JPH0987241A - ４−ヒドロキシフェニルカルバミン酸化合物及びそれを用いた定量方法 - Google Patents
４−ヒドロキシフェニルカルバミン酸化合物及びそれを用いた定量方法Info
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- JPH0987241A JPH0987241A JP24973695A JP24973695A JPH0987241A JP H0987241 A JPH0987241 A JP H0987241A JP 24973695 A JP24973695 A JP 24973695A JP 24973695 A JP24973695 A JP 24973695A JP H0987241 A JPH0987241 A JP H0987241A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 検出感度の高い蛍光基質の提供。また、これ
を用いるペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）、過酸化水素、抗
原又は抗体の定量方法の提供。 【解決手段】 一般式（Ｉ）： 【化１】 （Ｒ1 ：水酸基又はカルボキシル基で置換されていても
よいアルキル基、Ｒ2 ：アルキル基）で表される４−ヒ
ドロキシフェニルカルバミン酸化合物。また、ＰＯＤの
存在下に、化合物（Ｉ）と過酸化水素とを反応させて、
化合物（Ｉ）の二量体を生成せしめ、該二量体を検出す
る工程を有することを特徴とするＰＯＤ、過酸化水素、
抗原又は抗体の定量方法。
を用いるペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）、過酸化水素、抗
原又は抗体の定量方法の提供。 【解決手段】 一般式（Ｉ）： 【化１】 （Ｒ1 ：水酸基又はカルボキシル基で置換されていても
よいアルキル基、Ｒ2 ：アルキル基）で表される４−ヒ
ドロキシフェニルカルバミン酸化合物。また、ＰＯＤの
存在下に、化合物（Ｉ）と過酸化水素とを反応させて、
化合物（Ｉ）の二量体を生成せしめ、該二量体を検出す
る工程を有することを特徴とするＰＯＤ、過酸化水素、
抗原又は抗体の定量方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、新規４−ヒドロキ
シフェニルカルバミン酸化合物及びそれを用いるペルオ
キシダーゼ（以下、ＰＯＤという）、過酸化水素、抗原
又は抗体の定量方法に関する。
シフェニルカルバミン酸化合物及びそれを用いるペルオ
キシダーゼ（以下、ＰＯＤという）、過酸化水素、抗原
又は抗体の定量方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】従来、組織標本中の酵素、構造蛋白質、
微生物等の抗原性物質を、酵素で標識した抗体を用いて
検出する方法が、臨床検査等において一般に用いられて
いる。標識酵素としては、ＰＯＤが最もよく用いられ、
その他にグルコースオキシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシ
ダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ等が用いられてい
る。ＰＯＤ定量用の基質としては、従来、酸化によって
発色するものが用いられていたが、近年、ＰＯＤの存在
下で過酸化水素と反応して蛍光物質を形成し、高感度で
のＰＯＤ定量が可能であるｐ−ヒドロキシフェニルプロ
ピオン酸（以下、ＨＰＰＡという）が開発された。
微生物等の抗原性物質を、酵素で標識した抗体を用いて
検出する方法が、臨床検査等において一般に用いられて
いる。標識酵素としては、ＰＯＤが最もよく用いられ、
その他にグルコースオキシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシ
ダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ等が用いられてい
る。ＰＯＤ定量用の基質としては、従来、酸化によって
発色するものが用いられていたが、近年、ＰＯＤの存在
下で過酸化水素と反応して蛍光物質を形成し、高感度で
のＰＯＤ定量が可能であるｐ−ヒドロキシフェニルプロ
ピオン酸（以下、ＨＰＰＡという）が開発された。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】現在、臨床検査等にお
いて、さらに検出感度の高い基質の開発が望まれてい
る。
いて、さらに検出感度の高い基質の開発が望まれてい
る。
【０００４】本発明の目的は、新規４−ヒドロキシフェ
ニルカルバミン酸化合物を提供することにある。また、
本発明の目的は、検出感度の高い新規４−ヒドロキシフ
ェニルカルバミン酸化合物を用いるＰＯＤ、過酸化水
素、抗原又は抗体の定量方法を提供することにある。
ニルカルバミン酸化合物を提供することにある。また、
本発明の目的は、検出感度の高い新規４−ヒドロキシフ
ェニルカルバミン酸化合物を用いるＰＯＤ、過酸化水
素、抗原又は抗体の定量方法を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記目的
を達成するために鋭意研究を行った結果、非蛍光物質で
ある後記一般式（Ｉ）で表される４−ヒドロキシフェニ
ルカルバミン酸化合物が、ＰＯＤの存在下で過酸化水素
と反応して二量体化することによって蛍光物質となるこ
とを見出し、本発明を完成するに至った。
を達成するために鋭意研究を行った結果、非蛍光物質で
ある後記一般式（Ｉ）で表される４−ヒドロキシフェニ
ルカルバミン酸化合物が、ＰＯＤの存在下で過酸化水素
と反応して二量体化することによって蛍光物質となるこ
とを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００６】即ち、本発明は、以下の通りである。 (1) 一般式（Ｉ）：
【０００７】
【化６】
【０００８】（式中、Ｒ1 は水酸基又はカルボキシル基
で置換されていてもよいアルキル基を、Ｒ2 はアルキル
基を示す）で表される４−ヒドロキシフェニルカルバミ
ン酸化合物（以下、化合物（Ｉ）という）。 (2) ＰＯＤの存在下に、化合物（Ｉ）と過酸化水素とを
反応させて、化合物（Ｉ）の二量体を生成せしめ、該二
量体を検出する工程を有することを特徴とするＰＯＤの
定量方法。 (3) ＰＯＤの存在下に、化合物（Ｉ）と過酸化水素とを
反応させて、化合物（Ｉ）の二量体を生成せしめ、該二
量体を検出する工程を有することを特徴とする過酸化水
素の定量方法。 (4) ＰＯＤで標識した抗体を抗原と反応させて、抗原−
抗体複合体を形成させ、該複合体に結合したＰＯＤの存
在下に、化合物（Ｉ）と過酸化水素とを反応させて、化
合物（Ｉ）の二量体を生成せしめ、該二量体を検出する
工程を有することを特徴とする抗原の定量方法。 (5) ＰＯＤで標識した抗原を抗体と反応させて、抗原−
抗体複合体を形成させ、該複合体に結合したＰＯＤの存
在下に、化合物（Ｉ）と過酸化水素とを反応させて、化
合物（Ｉ）の二量体を生成せしめ、該二量体を検出する
工程を有することを特徴とする抗体の定量方法。
で置換されていてもよいアルキル基を、Ｒ2 はアルキル
基を示す）で表される４−ヒドロキシフェニルカルバミ
ン酸化合物（以下、化合物（Ｉ）という）。 (2) ＰＯＤの存在下に、化合物（Ｉ）と過酸化水素とを
反応させて、化合物（Ｉ）の二量体を生成せしめ、該二
量体を検出する工程を有することを特徴とするＰＯＤの
定量方法。 (3) ＰＯＤの存在下に、化合物（Ｉ）と過酸化水素とを
反応させて、化合物（Ｉ）の二量体を生成せしめ、該二
量体を検出する工程を有することを特徴とする過酸化水
素の定量方法。 (4) ＰＯＤで標識した抗体を抗原と反応させて、抗原−
抗体複合体を形成させ、該複合体に結合したＰＯＤの存
在下に、化合物（Ｉ）と過酸化水素とを反応させて、化
合物（Ｉ）の二量体を生成せしめ、該二量体を検出する
工程を有することを特徴とする抗原の定量方法。 (5) ＰＯＤで標識した抗原を抗体と反応させて、抗原−
抗体複合体を形成させ、該複合体に結合したＰＯＤの存
在下に、化合物（Ｉ）と過酸化水素とを反応させて、化
合物（Ｉ）の二量体を生成せしめ、該二量体を検出する
工程を有することを特徴とする抗体の定量方法。
【０００９】
【発明の実施の形態】本明細書において、各置換基の定
義は次の通りである。Ｒ1 における水酸基又はカルボキ
シル基で置換されていてもよいアルキル基とは、水酸
基、カルボキシル基が１〜５個置換していてもよい炭素
数１〜５個の直鎖又は分岐状アルキル基を意味し、具体
的にはメチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル
基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチ
ル基、イソブチル基、１−カルボキシイソプロピル基、
１，３−ジカルボキシイソプロピル基、１−ジカルボキ
シイソプロピル基、３−カルボキシプロピル基、３，４
−ジカルボキシ−ｓｅｃ−ブチル基、１−メチル−２，
４−ジカルボキシブチル基、２，３−ジヒドロキシプロ
ピル基、１，３−ジヒドロキシイソプロピル基等が挙げ
られる。好ましくはメチル基、エチル基、１−カルボキ
シイソプロピル基、２，３−ジヒドロキシプロピル基、
１，３−ジヒドロキシイソプロピル基である。Ｒ2 にお
けるアルキル基とは、炭素数１〜４個の直鎖又は分岐状
アルキル基を意味し、具体的にはメチル基、エチル基、
プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−
ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、イソブチル基等が挙げ
られる。好ましくはメチル基、エチル基である。
義は次の通りである。Ｒ1 における水酸基又はカルボキ
シル基で置換されていてもよいアルキル基とは、水酸
基、カルボキシル基が１〜５個置換していてもよい炭素
数１〜５個の直鎖又は分岐状アルキル基を意味し、具体
的にはメチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル
基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチ
ル基、イソブチル基、１−カルボキシイソプロピル基、
１，３−ジカルボキシイソプロピル基、１−ジカルボキ
シイソプロピル基、３−カルボキシプロピル基、３，４
−ジカルボキシ−ｓｅｃ−ブチル基、１−メチル−２，
４−ジカルボキシブチル基、２，３−ジヒドロキシプロ
ピル基、１，３−ジヒドロキシイソプロピル基等が挙げ
られる。好ましくはメチル基、エチル基、１−カルボキ
シイソプロピル基、２，３−ジヒドロキシプロピル基、
１，３−ジヒドロキシイソプロピル基である。Ｒ2 にお
けるアルキル基とは、炭素数１〜４個の直鎖又は分岐状
アルキル基を意味し、具体的にはメチル基、エチル基、
プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−
ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、イソブチル基等が挙げ
られる。好ましくはメチル基、エチル基である。
【００１０】本発明の化合物は、例えば以下に示す方法
によって合成できる。
によって合成できる。
【００１１】製造法１
【００１２】
【化７】
【００１３】（式中、Ｘはフッ素、塩素、臭素又はヨウ
素のハロゲンを、Ｙはフッ素、塩素、臭素もしくはヨウ
素のハロゲン又はｐ−ニトロフェノキシ等の脱離基を示
し、Ｒ 1 及びＲ2 は前記と同義である） 化合物（ＩＩ）を化合物（ＩＩＩ）と反応させて化合物
（ＩＶ）とし、さらに化合物（Ｖ）を反応させることに
より本発明の化合物（Ｉ）を合成することができる。ま
た、化合物（ＩＶ）は、シアノ水素化ホウ素ナトリウム
等の還元剤の存在下に、相当するアルデヒド又はケトン
を化合物（ＩＩ）に反応させることにより合成すること
もできる。
素のハロゲンを、Ｙはフッ素、塩素、臭素もしくはヨウ
素のハロゲン又はｐ−ニトロフェノキシ等の脱離基を示
し、Ｒ 1 及びＲ2 は前記と同義である） 化合物（ＩＩ）を化合物（ＩＩＩ）と反応させて化合物
（ＩＶ）とし、さらに化合物（Ｖ）を反応させることに
より本発明の化合物（Ｉ）を合成することができる。ま
た、化合物（ＩＶ）は、シアノ水素化ホウ素ナトリウム
等の還元剤の存在下に、相当するアルデヒド又はケトン
を化合物（ＩＩ）に反応させることにより合成すること
もできる。
【００１４】製造法２
【００１５】
【化８】
【００１６】（式中、Ｒはメチル基、ｔｅｒｔ−ブチル
基、ベンジル基、トリメチルシリル基、アセチル基等の
水酸基の保護基を示し、Ｘ、Ｙ、Ｒ1 及びＲ2 は前記と
同義である） 化合物（ＶＩ）を化合物（ＩＩＩ）と反応させて化合物
（ＶＩＩ）とし、製造法１と同様に化合物（Ｖ）を反応
させ、さらに水酸基の保護基を脱離させることにより本
発明の化合物（Ｉ）を合成することができる。
基、ベンジル基、トリメチルシリル基、アセチル基等の
水酸基の保護基を示し、Ｘ、Ｙ、Ｒ1 及びＲ2 は前記と
同義である） 化合物（ＶＩ）を化合物（ＩＩＩ）と反応させて化合物
（ＶＩＩ）とし、製造法１と同様に化合物（Ｖ）を反応
させ、さらに水酸基の保護基を脱離させることにより本
発明の化合物（Ｉ）を合成することができる。
【００１７】本発明の定量方法は、例えば次のようにし
て実施される。
て実施される。
【００１８】本発明化合物（Ｉ）は、ＰＯＤの存在下
で、過酸化水素と反応して式
で、過酸化水素と反応して式
【００１９】
【化９】
【００２０】（式中、Ｒ1 及びＲ2 は前記と同義であ
る）で表される二量体を形成する。該二量体は、ＰＯ
Ｄ、過酸化水素の量に対して１次関数的に生成する。こ
こで、本発明化合物（Ｉ）は非蛍光物質であるが、これ
を二量体化することによって波長３００〜３４０ｎｍの
光により励起され、波長３９０〜４４０ｎｍの蛍光を発
する蛍光物質となる。
る）で表される二量体を形成する。該二量体は、ＰＯ
Ｄ、過酸化水素の量に対して１次関数的に生成する。こ
こで、本発明化合物（Ｉ）は非蛍光物質であるが、これ
を二量体化することによって波長３００〜３４０ｎｍの
光により励起され、波長３９０〜４４０ｎｍの蛍光を発
する蛍光物質となる。
【００２１】本発明化合物（Ｉ）と過酸化水素との反応
は、通常、ＰＯＤの存在下、ｐＨ４〜９の条件下で行わ
れる。
は、通常、ＰＯＤの存在下、ｐＨ４〜９の条件下で行わ
れる。
【００２２】即ち、各種既知量のＰＯＤの存在下に、前
記のように過酸化水素と本発明化合物（Ｉ）とを反応さ
せて、本発明化合物（Ｉ）の二量体を生成せしめる。該
二量体を検出する工程として、蛍光光度計を用いてその
蛍光強度より二量体量を測定する。各種ＰＯＤ量とその
蛍光強度より検量線を作成し、該検量線を用いて未知量
のＰＯＤの定量を行うことができる。同様にして、過酸
化水素量とその蛍光強度より検量線を作成して、これを
用いて過酸化水素の定量を行うことができる。
記のように過酸化水素と本発明化合物（Ｉ）とを反応さ
せて、本発明化合物（Ｉ）の二量体を生成せしめる。該
二量体を検出する工程として、蛍光光度計を用いてその
蛍光強度より二量体量を測定する。各種ＰＯＤ量とその
蛍光強度より検量線を作成し、該検量線を用いて未知量
のＰＯＤの定量を行うことができる。同様にして、過酸
化水素量とその蛍光強度より検量線を作成して、これを
用いて過酸化水素の定量を行うことができる。
【００２３】また、抗原の定量は次のようにして行うこ
とができる。先ず、自体既知の方法を用いて、ＰＯＤで
標識した抗体を抗原と反応させて抗原−抗体複合体を形
成させる。次いで、該複合体に結合したＰＯＤの存在下
に、上記のように本発明化合物（Ｉ）と過酸化水素とを
反応させて、本発明化合物（Ｉ）の二量体を生成せしめ
る。既知量の抗原を用い、前記と同様にして作成した検
量線を用いて、該二量体からの蛍光強度より、ＰＯＤを
定量、即ち抗原を定量することができる。ＰＯＤで標識
した抗原を用い、同様にして、抗体の定量を行うことが
できる。
とができる。先ず、自体既知の方法を用いて、ＰＯＤで
標識した抗体を抗原と反応させて抗原−抗体複合体を形
成させる。次いで、該複合体に結合したＰＯＤの存在下
に、上記のように本発明化合物（Ｉ）と過酸化水素とを
反応させて、本発明化合物（Ｉ）の二量体を生成せしめ
る。既知量の抗原を用い、前記と同様にして作成した検
量線を用いて、該二量体からの蛍光強度より、ＰＯＤを
定量、即ち抗原を定量することができる。ＰＯＤで標識
した抗原を用い、同様にして、抗体の定量を行うことが
できる。
【００２４】
【実施例】以下、実施例を挙げて、本発明を更に具体的
に説明する。
に説明する。
【００２５】実施例１ ４−（Ｎ−メトキシカルボニル−Ｎ−メチルアミノ）フ
ェノールの製造 ４−メチルアミノフェノール硫酸塩１７．２ｇ（０．０
５ｍｏｌ）をピリジン１００ｍｌに溶かし、氷冷下、ク
ロロギ酸メチル８．５ｍｌ（０．１１ｍｏｌ）を１０分
間かけて滴下し、室温で３時間攪拌した。反応液を減圧
濃縮した後、６Ｎ塩酸（１００ｍｌ）と酢酸エチル（１
００ｍｌ）を加え、生成物を抽出した。有機層を飽和食
塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を
減圧下で留去して結晶を得、さらに水とエタノールから
再結晶することにより表題化合物（収率５８％）を得
た。 融点：９９℃1 Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6 ）：３．１３（ｓ，３
Ｈ），３．５５（ｓ，３Ｈ），６．７１（ｄ，２Ｈ），
７．０６（ｄ，２Ｈ） ＦＴ−ＩＲ（ＫＢｒ）：１７６３，１６６０，１５０
７，１４２４，１３８５，１１９８ｃｍ-1
ェノールの製造 ４−メチルアミノフェノール硫酸塩１７．２ｇ（０．０
５ｍｏｌ）をピリジン１００ｍｌに溶かし、氷冷下、ク
ロロギ酸メチル８．５ｍｌ（０．１１ｍｏｌ）を１０分
間かけて滴下し、室温で３時間攪拌した。反応液を減圧
濃縮した後、６Ｎ塩酸（１００ｍｌ）と酢酸エチル（１
００ｍｌ）を加え、生成物を抽出した。有機層を飽和食
塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を
減圧下で留去して結晶を得、さらに水とエタノールから
再結晶することにより表題化合物（収率５８％）を得
た。 融点：９９℃1 Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6 ）：３．１３（ｓ，３
Ｈ），３．５５（ｓ，３Ｈ），６．７１（ｄ，２Ｈ），
７．０６（ｄ，２Ｈ） ＦＴ−ＩＲ（ＫＢｒ）：１７６３，１６６０，１５０
７，１４２４，１３８５，１１９８ｃｍ-1
【００２６】実施例２ ４−（Ｎ−エトキシカルボニル−Ｎ−メチルアミノ）フ
ェノールの製造 ４−メチルアミノフェノール硫酸塩とクロロギ酸エチル
を用いて実施例１と同様の方法で処理することにより、
油状の表題化合物を得た。 ＩＲ（ＫＢｒ）：３３５０，１６８０，１５１８ｃｍ-1
ェノールの製造 ４−メチルアミノフェノール硫酸塩とクロロギ酸エチル
を用いて実施例１と同様の方法で処理することにより、
油状の表題化合物を得た。 ＩＲ（ＫＢｒ）：３３５０，１６８０，１５１８ｃｍ-1
【００２７】実施例３ ４−（Ｎ−メトキシカルボニル−Ｎ−２，３−ジヒドロ
キシプロピルアミノ）フェノールの製造 （１）Ｎ−２，３−ジヒドロキシプロピル−４−アニシ
ジンの製造 ｐ−アニシジン１２．３ｇ（０．１ｍｏｌ）とシアノ水
素化ホウ素ナトリウム６．７２ｇ（０．１０７ｍｏｌ）
をメタノール（０．３リットル）に溶かし、酢酸でｐＨ
５に調整した。ＤＬ−グリセリンアルデヒド９ｇ（０．
１ｍｏｌ）を粉末で、徐々に、攪拌しながら加えた。添
加後、室温で３時間攪拌した。その間、酢酸でｐＨ５と
なるように調整した。減圧下で、溶媒を留去した後、飽
和炭酸水素ナトリウム水溶液（５００ｍｌ）と酢酸エチ
ル（５００ｍｌ）を加え、抽出した。有機層を飽和食塩
水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧下
で、１００ｍｌまで濃縮し、ｎ−ヘキサン（１５０ｍ
ｌ）を加え、結晶を得た（１２．６ｇ，収率６４％）。 融点：７６．５〜７７．０℃ ＩＲ（ＫＢｒ）：３３６０，１５１４，１４７０，１２
９４，１２６５，１２４０ｃｍ-1
キシプロピルアミノ）フェノールの製造 （１）Ｎ−２，３−ジヒドロキシプロピル−４−アニシ
ジンの製造 ｐ−アニシジン１２．３ｇ（０．１ｍｏｌ）とシアノ水
素化ホウ素ナトリウム６．７２ｇ（０．１０７ｍｏｌ）
をメタノール（０．３リットル）に溶かし、酢酸でｐＨ
５に調整した。ＤＬ−グリセリンアルデヒド９ｇ（０．
１ｍｏｌ）を粉末で、徐々に、攪拌しながら加えた。添
加後、室温で３時間攪拌した。その間、酢酸でｐＨ５と
なるように調整した。減圧下で、溶媒を留去した後、飽
和炭酸水素ナトリウム水溶液（５００ｍｌ）と酢酸エチ
ル（５００ｍｌ）を加え、抽出した。有機層を飽和食塩
水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧下
で、１００ｍｌまで濃縮し、ｎ−ヘキサン（１５０ｍ
ｌ）を加え、結晶を得た（１２．６ｇ，収率６４％）。 融点：７６．５〜７７．０℃ ＩＲ（ＫＢｒ）：３３６０，１５１４，１４７０，１２
９４，１２６５，１２４０ｃｍ-1
【００２８】（２）４−（Ｎ−メトキシカルボニル−Ｎ
−２，３−ジヒドロキシプロピルアミノ）フェノールの
製造 Ｎ−２，３−ジヒドロキシプロピル−４−アニシジン
３．６６ｇ（１８．６ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン
（８６ｍｌ）に溶かし、炭酸水素ナトリウム（４ｇ）を
加え、０℃に冷却した。攪拌しながら、クロロギ酸メチ
ル３．３４ｍｌ（４０ｍｍｏｌ）を１５分かけて滴下し
た。室温で２時間攪拌した後、濾過し、減圧下で溶媒を
留去した。無水臭化アルミニウム１２．６ｇ（５５．６
ｍｍｏｌ）、エタンチオール（８０ｍｌ）、無水ジクロ
ロメタン（８０ｍｌ）を加え、一昼夜攪拌した。冷水５
００ｍｌに反応液を移し、６Ｎ−塩酸（１００ｍｌ）、
酢酸エチル（５００ｍｌ）を加え、抽出した。有機層を
分離し、飽和食塩水（２００ｍｌ）で洗浄後、減圧下で
３０ｍｌまで濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー
により精製した（充填材：シリカゲル、溶媒：酢酸エチ
ル）。生成物を含む分画から減圧下で溶媒を留去し、結
晶を得た（１．７５ｇ，収率３９％）。 融点：１１０．５〜１１１．５℃1 Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ3 ＯＤ）δ：３．４０（ｍ，５
Ｈ），３．６４（ｓ，３Ｈ），６．７６（ｄ，２Ｈ），
７．１０（ｄ，２Ｈ） ＩＲ（ＫＢｒ）：３３２０，１６７４，１５１６，１４
６０ｃｍ-1
−２，３−ジヒドロキシプロピルアミノ）フェノールの
製造 Ｎ−２，３−ジヒドロキシプロピル−４−アニシジン
３．６６ｇ（１８．６ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン
（８６ｍｌ）に溶かし、炭酸水素ナトリウム（４ｇ）を
加え、０℃に冷却した。攪拌しながら、クロロギ酸メチ
ル３．３４ｍｌ（４０ｍｍｏｌ）を１５分かけて滴下し
た。室温で２時間攪拌した後、濾過し、減圧下で溶媒を
留去した。無水臭化アルミニウム１２．６ｇ（５５．６
ｍｍｏｌ）、エタンチオール（８０ｍｌ）、無水ジクロ
ロメタン（８０ｍｌ）を加え、一昼夜攪拌した。冷水５
００ｍｌに反応液を移し、６Ｎ−塩酸（１００ｍｌ）、
酢酸エチル（５００ｍｌ）を加え、抽出した。有機層を
分離し、飽和食塩水（２００ｍｌ）で洗浄後、減圧下で
３０ｍｌまで濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー
により精製した（充填材：シリカゲル、溶媒：酢酸エチ
ル）。生成物を含む分画から減圧下で溶媒を留去し、結
晶を得た（１．７５ｇ，収率３９％）。 融点：１１０．５〜１１１．５℃1 Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ3 ＯＤ）δ：３．４０（ｍ，５
Ｈ），３．６４（ｓ，３Ｈ），６．７６（ｄ，２Ｈ），
７．１０（ｄ，２Ｈ） ＩＲ（ＫＢｒ）：３３２０，１６７４，１５１６，１４
６０ｃｍ-1
【００２９】実施例４：励起波長及び蛍光波長 基質液として、実施例１〜３の化合物を０．０１４％−
過酸化水素を含む０．１Ｍ−ＫＨ2 ＰＯ4 −ＫＯＨ（ｐ
Ｈ７．０）で１ｍｇ／ｍｌとなるように溶解した。この
基質液０．６ｍｌに、１２ｍＵ／ｍｌのＰＯＤ（２０μ
ｌ）を加え、３７℃×９分間保持した。その後、０．２
％−Ｎａ2 ＳＯ3 を含む０．１Ｍ−グリシン緩衝液（ｐ
Ｈ１０．５，２ｍｌ）で反応を停止し、蛍光光度計（島
津製作所製，ＲＦ−５１０）で蛍光スペクトルを測定し
た。その励起波長及び蛍光波長を以下に記す。
過酸化水素を含む０．１Ｍ−ＫＨ2 ＰＯ4 −ＫＯＨ（ｐ
Ｈ７．０）で１ｍｇ／ｍｌとなるように溶解した。この
基質液０．６ｍｌに、１２ｍＵ／ｍｌのＰＯＤ（２０μ
ｌ）を加え、３７℃×９分間保持した。その後、０．２
％−Ｎａ2 ＳＯ3 を含む０．１Ｍ−グリシン緩衝液（ｐ
Ｈ１０．５，２ｍｌ）で反応を停止し、蛍光光度計（島
津製作所製，ＲＦ−５１０）で蛍光スペクトルを測定し
た。その励起波長及び蛍光波長を以下に記す。
【００３０】実施例５：蛍光物質の安定性 基質液として６ｍｇ／ｍｌ実施例１の化合物／０．１Ｍ
−ＫＨ2 ＰＯ4 −ＫＯＨ（ｐＨ７．０）４００μｌと、
過酸化水素溶液として０．０４２％過酸化水素／０．１
Ｍ−ＫＨ2 ＰＯ4 −ＫＯＨ（ｐＨ７．０）２００μｌと
を混合した。これに、１２ｍＵ／ｍｌのＰＯＤ（２０μ
ｌ）を加え、３７℃×９分間保持した。その後、０．２
％−Ｎａ2 ＳＯ3 を含む０．１Ｍ−グリシン緩衝液（ｐ
Ｈ１０．５，２ｍｌ）で反応を停止し、蛍光光度計（島
津製作所製，ＲＦ−５１０）を用いて反応停止から、１
２０分後までの相対蛍光強度を測定した。相対蛍光強度
の経時変化を表１に示す。
−ＫＨ2 ＰＯ4 −ＫＯＨ（ｐＨ７．０）４００μｌと、
過酸化水素溶液として０．０４２％過酸化水素／０．１
Ｍ−ＫＨ2 ＰＯ4 −ＫＯＨ（ｐＨ７．０）２００μｌと
を混合した。これに、１２ｍＵ／ｍｌのＰＯＤ（２０μ
ｌ）を加え、３７℃×９分間保持した。その後、０．２
％−Ｎａ2 ＳＯ3 を含む０．１Ｍ−グリシン緩衝液（ｐ
Ｈ１０．５，２ｍｌ）で反応を停止し、蛍光光度計（島
津製作所製，ＲＦ−５１０）を用いて反応停止から、１
２０分後までの相対蛍光強度を測定した。相対蛍光強度
の経時変化を表１に示す。
【００３１】
【表１】
【００３２】これより、本発明化合物が二量化した蛍光
物質は、経時安定性に優れていることがわかる。
物質は、経時安定性に優れていることがわかる。
【００３３】実施例６：ＰＯＤ濃度と蛍光強度 基質液として８ｍｇ／ｍｌ実施例１の化合物、０．１Ｍ
−ＫＨ2 ＰＯ4 −ＫＯＨの混合液（ｐＨ６．８）２００
μｌと、過酸化水素溶液として１１．２ｍＭ過酸化水素
／０．１Ｍ−ＫＨ2 ＰＯ4 −ＫＯＨ（ｐＨ６．８）１０
０μｌとを混合した。これに、０，１，２．５，５又は
１０ｍＵ／ｍｌ濃度のＰＯＤを２０μｌを加え、それぞ
れ３７℃×９分間保持した。その後、０．２％−Ｎａ2
ＳＯ3 を含む０．１Ｍ−グリシン緩衝液（ｐＨ１０．
５，１ｍｌ）で反応を停止し、蛍光光度計（島津製作所
製，ＲＦ−５１０）を用い、相対蛍光強度を各基質の至
適波長で測定した。コントロールとしてＨＰＰＡ基質液
を用いて同様に測定した。蛍光基質として実施例１の化
合物又はＨＰＰＡを用いたときのＰＯＤ濃度と相対蛍光
強度の関係を図１に示す。以上の結果より、本発明化合
物は、ＨＰＰＡを用いた場合より、２倍程度蛍光強度が
高く、ＰＯＤ検出感度が高いことがわかる。
−ＫＨ2 ＰＯ4 −ＫＯＨの混合液（ｐＨ６．８）２００
μｌと、過酸化水素溶液として１１．２ｍＭ過酸化水素
／０．１Ｍ−ＫＨ2 ＰＯ4 −ＫＯＨ（ｐＨ６．８）１０
０μｌとを混合した。これに、０，１，２．５，５又は
１０ｍＵ／ｍｌ濃度のＰＯＤを２０μｌを加え、それぞ
れ３７℃×９分間保持した。その後、０．２％−Ｎａ2
ＳＯ3 を含む０．１Ｍ−グリシン緩衝液（ｐＨ１０．
５，１ｍｌ）で反応を停止し、蛍光光度計（島津製作所
製，ＲＦ−５１０）を用い、相対蛍光強度を各基質の至
適波長で測定した。コントロールとしてＨＰＰＡ基質液
を用いて同様に測定した。蛍光基質として実施例１の化
合物又はＨＰＰＡを用いたときのＰＯＤ濃度と相対蛍光
強度の関係を図１に示す。以上の結果より、本発明化合
物は、ＨＰＰＡを用いた場合より、２倍程度蛍光強度が
高く、ＰＯＤ検出感度が高いことがわかる。
【００３４】実施例７：過酸化水素量と蛍光強度 実施例１〜３の化合物を、それぞれ０．１Ｍ−トリス塩
酸緩衝液（ｐＨ８．５）を用いて０．６ｍＭとなるよう
に溶解し、基質液とした。これら基質液（２ｍｌ）に、
西洋ワサビＰＯＤ溶液（２００ｍＵ／ｍｌ，０．１Ｍ−
トリス塩酸緩衝液，ｐＨ８．５）０．３ｍｌ及び種々の
濃度の過酸化水素水溶液（０〜１００μＭ）０．１ｍｌ
を加え、室温で３分間反応させ、蛍光光度計（島津製作
所製，ＲＦ−５１０）を用い、相対蛍光強度を各基質の
至適波長で測定した。コントロールとしてＨＰＰＡ基質
液を用いて同様に測定した。蛍光基質として実施例１〜
３の化合物又はＨＰＰＡを用いたときの過酸化水素量と
相対蛍光強度の関係を図２に示す。以上の結果より、本
発明化合物は、ＨＰＰＡを用いた場合より、蛍光強度が
高く、過酸化水素検出感度が高いことがわかる。
酸緩衝液（ｐＨ８．５）を用いて０．６ｍＭとなるよう
に溶解し、基質液とした。これら基質液（２ｍｌ）に、
西洋ワサビＰＯＤ溶液（２００ｍＵ／ｍｌ，０．１Ｍ−
トリス塩酸緩衝液，ｐＨ８．５）０．３ｍｌ及び種々の
濃度の過酸化水素水溶液（０〜１００μＭ）０．１ｍｌ
を加え、室温で３分間反応させ、蛍光光度計（島津製作
所製，ＲＦ−５１０）を用い、相対蛍光強度を各基質の
至適波長で測定した。コントロールとしてＨＰＰＡ基質
液を用いて同様に測定した。蛍光基質として実施例１〜
３の化合物又はＨＰＰＡを用いたときの過酸化水素量と
相対蛍光強度の関係を図２に示す。以上の結果より、本
発明化合物は、ＨＰＰＡを用いた場合より、蛍光強度が
高く、過酸化水素検出感度が高いことがわかる。
【００３５】実施例８：ＣＥＡ（がん胎児性抗原）濃度
と蛍光強度 抗ＣＥＡヤギＩｇＧを感作したポリスチレン製試験管
（１２×７５ｍｍ，ヌンク社製マキシソープチューブ）
に、０．５％−牛血清アルブミンを含む０．１Ｍ−ＫＨ
2 ＰＯ4 −ＫＯＨ（ｐＨ７．０）０．３ｍｌ及びＣＥＡ
標準液（１ｎｇ／ｍｌ〜５０ｎｇ／ｍｌ）２０μｌを加
え、室温で１時間保持した。０．１％−ツイーン２０を
含む０．１Ｍ−ＫＨ2 ＰＯ4 −ＫＯＨ（ｐＨ７．０）で
２回洗浄後、ＰＯＤを標識した抗ＣＥＡヤギＩｇＧ（２
５ｍＵ／ｍｌ）を０．３ｍｌ加え、室温で１時間保持し
た。０．１％−ツイーン２０を含む０．１Ｍ−ＫＨ2 Ｐ
Ｏ4−ＫＯＨ（ｐＨ７．０）で４回洗浄後、実施例６の
方法に従って、ポリスチレン製試験管内壁に残ったＰＯ
Ｄ活性を相対蛍光強度として測定した。コントロールと
してＨＰＰＡ基質液を用いて同様に測定した。ＣＥＡ濃
度と相対蛍光強度の関係を表２に示す。
と蛍光強度 抗ＣＥＡヤギＩｇＧを感作したポリスチレン製試験管
（１２×７５ｍｍ，ヌンク社製マキシソープチューブ）
に、０．５％−牛血清アルブミンを含む０．１Ｍ−ＫＨ
2 ＰＯ4 −ＫＯＨ（ｐＨ７．０）０．３ｍｌ及びＣＥＡ
標準液（１ｎｇ／ｍｌ〜５０ｎｇ／ｍｌ）２０μｌを加
え、室温で１時間保持した。０．１％−ツイーン２０を
含む０．１Ｍ−ＫＨ2 ＰＯ4 −ＫＯＨ（ｐＨ７．０）で
２回洗浄後、ＰＯＤを標識した抗ＣＥＡヤギＩｇＧ（２
５ｍＵ／ｍｌ）を０．３ｍｌ加え、室温で１時間保持し
た。０．１％−ツイーン２０を含む０．１Ｍ−ＫＨ2 Ｐ
Ｏ4−ＫＯＨ（ｐＨ７．０）で４回洗浄後、実施例６の
方法に従って、ポリスチレン製試験管内壁に残ったＰＯ
Ｄ活性を相対蛍光強度として測定した。コントロールと
してＨＰＰＡ基質液を用いて同様に測定した。ＣＥＡ濃
度と相対蛍光強度の関係を表２に示す。
【００３６】
【表２】
【００３７】以上の結果より、本発明化合物は、ＨＰＰ
Ａを用いた場合より、２倍程度蛍光強度が高く、検出感
度が高いことがわかる。
Ａを用いた場合より、２倍程度蛍光強度が高く、検出感
度が高いことがわかる。
【００３８】
【発明の効果】以上のように、本発明化合物は、ＰＯ
Ｄ、過酸化水素、抗原又は抗体の定量において、検出感
度が高く、蛍光基質として有用である。また、本発明化
合物からの蛍光物質は安定性にも優れる。
Ｄ、過酸化水素、抗原又は抗体の定量において、検出感
度が高く、蛍光基質として有用である。また、本発明化
合物からの蛍光物質は安定性にも優れる。
【図１】実施例１の化合物及びＨＰＰＡを用いた場合の
ＰＯＤ濃度と相対蛍光強度の関係を示す図である。
ＰＯＤ濃度と相対蛍光強度の関係を示す図である。
【図２】実施例１〜３の化合物又はＨＰＰＡを用いた場
合の過酸化水素量と相対蛍光強度の関係を示す図であ
る。
合の過酸化水素量と相対蛍光強度の関係を示す図であ
る。
Claims (5)
- 【請求項１】 一般式（Ｉ）： 【化１】 （式中、Ｒ1 は水酸基又はカルボキシル基で置換されて
いてもよいアルキル基を、Ｒ2 はアルキル基を示す）で
表される４−ヒドロキシフェニルカルバミン酸化合物。 - 【請求項２】 ペルオキシダーゼの存在下に、一般式
（Ｉ）： 【化２】 （式中、Ｒ1 及びＲ2 は請求項１に記載と同義である）
で表される４−ヒドロキシフェニルカルバミン酸化合物
と過酸化水素とを反応させて、４−ヒドロキシフェニル
カルバミン酸化合物の二量体を生成せしめ、該二量体を
検出する工程を有することを特徴とするペルオキシダー
ゼの定量方法。 - 【請求項３】 ペルオキシダーゼの存在下に、一般式
（Ｉ）： 【化３】 （式中、Ｒ1 及びＲ2 は請求項１に記載と同義である）
で表される４−ヒドロキシフェニルカルバミン酸化合物
と過酸化水素とを反応させて、４−ヒドロキシフェニル
カルバミン酸化合物の二量体を生成せしめ、該二量体を
検出する工程を有することを特徴とする過酸化水素の定
量方法。 - 【請求項４】 ペルオキシダーゼで標識した抗体を抗原
と反応させて、抗原−抗体複合体を形成させ、該複合体
に結合したペルオキシダーゼの存在下に、一般式
（Ｉ）： 【化４】 （式中、Ｒ1 及びＲ2 は請求項１に記載と同義である）
で表される４−ヒドロキシフェニルカルバミン酸化合物
と過酸化水素とを反応させて、４−ヒドロキシフェニル
カルバミン酸化合物の二量体を生成せしめ、該二量体を
検出する工程を有することを特徴とする抗原の定量方
法。 - 【請求項５】 ペルオキシダーゼで標識した抗原を抗体
と反応させて、抗原−抗体複合体を形成させ、該複合体
に結合したペルオキシダーゼの存在下に、一般式
（Ｉ）： 【化５】 （式中、Ｒ1 及びＲ2 は請求項１に記載と同義である）
で表される４−ヒドロキシフェニルカルバミン酸化合物
と過酸化水素とを反応させて、４−ヒドロキシフェニル
カルバミン酸化合物の二量体を生成せしめ、該二量体を
検出する工程を有することを特徴とする抗体の定量方
法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP24973695A JPH0987241A (ja) | 1995-09-27 | 1995-09-27 | ４−ヒドロキシフェニルカルバミン酸化合物及びそれを用いた定量方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP24973695A JPH0987241A (ja) | 1995-09-27 | 1995-09-27 | ４−ヒドロキシフェニルカルバミン酸化合物及びそれを用いた定量方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0987241A true JPH0987241A (ja) | 1997-03-31 |
Family
ID=17197448
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP24973695A Pending JPH0987241A (ja) | 1995-09-27 | 1995-09-27 | ４−ヒドロキシフェニルカルバミン酸化合物及びそれを用いた定量方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0987241A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH1192462A (ja) * | 1997-09-25 | 1999-04-06 | Nippon Soda Co Ltd | ピラジン環を主鎖に有するポリエステル系化合物、その製造方法および高分子色素 |
| RU2812527C1 (ru) * | 2023-06-19 | 2024-01-30 | Акционерное общество "Щелково Агрохим" | Способ получения метил-N-(3-гидроксифенил)карбамата |
-
1995
- 1995-09-27 JP JP24973695A patent/JPH0987241A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH1192462A (ja) * | 1997-09-25 | 1999-04-06 | Nippon Soda Co Ltd | ピラジン環を主鎖に有するポリエステル系化合物、その製造方法および高分子色素 |
| RU2812527C1 (ru) * | 2023-06-19 | 2024-01-30 | Акционерное общество "Щелково Агрохим" | Способ получения метил-N-(3-гидроксифенил)карбамата |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20040316 |