JPH0967400A - モノクローナル抗体、該抗体を産生するハイブリドーマ及びその利用 - Google Patents
モノクローナル抗体、該抗体を産生するハイブリドーマ及びその利用Info
- Publication number
- JPH0967400A JPH0967400A JP7222849A JP22284995A JPH0967400A JP H0967400 A JPH0967400 A JP H0967400A JP 7222849 A JP7222849 A JP 7222849A JP 22284995 A JP22284995 A JP 22284995A JP H0967400 A JPH0967400 A JP H0967400A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cells
- csfr
- stimulating factor
- colony stimulating
- antibody
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【解決手段】Ｍ−ＣＳＦＲに特異的に反応するＭ−ＣＳ
ＦＲに対するモノクローナル抗体、その抗体を産生する
ハイブリドーマ、Ｍ−ＣＳＦＲを検出する方法、および
Ｍ−ＣＳＦＲに対するモノクローナル抗体とｃ−ｋｉｔ
に対するモノクローナル抗体を用いて単球・マクロファ
ージ前駆細胞を分離精製する方法。 【効果】Ｍ−ＣＳＦＲに特異的なモノクローナル抗体が
提供され、Ｍ−ＣＳＦＲおよびＭ−ＣＳＦＲを有する細
胞を高感度、高精度でしかも簡便に検出および測定可能
な免疫検定法が提供される。また、本発明抗体はＭ−Ｃ
ＳＦに反応して機能発現する細胞に対し、Ｍ−ＣＳＦの
作用を中和する性質を有するので、骨髄細胞からマクロ
ファージへの分化の研究、造血幹細胞から破骨細胞への
分化の研究、資質代謝の研究、動脈硬化の研究等におい
てＭ−ＣＳＦのシグナルの役割を研究する手法が提供さ
れる。さらに、本発明抗体と項ｃ−ｋｉｔ抗体を用い、
細胞を分離することにより、単球・マクロファージ前駆
細胞を分離精製する方法が提供される。
ＦＲに対するモノクローナル抗体、その抗体を産生する
ハイブリドーマ、Ｍ−ＣＳＦＲを検出する方法、および
Ｍ−ＣＳＦＲに対するモノクローナル抗体とｃ−ｋｉｔ
に対するモノクローナル抗体を用いて単球・マクロファ
ージ前駆細胞を分離精製する方法。 【効果】Ｍ−ＣＳＦＲに特異的なモノクローナル抗体が
提供され、Ｍ−ＣＳＦＲおよびＭ−ＣＳＦＲを有する細
胞を高感度、高精度でしかも簡便に検出および測定可能
な免疫検定法が提供される。また、本発明抗体はＭ−Ｃ
ＳＦに反応して機能発現する細胞に対し、Ｍ−ＣＳＦの
作用を中和する性質を有するので、骨髄細胞からマクロ
ファージへの分化の研究、造血幹細胞から破骨細胞への
分化の研究、資質代謝の研究、動脈硬化の研究等におい
てＭ−ＣＳＦのシグナルの役割を研究する手法が提供さ
れる。さらに、本発明抗体と項ｃ−ｋｉｔ抗体を用い、
細胞を分離することにより、単球・マクロファージ前駆
細胞を分離精製する方法が提供される。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、マクロファージコ
ロニー刺激因子レセプター（以下Ｍ−ＣＳＦＲと略す）
に対する抗体およびそれを産生するハイブリドーマに関
する。さらに本発明は、該抗体を利用してマウスＭ−Ｃ
ＳＦＲまたはそれを有する細胞を検出する方法および該
抗体とマウスｃ−ｋｉｔに対する抗体を用いて骨髄細胞
中からマクロファージコロニー刺激因子（以下Ｍ−ＣＳ
Ｆと略す）に反応して増殖する前駆細胞を分離する方法
に関するものである。
ロニー刺激因子レセプター（以下Ｍ−ＣＳＦＲと略す）
に対する抗体およびそれを産生するハイブリドーマに関
する。さらに本発明は、該抗体を利用してマウスＭ−Ｃ
ＳＦＲまたはそれを有する細胞を検出する方法および該
抗体とマウスｃ−ｋｉｔに対する抗体を用いて骨髄細胞
中からマクロファージコロニー刺激因子（以下Ｍ−ＣＳ
Ｆと略す）に反応して増殖する前駆細胞を分離する方法
に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】Ｍ−ＣＳＦは単球・マクロファージの生
成と機能発現を刺激する因子として発見され、その後ｃ
ＤＮＡが単離されるに至り、その全構造が明らかになっ
た［Ｋａｗａｓａｋｉ，Ｅ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ，２３０，２９１−２９６（１９８５），Ｗ
ｏｎｇ，Ｇ．Ｇ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２
３５，１５０４−１５０８（１９８７）］。一方、Ｍ−
ＣＳＦＲは癌原遺伝子であるｃ−ｆｍｓであることが明
らかにされ［Ｓｈｅｒｒ，Ｃ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃ
ｅｌｌ，４１，６６５−６７６（１９８５）］、チロシ
ンキナーゼ活性を持った約１７０ｋｄのレセプターであ
ることが判明した。そしてＭ−ＣＳＦＲにホモダイマー
であるＭ−ＣＳＦが結合するとＭ−ＣＳＦＲは自己リン
酸化し、チロシンキナーゼが活性化され、シグナルが伝
達されることも明らかとなった。その後の研究から、大
理石病を発症する突然変異マウスであるｏｐマウスがＭ
−ＣＳＦ遺伝子のポイントミューテーションであること
が示され、大理石病の原因がＭ−ＣＳＦの活性欠損であ
ることが明らかとなった［Ｙｏｓｈｉｄａ，Ｈ．，ｅｔ
ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３４５，４４２−４４４（１９
９０）］。また、Ｍ−ＣＳＦは脂肪代謝促進作用を持つ
ことも判明した［Ｓｈｉｍａｎｏ，Ｈ．，ｅｔａｌ．，
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５，１２８６５−１２
８７５（１９９０）］。
成と機能発現を刺激する因子として発見され、その後ｃ
ＤＮＡが単離されるに至り、その全構造が明らかになっ
た［Ｋａｗａｓａｋｉ，Ｅ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ，２３０，２９１−２９６（１９８５），Ｗ
ｏｎｇ，Ｇ．Ｇ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２
３５，１５０４−１５０８（１９８７）］。一方、Ｍ−
ＣＳＦＲは癌原遺伝子であるｃ−ｆｍｓであることが明
らかにされ［Ｓｈｅｒｒ，Ｃ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃ
ｅｌｌ，４１，６６５−６７６（１９８５）］、チロシ
ンキナーゼ活性を持った約１７０ｋｄのレセプターであ
ることが判明した。そしてＭ−ＣＳＦＲにホモダイマー
であるＭ−ＣＳＦが結合するとＭ−ＣＳＦＲは自己リン
酸化し、チロシンキナーゼが活性化され、シグナルが伝
達されることも明らかとなった。その後の研究から、大
理石病を発症する突然変異マウスであるｏｐマウスがＭ
−ＣＳＦ遺伝子のポイントミューテーションであること
が示され、大理石病の原因がＭ−ＣＳＦの活性欠損であ
ることが明らかとなった［Ｙｏｓｈｉｄａ，Ｈ．，ｅｔ
ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３４５，４４２−４４４（１９
９０）］。また、Ｍ−ＣＳＦは脂肪代謝促進作用を持つ
ことも判明した［Ｓｈｉｍａｎｏ，Ｈ．，ｅｔａｌ．，
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５，１２８６５−１２
８７５（１９９０）］。
【０００３】以上の研究から、Ｍ−ＣＳＦは単球・マク
ロファージの生成と機能発現を刺激するばかりでなく破
骨細胞の分化成熟作用、脂肪代謝促進作用など多彩な機
能を持っていることが分かった。
ロファージの生成と機能発現を刺激するばかりでなく破
骨細胞の分化成熟作用、脂肪代謝促進作用など多彩な機
能を持っていることが分かった。
【０００４】しかし、実際の骨髄中でのＭ−ＣＳＦの役
割は不明な点が多い。その理由の一つは、Ｍ−ＣＳＦの
欠損によりｏｐマウスに見られるように骨髄造血を支え
る骨髄腔の発達が極度に阻害され、造血が抑制されるの
で、Ｍ−ＣＳＦの造血への作用を明らかにできない点に
ある。この問題を解決し、成獣の骨髄造血におけるＭ−
ＣＳＦおよびＭ−ＣＳＦＲの機能を明らかにするために
は、Ｍ−ＣＳＦＲの機能を阻害する抗体を作製し、正常
骨髄でその発現と機能を解析することが重要である。ま
た、血液細胞の生成は増殖因子レセプターの分化段階お
よび系統特異的な発現によって制御されていると考えら
れるが、それらの増殖因子のレセプターの中で未分化な
血液細胞に発現しているものがｃ−ｋｉｔである［Ｏｇ
ａｗａ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，
１７４，６３−７１（１９９１）］。このｃ−ｋｉｔ陽
性細胞から、成熟細胞であるマクロファージへの分化の
過程でどの細胞がＭ−ＣＳＦに反応するのかを詳細に検
討したり、それらの細胞を分離し機能発現の研究に用い
たりするにはＭ−ＣＳＦＲに対する抗体が必要となる。
さらに、骨形成や脂肪代謝の研究にもＭ−ＣＳＦＲに対
する抗体が有力な武器となり得る。
割は不明な点が多い。その理由の一つは、Ｍ−ＣＳＦの
欠損によりｏｐマウスに見られるように骨髄造血を支え
る骨髄腔の発達が極度に阻害され、造血が抑制されるの
で、Ｍ−ＣＳＦの造血への作用を明らかにできない点に
ある。この問題を解決し、成獣の骨髄造血におけるＭ−
ＣＳＦおよびＭ−ＣＳＦＲの機能を明らかにするために
は、Ｍ−ＣＳＦＲの機能を阻害する抗体を作製し、正常
骨髄でその発現と機能を解析することが重要である。ま
た、血液細胞の生成は増殖因子レセプターの分化段階お
よび系統特異的な発現によって制御されていると考えら
れるが、それらの増殖因子のレセプターの中で未分化な
血液細胞に発現しているものがｃ−ｋｉｔである［Ｏｇ
ａｗａ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，
１７４，６３−７１（１９９１）］。このｃ−ｋｉｔ陽
性細胞から、成熟細胞であるマクロファージへの分化の
過程でどの細胞がＭ−ＣＳＦに反応するのかを詳細に検
討したり、それらの細胞を分離し機能発現の研究に用い
たりするにはＭ−ＣＳＦＲに対する抗体が必要となる。
さらに、骨形成や脂肪代謝の研究にもＭ−ＣＳＦＲに対
する抗体が有力な武器となり得る。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的はＭ−Ｃ
ＳＦＲに特異的に反応することを特長とするＭ−ＣＳＦ
Ｒに対するモノクローナル抗体、それを産生するハイブ
リドーマを提供することである。また、本発明の目的は
Ｍ−ＣＳＦＲまたはそれを有する細胞を検出する方法を
提供することである。さらに本発明の目的は、Ｍ−ＣＳ
ＦＲに対する抗体とｃ−ｋｉｔに対する抗体を利用し
て、骨髄細胞中からＭ−ＣＳＦに反応して増殖する前駆
細胞を分離する方法を提供することである。
ＳＦＲに特異的に反応することを特長とするＭ−ＣＳＦ
Ｒに対するモノクローナル抗体、それを産生するハイブ
リドーマを提供することである。また、本発明の目的は
Ｍ−ＣＳＦＲまたはそれを有する細胞を検出する方法を
提供することである。さらに本発明の目的は、Ｍ−ＣＳ
ＦＲに対する抗体とｃ−ｋｉｔに対する抗体を利用し
て、骨髄細胞中からＭ−ＣＳＦに反応して増殖する前駆
細胞を分離する方法を提供することである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明抗体を利用すれ
ば、Ｍ−ＣＳＦＲを有する細胞、または可溶性Ｍ−ＣＳ
ＦＲを高感度、高精度で、しかも簡便に検出および測定
できる免疫検出法を提供することができる。また、本発
明抗体は血液細胞の分化増殖機構を解明する研究にも利
用できる。さらに、本発明抗体はＭ−ＣＳＦＲに特異的
であるため、アフィニティークロマトグラフィー等の手
法による、Ｍ−ＣＳＦＲの特異的精製の手法も提供され
る。
ば、Ｍ−ＣＳＦＲを有する細胞、または可溶性Ｍ−ＣＳ
ＦＲを高感度、高精度で、しかも簡便に検出および測定
できる免疫検出法を提供することができる。また、本発
明抗体は血液細胞の分化増殖機構を解明する研究にも利
用できる。さらに、本発明抗体はＭ−ＣＳＦＲに特異的
であるため、アフィニティークロマトグラフィー等の手
法による、Ｍ−ＣＳＦＲの特異的精製の手法も提供され
る。
【０００７】本発明抗体は、免疫抗原としてマウスＭ−
ＣＳＦＲを利用して製造できる。より具体的には、例え
ば上記免疫抗原で免疫した哺乳動物の形質細胞（免疫細
胞）と哺乳動物の形質細胞腫細胞との融合細胞（ｈｙｂ
ｒｉｄｏｍａ，ハイブリドーマ）を作製し、これよりマ
ウスＭ−ＣＳＦＲを認識する所望抗体を産生するクロー
ンを選択し、該クローンの培養により製造できる。
ＣＳＦＲを利用して製造できる。より具体的には、例え
ば上記免疫抗原で免疫した哺乳動物の形質細胞（免疫細
胞）と哺乳動物の形質細胞腫細胞との融合細胞（ｈｙｂ
ｒｉｄｏｍａ，ハイブリドーマ）を作製し、これよりマ
ウスＭ−ＣＳＦＲを認識する所望抗体を産生するクロー
ンを選択し、該クローンの培養により製造できる。
【０００８】上記の方法において用いられる免疫抗原と
してのマウスＭ−ＣＳＦＲは、マウスのＭ−ＣＳＦＲで
あれば特に限定はなく、既に公知のマウスＭ−ＣＳＦＲ
を有するマウス株化細胞、例えば、マウス単球由来細胞
株Ｊ７７４．１（ＡＴＣＣ，ＴＩＢ−６７）あるいはマ
ウス骨髄芽球細胞株ＮＦＳ６０［Ｈｏｌｍｅｓ，Ｋ
Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａ
ｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ．８２， ６６８７−６６９１
（１９８５）］がある。さらにはマウスＭ−ＣＳＦＲ遺
伝子を導入され、マウスＭ−ＣＳＦＲを発現するように
なった細胞等の細胞または細胞分画、あるいはこれらの
細胞分画よりマウスＭ−ＣＳＦＲを精製した標品、遺伝
子組換え技術に従い製造されたマウスＭ−ＣＳＦＲもし
くはＭ−ＣＳＦＲと他の蛋白質とのキメラ蛋白およびマ
ウスＭ−ＣＳＦＲの一部のアミノ酸配列を有するペプチ
ド等のいずれでもよい。ＷＯ９４／２８１６０に記載さ
れた方法に従い、マウスＭ−ＣＳＦＲもしくはＭ−ＣＳ
ＦＲと他の蛋白質とのキメラ蛋白を免疫抗原として用い
るのが良く、特にマウスＭ−ＣＳＦＲの細胞外部分と免
疫グロブリンのＨ鎖の定常領域とのキメラ蛋白が望まし
い。このキメラ蛋白はプロテインＡカラムに特異的に結
合するため精製が容易である。さらに、免疫グロブリン
が他の蛋白に比べ血液中で安定なことから、このキメラ
蛋白を動物に投与した場合と比べ血液中で安定であるこ
とが期待されるので、このキメラ蛋白を免疫抗原として
用いれば、効率よく抗体が作製されると考えられる。ま
た、上記の方法において免疫抗原で免疫される哺乳動物
としては特に制限はないが、細胞融合に使用する形質細
胞腫細胞との適合性を考えて選択するのが好ましく、一
般にはラット、アルメニアハムスター等が有利に用いら
れる。
してのマウスＭ−ＣＳＦＲは、マウスのＭ−ＣＳＦＲで
あれば特に限定はなく、既に公知のマウスＭ−ＣＳＦＲ
を有するマウス株化細胞、例えば、マウス単球由来細胞
株Ｊ７７４．１（ＡＴＣＣ，ＴＩＢ−６７）あるいはマ
ウス骨髄芽球細胞株ＮＦＳ６０［Ｈｏｌｍｅｓ，Ｋ
Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａ
ｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ．８２， ６６８７−６６９１
（１９８５）］がある。さらにはマウスＭ−ＣＳＦＲ遺
伝子を導入され、マウスＭ−ＣＳＦＲを発現するように
なった細胞等の細胞または細胞分画、あるいはこれらの
細胞分画よりマウスＭ−ＣＳＦＲを精製した標品、遺伝
子組換え技術に従い製造されたマウスＭ−ＣＳＦＲもし
くはＭ−ＣＳＦＲと他の蛋白質とのキメラ蛋白およびマ
ウスＭ−ＣＳＦＲの一部のアミノ酸配列を有するペプチ
ド等のいずれでもよい。ＷＯ９４／２８１６０に記載さ
れた方法に従い、マウスＭ−ＣＳＦＲもしくはＭ−ＣＳ
ＦＲと他の蛋白質とのキメラ蛋白を免疫抗原として用い
るのが良く、特にマウスＭ−ＣＳＦＲの細胞外部分と免
疫グロブリンのＨ鎖の定常領域とのキメラ蛋白が望まし
い。このキメラ蛋白はプロテインＡカラムに特異的に結
合するため精製が容易である。さらに、免疫グロブリン
が他の蛋白に比べ血液中で安定なことから、このキメラ
蛋白を動物に投与した場合と比べ血液中で安定であるこ
とが期待されるので、このキメラ蛋白を免疫抗原として
用いれば、効率よく抗体が作製されると考えられる。ま
た、上記の方法において免疫抗原で免疫される哺乳動物
としては特に制限はないが、細胞融合に使用する形質細
胞腫細胞との適合性を考えて選択するのが好ましく、一
般にはラット、アルメニアハムスター等が有利に用いら
れる。
【０００９】免疫は一般的方法により、例えば上記免疫
抗原を哺乳動物に静脈内、皮内、皮下、腹腔内注射等に
より投与することのより実施できる。より具体的には、
免疫抗原を、所望により通常のアジュバントと併用し
て、哺乳動物に２日から３０日毎に、数回投与し、総投
与量が約１００から５００μｇ／ラット程度になるよう
にするのが好ましい。免疫細胞としては、上記最終投与
の約３日後に摘出した脾臓細胞を使用するのが好まし
い。
抗原を哺乳動物に静脈内、皮内、皮下、腹腔内注射等に
より投与することのより実施できる。より具体的には、
免疫抗原を、所望により通常のアジュバントと併用し
て、哺乳動物に２日から３０日毎に、数回投与し、総投
与量が約１００から５００μｇ／ラット程度になるよう
にするのが好ましい。免疫細胞としては、上記最終投与
の約３日後に摘出した脾臓細胞を使用するのが好まし
い。
【００１０】さらに、上記免疫細胞と融合させる他方の
親細胞としての哺乳動物の形質細胞腫細胞としては、既
に公知の種々のもの、例えばＰ３Ｘ６３Ａｇ８（ＡＴＣ
Ｃ，ＴＩＢ−９），Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３（ＡＴＣ
Ｃ，ＣＲＬ−１５８０），Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８Ｕ．１
（ＡＴＣＣ，ＣＲＬ−１５９７），Ｐ３／ＮＳ１／１−
Ａｇ−１（ＡＴＣＣ，ＴＩＢ−１８），Ｓｐ２／０−Ａ
ｇ１４（ＡＴＣＣ，ＣＲＬ−１５８１）等や、ラットに
おけるＹ３−Ａｇ１．２．３（ＡＴＣＣ，ＣＲＬ−１６
３１）等の骨髄腫細胞等を使用できる。
親細胞としての哺乳動物の形質細胞腫細胞としては、既
に公知の種々のもの、例えばＰ３Ｘ６３Ａｇ８（ＡＴＣ
Ｃ，ＴＩＢ−９），Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３（ＡＴＣ
Ｃ，ＣＲＬ−１５８０），Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８Ｕ．１
（ＡＴＣＣ，ＣＲＬ−１５９７），Ｐ３／ＮＳ１／１−
Ａｇ−１（ＡＴＣＣ，ＴＩＢ−１８），Ｓｐ２／０−Ａ
ｇ１４（ＡＴＣＣ，ＣＲＬ−１５８１）等や、ラットに
おけるＹ３−Ａｇ１．２．３（ＡＴＣＣ，ＣＲＬ−１６
３１）等の骨髄腫細胞等を使用できる。
【００１１】上記免疫細胞と形質細胞腫細胞との融合反
応は、公知の方法、例えばＭｉｌｓｔｅｉｎ等の方法
［Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，７３，３−４６（１９
８１）］等に準じて行うことができる。より具体的に
は、上記融合反応は通常の融合促進剤、例えばポリエチ
レングリコール（ＰＧＥ）、センダイウイルス（ＨＶ
Ｊ）等の存在下に通常の培地中で実施され、培地には更
に融合効率を高めるために、ジメチルスルホキシド等の
補助剤を必要に応じて添加することもできる。
応は、公知の方法、例えばＭｉｌｓｔｅｉｎ等の方法
［Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，７３，３−４６（１９
８１）］等に準じて行うことができる。より具体的に
は、上記融合反応は通常の融合促進剤、例えばポリエチ
レングリコール（ＰＧＥ）、センダイウイルス（ＨＶ
Ｊ）等の存在下に通常の培地中で実施され、培地には更
に融合効率を高めるために、ジメチルスルホキシド等の
補助剤を必要に応じて添加することもできる。
【００１２】免疫細胞と形質細胞腫細胞との使用比は通
常の方法と変わりなく、例えば形質細胞腫細胞に対して
免疫細胞を約１から１０倍程度用いるのが普通である。
融合反応時の培地としては、形質細胞腫細胞の増殖に通
常用いられる各種のもの、例えばＲＰＭＩ１６４０培
地、ＭＥＭ培地、その他この種の細胞培養に利用される
ものが例示でき、通常の融合反応には牛胎児血清（ＦＣ
Ｓ）等の血清補助剤を抜いておくのがよい。融合は上記
免疫細胞と形質細胞腫細胞との所定量を、上記培地内で
よく混和し、予め３７℃程度に加温して、ＰＥＧ溶液、
例えば平均分子量１０００から６０００程度のものを、
通常培地に３０から６０ｗ／ｖ％の濃度で加え混ぜ合わ
せることにより行われる。以後、適当な培地を逐次添加
して遠心し、上清を除去する操作を繰り返すことにより
所望のハイブリドーマが形成される。 得られる所望の
ハイブリドーマの分離は、通常の選択用培地、例えばＨ
ＡＴ培地（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミ
ジンを含む培地）で培養することにより行われる。該Ｈ
ＡＴ培地での培養は、目的とするハイブリドーマ以外の
細胞（未融合細胞等）が死滅するのに充分な時間、通常
数日から数週間行えばよい。かくして得られるハイブリ
ドーマは、通常の限界希釈法により目的とする抗体の検
索および単一クローン化に供される。
常の方法と変わりなく、例えば形質細胞腫細胞に対して
免疫細胞を約１から１０倍程度用いるのが普通である。
融合反応時の培地としては、形質細胞腫細胞の増殖に通
常用いられる各種のもの、例えばＲＰＭＩ１６４０培
地、ＭＥＭ培地、その他この種の細胞培養に利用される
ものが例示でき、通常の融合反応には牛胎児血清（ＦＣ
Ｓ）等の血清補助剤を抜いておくのがよい。融合は上記
免疫細胞と形質細胞腫細胞との所定量を、上記培地内で
よく混和し、予め３７℃程度に加温して、ＰＥＧ溶液、
例えば平均分子量１０００から６０００程度のものを、
通常培地に３０から６０ｗ／ｖ％の濃度で加え混ぜ合わ
せることにより行われる。以後、適当な培地を逐次添加
して遠心し、上清を除去する操作を繰り返すことにより
所望のハイブリドーマが形成される。 得られる所望の
ハイブリドーマの分離は、通常の選択用培地、例えばＨ
ＡＴ培地（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミ
ジンを含む培地）で培養することにより行われる。該Ｈ
ＡＴ培地での培養は、目的とするハイブリドーマ以外の
細胞（未融合細胞等）が死滅するのに充分な時間、通常
数日から数週間行えばよい。かくして得られるハイブリ
ドーマは、通常の限界希釈法により目的とする抗体の検
索および単一クローン化に供される。
【００１３】目的抗体産生株の検索は、例えばＥＬＩＳ
Ａ法［Ｅｎｇｖａｌｌ，Ｅ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏ
ｌ．，７０，４１９−４３９（１９８０）］やラジオイ
ムノアッセイ（ＲＩＡ）法等の一般に抗体の検出に用い
られている種々の方法［Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，
９２，１４７−５２３（１９８３）］に従い実施するこ
とができ、さらにＮＦＳ６０細胞あるいは骨髄細胞のＭ
−ＣＳＦ依存性増殖の阻害等のＭ−ＣＳＦの生物活性の
阻止試験およびフローサイトメトリ等によりＭ−ＣＳＦ
Ｒ発現細胞への結合試験を組み合わせて行う。この検索
には上記免疫抗原が利用できる。
Ａ法［Ｅｎｇｖａｌｌ，Ｅ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏ
ｌ．，７０，４１９−４３９（１９８０）］やラジオイ
ムノアッセイ（ＲＩＡ）法等の一般に抗体の検出に用い
られている種々の方法［Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，
９２，１４７−５２３（１９８３）］に従い実施するこ
とができ、さらにＮＦＳ６０細胞あるいは骨髄細胞のＭ
−ＣＳＦ依存性増殖の阻害等のＭ−ＣＳＦの生物活性の
阻止試験およびフローサイトメトリ等によりＭ−ＣＳＦ
Ｒ発現細胞への結合試験を組み合わせて行う。この検索
には上記免疫抗原が利用できる。
【００１４】かくして得られるマウスＭ−ＣＳＦＲを認
識する所望のモノクローナル抗体を産生するハイブリド
ーマは、通常の培地で継代培養することができ、また、
液体窒素中で長期間保存することができる。
識する所望のモノクローナル抗体を産生するハイブリド
ーマは、通常の培地で継代培養することができ、また、
液体窒素中で長期間保存することができる。
【００１５】上記ハイブリドーマからの所望抗体の採取
は、該ハイブリドーマを定法に従って培養してその培養
上清として得る方法やハイブリドーマをこれと適合性の
ある哺乳動物に投与して増殖させ、その腹水として得る
方法等が採用される。一般に前者の方法は高純度の抗体
を得るのに適しており、後者の方法は抗体の大量生産に
適している。
は、該ハイブリドーマを定法に従って培養してその培養
上清として得る方法やハイブリドーマをこれと適合性の
ある哺乳動物に投与して増殖させ、その腹水として得る
方法等が採用される。一般に前者の方法は高純度の抗体
を得るのに適しており、後者の方法は抗体の大量生産に
適している。
【００１６】上記の如くして得られる本発明のモノクロ
ーナル抗体は、マウスＭ−ＣＳＦＲに特異反応を有する
ものである。さらに本発明のモノクローナル抗体は以下
の特性を有する。 ａ）分子量：約１６０，０００ ｂ）抗体のサブクラス：ＩｇＧ２ａ，κ ｃ）Ｍ−ＣＳＦがＭ−ＣＳＦＲをリン酸化するのを阻害
する活性を有する。 ｄ）Ｍ−ＣＳＦがＭ−ＣＳＦ依存性細胞株を増殖させる
作用を阻害する活性を有する。 ｅ）Ｍ−ＣＳＦが骨髄細胞からマクロファージを誘導す
る作用を阻害する活性を有する。 また本発明抗体は、マウスＭ−ＣＳＦＲを強く認識する
抗体であり、かかる抗体はマウスＭ−ＣＳＦＲを有する
細胞を検出するのに好適である。また、本発明抗体はヒ
トＭ−ＣＳＦＲも認識する。以上のことから、放射活性
または酵素により標識した抗体と固定した抗体とからな
るサンドイッチアッセイにおいて、または蛍光色素標識
抗体によるフローサイトメトリにおいて、本発明のモノ
クローナル抗体を用いることにより、Ｍ−ＣＳＦＲを測
定することができる。例えば、本発明抗体と細胞を反応
させた後、二次抗体としてＦＩＴＣ標識抗ラットＩｇＧ
抗体を加え、フローサイトメトリによりその細胞のＭ−
ＣＳＦＲの有無を検出することができる。
ーナル抗体は、マウスＭ−ＣＳＦＲに特異反応を有する
ものである。さらに本発明のモノクローナル抗体は以下
の特性を有する。 ａ）分子量：約１６０，０００ ｂ）抗体のサブクラス：ＩｇＧ２ａ，κ ｃ）Ｍ−ＣＳＦがＭ−ＣＳＦＲをリン酸化するのを阻害
する活性を有する。 ｄ）Ｍ−ＣＳＦがＭ−ＣＳＦ依存性細胞株を増殖させる
作用を阻害する活性を有する。 ｅ）Ｍ−ＣＳＦが骨髄細胞からマクロファージを誘導す
る作用を阻害する活性を有する。 また本発明抗体は、マウスＭ−ＣＳＦＲを強く認識する
抗体であり、かかる抗体はマウスＭ−ＣＳＦＲを有する
細胞を検出するのに好適である。また、本発明抗体はヒ
トＭ−ＣＳＦＲも認識する。以上のことから、放射活性
または酵素により標識した抗体と固定した抗体とからな
るサンドイッチアッセイにおいて、または蛍光色素標識
抗体によるフローサイトメトリにおいて、本発明のモノ
クローナル抗体を用いることにより、Ｍ−ＣＳＦＲを測
定することができる。例えば、本発明抗体と細胞を反応
させた後、二次抗体としてＦＩＴＣ標識抗ラットＩｇＧ
抗体を加え、フローサイトメトリによりその細胞のＭ−
ＣＳＦＲの有無を検出することができる。
【００１７】また、本発明抗体を用い、サンドイッチア
ッセイ等の通常の免疫学的測定法により、マウスＭ−Ｃ
ＳＦＲまたはそれを有する細胞を検出することができ
る。さらに、本発明抗体はＭ−ＣＳＦの作用を阻害する
ことができるので、マクロファージの分化増殖の機構を
解明する研究、造血幹細胞から破骨細胞への分化の研究
［Ｋｏｄａｍａ，Ｈ．， ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．
Ｍｅｄ．，１７３，１２９１−１２９４（１９９１）］
およびマクロファージが関与すると考えられる動脈硬化
症の研究 ［Ｉｓｈｉｂａｓｈｉ，Ｓ．， ｅｔ ａ
ｌ．，Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．，２６５，１４１
０９−１４１１７（１９９０）］等に利用することがで
きる。
ッセイ等の通常の免疫学的測定法により、マウスＭ−Ｃ
ＳＦＲまたはそれを有する細胞を検出することができ
る。さらに、本発明抗体はＭ−ＣＳＦの作用を阻害する
ことができるので、マクロファージの分化増殖の機構を
解明する研究、造血幹細胞から破骨細胞への分化の研究
［Ｋｏｄａｍａ，Ｈ．， ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．
Ｍｅｄ．，１７３，１２９１−１２９４（１９９１）］
およびマクロファージが関与すると考えられる動脈硬化
症の研究 ［Ｉｓｈｉｂａｓｈｉ，Ｓ．， ｅｔ ａ
ｌ．，Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．，２６５，１４１
０９−１４１１７（１９９０）］等に利用することがで
きる。
【００１８】
【実施例】以下、本発明をより詳しく説明するため実施
例を挙げるが、本発明はこれらに限定されるものではな
い。
例を挙げるが、本発明はこれらに限定されるものではな
い。
【００１９】実施例１ マウスＭ−ＣＳＦＲ−ヒトＩｇＧキメラ蛋白質の精製：（１）マウスＭ−ＣＳＦＲｃＤＮＡのクローニングとマ
ウスＭ−ＣＳＦＲ−ヒトＩｇＧキメラ蛋白質の発現用ベ
クターの構築 マウスＭ−ＣＳＦＲのｃＤＮＡとして報告されている塩
基配列［Ｒｏｔｈｗｅｌｌ，Ｖ．Ｍ．＆ Ｒｏｈｒｓｃ
ｈｅｉｄｅｒ，Ｌ．Ｒ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ Ｒｅｓ．，
１，３１１−３２４（１９８７）］をもとに、以下の２
種類のプライマーをＤＮＡシンセサイザーにて合成し
た。 ５’ＣＣＴＣＧＡＧＴＡＴＧＧＡＧＴＴＧＧＧＧＣＣＴ
ＣＣＴＣ３’（配列表の配列番号１）と ５’ＣＧＧＧＡＴＣＣＴＣＡＴＣＧＧＧＧＡＧＣＴＧＣ
ＴＴＧ３’（配列表の配列番号２）
ウスＭ−ＣＳＦＲ−ヒトＩｇＧキメラ蛋白質の発現用ベ
クターの構築 マウスＭ−ＣＳＦＲのｃＤＮＡとして報告されている塩
基配列［Ｒｏｔｈｗｅｌｌ，Ｖ．Ｍ．＆ Ｒｏｈｒｓｃ
ｈｅｉｄｅｒ，Ｌ．Ｒ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ Ｒｅｓ．，
１，３１１−３２４（１９８７）］をもとに、以下の２
種類のプライマーをＤＮＡシンセサイザーにて合成し
た。 ５’ＣＣＴＣＧＡＧＴＡＴＧＧＡＧＴＴＧＧＧＧＣＣＴ
ＣＣＴＣ３’（配列表の配列番号１）と ５’ＣＧＧＧＡＴＣＣＴＣＡＴＣＧＧＧＧＡＧＣＴＧＣ
ＴＴＧ３’（配列表の配列番号２）
【００２０】上記各プライマーを２０ｐｍｐｌ，Ｊ７７
４．１細胞のｍＲＮＡより得られたｃＤＮＡを０．２μ
ｇを０．５ｍｌのミクロ遠心チューブに取り、２０ｍＭ
トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．３），１．５ｍＭ ＭｇＣ
ｌ2 ，２５ｍＭ ＫＣｌ，１００μｇ／ｍｌ ゼラチ
ン，５０μＭ 各ｄＮＴＰ，４単位 ＴａｑＤＮＡポリ
メラーゼとなるように各試薬を加え、全量を５０μｌと
する。ＤＮＡの変性条件を９４℃で１分、プライマーの
アニーリング条件を６２℃で２分、プライマー伸長条件
を７２℃で３分の各条件でＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ
Ｃｅｔｕｓ社のＤＮＡサーマルサイクラーを用い、３０
サイクル反応させた。合成されたＤＮＡを制限酵素Ｘｈ
ｏＩおよびＢａｍＨＩにて消化し、これを１％アガロー
スゲルにて電気泳動し、マウスＭ−ＣＳＦＲの細胞外領
域の塩基配列を含む約１．５ｋｂのＤＮＡ断片を常法
（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ． Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ．
Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ．）に従って調製した。
４．１細胞のｍＲＮＡより得られたｃＤＮＡを０．２μ
ｇを０．５ｍｌのミクロ遠心チューブに取り、２０ｍＭ
トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．３），１．５ｍＭ ＭｇＣ
ｌ2 ，２５ｍＭ ＫＣｌ，１００μｇ／ｍｌ ゼラチ
ン，５０μＭ 各ｄＮＴＰ，４単位 ＴａｑＤＮＡポリ
メラーゼとなるように各試薬を加え、全量を５０μｌと
する。ＤＮＡの変性条件を９４℃で１分、プライマーの
アニーリング条件を６２℃で２分、プライマー伸長条件
を７２℃で３分の各条件でＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ
Ｃｅｔｕｓ社のＤＮＡサーマルサイクラーを用い、３０
サイクル反応させた。合成されたＤＮＡを制限酵素Ｘｈ
ｏＩおよびＢａｍＨＩにて消化し、これを１％アガロー
スゲルにて電気泳動し、マウスＭ−ＣＳＦＲの細胞外領
域の塩基配列を含む約１．５ｋｂのＤＮＡ断片を常法
（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ． Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ．
Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ．）に従って調製した。
【００２１】一方、Ｂ．Ｓｅｅｄより分与されたヒトＣ
Ｄ４−ヒトＩｇＧキメラ蛋白質発現ベクター、ＣＤ４Ｒ
ｇ［Ａｒｕｆｆｏ，Ａ．，ｅｔ ａｌ． Ｃｅｌｌ，６
１，１３０３−１３１３（１９９０）］を制限酵素Ｘｈ
ｏＩとＢａｍＨＩで消化し、ヒトＩｇＧ１遺伝子のヒン
ジ領域 （Ｈ）と定常領域部分（ＣＨ２とＣＨ３）を含
むＤＮＡ断片を１％アガロースゲルにて電気泳動するこ
とにより分離精製した。このＤＡＮ断片と上記の操作で
得たマウスＭ−ＣＳＦＲの細胞外領域の塩基配列を含む
ＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼにて連結した。
Ｄ４−ヒトＩｇＧキメラ蛋白質発現ベクター、ＣＤ４Ｒ
ｇ［Ａｒｕｆｆｏ，Ａ．，ｅｔ ａｌ． Ｃｅｌｌ，６
１，１３０３−１３１３（１９９０）］を制限酵素Ｘｈ
ｏＩとＢａｍＨＩで消化し、ヒトＩｇＧ１遺伝子のヒン
ジ領域 （Ｈ）と定常領域部分（ＣＨ２とＣＨ３）を含
むＤＮＡ断片を１％アガロースゲルにて電気泳動するこ
とにより分離精製した。このＤＡＮ断片と上記の操作で
得たマウスＭ−ＣＳＦＲの細胞外領域の塩基配列を含む
ＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼにて連結した。
【００２２】この連結したＤＮＡを用いて定法に従い大
腸菌（ＭＣ１０６１／Ｐ３株）を形質転換し、得られた
形質転換体よりプラスミドＤＮＡを調製した。次にこの
プラスミドＤＮＡを制限酵素ＸｈｏＩとＢａｍＨＩとで
消化することにより目的のマウスＭ−ＣＳＦＲＤＮＡ断
片が組み込まれていることを確認した。（該プラスミド
をＣＤＭｍｆｍｓＩｇと呼ぶ）。第１図に動物細胞発現
用マウスＭ−ＣＳＦＲ−ヒトＩｇＧキメラ蛋白質発現ベ
クターＣＤＭｍｆｍｓＩｇの構築図を示す。
腸菌（ＭＣ１０６１／Ｐ３株）を形質転換し、得られた
形質転換体よりプラスミドＤＮＡを調製した。次にこの
プラスミドＤＮＡを制限酵素ＸｈｏＩとＢａｍＨＩとで
消化することにより目的のマウスＭ−ＣＳＦＲＤＮＡ断
片が組み込まれていることを確認した。（該プラスミド
をＣＤＭｍｆｍｓＩｇと呼ぶ）。第１図に動物細胞発現
用マウスＭ−ＣＳＦＲ−ヒトＩｇＧキメラ蛋白質発現ベ
クターＣＤＭｍｆｍｓＩｇの構築図を示す。
【００２３】（２）動物細胞でのマウスＭ−ＣＳＦＲ−
ヒトＩｇＧキメラ蛋白質の発現と調製 上記（１）で得られたＣＤＭｍｆｍｓＩｇを５０ｍＭト
リス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）、４００μｇ／ｍｌのＤ
ＥＡＥデキストラン（ファルマシア社）および１００μ
Ｍのクロロキン（シグマ社）を含むＲＰＭＩ１６４０培
地に４μｇ／ｍｌとなるように加えておく。一方、直径
１０ｃｍのディッシュを用いて１０％ウシ胎児血清を含
むＲＰＭＩ１６４０培地で５０から７０％コンフルエン
トになるまで増殖させたＣＯＳ−１細胞（ＡＴＣＣ，
ＣＲＬ−１６５０）をＰＢＳで一回洗浄した後、上記で
得たＤＮＡ混合液をディッシュ当たり４ｍｌ加え、５％
ＣＯ2 の条件下で３７℃にて培養した。４時間後、細胞
をＰＢＳで洗浄後、１％のＮｕｔｒｉｄｏｍａ−ＮＳ
（ベーリンガーマンハイム社）を含むＤ−ＭＥＭ／Ｆ−
１２培地（ギブコ社）を２５ｍｌ加え、さらに培養を続
けた。
ヒトＩｇＧキメラ蛋白質の発現と調製 上記（１）で得られたＣＤＭｍｆｍｓＩｇを５０ｍＭト
リス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）、４００μｇ／ｍｌのＤ
ＥＡＥデキストラン（ファルマシア社）および１００μ
Ｍのクロロキン（シグマ社）を含むＲＰＭＩ１６４０培
地に４μｇ／ｍｌとなるように加えておく。一方、直径
１０ｃｍのディッシュを用いて１０％ウシ胎児血清を含
むＲＰＭＩ１６４０培地で５０から７０％コンフルエン
トになるまで増殖させたＣＯＳ−１細胞（ＡＴＣＣ，
ＣＲＬ−１６５０）をＰＢＳで一回洗浄した後、上記で
得たＤＮＡ混合液をディッシュ当たり４ｍｌ加え、５％
ＣＯ2 の条件下で３７℃にて培養した。４時間後、細胞
をＰＢＳで洗浄後、１％のＮｕｔｒｉｄｏｍａ−ＮＳ
（ベーリンガーマンハイム社）を含むＤ−ＭＥＭ／Ｆ−
１２培地（ギブコ社）を２５ｍｌ加え、さらに培養を続
けた。
【００２４】４日後に培養上清を集め、培養上清をＰＢ
Ｓで平衡化したＰＲＯＳＥＰ−Ａ（Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓ
ｓｉｎｇ社）に添加した。ＰＢＳでカラムを洗浄し、未
吸着物質を除去した。その後、１０ｍＭ塩酸溶液にて溶
出し、この溶出液に１／１０容の０．２Ｍリン酸ナトリ
ウム緩衝液（ｐＨ８．０）を加えて中和した。こうして
精製マウスＭ−ＣＳＦＲ−ヒトＩｇＧキメラ蛋白質を得
た。
Ｓで平衡化したＰＲＯＳＥＰ−Ａ（Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓ
ｓｉｎｇ社）に添加した。ＰＢＳでカラムを洗浄し、未
吸着物質を除去した。その後、１０ｍＭ塩酸溶液にて溶
出し、この溶出液に１／１０容の０．２Ｍリン酸ナトリ
ウム緩衝液（ｐＨ８．０）を加えて中和した。こうして
精製マウスＭ−ＣＳＦＲ−ヒトＩｇＧキメラ蛋白質を得
た。
【００２５】実施例２ モノクロ−ナル抗体の作製： 実施例１で得られたマウスＭ−ＣＳＦＲ−ヒトＩｇＧキ
メラ蛋白質をマウスＭ−ＣＳＦＲの抗原として用いた。
すなわち、マウスＭ−ＣＳＦＲ−ヒトＩｇＧキメラ蛋白
質５００μｇを完全Ｆｒｅｕｎｄ’ｓアジュバントと混
合し、ウィスター系ラットに皮下投与した。約３０日後
に生理食塩水で調製した５０μｇのマウスＭ−ＣＳＦＲ
−ヒトＩｇＧキメラ蛋白質を静脈内投与した。
メラ蛋白質をマウスＭ−ＣＳＦＲの抗原として用いた。
すなわち、マウスＭ−ＣＳＦＲ−ヒトＩｇＧキメラ蛋白
質５００μｇを完全Ｆｒｅｕｎｄ’ｓアジュバントと混
合し、ウィスター系ラットに皮下投与した。約３０日後
に生理食塩水で調製した５０μｇのマウスＭ−ＣＳＦＲ
−ヒトＩｇＧキメラ蛋白質を静脈内投与した。
【００２６】４日後に、脾細胞を調製し、常法［Ｓｕｄ
ｏ，Ｔ．， ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ， ９０， ９１２５−９１２９
（１９９３）］に従って、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３細
胞（ＡＴＣＣ，ＣＲＬ−１５８０）と融合させた。融合
細胞を１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、１００単位／ｍ
ｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、
５０μＭ２−メルカプトエタノールを含むＲＰＭＩ１６
４０培地に懸濁し、これを９６ウエルプレートに１００
μｌ／ウエルの割合で入れ、３７℃、５％ＣＯ2 インキ
ュベーター中で培養した。
ｏ，Ｔ．， ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ， ９０， ９１２５−９１２９
（１９９３）］に従って、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３細
胞（ＡＴＣＣ，ＣＲＬ−１５８０）と融合させた。融合
細胞を１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、１００単位／ｍ
ｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、
５０μＭ２−メルカプトエタノールを含むＲＰＭＩ１６
４０培地に懸濁し、これを９６ウエルプレートに１００
μｌ／ウエルの割合で入れ、３７℃、５％ＣＯ2 インキ
ュベーター中で培養した。
【００２７】ハイブリドーマ細胞をＨＡＴ培地で選別
後、その上清を２つの異なるアッセイ系でスクリーニン
グを行った。
後、その上清を２つの異なるアッセイ系でスクリーニン
グを行った。
【００２８】第１の試験は、ハイブリドーマの培養上清
中の抗体がＮＦＳ６０細胞のＭ−ＣＳＦ依存性の増殖を
阻害するか否かを測定した。ＮＦＳ６０細胞をリン酸緩
衝液（ＰＢＳ）で２回洗浄し、１０％ＦＣＳおよび５０
μＭ２−メルカプトエタノールを含むＲＰＭＩ１６４０
培地に懸濁する。２４ウエルプレートに細胞を１Ｘ１０
5 個／０．５ｍｌ／ウエル加え、次にハイブリドーマの
培養上清を１００μｌ加える。１時間培養後、Ｍ−ＣＳ
Ｆを加える。２日間培養後、細胞数を計測し、ハイブリ
ドーマ培養上清中のＭ−ＣＳＦ依存性増殖阻害活性を調
べた。
中の抗体がＮＦＳ６０細胞のＭ−ＣＳＦ依存性の増殖を
阻害するか否かを測定した。ＮＦＳ６０細胞をリン酸緩
衝液（ＰＢＳ）で２回洗浄し、１０％ＦＣＳおよび５０
μＭ２−メルカプトエタノールを含むＲＰＭＩ１６４０
培地に懸濁する。２４ウエルプレートに細胞を１Ｘ１０
5 個／０．５ｍｌ／ウエル加え、次にハイブリドーマの
培養上清を１００μｌ加える。１時間培養後、Ｍ−ＣＳ
Ｆを加える。２日間培養後、細胞数を計測し、ハイブリ
ドーマ培養上清中のＭ−ＣＳＦ依存性増殖阻害活性を調
べた。
【００２９】第２の試験は、ハイブリドーマの培養上清
中の抗体がＮＦＳ６０細胞または単球由来のＪ７７４．
１細胞（ＡＴＣＣ，ＴＩＢ−６７）のＭ−ＣＳＦＲに結
合するか否かをハイブリドーマ上清と上記細胞とを反応
させ、二次抗体としてＦＩＴＣ標識抗ラットＩｇ抗体を
用いて染色し、フローサイトメトリで解析した。
中の抗体がＮＦＳ６０細胞または単球由来のＪ７７４．
１細胞（ＡＴＣＣ，ＴＩＢ−６７）のＭ−ＣＳＦＲに結
合するか否かをハイブリドーマ上清と上記細胞とを反応
させ、二次抗体としてＦＩＴＣ標識抗ラットＩｇ抗体を
用いて染色し、フローサイトメトリで解析した。
【００３０】上記の方法で、約１２００ウエルのハイブ
リドーマの培養上清をスクリーニングし、目的のマウス
Ｍ−ＣＳＦＲに対する抗体を産生する細胞株を１株検出
した。限界希釈法によりクローニングを繰り返して、所
望の抗体産生クローンを得た。該クローン（ＡＦＳ９８
−１）は、工業技術院生命工学工業技術研究所に、ＦＥ
ＲＭＢＰ−１５１０５として寄託されている。
リドーマの培養上清をスクリーニングし、目的のマウス
Ｍ−ＣＳＦＲに対する抗体を産生する細胞株を１株検出
した。限界希釈法によりクローニングを繰り返して、所
望の抗体産生クローンを得た。該クローン（ＡＦＳ９８
−１）は、工業技術院生命工学工業技術研究所に、ＦＥ
ＲＭＢＰ−１５１０５として寄託されている。
【００３１】実施例３ ＡＦＳ９８から得られた抗体（以下、ＡＦＳ９８と呼
ぶ）の特性：（１）抗体のサブクラス ラット抗体サブクラス検出キット（ザイメッド社）を用
いて決定した上記抗体のサブクラスは（ＩｇＧ２ａ、
κ）であった。
ぶ）の特性：（１）抗体のサブクラス ラット抗体サブクラス検出キット（ザイメッド社）を用
いて決定した上記抗体のサブクラスは（ＩｇＧ２ａ、
κ）であった。
【００３２】（２）分子量 ハイブリドーマを無血清培地にて培養後、硫酸アンモニ
ウム塩析を２回行い、抗ラットＩｇＧ抗体結合セファロ
ース４Ｂカラムにより精製した。その後、ＳＤＳ−ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動を行い、クマシー ブリリ
アント ブルーで染色すると、ＡＦＳ９８以外のバンド
は認められなかった。この分析により求めた該抗体の分
子量（重鎖と軽鎖の分子量の和を抗体の分子量とする）
は約１６０ｋｄであった。
ウム塩析を２回行い、抗ラットＩｇＧ抗体結合セファロ
ース４Ｂカラムにより精製した。その後、ＳＤＳ−ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動を行い、クマシー ブリリ
アント ブルーで染色すると、ＡＦＳ９８以外のバンド
は認められなかった。この分析により求めた該抗体の分
子量（重鎖と軽鎖の分子量の和を抗体の分子量とする）
は約１６０ｋｄであった。
【００３３】（３）交叉反応性 実施例１に示したキメラ蛋白質を作製する方法を用いて
作製した各種レセプターとヒトＩｇＧとのキメラ蛋白質
とＡＦＳ９８が反応するか否かについて調べた。 その
結果、ＡＦＳ９８は、マウスＭ−ＣＳＦＲ−ヒトＩｇＧ
キメラ蛋白質と強く反応し、ヒトＭ−ＣＳＦＲ−ヒトＩ
ｇＧキメラ蛋白質とは弱く反応することが分かった。ま
た、マウスＰＤＧＦαレセプター−ヒトＩｇＧキメラ蛋
白質、マウスｆｌｋ１−ヒトＩｇＧキメラ蛋白質、マウ
スｆｌｋ２−ヒトＩｇＧキメラ蛋白質、マウスＩＬ−７
レセプター−ヒトＩｇＧキメラ蛋白質およびマウスｇｐ
１３０−ヒトＩｇＧキメラ蛋白質とは交叉反応しないこ
とが示された。
作製した各種レセプターとヒトＩｇＧとのキメラ蛋白質
とＡＦＳ９８が反応するか否かについて調べた。 その
結果、ＡＦＳ９８は、マウスＭ−ＣＳＦＲ−ヒトＩｇＧ
キメラ蛋白質と強く反応し、ヒトＭ−ＣＳＦＲ−ヒトＩ
ｇＧキメラ蛋白質とは弱く反応することが分かった。ま
た、マウスＰＤＧＦαレセプター−ヒトＩｇＧキメラ蛋
白質、マウスｆｌｋ１−ヒトＩｇＧキメラ蛋白質、マウ
スｆｌｋ２−ヒトＩｇＧキメラ蛋白質、マウスＩＬ−７
レセプター−ヒトＩｇＧキメラ蛋白質およびマウスｇｐ
１３０−ヒトＩｇＧキメラ蛋白質とは交叉反応しないこ
とが示された。
【００３４】（４）中和活性 造血因子に反応して骨髄細胞から形成されるコロニー
が、ＡＦＳ９８により阻害されるか否かについて調べ
た。
が、ＡＦＳ９８により阻害されるか否かについて調べ
た。
【００３５】Ｃ５７ＢＬマウスから大腿骨を採取し、常
法［Ｂｅｎｎｅｒ，Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，ｉｎ Ｉｍｍ
ｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．、Ｖｏｌ．
２，（Ｌｅｆｋｏｖｉｔｓ，Ｉ．＆ Ｐｅｒｎｉｓ，
Ｂ．，ｅｄ．）２４７−２６１，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐ
ｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ．（１９８１）］に従って
骨髄細胞を調製した。
法［Ｂｅｎｎｅｒ，Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，ｉｎ Ｉｍｍ
ｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．、Ｖｏｌ．
２，（Ｌｅｆｋｏｖｉｔｓ，Ｉ．＆ Ｐｅｒｎｉｓ，
Ｂ．，ｅｄ．）２４７−２６１，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐ
ｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ．（１９８１）］に従って
骨髄細胞を調製した。
【００３６】次に骨髄細胞をステンレス製のメッシュに
通し細胞の塊を除去した後、直径１００ｍｍのディッシ
ュ（コーニング社）に移し、３７℃、５％ＣＯ2 条件下
で１時間静置し接着性の細胞を除いた。さらにα−ＭＥ
Ｍ（ギブコ社）で２回洗浄し、細胞濃度が２Ｘ１０4 個
／ｍｌとなるように２０％ＦＣＳ、１％脱イオン化牛血
清アルブミン（シグマ社）、１％メチルセルロース、
０．１ｍＭ ２−メルカプトエタノールおよび各種造血
因子と種々の濃度のＡＦＳ９８を含むα−ＭＥＭで懸濁
し、直径３５ｍｍのディッシュ（ファルコン社）当たり
１ｍｌ加え、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で培養した。
各造血因子は、マウスＩＬ−３：１００単位／ｍｌ、マ
ウスＧＭ−ＣＳＦ：１００単位／ｍｌ、マウスＭ−ＣＳ
Ｆ：１０ｎｇ／ｍｌの濃度で添加した。。
通し細胞の塊を除去した後、直径１００ｍｍのディッシ
ュ（コーニング社）に移し、３７℃、５％ＣＯ2 条件下
で１時間静置し接着性の細胞を除いた。さらにα−ＭＥ
Ｍ（ギブコ社）で２回洗浄し、細胞濃度が２Ｘ１０4 個
／ｍｌとなるように２０％ＦＣＳ、１％脱イオン化牛血
清アルブミン（シグマ社）、１％メチルセルロース、
０．１ｍＭ ２−メルカプトエタノールおよび各種造血
因子と種々の濃度のＡＦＳ９８を含むα−ＭＥＭで懸濁
し、直径３５ｍｍのディッシュ（ファルコン社）当たり
１ｍｌ加え、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で培養した。
各造血因子は、マウスＩＬ−３：１００単位／ｍｌ、マ
ウスＧＭ−ＣＳＦ：１００単位／ｍｌ、マウスＭ−ＣＳ
Ｆ：１０ｎｇ／ｍｌの濃度で添加した。。
【００３７】これらの造血因子と種々の濃度のＡＦＳ９
８の組み合わせにより、骨髄細胞２Ｘ１０4 個当たりに
形成されたコロニーの数を培養後７日目に調べたとこ
ろ、第図２に示すように、Ｍ−ＣＳＦで形成されるコロ
ニーのみがＡＦＳ９８で阻害された。
８の組み合わせにより、骨髄細胞２Ｘ１０4 個当たりに
形成されたコロニーの数を培養後７日目に調べたとこ
ろ、第図２に示すように、Ｍ−ＣＳＦで形成されるコロ
ニーのみがＡＦＳ９８で阻害された。
【００３８】以上の結果からＡＦＳ９８はＭ−ＣＳＦの
作用を特異的に中和することが分かった。また１０ｎｇ
／ｍｌのＭ−ＣＳＦのコロニー形成刺激活性を完全に阻
害するＡＦＳ９８の濃度は０．１μｇ／ｍｌであった。
作用を特異的に中和することが分かった。また１０ｎｇ
／ｍｌのＭ−ＣＳＦのコロニー形成刺激活性を完全に阻
害するＡＦＳ９８の濃度は０．１μｇ／ｍｌであった。
【００３９】実施例４ ＡＦＳ９８を用いたフローサイトメトリによるＭ−ＣＳ
ＦＲの検出：（１）フローサイトメトリを用いたＭ−ＣＳＦＲ陽性細
胞の検出 マウス骨髄芽球細胞株ＦＤＣ−Ｐ２，ＮＦＳ６０（Ｍ−
ＣＳＦ依存性増殖を示す）および単球由来細胞株Ｊ７７
４．１とＡＦＳ９８を反応させ、２次抗体としてＦＩＴ
Ｃ標識抗ラットＩｇＧ抗体を用いて染色し、フローサイ
トメトリにて解析すると、ＮＦＳ６０およびＪ７７４．
１は明らかに陽性となった。しかし、ＦＤＣ−Ｐ２は陰
性であった。
ＦＲの検出：（１）フローサイトメトリを用いたＭ−ＣＳＦＲ陽性細
胞の検出 マウス骨髄芽球細胞株ＦＤＣ−Ｐ２，ＮＦＳ６０（Ｍ−
ＣＳＦ依存性増殖を示す）および単球由来細胞株Ｊ７７
４．１とＡＦＳ９８を反応させ、２次抗体としてＦＩＴ
Ｃ標識抗ラットＩｇＧ抗体を用いて染色し、フローサイ
トメトリにて解析すると、ＮＦＳ６０およびＪ７７４．
１は明らかに陽性となった。しかし、ＦＤＣ−Ｐ２は陰
性であった。
【００４０】（２）フローサイトメトリを用いたマウス
骨髄細胞中のＭ−ＣＳＦＲ陽性細胞の検出 正常マウス骨髄細胞中のＭ−ＣＳＦＲ陽性細胞の割合を
フローサイトメトリにて解析した。ＡＦＳ９８はＦＩＴ
Ｃまたはビオチンで標識を行い使用した。Ｃ５７ＢＬマ
ウスから大腿骨を採取し、常法［Ｂｅｎｎｅｒ，Ｒ．，
ｅｔ ａｌ．，ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ．、Ｖｏｌ．２，（Ｌｅｆｋｏｖｉｔｓ，
Ｉ．＆ Ｐｅｒｎｉｓ，Ｂ．，ｅｄ．）２４７−２６
１，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒ
ｋ．（１９８１）］に従って骨髄細胞を調製した。骨髄
細胞をＦＩＴＣ標識したＡＦＳ９８とビオチンで標識し
た抗ｃ−ｋｉｔ抗体（未分化な造血細胞のマーカー）で
あるＡＣＫ４ ［Ｏｇａｗａ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，
Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７４，６３−７１（１９９
１）］で反応させ、フィコエリスリン−アビジン（ベク
トンデッキンソン社）で染色しフローサイトメトリ解析
を行った。
骨髄細胞中のＭ−ＣＳＦＲ陽性細胞の検出 正常マウス骨髄細胞中のＭ−ＣＳＦＲ陽性細胞の割合を
フローサイトメトリにて解析した。ＡＦＳ９８はＦＩＴ
Ｃまたはビオチンで標識を行い使用した。Ｃ５７ＢＬマ
ウスから大腿骨を採取し、常法［Ｂｅｎｎｅｒ，Ｒ．，
ｅｔ ａｌ．，ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ．、Ｖｏｌ．２，（Ｌｅｆｋｏｖｉｔｓ，
Ｉ．＆ Ｐｅｒｎｉｓ，Ｂ．，ｅｄ．）２４７−２６
１，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒ
ｋ．（１９８１）］に従って骨髄細胞を調製した。骨髄
細胞をＦＩＴＣ標識したＡＦＳ９８とビオチンで標識し
た抗ｃ−ｋｉｔ抗体（未分化な造血細胞のマーカー）で
あるＡＣＫ４ ［Ｏｇａｗａ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，
Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７４，６３−７１（１９９
１）］で反応させ、フィコエリスリン−アビジン（ベク
トンデッキンソン社）で染色しフローサイトメトリ解析
を行った。
【００４１】さらに骨髄細胞をビオチンで標識したＡＦ
Ｓ９８とＦＩＴＣで標識した単球系マーカーであるＭａ
ｃ１［Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，Ｅｕ
ｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９，３０１−３０６（１９７
９）］あるいはビオチンで標識したＡＦＳ９８とＦＩＴ
Ｃで標識したＢ細胞マーカーであるＢ２２０（ＲＡ３−
６Ｂ２）［Ｃｏｆｆｍａｎ，Ｒ．Ｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．
Ｒｅｖ．，６９，５（１９８６）］あるいはビオチンで
標識したＡＦＳ９８とＦＩＴＣで標識した赤血球系マー
カーであるＴｅｒ１１９［Ｉｋｕｔａ，Ｋ．，ｅｔ ａ
ｌ．，Ｃｅｌｌ，６２，８６３−８７４（１９９０）］
でそれぞれ反応させフィコエリスリン−アビジンで染色
しフローサイトメトリ解析を行った。
Ｓ９８とＦＩＴＣで標識した単球系マーカーであるＭａ
ｃ１［Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，Ｅｕ
ｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９，３０１−３０６（１９７
９）］あるいはビオチンで標識したＡＦＳ９８とＦＩＴ
Ｃで標識したＢ細胞マーカーであるＢ２２０（ＲＡ３−
６Ｂ２）［Ｃｏｆｆｍａｎ，Ｒ．Ｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．
Ｒｅｖ．，６９，５（１９８６）］あるいはビオチンで
標識したＡＦＳ９８とＦＩＴＣで標識した赤血球系マー
カーであるＴｅｒ１１９［Ｉｋｕｔａ，Ｋ．，ｅｔ ａ
ｌ．，Ｃｅｌｌ，６２，８６３−８７４（１９９０）］
でそれぞれ反応させフィコエリスリン−アビジンで染色
しフローサイトメトリ解析を行った。
【００４２】その結果、ｃ−ｋｉｔ陽性Ｍ−ＣＳＦＲ陰
性細胞が１．９％、ｃ−ｋｉｔ陰性Ｍ−ＣＳＦＲ陽性細
胞が４．８％、ｃ−ｋｉｔ陽性Ｍ−ＣＳＦＲ陽性細胞が
０．４％であり、Ｍａｃ１陽性Ｍ−ＣＳＦＲ陰性細胞が
１５．２％、Ｍａｃ１陰性Ｍ−ＣＳＦＲ陽性細胞が１．
５％、Ｍａｃ１陽性Ｍ−ＣＳＦＲ陽性細胞が３．２％で
あった。また、Ｂ２２０陽性Ｍ−ＣＳＦＲ陰性細胞が２
４．５％、Ｂ２２０陰性Ｍ−ＣＳＦＲ陽性細胞が４．１
％、Ｂ２２０陽性Ｍ−ＣＳＦＲ陽性細胞が０．１％であ
り、Ｔｅｒ１１９陽性Ｍ−ＣＳＦＲ陰性細胞が４６．６
％、Ｔｅｒ１１９陰性Ｍ−ＣＳＦＲ陽性細胞が４．４
％、Ｔｅｒ１１９陽性Ｍ−ＣＳＦＲ陽性細胞が０．３％
であった。以上の結果から、Ｍ−ＣＳＦＲは単球系の細
胞に３．２％、Ｂ細胞系の細胞に０．１％、赤血球系の
細胞に０．３％、未分化な細胞に０．４％発現している
ことが示された。また、Ｍ−ＣＳＦＲ陽性細胞は骨髄中
の約４から５％であった。
性細胞が１．９％、ｃ−ｋｉｔ陰性Ｍ−ＣＳＦＲ陽性細
胞が４．８％、ｃ−ｋｉｔ陽性Ｍ−ＣＳＦＲ陽性細胞が
０．４％であり、Ｍａｃ１陽性Ｍ−ＣＳＦＲ陰性細胞が
１５．２％、Ｍａｃ１陰性Ｍ−ＣＳＦＲ陽性細胞が１．
５％、Ｍａｃ１陽性Ｍ−ＣＳＦＲ陽性細胞が３．２％で
あった。また、Ｂ２２０陽性Ｍ−ＣＳＦＲ陰性細胞が２
４．５％、Ｂ２２０陰性Ｍ−ＣＳＦＲ陽性細胞が４．１
％、Ｂ２２０陽性Ｍ−ＣＳＦＲ陽性細胞が０．１％であ
り、Ｔｅｒ１１９陽性Ｍ−ＣＳＦＲ陰性細胞が４６．６
％、Ｔｅｒ１１９陰性Ｍ−ＣＳＦＲ陽性細胞が４．４
％、Ｔｅｒ１１９陽性Ｍ−ＣＳＦＲ陽性細胞が０．３％
であった。以上の結果から、Ｍ−ＣＳＦＲは単球系の細
胞に３．２％、Ｂ細胞系の細胞に０．１％、赤血球系の
細胞に０．３％、未分化な細胞に０．４％発現している
ことが示された。また、Ｍ−ＣＳＦＲ陽性細胞は骨髄中
の約４から５％であった。
【００４３】実施例５ ＡＦＳ９８が認識する細胞表面抗原の検出：４Ｘ１０7
個のＪ７７４．１細胞を１ｍｌの０．１５Ｍ ＮａＣｌ
および０．５ｍｇ／ｍｌ ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ｂｉｏ
ｔｉｎ （ピアース社）を含む０．１Ｍ Ｈｅｐｅｓ緩
衝液（ｐＨ８．０）に懸濁し、３０分間室温にてときど
きゆっくり撹拌しながら反応させ細胞表面の蛋白質をビ
オチンで標識する。細胞をＲＰＭＩ１６４０培地で３回
洗浄し、１％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１ｍｇ／ｍｌ
ｐｅｆａｂｌｏｃＳＣ、 １μｇ／ｍｌ ｌｅｕｐｅ
ｐｔｉｎ、１μｇ／ｍｌ ｐｅｐｓｔａｔｉｎ、０．１
μｇ／ｍｌ ａｐｒｏｔｉｎｉｎ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、
１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む５０ｍＭ トリス塩酸緩衝
液（ｐＨ７．２）（以後ＩＰと呼ぶ）に懸濁し氷中に３
０分置いて細胞を溶解させた。遠心し、細胞溶解液にヤ
ギ抗ラットＩｇＧを結合させたダイナビーズ（Ｄｙｎａ
ｌ社）を加え、一夜、４℃にて反応させた。磁石でダイ
ナビーズを除き、上清を２等分し、一方にＡＦＳ９８を
吸着させたヤギ抗ラットＩｇＧ結合ダイナビーズを、も
う一方にコントロール抗体としてラット抗マウスＩＬ−
４抗体 （１１Ｂ１１）（ファーミンジェン社）を吸着
させたヤギ抗ラットＩｇＧ結合ダイナビーズ加え４℃に
て１時間反応させた。ビーズをＩＰにて５回洗浄後、ビ
ーズに電気泳動用サンプルバッファーを加え、１００℃
で５分間処理し、還元下で、８％ＳＤＳ−ポリアクリル
アミドゲルにて電気泳動した。電気泳動後、ニトロセル
ロース膜（アマシャム社）に蛋白質を転写した。ニトロ
セルロース膜をブロックエース（大日本製薬）にてブロ
ッキングを行い、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０および
０．１５ＭＮａＣｌ，を含む５０ｍＭ トリス塩酸緩衝
液（ｐＨ７．４）（以後Ｔ−ＴＢＳと呼ぶ）で膜を洗浄
し、ストレプトアビジン−ホースラディッシュペルオキ
シダーゼ複合体（アマシャム社）をＴ−ＴＢＳで３００
０倍に希釈した溶液に浸す。１時間反応させ、Ｔ−ＴＢ
Ｓで洗浄後、アマシャム社のＥＣＬ検出システムにて膜
に転写された蛋白質を検出した。その結果、コントロー
ル抗体である１１Ｂ１１はＪ７７４．１細胞のどんな蛋
白質も沈降させないが、ＡＦＳ９８は分子量約１７０ｋ
ｄの蛋白質をＪ７７４．１細胞から沈降させることが明
らかにされた。この約１７０ｋｄの蛋白質はマウスＭ−
ＣＳＦＲの分子量と一致した。
個のＪ７７４．１細胞を１ｍｌの０．１５Ｍ ＮａＣｌ
および０．５ｍｇ／ｍｌ ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ｂｉｏ
ｔｉｎ （ピアース社）を含む０．１Ｍ Ｈｅｐｅｓ緩
衝液（ｐＨ８．０）に懸濁し、３０分間室温にてときど
きゆっくり撹拌しながら反応させ細胞表面の蛋白質をビ
オチンで標識する。細胞をＲＰＭＩ１６４０培地で３回
洗浄し、１％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１ｍｇ／ｍｌ
ｐｅｆａｂｌｏｃＳＣ、 １μｇ／ｍｌ ｌｅｕｐｅ
ｐｔｉｎ、１μｇ／ｍｌ ｐｅｐｓｔａｔｉｎ、０．１
μｇ／ｍｌ ａｐｒｏｔｉｎｉｎ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、
１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む５０ｍＭ トリス塩酸緩衝
液（ｐＨ７．２）（以後ＩＰと呼ぶ）に懸濁し氷中に３
０分置いて細胞を溶解させた。遠心し、細胞溶解液にヤ
ギ抗ラットＩｇＧを結合させたダイナビーズ（Ｄｙｎａ
ｌ社）を加え、一夜、４℃にて反応させた。磁石でダイ
ナビーズを除き、上清を２等分し、一方にＡＦＳ９８を
吸着させたヤギ抗ラットＩｇＧ結合ダイナビーズを、も
う一方にコントロール抗体としてラット抗マウスＩＬ−
４抗体 （１１Ｂ１１）（ファーミンジェン社）を吸着
させたヤギ抗ラットＩｇＧ結合ダイナビーズ加え４℃に
て１時間反応させた。ビーズをＩＰにて５回洗浄後、ビ
ーズに電気泳動用サンプルバッファーを加え、１００℃
で５分間処理し、還元下で、８％ＳＤＳ−ポリアクリル
アミドゲルにて電気泳動した。電気泳動後、ニトロセル
ロース膜（アマシャム社）に蛋白質を転写した。ニトロ
セルロース膜をブロックエース（大日本製薬）にてブロ
ッキングを行い、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０および
０．１５ＭＮａＣｌ，を含む５０ｍＭ トリス塩酸緩衝
液（ｐＨ７．４）（以後Ｔ−ＴＢＳと呼ぶ）で膜を洗浄
し、ストレプトアビジン−ホースラディッシュペルオキ
シダーゼ複合体（アマシャム社）をＴ−ＴＢＳで３００
０倍に希釈した溶液に浸す。１時間反応させ、Ｔ−ＴＢ
Ｓで洗浄後、アマシャム社のＥＣＬ検出システムにて膜
に転写された蛋白質を検出した。その結果、コントロー
ル抗体である１１Ｂ１１はＪ７７４．１細胞のどんな蛋
白質も沈降させないが、ＡＦＳ９８は分子量約１７０ｋ
ｄの蛋白質をＪ７７４．１細胞から沈降させることが明
らかにされた。この約１７０ｋｄの蛋白質はマウスＭ−
ＣＳＦＲの分子量と一致した。
【００４４】実施例６ ＡＦＳ９８が認識する分子量約１７０ｋｄの蛋白質の同
定：Ｍ−ＣＳＦがＭ−ＣＳＦＲに結合するとＭ−ＣＳＦ
Ｒがリン酸化されることが知られている。本発明抗体で
あるＡＦＳ９８が認識する分子量約１７０ｋｄの蛋白質
がＭ−ＣＳＦＲであるか否かを明らかにするために、約
１７０ｋｄの蛋白質がＭ−ＣＳＦによりリン酸化される
かについて調べた。
定：Ｍ−ＣＳＦがＭ−ＣＳＦＲに結合するとＭ−ＣＳＦ
Ｒがリン酸化されることが知られている。本発明抗体で
あるＡＦＳ９８が認識する分子量約１７０ｋｄの蛋白質
がＭ−ＣＳＦＲであるか否かを明らかにするために、約
１７０ｋｄの蛋白質がＭ−ＣＳＦによりリン酸化される
かについて調べた。
【００４５】Ｊ７７４．１細胞を１０％ＦＣＳを含むＲ
ＰＭＩ１６４０培地で培養し、ＰＢＳで３回洗浄し、Ｆ
ＣＳを含まないＲＰＭＩ１６４０培地でさらに培養を続
ける。１６時間後、ＲＰＭＩ１６４０培地で洗浄後、Ｊ
７７４．１細胞を１Ｘ１０7個／ｍｌとなるように２５
ｍＭＨｅｐｅｓ緩衝液（ｐＨ７．２）、０．１ｍＭＮａ
3 ＶＯ4 を含むＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁した。１Ｘ
１０７個のＪ７７４．１細胞を０．１μｇのヒトＭ−Ｃ
ＳＦ（Ｒ＆Ｄシステム社）存在下または非存在下で３７
℃にて培養した。１０分後、細胞を氷冷した１ｍＭ Ｎ
ａ3 ＶＯ4 を含むＰＢＳで３回洗浄した。細胞を２ｍＭ
Ｎａ3 ＶＯ4 、１０ｍＭ ピロリン酸ナトリウムおよ
び１００ｍＭ ＮａＦを含むＩＰ（以後Ｖ−ＩＰと呼
ぶ）に懸濁し氷中に３０分置いて細胞を溶解させた。遠
心し、細胞溶解液にヤギ抗ラットＩｇＧを結合させたダ
イナビーズ（Ｄｙｎａｌ社）を加え、一夜、４℃にて反
応させた。磁石でダイナビーズを除き、上清にＡＦＳ９
８を吸着させたヤギ抗ラットＩｇＧ結合ダイナビーズを
加え１時間反応させ、Ｖ−ＩＰでビーズを５回洗浄後、
ビーズに電気泳動用サンプルバッファーを加え、１００
℃で５分間処理し、還元下で、８％ＳＤＳ−ポリアクリ
ルアミドゲルにて電気泳動した。電気泳動後、ニトロセ
ルロース膜（アマシャム社）に蛋白質を転写し、抗リン
酸化チロシン抗体である４Ｇ１０（Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂ
ｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）を用いてウエスタンブロ
ットを行なった。４Ｇ１０に反応する蛋白質の検出はＥ
ＣＬシステム（アマシャム社）を用いた。
ＰＭＩ１６４０培地で培養し、ＰＢＳで３回洗浄し、Ｆ
ＣＳを含まないＲＰＭＩ１６４０培地でさらに培養を続
ける。１６時間後、ＲＰＭＩ１６４０培地で洗浄後、Ｊ
７７４．１細胞を１Ｘ１０7個／ｍｌとなるように２５
ｍＭＨｅｐｅｓ緩衝液（ｐＨ７．２）、０．１ｍＭＮａ
3 ＶＯ4 を含むＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁した。１Ｘ
１０７個のＪ７７４．１細胞を０．１μｇのヒトＭ−Ｃ
ＳＦ（Ｒ＆Ｄシステム社）存在下または非存在下で３７
℃にて培養した。１０分後、細胞を氷冷した１ｍＭ Ｎ
ａ3 ＶＯ4 を含むＰＢＳで３回洗浄した。細胞を２ｍＭ
Ｎａ3 ＶＯ4 、１０ｍＭ ピロリン酸ナトリウムおよ
び１００ｍＭ ＮａＦを含むＩＰ（以後Ｖ−ＩＰと呼
ぶ）に懸濁し氷中に３０分置いて細胞を溶解させた。遠
心し、細胞溶解液にヤギ抗ラットＩｇＧを結合させたダ
イナビーズ（Ｄｙｎａｌ社）を加え、一夜、４℃にて反
応させた。磁石でダイナビーズを除き、上清にＡＦＳ９
８を吸着させたヤギ抗ラットＩｇＧ結合ダイナビーズを
加え１時間反応させ、Ｖ−ＩＰでビーズを５回洗浄後、
ビーズに電気泳動用サンプルバッファーを加え、１００
℃で５分間処理し、還元下で、８％ＳＤＳ−ポリアクリ
ルアミドゲルにて電気泳動した。電気泳動後、ニトロセ
ルロース膜（アマシャム社）に蛋白質を転写し、抗リン
酸化チロシン抗体である４Ｇ１０（Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂ
ｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）を用いてウエスタンブロ
ットを行なった。４Ｇ１０に反応する蛋白質の検出はＥ
ＣＬシステム（アマシャム社）を用いた。
【００４６】その結果、Ｍ−ＣＳＦ存在下で培養したＪ
７７４．１細胞からＡＦＳ９８で沈降される約１７０ｋ
ｄの蛋白質はリン酸化されており、Ｍ−ＣＳＦ非存在下
で培養したＪ７７４．１細胞からＡＦＳ９８で沈降され
る蛋白質はリン酸化されていないことが分かった。この
ことから、約１７０ｋｄの蛋白質はＭ−ＣＳＦで特異的
にリン酸化されるＭ−ＣＳＦＲであることが強く示唆さ
れ、ＡＦＳ９８はＭ−ＣＳＦＲを認識する抗体であるこ
とが明らかとなった。
７７４．１細胞からＡＦＳ９８で沈降される約１７０ｋ
ｄの蛋白質はリン酸化されており、Ｍ−ＣＳＦ非存在下
で培養したＪ７７４．１細胞からＡＦＳ９８で沈降され
る蛋白質はリン酸化されていないことが分かった。この
ことから、約１７０ｋｄの蛋白質はＭ−ＣＳＦで特異的
にリン酸化されるＭ−ＣＳＦＲであることが強く示唆さ
れ、ＡＦＳ９８はＭ−ＣＳＦＲを認識する抗体であるこ
とが明らかとなった。
【００４７】実施例７ Ｍ−ＣＳＦに反応し増殖する細胞集団の骨髄細胞からの
分離：本発明抗体であるＡＦＳ９８および抗マウスｃ−
ｋｉｔ抗体であるＡＣＫ４を用いて，骨髄細胞中のどの
ような細胞集団がＭ−ＣＳＦに反応してコロニーを形成
するのかを調べた。
分離：本発明抗体であるＡＦＳ９８および抗マウスｃ−
ｋｉｔ抗体であるＡＣＫ４を用いて，骨髄細胞中のどの
ような細胞集団がＭ−ＣＳＦに反応してコロニーを形成
するのかを調べた。
【００４８】Ｃ５７ＢＬ／６マウスの骨髄細胞をビオチ
ン標識ＡＣＫ４およびＦＩＴＣ標識ＡＦＳ９８と反応さ
せ、引き続きフィコエリスリン−アビジンで染色しセル
ソーター（ＥＰＩＣＳ−ＥＬＩＴＥ）にて骨髄細胞をそ
れぞれｃ−ｋｉｔ陰性Ｍ−ＣＳＦＲ陽性、ｃ−ｋｉｔ陽
性ＭＣＳＦＲ陰性およびｃ−ｋｉｔ陽性ＭＣＳＦＲ陽性
の集団に分けた。これらの分画した細胞をそれぞれ１０
００個、分画していない骨髄細胞１００００個を用い、
これらの細胞のＭ−ＣＳＦで誘導されるコロニー形成能
について調べた。
ン標識ＡＣＫ４およびＦＩＴＣ標識ＡＦＳ９８と反応さ
せ、引き続きフィコエリスリン−アビジンで染色しセル
ソーター（ＥＰＩＣＳ−ＥＬＩＴＥ）にて骨髄細胞をそ
れぞれｃ−ｋｉｔ陰性Ｍ−ＣＳＦＲ陽性、ｃ−ｋｉｔ陽
性ＭＣＳＦＲ陰性およびｃ−ｋｉｔ陽性ＭＣＳＦＲ陽性
の集団に分けた。これらの分画した細胞をそれぞれ１０
００個、分画していない骨髄細胞１００００個を用い、
これらの細胞のＭ−ＣＳＦで誘導されるコロニー形成能
について調べた。
【００４９】第３図に示すように、ｃ−ｋｉｔ陰性ＭＣ
ＳＦＲ陽性細胞集団はＭ−ＣＳＦでコロニーを形成せ
ず、ｃ−ｋｉｔ陽性Ｍ−ＣＳＦＲ陰性およびｃ−ｋｉｔ
陽性Ｍ−ＣＳＦＲ陽性細胞集団がＭ−ＣＳＦでコロニー
を形成した。その数はｃ−ｋｉｔ陽性Ｍ−ＣＳＦＲ陰性
細胞集団がｃ−ｋｉｔ陽性Ｍ−ＣＳＦＲ陽性細胞集団よ
り１０倍多い。またｃ−ｋｉｔ陽性Ｍ−ＣＳＦＲ陽性細
胞集団のＭ−ＣＳＦでコロニーを形成する細胞の数は細
胞を分画しない骨髄細胞の２倍多い。
ＳＦＲ陽性細胞集団はＭ−ＣＳＦでコロニーを形成せ
ず、ｃ−ｋｉｔ陽性Ｍ−ＣＳＦＲ陰性およびｃ−ｋｉｔ
陽性Ｍ−ＣＳＦＲ陽性細胞集団がＭ−ＣＳＦでコロニー
を形成した。その数はｃ−ｋｉｔ陽性Ｍ−ＣＳＦＲ陰性
細胞集団がｃ−ｋｉｔ陽性Ｍ−ＣＳＦＲ陽性細胞集団よ
り１０倍多い。またｃ−ｋｉｔ陽性Ｍ−ＣＳＦＲ陽性細
胞集団のＭ−ＣＳＦでコロニーを形成する細胞の数は細
胞を分画しない骨髄細胞の２倍多い。
【００５０】以上のことから、骨髄細胞中のＭ−ＣＳＦ
に反応してマクロファージコロニーを形成する能力の高
い細胞集団はｃ−ｋｉｔ陽性Ｍ−ＣＳＦＲ陰性の細胞集
団で、次いでｃ−ｋｉｔ陽性Ｍ−ＣＳＦＲ陽性の細胞集
団あることが示された。
に反応してマクロファージコロニーを形成する能力の高
い細胞集団はｃ−ｋｉｔ陽性Ｍ−ＣＳＦＲ陰性の細胞集
団で、次いでｃ−ｋｉｔ陽性Ｍ−ＣＳＦＲ陽性の細胞集
団あることが示された。
【００５１】
【発明の効果】本発明によれば、Ｍ−ＣＳＦＲに特異的
なモノクローナル抗体が提供され、Ｍ−ＣＳＦＲおよび
Ｍ−ＣＳＦＲを有する細胞を高感度、高精度でしかも簡
便に検出および測定可能な免疫検定法が提供される。ま
た、本発明抗体はＭ−ＣＳＦに反応して機能発現する細
胞に対し、Ｍ−ＣＳＦの作用を中和する性質を有するの
で、骨髄細胞からマクロファージへの分化の研究、造血
幹細胞から破骨細胞への分化の研究、資質代謝の研究、
動脈硬化の研究等においてＭ−ＣＳＦのシグナルの役割
を研究する手法が提供される。さらに、本発明抗体と項
ｃ−ｋｉｔ抗体を用い、細胞を分離することにより、単
球・マクロファージ前駆細胞を分離精製する方法が提供
される。
なモノクローナル抗体が提供され、Ｍ−ＣＳＦＲおよび
Ｍ−ＣＳＦＲを有する細胞を高感度、高精度でしかも簡
便に検出および測定可能な免疫検定法が提供される。ま
た、本発明抗体はＭ−ＣＳＦに反応して機能発現する細
胞に対し、Ｍ−ＣＳＦの作用を中和する性質を有するの
で、骨髄細胞からマクロファージへの分化の研究、造血
幹細胞から破骨細胞への分化の研究、資質代謝の研究、
動脈硬化の研究等においてＭ−ＣＳＦのシグナルの役割
を研究する手法が提供される。さらに、本発明抗体と項
ｃ−ｋｉｔ抗体を用い、細胞を分離することにより、単
球・マクロファージ前駆細胞を分離精製する方法が提供
される。
【００５２】
配列番号：１ 配列の長さ：２７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CCTCGAGTAT GGAGTTGGGG CCTCCTC
【００５３】配列番号：２ 配列の長さ：２６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CGGGATCCTC ATCGGGGAGC TGCTTG
【図１】マウスＭ−ＣＳＦＲとヒトＩｇＧから成るキメ
ラ蛋白質を発現するベクターの構築法を示す模式図であ
る。
ラ蛋白質を発現するベクターの構築法を示す模式図であ
る。
【図２】本発明モノクローナル抗体であるＡＦＳ９８に
よりＭ−ＣＳＦによる骨髄細胞からのマクロファージの
分化増殖誘導が阻害されることを示した図である。
よりＭ−ＣＳＦによる骨髄細胞からのマクロファージの
分化増殖誘導が阻害されることを示した図である。
【図３】本発明モノクローナル抗体であるＡＦＳ９８と
マウスｃ−ｋｉｔに対するモノクローナル抗体であるＡ
ＣＫ４を用いて骨髄細胞からセルソーターを用いて分離
した細胞集団のＭ−ＣＳＦに対する反応性を示したもの
である。
マウスｃ−ｋｉｔに対するモノクローナル抗体であるＡ
ＣＫ４を用いて骨髄細胞からセルソーターを用いて分離
した細胞集団のＭ−ＣＳＦに対する反応性を示したもの
である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/566 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ 33/577 9162−4Ｂ 15/00 Ｃ //(Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91）
Claims (6)
- 【請求項１】マクロファージコロニー刺激因子に反応し
て分化増殖する細胞に対して、マクロファージコロニー
刺激因子の作用を中和する性質を有することを特徴とす
るマクロファージコロニー刺激因子レセプターに特異的
に結合するマクロファージコロニー刺激因子レセプター
に対するモノクローナル抗体。 - 【請求項２】下記の特性を有する請求項１記載のモノク
ローナル抗体。 ａ）分子量：約１６０，０００ ｂ）抗体のサブクラス：ＩｇＧ２ａ，κ ｃ）マクロファージコロニー刺激因子がマクロファージ
コロニー刺激因子レセプターへ結合し、マクロファージ
コロニー刺激因子レセプターをリン酸化する作用を阻害
する活性を有する。 ｄ）マクロファージコロニー刺激因子がマクロファージ
コロニー刺激因子依存性細胞株を増殖させる作用を阻害
する活性を有する。 ｅ）マクロファージコロニー刺激因子が骨髄細胞からマ
クロファージを誘導する作用を阻害する活性を有する。 ｆ）マウスおよびヒトマクロファージコロニー刺激因子
レセプターに結合する活性を有する。 - 【請求項３】請求項１または請求項２記載のモノクロー
ナル抗体を産生するハイブリドーマ。 - 【請求項４】ハイブリドーマＡＦＳ９８−１（ＦＥＲＭ
ＢＰ−１５１０５）である請求項３に記載のハイブリド
ーマ。 - 【請求項５】放射活性物質、酵素または蛍光色素により
標識した抗体を用いるイムノアッセイまたはフローサイ
トメトリにおいて、請求項１または請求項２記載のモノ
クローナル抗体を用いることを特徴とするマクロファー
ジコロニー刺激因子レセプターを測定する方法。 - 【請求項６】請求項１また請求項２記載のモノクローナ
ル抗体およびｃ−ｋｉｔに対するモノクローナル抗体を
用い、ｃ−ｋｉｔ陽性マクロファージコロニー刺激因子
レセプター陰性細胞を分離することにより、単球・マク
ロファージ前駆細胞を分離精製する方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7222849A JPH0967400A (ja) | 1995-08-31 | 1995-08-31 | モノクローナル抗体、該抗体を産生するハイブリドーマ及びその利用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7222849A JPH0967400A (ja) | 1995-08-31 | 1995-08-31 | モノクローナル抗体、該抗体を産生するハイブリドーマ及びその利用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0967400A true JPH0967400A (ja) | 1997-03-11 |
Family
ID=16788870
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7222849A Pending JPH0967400A (ja) | 1995-08-31 | 1995-08-31 | モノクローナル抗体、該抗体を産生するハイブリドーマ及びその利用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0967400A (ja) |
Cited By (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009521685A (ja) * | 2005-12-22 | 2009-06-04 | ノバルティス アーゲー | 可溶性ヒトｍ−ｃｓｆ受容体およびその使用 |
| US8263079B2 (en) | 2010-04-01 | 2012-09-11 | ImClone, LLC | Antibodies against CSF-1R |
| ES2442991A1 (es) * | 2012-08-14 | 2014-02-14 | Fundación Md Anderson International España | Método para el diagnóstico y/o pronóstico de linfomas |
| JP2015501823A (ja) * | 2011-12-15 | 2015-01-19 | エフ・ホフマン−ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト | ヒトｃｓｆ−１ｒに対する抗体及びその使用 |
| US9499626B2 (en) | 2009-12-10 | 2016-11-22 | Hoffmann-La Roche Inc. | Antibodies against human CSF-1R and uses thereof |
| US9617342B2 (en) | 2010-03-05 | 2017-04-11 | Hoffman-La Roche Inc. | Nucleic acids encoding antibodies against human CSF-1R and uses thereof |
| US9624302B2 (en) | 2010-03-05 | 2017-04-18 | Hoffmann-La Roche Inc. | Nucleic acids encoding antibodies against human CSF-1R |
| US11498968B2 (en) | 2016-12-22 | 2022-11-15 | Hoffmann-La Roche Inc. | Treatment of tumors with an anti-CSF-1R antibody in combination with an anti-PD-L1 antibody after failure of anti-PD-L1/PD1 treatment |
| US11512133B2 (en) | 2013-09-12 | 2022-11-29 | Hoffmann-La Roche Inc. | Methods for treating colon cancer or inhibiting cell proliferation by administering a combination of antibodies against human CSF-1R and antibodies against human PD-L1 |
| US11542335B2 (en) | 2016-08-25 | 2023-01-03 | Hoffmann-La Roche Inc. | Method of treating cancer in a patient by administering an antibody which binds colony stimulating factor-1 receptor (CSF-1R) |
-
1995
- 1995-08-31 JP JP7222849A patent/JPH0967400A/ja active Pending
Cited By (22)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009521685A (ja) * | 2005-12-22 | 2009-06-04 | ノバルティス アーゲー | 可溶性ヒトｍ−ｃｓｆ受容体およびその使用 |
| JP2012108155A (ja) * | 2005-12-22 | 2012-06-07 | Novartis Ag | 可溶性ヒトｍ−ｃｓｆ受容体およびその使用 |
| US9663580B2 (en) | 2009-12-10 | 2017-05-30 | Hoffmann-La Roche Inc. | Antibodies against human CSF-1R and uses thereof |
| US9879085B2 (en) | 2009-12-10 | 2018-01-30 | Hoffmann-La Roche Inc. | Antibodies against human CSF-1R and uses thereof |
| US10287358B2 (en) | 2009-12-10 | 2019-05-14 | Hoffmann-La Roche Inc. | Antibodies against human CSF-1R and uses thereof |
| US9499626B2 (en) | 2009-12-10 | 2016-11-22 | Hoffmann-La Roche Inc. | Antibodies against human CSF-1R and uses thereof |
| US9499625B2 (en) | 2009-12-10 | 2016-11-22 | Hoffmann-La Roche Inc. | Antibodies against human CSF-1R and uses thereof |
| US9499624B2 (en) | 2009-12-10 | 2016-11-22 | Hoffmann-La Roche Inc. | Antibodies against human CSF-1R and uses thereof |
| US10077314B1 (en) | 2009-12-10 | 2018-09-18 | Hoffmann-La Roche Inc. | Antibodies against human CSF-1R and uses thereof |
| US10072087B2 (en) | 2009-12-10 | 2018-09-11 | Hoffmann-La Roche Inc. | Antibodies against human CSF-1R and uses thereof |
| US9988458B2 (en) | 2010-03-05 | 2018-06-05 | Hoffmann-La Roche Inc. | Antibodies against human CSF-1R and uses thereof |
| US10030073B2 (en) | 2010-03-05 | 2018-07-24 | Hoffmann-La Roche Inc. | Antibodies against human CSF-1R and uses thereof |
| US9624302B2 (en) | 2010-03-05 | 2017-04-18 | Hoffmann-La Roche Inc. | Nucleic acids encoding antibodies against human CSF-1R |
| US9617342B2 (en) | 2010-03-05 | 2017-04-11 | Hoffman-La Roche Inc. | Nucleic acids encoding antibodies against human CSF-1R and uses thereof |
| US8263079B2 (en) | 2010-04-01 | 2012-09-11 | ImClone, LLC | Antibodies against CSF-1R |
| US10023643B2 (en) | 2011-12-15 | 2018-07-17 | Hoffmann-La Roche Inc. | Antibodies against human CSF-1R and uses thereof |
| JP2015501823A (ja) * | 2011-12-15 | 2015-01-19 | エフ・ホフマン−ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト | ヒトｃｓｆ−１ｒに対する抗体及びその使用 |
| US10336830B2 (en) | 2011-12-15 | 2019-07-02 | Hoffmann-La Roche Inc. | Antibodies against human CSF-1R and uses thereof |
| ES2442991A1 (es) * | 2012-08-14 | 2014-02-14 | Fundación Md Anderson International España | Método para el diagnóstico y/o pronóstico de linfomas |
| US11512133B2 (en) | 2013-09-12 | 2022-11-29 | Hoffmann-La Roche Inc. | Methods for treating colon cancer or inhibiting cell proliferation by administering a combination of antibodies against human CSF-1R and antibodies against human PD-L1 |
| US11542335B2 (en) | 2016-08-25 | 2023-01-03 | Hoffmann-La Roche Inc. | Method of treating cancer in a patient by administering an antibody which binds colony stimulating factor-1 receptor (CSF-1R) |
| US11498968B2 (en) | 2016-12-22 | 2022-11-15 | Hoffmann-La Roche Inc. | Treatment of tumors with an anti-CSF-1R antibody in combination with an anti-PD-L1 antibody after failure of anti-PD-L1/PD1 treatment |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US10934353B2 (en) | Single agent anti-PD-L1 and PD-L2 dual binding antibodies and methods of use | |
| JP2022191318A (ja) | 抗ｇｐｃ３抗体 | |
| JP6412072B2 (ja) | 抗ヒト受容体型プロテインチロシンホスファターゼσ抗体 | |
| RU2741105C2 (ru) | Антитела и химерные антигенные рецепторы, специфичные к cd19 | |
| KR20230052910A (ko) | Ccr8 항체 및 이의 응용 | |
| CN110776566B (zh) | 抗ilt7抗体 | |
| KR100919915B1 (ko) | Ｎｋｇ２ｄ의 조절 | |
| KR20220045980A (ko) | 체외 감마 델타 t 세포 집단 | |
| CN104284903B (zh) | 抗磷脂酶d4抗体 | |
| KR100301189B1 (ko) | 당단백질피(p)에대한단일클론항체 | |
| JPH0967400A (ja) | モノクローナル抗体、該抗体を産生するハイブリドーマ及びその利用 | |
| JP4915919B2 (ja) | インターフェロン産生細胞の活性調節剤 | |
| JPWO1994028160A1 (ja) | モノクローナル抗体，その製造方法およびその使用 | |
| Dehghanpisheh et al. | Retrovirally induced mouse anti‐TCR monoclonals can synergize the in vitro proliferative T cell response to bacterial superantigens | |
| CN115947854A (zh) | 抗人cd40蛋白单克隆抗体、制备方法及其应用 | |
| JP2900039B2 (ja) | マウスインターロイキン５レセプターに対する抗体 | |
| TWI918704B (zh) | Ｃｃｒ８抗體及其應用 | |
| JPH1142087A (ja) | 抗ヒトプレｂ細胞レセプター抗体およびその活性フラグメントならびにヒトプロｂ細胞の検出方法 | |
| JPH11133028A (ja) | 抗ヒトプレｂ細胞レセプター抗体 | |
| WO1994028160A1 (en) | Monoclonal antibody, process for producing the same, and use thereof | |
| EA042982B1 (ru) | Моноклональные антитела против участка бета-цепи trbv9 человека | |
| JPWO2006054748A1 (ja) | 腎炎の治療剤 | |
| WO1999023207A1 (en) | Monoclonal antibodies to canine cd34 | |
| HK1210481B (en) | Single agent anti-pd-l1 and pd-l2 dual binding antibodies and methods of use | |
| JPH104962A (ja) | モノクローナル抗体及びその産生細胞 |