JPH1010107A - 液体クロマトグラフィーによる試料の分析方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 液体クロマトグラフにより多数の試料を測定
する場合に、試料に由来する残存物質等による分析系流
路の汚染を防ぐための簡便な方法を提供する。 【解決手段】 液体クロマトグラフにより複数の試料を
同一の測定条件を用いて連続して測定した後、測定を中
断し、再び他の試料を上記と同一の測定条件を用いて測
定する、液体クロマトグラフィーによる試料の分析方法
において、該試料の連続測定の終了後に、分析系流路に
洗浄液を送液して試料に由来する残存物質を除去した
後、洗浄用溶離液を送液することを特徴とする。測定
例：溶血液試料中の糖化ヘモグロビンの測定。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、液体クロマトグラ
フィーによる試料の分析方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】有機化学、生化学、医学などの分野にお
ける試料中の成分の分析に液体クロマトグラフが汎用さ
れている。この液体クロマトグラフのシステムは、通
常、図３のように構成されている。溶離液１が切り替え
機構２（例えば、電磁弁からなり、溶離液１ａ、１ｂ、
１ｃなどの切り替えを行う機構）を通り、送液ポンプ３
により試料導入装置４を経由して、充填剤が充填された
分離カラム５に入り、この分離カラム５により試料中の
各成分が分離される。分離された各成分は検出器６によ
って、例えば、吸光度を測定する等によって検出され、
その結果が記録計７に記録され、検出後の溶離液１は廃
液溜め８に溜められる。

【０００３】このような液体クロマトグラフを用いた液
体クロマトグラフィーによる試料の分析において、複数
の試料を同一の測定条件を用いて連続して測定した後、
測定を中断し（例えば、一日の稼働時間を終えて）、再
び（再びとは、例えば、翌日、再開するようなケース）
他の試料を上記と同一の測定条件を用いて測定するよう
に、多数の試料を処理する場合、測定される試料に由来
する物質によって液体クロマトグラフの流路が汚染され
ると、分析結果に影響を及ぼしたり、各装置や部品の寿
命を短くしたり、又はメンテナンスの手間の増大による
コスト増加を生じる。

【０００４】流路の洗浄についてみると、通常、自動的
な試料導入装置４などでは、試料導入装置４内の試料の
流路は、１試料の測定毎に専用の洗浄液で洗浄される。
しかしながら、図３に示したような分析系流路において
は、通常は、特別の洗浄はなされない。分析系流路を洗
浄しない理由は、測定中、常に溶離液が通液されている
ことと、通常、１試料の測定後は該試料に由来する残存
物質が分離カラム等の分析系流路に発生しないように溶
離条件を設定して行っているからである。

【０００５】しかしながら、実際には、分析データーの
上に、短期的には影響を与えないような程度の、試料由
来の残存物質があり、それが長期的には蓄積されて分析
に影響を与えることがあった。例えば、分離カラムの上
流や、分離カラムそのものに設置されているフィルター
に吸着や蓄積して目詰まりを起こさせたり、検出器の検
出部（測光セル等）に吸着や蓄積して検出感度の劣化を
起こさせるものである。

【０００６】このような、残存物質の洗浄法としては、
長期間分析を続けた後には、フィルター類を取り外して
超音波洗浄などをする、検出器のセルなどを洗剤で洗浄
するなどの対策がとられてきた。

【０００７】また、この残存物質の蓄積をできるだけ防
止する対策としては、残存物質の蓄積が溶離液が通液し
ていない、すなわち、送液ポンプが停止中において最も
起こり易いので、長期間、液体クロマトグラフを使用し
ない場合は、分離カラム以外の流路をイオン交換水など
で置換し、分離カラムは取り外して保管することも行わ
れている。

【０００８】しかしながら、これらの対策をとっても、
以下のような問題が残る。 残存物質が吸着、蓄積してしまった分離カラム中の充
填剤の洗浄に対しては、試薬などで洗浄除去できる場合
もあるが、通常、残存物質の吸着、蓄積は不可逆的に起
こる場合が多く、このような充填剤は使用不可能になる
ケースが多い。試料として血液のような生体試料を用い
る場合には、特に起こり易い。また、この洗浄に際し
て、余りにも強力な洗浄操作（使用条件とかけ離れた組
成の洗浄液を用いるとか、充填剤の素材そのものを劣化
させるような試薬を用いるなど）をすると、残存物質の
除去よりも充填剤そのものを劣化させてしまうので、こ
のような洗浄も用いにくい。

【０００９】流路を全てイオン交換水などで置換する
と、再稼働のための手間が大変であり、この置換方法は
非常に長い間、停止するとき以外には不向きな方法であ
る。

【００１０】このため、分析系流路における、試料残存
物質による汚染（特に充填剤に対する汚染）に対して
は、洗浄処理よりも汚染を最小に抑える予防が必要であ
る。また、流路の液置換のような手間のかかる方法でな
く、簡便に、場合によっては、自動で行え、且つ再稼働
の作業もスムーズに行える方法が必要である。

【００１１】上記のような、液体クロマトグラフィーに
よる試料の分析の例として、溶血液試料中の糖化ヘモグ
ロビンの測定が挙げられる。糖化ヘモグロビンとは血液
中の糖がその濃度に比例して赤血球に入った後に、ヘモ
グロビンと結合して生成したものであり、その濃度は過
去１〜２カ月間の血液中の平均的な糖濃度を反映すると
言われている。そして血糖値や尿糖値に比べ生理的要因
に左右されにくいので、血液中の糖化ヘモグロビンの濃
度は、糖尿病の診断又は糖尿病患者の経過観察の最適な
指標として使用されている。このため、臨床検査分野に
おいて液体クロマトグラフィーによる糖化ヘモグロビン
の測定が広く行われており、臨床検査センターなどの測
定現場では、複数の試料を同一の測定条件を用いて連続
して測定した後、測定を中断し、再び他の試料を上記と
同一の測定条件を用いて測定するようにして、連日多数
の試料が測定されている。

【００１２】上記糖化ヘモグロビンの測定は、血液を溶
血して赤血球中の糖化ヘモグロビンを赤血球から取り出
した溶血液試料を用い、陽イオン交換樹脂が充填された
分離カラムを使用した液体クロマトグラフィーにより測
定されており、この測定のための糖化ヘモグロビンの専
用測定装置が市販され普及している。この測定装置で
は、溶離液として後述の３種の溶離液を用いた３液ステ
ップグラジエント法により測定されているが、多数の試
料を測定した後、装置を停止し、その後、再度装置を稼
働するということの繰り返しの影響により、試料に由来
する残存物質等の主として充填剤への吸着などの、分析
系流路の汚染のためか、稼働を続けていると糖化ヘモグ
ロビンの保持時間が変化することがあり、このため毎日
の装置の使用開始に先立って保持時間をチエックし、測
定系の微調整をしたり、場合により分離カラムを廃棄し
新しいものに取り替えるなどが行われていた。

【００１３】

【発明が解決しようとする課題】請求項１記載の発明
（以下、請求項１記載の発明を本発明１という）は、上
記問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、液
体クロマトグラフにより多数の試料を測定する場合に、
試料に由来する残存物質等による分析系流路の汚染を防
ぐための簡便な方法を提供することにある。請求項２記
載の発明（以下、請求項２記載の発明を本発明２とい
う）の目的は、試料が溶血液であり、測定目的成分が糖
化ヘモグロビンである場合に、上記請求項１記載の発明
と同様の目的を達成することである。

【００１４】

【課題を解決するための手段】本発明１の液体クロマト
グラフィーによる試料の分析方法は、液体クロマトグラ
フにより複数の試料を同一の測定条件を用いて連続して
測定した後、測定を中断し、再び他の試料を上記と同一
の測定条件を用いて測定する、液体クロマトグラフィー
による試料の分析方法において、該試料の連続測定の終
了後に、分析系流路に洗浄液を送液して試料に由来する
残存物質を除去した後、洗浄用溶離液を送液することを
特徴とする。

【００１５】本発明２の液体クロマトグラフィーによる
試料の分析方法は、試料が溶血液であり、測定目的成分
が糖化ヘモグロビンである本発明１の液体クロマトグラ
フィーによる試料の分析方法である。

【００１６】以下の説明において、本発明という場合
は、本発明１及び２をいうものとする。

【００１７】本発明の液体クロマトグラフィーによる試
料の分析方法は、試料の連続測定の終了後に、分析系流
路に洗浄液を送液して試料に由来する残存物質を除去し
た後、洗浄用溶離液を送液する。

【００１８】上記連続測定とは、同一の条件下で試料を
変えて繰り返して測定することをいう。

【００１９】上記分析系流路とは、（例えば図３に示し
たような）液体クロマトグラフのシステム構成におい
て、分析のために溶離液が流れる全ての流路を指す。

【００２０】上記洗浄液とは、試料に由来する残存物質
を除去し得ると共に、充填剤を含め分析系流路を構成す
る材料に悪影響を及ぼさないものをいう。試料に由来す
る残存物質を除去するとは、充填剤を含め分析系流路を
構成する材料から、該残存物質を遊離させて除去した
り、又は分解させて除去することを意味する。従って、
洗浄液の種類は、測定対象試料と充填剤などの種類によ
り異なる。また、該洗浄液は流路内において、分析用の
溶離液と部分的混合されるので、分析用の溶離液との混
合により、分析に悪影響を及ぼす物質を生成する（例え
ば、塩の析出など）ものは好ましくない。

【００２１】上記洗浄液としては、上記のような条件に
よって選ばれる洗浄液を、専用の洗浄液として特別に用
意してもよいが、例えば、試料の分析がグラジエント法
（分析用溶離液を一種類でなく、溶出力の異なる複数の
溶離液を用いる分析方法）で行われる場合においては、
分析に使用される溶離液の中で最も溶出力の強い溶離液
が本発明の洗浄効果を有する場合には、この溶離液を使
用するのが簡便であり好ましい。

【００２２】上記洗浄液を送液する時間は、試料に由来
する残存物質を除去し得る時間である必要があり、測定
対象試料によって異なる。

【００２３】上記洗浄用溶離液は、上記洗浄液が分析に
悪影響を及ぼすことを避けるために送液されるものであ
り、充填剤を含め分析系流路を構成する材料に悪影響を
及ぼさないものであれば、任意に選択され得るが、通常
は、分析時に最初に送液される溶離液が好ましい。

【００２４】上記洗浄用溶離液を送液する時間及び送液
量は、上記洗浄液の分析に及ぼす影響が消滅する時間及
び送液量である必要がある。

【００２５】本発明１が適用される液体クロマトグラフ
ィーの方法は、従来から使用されてきた液体クロマトグ
ラフィーの方法のいずれでもよく、充填剤としては、無
機又は有機系の各種モード（例えば、イオン交換、逆
相、順相モードなど）に用いられる充填剤が挙げられ、
溶離液としては、充填剤又は測定対象試料によって異な
るが、例えば、アルコール系や炭化水素系などの有機溶
媒、無機酸塩・有機酸塩を含む緩衝液、又はこれらの混
合液などが用いられる。

【００２６】本発明で用いられる液体クロマトグラフィ
ーのシステムも、従来から使用されてきたシステムのい
ずれでもよく、例えば、従来技術の項で述べた図３のシ
ステムが挙げられる。

【００２７】本発明の試料の分析方法における、分析系
流路に洗浄液を送液する洗浄方法としては、自動洗浄方
法と手作業による洗浄方法がある。

【００２８】上記自動洗浄方法としては、例えば、図１
に示すシステムによって行うことができる。図１は、図
３に示した液体クロマトグラフのシステムに制御部９が
付け加えられたものである。制御部９はシステム全体を
統括制御するコントローラーである。制御部９の機能
は、連続測定終了後に洗浄液を一定時間送液し、その
後、洗浄液用溶離液を送液し、その後送液を停止すると
いう一連の制御を行うことである。そのため、制御部９
は、連続測定の終了を検知するために試料導入装置４
に、送液を自動で切り替えるために切り替え機構２に、
送液を停止させるために送液ポンプ３に接続される。ま
た、一連の連続測定が終了し、分析を一旦停止した後、
すぐに測定を再開する場合などのように、該洗浄操作が
不要の場合は、洗浄操作をキャンセルできるように制御
できることが好ましい。

【００２９】制御部９は、独立した装置を用いてもよい
し、例えば、送液ポンプ３や試料導入装置４などに制御
部機能が付属しているものは、それを用いて制御しても
よい。

【００３０】上記の自動洗浄方法は、夜間の連続運転な
どの場合には、特に好ましい。

【００３１】上記手作業による洗浄方法としては、人手
による作業部分としては、用いるシステムにより異なる
が、連続測定の終了の確認と、洗浄液の送液の開始入力
は最低限必要となる。

【００３２】本発明２では、上記液体クロマトグラフィ
ーの方法として、試料が溶血液であり、測定目的成分が
糖化ヘモグロビンである液体クロマトグラフィーによる
試料の分析方法に限定される他は、本発明１の液体クロ
マトグラフィーによる試料の分析方法と同様である。。
そして、この液体クロマトグラフィーの測定モードは、
従来技術の項で説明した方法と同様である。

【００３３】

【発明の実施の形態】以下、本発明の実施例及び比較例
を挙げることにより、本発明を詳細に説明するが、本発
明はこれに限定されるものではない。

【００３４】以下の実施例及び比較例においては、試料
を溶血液とし、測定目的成分として試料中の糖化ヘモグ
ロビンＡ１ｃを液体クロマトグラフィーによって測定し
た。測定装置及び測定方法、溶血剤並びに溶血液試料は
以下の通りである。

【００３５】糖化ヘモグロビンの測定装置及び測定方法 糖化ヘモグロビンの測定は、京都第一科学社製のＨｉ−
Ａｕｔｏ Ａ１ｃ ＨＡ−８１２１を用い適切な条件を
選択して行った。このＨＡ−８１２１は、液体クロマト
グラフィーによる糖化ヘモグロビン測定専用装置であ
り、陽イオン交換樹脂が充填された分離カラムを使用し
ており、陽イオン交換により各ヘモグロビン成分を４分
間で分離して溶出するものである。溶離液としては、溶
離液Ａ（０．１０Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ６）、溶離液Ｂ
（０．１５Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７）、溶離液Ｃ（０．
１０Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ６）を用い３液ステップグラ
ジエント法により測定（溶離液Ａを１３０秒送液し、溶
離液Ｂを２０秒送液し、溶離液Ｃを９０秒送液する）
し、クロマトグラムは分離カラムから溶出される各成分
の４１５ｎｍの吸光度を測定することにより得た。

【００３６】溶血剤 溶血試薬としてＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（ポリエチレ
ングリコールオクチルフェニルエーテル、和光純薬社
製）が０．１重量％で溶解された、０．０５Ｍリン酸緩
衝液（ｐＨ７．０）を溶血剤として用いた。

【００３７】溶血液試料 血液試料として、健常人の血液を使用し、採血後、直ち
に全血１ｍｌに対して血液抗凝固剤としてフッ化ナトリ
ウムを１０ｍｇの割合で添加したものを用い、血液試料
３μｌを上記溶血剤で１５０倍に希釈したものを溶血液
試料とした。

【００３８】（実施例１）まず、上記溶血液試料の２０
０検体を連続測定し、終了後、上記溶離液中で最も溶出
力の強い溶離液Ｂを洗浄液として６０秒送液した後、溶
離液Ａを洗浄用溶離液として６０秒送液し送液を停止し
た。翌日、同様にして、上記溶血液試料の２００検体を
連続測定し、終了後、同様に溶離液Ｂを６０秒送液した
後、溶離液Ａを６０秒送液し送液を停止した。さらに、
この翌日も同様に操作し、これを最初の測定日を含め８
日間くり返した。得られた代表的なクロマトグラムを図
２に示した。図２における各ピークは、１１糖化ヘモグ
ロビンＨｂＡ１ａ及びＨｂＡ１ｂ、１２胎児性ヘモグロ
ビンＨｂＦ、１３不安定型糖化ヘモグロビンＨｂＡ１
ｃ、１４安定型糖化ヘモグロビンＨｂＡ１ｃ、１５正常
ヘモグロビンＨｂＡ０である。各日の最初の検体のクロ
マトグラムにおける、安定型糖化ヘモグロビンＨｂＡ１
ｃの保持時間（秒）を測定し表１に示した。第１日目〜
第８日目まで保持時間（秒）は、殆ど変わらなかった。

【００３９】（比較例１）実施例１において、各日に
「２００検体を連続測定し、終了後、溶離液Ｂを６０秒
送液した後、溶離液Ｃを６０秒送液し送液を停止した」
ことの代わりに、「２００検体を連続測定し、終了後、
送液を停止した（すなわち、２００検体目の測定を、溶
離液Ａ、溶離液Ｂ、溶離液Ｃの順で送液して行った状態
で終了する）」ことの他は、実施例１と同様にして糖化
ヘモグロビンの測定を行い、各日の最初の検体のクロマ
トグラムにおける、安定型糖化ヘモグロビンＨｂＡ１ｃ
の保持時間（秒）を測定し表１に示した。第４日目から
ＨｂＡ１ｃの保持時間（秒）が短くなり、充填剤の劣化
が認められた。

【００４０】

【表１】

【００４１】

【発明の効果】本発明１の液体クロマトグラフィーによ
る試料の分析方法の構成は、上述の通りであり、本発明
１の分析方法は、試料に由来する残存物質等による分析
系流路の汚染を防ぐための簡便な方法を提供するので、
本発明１の分析方法を用いると、分析系流路（特に分離
カラム）への試料の吸着などを防ぎ、分析系流路（特に
分離カラム）の寿命を延長できる。本発明２の液体クロ
マトグラフィーによる試料の分析方法の構成は、上述の
通りであり、本発明２の分析方法を用いると、溶血液中
の糖化ヘモグロビンの測定において、分析系流路（特に
分離カラム）への試料の吸着などを防ぎ、分析系流路
（特に分離カラム）の寿命を延長できる。

【図面の簡単な説明】

【図１】自動洗浄のための制御部９が付け加えられた、
液体クロマトグラフのシステムを示す説明図である。

【図２】実施例１で得られたクロマトグラムである。

【図３】液体クロマトグラフのシステムを示す説明図で
ある。

【符号の説明】

１ 溶離液 ２ 切り替え機構 ３ 送液ポンプ ４ 試料導入装置 ５ 分離カラム ６ 検出器 ７ 記録計 ８ 廃液溜め ９ 制御部

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 液体クロマトグラフにより複数の試料を
   同一の測定条件を用いて連続して測定した後、測定を中
   断し、再び他の試料を上記と同一の測定条件を用いて測
   定する、液体クロマトグラフィーによる試料の分析方法
   において、該試料の連続測定の終了後に、分析系流路に
   洗浄液を送液して試料に由来する残存物質を除去した
   後、洗浄用溶離液を送液することを特徴とする液体クロ
   マトグラフィーによる試料の分析方法。
2. 【請求項２】 試料が溶血液であり、測定目的成分が糖
   化ヘモグロビンである請求項１記載の液体クロマトグラ
   フィーによる試料の分析方法。