JPH10127278A

JPH10127278A - コレステロール・エステラーゼの製造方法

Info

Publication number: JPH10127278A
Application number: JP8304182A
Authority: JP
Inventors: Minoru Hiruma; 稔蛭間; Takao Shirokane; 孝雄白兼; Masaru Suzuki; 勝鈴木
Original assignee: Kikkoman Corp
Current assignee: Kikkoman Corp
Priority date: 1996-10-31
Filing date: 1996-10-31
Publication date: 1998-05-19

Abstract

(57)【要約】【課題】エステル型コレステロールの定量などの際に
有用な、実用性に優れた理化学的性質を有するコレステ
ロール・エステラーゼを容易に製造する。【解決手段】ブルクホルデリア属に属し、コレステロー
ル・エステラーゼ生産能を有する菌株を培地に培養し、
その培養物からコレステロール・エステラーゼを採取す
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、コレステロール・
エステルを加水分解し、コレステロールと脂肪酸を生成
するコレステロール・エステラーゼの製造方法、さらに
詳しくはブルクホルデリア属に属し、コレステロール・
エステラーゼ生産能を有する菌株を培地に培養し、その
培養物からコレステロール・エステラーゼを採取する、
コレステロール・エステラーゼの製造方法に関するもの
である。

【０００２】

【従来の技術】血中の総コレステロール（遊離型コレス
テロールとエステル型コレステロールの合計量）及びエ
ステル型コレステロールの定量は、臨床学的な診断に際
して非常に重要であり、その存在量を知ることは動脈硬
化症、心筋梗塞症などの診断に役立ち、保健上重視され
ている。従来、遊離型コレステロールの定量法として
は、コレステロール・オキシダーゼを作用させて酵素的
に直接定量する方法が知られているが、該酵素は、エス
テル型コレステロールには作用しないため、エステル型
コレステロールを定量する場合には、まずエステル結合
を加水分解して遊離型のコレステロールを生成させ、そ
の後遊離型のコレステロールにコレステロール・オキシ
ダーゼを作用させて生成する過酸化水素を測定してエス
テル型のコレステロールを定量する方法が一般的に行わ
れている。前記のエステル型コレステロールを加水分解
する方法としては、例えばアルコール性水酸化カリウム
と化学的に反応させてケン化する方法、あるいは酵素的
にコレステロール・エステラーゼを作用させる方法など
が挙げられる。そして後者の方法は、前記分解操作が簡
便で、自動分析法などにおいて直接かつ迅速に定量がで
きることから好ましく用いられる。

【０００３】コレステロール・エステラーゼは、エステ
ル型コレステロールに作用して遊離型コレステロールと
脂肪酸を生成する酵素であり、特に動物の膵臓、肝臓な
どに由来するもの、あるいは微生物由来のものなどが知
られている。微生物由来のコレステロール・エステラー
ゼとしては、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａ
ｓ）属に属する微生物から得たもの（特開昭５０−１５
７５８８号公報参照）、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕ
ｍ）属に属する微生物から得たもの（ジャーナル・オブ
・バイオケミストリー（ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏ
ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）第８１巻、１２０９−１２１５
頁、１９７７年、参照）、シゾフィラム（Ｓｃｈｉｚｏ
ｐｈｙｌｌｕｍ）属に属する微生物から得たもの（特公
昭５５−３４６７４号公報参照）、担子菌のカワラタケ
属から得たもの（特公昭５６−５３３５５号公報参
照）、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）
属から得たもの（特公昭６０−１５３１１号公報参
照）、また、ノカルジア・コレステロリカム（Ｎｏｃａ
ｒｄｉａｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌｉｃｕｍ）ＮＲＲＬ
５７６７から得たもの（特公昭６０−５８９５５号公報
参照）、などが知られている。しかしながら、ブルクホ
ルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）属に属する微生
物由来のコレステロール・エステラーゼについての報告
はない。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、エステル型
コレステロールの定量などの際に用いられる、実用性に
優れた理化学的性質を有するコレステロール・エステラ
ーゼを、容易に得る方法を提供することを目的としてな
されたものである。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、前記目的
を達成するために鋭意研究を重ね、広く自然界よりコレ
ステロール・エステラーゼを生産し得る微生物の検索を
行った結果、土壌より分離したブルクホルデリア属に属
する菌株がコレステロール・エステラーゼを生産するこ
と、そしてその菌株によって生産された酵素の至適ｐＨ
が微酸性にあり、かつ熱安定性に優れて実用に適してい
ることなどを見出し、この知見に基づいて本発明を完成
するに至った。すなわち、本発明は、ブルクホルデリア
属に属し、コレステロール・エステラーゼ生産能を有す
る菌株を培地に培養し、その培養物からコレステロール
・エステラーゼを採取することを特徴とするコレステロ
ール・エステラーゼの製造方法である。以下、本発明に
ついて詳細に説明する。

【０００６】

【発明の実施の形態】先ず、本発明に用いられる菌とし
ては、ブルクホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）
属に属し、コレステロール・エステラーゼ生産能を有す
る菌株であればいかなる菌でもよく、またこれらの変種
又は変異株でもよい。そして、その具体例としては、ブ
ルクホルデリア・エスピーＮｏ．１２８−１１（Ｂｕ
ｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｓｐ．Ｎｏ．１２８−１１）
が挙げられ、該菌株の変種又は変異株も用いることがで
きる。このブルクホルデリア・エスピーＮｏ．１２８
−１１は、本発明者らが奈良市郊外の畑の土壌から採取
して純粋分離して得た菌であり、その菌学的性質は以下
に示すとおりである。

【０００７】＜ブルクホルデリア・エスピーＮｏ．１
２８−１１の菌学的性質＞（ａ）形態的性質顕微鏡的観察（肉汁寒天培地（ｐＨ７．０）上で、３０
℃、６〜４８時間培養）（１）細胞の形及び大きさ：０．７〜０．８×１．４〜
１．６μｍの桿菌。（２）細胞の多形性：単独または２連鎖。（３）運動性の有無：運動性あり。数本の極鞭毛を有す
る。（４）胞子の有無：胞子なし。（５）グラム染色性：陰性。（６）抗酸性：陰性。（ｂ）生育状態（１）肉汁寒天平板培養：３０℃、４８時間培養で直径
約１．５〜２．０ｍｍの円形コロニーを形成し、その表
面は平滑で光沢があり、凸円状の隆起をなし、色調は淡
いクリーム色で可溶性色素の生産は見られない。（２）肉汁寒天斜面培養：３０℃、２４時間培養で糸状
に生育する。表面は光沢があり淡いクリーム色で、生育
は良好である。（３）肉汁液体培養：３０℃、４８時間の静置培養でわ
ずかに濁り、沈渣を生成する。（４）肉汁ゼラチン穿刺培養：３０℃、２４時間培養で
培地の表面だけに生育し、穿刺孔に沿っては生育しな
い。また生育に伴いゼラチンを液化する。（５）リトマスミルク：３０℃、３日間の静置培養でや
やアルカリ性となり、液化するが凝固しない。（ｃ）生理的性質（１）硝酸塩の還元：陰性。（２）脱窒反応：陰性。（３）ＭＲテスト：陰性。（４）ＶＰテスト：陰性。（５）インドールの生成：陰性。（６）硫化水素の生成：陰性。（７）デンプンの加水分解：陰性。（８）クエン酸の利用：利用する。（９）無機窒素源の利用：硝酸塩は利用されないが、ア
ンモニウム塩は利用される。（10）色素の生成：陰性。（11）ウレアーゼ：陽性。（12）オキシダーゼ：陽性。（13）カタラーゼ：陽性。（14）生育の範囲：ｐＨ；４．５〜８．５、温度；５〜
４２℃。（15）酸素に対する態度：好気性。（16）Ｏ−Ｆテスト：酸化的。（17）糖類からの酸及びガスの生成の有無：Ｌ−アラビノース、Ｄ−キシロース、Ｄ−グルコース、
Ｄ−マンノース、Ｄ−フラクトース、Ｄ−ガラクトー
ス、ラクトース、トレハロース、Ｄ−ソルビトール、Ｄ
−マンニトール、イノシトール、グリセロール、マルト
ース及びシュークロースから酸を生成し、スターチから
は酸を生成しない。また何れからもガスの生成は認めら
れない。

【０００８】以上の諸性質をバージーズ・マニュアル・
オブ・デイタミネイテイブ・バクテリオロジー（Ｂｅｒ
ｇｅｙ′ｓＭａｎｕａｌｏｆＤｅｔｅｒｍｉｎａ
ｔｉｖｅＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）第９版（１９９
４年）の記載と対比すると、形態において桿菌であるこ
と、好気性菌であること、数本の極鞭毛を有すること、
グラム陰性であること、運動性があること、カタラーゼ
陽性であることなどから、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄ
ｏｍｏｎａｓ）属に属する菌株と考えられたが、Ｏｙａ
ｉｚｕとＫｏｍａｇａｔａは、３−ヒドロキシ脂肪酸の
組成の違いがシュードモナス属の５つのリボゾーマルリ
ボ核酸−デオキシリボ核酸（ｒＲＮＡ−ＤＮＡ）ホモロ
ジーグループに対応することを報告している（ジャ−ナ
ル・オブ・ジェネラル・アンド・アプライド・ミクロバ
イオロジー（ＪｏｕｒｎａｌｏｆＧｅｎｅｒａｌ
ａｎｄＡｐｐｌｉｅｄＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）
第２９巻、１７−４０頁、１９８３年、参照）。

【０００９】そこで、本菌株の菌体内脂肪酸組成を調べ
たところ、３−ヒドロキシ脂肪酸のうち、３−ヒドロキ
シミリスチン酸（３ＯＨ−Ｃ１４：０）と３−ヒドロキ
シパルミチン酸（３ＯＨ−Ｃ１６：０）の存在が認めら
れた。この３−ヒドロキシ脂肪酸の組成から、本菌株は
シュードモナス属のｒＲＮＡ−ＤＮＡホモロジーグルー
プＩＩに属する菌株であることが明らかになった。この
ｒＲＮＡ−ＤＮＡホモロジーグループＩＩは、１９９３
年にブルクホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）属
としてシュードモナス属から独立しており（マイクロバ
イオロジー・アンド・イムノロジー（Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌｏｇｙａｎｄＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）第３６巻、
１２５１−１２７５頁、１９９２年、参照）、従って本
菌株はブルクホルデリア属に属するものであると判定さ
れた。このことは主要キノンシステムがＱ−８であるこ
とからも裏付けられた。さらに、菌体内脂肪酸のうち、
ラクトバシル酸（Ｃ１９ＣＰＡ）がステアリン酸（Ｃ１
８：０）に比較して２倍以上多く存在することから、ブ
ルクホルデリア・セパシア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ
ｃｅｐａｃｉａ）の特徴を有していた。また、電子顕
微鏡観察の結果、本菌株には数本の極鞭毛の他に細胞の
周囲に繊毛（ｐｉｌｉあるいはｆｉｍｂｒｉａｅ）の存
在が確認された。このような繊毛は、ブルクホルデリア
・セパシアとシュードモナス・フラギ（Ｐｓｅｕｄｏｍ
ｏｎａｓｆｒａｇｉ）に認められると報告されている
（ジャーナル・オブ・ジェネラル・マイクロバイオロジ
ー（ＪｏｕｒｎａｌｏｆＧｅｎｅｒａｌＭｉｃｒ
ｏｂｉｏｌｏｇｙ）第５８巻、２２７−２３７頁、１９
６９年、参照）が、シュードモナス・フラギの生育温度
範囲が１０℃−３０℃であるのに対し、本菌株の生育温
度範囲は５℃−４２℃であり、シュードモナス・フラギ
とは明らかに異なっていた。

【００１０】以上の結果から、本菌株はブルクホルデリ
ア・セパシアに近縁のものと認められるが、前記文献お
よびインタ−ナショナル・ジャーナル・オブ・システマ
チック・バクテリオロジー（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａ
ｌＪｏｕｒｎａｌｏｆＳｙｓｔｅｍａｔｉｃＢａ
ｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）第３１巻、４７９−４８１頁、
１９８１年、に記載の性質と比較すると、色素の生産
能、オルニチンの脱炭酸能、ウレアーゼ生産能、エスク
リン分解能などの性質が明らかに異なっており、本菌株
はブルクホルデリア属に属する新種と認められることか
ら、ブルクホルデリア・エスピーＮｏ．１２８−１１
（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｓｐ．Ｎｏ．１２８−１
１）と命名した。そしてこの菌株は、工業技術院生命工
学工業技術研究所に、ＦＥＲＭＰ−１５９２４として
寄託されている。

【００１１】次に、前記のブルクホルデリア属に属し、
コレステロール・エステラーゼ生産能を有する菌株を培
地に培養し、その培養物からコレステロール・エステラ
ーゼを採取する菌株を用いてコレステロール・エステラ
ーゼ（以下本酵素という）を製造するには、先ず培養方
法としては、通常の固体培養法でもよいが、液体培養法
が好ましい。そしてその培地としては、炭素源、窒素
源、無機物、その他の栄養素を程よく含有するものであ
れば、合成培地又は天然培地のいずれでも使用できる。
炭素源としては、同化可能な炭素化合物であればいずれ
でもよく、例えばマルトース、グルコース、デンプン加
水分解物、グリセリン、フラクトース、糖蜜、大豆油、
ステアリン酸コレステリルなどが使用される。また、窒
素源としては、利用可能な窒素化合物であればよく、例
えば酵母エキス、ペプトン、肉エキス、コーンスチープ
リカー、大豆粉、アミノ酸、硫安、硝酸アンモニウムな
どが使用される。その他、食塩、塩化カリウム、硫酸マ
グネシウム、塩化マンガン、硫酸第一鉄、リン酸第一カ
リウム、リン酸第二カリウム、炭酸ナトリウム、酢酸ナ
トリウムなどの種々の塩類、ビタミン類、消泡剤などが
使用される。そしてこれらの栄養源はそれぞれ単独で用
いることもでき、また組み合わせて用いることもでき
る。このようにして調製した培地を用いて本酵素を製造
するには、通気攪拌深部培養または振盪培養などにより
好気的に培養し、その際に、培地の初発ｐＨを５〜８程
度に調整し、２０〜３７℃、好ましくは２５〜３５℃前
後の温度で１０〜５０時間、好ましくは１５〜２５時間
培養する。こうすることによって、培養物中に本酵素が
生成し、蓄積する。

【００１２】次いでこの培養物から本酵素を採取するに
は、通常の酵素採取手段を用いることができる。本酵素
は、主に菌体外に存在する酵素であるため、培養物か
ら、例えばろ過、遠心分離などの操作により菌体を除去
したのち、その菌体除去液からアセトン、アルコールに
よる有機溶媒沈殿法、あるいは硫安、その他塩類による
塩析法などの通常用いられる方法で酵素を得る。さらに
高度に精製された酵素標品を得るには、疎水及びイオン
交換を応用した吸着溶出法及び電気泳動法などを用いる
ことができる。次に本発明の方法によって得られた本酵
素の理化学的性質の一例は、下記のとおりである。

【００１３】＜本酵素の理化学的性質＞（１）作用：コレステロール・エステルを加水分解して
脂肪酸とコレステロールを生成する。

【００１４】（２）基質特異性：本酵素の、種々のコレ
スエロール・エステルに対する活性を後に述べる活性測
定法によって測定し、コレステロール・リノール酸に対
する活性を１００としたときの相対活性（％）を求めた
結果の一例を表１に示す。

【００１５】

【表１】

【００１６】表１からわかるように、コレステロール・
リノール酸、コレステロール・オレイン酸、コレステロ
ール・パルミチン酸及びコレステロール・オクタン酸に
作用し、中でもコレステロール・リノール酸に対して最
も強く作用する。またコレステロール・ステアリン酸及
びコレステロール・酢酸にもわずかに作用する。

【００１７】（３）至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲：至適ｐ
Ｈは、２００ｍＭリン酸緩衝液を用い、希釈した水酸化
ナトリウム及び塩酸にて各ｐＨに調整し、各ｐＨにおけ
る本酵素の活性測定を行って求めた。その結果は、図１
に示すとおりであり、本酵素の至適ｐＨは、６．５付近
である。また、安定ｐＨ範囲は、５０ｍＭ酢酸ナトリウ
ム−酢酸緩衝液（ｐＨ３．０〜５．０）、５０ｍＭメス
−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０〜６．５）、５
０ｍＭヘペス−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５〜
８．０）及び５０ｍＭチェス−水酸化ナトリウム緩衝液
（ｐＨ８．０〜１０．０）を用い、ｐＨ３．０〜１０．
０において３７℃、６０分間それぞれ処理した後、本酵
素の残存活性を測定して求めた。その結果は、図２に示
すとおりであり、本酵素の安定ｐＨ範囲は４．５〜７．
５である。なお、図２中に示すマークで、□は５０ｍＭ
酢酸ナトリウム−酢酸緩衝液（ｐＨ３．０〜５．０）
を、■は５０ｍＭメス−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ
５．０〜６．５）を、●は５０ｍＭヘペス−水酸化ナト
リウム緩衝液（ｐＨ６．５〜８．０）を、また、○は５
０ｍＭチェス−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０〜
１０．０）を、それぞれ用いたときの結果を示してい
る。

【００１８】（４）作用適温の範囲：後記する力価の測
定法におけると同一の基質と酵素液を用い、種々の温度
（２５℃〜７０℃）で処理を行い本酵素の活性測定を行
った。その結果は、図３に示すとおりであり、本酵素の
作用適温の範囲は４３〜４７℃である。

【００１９】（５）ｐＨ、温度などによる失活の条件：
本酵素は、３７℃、６０分間の処理では、ｐＨ４．５〜
７．５で安定であり、５０ｍＭメス−水酸化ナトリウム
緩衝液（ｐＨ６．０）を用いて、各温度で３０分間処理
した場合の本酵素の熱安定性を調べた。その結果は、図
４に示すとおりであり、本酵素は６０℃程度まで安定で
あり、７５℃で約３０％程度失活する。

【００２０】（６）阻害、活性化及び安定化：後記する
力価の測定法におけると同一の基質・酵素混合液に、表
２に示す種々の金属塩（各々１ｍＭの濃度）を添加して
酵素活性を測定し、各金属塩による影響を調べた結果を
表２に示す。

【００２１】

【表２】

【００２２】表２からわかるように、本酵素は、ＨｇＣ
ｌ₂で強く阻害され、またＣｕＳＯ₄で阻害されるが、活
性化及び安定化に特別に寄与する金属塩は見当たらな
い。

【００２３】（７）力価の測定方法：コレステロール・
リノール酸を基質として、本酵素を作用させ、生成する
コレステロールをさらにコレステロール・オキシダーゼ
によって酸化し、生成する過酸化水素をさらに４−アミ
ノアンチピリンとフェノールを定量的に酸化縮合せし
め、キノネイミン色素を生じさせる。この色素を５００
ｎｍで測定し、酵素力価を求めた。なお、酵素反応液の
組成及び反応条件は以下のとおりである。また、本発明
におけるコレステロール・エステラーゼ１単位は、コレ
ステロール・リノール酸を基質として、ｐＨ７．０、３
７℃の条件で１分間に１マイクロモルの遊離コレステロ
ールを生成するに要する酵素量とした。

【００２４】＜反応液の組成＞コレステロール・リノール酸（０．６ｍＭ、１％トリ
トンＸ−１００溶液）；１．０ｍｌ８６．６ｍＭ４−アミノアンチピリン水溶液；０．
０５ｍｌ６３８ｍＭフェノール水溶液；０．１ｍｌパーオキシダーゼ（１５０単位／ｍｌ、０．１Ｍリ
ン酸緩衝液、ｐＨ７．０）；０．１ｍｌコレステロール・オキシダーゼ（１００単位／ｍｌ、
０．１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７．０）；０．１ｍｌ酵素液；０．１ｍｌリン酸緩衝液（２００ｍＭ、ｐＨ７．０）；１．５ｍ
ｌ反応液量；２．９５ｍｌ

【００２５】＜測定手順＞前記の、、、、の
反応混液２．７５ｍｌを試験管に採り、３７℃で約５分
間予備加温し、これにを加えてさらに２分間加温す
る。次に前記したを添加し、緩やかに混和後、水を対
照に３７℃に制御された分光光度計で５００ｎｍの吸光
度変化を３〜４分間記録し、その初期直線部分から１分
間あたりの吸光度変化量を求める。

【００２６】（９）精製方法：本酵素の単離、精製は常
法に従って行うことができ、例えば硫安塩析法、有機溶
媒沈澱法、イオン交換体などによる吸着処理法、イオン
交換クロマトグラフ法、疎水クロマトグラフ法、ゲルろ
過クロマトグラフ法、吸着クロマトグラフ法、アフィニ
ティークロマトグラフ法、電気泳動法などを単独又は適
宜組合わせて用いられる。

【００２７】なお、本発明によって得られるコレステロ
ール・エステラーゼの主要な理化学的性質は前記のとお
りであるが、この酵素が従来知られているコレステロー
ル・エステラーゼとは異なるものであることを、主とし
て至適ｐＨ、熱安定性について表３に示して比較する。
なお、比較の対象としては、シュードモナス属として、
（１）特開昭５０−１５７５８８号公報記載のシュード
モナス・フルオレッセンスＫＹ３９５５、（２）特公
昭５８−３００３３号公報記載のシュードモナス・ノブ
・エスピーＮｏ．１０９、（３）アグリカルチュラル・
アンド・バイオロジカル・ケミストリー（Ａｇｒｉｃｕ
ｌｔｕｒａｌａｎｄＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅ
ｍｉｓｔｒｙ）第４０巻、１９５７−１９６４頁、１９
７６年、記載のシュードモナス・フルオレッセンスＡＴ
ＣＣ２１１５６、及び（４）東洋紡績カタログに記載の
シュードモナス・エスピー由来のものを挙げた。また
（５）フザリウム属として、ジャーナル・オブ・バイオ
ケミストリー（ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｃｈｅｍ
ｉｓｔｒｙ）第８１巻、１２０９−１２１５頁、１９７
７年、に記載のＦｕｓａｒｉｕｍｏｘｙｓｐｏｒｕｍ
ＩＧＨ−２由来のものを、（６）シゾフィラムとし
て、特公昭５５−３４６７４号公報記載のＳｃｈｉｚｏ
ｐｈｙｌｌｕｍｃｏｍｍｕｎｅＩＦＯ４９２８由来の
ものを、（７）担子菌のカワラタケ属として、特公昭５
６−５３３５５号公報記載のＣｏｒｉｏｌｕｓｖｅｒ
ｓｉｃｏｌｏｒＫ−１２１３由来のもの、及び（８）
ストレプトミセス属として、特公昭６０−１５３１１号
公報記載のＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｌａｖｅｎｄｕ
ｌａｅＨ−６４６−ＳＹ２由来のもの、を挙げて各文
献に記載のコレステロール・エステラーゼの性質と本酵
素のそれとを比較した。

【００２８】

【表３】

【００２９】表３に示すごとく、本発明の方法によるコ
レステロール・エステラーゼは、至適ｐＨが微酸性にあ
り、かつ熱安定性がｐＨ６．０で３０分間の処理で６０
℃まで安定であり、他の微生物由来のそれとは異なって
いる。

【００３０】

【実施例】次に、実施例により本発明をさらに詳細に説
明するが、本発明はこれらの例によってなんら限定され
るものではない。実施例１大豆油０．５％（Ｗ／Ｖ）、酵母エキス０．５％（Ｗ
／Ｖ）、リン酸一カリウム０．１％（Ｗ／Ｖ）、リン
酸二カリウム０．１％（Ｗ／Ｖ）、硫酸マグネシウム
・７水和物０．０１％（Ｗ／Ｖ）、硫酸第一鉄・７水和
物、０．００５％（Ｗ／Ｖ）及び水道水からなる培地
（ｐＨ７．５）２０ｌを３０ｌ容ジャーに入れて、１２
０℃で１５分間殺菌した。この培地に、ブルクホルデリ
ア・エスピーＮｏ．１２８−１１（Ｂｕｒｋｈｏｒｄｅ
ｒｉａ．ｓｐ．Ｎｏ．１２８−１１）の保存スラント
（３本）から、生理食塩水を用いて調製した菌体懸濁液
を接種し、これを３０℃で約２４時間、等量通気で攪拌
培養した。培養終了後、培養液２０ｌを遠心分離によっ
て菌体除去し、上清を限外ろ過膜を用いて濃縮して２ｍ
Ｍ塩化マグネシウム及び０．５ｍＭエチレンジアミン四
酢酸を含有する１０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）
（以下緩衝Ａという）に対して透析した。本酵素の精製
は、濃縮透析液の５ｌの半分量の２．５ｌに対して、以
下に示す操作により行なった。

【００３１】ステップ１；（フェニル−セファロースＣ
Ｌ−４Ｂ・クロマトグラフィー）透析液（２．５ｌ）に５％飽和になるように硫安粉末を
添加、混合した後、フェニル−セファロースＣＬ−４Ｂ
のカラム（８×３０ｃｍ）に本酵素を吸着させ、緩衝液
Ａにてカラムを洗浄した。次に、０Ｍ〜１．０Ｍ尿素と
３５ｍＭコール酸ナトリウムを含有する緩衝液Ａの直線
濃度勾配法により本酵素を溶出させ、活性画分を限外濃
縮し、緩衝液Ａに対して透析した。ステップ２；（ＤＥＡＥ−セファセル・クロマトグラフ
ィー）前記透析液（２５０ｍｌ）を、ＤＥＡＥ−セファセルの
カラム（６×２１ｃｍ）に吸着させた後、緩衝液Ａにて
カラムを洗浄し、次ぎに０Ｍ〜２．０Ｍ尿素と７０ｍＭ
コール酸ナトリウムを含有する緩衝液Ａの直線濃度勾配
法により溶出させ、活性画分を限外濃縮し、緩衝液Ａに
対して透析した。ステップ３；（セファデックスＧ−２００・クロマトグ
ラフィー）濃縮液（１４ｍｌ）の一部（２ｍｌ）をセファデックス
Ｇ−２００のカラム（２．５×９５ｃｍ）に添加した
後、０．１Ｍ塩化カリウムを含有する緩衝液Ａを用いて
ゲルろ過を行い、溶出された活性画分８０ｍｌを採取し
た。以上のステップ３の精製操作を合計７回繰り返し行
い、全タンパク量１０ｍｇ、全活性５１０Ｕの精製酵素
標品を得た。

【００３２】

【発明の効果】本発明によれば、熱安定性に優れたコレ
ステロール・エステラーゼを容易に製造することができ
る。そして本酵素は、熱安定性に優れているため実用性
に富み、本酵素を液状試薬としたときなどの保存性がよ
いことから、例えばエステル型コレステロールの定量な
どの際の試薬として有効に用いられる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本酵素の至適ｐＨを示すグラフ。

【図２】本酵素の安定ｐＨ範囲を示すグラフ。

【図３】本酵素の作用適温の範囲を示すグラフ。

【図４】本酵素の熱安定性を示すグラフ。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ブルクホルデリア属に属し、コレステロ
ール・エステラーゼ生産能を有する菌株を培地に培養
し、その培養物からコレステロール・エステラーゼを採
取することを特徴とするコレステロール・エステラーゼ
の製造方法。
【請求項２】コレステロール・エステラーゼ生産能を
有する菌株が、ブルクホルデリア・エスピーＮｏ．１
２８−１１である請求項１記載のコレステロール・エス
テラーゼの製造方法。