JPH0940700A - モノクロナール抗体 - Google Patents
モノクロナール抗体Info
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- JPH0940700A JPH0940700A JP7212370A JP21237095A JPH0940700A JP H0940700 A JPH0940700 A JP H0940700A JP 7212370 A JP7212370 A JP 7212370A JP 21237095 A JP21237095 A JP 21237095A JP H0940700 A JPH0940700 A JP H0940700A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 ラット血栓分解産物中のＤ−ダイマーに対す
る特異的なモノクロナール抗体およびその抗体を利用す
る酵素免疫測定法を提供する。 【構成】 ラットＤ−ダイマーから分離したγ−γ鎖を
抗原として免疫された哺乳動物の細胞とミエローマ細胞
との融合細胞により生産され、ラットフィブリノーゲン
よりもラットＤ−ダイマーを強く認識する分子量７４キ
ロダルトンのモノクロナール抗体、およびそれを抗体と
して用いる酵素免疫測定法。 【効果】 本発明のモノクロナール抗体はラットフィブ
リノーゲンよりもラットＤ−ダイマーを強く認識できる
ので、これを用いる酵素免疫測定法によりラット血液中
のＤ−ダイマーを測定することができ、ラットを実験動
物とする血栓溶解剤の開発、研究に非常に有用である。
しかも融合細胞を培養することによりこのモノクロナー
ル抗体を量産することができる。
る特異的なモノクロナール抗体およびその抗体を利用す
る酵素免疫測定法を提供する。 【構成】 ラットＤ−ダイマーから分離したγ−γ鎖を
抗原として免疫された哺乳動物の細胞とミエローマ細胞
との融合細胞により生産され、ラットフィブリノーゲン
よりもラットＤ−ダイマーを強く認識する分子量７４キ
ロダルトンのモノクロナール抗体、およびそれを抗体と
して用いる酵素免疫測定法。 【効果】 本発明のモノクロナール抗体はラットフィブ
リノーゲンよりもラットＤ−ダイマーを強く認識できる
ので、これを用いる酵素免疫測定法によりラット血液中
のＤ−ダイマーを測定することができ、ラットを実験動
物とする血栓溶解剤の開発、研究に非常に有用である。
しかも融合細胞を培養することによりこのモノクロナー
ル抗体を量産することができる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はラットＤ−ダイマー（Ｄ
−ｄｉｍｅｒ）に対するモノクロナール抗体、その製造
方法及び利用方法に関する。
−ｄｉｍｅｒ）に対するモノクロナール抗体、その製造
方法及び利用方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】古くから、肺塞栓症、心筋梗塞など血栓
症により引き起こされる疾病は、生命を脅かすものが多
く、常に死因の上位を占めている。血栓の形成は、生体
内の血液凝固系が活性化され、血液凝固機序の結果生じ
たトロンビンによりフィブリン血栓が形成される。この
フィブリン血栓が線溶活性化の契機となり、フィブリン
はプラスミンによる加水分解を受けて可溶性のフィブリ
ン分解産物を血中に遊離する。この分解産物を総称して
ＦＤＰ（ｆｉｂｒｉｎ／ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎｄｅｇｒ
ａｄａｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔｓ）と呼んでいる。近
年、血漿の凝固、線溶系の活性を示すいくつかのマーカ
ーの測定法が臨床にも利用されてきたが、その中でもプ
ラスミンの作用によりフィブリンが分解される際の特異
産生物であるＤ−ダイマーを測定することは血液凝固・
線溶亢進状態のパラメーターのひとつとして重要であ
り、現在ヒトＤ−ダイマー測定試薬を用いる酵素免疫測
定法が実用化されている。
症により引き起こされる疾病は、生命を脅かすものが多
く、常に死因の上位を占めている。血栓の形成は、生体
内の血液凝固系が活性化され、血液凝固機序の結果生じ
たトロンビンによりフィブリン血栓が形成される。この
フィブリン血栓が線溶活性化の契機となり、フィブリン
はプラスミンによる加水分解を受けて可溶性のフィブリ
ン分解産物を血中に遊離する。この分解産物を総称して
ＦＤＰ（ｆｉｂｒｉｎ／ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎｄｅｇｒ
ａｄａｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔｓ）と呼んでいる。近
年、血漿の凝固、線溶系の活性を示すいくつかのマーカ
ーの測定法が臨床にも利用されてきたが、その中でもプ
ラスミンの作用によりフィブリンが分解される際の特異
産生物であるＤ−ダイマーを測定することは血液凝固・
線溶亢進状態のパラメーターのひとつとして重要であ
り、現在ヒトＤ−ダイマー測定試薬を用いる酵素免疫測
定法が実用化されている。
【０００３】
【発明の解決しようとする課題】新規血栓溶解剤を開発
するにあたり、効果がみられるからといってその医薬品
候補物質をすぐさま患者に投与することは許されない。
まずはヒトの病態に近い動物病態モデルを作成し、その
モデル動物による薬効の検討が不可欠である。しかし、
現在までに報告のあった抗フィブリノーゲン／フィブリ
ン抗体は、ヒト由来の抗原を用いて作製したものである
ため、モデルラット血漿中の血栓分解産物を正確に測定
できない。従って、ラット血栓分解物に特異的に反応す
るモノクロナール抗体を用い、放射線ラベルを用いる方
法のように特別の施設や計器を必要とせず、半減期や廃
棄物の心配もない極めて簡便かつ安全なモデル動物にお
ける血栓分解産物の検出方法が必要とされている。
するにあたり、効果がみられるからといってその医薬品
候補物質をすぐさま患者に投与することは許されない。
まずはヒトの病態に近い動物病態モデルを作成し、その
モデル動物による薬効の検討が不可欠である。しかし、
現在までに報告のあった抗フィブリノーゲン／フィブリ
ン抗体は、ヒト由来の抗原を用いて作製したものである
ため、モデルラット血漿中の血栓分解産物を正確に測定
できない。従って、ラット血栓分解物に特異的に反応す
るモノクロナール抗体を用い、放射線ラベルを用いる方
法のように特別の施設や計器を必要とせず、半減期や廃
棄物の心配もない極めて簡便かつ安全なモデル動物にお
ける血栓分解産物の検出方法が必要とされている。
【０００４】従来、ラットのＦＤＰは、セファデックス
Ｇ−１００を用いたゲルろ過と等電点電気泳動法によっ
て精製され、ヒトのＦＤＰと大変類似していることが示
されているが（Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ’ｓ Ｚｅｉ
ｔｓｃｈｒｉｆｔ ｆｕｅｒＰｈｙｓｉｏｌｏｇｉｓｃ
ｈｅ Ｃｈｅｍｉｅ ３６０，６３３−７（１９７
９））、ラット由来のフィブリン分解産物であるラット
Ｄ−ダイマーを測定する方法は現在開発されていない。
そこでラット血栓症モデルを用いての血栓溶解剤、血栓
再閉塞防止剤等の開発においてモデル動物体内での血液
凝固、線溶促進状態の重要なパラメーターとなるフィブ
リン分解産物ラットＤ−ダイマーを測定する方法を開発
する必要性が生じてきたが、従来の技術は、 131Ｉや
99mＴｃなどの放射線同位体でラベルした抗ヒトフィブ
リンモノクロナール抗体を用いてラットの血栓の検出が
検討されてきたにとどまっていた（Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉ
ｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５２，２６９−７８（１９８
８），Ｎｕｃｌｅａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ−Ｃｏｍｍｕ
ｎｉｃａｔｉｏｎｓ １０，６５３−９（１９８９），
Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｅｌｌｕｌｅｒ Ｂｉ
ｏｌｏｇｙ ７１，１１７−２４（１９９３））。
Ｇ−１００を用いたゲルろ過と等電点電気泳動法によっ
て精製され、ヒトのＦＤＰと大変類似していることが示
されているが（Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ’ｓ Ｚｅｉ
ｔｓｃｈｒｉｆｔ ｆｕｅｒＰｈｙｓｉｏｌｏｇｉｓｃ
ｈｅ Ｃｈｅｍｉｅ ３６０，６３３−７（１９７
９））、ラット由来のフィブリン分解産物であるラット
Ｄ−ダイマーを測定する方法は現在開発されていない。
そこでラット血栓症モデルを用いての血栓溶解剤、血栓
再閉塞防止剤等の開発においてモデル動物体内での血液
凝固、線溶促進状態の重要なパラメーターとなるフィブ
リン分解産物ラットＤ−ダイマーを測定する方法を開発
する必要性が生じてきたが、従来の技術は、 131Ｉや
99mＴｃなどの放射線同位体でラベルした抗ヒトフィブ
リンモノクロナール抗体を用いてラットの血栓の検出が
検討されてきたにとどまっていた（Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉ
ｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５２，２６９−７８（１９８
８），Ｎｕｃｌｅａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ−Ｃｏｍｍｕ
ｎｉｃａｔｉｏｎｓ １０，６５３−９（１９８９），
Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｅｌｌｕｌｅｒ Ｂｉ
ｏｌｏｇｙ ７１，１１７−２４（１９９３））。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、クエン酸
処理を行ったラット血漿に塩化カルシウムを添加し、フ
ィブリン血栓を作製、これをプラスミンで消化し、生じ
た分解産物の混合物から、主にフィブリン分解過程の終
期画分に現れるＤ−ダイマーを分離した。さらに、これ
を還元してα鎖、β鎖、γ−γ鎖の残鎖に分離し、その
うちフィブリンにのみ存在するクロスリンク結合を持っ
たγ−γ残鎖を精製した。これを材料として抗ラットＤ
−ダイマーモノクロナール抗体産生ハイブリドーマを作
製し、得られた細胞株、約２０００種の中から３株のラ
ットフィブリノーゲン抗原を認識するよりもフィブリン
の特異的分解産物である抗原をより強く認識するモノク
ロナール抗体を産生する株を樹立した。これらの細胞株
を利用して抗ラットＤ−ダイマー抗体を多量生産、精製
し、検討を重ねた結果、ラットＤ−ダイマーを選択的に
定量し得る酵素抗体法による測定法の確立に成功した。
処理を行ったラット血漿に塩化カルシウムを添加し、フ
ィブリン血栓を作製、これをプラスミンで消化し、生じ
た分解産物の混合物から、主にフィブリン分解過程の終
期画分に現れるＤ−ダイマーを分離した。さらに、これ
を還元してα鎖、β鎖、γ−γ鎖の残鎖に分離し、その
うちフィブリンにのみ存在するクロスリンク結合を持っ
たγ−γ残鎖を精製した。これを材料として抗ラットＤ
−ダイマーモノクロナール抗体産生ハイブリドーマを作
製し、得られた細胞株、約２０００種の中から３株のラ
ットフィブリノーゲン抗原を認識するよりもフィブリン
の特異的分解産物である抗原をより強く認識するモノク
ロナール抗体を産生する株を樹立した。これらの細胞株
を利用して抗ラットＤ−ダイマー抗体を多量生産、精製
し、検討を重ねた結果、ラットＤ−ダイマーを選択的に
定量し得る酵素抗体法による測定法の確立に成功した。
【０００６】本発明はこれらの知見に基くもので、ラッ
トＤ−ダイマーから分離したγ−γ鎖を抗原として免疫
された哺乳動物の細胞とミエローマ細胞との融合細胞に
より生産され、ラットフィブリノーゲンよりもラットＤ
−ダイマーを強く認識する分子量７４キロタルトンのモ
ノクロナール抗体、上記のモノクロナール抗体を抗体と
して用いることを特徴とするラットＤ−ダイマーの酵素
免疫測定法、および上記のモノクロナール抗体を産生す
る細胞融合株に関する。
トＤ−ダイマーから分離したγ−γ鎖を抗原として免疫
された哺乳動物の細胞とミエローマ細胞との融合細胞に
より生産され、ラットフィブリノーゲンよりもラットＤ
−ダイマーを強く認識する分子量７４キロタルトンのモ
ノクロナール抗体、上記のモノクロナール抗体を抗体と
して用いることを特徴とするラットＤ−ダイマーの酵素
免疫測定法、および上記のモノクロナール抗体を産生す
る細胞融合株に関する。
【０００７】本発明のモノクロナール抗体や融合細胞の
製造に必要なラットＤ−ダイマーのγ−γ残鎖は以下の
様にして得ることができる。先ずラットのクエン酸処理
血漿に塩化カルシウムを添加し、フィブリン血栓を作
製、これをプラスミンで消化し、セファロース６Ｂのゲ
ルろ過を行い、尿素で処理した後、セファデックスＧ−
１００のゲルろ過を行いＤ−ダイマーを分離する。さら
に還元、カルボキシメチル化を行い、ＣＭ−セルロース
のイオン交換クロマトを行ってγ−γ残鎖を得る。次に
上に得たＤ−ダイマー γ−γ残鎖を用いて、哺乳動
物、例えばＢａｌｂ／Ｃマウスのような動物を常法で免
疫し、その脾臓を摘出し、その中のリンパ球を精製した
後、予め培養したミエローマ細胞と融合させることによ
りＤ−ダイマーに対するモノクロナール抗体を産生する
ハイブリドーマが得られる。融合はポリエチレングリコ
ールやエレクトロポレーション等を用いて行うことがで
きる。ハイブリドーマ細胞の選択はアミノプテリン耐性
を利用したＨＡＴ培地を用いて行うことができる。抗体
産生能を有するハイブリドーマのスクリーニングはラッ
ト血漿から得たＤ−ダイマーを用いたイムノブロット法
で行うことができる。このようなスクリーニングには他
の免疫学的手法、即ちラジオイムノアッセイ、ラジオイ
ムノプレシピテーション、酵素免疫測定法等の方法も用
いられる。
製造に必要なラットＤ−ダイマーのγ−γ残鎖は以下の
様にして得ることができる。先ずラットのクエン酸処理
血漿に塩化カルシウムを添加し、フィブリン血栓を作
製、これをプラスミンで消化し、セファロース６Ｂのゲ
ルろ過を行い、尿素で処理した後、セファデックスＧ−
１００のゲルろ過を行いＤ−ダイマーを分離する。さら
に還元、カルボキシメチル化を行い、ＣＭ−セルロース
のイオン交換クロマトを行ってγ−γ残鎖を得る。次に
上に得たＤ−ダイマー γ−γ残鎖を用いて、哺乳動
物、例えばＢａｌｂ／Ｃマウスのような動物を常法で免
疫し、その脾臓を摘出し、その中のリンパ球を精製した
後、予め培養したミエローマ細胞と融合させることによ
りＤ−ダイマーに対するモノクロナール抗体を産生する
ハイブリドーマが得られる。融合はポリエチレングリコ
ールやエレクトロポレーション等を用いて行うことがで
きる。ハイブリドーマ細胞の選択はアミノプテリン耐性
を利用したＨＡＴ培地を用いて行うことができる。抗体
産生能を有するハイブリドーマのスクリーニングはラッ
ト血漿から得たＤ−ダイマーを用いたイムノブロット法
で行うことができる。このようなスクリーニングには他
の免疫学的手法、即ちラジオイムノアッセイ、ラジオイ
ムノプレシピテーション、酵素免疫測定法等の方法も用
いられる。
【０００８】本発明者らは以上述べたスクリーニングで
約２０００株の中から３株のフィブリノーゲンより強く
Ｄ−ダイマーを認識するモノクロナール抗体産生株を確
立した。またフィブリノーゲンおよびＤ−ダイマーを同
じ感度で認識する抗体産生株４株を得た。上記の株はい
ずれもマウス腹腔内でもよく生育し容易に大量の抗体を
得ることができる。これらの株のうちＲａｔ ＤＤ／２
Ｂ６およびＲａｔ ＤＤ／２８Ｅ９は工業技術院生命工
学工業技術研究所に寄託され、それぞれＰ−１４９９５
およびＰ−１４９９６の受託番号を与えられている。
約２０００株の中から３株のフィブリノーゲンより強く
Ｄ−ダイマーを認識するモノクロナール抗体産生株を確
立した。またフィブリノーゲンおよびＤ−ダイマーを同
じ感度で認識する抗体産生株４株を得た。上記の株はい
ずれもマウス腹腔内でもよく生育し容易に大量の抗体を
得ることができる。これらの株のうちＲａｔ ＤＤ／２
Ｂ６およびＲａｔ ＤＤ／２８Ｅ９は工業技術院生命工
学工業技術研究所に寄託され、それぞれＰ−１４９９５
およびＰ−１４９９６の受託番号を与えられている。
【０００９】これらの株の生産する抗体はよく知られた
精製法、例えば塩析、イオン交換、プロテインＡやプロ
テインＧを用いたアフィニティークロマトグラフなどで
高純度に精製することができる。
精製法、例えば塩析、イオン交換、プロテインＡやプロ
テインＧを用いたアフィニティークロマトグラフなどで
高純度に精製することができる。
【００１０】その抗体を用いる酵素免疫測定法は、たと
えば、試料中に含有されるラットＤ−ダイマーを固定化
し、これに上記のモノクロナール抗体を作用させ、その
作用量を酵素標識法により測定することを特徴とするラ
ットＤ−ダイマーの酵素免疫測定法、および１部のモノ
クロナール抗体を酵素標識し、サンドイッチ法によって
試料中に含まれるラットＤ−ダイマーを測定することを
特徴とする酵素免疫測定法を包含する。
えば、試料中に含有されるラットＤ−ダイマーを固定化
し、これに上記のモノクロナール抗体を作用させ、その
作用量を酵素標識法により測定することを特徴とするラ
ットＤ−ダイマーの酵素免疫測定法、および１部のモノ
クロナール抗体を酵素標識し、サンドイッチ法によって
試料中に含まれるラットＤ−ダイマーを測定することを
特徴とする酵素免疫測定法を包含する。
【００１１】抗体はそのまま用いてもよく、或いは抗体
をペプシンまたはパパインで消化することにより得られ
るＦａｂ’またはＦａｂを用いて酵素免疫測定法の系を
組むこともできる。その際に抗体に直接、酵素たとえば
アルカリフォスファターゼやペルオキシダーゼを結合さ
せて得られる酵素標識抗体を用いてもよく、或いは抗マ
ウスＩｇＧ抗体などを酵素標識したものを二次抗体とし
て用いてもよい。このような方法を組み合わせることに
より、前記Ｄ−ダイマー特異モノクロナール抗体産生株
の培養上清から得られたモノクロナール抗体を利用して
ラットの血液中のＤ−ダイマーを特異的に測定すること
ができる。サンドイッチ型酵素免疫測定法においてはモ
ノクロナール抗体をビオチンにより標識し、酵素標識ス
トレプトアビジンを作用させてラットＤ−ダイマーをフ
ィブリノーゲンの交差なしに特異的に測定することがで
きる。
をペプシンまたはパパインで消化することにより得られ
るＦａｂ’またはＦａｂを用いて酵素免疫測定法の系を
組むこともできる。その際に抗体に直接、酵素たとえば
アルカリフォスファターゼやペルオキシダーゼを結合さ
せて得られる酵素標識抗体を用いてもよく、或いは抗マ
ウスＩｇＧ抗体などを酵素標識したものを二次抗体とし
て用いてもよい。このような方法を組み合わせることに
より、前記Ｄ−ダイマー特異モノクロナール抗体産生株
の培養上清から得られたモノクロナール抗体を利用して
ラットの血液中のＤ−ダイマーを特異的に測定すること
ができる。サンドイッチ型酵素免疫測定法においてはモ
ノクロナール抗体をビオチンにより標識し、酵素標識ス
トレプトアビジンを作用させてラットＤ−ダイマーをフ
ィブリノーゲンの交差なしに特異的に測定することがで
きる。
【００１２】
【実施例】以下に実施例を挙げて本発明をさらに説明す
る。
る。
【００１３】実施例１ ラット血漿に塩化カルシウムを添加し、フィブリン網
（安定化フィブリン）を形成させた。ヒトプラスミン及
び、組織プラスミノーゲンアクティベータを添加し、フ
ィブリンを分解した後、セファロース６Ｂ（ファルマシ
ア社製）でゲルろ過し、安定化フィブリンの最終分解産
物であるＤ−ダイマーを含む画分に最終濃度が３Ｍにな
るように尿素を添加しｐＨ５．５に調整、３７℃で４時
間放置後、セファデックスＧ−１００（ファルマシア社
製）でゲルろ過した。溶出液にβ−メルカプトエタノー
ルを添加し反応させた後、ヨード酢酸を添加して、カル
ボキシメチル化を行い、ＣＭ−５２（ワットマン社製）
のイオン交換樹脂で精製し、分子量７４キロダルトンの
γ−γ鎖残査画分を得た（図１）。
（安定化フィブリン）を形成させた。ヒトプラスミン及
び、組織プラスミノーゲンアクティベータを添加し、フ
ィブリンを分解した後、セファロース６Ｂ（ファルマシ
ア社製）でゲルろ過し、安定化フィブリンの最終分解産
物であるＤ−ダイマーを含む画分に最終濃度が３Ｍにな
るように尿素を添加しｐＨ５．５に調整、３７℃で４時
間放置後、セファデックスＧ−１００（ファルマシア社
製）でゲルろ過した。溶出液にβ−メルカプトエタノー
ルを添加し反応させた後、ヨード酢酸を添加して、カル
ボキシメチル化を行い、ＣＭ−５２（ワットマン社製）
のイオン交換樹脂で精製し、分子量７４キロダルトンの
γ−γ鎖残査画分を得た（図１）。
【００１４】
【図１】
【００１５】次にＢａｌｂ／Ｃマウス（日本ＳＬＣ）に
上記方法で得たγ−γ鎖残査５０μｇをフロイント完全
アジュバンド（ディフコ社製）で乳化した上で、腹腔に
投与した。２週間後及び４週間後にフロイント不完全ア
ジュバンド（ディフコ社製）で乳化した同量のγ−γ鎖
残査を腹腔に投与した。さらに２週間後同様に投与し、
３日後に脾臓を摘出した。脾臓を２価のイオンを含まな
いダルベッコ処方のリン酸食塩緩衝液（以下ＰＢＳ
（−）と略す）で洗浄した後、すりつぶし脾細胞の懸濁
液を得た。一方、本脾細胞と融合させるマウスミエロー
マＰ３×６３Ａｇ８・６５３株はＢａｌｂ／Ｃマウス由
来で抗体関連蛋白の合成能を全く失った免疫グロブリン
非分泌性細胞であり、融合することによってはじめて抗
体の分泌が可能になる。本株は１０％の牛胎児血清（Ｊ
ＲＨ バイオサイエンス社製）を添加したＲＰＭＩ−１
６４０（日水製薬社製）の培地で増殖させた。６×１０
7 個のミエローマ細胞を１０００ｒｐｍで１０分間遠心
分離して回収した後、２匹のマウスより調製した脾細胞
と混和した。１０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した
後、血清を含まないＲＰＭＩ−１６４０液で再懸濁し
た。この操作を繰り返し洗浄した細胞に５０％ＰＥＧ４
０００（ライフテックオリエンタル社製）を３ｍｌ滴下
した。１分間混和後、血清を含まないＲＰＭＩ−１６４
０液３０ｍｌを滴下し、直ちに１０００ｒｐｍで１０分
間遠心分離した。融合した細胞沈渣をＨＡＴ培地＊に懸
濁した。この懸濁液を、３３枚の９６穴マイクロプレー
ト（ヌンク社製）に、各穴１００μｌずつ滴下した。こ
れを５％の炭酸ガス濃度に調製した３７℃インキュベー
ター中で２〜３週間培養した。ＨＡＴ培地中で増殖可能
となる脾細胞−ミエローマの融合細胞を選択した。
上記方法で得たγ−γ鎖残査５０μｇをフロイント完全
アジュバンド（ディフコ社製）で乳化した上で、腹腔に
投与した。２週間後及び４週間後にフロイント不完全ア
ジュバンド（ディフコ社製）で乳化した同量のγ−γ鎖
残査を腹腔に投与した。さらに２週間後同様に投与し、
３日後に脾臓を摘出した。脾臓を２価のイオンを含まな
いダルベッコ処方のリン酸食塩緩衝液（以下ＰＢＳ
（−）と略す）で洗浄した後、すりつぶし脾細胞の懸濁
液を得た。一方、本脾細胞と融合させるマウスミエロー
マＰ３×６３Ａｇ８・６５３株はＢａｌｂ／Ｃマウス由
来で抗体関連蛋白の合成能を全く失った免疫グロブリン
非分泌性細胞であり、融合することによってはじめて抗
体の分泌が可能になる。本株は１０％の牛胎児血清（Ｊ
ＲＨ バイオサイエンス社製）を添加したＲＰＭＩ−１
６４０（日水製薬社製）の培地で増殖させた。６×１０
7 個のミエローマ細胞を１０００ｒｐｍで１０分間遠心
分離して回収した後、２匹のマウスより調製した脾細胞
と混和した。１０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した
後、血清を含まないＲＰＭＩ−１６４０液で再懸濁し
た。この操作を繰り返し洗浄した細胞に５０％ＰＥＧ４
０００（ライフテックオリエンタル社製）を３ｍｌ滴下
した。１分間混和後、血清を含まないＲＰＭＩ−１６４
０液３０ｍｌを滴下し、直ちに１０００ｒｐｍで１０分
間遠心分離した。融合した細胞沈渣をＨＡＴ培地＊に懸
濁した。この懸濁液を、３３枚の９６穴マイクロプレー
ト（ヌンク社製）に、各穴１００μｌずつ滴下した。こ
れを５％の炭酸ガス濃度に調製した３７℃インキュベー
ター中で２〜３週間培養した。ＨＡＴ培地中で増殖可能
となる脾細胞−ミエローマの融合細胞を選択した。
【００１６】＊ Ｓ−Ｃｌｏｎｅ ｍｅｄｉｕｍ（クロ
ーニングメディウム；三光純薬社製）に、１００μＭの
ヒポキサンチン、０．１μＭのアミノプテリン、１．６
μＭのチミジン（いずれもシグマ社製）を添加して作っ
た。
ーニングメディウム；三光純薬社製）に、１００μＭの
ヒポキサンチン、０．１μＭのアミノプテリン、１．６
μＭのチミジン（いずれもシグマ社製）を添加して作っ
た。
【００１７】抗体産生ハイブリドーマの検索は以下の様
にして行った。９６穴のマニフォールド（バイオドッ
ト；バイオラド社製）を固定し各穴の膜上に１μｇ相当
のＤ−ダイマーを吸着させた。吸着はＤ−ダイマー溶液
の自然落下により通過させることで行った。膜の非吸着
部分をブロックするため、１％牛血清アルブミン（シグ
マ社製）を含むＴＢＳを２００μｌずつ各穴に加えた。
各穴をＴＢＳで吸引法により洗浄した。融合細胞を植え
込んだ後ＨＡＴ培地中で細胞の増殖がみられる各穴の培
養上清を１００μずつマニフォールドの各穴に移し、１
時間反応させた。反応後０．０５％の界面活性剤（Ｔｗ
ｅｅｎ２０；バイオラド社製）を含むＴＢＳ（ＴＴＢ
Ｓ）で洗浄した後、アルカリフォスファターゼ標識した
抗マウスＩｇＧ（バイオラド社製）を１％牛血清アルブ
ミンを含むＴＢＳで３０００倍に希釈した溶液各１００
μｌ反応させた。反応後ＴＴＢＳで洗浄した後、０．１
Ｍ塩化ナトリウム、５ｍＭ塩化マグネシウム、３３ｍｇ
／ｄｌのニトロブルーテトラゾリウム、１６．５ｍｇ／
ｄｌ ブロモクロロインドリルリン酸を含むトリス塩酸
バッファーｐＨ９．５の基質溶液各１００μｌを各穴に
滴下し発色させた。その結果濃い青色の色素が沈着した
穴に対応するハイブリドーマを抗体産生陽性株として拾
い上げた。この方法により８株の抗体産生陽性株を得
た。
にして行った。９６穴のマニフォールド（バイオドッ
ト；バイオラド社製）を固定し各穴の膜上に１μｇ相当
のＤ−ダイマーを吸着させた。吸着はＤ−ダイマー溶液
の自然落下により通過させることで行った。膜の非吸着
部分をブロックするため、１％牛血清アルブミン（シグ
マ社製）を含むＴＢＳを２００μｌずつ各穴に加えた。
各穴をＴＢＳで吸引法により洗浄した。融合細胞を植え
込んだ後ＨＡＴ培地中で細胞の増殖がみられる各穴の培
養上清を１００μずつマニフォールドの各穴に移し、１
時間反応させた。反応後０．０５％の界面活性剤（Ｔｗ
ｅｅｎ２０；バイオラド社製）を含むＴＢＳ（ＴＴＢ
Ｓ）で洗浄した後、アルカリフォスファターゼ標識した
抗マウスＩｇＧ（バイオラド社製）を１％牛血清アルブ
ミンを含むＴＢＳで３０００倍に希釈した溶液各１００
μｌ反応させた。反応後ＴＴＢＳで洗浄した後、０．１
Ｍ塩化ナトリウム、５ｍＭ塩化マグネシウム、３３ｍｇ
／ｄｌのニトロブルーテトラゾリウム、１６．５ｍｇ／
ｄｌ ブロモクロロインドリルリン酸を含むトリス塩酸
バッファーｐＨ９．５の基質溶液各１００μｌを各穴に
滴下し発色させた。その結果濃い青色の色素が沈着した
穴に対応するハイブリドーマを抗体産生陽性株として拾
い上げた。この方法により８株の抗体産生陽性株を得
た。
【００１８】実施例２ Ｄ−ダイマー定量用酵素免疫測
定法 実施例１で得た株に由来するＤ−ダイマーを認識する抗
体の抗原特異性を決定するため、各抗体を精製しイムノ
グロブリンを得た。これらのイムノグロブリンサブタイ
プはアマシャム社製タイピングキットを用いて決定し
た。ＤＤ／２Ｂ６、ＤＤ／３Ｃ１１はＩｇＧ２ｂ、ＤＤ
／１７Ａ２、ＤＤ／１９Ｄ９、ＤＤ／３０Ａ７はＩｇ
Ｍ、そしてＤＤ／２８Ｅ９、ＤＤ／２８Ｆ２、ＤＤ／３
０Ｄ５はＩｇＧ１であった。ＩｇＧはファルマシア社製
ＭＡｂＴｒａｐTMＧIIキットを用いて精製した。１００
ｍｌの培養上清から１．５ｍｇの精製ＩｇＧが得られ
た。また、ＩｇＭは培養上清を濃縮した後、蒸留水に対
して透析をし遠心分離をして得た沈澱を炭酸ナトリウム
緩衝液に溶解したものを抗体溶液として使用した。これ
らの抗体を用いて酵素免疫測定法を行い、特異性を決定
した。ラットＤ−ダイマー及びフィブリノーゲンを０．
０５Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液ｐＨ９．６を用いて段階希
釈したものを各穴に１００μｌずつ９６穴のＥＬＩＳＡ
用マイクロプレート（ヌンク社製）に滴下し、１晩４℃
に保存することで抗原を吸着させた。プレート中の未吸
着部分を１％牛血清アルブミンを含むＰＢＳ（−）を各
穴に２００μｌずつ滴下し２時間室温でインキュベート
してブロックした。０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含む
ＰＢＳ（−）（ＴＰＢＳ（−））でプレートをよく洗浄
した後、ＤＤ／２８Ｅ９株の培養上清より精製したＩｇ
Ｇをブロック液でＯＤ280 ＝０．０１４３（１０μｇ／
ｍｌ）の濃度に希釈して、これを１００μｌずつ各穴に
滴下した。２時間室温で反応させた後、ＴＰＢＳで洗浄
した上で、酵素抗体法用ホースラディッシュペルオキシ
ダーゼ標識抗マウスＩｇＧ（バイオラド社製）の１００
０倍希釈液を１００μｌずつ各穴に滴下した。抗体の希
釈液はブロック液を用いた。２時間反応させた後、ＴＰ
ＢＳでよく洗浄した。基質溶液はｏ−フェニレンジアミ
ン二塩酸塩（ＯＰＤ錠；和光純薬社製）１錠を３０％過
酸化水素７μｌを加えた３２．５ｍｌ、０．１Ｍクエン
酸／０．２Ｍリン酸緩衝液ｐＨ５．０に溶かして調製し
た。これを１００μｌずつプレートの各穴に滴下して３
０分間発色させた。２規定のＨ2 ＳＯ4 液１００μｌず
つ各穴に加え、発色反応を停止した。発色の強度を４９
０ｎｍのフィルターを装備したキネティックミクロプレ
イトリーダー（ｋｉｎｅｔｉｃ ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ
ｒｅａｄｅｒ）（モレキュラーデヴァイス社製）を用
いて測定した。上記方法に於いてＤ−ｄｉｍｅｒに対す
る反応（吸光度）を１００とした場合、ＤＤ／２８Ｅ９
株、ＤＤ／３０Ａ７株、ＤＤ／３０Ｄ５株ＩｇＧ及びＩ
ｇＭのフィブリノーゲンに対する反応はそれぞれ３３、
３８、１５であった（表１）。
定法 実施例１で得た株に由来するＤ−ダイマーを認識する抗
体の抗原特異性を決定するため、各抗体を精製しイムノ
グロブリンを得た。これらのイムノグロブリンサブタイ
プはアマシャム社製タイピングキットを用いて決定し
た。ＤＤ／２Ｂ６、ＤＤ／３Ｃ１１はＩｇＧ２ｂ、ＤＤ
／１７Ａ２、ＤＤ／１９Ｄ９、ＤＤ／３０Ａ７はＩｇ
Ｍ、そしてＤＤ／２８Ｅ９、ＤＤ／２８Ｆ２、ＤＤ／３
０Ｄ５はＩｇＧ１であった。ＩｇＧはファルマシア社製
ＭＡｂＴｒａｐTMＧIIキットを用いて精製した。１００
ｍｌの培養上清から１．５ｍｇの精製ＩｇＧが得られ
た。また、ＩｇＭは培養上清を濃縮した後、蒸留水に対
して透析をし遠心分離をして得た沈澱を炭酸ナトリウム
緩衝液に溶解したものを抗体溶液として使用した。これ
らの抗体を用いて酵素免疫測定法を行い、特異性を決定
した。ラットＤ−ダイマー及びフィブリノーゲンを０．
０５Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液ｐＨ９．６を用いて段階希
釈したものを各穴に１００μｌずつ９６穴のＥＬＩＳＡ
用マイクロプレート（ヌンク社製）に滴下し、１晩４℃
に保存することで抗原を吸着させた。プレート中の未吸
着部分を１％牛血清アルブミンを含むＰＢＳ（−）を各
穴に２００μｌずつ滴下し２時間室温でインキュベート
してブロックした。０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含む
ＰＢＳ（−）（ＴＰＢＳ（−））でプレートをよく洗浄
した後、ＤＤ／２８Ｅ９株の培養上清より精製したＩｇ
Ｇをブロック液でＯＤ280 ＝０．０１４３（１０μｇ／
ｍｌ）の濃度に希釈して、これを１００μｌずつ各穴に
滴下した。２時間室温で反応させた後、ＴＰＢＳで洗浄
した上で、酵素抗体法用ホースラディッシュペルオキシ
ダーゼ標識抗マウスＩｇＧ（バイオラド社製）の１００
０倍希釈液を１００μｌずつ各穴に滴下した。抗体の希
釈液はブロック液を用いた。２時間反応させた後、ＴＰ
ＢＳでよく洗浄した。基質溶液はｏ−フェニレンジアミ
ン二塩酸塩（ＯＰＤ錠；和光純薬社製）１錠を３０％過
酸化水素７μｌを加えた３２．５ｍｌ、０．１Ｍクエン
酸／０．２Ｍリン酸緩衝液ｐＨ５．０に溶かして調製し
た。これを１００μｌずつプレートの各穴に滴下して３
０分間発色させた。２規定のＨ2 ＳＯ4 液１００μｌず
つ各穴に加え、発色反応を停止した。発色の強度を４９
０ｎｍのフィルターを装備したキネティックミクロプレ
イトリーダー（ｋｉｎｅｔｉｃ ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ
ｒｅａｄｅｒ）（モレキュラーデヴァイス社製）を用
いて測定した。上記方法に於いてＤ−ｄｉｍｅｒに対す
る反応（吸光度）を１００とした場合、ＤＤ／２８Ｅ９
株、ＤＤ／３０Ａ７株、ＤＤ／３０Ｄ５株ＩｇＧ及びＩ
ｇＭのフィブリノーゲンに対する反応はそれぞれ３３、
３８、１５であった（表１）。
【００１９】
【表１】表１は実施例１において得られた株のサブタイ
プ、及び実施例２の抗原固相法による酵素免疫測定法の
結果を一覧に示した。表中の数値はそれぞれの抗体のＤ
−ダイマーに対する反応（Ａ４９０ｎｍ）を１００％と
してフィブリノーゲンとの交差反応を表している。
プ、及び実施例２の抗原固相法による酵素免疫測定法の
結果を一覧に示した。表中の数値はそれぞれの抗体のＤ
−ダイマーに対する反応（Ａ４９０ｎｍ）を１００％と
してフィブリノーゲンとの交差反応を表している。
【００２０】次に精製したＤＤ／２Ｂ６株に由来するＤ
−ダイマー、フィブリノーゲンを認識する抗体及びＤＤ
／２８Ｅ９株に由来するフィブリノーゲンよりＤ−ダイ
マーを強く認識する抗体を用いてラット血漿中のＤ−ダ
イマーの定量を行った。ＤＤ／２８Ｅ９株ＩｇＧを０．
０５Ｍ トリス／塩酸緩衝液を用いてＯＤ2 ＝０．０
１４３の濃度に希釈し、これを１００μｌずつ９６穴の
ＥＬＩＳＡ用マイクロプレートに滴下し、１晩４℃に保
存することで抗体を吸着させた。プレート中の未吸着部
分を１％牛血清アルブミンを含むＰＢＳ（−）を各穴に
２００μｌずつ滴下し２時間室温でインキュベートして
ブロックした。ＴＰＢ（−）でプレートをよく洗浄した
後、既知の濃度のＤ−ダイマーをラット血漿に添加した
ものを試料として加え２時間反応させた。反応後ＴＰＢ
Ｓでよく洗浄した後、ビオチンにて標識したＤＤ／２Ｂ
６株ＩｇＧを１％牛血清アルブミン含有のＰＢＳ（−）
で５００倍に希釈して、これを１００μｌずつ各穴に滴
下した。２時間室温で反応させた後、ＴＰＢＳで洗浄
し、ホースラディッシュパーオキシダーゼ標識ストレプ
トアビジン（ライフテックオリエンタル社製）を１％牛
血清アルブミン含有のＰＢＳ（−）での２０００倍に希
釈し、１００μｌずつ各穴に滴下した。９０分間反応さ
せた後、ＴＰＢＳでよく洗浄した。基質溶液は上記方法
と同様ＯＰＤ錠を用いて発色させ４９０ｎｍの吸光度を
測定した。上記方法を用いると精製ラットＤ−ダイマー
は１μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌまで測定することがで
きた。その結果を図２に示す。
−ダイマー、フィブリノーゲンを認識する抗体及びＤＤ
／２８Ｅ９株に由来するフィブリノーゲンよりＤ−ダイ
マーを強く認識する抗体を用いてラット血漿中のＤ−ダ
イマーの定量を行った。ＤＤ／２８Ｅ９株ＩｇＧを０．
０５Ｍ トリス／塩酸緩衝液を用いてＯＤ2 ＝０．０
１４３の濃度に希釈し、これを１００μｌずつ９６穴の
ＥＬＩＳＡ用マイクロプレートに滴下し、１晩４℃に保
存することで抗体を吸着させた。プレート中の未吸着部
分を１％牛血清アルブミンを含むＰＢＳ（−）を各穴に
２００μｌずつ滴下し２時間室温でインキュベートして
ブロックした。ＴＰＢ（−）でプレートをよく洗浄した
後、既知の濃度のＤ−ダイマーをラット血漿に添加した
ものを試料として加え２時間反応させた。反応後ＴＰＢ
Ｓでよく洗浄した後、ビオチンにて標識したＤＤ／２Ｂ
６株ＩｇＧを１％牛血清アルブミン含有のＰＢＳ（−）
で５００倍に希釈して、これを１００μｌずつ各穴に滴
下した。２時間室温で反応させた後、ＴＰＢＳで洗浄
し、ホースラディッシュパーオキシダーゼ標識ストレプ
トアビジン（ライフテックオリエンタル社製）を１％牛
血清アルブミン含有のＰＢＳ（−）での２０００倍に希
釈し、１００μｌずつ各穴に滴下した。９０分間反応さ
せた後、ＴＰＢＳでよく洗浄した。基質溶液は上記方法
と同様ＯＰＤ錠を用いて発色させ４９０ｎｍの吸光度を
測定した。上記方法を用いると精製ラットＤ−ダイマー
は１μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌまで測定することがで
きた。その結果を図２に示す。
【００２１】
【図２】
【００２２】またラット血漿存在下の精製Ｄ−ダイマー
についても血漿フィブリノーゲンとの交差なしに検出す
ることができた。
についても血漿フィブリノーゲンとの交差なしに検出す
ることができた。
【００２３】次に、ハイブリドーマの産生する抗体の認
識部位をイムノブロッティング法により決定した。０．
１ｍｇ／ｍｌの濃度のフィブリノーゲン α鎖、β鎖、
Ｄ−ダイマー、そのγ−γ残鎖、およびフィブリノーゲ
ンの分解産物を含む各溶液に２％ドデシル硫酸ナトリウ
ム（ＳＤＳ；バイオラド社製）グリセロール、少量のブ
ロムフェノールブルー（バイオラド社製）を含む５０ｍ
Ｍのトリス塩酸緩衝液ｐＨ６．８のサンプルバッファー
を等量加え、５分間１００℃のオイルバス中で処理し
た。また、フィブリノーゲンにはβ−メルカプトエタノ
ールを含むサンプルバッファーを加え、同様に処理し
た。これらを４／２０％のポリアクリルアミドグラジエ
ントゲル上で、０．１％ ＳＤＳの存在下に電気泳動し
た。ゲル上に分離されたタンパク質はトランスブロット
装置（ザルトブロットＳ−II；ザルトリウス社製）で電
気的にＰＶＤＦトランスファーメンブレン（ミリポア社
製）に移行させた。本過程は上記装置で、２０％メタノ
ールを含むトリスグリシンバッファーを用い、０．２５
ｍＡ／ｃｍ2 で３５分間通電することで行った。膜をＴ
ＢＳでよく洗ったあと、１％の牛血清アルブミンを含む
ＴＢＳ中に１時間保持して非吸着部をブロックした。次
に抗体産生陽性が確認された細胞株の上清と室温で１時
間反応させた。反応後膜をＴＴＢＳでよく洗浄した後、
アルカリフォスファターゼ標識抗マウスＩｇＧと反応さ
せ、さらに実施例２に倣いニトロブルーテトラゾリウ
ム、ブロモクロロインドクールリン酸含有の基質溶液で
発色させた。発色した抗原より各細胞株が分泌するモノ
クロナール抗体の認識部位を決定した。以上の方法によ
り、Ｄ−ダイマーを認識するＤＤ／２８Ｅ９株、ＤＤ／
３０Ａ７株、及びＤＤ／３０Ｄ５株の諸株から得られる
抗体はフィブリノーゲンのα鎖、β鎖には反応しないが
フィブリノーゲンおよびフィブリンの分解産物中のγ残
鎖を認識することから、γ鎖のアミノ酸配列９０−４１
２の領域にエピトープが存在することが明らかになっ
た。
識部位をイムノブロッティング法により決定した。０．
１ｍｇ／ｍｌの濃度のフィブリノーゲン α鎖、β鎖、
Ｄ−ダイマー、そのγ−γ残鎖、およびフィブリノーゲ
ンの分解産物を含む各溶液に２％ドデシル硫酸ナトリウ
ム（ＳＤＳ；バイオラド社製）グリセロール、少量のブ
ロムフェノールブルー（バイオラド社製）を含む５０ｍ
Ｍのトリス塩酸緩衝液ｐＨ６．８のサンプルバッファー
を等量加え、５分間１００℃のオイルバス中で処理し
た。また、フィブリノーゲンにはβ−メルカプトエタノ
ールを含むサンプルバッファーを加え、同様に処理し
た。これらを４／２０％のポリアクリルアミドグラジエ
ントゲル上で、０．１％ ＳＤＳの存在下に電気泳動し
た。ゲル上に分離されたタンパク質はトランスブロット
装置（ザルトブロットＳ−II；ザルトリウス社製）で電
気的にＰＶＤＦトランスファーメンブレン（ミリポア社
製）に移行させた。本過程は上記装置で、２０％メタノ
ールを含むトリスグリシンバッファーを用い、０．２５
ｍＡ／ｃｍ2 で３５分間通電することで行った。膜をＴ
ＢＳでよく洗ったあと、１％の牛血清アルブミンを含む
ＴＢＳ中に１時間保持して非吸着部をブロックした。次
に抗体産生陽性が確認された細胞株の上清と室温で１時
間反応させた。反応後膜をＴＴＢＳでよく洗浄した後、
アルカリフォスファターゼ標識抗マウスＩｇＧと反応さ
せ、さらに実施例２に倣いニトロブルーテトラゾリウ
ム、ブロモクロロインドクールリン酸含有の基質溶液で
発色させた。発色した抗原より各細胞株が分泌するモノ
クロナール抗体の認識部位を決定した。以上の方法によ
り、Ｄ−ダイマーを認識するＤＤ／２８Ｅ９株、ＤＤ／
３０Ａ７株、及びＤＤ／３０Ｄ５株の諸株から得られる
抗体はフィブリノーゲンのα鎖、β鎖には反応しないが
フィブリノーゲンおよびフィブリンの分解産物中のγ残
鎖を認識することから、γ鎖のアミノ酸配列９０−４１
２の領域にエピトープが存在することが明らかになっ
た。
【００２４】
【発明の効果】本発明により新規なラットＤ−ダイマー
に対するモノクロナール抗体を産生する細胞をつくるこ
とができる。それを培養してＤ−ダイマーモノクロナー
ル抗体を大量生産することが可能である。また、このモ
ノクロナール抗体はラットのフィブリノーゲンよりもＤ
−ダイマーを強く認識するのでそれを用いてラット血漿
中のＤ−ダイマーを特異的に、また安全かつ簡便に測定
することができるので、ラットを試験動物として血栓溶
解剤を開発、研究を行う場合に極めて有用である。
に対するモノクロナール抗体を産生する細胞をつくるこ
とができる。それを培養してＤ−ダイマーモノクロナー
ル抗体を大量生産することが可能である。また、このモ
ノクロナール抗体はラットのフィブリノーゲンよりもＤ
−ダイマーを強く認識するのでそれを用いてラット血漿
中のＤ−ダイマーを特異的に、また安全かつ簡便に測定
することができるので、ラットを試験動物として血栓溶
解剤を開発、研究を行う場合に極めて有用である。
【図１】免疫用抗原として用いた精製γ−γ鎖残鎖をＳ
ＤＳ電気泳動に付した結果を示す写真である。
ＤＳ電気泳動に付した結果を示す写真である。
【図２】実施例２で行われたサンドイッチ法による酵素
免疫測定の結果を示すグラフで、（□−□）は精製ラッ
トＤ−ダイマーが抗原であり、（△−△）はラットフィ
ブリノーゲンが抗原である。
免疫測定の結果を示すグラフで、（□−□）は精製ラッ
トＤ−ダイマーが抗原であり、（△−△）はラットフィ
ブリノーゲンが抗原である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:91）
Claims (7)
- 【請求項１】 ラットＤ−ダイマーから分離したγ−γ
鎖を抗原として免疫された哺乳動物の細胞とミエローマ
細胞との融合細胞により生産され、ラットフィブリノー
ゲンよりもラットＤ−ダイマーを強く認識するモノクロ
ナール抗体。 - 【請求項２】 分子量が約１７４０キロダルトンである
請求項１記載のモノクロナール抗体。 - 【請求項３】 請求項１または２記載のモノクロナール
抗体を抗体として用いることを特徴とするラットＤ−ダ
イマーの酵素免疫測定法。 - 【請求項４】 サンドイッチ法で行う請求項３記載の測
定法。 - 【請求項５】 試料中に含有されるラットＤ−ダイマー
を固定化し、これに請求項１記載のモノクロナール抗体
を作用させ、その作用量を酵素標識法により測定するこ
とを特徴とする請求項３記載の測定法。 - 【請求項６】 モノクロナール抗体を酵素標識し、サン
ドイッチ法によって試料中に含まれるラットＤ−ダイマ
ーを測定することを特徴とする請求項３または請求項４
記載の測定法。 - 【請求項７】 ラットＤ−ダイマーから分離したγ−γ
鎖を抗原として免疫された哺乳動物細胞とミエローマ細
胞との融合細胞であるラットＤ−ダイマーを認識するモ
ノクロナール抗体を産生する細胞株。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7212370A JPH0940700A (ja) | 1995-07-28 | 1995-07-28 | モノクロナール抗体 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7212370A JPH0940700A (ja) | 1995-07-28 | 1995-07-28 | モノクロナール抗体 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0940700A true JPH0940700A (ja) | 1997-02-10 |
Family
ID=16621446
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7212370A Pending JPH0940700A (ja) | 1995-07-28 | 1995-07-28 | モノクロナール抗体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0940700A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2006016687A1 (ja) * | 2004-08-10 | 2006-02-16 | Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd. | 破裂性腹部大動脈瘤の判定方法及び判定用試薬 |
| CN102010472A (zh) * | 2010-10-22 | 2011-04-13 | 上海贝西生物科技有限公司 | 一种抗d-二聚体单克隆抗体及其用途 |
-
1995
- 1995-07-28 JP JP7212370A patent/JPH0940700A/ja active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2006016687A1 (ja) * | 2004-08-10 | 2006-02-16 | Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd. | 破裂性腹部大動脈瘤の判定方法及び判定用試薬 |
| CN102010472A (zh) * | 2010-10-22 | 2011-04-13 | 上海贝西生物科技有限公司 | 一种抗d-二聚体单克隆抗体及其用途 |
| CN102010472B (zh) | 2010-10-22 | 2012-09-05 | 上海贝西生物科技有限公司 | 一种抗d-二聚体单克隆抗体及其用途 |
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