクローナル抗体に関しては何等記載されて
いない。
【０００４】ヒト以外の動物由来の抗体は、ヒトに対し
て投与した場合異物として認識され、その結果種々の抗
体反応が起こり、投与した動物抗体に対する抗体が形成
される。この抗体反応は、投与した抗体自体の反応性を
減少させると同時に、ヒト血中での半減期を著しく短縮
させる。例えばマウスモノクローナル抗体をヒトに投与
すると、抗マウス抗体反応（ＨＡＭＡ）が生じる。ＨＡ
ＭＡを減ずる方策として、マウスモノクローナル抗体の
抗原結合部位とあるヒト抗体の定常部位を組み換えて、
キメラ抗体あるいはヒト化抗体を作製する試みがなされ
ている。しかし、この方法においてもやはりマウス抗体
に由来する成分がヒト体内で抗原として認識されるた
め、ＨＡＭＡの問題は完全に回避できない。このため、
完全なヒトモノクローナル抗体が有用であろうと期待さ
れる。
て投与した場合異物として認識され、その結果種々の抗
体反応が起こり、投与した動物抗体に対する抗体が形成
される。この抗体反応は、投与した抗体自体の反応性を
減少させると同時に、ヒト血中での半減期を著しく短縮
させる。例えばマウスモノクローナル抗体をヒトに投与
すると、抗マウス抗体反応（ＨＡＭＡ）が生じる。ＨＡ
ＭＡを減ずる方策として、マウスモノクローナル抗体の
抗原結合部位とあるヒト抗体の定常部位を組み換えて、
キメラ抗体あるいはヒト化抗体を作製する試みがなされ
ている。しかし、この方法においてもやはりマウス抗体
に由来する成分がヒト体内で抗原として認識されるた
め、ＨＡＭＡの問題は完全に回避できない。このため、
完全なヒトモノクローナル抗体が有用であろうと期待さ
れる。
【０００５】一方、ヒトの血清中にＭＣＰ−１と結合す
るポリクローナル抗体が存在することが、Sylvesterら
（Sylvesterら: J. Immunol., 151, 3292 (1993)）によ
り報告されている。しかし、この中においてもヒトポリ
クローナル抗体に関しては記載されているものの、ヒト
モノクローナル抗体については何等記載されていない。
るポリクローナル抗体が存在することが、Sylvesterら
（Sylvesterら: J. Immunol., 151, 3292 (1993)）によ
り報告されている。しかし、この中においてもヒトポリ
クローナル抗体に関しては記載されているものの、ヒト
モノクローナル抗体については何等記載されていない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、抗Ｍ
ＣＰ−１ヒトモノクローナル抗体を提供することであ
る。詳しくは、単球やマクロファージの走化性のこう進
と活性化を促すＭＣＰ−１に結合してＭＣＰ−１の働き
を抑制する、ヒトモノクローナル抗体を提供することで
ある。また本発明の他の目的は、炎症反応に関与するＭ
ＣＰ−１に結合することにより、単球やマクロファージ
の関与する炎症を伴う疾患に対する治療、予防剤として
期待される薬剤を提供することである。
ＣＰ−１ヒトモノクローナル抗体を提供することであ
る。詳しくは、単球やマクロファージの走化性のこう進
と活性化を促すＭＣＰ−１に結合してＭＣＰ−１の働き
を抑制する、ヒトモノクローナル抗体を提供することで
ある。また本発明の他の目的は、炎症反応に関与するＭ
ＣＰ−１に結合することにより、単球やマクロファージ
の関与する炎症を伴う疾患に対する治療、予防剤として
期待される薬剤を提供することである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決するために鋭意検討を行った結果、ヒトリンパ球
よりヒトＭＣＰ−１に結合するヒトモノクローナル抗体
を取得できることを見いだし、本発明を解決するに至っ
た。すなわち本発明は、ヒトＭＣＰ−１に結合するヒト
モノクローナル抗体を提供するものであり、単球やマク
ロファージの関与する炎症反応を伴う疾患の治療、予防
剤として期待される新規な薬剤を提供するものである。
を解決するために鋭意検討を行った結果、ヒトリンパ球
よりヒトＭＣＰ−１に結合するヒトモノクローナル抗体
を取得できることを見いだし、本発明を解決するに至っ
た。すなわち本発明は、ヒトＭＣＰ−１に結合するヒト
モノクローナル抗体を提供するものであり、単球やマク
ロファージの関与する炎症反応を伴う疾患の治療、予防
剤として期待される新規な薬剤を提供するものである。
【０００８】
【発明の実施の形態】本発明のモノクローナル抗体は、
ヒトリンパ球に由来するヒトモノクローナル抗体であ
る。本発明のヒトモノクローナル抗体のグロブリンタイ
プは、ＭＣＰ−１との結合性を有する限り特に制限され
ないが、例えばＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、Ｉｇ
Ｄ等が挙げられる。本発明のヒトモノクローナル抗体
は、ヒトモノクローナル抗体を産生する細胞株から得ら
れるものの他に、酵素消化や遺伝子組み換え等により作
製したフラグメント、他の蛋白質あるいは因子との融合
体蛋白質であって、ヒトＭＣＰ−１との結合を有する限
り本発明の範疇である。また、ヒトＭＣＰ−１との結合
性を損なわない限り、遺伝子組み換えによる改変も可能
である。
ヒトリンパ球に由来するヒトモノクローナル抗体であ
る。本発明のヒトモノクローナル抗体のグロブリンタイ
プは、ＭＣＰ−１との結合性を有する限り特に制限され
ないが、例えばＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、Ｉｇ
Ｄ等が挙げられる。本発明のヒトモノクローナル抗体
は、ヒトモノクローナル抗体を産生する細胞株から得ら
れるものの他に、酵素消化や遺伝子組み換え等により作
製したフラグメント、他の蛋白質あるいは因子との融合
体蛋白質であって、ヒトＭＣＰ−１との結合を有する限
り本発明の範疇である。また、ヒトＭＣＰ−１との結合
性を損なわない限り、遺伝子組み換えによる改変も可能
である。
【０００９】本発明のヒトモノクローナル抗体を産生す
る細胞株は、抗ＭＣＰ−１ヒトモノクローナル抗体を産
生する限り特に限定はないが、抗ヒトＭＣＰ−１抗体を
産生するヒトリンパ球をエプスタイン・バー・ウイルス
（ＥＢＶ）で形質転換して得ることができ、更にこの形
質転換細胞とヒトミエローマ細胞とを細胞融合したハイ
ブリドーマとして得ることができる。また、抗ヒトＭＣ
Ｐ−１抗体を産生するヒトリンパ球とヒトミエローマ細
胞とを細胞融合したハイブリドーマとして得ることもで
きる。さらに、ヒトリンパ球から抗体遺伝子を取り出し
て、これを適当なベクターに組み込むことにより産生細
胞を作製しても良い。このような抗ＭＣＰ−１ヒトモノ
クローナル抗体産生細胞株の例としては、例えばハイブ
リドーマ株ＭＡ０１（ＦＥＲＭ Ｐ−１５０５２）があ
げられる。
る細胞株は、抗ＭＣＰ−１ヒトモノクローナル抗体を産
生する限り特に限定はないが、抗ヒトＭＣＰ−１抗体を
産生するヒトリンパ球をエプスタイン・バー・ウイルス
（ＥＢＶ）で形質転換して得ることができ、更にこの形
質転換細胞とヒトミエローマ細胞とを細胞融合したハイ
ブリドーマとして得ることができる。また、抗ヒトＭＣ
Ｐ−１抗体を産生するヒトリンパ球とヒトミエローマ細
胞とを細胞融合したハイブリドーマとして得ることもで
きる。さらに、ヒトリンパ球から抗体遺伝子を取り出し
て、これを適当なベクターに組み込むことにより産生細
胞を作製しても良い。このような抗ＭＣＰ−１ヒトモノ
クローナル抗体産生細胞株の例としては、例えばハイブ
リドーマ株ＭＡ０１（ＦＥＲＭ Ｐ−１５０５２）があ
げられる。
【００１０】本発明のヒトモノクローナル抗体を産生す
る細胞を得るための、抗ヒトＭＣＰ−１抗体を産生する
ヒトリンパ球は、ヒト末梢血やリンパ節等から取得でき
る。ヒト生体内に存在し、ヒトＭＣＰ−１と結合できる
抗体を作り得るリンパ球であれば本発明に用いることが
できる。通常、マウスやウサギ等でモノクローナル抗体
やポリクローナル抗体を取得する際に行われるＭＣＰ−
１の免疫は、必要がない。
る細胞を得るための、抗ヒトＭＣＰ−１抗体を産生する
ヒトリンパ球は、ヒト末梢血やリンパ節等から取得でき
る。ヒト生体内に存在し、ヒトＭＣＰ−１と結合できる
抗体を作り得るリンパ球であれば本発明に用いることが
できる。通常、マウスやウサギ等でモノクローナル抗体
やポリクローナル抗体を取得する際に行われるＭＣＰ−
１の免疫は、必要がない。
【００１１】本発明のヒトモノクローナル抗体の調製
は、上記の抗ＭＣＰ−１ヒトモノクローナル抗体を産生
する細胞株を各種公知の方法を用いて培養・精製すれば
よく、細胞の増殖及びＭＣＰ−１ヒトモノクローナル抗
体の産生を阻害しないものであれば特に制限はない。
は、上記の抗ＭＣＰ−１ヒトモノクローナル抗体を産生
する細胞株を各種公知の方法を用いて培養・精製すれば
よく、細胞の増殖及びＭＣＰ−１ヒトモノクローナル抗
体の産生を阻害しないものであれば特に制限はない。
【００１２】本発明の抗ＭＣＰ−１ヒトモノクローナル
抗体を含有する薬剤は、単球及びマクロファージの関与
する炎症反応の関わる疾患、例えば特発性肺繊維腫、子
球体腎炎、動脈硬化等の予防や治療に有用となることが
期待される。
抗体を含有する薬剤は、単球及びマクロファージの関与
する炎症反応の関わる疾患、例えば特発性肺繊維腫、子
球体腎炎、動脈硬化等の予防や治療に有用となることが
期待される。
【００１３】
【実施例】以下実施例を示して本発明を説明するが、本
発明はこれに限られるものではない。 実施例１ 抗ＭＣＰ−１ヒトモノクローナル抗体の作製 ａ）ＥＢＶ形質転換 健常人より末梢血２０ｍｌを採取し、フィコール分離液
（大日本製薬）により血球分離を行い、ヒト単核球画分
を得た。これをＲＰＭＩ−１６４０培地（日水製薬）で
２度洗浄し、ヒト単核球３×１０7 個を調製した。遠心
分離（１，６００ｒｐｍ、６分間）によりペレットを
得、あらかじめ３７℃に保温したＢ９５−８細胞の培養
上清（Ｂ９５−８細胞を、２０％牛胎児血清（ＦＣＳ）
を含むＲＰＭＩ−１６４０培地で培養したときの培養上
清）３０ｍｌを加えて再懸濁した。３７℃の炭酸ガスイ
ンキュベーターに移し、９０分間保温してＥＢＶを感染
させた。遠心分離（１，６００ｒｐｍ、６分間）により
ペレットを得、該ペレットを２０％ＦＣＳを含むＲＰＭ
Ｉ−１６４０培地６０ｍｌに懸濁し、懸濁液を９６穴プ
レート（Corning）６枚に分注した。３７℃の炭酸ガス
インキュベーターに移し、３〜５日毎に半量ずつ培地交
換を行いながら培養した。
発明はこれに限られるものではない。 実施例１ 抗ＭＣＰ−１ヒトモノクローナル抗体の作製 ａ）ＥＢＶ形質転換 健常人より末梢血２０ｍｌを採取し、フィコール分離液
（大日本製薬）により血球分離を行い、ヒト単核球画分
を得た。これをＲＰＭＩ−１６４０培地（日水製薬）で
２度洗浄し、ヒト単核球３×１０7 個を調製した。遠心
分離（１，６００ｒｐｍ、６分間）によりペレットを
得、あらかじめ３７℃に保温したＢ９５−８細胞の培養
上清（Ｂ９５−８細胞を、２０％牛胎児血清（ＦＣＳ）
を含むＲＰＭＩ−１６４０培地で培養したときの培養上
清）３０ｍｌを加えて再懸濁した。３７℃の炭酸ガスイ
ンキュベーターに移し、９０分間保温してＥＢＶを感染
させた。遠心分離（１，６００ｒｐｍ、６分間）により
ペレットを得、該ペレットを２０％ＦＣＳを含むＲＰＭ
Ｉ−１６４０培地６０ｍｌに懸濁し、懸濁液を９６穴プ
レート（Corning）６枚に分注した。３７℃の炭酸ガス
インキュベーターに移し、３〜５日毎に半量ずつ培地交
換を行いながら培養した。
【００１４】ｂ）抗体産生の確認 上記ａ）の培養から２０日後にコロニー形成の確認され
たウエルについて、培養上清中の抗体活性をヒトＭＣＰ
−１を抗原として用いたドット・イムノバインディング
アッセイ（ＤＩＢＡ）法により測定した。リコンビナン
ト・ヒトＭＣＰ−１（PeproTech）を５０μｇ／ｍｌ濃
度に水に溶解した。これをグリッド付のニトロセルロー
ス膜（トーヨー）に０．２μｌずつスポットした後風乾
し、固定化抗原とした。固定化抗原を、ブロック液（１
０％ＦＣＳを含む生理的塩濃度のトリス塩酸緩衝液（Ｔ
ＢＳ））でブロッキングした。サンプルとなる培養液５
０μｌを９６穴Ｕ底プレートに取り、これにブロッキン
グした固定化抗原を入れ、室温で２時間振とうした。Ｔ
ＢＳでウエルを洗浄後、パーオキシダーゼ標識抗ヒトイ
ムノグロブリン抗体（DAKO）をブロック液で５００倍に
希釈してウエルあたり５０μｌずつ添加し、室温で２時
間振とうした。ウエルをＴＢＳで洗浄後、コニカイムノ
ステイン（コニカ）により染色し、発色を肉眼で確認し
た。
たウエルについて、培養上清中の抗体活性をヒトＭＣＰ
−１を抗原として用いたドット・イムノバインディング
アッセイ（ＤＩＢＡ）法により測定した。リコンビナン
ト・ヒトＭＣＰ−１（PeproTech）を５０μｇ／ｍｌ濃
度に水に溶解した。これをグリッド付のニトロセルロー
ス膜（トーヨー）に０．２μｌずつスポットした後風乾
し、固定化抗原とした。固定化抗原を、ブロック液（１
０％ＦＣＳを含む生理的塩濃度のトリス塩酸緩衝液（Ｔ
ＢＳ））でブロッキングした。サンプルとなる培養液５
０μｌを９６穴Ｕ底プレートに取り、これにブロッキン
グした固定化抗原を入れ、室温で２時間振とうした。Ｔ
ＢＳでウエルを洗浄後、パーオキシダーゼ標識抗ヒトイ
ムノグロブリン抗体（DAKO）をブロック液で５００倍に
希釈してウエルあたり５０μｌずつ添加し、室温で２時
間振とうした。ウエルをＴＢＳで洗浄後、コニカイムノ
ステイン（コニカ）により染色し、発色を肉眼で確認し
た。
【００１５】ｃ）細胞融合 上記ｂ）において抗体活性の確認されたウエルの細胞
を、６穴プレートまで拡大培養した。２×１０6 個の細
胞と、あらかじめ２０％ＦＣＳを含むＩＭＤＭ培地で培
養したＳＨＭ−Ｄ３３（ＡＴＣＣより入手）１×１０6
個を遠心チューブに集め、遠心分離（１，６００ｒｐ
ｍ、６分間）によりペレットを得た。このペレットを細
胞融合用培地（０．２５Ｍマンニトール、０．１ｍＭ塩
化カルシウム、０．１ｍＭ塩化マグネシウム、０．２ｍ
Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．２））で２度洗浄して再
びペレットを得た後、ペレットを細胞融合用培地０．４
ｍｌに再懸濁し、電気融合法（融合装置：島津ＳＳＨ−
１、融合チャンバー：島津ＦＴＣ−０２）により細胞融
合を行った。融合条件は、交流高周波電界：１ＭＨｚ、
４０Ｖ、１０秒、直流パルス電界：２．３ｋＶ／ｃｍ、
４０μｓ、１０秒。融合後の細胞は、ＨＡＴ（三光純
薬）と１μＭウアバイン、２０％ＦＣＳ、５μｇ／ｍｌ
ヒト・トランスフェリン、８μｇ／ｍｌウシ・インスリ
ン、５０ｍＭ２−メルカプトエタノールを含むＩＭＤＭ
培地に懸濁し、９６穴プレートに播種した。３７℃炭酸
ガスインキュベーターに移し、３〜５日毎に半量ずつ培
地交換を行いながら培養した。１４〜２０日後、コロニ
ー形成の確認されたウエルについて、培養上清中の抗体
活性を上記ｂ）に記載のＤＩＢＡ法で確認した。活性の
確認できた細胞については限界希釈法によるクローニン
グを３度行い、抗ＭＣＰ−１ヒトモノクローナル抗体産
生ハイブリドーマ株を得た。ハイブリドーマ株のうち１
つをＭＡ０１として取得した。このハイブリドーマ株Ｍ
Ａ０１は、茨城県つくば市東１丁目１番３号の通商産業
省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託番号ＦＥＲ
Ｍ Ｐ−１５０５２として寄託されている。
を、６穴プレートまで拡大培養した。２×１０6 個の細
胞と、あらかじめ２０％ＦＣＳを含むＩＭＤＭ培地で培
養したＳＨＭ−Ｄ３３（ＡＴＣＣより入手）１×１０6
個を遠心チューブに集め、遠心分離（１，６００ｒｐ
ｍ、６分間）によりペレットを得た。このペレットを細
胞融合用培地（０．２５Ｍマンニトール、０．１ｍＭ塩
化カルシウム、０．１ｍＭ塩化マグネシウム、０．２ｍ
Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．２））で２度洗浄して再
びペレットを得た後、ペレットを細胞融合用培地０．４
ｍｌに再懸濁し、電気融合法（融合装置：島津ＳＳＨ−
１、融合チャンバー：島津ＦＴＣ−０２）により細胞融
合を行った。融合条件は、交流高周波電界：１ＭＨｚ、
４０Ｖ、１０秒、直流パルス電界：２．３ｋＶ／ｃｍ、
４０μｓ、１０秒。融合後の細胞は、ＨＡＴ（三光純
薬）と１μＭウアバイン、２０％ＦＣＳ、５μｇ／ｍｌ
ヒト・トランスフェリン、８μｇ／ｍｌウシ・インスリ
ン、５０ｍＭ２−メルカプトエタノールを含むＩＭＤＭ
培地に懸濁し、９６穴プレートに播種した。３７℃炭酸
ガスインキュベーターに移し、３〜５日毎に半量ずつ培
地交換を行いながら培養した。１４〜２０日後、コロニ
ー形成の確認されたウエルについて、培養上清中の抗体
活性を上記ｂ）に記載のＤＩＢＡ法で確認した。活性の
確認できた細胞については限界希釈法によるクローニン
グを３度行い、抗ＭＣＰ−１ヒトモノクローナル抗体産
生ハイブリドーマ株を得た。ハイブリドーマ株のうち１
つをＭＡ０１として取得した。このハイブリドーマ株Ｍ
Ａ０１は、茨城県つくば市東１丁目１番３号の通商産業
省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託番号ＦＥＲ
Ｍ Ｐ−１５０５２として寄託されている。
【００１６】ｄ）抗体の精製 ハイブリドーマ株ＭＡ０１を無血清培地ＳＦＭ−１０１
（日水製薬）で培養し、培養上清３５０ｍｌを取得し
た。この培養上清に対し５０％飽和硫酸アンモニウム分
画を行った後、生理的塩濃度のリン酸緩衝液（ＰＢＳ）
に再溶解した。これを０．２μｍのフィルターで濾過
後、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム（ファルマシア）を
用いて精製した。得られた抗体画分は、限外濾過膜（３
０ｋ分画、フジフィルター）により濃縮し、無菌的にフ
ィルター濾過（０．２μｍ）後小分けし、使用時まで−
８０℃に凍結保存した。
（日水製薬）で培養し、培養上清３５０ｍｌを取得し
た。この培養上清に対し５０％飽和硫酸アンモニウム分
画を行った後、生理的塩濃度のリン酸緩衝液（ＰＢＳ）
に再溶解した。これを０．２μｍのフィルターで濾過
後、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム（ファルマシア）を
用いて精製した。得られた抗体画分は、限外濾過膜（３
０ｋ分画、フジフィルター）により濃縮し、無菌的にフ
ィルター濾過（０．２μｍ）後小分けし、使用時まで−
８０℃に凍結保存した。
【００１７】実施例２ サンドイッチＥＬＩＳＡ法によ
る液相でのヒトＭＣＰ−１抗原との結合性の確認 抗ＭＣＰ−１ウサギポリクローナル抗体（PeproTech）
を０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）で４μｇ／ｍｌに
希釈し、希釈液を９６穴プレート（Greiner）にウエル
あたり５０μｌずつ分注した。プレートを４℃で一晩放
置し、抗体固定化プレートとした。このプレートを洗浄
液（０．０２％アジ化ナトリウム、０．０５％Ｔｗｅｅ
ｎ２０を含む１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．
０））で洗浄後、ブロック液（０．５％ウシ血清アルブ
ミンを含むＰＢＳ）でブロッキングした。一方、別の９
６穴Ｕ底プレート内で、ハイブリドーマ株ＭＡ０１より
精製した抗ＭＣＰ−１ヒトモノクローナル抗体２０及び
５μｇ／ｍｌとヒトＭＣＰ−１抗原（PeproTech）０〜
１００ｎｇ／ｍｌを混合し、室温で２時間振とうした。
反応物は、ブロッキングの終了した抗体固定化プレート
に移し、室温で２時間振とうした。洗浄液で洗浄後、ブ
ロック液で５００倍に希釈したアルカリホスファターゼ
標識抗ヒトＩｇＭ抗体（BIO SOURCE）をウエルあたり１
００μｌずつ分注し、室温で２時間振とうした。洗浄液
で洗浄後、基質溶液（０．６％ｐ−ニトロフェニルリン
酸、０．５ｍＭ塩化マグネシウムを含む９．６％ジエタ
ノールアミン緩衝液（ｐＨ９．６））５０μｌを加え、
室温で３０分振とうした。反応液に３Ｎ水酸化ナトリウ
ム５０μｌを加えて反応を停止した後、４０５ｎｍにお
ける吸光度をイムノリーダー（日本インターメッド）に
より測定した。その結果、図１（図１）に示す通り、ハ
イブリドーマ株ＭＡ０１より調製した抗体はヒトＭＣＰ
−１抗原量に依存して反応が認められた。同様の反応
を、反応特異性の異なるヒトＩｇＭ抗体（Rockland）を
抗ＭＣＰ−１ヒトモノクローナル抗体の代わりに用いた
場合、及びヒトモノクローナル抗体を用いなかった場合
（Ｃｏｎｔｒｏｌ）は、ヒトＭＣＰ−１と全く反応が認
められなかった。このことより、ハイブリドーマ株ＭＡ
０１の産生する抗ＭＣＰ−１ヒトモノクローナル抗体
は、ヒトＭＣＰ−１を液相で認識し、結合できることが
確認できた。
る液相でのヒトＭＣＰ−１抗原との結合性の確認 抗ＭＣＰ−１ウサギポリクローナル抗体（PeproTech）
を０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）で４μｇ／ｍｌに
希釈し、希釈液を９６穴プレート（Greiner）にウエル
あたり５０μｌずつ分注した。プレートを４℃で一晩放
置し、抗体固定化プレートとした。このプレートを洗浄
液（０．０２％アジ化ナトリウム、０．０５％Ｔｗｅｅ
ｎ２０を含む１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．
０））で洗浄後、ブロック液（０．５％ウシ血清アルブ
ミンを含むＰＢＳ）でブロッキングした。一方、別の９
６穴Ｕ底プレート内で、ハイブリドーマ株ＭＡ０１より
精製した抗ＭＣＰ−１ヒトモノクローナル抗体２０及び
５μｇ／ｍｌとヒトＭＣＰ−１抗原（PeproTech）０〜
１００ｎｇ／ｍｌを混合し、室温で２時間振とうした。
反応物は、ブロッキングの終了した抗体固定化プレート
に移し、室温で２時間振とうした。洗浄液で洗浄後、ブ
ロック液で５００倍に希釈したアルカリホスファターゼ
標識抗ヒトＩｇＭ抗体（BIO SOURCE）をウエルあたり１
００μｌずつ分注し、室温で２時間振とうした。洗浄液
で洗浄後、基質溶液（０．６％ｐ−ニトロフェニルリン
酸、０．５ｍＭ塩化マグネシウムを含む９．６％ジエタ
ノールアミン緩衝液（ｐＨ９．６））５０μｌを加え、
室温で３０分振とうした。反応液に３Ｎ水酸化ナトリウ
ム５０μｌを加えて反応を停止した後、４０５ｎｍにお
ける吸光度をイムノリーダー（日本インターメッド）に
より測定した。その結果、図１（図１）に示す通り、ハ
イブリドーマ株ＭＡ０１より調製した抗体はヒトＭＣＰ
−１抗原量に依存して反応が認められた。同様の反応
を、反応特異性の異なるヒトＩｇＭ抗体（Rockland）を
抗ＭＣＰ−１ヒトモノクローナル抗体の代わりに用いた
場合、及びヒトモノクローナル抗体を用いなかった場合
（Ｃｏｎｔｒｏｌ）は、ヒトＭＣＰ−１と全く反応が認
められなかった。このことより、ハイブリドーマ株ＭＡ
０１の産生する抗ＭＣＰ−１ヒトモノクローナル抗体
は、ヒトＭＣＰ−１を液相で認識し、結合できることが
確認できた。
【００１８】
【発明の効果】本発明により、ヒトＭＣＰ−１に対して
結合するヒトモノクローナル抗体が提供される。これ
は、単球やマクロファージの関与する炎症反応に深く関
わっていると考えられているヒトＭＣＰ−１に結合する
ことができるため、この様な炎症反応を伴う疾患に対す
る予防、治療効果が期待できる。さらに、これまで報告
されているＭＣＰ−１の特異的阻害剤である抗ＭＣＰ−
１マウスモノクローナル抗体と比べ、ヒトに投与する際
に抗原性の問題がないヒトモノクローナル抗体が示され
た。この様な特性から、本発明により提供される抗ＭＣ
Ｐ−１ヒトモノクローナル抗体を含有する薬剤は、ヒト
に対する有用な薬剤となることが期待される。
結合するヒトモノクローナル抗体が提供される。これ
は、単球やマクロファージの関与する炎症反応に深く関
わっていると考えられているヒトＭＣＰ−１に結合する
ことができるため、この様な炎症反応を伴う疾患に対す
る予防、治療効果が期待できる。さらに、これまで報告
されているＭＣＰ−１の特異的阻害剤である抗ＭＣＰ−
１マウスモノクローナル抗体と比べ、ヒトに投与する際
に抗原性の問題がないヒトモノクローナル抗体が示され
た。この様な特性から、本発明により提供される抗ＭＣ
Ｐ−１ヒトモノクローナル抗体を含有する薬剤は、ヒト
に対する有用な薬剤となることが期待される。
【図１】抗ＭＣＰ−１ヒトモノクローナル抗体の液相に
おけるヒトＭＣＰ−１抗原に対する結合性を示す図であ
る。図中、ＭＡ０１はハイブリドーマ株ＭＡ０１より精
製した抗ＭＣＰ−１ヒトモノクローナル抗体を、ＩｇＭ
はヒトＩｇＭ抗体（Rockland）であることを示してい
る。
おけるヒトＭＣＰ−１抗原に対する結合性を示す図であ
る。図中、ＭＡ０１はハイブリドーマ株ＭＡ０１より精
製した抗ＭＣＰ−１ヒトモノクローナル抗体を、ＩｇＭ
はヒトＩｇＭ抗体（Rockland）であることを示してい
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 里澤 昇 千葉県茂原市東郷1144番地 三井東圧化学 株式会社内 (72)発明者 渡邊 綾子 千葉県茂原市東郷1900番地の１ 三井東圧 化学株式会社内 (72)発明者 横松 知子 千葉県茂原市東郷1144番地 三井東圧化学 株式会社内
Claims (5)
- 【請求項１】 ヒト単球走化活性化因子（ヒトＭＣＰ−
１）に結合するヒトモノクローナル抗体。 - 【請求項２】 請求項１記載のヒトモノクローナル抗体
を産生する細胞株。 - 【請求項３】 ヒトモノクローナル抗体を産生するハイ
ブリドーマ株ＦＥＲＭ Ｐ−１５０５２。 - 【請求項４】 ハイブリドーマ株ＦＥＲＭ Ｐ−１５０
５２の産生するヒトモノクローナル抗体。 - 【請求項５】 請求項１または４記載のヒトモノクロー
ナル抗体を含有することを特徴とする医薬組成物。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7221794A JPH0967399A (ja) | 1995-08-30 | 1995-08-30 | 抗ｍｃｐ−１ヒトモノクローナル抗体 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7221794A JPH0967399A (ja) | 1995-08-30 | 1995-08-30 | 抗ｍｃｐ−１ヒトモノクローナル抗体 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0967399A true JPH0967399A (ja) | 1997-03-11 |
Family
ID=16772309
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7221794A Pending JPH0967399A (ja) | 1995-08-30 | 1995-08-30 | 抗ｍｃｐ−１ヒトモノクローナル抗体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0967399A (ja) |
Cited By (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002030464A1 (en) * | 2000-10-11 | 2002-04-18 | Daiichi Pharmaceutical Co., Ltd. | Novel drugs for liver diseases |
| WO2004024921A1 (ja) | 2002-09-12 | 2004-03-25 | Juridical Foundation The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute | ヒト抗ヒトｍｃｐ−１抗体及び該抗体フラグメント |
| EP1542724A4 (en) * | 2002-08-19 | 2005-10-19 | Abgenix Inc | ANTIBODIES AGAINST THE MONOCYTE 1 CHIMIOATTRACTIVE PROTEIN (MCP-1) AND USES THEREOF |
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| JP2009263396A (ja) * | 1998-02-27 | 2009-11-12 | Trustees Of The Univ Of Pennsylvania | ワクチン、免疫療法剤およびそれらの使用法 |
| EP2170387A4 (en) * | 2007-06-29 | 2011-01-19 | Centocor Ortho Biotech Inc | ANTI-MCP-1 ANTIBODIES, COMPOSITIONS, METHODS AND USES |
| US8114964B2 (en) | 2005-05-19 | 2012-02-14 | Centocor, Inc. | Anti-MCP-1 antibodies, compositions, methods and uses |
| CN104198727A (zh) * | 2014-08-22 | 2014-12-10 | 广西南宁隆吉维特生物科技有限公司 | 人血清ccl2酶联免疫检测试剂盒及其制备和使用方法 |
| WO2020213665A1 (ja) | 2019-04-17 | 2020-10-22 | 国立大学法人広島大学 | Ｉｌ－６阻害剤及びｃｃｒ２阻害剤を組み合わせて投与することを特徴とする泌尿器がんの治療剤 |
-
1995
- 1995-08-30 JP JP7221794A patent/JPH0967399A/ja active Pending
Cited By (21)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009263396A (ja) * | 1998-02-27 | 2009-11-12 | Trustees Of The Univ Of Pennsylvania | ワクチン、免疫療法剤およびそれらの使用法 |
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| US8431125B2 (en) | 2001-11-30 | 2013-04-30 | Biogen Idec Ma, Inc. | Methods of treating lupus nephritis using antibodies against monocyte chemotactic proteins |
| US7972597B2 (en) | 2001-11-30 | 2011-07-05 | Biogen Idec Ma, Inc. | Methods of reducing chemotaxis using antibodies against monocyte chemotactic proteins |
| US7632501B2 (en) | 2001-11-30 | 2009-12-15 | Biogen Idec Ma Inc. | Antibodies against monocyte chemotactic proteins |
| US7405277B2 (en) | 2001-11-30 | 2008-07-29 | Biogen Idec Ma Inc. | Antibodies against monocyte chemotactic proteins |
| AU2003265575B2 (en) * | 2002-08-19 | 2009-12-10 | Astrazeneca Ab | Antibodies directed to monocyte chemo-attractant protein-1 (MCP-1) and uses thereof |
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| US7342106B2 (en) | 2002-09-12 | 2008-03-11 | Judicial Foundation The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute | Human antihuman MCP-1 antibody and antibody fragment thereof |
| JPWO2004024921A1 (ja) * | 2002-09-12 | 2006-01-12 | 財団法人化学及血清療法研究所 | ヒト抗ヒトｍｃｐ−１抗体及び該抗体フラグメント |
| WO2004024921A1 (ja) | 2002-09-12 | 2004-03-25 | Juridical Foundation The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute | ヒト抗ヒトｍｃｐ−１抗体及び該抗体フラグメント |
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