JPH10115618A

JPH10115618A - ブタｍｍｐ−３の免疫学的測定法

Info

Publication number: JPH10115618A
Application number: JP30542696A
Authority: JP
Inventors: Seiji Kusuhara; 征治楠原; Arinori Iwasaki; 有紀岩崎; Yasuhiko Inagaki; 靖彦稲垣
Original assignee: Fuji Yakuhin Kogyo KK
Current assignee: Fuji Yakuhin Kogyo KK
Priority date: 1996-10-12
Filing date: 1996-10-12
Publication date: 1998-05-06

Abstract

(57)【要約】【課題】ブタにおける骨軟骨症の簡便な検出方法の提
供。【解決手段】ブタＭＭＰ−３と特異的に反応するモノク
ローナル抗体を用いて組織や細胞の免疫学的染色のため
の試薬として、さらには免疫学的測定法として確立。【効果】本ブタＭＭＰ−３と特異的に反応するモノクロ
ーナル抗体を用いることにより、ブタにおける骨軟骨症
の簡便な検出及び／または測定の有用な手段となり得
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、抗ブタマトリック
スメタロプロテアーゼ−３（ＭＭＰ−３；ストロムライ
シン１）モノクローナル抗体、及びそのモノクローナル
抗体を用いて検体中に存在するブタＭＭＰ−３を検出及
び／または定量する方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】ブタにおいて、骨軟骨症は極めて一般的
な疾病であり、脚弱の大きな原因のひとつになってい
る。骨軟骨症の病変は、初期には軟骨細胞の変性、壊死
に始まり、症状が進むにつれ、軟骨基質の亀裂、剥離を
招く。その結果、軟骨内化骨に障害を来すため、軟骨そ
のものよりもむしろ関節軟骨直下の骨組織と骨端軟骨周
囲の骨組織の形成不全、石灰化異常および線維化が主病
変として進行する。このような骨軟骨症は、１３〜１４
ケ月令までのブタにおいて殆ど１００％の出現率で現れ
る。

【０００３】このようなブタの骨軟骨症の発生は次のよ
うな原因が考えられている。例えば、栄養過多によって
急成長したブタは、その成長期において、体重増加に伴
う機械的過重に耐えられず、軟骨関節、骨端軟骨に病変
を引き起こし、骨軟化症に至る。栄養過多のうち、特に
カルシウム、リン、ビタミンＡおよびＤが関節病変に関
係すると考えられている。また、ストール単飼のブタに
おいては、舎内群飼に比較して、健脚性が弱く、運動の
不足により関節軟骨を保護するプロテオグリカンの合成
能が損なわれ、関節軟骨はひ薄化して病変が起こる。そ
の他、舎の床の構造も関節病変を進行させる原因ともな
っている。固いセメントでの飼育は四肢関節にかかる負
重が増加するためである。また、品種、系統にも大きく
係っているといわれ、それらによって骨軟化症の出現に
違いが見られ、特に、ヨークシャ種に比べ、ランドレー
ス種や大ヨークシャ種に発生しやすい。これは、大型種
の成長ホルモン濃度は一般に高く、このホルモンが軟骨
組織の成長を促進するためとされている。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】このように、重大で、
頻発する疾患にもかかわらず、骨軟化症の診断方法は、
あまりない。墨汁スタンプ法は、関節軟骨表面に出現す
る病変に墨汁を塗布し、その後、その部位を拭き取って
関節表面を観察するものである。この場合、病変部に墨
汁が浸透して肉眼的に認められる。しかしながら、肉眼
的に観察できるためには、骨軟化症がある程度まで進行
していなくてはならないため、初期の病変を診断するこ
とができず、さらに確定的な診断とはいえない。組織学
的な観察としては、プロテオグリカンの減少・消失、軟
骨細胞の壊死、軟骨の亀裂・融解、軟骨下骨からの軟骨
の剥離、軟骨下骨内への軟骨の残留、結合組織の増成な
どから総合的に診断することもできる。また、関節部位
を約３ｍｍに薄切りして軟骨をＸ線撮影を行って観察
し、骨形成および石灰化異常を観察することができる。
しかしながら、組織学的診断方法及びＸ線による方法な
どは、操作が煩雑で、簡便な診断方法が望まれている。

【０００５】

【課題を解決するための手段】ＭＭＰ−３は多種の軟骨
基質構成タンパクを分解するなど、変形性関節症にみら
れるような軟骨破壊において重要な役割を果たしている
タンパクと考えられているが、そのメカニズムについて
はまだ解明されていない。さらに、ブタにおける骨軟化
症にＭＭＰ−３が関与しているか否かについても知られ
ていない。本発明者らは、ブタＭＭＰ−３タンパクを定
性的及び定量的に測定するには、それを特異的に認識し
得るモノクローナル抗体を得るべきと考え、鋭意研究の
結果、ブタＭＭＰ−３と特異的に反応するモノクローナ
ル抗体を作製することに成功した。その結果、抗体とし
て抗ブタＭＭＰ−３と特異的に反応するモノクローナル
抗体を用いた測定法を確立した。さらに、これらモノク
ローナル抗体を用いることにより、組織や細胞の免疫染
色のための試薬としても有用であることを見出した。

【０００６】従来、ヒトＭＭＰ−３については、その測
定系が報告されているが（特開平４−２３７４９９）、
ヒト以外、しかもブタのＭＭＰ−３を免疫学的に測定、
検出する方法は未だ見出されていないのである。すなわ
ち、本発明は、（１）ブタマトリックスメタロプロテア
ーゼ−３（ＭＭＰ−３）と特異的に免疫反応することを
特徴とするモノクローナル抗体、（２）ブタＭＭＰ−３
と特異的に免疫反応し、かつヒトＭＭＰ−３とも特異的
に免疫反応することを特徴とする請求項１記載のモノク
ローナル抗体、（３）ブタＭＭＰ−３を特異的に認識
し、免疫組織染色に使用可能である請求項１又は２記載
のモノクローナル抗体、（４）ブタＭＭＰ−３と特異的
に免疫反応するモノクローナル抗体を用いることを特徴
とする組織免疫学的染色方法。（５）ブタＭＭＰ−３と
特異的に免疫反応するモノクローナル抗体を測定試薬と
して用いることを特徴とするブタＭＭＰ−３の測定方
法、（６）ブタＭＭＰ−３と特異的に免疫反応するモノ
クローナル抗体を用いることを特徴とするブタＭＭＰ−
３を測定するための試薬を提供するものである。

【０００７】

【発明の実施の形態】本発明で使用されるモノクローナ
ル抗体は、ケラーおよびミルシュタイン（Ｋｏｈｌｅ
ｒ，Ｇ．＆Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．，Ｎａｔｕｒｅ，
２５６，４９５，１９７５）などにより開示されたミエ
ローマ細胞を用いての細胞融合技術を利用して得られた
モノクローナル抗体を用いてよい。本発明で使用される
モノクローナル抗体は、次のような工程で作製できる。１．免疫原性抗原の調製２．免疫原性抗原による動物の免疫３．ミエローマ細胞（骨髄種細胞）の調製４．抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合５．ハイブリドーマ（融合細胞）の選択およびモノクロ
ーン化６．モノクローナル抗体の製造

【０００８】１．免疫原性抗原の調製抗原としては、例えばブタ組織由来あるいは培養ブタ細
胞株由来のＭＭＰ−３を挙げることができる。例えば、
ブタＭＭＰ−３においては骨軟化症ブタの滑膜細胞の培
養上清より精製して免疫抗原を得ることができる。さら
には、ヒト組織由来あるいは培養ヒト細胞株由来のＭＭ
Ｐ−３を挙げることができる。このヒト組織由来あるい
は培養ヒト細胞株由来のＭＭＰ−３を抗原とする場合、
該モノクローナル抗体は、ブタＭＭＰ−３と免疫学的に
交差反応性を有するモノクローナル抗体を選択して用い
られる。ヒト由来のＭＭＰ−３を免疫原とする場合、慢
性関節リウマチ疾患患者の滑膜細胞の培養上清より精製
して得ることができる。ブタＭＭＰ−３またはヒトＭＭ
Ｐ−３は、さらに免疫原性コンジュゲートなどにしても
よいが、そのまま適当なアジュバントと混合して動物を
免疫するのに使用できる。さらにブタＭＭＰ−３または
ヒトＭＭＰ−３は、それを断片化したものを適当な縮合
剤を介して種々の担体タンパク質類と結合させてハプテ
ン−タンパク質の如き免疫原性コンジュゲートとし、こ
れを用いて特定の配列のみを認識できるモノクローナル
抗体をデザインするのに用いることもできる。さらに
は、遺伝子組換技術を適用し、天然の細胞から分子クロ
ーニングにより得られたＤＮＡ配列あるいは既に知られ
たゲノム配列から、酵素などを用いたり、化学合成によ
り得られたＤＮＡ配列または修飾ＤＮＡ配列を、微生物
あるいは動物、植物、昆虫などで発現させて得られたリ
コンビナント抗原や、それらの情報を利用し液相法や固
相法として知られたペプチ化学合成法により得られたペ
プチドまたは改変ペプチドを用いることもできる。

【０００９】２．免疫原性抗原による動物の免疫動物を免疫するには、例えば村松繁、他編、実験生物学
講座１４、免疫生物学、丸善株式会社、昭和６０年、日
本生化学会編、続生化学実験講座５、免疫生化学研究
法、東京化学同人、１９８６年、日本生化学会編、新生
化学実験講座１２、分子免疫学ＩＩＩ、抗原・抗体・補
体、東京化学同人、１９９２年などに記載の方法に準じ
て行うことができる。抗原と共に用いられるアジュバン
トとしては、例えばフロイント完全アジュバント、リビ
（Ｒｉｂｉ）アジュバント、百日咳ワクチン，ＢＣＧ、
リピッドＡ、リポソーム、水酸化アルミニウム、シリカ
などが挙げられる。免疫は、例えばＢＡＬＢ／ｃなどの
マウスをはじめとする動物を使用して行われる。抗原の
投与量は、例えば、マウスに対して約１〜４００μｇ／
動物で、一般には宿主動物の腹腔内や皮下に注射し、以
後１〜４週間おきに、好ましくは１〜２週間ごとに腹腔
内、皮下、静脈内あるいは筋肉内に追加免疫を２〜１０
回程度反復して行う。免疫用のマウスとしてはＢＡＬＢ
／ｃ系マウスの他、ＢＡＬＢ／ｃ系マウスと他系マウス
とのＦ１マウスなどを用いることもできる。必要に応
じ、抗体価測定系を調製し、抗体価を測定して動物免疫
の程度を確認できる。

【００１０】３．ミエローマ細胞（骨髄腫細胞）の調製細胞融合に使用される無限増殖可能株（腫瘍細胞株）と
しては免疫グロブリンを産生しない細胞株から選ぶこと
ができ、例えばＰ３−ＮＳ−１−Ａｇ４−１（ＮＳ−
１、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６，５１１〜５１
９，１９７６）、ＳＰ２／０−Ａｇ１４（ＳＰ２，Ｎａ
ｔｕｒｅ，２７６，２６９〜２７０，１９７８）、マウ
スミエローマＭＯＰＣ−２１セルライン由来のＰ３−Ｘ
６３−Ａｇ８−Ｕ１（Ｐ３Ｕ１，Ｃｕｒｒｅｎｔｔｏ
ｐｉｃｓｉｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．ａｎｄＩｍｍ
ｕｎｏｌ．，８１，１〜７，１９７８）、Ｐ３−Ｘ６３
−Ａｇ８（Ｘ６３，Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５〜４
９７，１９７５）、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８．６５３（６
５３，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２３，１５４８〜１５
５０，１９７９）などを用いることができる。８−アザ
グアニン耐性のマウスミエローマ細胞株はダルベッコＭ
ＥＭ培地（ＤＭＥＭ培地）、ＲＰＭＩ−１６４０培地な
どの細胞培地に、例えば、ペニシリン、アミカシンなど
の抗生物質、牛胎児血清（ＦＣＳ）などを加え、さらに
８−アザグアニン（例えば５〜４５μｇ／ｍｌ）を加え
た培地で継代されるが、細胞融合の２〜５日前に正常培
地で継代して所要数の細胞株を用意することができる。
また使用細胞株は、凍結保存株を約３７℃で完全に解凍
したのちＲＰＭＩ−１６４０培地などの正常培地で３回
以上洗浄後、正常培地で培養して所要数の細胞株を用意
したものであってもよい。

【００１１】４．抗体産生細胞とミエローマ細胞との細
胞融合上記２．の工程に従い免疫された動物、例えばマウスは
最終免疫後、２〜５日後にその脾臓が摘出され、脾細胞
懸濁液を得る。脾細胞の他、生体各所のリンパ節細胞を
得て、それを細胞融合に使用することもできる。こうし
て得られた脾細胞懸濁液と上記３．の工程に従い得られ
たミエローマ細胞株を、例えば最小必須培地（ＭＥＭ培
地）ＤＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ−１６４０培地などの細胞
培地中に置き、細胞融合剤、例えばポリエチレングリコ
ールを添加する。細胞融合剤としては、この他各種当該
分野で知られたものを用いることができ、この様なもの
としては不活性化したセンダイウイルス（ＨＶＪ：Ｈｅ
ｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｎｇｖｉｒｕｓｏｆＪａ
ｐａｎ）などが挙げられる。好ましくは、例えば３０〜
６０％のポリエチレングリコールを０．５〜２ｍｌ加え
ることができ、分子量が１，０００〜８，０００のポリ
エチレングリコールを用いることができ、さらに分子量
が１，０００〜４，０００のポリエチレングリコールが
より好ましく使用できる。融合培地中でのポリエチレン
グリコールの濃度は、例えば３０〜６０％となるように
することが好ましい。必要に応じ、例えばジメチルスル
ホキシドなどを少量加え、融合を促進することもでき
る。融合に使用する脾細胞（リンパ球）：ミエローマ細
胞株の割合は、例えば１：１〜２０：１とすることが挙
げられるが、より好ましくは４：１〜１０：１とするこ
とができる。融合反応を１〜１０分間行い、次にＲＰＭ
Ｉ−１６４０培地などの細胞培地を加える。融合反応処
理は複数回行うこともできる。融合反応処理後、遠心な
どにより細胞を分離した後選択用培地に移す。

【００１２】５．ハイブリドーマ（融合細胞）の選択お
よびモノクローン化選択用培地としては、例えばヒポキサンチン、アミノプ
テリン及びチミジンを含む、ＦＣＳ含有ＭＥＭ培地、Ｒ
ＰＭＩ−１６４０培地などの培地、所謂ＨＡＴ培地が挙
げられる。選択培地交換の方法は、一般的には培養プレ
ートに分注した容量と当容量を翌日加え、その後１〜３
日ごとにＨＡＴ培地で半量ずつ交換するというようにす
ることができるが、適宜これに変更を加えて行うことも
できる。また融合後８〜１６日目には、アミノプテリン
を除いた、所謂ＨＴ培地で１〜４日ごとに培地交換をす
ることができる。フィーダーとして、たとえばマウス胸
腺細胞を使用することもでき、それが好ましい場合があ
る。ハイブリドーマの増殖のさかんな培養ウエルの培養
上清を、例えば放射免疫分析（ＲＩＡ）、酵素免疫分析
（ＥＬＩＳＡ）、蛍光免疫分析（ＦＩＡ）などの測定
系、あるいは蛍光惹起細胞分離装置（ＦＡＣＳ）など
で、ブタＭＭＰ−３またはヒトＭＭＰ−３あるいはその
断片ペプタイドなどを抗原として用いたり、あるいは標
識抗マウス抗体を用いて目的抗体を測定するなどして、
スクリーニングし分離する。目的抗体を産生しているハ
イブリドーマをクローニングする。クローニングは、寒
天培地中でコロニーをピック・アップするか、あるいは
限界希釈法によりなされうる。限界希釈法でクローニン
グがより好ましく行うことができる。クローニングは複
数回行うことが好ましい。

【００１３】６．モノクローナル抗体の製造得られたハイブリドーマ株は、ＦＣＳ含有ＭＥＭ培地、
ＲＰＭＩ−１６４０培地などの適当な増殖用培地中で培
養し、その培地上清から所望のモノクローナル抗体を得
ることができる。大量の抗体を得るためには、ハイブリ
ドーマを腹水化することが挙げられる。この場合ミエロ
ーマ細胞由来の動物と同系の組織適合性動物の腹腔内に
各ハイブリドーマを移植し、増殖させるか、例えばヌー
ド・マウスなどに各ハイブリドーマを移植し、増殖さ
せ、該動物の腹水中に産生されたモノクローナル抗体を
回収して得ることができる。ハイブリドーマの移植に先
立ち、プリスタン（２，６，１０，１４−テトラメチル
ペンタデカン）などの鉱物油を腹腔内投与した後、ハイ
ブリドーマを増殖させ、腹水を採取すればよい。腹水液
はそのまま、あるいは従来公知の方法、例えば硫酸アン
モニウム沈殿法などの塩析、セファデックスなどによる
ゲルろ過法、イオン交換クロマトグラフィー法、電気泳
動法、透析、限外ろ過法、アフィニテイ・クロマトグラ
フィー法、高速液体クロマトグラフィー法などにより精
製してモノクローナル抗体として用いることができる。
好ましくは、モノクローナル抗体を含有する腹水は、硫
安分画した後、ＤＥＡＥ−セファロースの如き、陰イオ
ン交換ゲル及びプロテインＡカラムの如きアフィテイ−
カラムなどで処理し精製分離処理できる。特に好ましく
は抗原又は抗原断片（例えば合成ペプチド、組換え抗原
タンパク質あるいはペプチド、抗体が特異的に認識する
部位など）を固定化したアフィニテイ・クロマトグラフ
ィー、プロテインＡを固定化したアフィニテイ・クロマ
トグラフィーなどが挙げられる。こうして得られたモノ
クローナル抗体は、市販のアイソタイプ特異的抗マウス
Ｉｇ抗体、例えばアイソタイプ特異的ウサギ抗マウスＩ
ｇ抗体などを用いてその抗体構成鎖の重鎖及び軽鎖のタ
イプについて調べることができる。さらにこれら抗体を
トリプシン、パパイン、ペプシンなどの酵素により処理
して、場合により還元して得られるＦａｂ、Ｆａｂ’，
Ｆ（ａｂ’）_２といった、抗体フラグメントにして使用
してもよい。

【００１４】標識物を付与する抗体としては、ＩｇＧ画
分、例えば抗体含有物を硫安分画した後、ペプシン消化
後還元して、ＤＥＡＥ−セファロースの如き、陰イオン
交換ゲルで処理して得られる特異的結合部Ｆａｂ’など
を用いることができる。これらの場合の標識物の例とし
ては、酵素（ペルオキシダーゼ、アルカリホスファター
ゼあるいはβ−Ｄ−ガラクトシダーゼなど）、化学物
質、蛍光物質あるいは放射性同位元素などがある。

【００１５】本発明の測定は、イムノアッセイ、例えば
競合型イムノアッセイまたは非競合型イムノアッセイで
行うことができることは上述した通りであり、ＲＩＡ、
ＥＬＩＳＡなどを用いることができる。好ましくはＥＩ
Ａであり、さらにサンドイッチ型アッセイが挙げられ
る。さらにはまた標識モノクローナル抗体試薬を用いた
免疫細胞染色あるいは免疫組織染色を行うことができ
る。測定は直接法でも間接法でもよい。また間接法の変
法、例えばＰＡＰ法（ペルオキシダーゼ・アンチペルオ
キシダーゼ法）、ＡＢＣ法（アビジン・ビオチン・コン
プレックス法）、プロテインＡ法などを用いることもで
きる。

【００１６】例えば、サンドイッチ型アッセイでは、ブ
タＭＭＰ−３と特異的に反応する抗体の一方を検出可能
に標識化する。同じ抗原を認識できる他の抗体を固相に
固定化する。検体と標識化抗体及び固相化抗体を必要に
応じ順次反応させるためインキュベーション処理し、こ
こで非結合抗体を分離後、標識物を測定する。測定され
た標識の量は抗原、すなわちブタＭＭＰ−３の量と比例
する。このアッセイでは、不溶化抗体や、標識化抗体の
添加の順序に応じてワンステップサンドイッチ型アッセ
イ、逆サンドイッチ型アッセイなどと呼ばれる。例え
ば、洗浄、攪拌、震盪、ろ過あるいは抗原の予備抽出等
は、特定の状況のもとでそれら測定工程の中で適宜採用
される。特定の試薬、緩衝液等の濃度、温度あるいはイ
ンキュベーション処理時間などのその他の測定条件は、
検体中の抗原の濃度、検体試料の性質等の要素に従い変
えることができる。当業者は通常の実験法を用いながら
各測定に対して有効な最適の条件を適宜選定して測定を
行うことができる。

【００１７】抗原あるいは抗体を固相化できる多くの担
体が知られており、本発明ではそれらから適宜選んで用
いることができる。担体としては、抗原抗体反応などに
使用されるものが種々知られており、本発明においても
もちろんこれらの公知のものの中から選んで使用でき
る。特に好適に使用されるものとしては、例えばガラ
ス、活性化ガラス、多孔質ガラス、シリカゲル、シリカ
−アルミナ、アルミナ、磁化鉄、磁化合金などの無機材
料、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、
ポリフッ化ビニリデン、ポリ酢酸ビニル、ポリメタクリ
レート、ポリスチレン、スチレン−ブタジエン共重合
体、ポリアクリルアミド、架橋ポリアクリルアミド、ポ
リグリシジルメタクリレート、アクロレイン−エチレン
グリコールジメタクリレート共重合体など、架橋化アル
ブミン、コラーゲン、ゼラチン、デキストラン、アガロ
ース、架橋化アガロース、セルロース、微結晶セルロー
ス、カルボキシメチルセルロース、セルロースアセテー
トなどの天然または変成セルロース、架橋デキストラ
ン、ナイロンなどのポリアミド、ポリウレタン、ポリエ
ポキシ樹脂などの有機高分子物質、さらにそれらを乳化
重合して得られたもの、細胞、赤血球などで必要に応
じ、シランカップリング剤などで官能性基を導入してあ
るものが挙げられる。

【００１８】さらに、ろ紙、ビーズ、試験容器の内壁、
例えば試験管、タイタープレート、タイターウエル、ガ
ラスセル、合成樹脂製セルなどの合成材料からなるセ
ル、ガラス棒、合成材料からなる棒、末端を太くしたり
あるいは細くしたりした棒、末端に丸い突起をつけたり
あるいは偏平な突起をつけた棒、薄板状にした棒などの
固体物質（物体）の表面などが挙げられる。これら担体
に、本発明で得られるブタＭＭＰ−３に対し特異的に結
合するモノクローナル抗体を結合させることができる。
担体とこれら抗原抗体反応に関与するものとの結合は、
吸着などの物理的な手法、あるいは縮合剤などを用いた
り、活性化されたものを用いたりする化学的な方法、さ
らには相互の化学的な結合反応を利用した手法などによ
り行うことができる。

【００１９】標識としては、酵素、酵素基質、酵素イン
ヒビター、補欠分子類、補酵素、酵素前駆体、アポ酵
素、蛍光物質、色素物質、化学ルミネッセンス化合物、
発光物質、発色物質、磁気物質、金属粒子、例えば金コ
ロイドなど、放射性物質などを挙げることができる。酵
素としては、脱水素酵素、還元酵素、酸化酵素などの酸
化還元酵素、例えば、アミノ基、カルボキシル基、メチ
ル基、アシル基、リン酸基などを転移するのを触媒する
転移酵素、例えば、エステル結合、グリコシド結合、エ
ーテル結合などを加水分解する加水分解酵素、リアー
ゼ、イソメラーゼ、リガーゼなどを挙げることができ
る。酵素は複数の酵素を複合的に用いて検知することも
できる。例えば酵素的サイクリングを利用することもで
きる。代表的な酵素標識としては、西洋ワサビペルオキ
シダーゼなどのペルオキシダーゼ、大腸菌β−Ｄ−ガラ
クトシダーゼなどのガラクトシダーゼ、マレエート・デ
ヒドロゲナーゼ、グルコース−６−フォスフェート・デ
ヒドロゲナーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコアミ
ラーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、カタラーゼ、ウ
シ小腸アルカリホスファターゼ、大腸菌アルカリホスフ
ァターゼなどのアルカリフォスフアターゼなどが挙げら
れる。

【００２０】アルカリフォスファターゼを用いた場合、
４−メチルウンベリフェリルフォスフエートなどのウン
ベリフェロン誘導体、ニトロフェニルホスフェートなど
のリン酸化フェノール誘導体、ＮＡＤＰを利用した酵素
的サイクリング系、ルシフエリン誘導体、ジオキセタン
誘導体などの基質を使用したりして、生ずる蛍光、発光
などにより測定できる。ルシフェリン、ルシフェラーゼ
系を利用したりすることもできる。カタラーゼを用いた
場合、過酸化水素と反応して酸素を生成するので、その
酸素を電極などで検知することもできる。電極としては
ガラス電極、難溶性塩膜を用いるイオン電極、液膜型電
極、高分子膜電極などであることもできる。酵素標識
は、ビオチン標識体と酵素標識アビジン（ストレプトア
ビジン）に置き換えることも可能である。標識は、複数
の異なった種類の標識を使用することもできる。こうし
た場合、複数の測定を連続的に、あるいは非連続的に、
そして同時にあるいは別々に行うことを可能にすること
もできる。

【００２１】蛍光物質あるいは化学ルミネッセンス化合
物としては、フルオレセインイソチオシアネート、たと
えばローダミンＢイソチオシアネート、テトラメチルロ
ーダミンイソチオシアネートなどのローダミン誘導体、
ダンシルクロリド、ダンシルフルオリド、フルオレスカ
ミン、フィコビリプロテイン、アクリジニウム塩、ルシ
フェリン、ルシフェラーゼ、エクオリンなどのルミノー
ル、イミダゾール、シュウ酸エステル、希土類キレート
化合物、クマリン誘導体などが挙げられる。標識するに
は、チオール基とマレイミド基の反応、ピリジルジスル
フイド基とチオール基の反応、アミノ基とアルデヒド基
の反応などを利用して行うことができ、公知の方法ある
いは当該分野の当業者が容易になしうる方法、さらには
それらを修飾した方法の中から適宜選択して適用でき
る。また上記免疫原性コンジュゲート作製に使用される
ことのできる縮合剤、担体との結合に使用されることの
できる縮合剤などを用いることができる。

【００２２】縮合剤としては、例えば、グルタルアルデ
ヒド、ヘキサメチレンジイソシアネート、ヘキサメチレ
ンジイソチオシアネート、Ｎ，Ｎ‘−ポリメチレンビス
ヨードアセトアミド、Ｎ，Ｎ‘−エチレンビスマレイミ
ド、エチレングリコールビススクシニミジルスタシネー
ト、ビスジアゾベンジジン、１−エチル−３−（３−ジ
メチルアミノプロピル）カルボジイミド、スクシンイミ
ジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰ
ＤＰ）、Ｎ−スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメ
チル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣ
Ｃ）、Ｎ−スルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミ
ドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート、Ｎ
−スクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベン
ゾエート、Ｎ−スクシンイミジル４−（１−マレイミド
フェニル）ブチレート、Ｎ−（ε−マレイミドカプロイ
ルオキシ）コハタ酸イミド（ＥＭＣＳ）、イミノチオラ
ン、Ｓ−アセチルメルカプトコハタ酸無水物、メチル−
３−（４’−ジチオピリジル）プロピオンイミデート、
メチル−４−メルカプトブチリルイミデート、メチル−
３−メルカプトプロピオンイミデート、Ｎ−スクシンイ
ミジル−Ｓ−アセチルメルカプトアセテートなどが挙げ
られる。

【００２３】本発明の測定法によれば、測定すべき物質
を酵素などで標識したモノクローナル抗体試薬と、担体
に結合された抗体とを順次反応させることもできるし、
同時に反応させることもできる。試薬を加える順序は選
ばれた担体系の型により異なる。感作されたプラスチッ
クなどのビーズを用いた場合には、酵素などで標識した
モノクローナル抗体試薬を測定すべき物質を含む検体試
料とともに最初適当な試験管中に一緒に入れ、その後、
該感作されたプラスチックなどのビーズを加えることに
より測定を行うことができる。本発明の定量法において
は、免疫学的測定法が用いられるが、その際の固相に担
体としては抗体等タンパク質を良く吸着するポリスチレ
ン製、ポリカーボナイト製、ポリプロピレン製あるいは
ポリビニル製のボール、マイクロプレート、ステイッ
ク、微粒子あるいは試験管等の種々の材料及び形態を任
意に選択し使用することができる。

【００２４】測定にあたっては、至適ｐＨ、例えばｐＨ
約４〜９に保つように適当な緩衝液系中で行うことがで
きる。特に適切な緩衝剤としては、例えばアセテート緩
衝剤、タエン酸塩緩衝剤、フォスフエート緩衝剤、トリ
ス緩衝剤、トリエタノールアミン緩衝剤、ボレート緩衝
剤、グリシン緩衝剤、炭酸塩緩衝剤、トリス−塩酸緩衝
剤などが挙げられる。緩衝剤は互いに任意の割合で混合
して用いることができる。抗体抗原反応は約０℃〜６０
℃の間の温度で行うことが好ましい。酵素などで標識さ
れたモノクローナル抗体試薬及び担体に結合せしめられ
た抗体試薬、さらには測定すべき物質のインキュベーシ
ョン処理は、平衡に達するまで行うことができるが、抗
原抗体反応の平衡が達成されるよりもずっと早い時点で
固相と液相とを分離して限定されたインキュベーション
処理の後に反応を止めることができ、液相または固相の
いずれかにおける酵素などの標識の存在の程度を測るこ
とができる。測定操作は、自動化された測定装置を用い
て行うことが可能であり、ルミネセンス・デイテクタ
ー、ホト・デイテクターなどを使用して基質が酵素の作
用で変換されて生ずる表示シグナルを検知して測定する
こともできる。

【００２５】抗原抗体反応においては、それぞれ用いら
れる試薬、測定すべき物質、さらには酵素などの標識を
安定化したり、抗原抗体反応自体を安定化するように適
切な手段を講ずることができる。さらに、非特異的な反
応を除去し、阻害的に働く影響を減らしたり、あるいは
測定反応を活性化したりするため、タンパク質、安定化
剤、界面活性剤、キレート化剤などをインキュベーショ
ン溶液中に加えることもできる。当該分野で普通に採用
されていたりあるいは当業者に知られた非特異的結合反
応を防ぐためのブロッキング処理を施してもよく、例え
ば、哺乳動物などの正常血清タンパク質、アルブミン、
スキムミルク、乳発酵物質、コラーゲン、ゼラチンなど
で処理することができる。非特異的結合反応を防ぐ目的
である限り、それらの方法は特に限定されず用いること
ができる。

【００２６】本発明の測定方法で測定される試料として
は、生物由来の液体試料、例えば、血液、血漿、血清、
関節液などの体液、細胞培養液、組織培養液、生検検
体、例えば細胞、組織、臓器などが挙げられる。特に好
ましくは、血漿、血清、関節液、組織などが挙げられ
る。本発明の標識モノクローナル抗体試薬を用いた免疫
細胞染色あるいは免疫組織染色では、生検検体、例えば
細胞、組織、臓器などが好適に用いられ、それら試料は
染色前に必要に応じ固定化することができる。組織の固
定化には当該分野で広く使用されているものあるいはそ
れらから誘導されたものを使用できる。例えば、ペリオ
デイト−リジン−パラホルムアルデヒド、グルタルアル
デヒド、ブアン、ホルマリン、パラホルムアルデヒド、
ザンボニー、アクロレインなどが使用できる。またパラ
フィンなどで固定化することもできる。

【００２７】

【実施例】以下に実施例を挙げ、本発明を具体的に説明
するが、本発明はこれら実施例に限定されず、様々な実
施形態が可能であり、本発明は本明細書及び図面に開示
の思想に従ったものである限り、すべての実施形態が包
含されるものである。

【００２８】実施例１抗ＭＭＰ−３モノクローナル抗
体の作製（ａ）抗原の調製Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２５４，７３１〜７４１（１９８
８）に記載の方法に従い、慢性関節リウマチ疾患患者の
滑膜細胞をダルベッコ変法イーグル培地（日水製薬製）
で培養した。すなわち、関節形成術を行った慢性関節リ
ウマチ患者の滑膜組織を細切し、酵素学的に滑膜細胞を
遊離させた後、２０％ウシ胎児血清、ペニシリンおよび
ストレプトマイシンを含むダルベッコ変法イーグル培地
で培養した。初代培養して得られた細胞を、次にウサギ
・マクロファージで処理した無血清培地でさらに培養
し、５〜７日目にその培養液を回収した。得られた培養
液をＤＥＡＥ−セルロースカラム（Ｗｈａｔｍａｎ
製）、グリーンＡダイアマトレックスカラム（Ａｍｉｃ
ｏｎＣｏｒｐ．製）、ゼラチンセファロースカラム、
コンカナバリンＡセフアロースカラム（Ｐｈａｒｍａｃ
ｉａ製）及び抗コラゲナーゼ抗体結合アフィニテイカラ
ムで処理した後、最後にウルトロゲルＡｃＡ４４カラム
（ＬＫＢ製）を用いてヒトＭＭＰ−３をドデシル硫酸ナ
トリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−
ＰＡＧＥ）に供したところ、分子量約５７ｋＤの単一バ
ンドを示した。この精製ヒトＭＭＰ−３は、上記処理に
おいてコンカナバリンＡセファロースカラムを用いて得
られたものであるため、糖鎖が結合している５９ｋＤの
プロＭＭＰ−３を含んでいない。

【００２９】（ｂ）抗体産生細胞の調製６週令のＢａｌｂ／ｃ雌マウス２匹にまずフロインド完
全アジュバンドを用いて、前記（ａ）項で記述した精製
ヒトＭＭＰ−３を初回免疫した。すなわち、それぞれの
マウスに１５μｇのヒトＭＭＰ−３を０．２ｍｌの溶液
として腹腔内投与した。その後、１７日目に１０ｍＭト
リス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解した１５μｇの
ヒトＭＭＰ−３を追加免疫した。最終免疫として５４日
目に静脈内投与（１６．５μｇ／マウス；１０ｍＭトリ
ス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解）により補助免疫
し、３日後にマウス脾臓を取り出し、脾臓細胞を調製し
た。

【００３０】（ｃ）細胞融合（１）以下の材料及び方法を用いる。ＲＰＭＩ１６４０
培地：ＲＰＭＩＮｏ．１６４０（ＦｌｏｗＬａｂ．製）
に重炭酸ナトリウム２４ｍＭ、ピルビン酸ナトリウム１
ｍＭ、ペニシリンＧカリウム５０Ｕ／ｍｌ、硫酸ストレ
プトマイシン５０μｇ／ｍｌ及び硫酸アミカシン１００
μｇ／ｍｌを加え、ドライアイスでｐＨを７．２にし、
０．２μｍ東洋メンブレンフイルターで除菌ろ過する。
ＮＳ−１培地：上記ＲＰＭＩ１６４０培地に除菌ろ過し
た仔牛胎児血清（Ｍ．Ａ．Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ製）
を１５％（ｖ／ｖ）の濃度になるように加える。ＰＥＧ
４，０００溶液：ＲＰＭＩ１６４０培地のポリエチレン
グリコール４，０００（ＰＥＧ４，０００、Ｍｅｒｃｋ
＆Ｃｏ．製）５０％（ｗ／ｗ）無血清溶液を調製す
る。８−アザグアニン耐性ミエローマ細胞ＳＰ−２（Ｓ
Ｐ−２／Ｏ・Ａｇ１４）との融合は、Ｓｅｌｅｃｔｅｄ
ＭｅｔｈｏｄｉｎＣｅｌｌｕｌａｒＩｍｍｕｎ
ｏｌｏｇｙ（ｅｄｓ．Ｂ．Ｂ．Ｍｉｓｈｅｌｌ＆
Ｓ．Ｍ．Ｓｈｉｉｇｉ），Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆
Ｃｏｍｐａｎｙ（１９８０），３５１〜３７２に記載
のＯｉらの方法に準拠して行った。

【００３１】（２）前記（ｂ）で調製した有核脾臓細胞
（生細胞率１００％）とミエローマ細胞（生細胞率１０
０％）とを５：１の割合で融合する。すなわち、脾臓細
胞とミエローマ細胞とを別々に前記ＲＰＭＩ１６４０培
地で洗浄する。次に同じ培地に懸濁し、融合させるため
上記の割合で混合する。容量５０ｍｌの円錐形スチロー
ル樹脂製試験管（住友ベークライト製）を用い、３７ｍ
ｌのＲＰＭＩ１６４０培地中１，０００ｒｐｍ、１０分
間遠心分離し、上清を完全に吸出する。沈殿した細胞に
３７℃で加温したＰＥＧ４，０００溶液４．５ｍｌを穏
やかに攪拌しながら１分間滴下し、さらに１分間攪拌
し、細胞を再懸濁、分散させる。次に３７℃で加温した
ＲＰＭＩ１６４０培地４．５ｍｌを１分間で滴下する。
この操作をさらに１回繰り返した後、同培地３１．７ｍ
ｌを２〜３分間で常に攪拌しながら滴下し、細胞を分散
させる。これを１，０００ｒｐｍ、７分間遠心分離し、
上清を完全に吸引除去する。次に沈殿した細胞に３７℃
で加温したＮＳ−１培地４５ｍｌをすみやかに加え、細
胞の大きい塊を１０ｍｌのピペットで注意深く分散させ
る。これを同培地９１ｍｌの入ったボトルに加えて希釈
し、ポリスチレン製９６穴マイクロウエル（岩城硝子
製）にウエルあたり６．０×１０個／０．１ｍｌの細胞
を加える。このマイクロウエルを７％炭酸ガス／９３％
空気中で３７℃、湿度１００％下で培養する。

【００３２】（ｄ）選択培地によるハイブリドーマの選
択的増殖（１）使用する培地は以下のとおりである。ＨＡＴ培
地：前記（ｃ）項で述べたＮＳ−１培地に、さらにヒポ
キサンチン（１００μＭ），アミノプテリン（０．４μ
Ｍ）及びチミジン（１６μＭ）を加える。ＨＴ培地：ア
ミノプテリンを除去した以外は上記ＨＡＴ培地と同一組
成の培地である。

【００３３】（２）前記（ｃ）項の培養開始翌日（１日
目）、細胞にピペットでＨＡＴ培地２滴（約０．１ｍ
ｌ）を加える。２，３，５及び８日目にそれぞれ培地の
半分（０．１ｍｌ）を新しいＨＡＴ培地で置き換え、１
０日目に培地の半分を新しいＨＴ培地で置き換える。こ
のとき、ハイブリドーマの十分な生育が観察される。ハ
イブリドーマが生育した全ウエルについて、次項（ｅ）
記載の固相−抗体結合テスト法（ＥＬＩＳＡ）により陽
性ウエルを確認する。次にフィーダーとして１０^７個の
マウス胸腺細胞を含むＨＴ培地１ｍｌをポリスチレン製
２４穴セルウエル（住友ベークライト製）に加えたもの
を用い、上記で検出された各陽性ハイブリドーマの全内
容物を移す。これを前記（ｃ）におけると同様に７％炭
酸ガス存在下、３７℃で５日間培養する。ハイブリドー
マの充分生育した時点でＥＬＩＳＡにより陽性を再確認
し、それぞれについて次項（ｆ）記載の限界希釈法によ
るクローニングを行う。なお、クローニングに使用した
後の残液をポリスチレン製２５ｃｍ^２組織培養フラスコ
（岩城硝子製）に写し、凍結保存用試料とする。

【００３４】（ｅ）ＥＬＩＳＡによる抗ＭＭＰ−３抗体
産生ハイブリドーマの検索Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０４，２０５〜２１４
（１９８０）に記載のＲｅｎｎａｒｄらの方法に準拠し
て行う。この方法は、ハイブリドーマ抗体の検出に適し
ている。９６穴ミクロタイトレーションプレート（Ｆｌ
ｏｗＬａｂ．製）を３０ｎｇ／ウエルのＭＭＰ−３で
コートする。これに前記（ｄ）で得られたハイブリドー
マ生育ウエルの上清の一部を加えて室温で１時間インキ
ュベートする。２次抗体としてＰＯＤ標識ヤギ抗マウス
イムノグロブリン（ＣａｐｐｅｌＬａｂ．製）をくわ
え、さらに室温で１時間インキュベートする。次に基質
である過酸化水素とｏ−フェニレンジアミンをくわえ、
マイクロプレートリーダー（ＭＲＰ−Ａ４、東洋ソーダ
製）を用いて４９２ｎｍの吸光度を測定する。

【００３５】（ｆ）クローニング前記（ｄ）の操作の後、各ウエル中には２種以上のハイ
ブリドーマが生育している可能性があるので、限界希釈
法によりクローニングを行い、モノクローナル抗体産生
ハイブリドーマを取得する。ＮＳ−１培地１ｍｌ当たり
フィーダーとして１０^７個のマウス胸腺細胞を含むクロ
ーニング培地を調製し、９６穴マイクロウエルにそれぞ
れハイブリドーマを加える。５日目に全ウエルに約０．
１ｍｌのＮＳ−１培地を追加し、１０日目に培地の半分
（０．１ｍｌ）を新しいＮＳ−１培地で置き換える。ク
ローニング開始後１４日目でハイブリドーマの十分な生
育が認められ、それらについてＥＬＩＳＡを行った。テ
ストした全ウエルが陽性でない場合、抗体陽性ウエル中
のコロニー数を確認し、ウエル中に１コロニーが確認さ
れたウエルを１個選び再クローニングする。最終的にヒ
トＭＭＰ−３に対するモノクローナル抗体産生ハイブリ
ドーマ１４株が得られた。

【００３６】（ｇ）モノクローナル抗体のアイソタイプ前述したＥＬＩＳＡ法にしたがって、ヒトＭＭＰ−３を
コートしたマイクロタイトレーションプレートに各モノ
クローナル抗体産生ハイブリドーマの培養上清を加え
た。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳで洗浄した
後、アイソタイプ特異的ウサギ抗マウスＩｇＧ抗体（Ｚ
ｙｍｅｄＬａｂ．製）を加えた。ＰＢＳによる洗浄
後、ＰＯＤ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体を加
え、基質として過酸化水素及び２，２‘−アジノ−ジ
（３−エチルベンゾチアゾリン硫酸）を用いて検出し
た。その結果、得られたモノクローナル抗体の内、１０
個が免疫グロブリン鎖γ１／κを、２個がγ２ａ／κ
を、２個がγ２ｂ／κを有していた。

【００３７】（ｈ）抗ＭＭＰ−３モノクローナル抗体の
選択前記（ｇ）項で得られた抗ＭＭＰ−３モノクローナル抗
体は、いずれもヒトＭＭＰ−３の潜在型及び活性型とも
反応することが確かめられた。さらに、ブタ滑膜組織と
の反応性からブタＭＭＰ−３とも交差反応性を有するこ
とが確認された。

【００３８】実施例２抗ＭＭＰ−３モノクローナル抗
体を用いた免疫染色ブタ骨軟骨症の病変部である後肢関節軟骨組織を採取
し、モネンシンで処理し（３時間）、ペリオデイト−リ
ジン−パラホルムアルデヒド（ＰＬＰ）で固定し（２４
時間）、パラフイン切片を作製した。脱パラフインした
これら組織切片中の内因性ぺルオキシダーゼを除去し、
１％馬血清−ＰＢＳでブロッキングを行った後、実施例
１で得られた抗ＭＭＰ−３モノクローナル抗体（クロー
ン番号５５−２Ａ４）と反応させた。次に、その切片を
ＰＢＳで充分洗浄し、ビオチン化ウマ抗マウスＩｇＧ
（Ｈ＋Ｌ）と反応させた後、さらにアビジン・ビオチン
ＨＲＰ複合体（ＶｅｃｔｏｒＬａｂ．製）と反応させ
た。このようにして得られた切片を、ＰＢＳで洗浄した
後、基質として０．０１％過酸化水素水及び０．０５％
ジアミノベンチジンを用いて発色させたところ、ブタＭ
ＭＰ−３は軟骨細胞中に染色された（図１及び２）。

【００３９】

【発明の効果】本発明に従えば、ブタ骨軟骨症における
ブタＭＭＰ−３の検出が容易にでき、従って、ブタ骨軟
骨症の診断が容易にできる。

【図面の簡単な説明】

【図１】ブタ骨軟骨症の病変部である後肢関節軟骨組織
の抗ＭＭＰ−３モノクローナル抗体を用いた組織染色の
光学的顕微鏡の写真である。

【図２】ブタ骨軟骨症の病変部である後肢関節軟骨組織
の抗ＭＭＰ−３モノクローナル抗体を用いた組織染色の
光学的顕微鏡の写真である。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ブタマトリックスメタロプロテアーゼ−３
（ＭＭＰ−３）と特異的に免疫反応することを特徴とす
るモノクローナル抗体。
【請求項２】ブタＭＭＰ−３と特異的に免疫反応し、か
つヒトＭＭＰ−３とも特異的に免疫反応することを特徴
とする請求項１記載のモノクローナル抗体。
【請求項３】ブタＭＭＰ−３を特異的に認識し、免疫組
織染色に使用可能である請求項１又は２記載のモノクロ
ーナル抗体。
【請求項４】ブタＭＭＰ−３と特異的に免疫反応するモ
ノクローナル抗体を用いることを特徴とする組織免疫学
的染色方法。
【請求項５】ブタＭＭＰ−３と特異的に免疫反応するモ
ノクローナル抗体を測定試薬として用いることを特徴と
するブタＭＭＰ−３の測定方法。
【請求項６】ブタＭＭＰ−３と特異的に免疫反応するモ
ノクローナル抗体を用いることを特徴とするブタＭＭＰ
−３を測定するための試薬。