JPH03112486A - Ｈｌａ―ｂ３５遺伝子およびｄｎａプローブ並びに形質転換細胞 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はＨＬＡ−８３５遺伝子およびＤＮＡプローブ並
びに形質転換細胞に関し、特にはＨＬ　Ａ　（ｈｕｍａ
ｎ　１ｅｕｋｏｃｙｔｏ　ａｎｔｉｇｅｎ）　−８３５
抗原のアロタイプをコードするＤＮＡおよびＤＮＡタイ
ピングで患者のクラス■遺伝子そのものを取り出して同
定する際に使用されるＤＮＡプローブ並びに本発明のＤ
ＮＡをヒトおよびヒト以外の真核細胞に導入することに
よりその細胞表面上にＨＬＡ−８３５抗原のアロタイプ
を発現した形質転換細胞に関する。ＨＬＡ−Ｂ３５アロ
抗原を発現した細胞は免疫原として動物に投与すること
が可能であるためＨＬＡ−Ｂ３５抗原に特異性を有する
モノクローナル抗体の開発に有用である。さらに、ヒト
の真核細胞へ本発明の遺伝子を導入しＨＬＡ−Ｂ３５抗
原を発現した細胞は抗血清の特異性判定に使用されるパ
ネル細胞（ｐａｎｅｌ　ｃｅｌｌ　）として有用である
。

〔従来の技術〕

ＨＬ　Ａ抗原はヒトの臓器移植の際、移植片の定着の可
否を決定する抗原として移植免疫に重要な役割を果たし
ている。この中でクラスＩ抗原は、細胞性免疫において
細胞傷害性Ｔ細胞による抗原認識に関与すると共に、尋
常性舵面（ＣＷ６）、天泡瘉（ＡＩＯ）　、０疹ヘルペ
ス（Ａ　２９）ベーチェット（ＢＳ？）などの疾患との
有意な相関が明らかにされている。　　（Ｏｚａｗａ＋
Ａ、＋０ｈｋｉｄｏ。

ｉｏ、↑５ｕｊｔ、Ｘ、Ｊ、Ａｍ、＾ｃａａ、ｎｅｒｍ
ａｔｏｔ＋土、２０５．１９８１　’）ＨＬＡ抗原は拒
絶現象や移植免疫に深く関連することから主要組織適合
抗原とも呼ばれ、それをコードする遺伝子群は主要＆Ｕ
繊織適合遺伝子複合体（ＭＭＣ）と呼ばれる。

ＨＬＡはヒトのＭＭＣであり、ＨＬＡクラス■抗原は細
胞膜上に存在する膜タンパク質であって、ｐ、、Ｂ、Ｃ
の３つの遺伝子座に支配されている。クラス！抗原は分
子量４４ｋｄの糖タンノ寸り（α鎖）が分子量１２ｋｄ
のタンパク質（β２−ミクログロブリン）と非共有結合
によって会合した構造を持ち、α鎖は細胞外に位置する
Ｎ末端側に、α１．α２．α３の３個のドメインがあり
、次いで細胞内に埋め込まれた領域（ｔｒａｎｓｍｅｍ
ｂｒａｎｅ　Ｒｅｇｉｏｎ）　、細胞内に位置する領域
（ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ　ｄｏｍｅｉｎ）が並んでい
る。β２−ミクログロブリンは１つのドメインからなり
、α鎖に結合している。

ＨＬＡ遺伝子領域はヒト第６染色体短腕上に２．５セン
チモルガン（ｃＭ）の距離に亘って存在し、セントロメ
アーの側からクラスＩＩ　ｃＭ域（１，ＯｃＭ）、クラ
ス■領域（ＤＲ−Ｂ間＝０．７ｃＭ）、クラスｌ領域（
０，８ｃ　Ｍ　）の順に並んでいる。

（Ｊｏｒｄａｎ＋Ｂ、Ｒ，ｅｔ　　ａｌ、Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ、Ｒｅｖ、＋８４．７３．１９８５））ＩＬＡクラス
Ｉ抗原を検査する方法は、血清学的方法および姐み換え
ＤＮＡ技術によるＨ　Ｌ　Ａ　−Ｄ　Ｎ　Ａ　　ｔｙｐ
ｉｎｇがある。

血清学的方法としては、補体依存性細胞障害性試験（Ｔ
ｅｒａｓａｋｉ、Ｐ、１．　ａｎｄ　ＭｃＣｌｅｌｌａ
ｎｄ、Ｊ、Ｄ。

Ｎａｔｕｒｅ　（Ｌｏｎｄｏｎ）　、　２０４．ｐｐ９
９８−１０００．１９６４　）が標準的な手法である。

この方法はアロ抗血清を用い、家兎の血清を補体として
リンパ球細胞毒（ｌｙｍｐｏｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ
　）によりＨＬＡをタイプする方法であるが、抗血清が
多産妊婦のアロ血清であること、および、抗血清は交差
反応性（ｃｒｏｓｓ　ｒｅａｃｔｌｏｎ）を示しＨＬＡ
クラス！アロタイプに単一特異的に反応するものが得難
いこと、さらに、抗血清はヒトから入手するため再現性
ある血清の安定供給は不可能であること、発現量の少な
いアロ抗原に対する抗血清は得られないことからアロ血
清に替わるモノクローナル抗体の開発が望まれている。

　１９８４年の国際組織適合性ワークショップで、およ
そ１５０種のモノクローナル抗体が提出されている。　
　（Ｆａｕｃｈｅｔ、Ｒ，、Ｂｏｎｄｅｒ、Ｊ、Ｇ、、
Ｋｅｎｎｅｄｙ、Ｌ、Ｊ、ｅｔ　ａｌｌ：　ＨＬ　Ａ−
Ａ、　　Ｂ、　　　Ｃｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　　ａｎｔ
ｉｂｏｄｉｅｓ、　　Ｈｉｓｔ。

ｃｏａ＋ｐａｔｉｂ１１ｉｔｙ　Ｔｅｓｔｉｎｇ　１９
８４　（Ａ１ｂｅｒｔ＋１！−Ｄ。

Ｂａｕｒ＋　Ｍ、Ｐ、、ＭａｙｒＪ、Ｒ，ｅｄ、）＋　
Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ。

Ｂｅｒｌｉｎ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｎｅｎ　　Ｙｏ
ｒｋ＋Ｔｏｋｙｏ：　　２１１＋１９８４）抗ＨＬＡモ
ノクローナル抗体の作成は、−ｉにヒトのリンパ球をマ
ウスに免疫して得られた肺細胞とマウス骨髄腫細胞を融
合させる方法を用いることができる。（Ｏｉ、Ｖ、Ｔ、
＋Ｈｅｒｚｅｎｂｅｒｇｉ、Ａ、：Ｉｍａ＋ｕｎｏｇｌ
ｏｂｕｌｉｎ−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ　　ｈｙｂｒｉｄ　
　ｃｅｌｌ　　　１ｉｎｅｓ。

５ｅｌｅｃｔｅｄ　ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　ＩＩＩｌｍ
ｕｎｏｌｏｇｙ、　３５１．１９８１）しかしながら、
現在まででモノクローナル抗体のうちでＨＬＡタイピン
グに適した抗体−たとえばＨＬＡ−Ｂ抗原のアロタイプ
に対するモノクローナル抗体を例にとると、８ｗ４，８
ｗ５゜Ｂ７．Ｂ８．Ｂ１３．Ｂ２７に単一特異的に結合
するモノクローナル抗体しか得られていない状況にあり
、他の多数のアロタイプに単一特異性を有するモノクロ
ーナル抗体の開発が期待されている。また、現在まだ反
応性を有するモノクローナル抗体すら得られていないア
ロ抗原が多数存在している。このようなアロ抗原につい
ては他のアロ抗原と交差反応性を有するモノクローナル
抗体も有効である。最近さらに抗ＨＬＡモノクローナル
抗体作製方法の改善が成された。

この方法は、ヒトのＴリンパ球優位の末梢リンパ球を免
疫原として用いた抗体産生法では、ヒト由来の抗原が多
数ゲ在するために目的とするＨＬＡアロタイプの抗原以
外の多数の抗原部位に対し反応性を示すモノクローナル
抗体が得られる点を改善したものであり、免疫動物由来
の真核細胞にヒ）ＨＬＡ抗原遺伝子クローンを導入して
形質転換した細胞を免疫動物に投与することで形質転換
細胞上に発現したヒ）ＨＬＡ抗原に対するモノクローナ
ル抗体を効率良（産生する肺細胞を得る方法である＠　
　（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ｔｏ
　ＨＬ　Ａ　−Ｄ　Ｐ　−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄｓ＋
ｏｕｓｅ　Ｌ　ｃｅｌｌ：　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａ
ｃａｄ、Ｓｃ！、＋　ＵＳＡ＋８３゜ｐｐ　３４１７−
３４２１．１９８６　）ＨＬＡクラス■抗原アロタイプ
に特異性を有する抗血清、モノクローナル抗体が得られ
ていないものについてはＤＮＡタイピングが有力な検査
方法である。尋常性乾廖はＨＬＡクラス■抗原であるＣ
ｗ５．Ｃｗ７に非常に高い相関を示す疾患として知られ
ている。　（Ｏｚａｓｅａ　ｅｔ　ａｌ、：５ｏｌｌｅ
　ｒｅｃｅｎｔ　ａｄｖａｎｃｅｓ　ｉｎ　　ＨＬ　Ａ
　ａｎｄ　５ｋｉｎｄｉｓｅａｓｅｓ＋Ｊ、Ａｓ、Ａｃ
ａｄ、Ｄｅｒｍａｔｏｌ、　　４＋　２０５＋１９８１
）そこでＯｚａｗａらはＣ抗原遺伝子クローンＰ４２（
Ｓｏｄｏｙｅｒ＋Ｒ，ｅｔ　ａｌ、＋ｃｏｍｐｌｅｔｅ
　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ａ　
ｇｅｎｅ　ｅｎｃｏｄｉｎｇ　ａ　ｆｕｎｃｔｉｏｎａ
ｌｈｕｍａｎ　　ｃｌａｓｓ　　Ｉ　　ｈｉｓｔｏ　　
ｃｏｍｐａｔｉｂｉ目ｔｙ　　ａｎｔｉｇｅｎ（ＨＬＡ
−Ｃｗ　３　）　、　ＥＭＢＯＪ、、３　：８７９．１
９８４）のＰｖｕ　ＩＩフラグメントをプローブとして
Ｃｗ６゜Ｃｗ７を有する尋常性乾％１ｆ２１名と健常人
１６名についてＤＮＡタイピングを実施したｅ　（Ｏｚ
ａｗａ。

＾、ｅｔ　ａｌ　　：　Ｄ　Ｎ　Ａ　　ｔｙｐｉｎｇ　
ｉｎ　ｐｓｏｒｉａｓｉｓＶｕ１ｇａｒｉｓ＋　Ｉｌｌ
：Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ　ｏｆ　ｔｈｅ　　３　ｒｄ　
Ａｓ１ａＯｃｅａｎｉａ　Ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂ
ｌｌｉｔｙ　賀ｏｒｋｓｈｏｐ　ａｎｄＣｏｎｆｅｒｅ
ｎｃｅ＋　ｉｎ　ｐｒｅｓｓ）その結果、シグナル配列
、αｌドメインα２ドメインの一部に相当するＰｖｕ　
ｎ　　　１．７ｋｂフラグメントをプローブとしたとき
に患者に特異的なバンドを検出した。

〔発明が解決しようとする課題〕

従来の技術においては、単離され塩基配列の特定された
ＨＬＡ遺伝子が数多く得られていないため、ＨＬＡ抗原
アロタイプの解析、ＤＮＡタイピングの適用に制限を受
けていた。また、抗ＨＬＡモノクローナル抗体を作成す
るための良い免疫原が少なかった。

本発明はこのような事情に着目してなされたもので、新
規なＨＬＡ−８３５遺伝子およびＤＮＡプローブ並びに
形質転換細胞を提供することを目的とする。

〔課題を解決するための手段及び作用〕発明者はＨＬＡ
に関する研究を続けた結果、ＨＬＡ−Ｂ３５遺伝子の単
離に成功し、本発明を完成させた。

本発明のＨＬＡ−８３５遺伝子は下記の塩基配列で表わ
されるエクソンを有する。

ＡＴＧＣＧＧＧＴＣＡＣＧＧＣＧＣＣＣＣＧＡＡＣＣＧ
ＴＣＣＴＣＣＴＧＣＴＧＣＴＣＴＧＧＧＧＧＧＣＡＧＴ
ＧＧＣＣＣＴＧＡＣＣＧＡＧＡＣＣＴＧＧＧＣＣＧＧＣ
ＴＣＣＣ＾ＣＴＣＣＡＴＧＡＧＧＴＡＴＴＴＣＴＡＣＡ
ＣＣＧＣＣＡＴＧＴＣＣＣＧＧＣＣＣＧＧＣＣＧＣＧＧ
ＧＧＡＧＣＣＣＣＧＣＴＴＣＡＴＣＧＣＡＧＴＧＧＧＣ
ＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＡＣＡＣＣＣＡＧＴＴＣＧＴＧＡ
ＧＧＴＴＣＧＡＣＡＧＣＧＡＣＧＣＣＧＣＧＡＧＴＣＣ
ＧＡＧＧＡＣＧＧＡＧＣＣＣＣＧＧＧＣＧＣＣＡＴＧＧ
ＡＴＡＧＡＧＣＡＧＧＡＧＧＧＧＣＣＧＧＡＧＴＡＴＴ
ＧＧＧＡＣＣＧＧＡＡＣＡＣＡＣＡＧＡＴＣＴＴＣＡＡ
ＧＡＣＣＡＡＣＡＣＡＣＡＧＡＣＴＴＡＣＣＧＡＧＡＧ
ＡＧＣＣＴＧＣＧＧＡＡＣＣＴＧＣＧＣＧＧＣＴＡＣＴ
ＡＣＡＡＣＣＡＧＡＧＣＧＡＧＧＣＣＧＧＧＴＣＴＣＡ
ＣＡＴＣＡＴＣＣＡＧＡＧＧＡＴＧＴ−ＡＴＧＧＣＴＧ
ＣＧＡＣＣＴＧＧＧＧＣＣＣＧＡＣＧＧＧＣＧＣＣＴＣ
ＣＴＣＣＧＣＧＧＧＣＡＴＧＡＣＣＡＧＴＣＣＧＣＣＴ
ＡＣＧＡＣＧＧＣＡＡＧＧＡＴＴＡＣＡＴＣＧＣＣＣＴ
ＧＡＡＣＧＡＧＧＡＣＣＴＧＡＧＣＴＣＣＴＧＧＡＣＣ
ＧＣＧＧＣＧＧＡＣＡＣＣＧＣＧＧＣＴＣＡＧＡＴＣＡ
ＣＣＣＡＧＣＧＣＡＡＧＴＧＧＧＡＧＧＣＧＧＣＣＣＧ
ＴＧＴＧＧＣＧＧＡＧＣＡＧＣＴＧＡＧＧＧＣＣＴＡＣ
ＣＴＧＧＡＧＧＧＣＣＴＧＴＧＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＣ
ＴＣＣＧＣＡＧＡＴＡＣＣＴＧＧＡＧＡＡＣＧＧＧＡＡ
ＧＧＡＧＡＣＧＣＴＧＣＡＧＧＣＣＧＣＧＧＡＣＣＣＣ
ＣＣＡＡＡＧＡＣＡＣＡＧＣＴＧＡＣＣＣＡＣＣＡＣＣ
ＣＣＧＴＣＴＣＴＧＡＣＣＡＴＧＡＧＧＣＣＡＣＣＣＴ
ＧＡＧＧＴＧＣＴＧＧＧＣＣＣＴＧＧＧＣＴＴＣＴＡＣ
ＣＣＴＧＣＧＧＡＧＡＴＣＡＣＡＣＴＧＡＣＣＴＧＧＣ
ＡＧＣＧＧＧＡＴＧＧＣＧＡＧＧＡＣＣＡＡＡＣＴＣＡ
ＧＧＡＣＡＣＴＧＡＧＣＴＴＧＴＧＧＡＧＡＣＣＡＧＡ
ＣＣＡＧＣＡＧＧＡＧＡＴＡＧＡＡＣＣＴＴＣＣＡＧＡ
ＡＣＴＧＧＧＣＡＧＣＴＧＴＧＧＴＧＧＴＧＣＣＴＴＣ
ＴＧＧＡＧＡＡＧＡＧＣＡＧＡＧＡＴＡＣＡＣＡＴＧＣ
ＣＡＴＧＴＡＣＡＧＣＡＴＧＡＧＧＧＧＣＴＧＣＣＧＡ
ＡＧＣＣＣＣＴＣＡＣＣＣＴＧＡＧＡＴＧＧＧＡＧＣＣ
ＡＴＣＴＴＣＣＣＡＧＴＣＣＡＣＣＡＴＣＣＣＣＡＴＣ
ＧＴＧＧＧＣＡＴＴＧＴＴＧＣＴＧＧＣＣＴＧＧＣＴＧ
ＴＣＣＴＡＧＣＡＧＴＴＧＴＧＧＴＣＡＴＣＧＧＡＧＣ
ＴＧＴＧＧＴＣＧＣＴＡＣＴＧＴＧＡＴＧＴＧＴＡＧＧ
ＡＧＧＡＡＧＡＧＣＴＣＡＧＧＴＧＧＡＡＡＡＧＧＡＧ
ＧＧＡＧＣＴＡＣＴＣＴＣＡＧＧＣＴＧＣＧＴＣＣＡＧ
ＣＧＡＣＡＧＴＧＣＣＣＡＧＧＧＣＴＣＴＧＡＴＧＴＧ
ＴＣＴＣＴＣＡＣＡＧＣＴＴＧＡ 上記塩基配列およびこの明細書の特許請求の範囲１発明
の詳細な説明に記載した塩基配列では、Ａはアデニン、
Ｃはシトシン、Ｇはグアニン、Ｔはチミンを示す。

本発明のＨＬＡ−８３５遺伝子の塩基配列の一部に一致
するｃＤＮＡは、マーカー物質を標識してＤＮＡタイピ
ングに使用されるＤＮＡプローブに応用できる。マーカ
ー物質としては、ベルオキシダーゼ。鉄ポルフィリン誘
導体、ルシフェラーゼ等の発光物質、蛍光物質、２．３
−ブタジオン等のリン光物質および３ｔｐ、’ｓｓ３等
の放射性物質が一般的に使用される。これらのマーカー
物質およびマーカー物質を１本鎖ＤＮＡに標識する方法
は公知である。（＾ｎｎｕａｌＲｅｖｉｅｗ　Ｂｉｏｐ
ｈｙｓ、　Ｂｉｏｅｎｇ、ｐｐ１７５−１９５．（１９
８１）。

Ｒｉｇｂｙ　ｅｔａｌ、、Ｊ、Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、、
１１３，２３７．（１９７７））このＨＬＡ−Ｂ３５遺
伝子はＨＬＡ−８３５抗原をコードするので真核細胞に
導入することによりＨＬＡ−Ｂ３５抗原を発現する形質
転換細胞を得ることができる。

〔実施例〕

本発明を実施例に基いて説明する。

ＨＬＡ−８３５の 染色体ＤＮＡの分離 ＨＬＡ−Ａ２４／Ａ２６．Ｂ３５／Ｂｗ５２゜Ｃ−／Ｃ
−、ＤＲ２／ＤＲ−のハブロタイブをもつ日本人の末梢
血リンパ球（ＰＢＬ）　　５Ｘ１０′個を１０−のリン
酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に浮遊させ、１５００ｒｐｍ＋
で遠心した。上滑を捨て、再び１０ａｄのＰＢＳに浮遊
させ、１５００ｒｐｍ　テ遠心し、上清を完全に取り除
いた。

次に、ＰＢＬを２ｄ（７）ＬＳＴ緩衝液（２０ｍＭＴｒ
ｉｓ溶液Ｐ　Ｈ７，４，１０＋ｓＭ　ＮａＣ１，３ｍＭ
ＭｇＣＩｇ　）　ニ浮遊させ１５００ｒｐｍで遠心し上
清を取り除いた。

４℃に冷却した５％５ｏｃｏｓｅ、　４％ＮＦ　−４Ｑ
を含むＬＳＴ１１街液１−を加えＰＢＬを浮遊させ５分
間放置した。その後１５００ｒｐｍで遠心し上清を取り
除き、冷却した５１１１１のＡＣＥ緩衝液（５０１１１
Ｍ酢酸ナトリウム、１０ｍＭＥＤＴＡ）を加えて攪拌し
た。０．５ｄの１０％ＳＤＳ溶液を加えた後、５ｄのフ
ェノール溶液を加え４分間振盪した。その後２００Ｏｒ
ｐｍで１０分間遠心し、上層を新しい試験管に入れた。

この試験管に上層液と等量のクロロホルム溶液を加え４
分間振盪後、２０００ｒｐｍで１０分間遠心し、上層を
新しい試験管に入れた。

上層をとった試験管に２倍量の９９％エタノールをゆっ
くり加え混合しヒト染色体ＤＮＡを糸状に分離した。分
離したヒト染色体ＤＮＡ３０ｕｇを制限酵素ＥｃｏＲＩ
９Ｑ単位（Ｕ）で３７°Ｃ３時間インキュベートした。

ＥｃｏＲＩで切断したヒト染色体ＤＮＡを０．８％アガ
ロースゲルの末端に添加し電気泳動し、６．０ｋｂから
８．５ｋｂの範囲にあるＤＮＡ断片をＤＥペーパー分離
法で分離し、ＨＬＡクラスＩゲノムＤＮＡを得た。

ゲノムＤＮＡライブラリーの作成 分離したヒトＤＮＡ０．４！ｇに対してλファージのア
ーム（ＥｃｏＲＩで処理したλＺＡＰ（Ｓｔｒａｔａｇ
ｅｎｅ社製））　２　ｕ　ｇを加え、Ｔ４　リガーゼを
加えて、４°Ｃ１８時間イン時間インキレベートさせた
。このサンプルをパッケージングキット（Ｇｉｇａｐａ
ｃｋ−ｇｏｌｄ：Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を使って
ｉｎ　ｖｉｔｒｏでパッケージングした。パッケージン
グがうまくいっているか確認するためパッケージングし
たファージサンプルの力価を以下の手順で調べた。

（サンプルの力価の測定） Ｂ　Ｂ　４　Ｅ、　ｃｏｌｉを少量とり、４０Ｗ１のＬ
Ｂ培地（ＮａＣ１５ｇ　、　イーストイクストラクト５
ｇ、　　トリプトン１０ｇを１１　Ｈ，Ｏにとかしたも
の、）を入れである５０−の遠心管に入れ３７°Ｃ−晩
振盪培養した。培養したバクテリア培地ｌ−を遠心管に
加え、さらに３−のＬＢ培地と８０−のＩＭＭｇＳＯ＜
を加えた。こうして得たバクテリア培地０．２ｍとパッ
ケージングサンプルの希釈系列２μ！（原液、１０倍希
釈液、　　１００倍希釈液、　１０００倍希釈液）を６
Ｉｌｉの試験管に加え３７°Ｃ１５分間インキュベート
した。４５℃保温の２．５−の０．７％軟寒天を各試験
管に加えて混ぜた後、直径９０ｍの１．５％寒天皿の上
に重層する。３７℃８時間培養しプラーク数をカウント
した。

ＨＬＡクラス■ゲノムＤＮＡのクローニング９０ｍの皿
に約４０００個のプラークができるようにライブラリー
の原液を３Ｍ培地（ＮａＣ１１５，８ｇ、　Ｍｇ５Ｏａ
　ＩＨｚｏ　　２ｇ、　５０ａｅｆｆｉ　　ＩＭＴｒｉ
ｓＣｌ　　ｐ　Ｈ７，５，５＋ｄ　　２％ｇｅｌａｔｉ
ｎを１！）（１０にとかしたもの、）で希釈した。−次
スクリーニングは上記のサンプルの力価の測定と同様の
手順で操作し９０關皿にファージプラークを形成した。

ニトロセルロース膜（Ｇｅ１ａ＋ａｎＳｃｉｅｎｃｅ社
製）を軟寒天層上に載せ５分間放置した０次に、ニトロ
セルロース膜をａｅｎａｔｕｒｅ溶液（０，１ＭＮａＯ
Ｈ，１，５ＭＮａ　ｃ　１）に浸したクロマトグラフィ
ー用紙に、ファージがついている面を上にして載せ５分
間放置した０次に、２倍のＳＳＣ溶液を含むクロマトグ
ラフィー用紙にニトロセルロース膜を載せ５分間放置し
た後、ニトロセルロース膜を室温で乾燥させた。

最後に、８０°Ｃの真空乾燥機の中で１２０分間放置し
プロッティングを完了した。

ハイブリダイゼーションで使用するＨＬＡ−Ｂ７ｃＤＮ
Ａプローブを以下のように調製した。

ＨＬ　Ａ　−Ｂ　７　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ１３４０ｂｐ　（
Ｏｒｒ　Ｈ，Ｔ、ｅｔａｌ　；　Ｂｌｏｃｈｅｍｉｓｔ
ｒｙ、１Ｂ、５７１１．１９７９　）がＰｓｔｌｓｉｔ
ｅでＰＢＲ３２Ｂに入っているプラスミドｐＩ）ｐｏｏ
ｌ　　（ＤｒＪｅｉｓｍａｎ、Ｖａｌｅ　Ｌｌｎｉｖｅ
ｒｓｉｔｙより入手）をＰｓｔｌで切断し、アガロース
ゲルで電気泳動し、ＤＥペーパー法で１３４０ｂｐのＨ
ＬＡ−Ｂ７ｃＤＮＡを分離した０分離したＨＬＡ−Ｂ７
ｃＤＮ　Ａ　２００ｎｇヲニックトランスレーション法
により３意Ｐ−ｄＣＴＰでＩ識した。標識したｃＤＮＡ
と未結合の”Ｐ−ｄＣＴＰを分離するためセファデック
ス０５０カラムに流し放射能活性のある第１ピークを集
めた。

以下の手順でＨＬＡクラスＩ遺伝子をクローニングした
。

ファージライブラリーをブロッティングしたニトロセル
ロース膜をハイブリダイゼーションバックに入れた。プ
レハイブリダイゼーション溶液（５０倍のＤｅｎｈａｒ
ｄｔ’ｓ　５ｏｌｕｔｉｏｎ　Ｏ，８ｍ＋１０ｍＦｏｒ
ｍａｗｉｄｅ＋　０．２ｍ　１０％　Ｓ　Ｄ　Ｓ　、０
．５ｍの４■／ｄサケ精子Ｄ　Ｎ　Ａ、　６．６ａｅ　
２０倍ＳＳＣ，１，９ｄＨ１Ｏ）を加えバックを密封し
４２°ｃ２時間インキヱベートした＊　２　ＸＩＱＩ′
ＩｃｐＩＩＩのＨＬＡ−Ｂ７ｃＤＮＡプローブと４ｍｇ
／−サケ精子ＤＮＡ０．５　ｍをガラス試験管に入れ１
００°Ｃの水浴で１０分間加熱した後、氷の中で急冷し
た。このガラス試験管に０．８−の５０倍Ｄｅｎｈａｒ
ｄｔ’５ｏｌｕｔｉｏｎ。

１０ｄ　ｆｏｒｍａｍｉｄｅ、０．２ｍ！　１０％Ｓ　
Ｄ　Ｓ　、６．６ｍ！　２０倍ＳＳＣ溶液、２ｄの５０
％Ｄｅｘｔｒａｎ　５ｕｌｆａｔｅの混合液を加えてハ
イブリダイゼーション溶液とした。ハイブリダイゼーシ
ョンバックからプレハイブリダイゼーション溶液を捨て
、ハイブリダイゼーション溶液を加えてバックを密封し
４２゛Ｃ１８時間インキュベートした。バックからニト
ロセルロース膜を取り出し、２倍のｓｓｃ、ｏ、ｉ％Ｓ
ＤＳからなる洗浄溶液で３７°Ｃ３０分間×２回、さら
に５２°Ｃ３０分間×２回洗った後ニトロセルロース膜
を乾燥させた。乾燥したニトロセルロース膜を−ｈａｔ
ｍａｎ　　３　Ｍ　Ｍ濾紙上に固定しＸ線フィルムのカ
セットに入れＸ線フィルムに３−１８時間露光した後、
フィルムを感光させた。黒いドツトとして現れたポジテ
ィブプラークを確認した後９０ｍｍ皿からポジティブプ
ラークをピペットで取り１ａｔＳＭ緩衝液の入っている
１、５ｄ遠心管に入れ３７’Ｃ１時間インキュベートし
た０次に、クロロホルムを数滴加えて１５０００ｒｐｍ
で数秒遠心した後、上清を２次スクリーニングのファー
ジとした。

９０閣皿に１００−５００個のプラークができるように
上清を３Ｍ培地で希釈した後、１次スクリーニングと同
様の方法でニトロセルロース膜にブロッティングし、Ｈ
Ｌ、、Ａ−Ｂ７ｃＤＮＡプローブを使用しハイブリダイ
ゼーションを行いポジティブプラークを取った。

２次スクリーニングで得たポジティブプラークをピペッ
トで取りｌａｄｓＭ培地の入っている１、５−遠心管に
入れ室温１時間インキュベートした後クロロホルムを数
滴加えて１５００ｒｐ閣数秒間遠心する。遠心後の上清
を３次スクリーニングのファージとし、２次スクリーニ
ングと同じ方法でスクリーニングを行い、すべてのプラ
ークがポジティブプラークであることをハイブリダイゼ
ーションによって確認し、クローニングを完了した。

ＤＮＡの精製 次の操作により３次スクリーニングで得たλファージに
組込んだゲノム遺伝子をヘルパーファージを使ってプラ
スミドに変換した。λフアージクローンを３次スクリー
ニングのプレートから取り５００ｐｌの３Ｍ培地と２０
ｕｌのクロロフォルムと混合しλＺＡＰ溶液とした。遠
心管に２００ｐＺのλＺＡＰ溶液と、１０．ＩｌｌのＩ
　Ｘ　１０＠ｐｆｕ／　ｄ濃度のＲ４０８ヘルパーフア
ージと、２００ｕＺの８×１０”個／−のＸ　Ｌ　１−
Ｂｌｕｅ　　Ｅ、ｃｏｌｉとを入れ混合し３７°Ｃ１５
分間インキエベートした。次にこの遠心管に５７の２倍
濃度のＹＴ培地（５ｇＮａＣ１，５ｇ　　イーストイク
ストラクト、　９ｇ　Ｂａｃｔ。

−ＴｒｙｐｔｏｎをｌＩ！、の水にとかしたもの）を加
え、３７℃４時間振優した。

次に、７０℃で２０分間熱を加えた後、遠心管を１００
０　ｇで５分間遠心した。上清を新しい試験管へ移し、
この試験管に２００１１７の８Ｘ１０＠個／−のＸ　Ｌ
　１−Ｂｌｕｅ　　Ｅ、ｃｏｌｉ　を加え３７’Ｃ１５
分間インキエベートした。この試験管中の溶液１００μ
ｌをアンピシリンプレートに注ぎ３７℃で一晩静置した
。翌日コロニーを取り、アンピシリンを含むＬＢ堵地に
植え３７℃で一晩振盪した。次にこの培養液５ｄをアン
ピシリンを含むＬＢ培地４００　ｍに加え、３７℃でＯ
Ｄ　ｈｅ、　＝　０．８になるまで振盪培養した。２Ｉ
１１の３４■／Ｈ１クロラムフエニコールを加え、さら
に３７℃で１２時間培養した。

次に、この培養液を遠心管へ移し５ＱＯＯｒｐｍで１０
分間遠心し上清を捨てた。この遠心管へ４０ｍの０、Ｉ
Ｍ　　　Ｎ　　ａ　　Ｃｌ　　、１０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ
−ＨＣＩ（ｐＨ７，８）、１　　ｍＭＥＤＴＡを加えて
沈澱物を懸濁させた後、５０００ｒｐｍで１０分間遠心
して上清を捨てた。この遠心管に７ｍグルコース・リゾ
チーム溶液を加えて沈澱物を再懸濁し、室温で１０分間
放置した。さらに遠心管に１４ｄアルカリ溶液を加え、
氷冷しながら１０分間放置した０次に１０．５ｄ酢酸カ
リウム溶液を加え攪拌後水中で１０分間放置した。この
遠心管を１５０Ｏｒｐｍ　２０分間４℃で遠心し、上清
を５０−の新しい遠心管へ移した。これに０．６容のイ
ソプロピルアルコールを加え、混合した後、室温で２０
分間放置した。この遠心管を３００Ｏｒｐｍ　１０分間
遠心し上清を捨てた。この遠心管に１００％エタノール
を加え、沈澱物を乾燥させた後、３．５ｄのＴ　Ｅ　７
７４街液（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　Ｃ１，１ｍＭ　ＥＤＴ
＾ｐＨ８，０）を加え沈澱物を溶解した。このＤＮＡ溶
液３．５ｍに対して、３．７ｇ　ＣｓＣ１，０，２ｍ　
　１０■／戚エチジウムブロマイド水溶液を加え、完全
に塩化セシウムを溶解した。得られた溶液をシールチュ
ーブに移し、５０％（Ｗ／Ｗ）塩化セシウム溶液でチュ
ーブを満たし、開口をシールした。シールチューブを１
５°Ｃ５５０００ｒｐｍ＋、　１５時間遠心してプラス
ミドＤＮＡを分離した。このプラスミドＤＮＡＩ’ｉを
注射器で回収し、水で飽和したれ一ブタノールを等量加
え混合した。　　３０００ｒｐｍ　１分間遠心して上層
を捨てた。この操作を３回繰り返し、エチジウムブロマ
イドを除去した。次に、プラスミドＤＮＡをＴＥ緩街液
で一晩透析してＤＮＡを精製した。

によるＨＬＡクラス１　　　の クローニングしたＨＬＡクラス■ゲノムＤＮＡをｔｋ−
マウスＬ細胞に遺伝子導入しその細胞表面上での発現を
抗ＨＬ　Ａクラス夏抗体で調べた。

マウスＬ細胞へのＨＬＡクラスＩ遺伝子の導入遺伝子移
入の前日、５×１０−個のマウスＬ細胞を培養フラスコ
に入れ１０％ＦＣ３を含むＭＥＭ培地中で培養した。

Ｃａ−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ沈殿法により沈殿物を以下の
手順で作成した。

（ａ）２０μｇ　／　１００μｍのＨＬＡクラス■ゲノ
ムＤＮＡと、１ｇｇ／１００μｌのチミジンキナーゼ遺
伝子と、１００μｊ！　　Ｃａ　ＣＩｇ　　・２　Ｈｚ
Ｏ溶液ｐＨ７，０と、７００μｌのＨ，Ｏを濃合し総量
を１ｄとした。

（ｂ）Ｈｅ　ｐ　ｅ　ｓ／Ｎａ　Ｃ１溶液と　１００倍
のＮａＨＰＯ，溶液を４９：１で混合し、その溶液を６
ｍの試験管に入れた。

（ｃ）　（ａ）で作成した溶液を１滴ずつ（ｂ）の試験
管に入れ混合した後２０分間インキュベートしＣａ−Ｄ
ＮＡ沈殿物を作成した。

前日培養したマウスＬ細胞をＣａ非含有ＰＢＳで１回洗
浄した後、Ｃａ−ＤＮＡ沈殿物を加えてフラスコ中で１
５分間インキュベートした。

さらに１０％ウシ胎児血清（Ｆｅ２）を含むＭＥＭ培地
を１０ａｄ加えて３７℃６時間ＣＯ，インキュベーター
でインキエベートした０次に、ＦＣ３非含有培地を用い
て作成した３４％ＰＥＧ−５％ＤＭＳＯ溶液でフラスコ
中の培地を除いた後、２１ｔ１の３４％ＰＥＧ−５％Ｄ
ＭＳＯ溶液を加えて３分間インキエベートした。ＦＣ３
非含有培地で３回洗浄後、ｌＯ％ＦＣ３を含む培地で２
回洗浄した。次に、１０ａｄ！の１０％ＦＣ３を含む培
地を加え一晩培養した。翌日、）ＥＡＴ培地に変え培養
した＃　２〜３日毎にＨＡＴ培地を交替した。

約１４〜２１日でｔｋ遺伝子導入し細胞が増殖しコロニ
ーを形成するのを確認した。各コロニーをクローニング
リングを使って拾った後、各クローンを培養した。

形質転換細胞上に発現したＨＬＡクラスＩ抗原の確認 クローン化した各コロニーｌＸ１０６個をＰＢＳで２回
洗い１００μｌのＰＢＳに浮遊させた後、５０ａ１１ず
つ２本の試験管に入れた。２本の試験管に５０μｌの抗
ＨＬＡクラスＩモノクローナル抗体Ｗ　６　／　３２　
（Ｐａｒｈａｍ　Ｐ　ｅｔ　ａｌ、Ｊ、Ｉｍａ＋ｕｎｏ
ｌ。

（１９７９）、１２３．ｐｐ３４２−３４９）　ト、５
０１ｔｌ（Ｄ抗ＨＬＡ−ＤＲモノクローナル抗体Ｌ　２
４３　ＣＬａｍｐｓｏｎ　ＬＡｅｔ　ａｌ、Ｊ、ｌｍ５
ｕｎｏ１．（１９８０）、１２５．ｐｐ２９３−２９９
）を別々に加え４°Ｃ３０分インキュベートした。各試
験管ニ０．５ｙａｌ　（７）　Ｐ　Ｂ　Ｓを加え７１５
００ｒｐｍテ５分間遠心し、上清を取り除いた。これを
３回繰り返した。５０倍希釈のＦＩＴＣ抗マウスＩｇ抗
体（５ｉｌｅｎｕｓ社製）を各試験管に加えて４°Ｃ３
０分インキュベートした。各試験管に０．５ｄ　Ｐ　Ｂ
　Ｓを加え、１５００ｒｐｎで５分間遠心して、上滑を
取り除く作業を３回繰り返した。最後に１ｄＰＢＳを各
試験管に加えスペクトラム■（オルソ−社製）で蛍光強
度を測定した。Ｌ細胞上にＨＬＡクラス■抗原を発現し
ている細胞は、Ｗ６／３２抗体で蛍光強度がＬ２４３抗
体より強くなり発現が確認できる。

以上の方法により、ＰＢＬから得た２種類のＨＬＡクラ
ス■ゲノム遺伝子クローン１．２および２．１を導入し
た形質転換細胞がＨＬ　ＡクラスＩ抗原を発現している
のを確認した。

９種の制限酵素を用いた制限酵素切断遺伝子の構成から
、クローン１．２はＨＬＡ−８ｗ５２遺伝子（Ｊ、Ｉｎ
＋ｍｕｎｏ１．１４２．　ｐｐ３０６−３１１．（１９
８９））と同一であった。

クローン２．１はＨＬＡ−８ｗ５２遺伝子と似ていたが
、ＰｖｕｌｌフラグメントがＨＬＡ−８ｗ５２遺伝子と
異っていた。それゆえ、クローン２．１はＨＬＡ−８３
５遺伝子であることが強く示唆された。

クローン２．１のアロ　　　の゛ クローン２．１をハイグロマイシン耐性遺伝子と一緒に
、ＨＬＡ−Ａ、Ｂ抗原を発現していないＢリンパ芽球細
胞株Ｈｍｙ２ｃＩＲ（Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ。

１６６、ｐｐ２８３−２８８．　（１８９７））に導入
し、ハイグロマイシンＢ培地を用いて形質転換細胞を得
た。

この形質転換細胞を、さらに培養し、Ｗ６／３２モノク
ローナル抗体を用いたフローサイトメトリーによりクロ
ーン２．１の遺伝子産物であるＨＬＡクラス■抗原を高
レベルで発現しているクローン２８１形質転換１（ｗｙ
２　ＣＩ　Ｒ細胞株を得た。

このクローン２．１形質転換細胞株Ｈｍｙ２ＣＩＲのア
ロ抗原性を補体依存性細胞障害性試験で調べた。

ＨＬＡ−Ｂ３５，８ｗ５３に特異性を有する抗血清−Ａ
ＯＨ２２３他　表１に記載した種々の抗血清をあらかじ
めマイクロプレートの各ウェルに１　ｐｌずつ分注した
０次に、３Ｘ１０”個／　ｐｌの標的細胞を各ウェルに
１　ｐｉずつ分注し、室温で３０分間インキュベートし
た。

次に５　ｐｌ　／ウェルのウサギ補体を各ウェルに分注
し室温で６０分間反応させた０次に２　ｐｌ　／ウェル
の５％エオシン水溶液を各ウェルに分注し、室温で５分
間静置した。８μｌ／ウエルの３７％ホルムアルデヒド
を各ウェルに加え、反応を停止し細胞を固定した。室温
で３０分間放置後、顕微鏡下で観察し、全細胞に対する
陽性細胞の百分率を求めた。結果を表１に示す、標的細
胞としてはＨａｉｙ２ＣＩＨにクローン２．１を導入し
て形質転換した細胞株と、形質転換してないＨ＋ｗｙ２
ＣＩＲ細胞株を陰性コントロールとして用いた。

クローン２．１　　　　　傘 ｕｌ ｌｆｌ　ｔｌＷｊＪ ＡＯＨ３１１Ｂ５．８ｗ５３　　　　　　　　　０　　
　　　　０＊：非形質転換Ｈｓｙ２Ｃ［Ｒ 表　　　　　１ 以上の結果より、クローン２．１はＨＬＡ−８３５遺伝
子であることを確認した。

クローン２．１のゲノムＤＮＡの全塩基配列をジデオキ
シ法により決定した。結果を第１図に示す０図中ＨＬＡ
−８３５遺伝子の他に、参考までにＨＬＡ−Ｂ５１，８
ｗ５２，８ｗ５Ｂの塩基配列を並記した。ＨＬＡ−Ｂ５
１，８ｗ５２はＪ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１４２．　ｐ
ｐ３０６−３１１．１９８９、ＨＬＡ−８ｗ５８はＪ、
Ｂｌｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　２６０．　ｐｐＨ９２４１１
９３３、１９８５として公知である０図中、Ａはアデニ
ン、Ｃはシトシン、Ｇはグアニン、Ｔはチミンを示す。

第２図は第１図に示したＨＬＡ−８３５遺伝子の各エク
ソン部がコードするペプチドのアミノ酸シークエンスを
示す、アミノ酸は１文字略記で表示してあり、Ａはアラ
ニン、Ｒはアルギニン、Ｎはアスパラギン、Ｄはアスパ
ラギン酸。

Ｃはシスティン、Ｑはグルタミン、Ｅはグルタミン酸、
Ｇはグリシン、Ｈはシスチジン、■はイソロイシン、Ｌ
はロイシン、にはリジン、Ｍはメチオニン、Ｆはフェニ
ルアラニン、Ｐはプロリン、Ｓはセリン、Ｔはトレオニ
ン、Ｗはトリプトファン、Ｙはチロシン、■はバリンを
示す。

図中、参考までにＨＬＡ−Ｂ３５，８ｗ５２゜８ｗ５Ｂ
、Ｂ８，８ｗ４１，８ｗ６０のアミノ酸配列を並記した
。

ＨＬＡ−Ｂ５１，８ｗ５２はＪ、ＩＩ１ｍｕｎｏｌ＋１
４２゜ｐｐ３０６−３１１．１９８９．　ＨＬ　Ａ　−
Ｂ　ｗ　５　ＢはＪ、Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｗ、　２６０．　ｐｐ１１９２４−１１９３３．
１９８５．　　ＨＬ　Ａ　−Ｂ９．８ｗ４１はＰｒｏｃ
、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、（ＵＳＡ）。

８５、ｐｐ４００５−４００９．１９８８゜ＨＬＡ−８
ｗ６０はＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２２．ｐｐ３９６
１３９６９、１９８３　として公知である。

第１図、第２図中、ダッシュは、ＨＬ　Ａ　−８３５の
配列と同じ塩基またはアミノ酸であることを示す。

ＤＮＡプローブへの ＨＬＡ−８３５遺伝子の塩基配列が上述した実施例によ
り明らかになったことがら、ＨＬＡ−８３５のアロタイ
プをＤＮＡタイピングによって決定・することが強（期
待される。

ＨＬＡ−Ｂ３５と８ｗ５８はα１ドメインのヘリカル領
域で８個のアミノ酸の置換が認められる。一方、他のド
メインのアミノ酸残基は全（同一である。したがって、
α１ドメインをコードするエクソン２０１８３番目から
２４８番目までの塩基配列部分である次の塩基配列（１
）を含む領域がＨＬ　Ａ　−Ｂ　３５アロ抗原に特異的
な塩基配列と思われる。

（１’）　ＣＧＧＡＡＣＡＣＡＣＡＧＡＴＣＴＴＣＡＡ
ＧＡＣＣＡＡＣＡＣＡＣＡＧＡＣＴＴＡＣＣＧＡＧＡＧ
ＡＧＣＣＴＧＣＧＧＡＡＣＣＴＧＣＧＣＧＧＣＤＮＡプ
ローブに用いるＤＮＡとしては、上記の塩基配列（１）
を含む領域が好ましく、エクソン２の１４７〜２６９番
目まで、１４７〜２４８番目まで、１８３〜２６９番目
まで、１８３〜２４８番目までの塩基配列からなるＤＮ
Ａが候補として挙げられる。塩基配列が決定されたＤＮ
Ａは、ＤＮＡ合成機又はホスホトリエステル合成法によ
り合成する０合成したＤＮＡにアルカリフォスファター
ゼ（３，１，３，１）　、　ポリヌクレオチドキナーゼ
（２，７，１，７８）とα−”ＰｄＡＴＰを加えて１本
鎖ＤＮＡの５′端に２１ｐを標識することにより、ＤＮ
Ａプローブが得られる。

〔発明の効果〕

本発明は、ＨＬＡ−Ｂ３５アロ抗原の研究、検査、診断
に有用である。

【図面の簡単な説明】

第１図（１）、（■）はＨＬＡ−８３５遺伝子の塩基配
列を示す図、第２図（１）、（Ｉｔ）はＨＬＡ−Ｂ　３
５遺伝子がコードするアミノ酸配列を示す図である。 特許出願人　　　　　　　　　　　２．−８オリンパス
光学工業株式会社

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、下記の塩基配列で表わされるエクソンを有するＨＬ
   Ａ−Ｂ３５遺伝子 【遺伝子配列があります】 【遺伝子配列があります】 上記式中、Ａはアデニン、Ｃはシトシン、Ｇはグアニン
   、Ｔはチミンを示す。 ２、下記のアミノ酸配列をコードするＨＬＡ−Ｂ３５遺
   伝子 【遺伝子配列があります】 【遺伝子配列があります】 上記式中、Ａはアラニン、Ｒはアルギニン、Ｎはアスパ
   ラギン、Ｄはアスパラギン酸、Ｃはシステイン、Ｑはグ
   ルタミン、Ｅはグルタミン酸、Ｇはグリシン、Ｈはヒス
   チシン、Ｉはイソロイシン、Ｌはロイシン、Ｋはリジン
   、Ｍはメチオニン、Ｆはフェニルアラニン、Ｐはプロリ
   ン、Ｓはセリン、Ｔはトレオニン、Ｗはトリプトファン
   、Ｙはチロシン、Ｖはバリンを示す。 ３、請求項１記載のＨＬＡ−Ｂ遺伝子の一部と、ＤＮＡ
   の一部に結合したマーカー物質とからなるＤＮＡプロー
   ブ。 ４、請求項１記載のＨＬＡ−Ｂ３５遺伝子を真核細胞に
   導入して得られＨＬＡ−Ｂ３５抗原を発現することを特
   徴とする形質転換細胞。