JPH0977794A - 新規タンパク質 - Google Patents
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- JPH0977794A JPH0977794A JP26224595A JP26224595A JPH0977794A JP H0977794 A JPH0977794 A JP H0977794A JP 26224595 A JP26224595 A JP 26224595A JP 26224595 A JP26224595 A JP 26224595A JP H0977794 A JPH0977794 A JP H0977794A
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Abstract
(57)【要約】
【解決手段】 アポトーシス時に特異的に誘導される新
規タンパク質であり、実質的に配列番号１〜７に示され
る各アミノ酸配列を部分配列として含有する新規タンパ
ク質ｐ３８。また、配列番号１〜８に示されるアミノ酸
配列のいずれかの配列の全部又は一部を有するペプチド
に親和性を示す抗体。 【効果】 ｐ３８は、アポトーシスの有効なマーカーで
あり、ｐ３８抗体は、アポトーシスの検出試薬として有
用。また、ｐ３８及びその抗体は癌、自己免疫疾患、ウ
ィルス感染症、神経変性疾患、内分泌疾患、臓器移植障
害、放射線障害等のアポトーシス関連疾患の診断、予防
又は治療薬としての利用。
規タンパク質であり、実質的に配列番号１〜７に示され
る各アミノ酸配列を部分配列として含有する新規タンパ
ク質ｐ３８。また、配列番号１〜８に示されるアミノ酸
配列のいずれかの配列の全部又は一部を有するペプチド
に親和性を示す抗体。 【効果】 ｐ３８は、アポトーシスの有効なマーカーで
あり、ｐ３８抗体は、アポトーシスの検出試薬として有
用。また、ｐ３８及びその抗体は癌、自己免疫疾患、ウ
ィルス感染症、神経変性疾患、内分泌疾患、臓器移植障
害、放射線障害等のアポトーシス関連疾患の診断、予防
又は治療薬としての利用。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、アポトーシスを誘
発された細胞において発現誘導されることを特徴とする
新規タンパク質に関する。より詳しくは、制ガン剤によ
りアポトーシスを誘発させたヒト培養細胞において発現
誘導されることを特徴とする新規タンパク質に関する。
さらに本発明は、該タンパク質の部分アミノ酸配列に親
和性を示す抗体に関する。
発された細胞において発現誘導されることを特徴とする
新規タンパク質に関する。より詳しくは、制ガン剤によ
りアポトーシスを誘発させたヒト培養細胞において発現
誘導されることを特徴とする新規タンパク質に関する。
さらに本発明は、該タンパク質の部分アミノ酸配列に親
和性を示す抗体に関する。
【０００２】
【従来の技術・発明が解決しようとする課題】近年、細
胞組織の死に関してアポトーシス（apoptosis ）が注目
されている。このアポトーシスは、病理的細胞死である
壊死（ネクローシス）とは異なり、細胞自身の遺伝子に
最初から組み込まれている死であると考えられている。
即ち、何らかの外的又は内的要因が引き金となって、ア
ポトーシスをプログラムする遺伝子が活性化され、当該
自壊プログラムが発動することによって起こる能動的な
細胞死であると考えられている。
胞組織の死に関してアポトーシス（apoptosis ）が注目
されている。このアポトーシスは、病理的細胞死である
壊死（ネクローシス）とは異なり、細胞自身の遺伝子に
最初から組み込まれている死であると考えられている。
即ち、何らかの外的又は内的要因が引き金となって、ア
ポトーシスをプログラムする遺伝子が活性化され、当該
自壊プログラムが発動することによって起こる能動的な
細胞死であると考えられている。
【０００３】アポトーシスは、非常に多くの生命現象に
関わっている。即ち、発生過程での形態形成のみなら
ず、成熟した固体における皮膚の表皮細胞、小腸や胃の
上皮細胞といった正常細胞の交代（古くなった細胞の除
去）、ホルモン依存性の組織である胸腺のグルココルチ
コイドによる萎縮、去勢による前立腺の萎縮、さらに自
己成分に反応してしまう免疫担当細胞の排除や、神経栄
養因子の除去による神経細胞死もアポトーシスによるこ
とが示唆されている。
関わっている。即ち、発生過程での形態形成のみなら
ず、成熟した固体における皮膚の表皮細胞、小腸や胃の
上皮細胞といった正常細胞の交代（古くなった細胞の除
去）、ホルモン依存性の組織である胸腺のグルココルチ
コイドによる萎縮、去勢による前立腺の萎縮、さらに自
己成分に反応してしまう免疫担当細胞の排除や、神経栄
養因子の除去による神経細胞死もアポトーシスによるこ
とが示唆されている。
【０００４】また、アポトーシスは、このような生理的
な細胞死だけでなく、放射線照射を受けた細胞やウィル
ス感染した細胞の細胞死にも見られる。さらにＡＩＤＳ
ウィルスによるＴ細胞の減少もアポトーシスによる細胞
死が原因であることが報告され、注目を集めている。こ
の他に、薬物や毒物の投与、熱といった化学的及び物理
的刺激によってもアポトーシスが起こる。さらにアルツ
ハイマー病等の神経変性疾患における神経細胞死、癌病
巣内での腫瘍細胞の自然消失や制ガン剤による細胞死に
もアポトーシスが関与していることが明らかになってい
る。
な細胞死だけでなく、放射線照射を受けた細胞やウィル
ス感染した細胞の細胞死にも見られる。さらにＡＩＤＳ
ウィルスによるＴ細胞の減少もアポトーシスによる細胞
死が原因であることが報告され、注目を集めている。こ
の他に、薬物や毒物の投与、熱といった化学的及び物理
的刺激によってもアポトーシスが起こる。さらにアルツ
ハイマー病等の神経変性疾患における神経細胞死、癌病
巣内での腫瘍細胞の自然消失や制ガン剤による細胞死に
もアポトーシスが関与していることが明らかになってい
る。
【０００５】従って、アポトーシスの分子機構を解明す
ることは、個体発生及び発癌の制御における細胞死の生
化学的意義、役割を理解する上で重要である。また、ア
ポトーシスに関与する遺伝子又はその翻訳産物は、アポ
トーシス関連疾患（例えば、癌、自己免疫性疾患、ウィ
ルス感染症、神経変性疾患、内分泌疾患、臓器移植障
害、放射線障害等）の診断、予防又は治療薬を開発する
手立てとなる点で有用である。
ることは、個体発生及び発癌の制御における細胞死の生
化学的意義、役割を理解する上で重要である。また、ア
ポトーシスに関与する遺伝子又はその翻訳産物は、アポ
トーシス関連疾患（例えば、癌、自己免疫性疾患、ウィ
ルス感染症、神経変性疾患、内分泌疾患、臓器移植障
害、放射線障害等）の診断、予防又は治療薬を開発する
手立てとなる点で有用である。
【０００６】アポトーシスに共通の特徴的現象は、細胞
膜の変化（微絨毛の消失）を伴う細胞の縮小、クロマチ
ンの凝縮断片化とそれに続く細胞の断片化（アポトーシ
ス小体の形成）等の形態的変化とヌクレオソーム単位で
のクロマチンＤＮＡの断片化（生化学的変化）である。
膜の変化（微絨毛の消失）を伴う細胞の縮小、クロマチ
ンの凝縮断片化とそれに続く細胞の断片化（アポトーシ
ス小体の形成）等の形態的変化とヌクレオソーム単位で
のクロマチンＤＮＡの断片化（生化学的変化）である。
【０００７】アポトーシスの分子機構の研究は、以下の
（１）〜（３）に大別される。即ち、 （１）内的又は外的刺激を認識し、死のシグナルとして
伝達する機構の研究 （２）アポトーシス実行に関与する遺伝子の発現とその
制御機構の研究 （３）上記（２）の遺伝子産物による、主としてクロマ
チンＤＮＡの断片化をもたらすアポトーシス実行過程の
研究である。 アポトーシス研究に特有の問題点は、アポトーシスが組
織内の細胞全部に一様に起こるのでなく、通常は一部の
細胞のみに散発的に起こることである。従って、アポト
ーシス細胞に特異的に起こっている分子変化を検出する
ことはかなり困難である。本課題を解決する方法とし
て、 ａ）アポトーシス細胞を高率に含む系の選択 ｂ）研究に先立つアポトーシス細胞の識別又は分離が挙
げられる。 ａ）の方法として、例えば、遊離細胞系を材料として人
工的にアポトーシスを誘発させる方法が挙げられる。一
方、ｂ）については、アポトーシス細胞を組織化学的に
検出する方法が有効であると考えられる。
（１）〜（３）に大別される。即ち、 （１）内的又は外的刺激を認識し、死のシグナルとして
伝達する機構の研究 （２）アポトーシス実行に関与する遺伝子の発現とその
制御機構の研究 （３）上記（２）の遺伝子産物による、主としてクロマ
チンＤＮＡの断片化をもたらすアポトーシス実行過程の
研究である。 アポトーシス研究に特有の問題点は、アポトーシスが組
織内の細胞全部に一様に起こるのでなく、通常は一部の
細胞のみに散発的に起こることである。従って、アポト
ーシス細胞に特異的に起こっている分子変化を検出する
ことはかなり困難である。本課題を解決する方法とし
て、 ａ）アポトーシス細胞を高率に含む系の選択 ｂ）研究に先立つアポトーシス細胞の識別又は分離が挙
げられる。 ａ）の方法として、例えば、遊離細胞系を材料として人
工的にアポトーシスを誘発させる方法が挙げられる。一
方、ｂ）については、アポトーシス細胞を組織化学的に
検出する方法が有効であると考えられる。
【０００８】現在使用されているアポトーシスの判別・
検出法としては、前述のアポトーシスの特徴的現象を指
標とした形態学的、生化学的又は組織化学的方法が例示
される。 (i) 形態学的方法 １．光学又は電子顕微鏡観察： 核の断片化、細胞の縮
小等を光学又は電子顕微鏡により観察する。また、走査
型電子顕微鏡（ＳＥＭ）を用いれば、微絨毛の消失等表
層構造の変化も確認できる。いずれの場合も高度な修練
及び時間と労力を要する。 ２．分染法： 死細胞のみを染色する色素(trypan blu
e, erythrosin B等) で染色後、光顕観察により死細胞
を検出する。ネクローシス細胞との区別が出来ないこと
が欠点である。 (ii)生化学的方法 １．ＤＮＡ電気泳動（ラダー検出法）： 組織又は遊離
細胞からＤＮＡを抽出後、アガロースゲル電気泳動に付
し、アポトーシス特異的ＤＮＡ断片化（ヌクレオソーム
単位での切断による１８０塩基対の整数倍の分子量を持
つＤＮＡ断片からなる梯子状泳動像）検出する。個々の
細胞のアポトーシスを確認できないことが欠点である。 (iii) 組織化学的方法 １．in situ エンドラベリング法（ＴＵＮＥＬ法）：
アポトーシスにより生じるＤＮＡ切断末端は５’側にリ
ン酸基を有する3'-OH/5'-P型である。そこで、ターミナ
ルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（Ｔｄ
Ｔ）を用いて3'-OH末端にビオチン化デオキシウリジン
を結合させ、該ビオチンを免疫組織化学的に検出する。
3'-OH 末端数が多い細胞ほど強く染色される。しかし、
3'-OH 断端であれば全て検出するので、一部のネクロー
シス細胞も検出してしまう。 ２．アポトーシス関連タンパクの抗体を用いた免疫組織
化学的方法： アポトーシス時に発現するタンパク質
（ｐ５３，Ｂｃｌ−２，抗Ｆａｓタンパク）のモノクロ
ーナル抗体を利用した蛍光抗体染色法又は酵素結合免疫
吸着検定法（ELISA法）である。しかし、現在利用され
ているタンパク質は原癌遺伝子や癌抑制遺伝子の翻訳産
物であり、必ずしもアポトーシス特異的タンパクではな
い。また、癌細胞等では該遺伝子は変異を起こし発現し
ない場合が多い。従って、アポトーシス特異的に発現す
る新規タンパク質の探索が、アポトーシス細胞を簡便且
つ高精度に識別する方法及び試薬の開発に必須であり、
本発明は、アポトーシス時に誘導される新規タンパク質
を提供することを目的とする。また、本発明は、該新規
タンパク質の部分アミノ酸配列の全部又は一部を有する
ペプチドに親和性を示す抗体を提供することを目的とす
る。
検出法としては、前述のアポトーシスの特徴的現象を指
標とした形態学的、生化学的又は組織化学的方法が例示
される。 (i) 形態学的方法 １．光学又は電子顕微鏡観察： 核の断片化、細胞の縮
小等を光学又は電子顕微鏡により観察する。また、走査
型電子顕微鏡（ＳＥＭ）を用いれば、微絨毛の消失等表
層構造の変化も確認できる。いずれの場合も高度な修練
及び時間と労力を要する。 ２．分染法： 死細胞のみを染色する色素(trypan blu
e, erythrosin B等) で染色後、光顕観察により死細胞
を検出する。ネクローシス細胞との区別が出来ないこと
が欠点である。 (ii)生化学的方法 １．ＤＮＡ電気泳動（ラダー検出法）： 組織又は遊離
細胞からＤＮＡを抽出後、アガロースゲル電気泳動に付
し、アポトーシス特異的ＤＮＡ断片化（ヌクレオソーム
単位での切断による１８０塩基対の整数倍の分子量を持
つＤＮＡ断片からなる梯子状泳動像）検出する。個々の
細胞のアポトーシスを確認できないことが欠点である。 (iii) 組織化学的方法 １．in situ エンドラベリング法（ＴＵＮＥＬ法）：
アポトーシスにより生じるＤＮＡ切断末端は５’側にリ
ン酸基を有する3'-OH/5'-P型である。そこで、ターミナ
ルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（Ｔｄ
Ｔ）を用いて3'-OH末端にビオチン化デオキシウリジン
を結合させ、該ビオチンを免疫組織化学的に検出する。
3'-OH 末端数が多い細胞ほど強く染色される。しかし、
3'-OH 断端であれば全て検出するので、一部のネクロー
シス細胞も検出してしまう。 ２．アポトーシス関連タンパクの抗体を用いた免疫組織
化学的方法： アポトーシス時に発現するタンパク質
（ｐ５３，Ｂｃｌ−２，抗Ｆａｓタンパク）のモノクロ
ーナル抗体を利用した蛍光抗体染色法又は酵素結合免疫
吸着検定法（ELISA法）である。しかし、現在利用され
ているタンパク質は原癌遺伝子や癌抑制遺伝子の翻訳産
物であり、必ずしもアポトーシス特異的タンパクではな
い。また、癌細胞等では該遺伝子は変異を起こし発現し
ない場合が多い。従って、アポトーシス特異的に発現す
る新規タンパク質の探索が、アポトーシス細胞を簡便且
つ高精度に識別する方法及び試薬の開発に必須であり、
本発明は、アポトーシス時に誘導される新規タンパク質
を提供することを目的とする。また、本発明は、該新規
タンパク質の部分アミノ酸配列の全部又は一部を有する
ペプチドに親和性を示す抗体を提供することを目的とす
る。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明者は、二次元電気
泳動を用い、アポトーシスを誘発した細胞におけるタン
パク質の消長について検討していたところ、数種の制ガ
ン剤によりアポトーシスを誘発された細胞に共通して出
現するタンパク質を確認した。該タンパク質を限定分解
して部分アミノ酸配列を決定し、データベースを用いた
解析により該タンパク質が新規であることを確認、ｐ３
８と命名して本発明を完成した。
泳動を用い、アポトーシスを誘発した細胞におけるタン
パク質の消長について検討していたところ、数種の制ガ
ン剤によりアポトーシスを誘発された細胞に共通して出
現するタンパク質を確認した。該タンパク質を限定分解
して部分アミノ酸配列を決定し、データベースを用いた
解析により該タンパク質が新規であることを確認、ｐ３
８と命名して本発明を完成した。
【００１０】即ち、本発明は、アポトーシス細胞におい
て発現誘導される新規タンパク質であって、且つ以下の
性状を有することを特徴とする新規タンパク質（以下、
ｐ３８と称する）である。 ａ）分子量： ３８ｋＤａ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ） ｂ）等電点（ｐＩ）： ５．２ ｃ）実質的に下記の(I) 〜(VII) の部分アミノ酸配列を
有する。 (I) ＥＨＥＬＬＥＱ (II) ＩＰＱＡＬＥＫ (III) ＡＰＶ (IV) ＬＡＱＱＱＡＡＬ (V) ＲＡＡＶＬＬＥＱＥ (VI) ＬＡＥＩＧＡＰＩ (VII) ＡＥＬＱＬＰＰ （上記式中、Ｅはグルタミン酸を、Ｈはヒスチジンを、
Ｌはロイシンを、Ｑはグルタミンを、Ｉはイソロイシン
を、Ｐはプロリンを、Ａはアラニンを、Ｋはリジンを、
Ｖはバリンを、Ｍはメチオニンを、Ｒはアルギニンを、
Ｇはグリシンを意味する。）
て発現誘導される新規タンパク質であって、且つ以下の
性状を有することを特徴とする新規タンパク質（以下、
ｐ３８と称する）である。 ａ）分子量： ３８ｋＤａ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ） ｂ）等電点（ｐＩ）： ５．２ ｃ）実質的に下記の(I) 〜(VII) の部分アミノ酸配列を
有する。 (I) ＥＨＥＬＬＥＱ (II) ＩＰＱＡＬＥＫ (III) ＡＰＶ (IV) ＬＡＱＱＱＡＡＬ (V) ＲＡＡＶＬＬＥＱＥ (VI) ＬＡＥＩＧＡＰＩ (VII) ＡＥＬＱＬＰＰ （上記式中、Ｅはグルタミン酸を、Ｈはヒスチジンを、
Ｌはロイシンを、Ｑはグルタミンを、Ｉはイソロイシン
を、Ｐはプロリンを、Ａはアラニンを、Ｋはリジンを、
Ｖはバリンを、Ｍはメチオニンを、Ｒはアルギニンを、
Ｇはグリシンを意味する。）
【００１１】より詳細には、本発明は、数種の制ガン剤
によりアポトーシスを誘発させたヒト培養細胞の抽出物
を二次元電気泳動に付すことによって得られうる新規タ
ンパク質であって、且つ上記ａ）〜ｃ）に示される性状
を有する新規タンパク質ｐ３８である。
によりアポトーシスを誘発させたヒト培養細胞の抽出物
を二次元電気泳動に付すことによって得られうる新規タ
ンパク質であって、且つ上記ａ）〜ｃ）に示される性状
を有する新規タンパク質ｐ３８である。
【００１２】また、本発明は、上記ｃ）に示される各ア
ミノ酸配列の全部又は一部を有するペプチドに親和性を
示す抗体である。
ミノ酸配列の全部又は一部を有するペプチドに親和性を
示す抗体である。
【００１３】
【発明の実施の形態】以下、本発明をより詳細に説明す
る。アポトーシスは、シクロヘキシミド等のタンパク質
合成阻害剤の他、フェニルメチルスルフォニルフルオリ
ド（ＰＭＳＦ）等のプロテアーゼ阻害剤によっても阻害
されることから、タンパク質合成及びタンパク質分解依
存性であることが明らかになってきた。このようなタン
パク質の消長を検出する最も一般的方法として、ポリア
クリルアミドゲル電気泳動法（ＰＡＧＥ）が使われてい
る。ＰＡＧＥには、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）
存在下で分子量の差による分離を行うＳＤＳ−ＰＡＧＥ
と、まず等電点差に基づく分離を行ってからＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥを行う二次元電気泳動とがある。
る。アポトーシスは、シクロヘキシミド等のタンパク質
合成阻害剤の他、フェニルメチルスルフォニルフルオリ
ド（ＰＭＳＦ）等のプロテアーゼ阻害剤によっても阻害
されることから、タンパク質合成及びタンパク質分解依
存性であることが明らかになってきた。このようなタン
パク質の消長を検出する最も一般的方法として、ポリア
クリルアミドゲル電気泳動法（ＰＡＧＥ）が使われてい
る。ＰＡＧＥには、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）
存在下で分子量の差による分離を行うＳＤＳ−ＰＡＧＥ
と、まず等電点差に基づく分離を行ってからＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥを行う二次元電気泳動とがある。
【００１４】本発明ｐ３８は、アポトーシスを誘発した
細胞の抽出物を、二次元電気泳動に付すことにより分離
される。
細胞の抽出物を、二次元電気泳動に付すことにより分離
される。
【００１５】細胞材料は、典型的な（即ち、微絨毛の消
失を伴う細胞の縮小、核の断片化、クロマチンの凝縮、
それに続く細胞の断片化等の形態的変化及びクロマチン
ＤＮＡのヌクレオソーム単位での断片化が観察される）
アポトーシス現象が見られる真核多細胞生物由来の細胞
であれば特に限定されず、また遊離細胞、組織のどちら
であってもよい。好ましくは、ヒト、ラット、マウス、
ウシ等の哺乳動物の遊離細胞、より好ましくは、ヒトの
培養細胞である。
失を伴う細胞の縮小、核の断片化、クロマチンの凝縮、
それに続く細胞の断片化等の形態的変化及びクロマチン
ＤＮＡのヌクレオソーム単位での断片化が観察される）
アポトーシス現象が見られる真核多細胞生物由来の細胞
であれば特に限定されず、また遊離細胞、組織のどちら
であってもよい。好ましくは、ヒト、ラット、マウス、
ウシ等の哺乳動物の遊離細胞、より好ましくは、ヒトの
培養細胞である。
【００１６】アポトーシスは、公知の方法により人工的
に誘発することができる。例えば、放射線・紫外線照
射、温熱処理、制ガン剤・毒物等の薬剤処理、ウィルス
・Ｆａｓ抗原の感染、サイトカインの除去等が例示され
る。好ましくはアクチノマイシンＤやカンプトテシン等
の制ガン剤処理が挙げられる。また、生理的にアポトー
シスを起こす細胞・組織を利用してもよい。具体的に
は、肢芽細胞、水晶体、軟骨細胞、血管内皮細胞、神経
細胞、胸腺細胞等が例示される。
に誘発することができる。例えば、放射線・紫外線照
射、温熱処理、制ガン剤・毒物等の薬剤処理、ウィルス
・Ｆａｓ抗原の感染、サイトカインの除去等が例示され
る。好ましくはアクチノマイシンＤやカンプトテシン等
の制ガン剤処理が挙げられる。また、生理的にアポトー
シスを起こす細胞・組織を利用してもよい。具体的に
は、肢芽細胞、水晶体、軟骨細胞、血管内皮細胞、神経
細胞、胸腺細胞等が例示される。
【００１７】細胞抽出液の調製法として、具体的には下
記の方法が例示される。アポトーシスを誘発させたヒ
ト、ラット等の培養細胞、好ましくは制ガン剤処理によ
りアポトーシスを誘発させたヒト培養細胞を適当な還元
剤及び尿素の存在下で（好適な態様としては、１００ｍ
Ｍのジチオスレイトール及び８Ｍの尿素の使用が挙げら
れる）超音波処理することによって破砕し、遠心処理に
より上清画分を得る。得られた上清画分に非イオン性界
面活性剤を加えたものを二次元電気泳動の試料となす。
好ましくは、１／１００（ｖ／ｖ）量のノニデットＰ−
４０（ＮＰ−４０）の使用が例示される。
記の方法が例示される。アポトーシスを誘発させたヒ
ト、ラット等の培養細胞、好ましくは制ガン剤処理によ
りアポトーシスを誘発させたヒト培養細胞を適当な還元
剤及び尿素の存在下で（好適な態様としては、１００ｍ
Ｍのジチオスレイトール及び８Ｍの尿素の使用が挙げら
れる）超音波処理することによって破砕し、遠心処理に
より上清画分を得る。得られた上清画分に非イオン性界
面活性剤を加えたものを二次元電気泳動の試料となす。
好ましくは、１／１００（ｖ／ｖ）量のノニデットＰ−
４０（ＮＰ−４０）の使用が例示される。
【００１８】得られた細胞抽出液中に含まれるタンパク
質は、二次元電気泳動により分離される。まず、予め形
成されたｐＨ勾配を持ったゲル支持体中の電場に該抽出
液をアプライし、等電点電気泳動を行う。各タンパク質
は、ｐＨ勾配中の、等電ｐＨ（正味の電荷を持たない状
態にある時のｐＨ）に等しいｐＨ部分に向かって泳動さ
れ、鋭いバンドを作る。続いて、等電点電気泳動したゲ
ルを適当な緩衝液に浸して平衡化した後、ＳＤＳ−ポリ
アクリルアミドゲル上に密着させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを
行う。タンパク質はＳＤＳ- イオンの結合により多数の
負電荷を持ち、ゲル中の移動速度と分子量の対数とが直
線関係を示す。二次元電気泳動の好適な態様について
は、実施例１の（４）に詳述する。分離後のタンパク質
は、クマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）染色や、よ
り高感度の銀染色により検出する。
質は、二次元電気泳動により分離される。まず、予め形
成されたｐＨ勾配を持ったゲル支持体中の電場に該抽出
液をアプライし、等電点電気泳動を行う。各タンパク質
は、ｐＨ勾配中の、等電ｐＨ（正味の電荷を持たない状
態にある時のｐＨ）に等しいｐＨ部分に向かって泳動さ
れ、鋭いバンドを作る。続いて、等電点電気泳動したゲ
ルを適当な緩衝液に浸して平衡化した後、ＳＤＳ−ポリ
アクリルアミドゲル上に密着させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを
行う。タンパク質はＳＤＳ- イオンの結合により多数の
負電荷を持ち、ゲル中の移動速度と分子量の対数とが直
線関係を示す。二次元電気泳動の好適な態様について
は、実施例１の（４）に詳述する。分離後のタンパク質
は、クマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）染色や、よ
り高感度の銀染色により検出する。
【００１９】本発明ｐ３８は、アポトーシス細胞からの
タンパク抽出液二次元電気泳動ゲル上の分子量３８ｋＤ
ａ、等電点５．２の位置のスポットとして検出される。
該スポットの部分を分離し、ナイロン又はニトロセルロ
ース膜にトランスファーした後、該タンパク質を膜上で
エンドペプチダーゼ又はブロムシアン等の化学物質によ
って、酵素的又は化学的に限定分解し、生成するペプチ
ドを逆相ＨＰＬＣを用いて分離精製し、さらにプロテイ
ンシークエンサーにより各ペプチドのアミノ酸配列を解
析することによって該タンパク質の部分アミノ酸配列を
決定できる。
タンパク抽出液二次元電気泳動ゲル上の分子量３８ｋＤ
ａ、等電点５．２の位置のスポットとして検出される。
該スポットの部分を分離し、ナイロン又はニトロセルロ
ース膜にトランスファーした後、該タンパク質を膜上で
エンドペプチダーゼ又はブロムシアン等の化学物質によ
って、酵素的又は化学的に限定分解し、生成するペプチ
ドを逆相ＨＰＬＣを用いて分離精製し、さらにプロテイ
ンシークエンサーにより各ペプチドのアミノ酸配列を解
析することによって該タンパク質の部分アミノ酸配列を
決定できる。
【００２０】本発明ｐ３８は、上記ｃ）の(I) 〜(VII)
に示される部分アミノ酸配列を有する。本発明はまた、
これら各アミノ酸配列の全部又は一部を有するペプチド
に親和性を示す抗体に関する。本発明の抗体は、上記性
質を有するポリクローナル抗体およびモノクローナル抗
体を共に包含する。また、当該モノクローナル抗体に
は、ＩｇＧ，ＩｇＭ，ＩｇＡ，ＩｇＤおよびＩｇＥなる
いずれのイムノグロブリンクラスに属するモノクローナ
ル抗体をも包含し、好適には、ＩｇＧまたはＩｇＭイム
ノグロブリンクラスモノクローナル抗体が挙げられる。
に示される部分アミノ酸配列を有する。本発明はまた、
これら各アミノ酸配列の全部又は一部を有するペプチド
に親和性を示す抗体に関する。本発明の抗体は、上記性
質を有するポリクローナル抗体およびモノクローナル抗
体を共に包含する。また、当該モノクローナル抗体に
は、ＩｇＧ，ＩｇＭ，ＩｇＡ，ＩｇＤおよびＩｇＥなる
いずれのイムノグロブリンクラスに属するモノクローナ
ル抗体をも包含し、好適には、ＩｇＧまたはＩｇＭイム
ノグロブリンクラスモノクローナル抗体が挙げられる。
【００２１】本発明の抗体は常法に従って取得すること
ができる（続生化学実験講座５、免疫生化学研究法、日
本生化学会編：東京化学同人発行、等）。 例えば、本
発明のポリクローナル抗体は、以下の方法により作製す
ることができる。上記ｃ）記載の各部分アミノ酸配列の
全部又は一部を有するペプチドをウシ血清アルブミン、
Keyhole Limpets Hemocyanin（ＫＬＨ）等のキャリアタ
ンパク質に架橋した複合体と、完全（不完全）フロイン
トアジュバント〔ＦＣＡ（ＦＩＡ）〕との混和物を抗原
として、ウサギ、マウス、ラット、モルモット又はハム
スター等の哺乳動物に免疫（初回免疫から約１〜４週間
毎に１〜数回追加免疫し、各追加免疫の約３〜１０日後
に部分採血した血清の抗体価を従来公知の抗原抗体反応
を利用して測定、その上昇を確認しておく。さらに最終
免疫から約３〜１０日後全血を採取して抗血清を精製す
る。
ができる（続生化学実験講座５、免疫生化学研究法、日
本生化学会編：東京化学同人発行、等）。 例えば、本
発明のポリクローナル抗体は、以下の方法により作製す
ることができる。上記ｃ）記載の各部分アミノ酸配列の
全部又は一部を有するペプチドをウシ血清アルブミン、
Keyhole Limpets Hemocyanin（ＫＬＨ）等のキャリアタ
ンパク質に架橋した複合体と、完全（不完全）フロイン
トアジュバント〔ＦＣＡ（ＦＩＡ）〕との混和物を抗原
として、ウサギ、マウス、ラット、モルモット又はハム
スター等の哺乳動物に免疫（初回免疫から約１〜４週間
毎に１〜数回追加免疫し、各追加免疫の約３〜１０日後
に部分採血した血清の抗体価を従来公知の抗原抗体反応
を利用して測定、その上昇を確認しておく。さらに最終
免疫から約３〜１０日後全血を採取して抗血清を精製す
る。
【００２２】また、本発明のｐ３８に対するモノクロー
ナル抗体は、いわゆる細胞融合によって製造されるハイ
ブリドーマ（融合細胞）から製造することができる。す
なわち、抗体産生細胞と骨髄腫系細胞から融合ハイブリ
ドーマを形成し、当該ハイブリドーマをクローン化し、
本発明ｐ３８の部分アミノ酸配列の全部又は一部を有す
るペプチドを抗原として、それに対して特異的親和性を
示す抗体を生産するクローンを選択することによって製
造される。その操作は免疫抗原として本発明ｐ３８の部
分アミノ酸配列の全部又は一部を有するペプチドを使用
する以外は、従来既知の手段を用いることができる。
ナル抗体は、いわゆる細胞融合によって製造されるハイ
ブリドーマ（融合細胞）から製造することができる。す
なわち、抗体産生細胞と骨髄腫系細胞から融合ハイブリ
ドーマを形成し、当該ハイブリドーマをクローン化し、
本発明ｐ３８の部分アミノ酸配列の全部又は一部を有す
るペプチドを抗原として、それに対して特異的親和性を
示す抗体を生産するクローンを選択することによって製
造される。その操作は免疫抗原として本発明ｐ３８の部
分アミノ酸配列の全部又は一部を有するペプチドを使用
する以外は、従来既知の手段を用いることができる。
【００２３】本発明の「モノクローナル抗体」は、いか
なる方法で得られたものであってもよい。また、通常
「モノクローナル抗体」は、免疫感作を施す哺乳動物の
種類によりそれぞれ異なる構造の糖鎖を有するが、本発
明における「モノクローナル抗体」は該糖鎖の構造差異
により限定されるものではなく、あらゆる哺乳動物由来
のモノクローナル抗体をも包含するものである。さら
に、例えばヒトイムノグロブリン遺伝子を組み込むこと
により、ヒト型抗体を産生するように遺伝子工学的に作
出されたトランスジェニックマウスを用いて得られるヒ
ト型モノクローナル抗体、あるいは、遺伝子組換え技術
により、ある哺乳動物由来のモノクローナル抗体の定常
領域（Ｆｃ領域）をヒトモノクローナル抗体のＦｃ領域
と組み換えたキメラモノクローナル抗体、さらには抗原
と相補的に直接結合し得る相補性決定部位（ＣＤＲ：co
mplementarity determining region）以外、全領域をヒ
トモノクローナル抗体抗体の対応領域と組換えたキメラ
モノクローナル抗体も本発明の「モノクローナル抗体」
に包含される。
なる方法で得られたものであってもよい。また、通常
「モノクローナル抗体」は、免疫感作を施す哺乳動物の
種類によりそれぞれ異なる構造の糖鎖を有するが、本発
明における「モノクローナル抗体」は該糖鎖の構造差異
により限定されるものではなく、あらゆる哺乳動物由来
のモノクローナル抗体をも包含するものである。さら
に、例えばヒトイムノグロブリン遺伝子を組み込むこと
により、ヒト型抗体を産生するように遺伝子工学的に作
出されたトランスジェニックマウスを用いて得られるヒ
ト型モノクローナル抗体、あるいは、遺伝子組換え技術
により、ある哺乳動物由来のモノクローナル抗体の定常
領域（Ｆｃ領域）をヒトモノクローナル抗体のＦｃ領域
と組み換えたキメラモノクローナル抗体、さらには抗原
と相補的に直接結合し得る相補性決定部位（ＣＤＲ：co
mplementarity determining region）以外、全領域をヒ
トモノクローナル抗体抗体の対応領域と組換えたキメラ
モノクローナル抗体も本発明の「モノクローナル抗体」
に包含される。
【００２４】以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説
明するが、本発明は、これら実施例によって何ら制限さ
れるものではない。
明するが、本発明は、これら実施例によって何ら制限さ
れるものではない。
【００２５】実施例１ （１）細胞培養 ７．５％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、７５μｇ
／ｍｌ（ｗ／ｖ）カナマイシン硫酸塩及び５μＭ２−メ
ルカプトエタノールを含むＲＰＭＩ６４０培養液にＨＬ
−６０細胞（ヒト前骨髄性白血病培養細胞）を懸濁し、
ＣＯ2 インキュベーター〔na co(登録商標）Model 510
0, NAPCO SCIENTIFIC COMPANY〕中で３７℃、５％ＣＯ
2 の条件下で細胞密度１．０×１０5 〜１．０×１０6
細胞／ｍｌとなるように継代培養を行った。
／ｍｌ（ｗ／ｖ）カナマイシン硫酸塩及び５μＭ２−メ
ルカプトエタノールを含むＲＰＭＩ６４０培養液にＨＬ
−６０細胞（ヒト前骨髄性白血病培養細胞）を懸濁し、
ＣＯ2 インキュベーター〔na co(登録商標）Model 510
0, NAPCO SCIENTIFIC COMPANY〕中で３７℃、５％ＣＯ
2 の条件下で細胞密度１．０×１０5 〜１．０×１０6
細胞／ｍｌとなるように継代培養を行った。
【００２６】（２）アポトーシスの誘発 上記（１）の方法により調製されたＨＬ−６０細胞（１
×１０6 細胞／ｍｌ）に、アクチノマイシンＤを最終濃
度１μｇ／ｍｌになるように加え、ＣＯ2 インキュベー
ター内に６時間静置した後、２００×ｇで５分間遠心し
て細胞を集めた。該細胞をリン酸緩衝生理食塩水（Ｎａ
Ｃｌ ８ｇ，ＫＣｌ ２ｇ，Ｎａ2 ＨＰＯ4 ・１２Ｈ2
Ｏ ２９ｇ，ＫＨ2 ＰＯ4 ２ｇを１リットルの精製水に
溶かした）に懸濁し、２００×ｇで５分間遠心して上清
を除いたものを以下の処理に供した。
×１０6 細胞／ｍｌ）に、アクチノマイシンＤを最終濃
度１μｇ／ｍｌになるように加え、ＣＯ2 インキュベー
ター内に６時間静置した後、２００×ｇで５分間遠心し
て細胞を集めた。該細胞をリン酸緩衝生理食塩水（Ｎａ
Ｃｌ ８ｇ，ＫＣｌ ２ｇ，Ｎａ2 ＨＰＯ4 ・１２Ｈ2
Ｏ ２９ｇ，ＫＨ2 ＰＯ4 ２ｇを１リットルの精製水に
溶かした）に懸濁し、２００×ｇで５分間遠心して上清
を除いたものを以下の処理に供した。
【００２７】（３）細胞抽出液の調製 以下の抽出操作はすべて４℃で行った。８Ｍ尿素、１０
０ｍＭジチオスレイトールの溶液に上記（２）の処理を
行った細胞を１×１０8 細胞／ｍｌになるように懸濁し
た。該懸濁液を２０Ｗ、１／１０秒、１０回超音波処理
し、２０秒冷却後、さらに同様の超音波処理を２回行っ
た。該処理液を１０４００×ｇで１時間遠心し、その上
清に１／１００（ｖ／ｖ）量のノニデットＰ−４０（Ｎ
Ｐ−４０）を加えたものを二次元電気泳動に付した。
０ｍＭジチオスレイトールの溶液に上記（２）の処理を
行った細胞を１×１０8 細胞／ｍｌになるように懸濁し
た。該懸濁液を２０Ｗ、１／１０秒、１０回超音波処理
し、２０秒冷却後、さらに同様の超音波処理を２回行っ
た。該処理液を１０４００×ｇで１時間遠心し、その上
清に１／１００（ｖ／ｖ）量のノニデットＰ−４０（Ｎ
Ｐ−４０）を加えたものを二次元電気泳動に付した。
【００２８】（４）二次元電気泳動 一次元目（等電点電気泳動）：Immobiline（登録商標）
DryPlate（ｐＨ４．５−５．４、ファルマシア社製）の
ｐＨ勾配を有するゲルをグラジェントに対し垂直に幅１
ｃｍに切り、該ゲルを再水和用緩衝液（８Ｍ尿素、０．
５％ＮＰ−４０、０．２％Ａｍｐｈｏｌｙｔｅ ｐＨ
３．５−１０）に浸漬し、１２時間以上膨潤させた後、
MultiphorII 泳動槽（ファルマシア社製）を用いて等電
点電気泳動を行った。一枚のゲルあたり２００μｌ（２
×１０7 細胞）をマーカー色素であるブロモフェノール
ブルー溶液と共にアプライした。泳動条件は、５００Ｖ
５時間、２０００Ｖ５時間、３５００Ｖ１０時間で、合
計４７５００Ｖｈｒ行った。二次元目（ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ）：上記一次元目のゲルを、平衡化緩衝液（５０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ６．８，６Ｍ尿素，３０％グ
リセロール，１％ＳＤＳ，１６２μＭ ジチオスレイト
ール）に１０分間浸漬、平衡化した。別途、分離用ゲル
及び濃縮用ゲルを以下のように調製した。 ・分離用ゲル（アクリルアミド終濃度：１０％） ３０％ アクリルアミド １５ｍｌ １．５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８） ７．５ｍｌ １０％ ＳＤＳ ０．３ｍｌ １０％ 過硫酸アンモニウム １５０μｌ 純水 １２．０４ｍｌ N, N, N', N'- テトラメチル ２０μｌ エチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ） ・濃縮用ゲル（アクリルアミド終濃度：４％） ３０％ アクリルアミド １．３３ｍｌ ０．５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）１．２５ｍｌ １０％ ＳＤＳ ０．１ｍｌ １０％ 過硫酸アンモニウム １００μｌ 純水 ７．５ｍｌ ＴＥＭＥＤ １０μｌ 次に、分離用ゲルを２枚のガラスプレートの間に流し込
み、水飽和ブタノールを重層した。ゲルが固化した後、
ブタノール層を除き、純水でゲルを洗った。濃縮用ゲル
を重層し、さらに水飽和ブタノールを重層した。固化し
たゲルに上記の平衡化した一次元目のゲルを密着させ、
泳動バッファー（25 mM Tris, 192 mMグリシン，0.1% S
DS）を入れた泳動槽にセットした。分子量マーカーを添
加後、電極をつなぎ泳動を開始した。まず、１０ｍＡで
泳動し、濃縮ゲル部分をマーカー色素が通過したら１５
ｍＡにあげて、マーカー色素がゲル下端から５ｍｍに達
するまで泳動した。泳動終了後、０．２５％クマシーブ
リリアントブルー（ＣＢＢ）染色液にゲルを浸し、緩や
かに振盪しながら２時間染色した。その結果得られた泳
動像（図１右）を、アポトーシスを誘導していないＨＬ
−６０細胞を全く同様にして抽出・二次元電気泳動して
得られた泳動像（図１左）と比較したところ、分子量３
８ｋＤａ、等電点５．２の位置にアポトーシス非誘発細
胞には見られないタンパク質のスポットが観察された。
本発明者は、当該タンパク質をｐ３８と命名した。
DryPlate（ｐＨ４．５−５．４、ファルマシア社製）の
ｐＨ勾配を有するゲルをグラジェントに対し垂直に幅１
ｃｍに切り、該ゲルを再水和用緩衝液（８Ｍ尿素、０．
５％ＮＰ−４０、０．２％Ａｍｐｈｏｌｙｔｅ ｐＨ
３．５−１０）に浸漬し、１２時間以上膨潤させた後、
MultiphorII 泳動槽（ファルマシア社製）を用いて等電
点電気泳動を行った。一枚のゲルあたり２００μｌ（２
×１０7 細胞）をマーカー色素であるブロモフェノール
ブルー溶液と共にアプライした。泳動条件は、５００Ｖ
５時間、２０００Ｖ５時間、３５００Ｖ１０時間で、合
計４７５００Ｖｈｒ行った。二次元目（ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ）：上記一次元目のゲルを、平衡化緩衝液（５０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ６．８，６Ｍ尿素，３０％グ
リセロール，１％ＳＤＳ，１６２μＭ ジチオスレイト
ール）に１０分間浸漬、平衡化した。別途、分離用ゲル
及び濃縮用ゲルを以下のように調製した。 ・分離用ゲル（アクリルアミド終濃度：１０％） ３０％ アクリルアミド １５ｍｌ １．５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８） ７．５ｍｌ １０％ ＳＤＳ ０．３ｍｌ １０％ 過硫酸アンモニウム １５０μｌ 純水 １２．０４ｍｌ N, N, N', N'- テトラメチル ２０μｌ エチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ） ・濃縮用ゲル（アクリルアミド終濃度：４％） ３０％ アクリルアミド １．３３ｍｌ ０．５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）１．２５ｍｌ １０％ ＳＤＳ ０．１ｍｌ １０％ 過硫酸アンモニウム １００μｌ 純水 ７．５ｍｌ ＴＥＭＥＤ １０μｌ 次に、分離用ゲルを２枚のガラスプレートの間に流し込
み、水飽和ブタノールを重層した。ゲルが固化した後、
ブタノール層を除き、純水でゲルを洗った。濃縮用ゲル
を重層し、さらに水飽和ブタノールを重層した。固化し
たゲルに上記の平衡化した一次元目のゲルを密着させ、
泳動バッファー（25 mM Tris, 192 mMグリシン，0.1% S
DS）を入れた泳動槽にセットした。分子量マーカーを添
加後、電極をつなぎ泳動を開始した。まず、１０ｍＡで
泳動し、濃縮ゲル部分をマーカー色素が通過したら１５
ｍＡにあげて、マーカー色素がゲル下端から５ｍｍに達
するまで泳動した。泳動終了後、０．２５％クマシーブ
リリアントブルー（ＣＢＢ）染色液にゲルを浸し、緩や
かに振盪しながら２時間染色した。その結果得られた泳
動像（図１右）を、アポトーシスを誘導していないＨＬ
−６０細胞を全く同様にして抽出・二次元電気泳動して
得られた泳動像（図１左）と比較したところ、分子量３
８ｋＤａ、等電点５．２の位置にアポトーシス非誘発細
胞には見られないタンパク質のスポットが観察された。
本発明者は、当該タンパク質をｐ３８と命名した。
【００２９】実施例２ 実施例１で得られたゲルをトランスブロット装置（バイ
オラッド社製）を用いてエレクトロブロッティングによ
りＰＶＤＦ膜（ミリポア社製）にトランスファーし、Ｐ
ＶＤＦ膜をＣＢＢ染色し、ｐ３８のスポット部位を回収
した。まず過剰のジチオスレイトールを加えてタンパク
質内のジスルフィド結合をスルフヒドリル基に還元後、
ヨード酢酸を用いて該スルフヒドリル基をアルキル化
し、Ｓ−カルボキシメチル誘導体とした。次いで、Ｌｙ
ｓ−Ｃエンドペプチダーゼ（ペプチドのリジン残基のカ
ルボキシル基側のペプチド結合を特異的に切断する酵
素）を含む緩衝液（20 mM Tris-HCl(pH 9.0), 10% アセ
トニトリル, Ｌｙｓ−Ｃエンドペプチダーゼ 1 pmol)中
にｐ３８タンパクを結合したＰＶＤＦ膜を加え、３７℃
で反応させた。酵素消化後、逆相ＨＰＬＣにより膜より
遊離する各ペプチドフラグメントを分離回収した。ペプ
チドを含むフラクションを波長２１４ｎｍでモニターし
た（図２）。ピークとして検出されるフラグメントの各
フラクションは、遠心エバポレーターにて乾燥後、ＳＤ
Ｓ溶液に溶解し、気相プロテインシークエンサー（ＰＳ
Ｑ−１、島津製作所製）にかけて、アミノ酸分析を行
い、各ペプチド断片の部分アミノ酸配列を決定した（図
２中、配列番号１〜７）。
オラッド社製）を用いてエレクトロブロッティングによ
りＰＶＤＦ膜（ミリポア社製）にトランスファーし、Ｐ
ＶＤＦ膜をＣＢＢ染色し、ｐ３８のスポット部位を回収
した。まず過剰のジチオスレイトールを加えてタンパク
質内のジスルフィド結合をスルフヒドリル基に還元後、
ヨード酢酸を用いて該スルフヒドリル基をアルキル化
し、Ｓ−カルボキシメチル誘導体とした。次いで、Ｌｙ
ｓ−Ｃエンドペプチダーゼ（ペプチドのリジン残基のカ
ルボキシル基側のペプチド結合を特異的に切断する酵
素）を含む緩衝液（20 mM Tris-HCl(pH 9.0), 10% アセ
トニトリル, Ｌｙｓ−Ｃエンドペプチダーゼ 1 pmol)中
にｐ３８タンパクを結合したＰＶＤＦ膜を加え、３７℃
で反応させた。酵素消化後、逆相ＨＰＬＣにより膜より
遊離する各ペプチドフラグメントを分離回収した。ペプ
チドを含むフラクションを波長２１４ｎｍでモニターし
た（図２）。ピークとして検出されるフラグメントの各
フラクションは、遠心エバポレーターにて乾燥後、ＳＤ
Ｓ溶液に溶解し、気相プロテインシークエンサー（ＰＳ
Ｑ−１、島津製作所製）にかけて、アミノ酸分析を行
い、各ペプチド断片の部分アミノ酸配列を決定した（図
２中、配列番号１〜７）。
【００３０】上述の方法により得られたｐ３８の部分ア
ミノ酸配列を基に、タンパク質・ペプチドのデータベー
スであるＧｅｎｏｍｅ Ｎｅｔを利用して既知タンパク
質とのホモロジー検索を行った結果、本発明ｐ３８は、
新規タンパク質であることがわかった。
ミノ酸配列を基に、タンパク質・ペプチドのデータベー
スであるＧｅｎｏｍｅ Ｎｅｔを利用して既知タンパク
質とのホモロジー検索を行った結果、本発明ｐ３８は、
新規タンパク質であることがわかった。
【００３１】実施例３ 実施例１と同様の材料及び方法で、アクチノマイシンＤ
による処理時間のみを０〜６時間の間で変化させて、ｐ
３８の発現を経時的に観察した（図３）。ｐ３８はアク
チノマイシンＤ添加３時間後から発現し、５時間後に最
高に達して、その後減少した。ｐ３８が高いレベルで発
現している時期は、ＤＮＡの断片化が進行する時期と一
致しており（図３中の泳動像）、ｐ３８はアポトーシス
の実行過程に関与する可能性が示唆された。
による処理時間のみを０〜６時間の間で変化させて、ｐ
３８の発現を経時的に観察した（図３）。ｐ３８はアク
チノマイシンＤ添加３時間後から発現し、５時間後に最
高に達して、その後減少した。ｐ３８が高いレベルで発
現している時期は、ＤＮＡの断片化が進行する時期と一
致しており（図３中の泳動像）、ｐ３８はアポトーシス
の実行過程に関与する可能性が示唆された。
【００３２】実施例４ 細胞材料と細胞に対する処理の組み合わせを以下のよう
に変更して実施例１と同様の方法によりｐ３８の発現を
観察した。 ａ）ＨＬ−６０細胞にカンプトテシン１μＭで６時間処
理 ｂ）Ｊｕｒｋａｔ（ヒトＴ細胞リンパ腫）細胞にカンプ
トテシン１μＭで６時間処理 ｃ）ラット胸腺細胞に１０ＧｙＸ線照射処理 ｄ）ＨＬ−６０細胞を５０℃または６０℃で３０分間熱
処理した後、３７℃で６時間インキュベーション その結果、ａ），ｂ），ｃ）のいずれの場合でもｐ３８
のスポットが検出された。本結果より、ｐ３８は種を越
えて、一般にアポトーシス時の細胞において誘導される
ことが示唆された。一方、ｄ）の場合にはｐ３８のスポ
ットは検出されなかった。ｄ）記載の処理は細胞にネク
ローシスを誘発する。本結果より、ｐ３８は細胞死に共
通に誘導されるのではなく、アポトーシス時に特異的に
誘導されることが確認された。
に変更して実施例１と同様の方法によりｐ３８の発現を
観察した。 ａ）ＨＬ−６０細胞にカンプトテシン１μＭで６時間処
理 ｂ）Ｊｕｒｋａｔ（ヒトＴ細胞リンパ腫）細胞にカンプ
トテシン１μＭで６時間処理 ｃ）ラット胸腺細胞に１０ＧｙＸ線照射処理 ｄ）ＨＬ−６０細胞を５０℃または６０℃で３０分間熱
処理した後、３７℃で６時間インキュベーション その結果、ａ），ｂ），ｃ）のいずれの場合でもｐ３８
のスポットが検出された。本結果より、ｐ３８は種を越
えて、一般にアポトーシス時の細胞において誘導される
ことが示唆された。一方、ｄ）の場合にはｐ３８のスポ
ットは検出されなかった。ｄ）記載の処理は細胞にネク
ローシスを誘発する。本結果より、ｐ３８は細胞死に共
通に誘導されるのではなく、アポトーシス時に特異的に
誘導されることが確認された。
【００３３】実施例４ ｐ３８抗体の作製 実施例２で決定された本発明ｐ３８の部分アミノ酸配列
を基に、合成した下記のペプチドを使用抗原としてｐ３
８に対するポリクローナル抗体を作製した。
を基に、合成した下記のペプチドを使用抗原としてｐ３
８に対するポリクローナル抗体を作製した。
【００３４】ＥＨＥＬＬＥＱｑｋ （上記式中、Ｅはグルタミン酸を、Ｈはヒスチジンを、
Ｌはロイシンを、Ｑ及びｑはグルタミンを、ｋはリジン
を意味する。また式中、大文字で示した部分はｐ３８の
部分アミノ酸配列であり、小文字で示した部分は、キャ
リアタンパク質との架橋形成の為に余分に付加された配
列である。）
Ｌはロイシンを、Ｑ及びｑはグルタミンを、ｋはリジン
を意味する。また式中、大文字で示した部分はｐ３８の
部分アミノ酸配列であり、小文字で示した部分は、キャ
リアタンパク質との架橋形成の為に余分に付加された配
列である。）
【００３５】上記合成ペプチドを、マレイミド法により
キャリアタンパクであるKeyhole Limpets Hemocyanin
（ＫＬＨ）に架橋した複合体と、完全フロイントアジュ
バント（ＦＣＡ）との混和物を抗原として、ウサギ〔Ｋ
ｂｌ：ＪＷ、１５齢、オス、体重３〜３．５ｋｇ（初回
免疫時）、２羽使用〕に背部皮下注射により約０．５ｍ
ｇ免疫した。初回免疫から約３週間毎に計３回約０．５
ｍｇずつ追加免疫し、各追加免疫の約１０日後に部分採
血して抗体価を測定し、さらに最終免疫（３回目の追加
免疫）から約１０日後に全血を採取して抗血清を得た。
キャリアタンパクであるKeyhole Limpets Hemocyanin
（ＫＬＨ）に架橋した複合体と、完全フロイントアジュ
バント（ＦＣＡ）との混和物を抗原として、ウサギ〔Ｋ
ｂｌ：ＪＷ、１５齢、オス、体重３〜３．５ｋｇ（初回
免疫時）、２羽使用〕に背部皮下注射により約０．５ｍ
ｇ免疫した。初回免疫から約３週間毎に計３回約０．５
ｍｇずつ追加免疫し、各追加免疫の約１０日後に部分採
血して抗体価を測定し、さらに最終免疫（３回目の追加
免疫）から約１０日後に全血を採取して抗血清を得た。
【００３６】抗体価の測定は以下の方法で行った。抗原
を１０μｇ／ｍｌの濃度でマイクロタイタープレートに
固相化し、ブロッキング後、感作ウサギの部分血を１０
1 〜１０8 まで希釈して抗原と反応させた。洗浄後、抗
ウサギＩｇＧ−ペルオキシダーゼ標識二次抗体を反応さ
せ、洗浄後、基質液ＡＢＴＳの発色により抗体価を測定
した。その結果、いずれの場合も経時的に抗体価の上昇
が確認された。
を１０μｇ／ｍｌの濃度でマイクロタイタープレートに
固相化し、ブロッキング後、感作ウサギの部分血を１０
1 〜１０8 まで希釈して抗原と反応させた。洗浄後、抗
ウサギＩｇＧ−ペルオキシダーゼ標識二次抗体を反応さ
せ、洗浄後、基質液ＡＢＴＳの発色により抗体価を測定
した。その結果、いずれの場合も経時的に抗体価の上昇
が確認された。
【００３７】
【発明の効果】本発明のｐ３８は、アポトーシス時に特
異的に誘導され、且つネクローシス時には誘導されない
ことを特徴とすることから、アポトーシスの有効なマー
カータンパク質である。従って、該タンパク質に対する
標識化抗体は、アポトーシスの組織化学的(histochemic
al) 検出試薬として有用である。また、このｐ３８の機
能を明らかにしていくことは、ｐ３８と相互作用する新
規なタンパク質の同定など、アポトーシスの分子機構を
新たな切口から解明していく上で重要な意義をもつ。
異的に誘導され、且つネクローシス時には誘導されない
ことを特徴とすることから、アポトーシスの有効なマー
カータンパク質である。従って、該タンパク質に対する
標識化抗体は、アポトーシスの組織化学的(histochemic
al) 検出試薬として有用である。また、このｐ３８の機
能を明らかにしていくことは、ｐ３８と相互作用する新
規なタンパク質の同定など、アポトーシスの分子機構を
新たな切口から解明していく上で重要な意義をもつ。
【００３８】本発明のｐ３８は、クロマチンＤＮＡの断
片化が顕著になる時期にその発現が最大に達することか
ら、ＤＮＡ断片化を初めとするアポトーシスの実行過程
に関与するタンパク質であることが予測される。従っ
て、本発明ｐ３８及びその抗体は、アポトーシスが関与
する疾患である癌、免疫抑制性疾患、自己免疫疾患、ウ
ィルス感染症、神経変性疾患、内分泌疾患、臓器移植障
害、放射線障害等の診断、予防又は治療薬としての利用
が期待される。
片化が顕著になる時期にその発現が最大に達することか
ら、ＤＮＡ断片化を初めとするアポトーシスの実行過程
に関与するタンパク質であることが予測される。従っ
て、本発明ｐ３８及びその抗体は、アポトーシスが関与
する疾患である癌、免疫抑制性疾患、自己免疫疾患、ウ
ィルス感染症、神経変性疾患、内分泌疾患、臓器移植障
害、放射線障害等の診断、予防又は治療薬としての利用
が期待される。
【００３９】
【配列表】配列番号：１ 配列の長さ：７ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド
【００４０】配列番号：２ 配列の長さ：７ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド
【００４１】配列番号：３ 配列の長さ：３ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド
【００４２】配列番号：４ 配列の長さ：８ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド
【００４３】配列番号：５ 配列の長さ：９ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド
【００４４】配列番号：６ 配列の長さ：８ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド
【００４５】配列番号：７ 配列の長さ：７ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド
【００４６】配列番号：８ 配列の長さ：９ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド
【図１】アクチノマイシンＤ１μｇ／ｍｌで６時間処理
し、アポトーシスを誘発した細胞から抽出したタンパク
質の二次元電気泳動像である。図１右 アポトーシス細
胞から抽出したタンパク質の泳動像。図１左 非アポト
ーシス細胞から抽出したタンパク質の泳動像。
し、アポトーシスを誘発した細胞から抽出したタンパク
質の二次元電気泳動像である。図１右 アポトーシス細
胞から抽出したタンパク質の泳動像。図１左 非アポト
ーシス細胞から抽出したタンパク質の泳動像。
【図２】ｐ３８をＬｙｓ−Ｃエンドペプチダーゼで限定
分解して生じるペプチド断片を逆相ＨＰＬＣで分離した
時の各ペプチド断片の溶出パターン。各ピークに対応す
るペプチドのアミノ酸配列を付記してある。
分解して生じるペプチド断片を逆相ＨＰＬＣで分離した
時の各ペプチド断片の溶出パターン。各ピークに対応す
るペプチドのアミノ酸配列を付記してある。
【図３】ｐ３８の出現の経時変化を示したグラフであ
る。タンパク量はＣＢＢ染色の強度を吸光度として測定
した。ほとんど変化しないタンパク質を基準に染色むら
を補正した数値を示している。
る。タンパク量はＣＢＢ染色の強度を吸光度として測定
した。ほとんど変化しないタンパク質を基準に染色むら
を補正した数値を示している。
Claims (3)
- 【請求項１】 アポトーシス時に誘導されることを特徴
とし、且つ以下の性状を有するタンパク質。 ａ）分子量： ３８ｋＤａ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ） ｂ）等電点（ｐＩ）： ５．２ ｃ）実質的に下記の(I) 〜(VII) の部分アミノ酸配列を
有する。 (I) ＥＨＥＬＬＥＱ (II) ＩＰＱＡＬＥＫ (III) ＡＰＶ (IV) ＬＡＱＱＱＡＡＬ (V) ＲＡＡＶＬＬＥＱＥ (VI) ＬＡＥＩＧＡＰＩ (VII) ＡＥＬＱＬＰＰ （上記式中、Ｅはグルタミン酸を、Ｈはヒスチジンを、
Ｌはロイシンを、Ｑはグルタミンを、Ｉはイソロイシン
を、Ｐはプロリンを、Ａはアラニンを、Ｋはリジンを、
Ｖはバリンを、Ｍはメチオニンを、Ｒはアルギニンを、
Ｇはグリシンを意味する。） - 【請求項２】 制ガン剤の添加によりアポトーシスを誘
発させたヒト培養細胞の抽出物を、等電点電気泳動とＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥとの二次元電気泳動に付すことにより得
られうる請求項１記載のタンパク質。 - 【請求項３】 請求項１記載のアミノ酸配列の全部又は
一部を有するペプチドに親和性を示す抗体。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP26224595A JPH0977794A (ja) | 1995-09-14 | 1995-09-14 | 新規タンパク質 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP26224595A JPH0977794A (ja) | 1995-09-14 | 1995-09-14 | 新規タンパク質 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0977794A true JPH0977794A (ja) | 1997-03-25 |
Family
ID=17373099
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP26224595A Pending JPH0977794A (ja) | 1995-09-14 | 1995-09-14 | 新規タンパク質 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0977794A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1997036928A1 (en) * | 1996-03-29 | 1997-10-09 | Dana-Farber Cancer Institute | Monoclonal antibody that detects apoptotic antigen |
-
1995
- 1995-09-14 JP JP26224595A patent/JPH0977794A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1997036928A1 (en) * | 1996-03-29 | 1997-10-09 | Dana-Farber Cancer Institute | Monoclonal antibody that detects apoptotic antigen |
| US5935801A (en) * | 1996-03-29 | 1999-08-10 | Dana-Farber Cancer Institute | Monoclonal antibody that detects apoptotic antigen |
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