JPH0661278B2 - ミオイノシトールの高感度定量法および定量用組成物 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、臨床生化学検査、食品検査等におけるミオイ
ノシトールの酵素サイクリング反応を用いた新規な高感
度測定法およびミオイノシトール定量用組成物に関す
る。

〔従来の技術〕

ミオイノシトールはイノシトールの９つの異性体の１つ
で、極めて安定した環状アルコールである。人の場合、
ミオイノシトールは食事により１日約１ｇ、腎臓におけ
る生合成により約２ｇが供給され、細胞への取り込みと
腎臓における排泄・再吸収および酸化により血漿レベル
がほぼ一定になるように調節されている。そのため腎機
能障害においては血漿ミオイノシトールレベルの著明な
増加が見られる〔臨床科学２４巻、１１号、１４４８−
１４５５頁（１９８８）〕。このようにミオイノシトー
ルを測定することによって腎機能のモニタリングができ
る。

従来、ミオイノシトールはガスクロマトグラフイー、高
速液体クロマトグラフイー等で測定されいるが、検体の
前処理が必要であり、また操作も煩雑で臨床検査等大量
の検体測定には用い難い。また、正常値も３０μｍｏｌ
／付近と低値であり〔日本臨床化学会年会記録第２８
集（１９８８）〕簡便で高感度な測定方法が望まれてい
る。

〔発明が解決しようとする課題〕

微量の基質や酵素活性を酵素サイクリング法として二種
類の酵素を用いて増幅する手法が従来より知られてい
る。よく知られたものとしてＮＡＤサイクリング、Ｃｏ
Ａサイクリング、ＡＴＰサイクリングなどがあるが、臨
床検査等のルーチン分析において操作が煩雑なため、ほ
とんど用いられていないのが現状である。

本発明者らはミオイノシトールデヒドロゲナーゼ（Ｅ
Ｃ．１．１．１．１８）がチオＮＡＤ（Ｐ）類に作用し
て、サイクリング反応を形成し得ることを見出した。

本発明はＮＡＤ及びＮＡＤＰのアナログであるチオＮＡ
Ｄ（Ｐ）類ととＮＡＤ（Ｐ）類の還元型吸収極大波長
が、それぞれ４００ｎｍ付近、３４０ｎｍ付近と異なっ
ていることを利用したもので、ミオイノシトールデヒド
ロゲナーゼを用いた酵素サイクリング反応を実施するに
あたり、二種類の補酵素のひとつにチオＮＡＤ（Ｐ）類
を使用して、どちらか一方の補酵素の変化量のみを分別
定量することによるものであり、その結果、ミオイノシ
トールを高感度に測定できる。

すなわち、本発明は被検体に、 チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェ
ート類（以下、チオＮＡＤＰ類という）及びチオニコチ
ンアミドアデニンジヌクレオチド類（以下、チオＮＡＤ
類という）からなる群より選ばれるひとつと、ニコチン
アミドアデニンジヌクレオチドホスフェート類（以下、
ＮＡＤＰ類という）およびニコチンアミドアデニンジヌ
クレオチド類（以下、ＮＡＤ類という）からなる群より
選ばれるひとつとを補酵素とし、少なくともミオイノシ
トールを基質としてミオイノソースを生成する可逆反応
をなすミオイノシトールデヒドロゲナーゼ、 Ａ_１、 Ｂ_１、 を含有する試薬を作用せしめて、次の反応式(I) （式中、Ａ_１はチオＮＡＤＰ類、チオＮＡＤ類、ＮＡＤ
Ｐ類またはＮＡＤ類を示し、Ａ_２はＡ_１の還元型生成物
を示し、Ｂ_１はＡ_１がチオＮＡＤＰ類またはチオＮＡＤ
類のときは還元型ＮＡＤＰ類または還元型ＮＡＤ類を、
Ａ_１がＮＡＤＰ類またはＮＡＤ類のときは還元型チオＮ
ＡＤＰ類または還元型チオＮＡＤ類を示し、Ｂ_２はＢ_１
の酸化型生成物を示す）で表されるサイクリング反応を
形成せしめ、該反応によって変化するＡ_２またはＢ_１の
量を測定することを特徴とするミオイノシトールの高感
度定量法、並びに上記、及びを含有することを特
徴とするミオイノシトール定量用組成物を提供するもの
である。

本発明において、ミオイノシトールデヒドロゲナーゼと
しては、上記条件を具備するものであれば何れのもので
も使用できるが、その具体例として、酵素ハンドブック
（朝倉書店ｐ６）記載の本酵素生産菌Ａｅｒｏｂａｃｔ
ｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ〔Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．２
４１，８００−８０６（１９６６）〕、Ｋｌｅｂｓｉｅ
ｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍ
ａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｅ
ｌｉｂｉｏｓｕｍ〔Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．
Ａｃｔａ．，２９３，２９５−３０３（１９７３）〕、
牛脳〔Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏ
ｍｍｕｎ．，６８，１１３３−１１３８（１９７６）〕
およびＢａｃｉｌｌｕｓ．ｓｐ．NO.３（東洋醸造社
製）が挙げられる。しかしながら、Ａｅｒｏｂａｃｔｅ
ｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎ
ｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓｅｒｒａｔｉａｍａｒｃｅｓｃｅ
ｎｓの三種は標準微生物学第２版（医学書院ｐ２０９−
２１２）によると肺炎あるいは日和見感染起因菌として
化学療法剤、抗生物質に抵抗性を有する難治性感染菌と
して知られており、このような病原菌を工業的規模で培
養することは実質的には困難である。また酵母Ｃｒｙｐ
ｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｅｌｉｂｉｏｓｕｍの生産する酵
素のミオイノシトールに対するＫｍ値は約１１．０ｍ
Ｍ、ＮＡＤに対するＫｍ値は約０．０７ｍＭと記載され
ており、Ｋｍ値が高いため充分な反応速度が得られ難
い。〔酵素ハンドブック、ｐ６〕 そこで、本発明者らは、ミオイノシトールを測定する目
的で、危険性のない、培養活性の高い、基質であるミオ
・イノシトールとＮＡＤ^＋に対するＫｍ値のできるだけ
低い、安定で精製の簡単な酵素を生産する菌株を広く自
然界よりスクリーニングしたところ、静岡県加茂郡東伊
豆町熱川の温泉近くの土壌より分離したＢａｃｉｌｌｕ
ｓ・ｓｐ NO.．３菌株が目的とする性質を有するミオ
イノシトールデヒドロゲナーゼを産生することを見出し
た。

本発明者らが見出したＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．NO.３
の生産するこの酵素は、pH８．５において測定したミオ
イノシトールとＮＡＤ^＋に対するＫｍ値がそれぞれ約
０．６ｍＭ、０．００４ｍＭと非常に低い、反応性の高
い性質を有し、かつほぼ６０℃の緩衝液中で約１５分間
処理した後の活性が、処理前の活性の約９５％以上の値
を保持している性質を有している新規なミオイノシトー
ルデヒドロゲナーゼあり、かつ補酵素としてＮＡＤ
（Ｐ）類のみならずチオＮＡＤ（Ｐ）類も補酵素として
利用する酵素であることを知り、また、本酵素は、バチ
ルス属に属するミオイノシトールデヒドロゲナーゼ生産
菌を培地に培養し、得られた培養物からミオイノシトー
ルデヒドロゲナーゼを採取してミオイノシトールデヒド
ロゲナーゼを製造できる。

ミオイノシトールデヒドロゲナーゼ生産菌はバチルス属
に属するが、例えば本発明者らが分離したNO.３菌株
は、本発明における酵素の製造に最も有効に使用される
菌株の一例であって、本菌株の菌学的性質を示すと次の
通りである。

(a)形態的特徴 端の丸いまっすぐまたはやや曲がった桿状細菌で大きさ
は０．５〜０．７×１．５〜３．５μｍで周毛で運動す
る。端または亜端に０．８×１．０〜２．０μｍの楕円
〜卵形の芽胞を形成し、芽胞によって菌体は膨張する。
多形性なし。

(b)各培地における成育状態 各種培地上で、１〜２日、５０〜５２℃で培養し、観察
した所見は次の通りである。普通寒天平板培地 円形で丘状（ｃｏｎｖｅｘ）の集落を形成する。表面は
滑らかで縁は丸い。黄土色〜淡黄土色を呈するが、可溶
性色素は産生しない。

普通寒天斜面培地 線状に良好に生育する。淡黄土〜黄土色を呈する。可溶
性色素は産生しない。

液体培地（ペプトン水） 生育良好で一様に混濁する。

リトモスミルク培地 ４〜５日後、弱酸性になる。

ＤＮＡのＧＣモル％：４１．９モル％（ＨＰＬＣ法）主
たるイソプレノイドキノン：ＭＫ−７ (c)生理的、生化学的性質〔＋；陽性、（＋）；弱陽
性、−；陰性、ＮＴ；未実験〕 グラム染色 ＋ ＫＯＨ反応 − カプセル形成 − 抗酸性染色 − ＯＦテスト （Ｈｕｇｈ−Ｌｅｉｆｓｏｎ） ＮＴＯＦテ
スト （Ｎ源にＮＨ_４Ｈ_２ＰＯ_４） Ｆ 好気での生育 ＋ 嫌気での生育 ＋ 生育温度 ７０℃ − ６０℃ ＋ ３７℃ ＋ ３０℃ − 食塩耐性 ０％ ＋ ３％ ＋ ５％ − 生育pH５．６ − ６．２ ＋ ９．０ ＋ ゼラチンの分解 − 澱粉の分解 （＋） カゼインの分解 − エスクリンの分解 ＋ チロシンの分解 − アルギニンの分解 − セルロースの分解 − カタラーゼ産生 ＋ オキシダーゼ産生 ＋ レシチナーゼ産生 − ウレアーゼ産生（ＳＳＲ） − ウレアーゼ産生（Ｃｈｒｉｓ） − インドール産生 − 硫化水素産生（酢酸鉛紙で検出） − アセトイン産生（Ｋ_２ＨＰＯ_４） − アセトイン産生（ＮａＣｌ） − ＭＲテスト − 硝酸塩還元テスト（ガス産生） − （ＮＯ_２ ⁻の検出） − （ＮＯ_３ ⁻の検出） ＋ シモンズ培地での利用性 クエン酸塩 − リンゴ酸塩 − マレイン酸塩 − マロン酸塩 − プロピオン酸塩 − グルコン酸塩 − コハク酸塩 − クリステンゼン培地での利用性 クエン酸塩 ＋ リンゴ酸塩 − マレイン酸塩 − マロン酸塩 − プロピオン酸塩 ＋ グルコン酸塩 − コハク酸塩 ＋ グルコースよりガスの産生 − 各種糖類より酸の産生 アドニトール − Ｌ（＋）アラビノース − セロビオース ＋ ヅルシトール − メソ・エリスリトール − フラクトース ＋ フコース ＋ ガラクトース ＋ グルコース ＋ グリセリン ＋ イノシトール ＋ イヌリン ＋ ラクトース ＋ マルトース ＋ マンニトール ＋ マンノース ＋ メレジトース − メリビオース ＋ ラフィノース − ラムノース ＋ Ｄ−リボース ＋ サリシン ＋ Ｌ−ソルボース − ソルビトール − 澱粉 ＋ サッカロース ＋ トレハロース ＋ キシロース − 以上の通り、本菌株の主性状は、グラム陽性の桿状細菌
で、大きさは０．５〜０．７×１．５〜３．５μｍ、周
毛で運動、芽胞形成、多形性なし、グルコースを醗酵的
に分解し、酸を産生する。カタラーゼ・オキシダーゼ産
生。高温性の通性嫌気性であり、これらのグラム陽性桿
菌で芽胞を形成し、好気で生育する特徴から、バチルス
属に属すると判断された。

そこで、本菌株がバチルス属のどの種に属するか否かを
同定した。即ち、Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏ
ｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇ
ｙ，Ｖｏ１．２によれば、高温（５０℃）で生育する菌
種はバチルスアシドカルダリウス（Ｂ．ａｃｉｄｏｃａ
ｌｄａｒｉｕｓ）、バチルスサブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔ
ｉｌｉｓ）、バチルスバジウス（Ｂ．ｂａｄｉｕｓ）、
バチルスブレビス（Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ）、バチルスコア
グランス（Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルスリケニ
フォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチ
ルスパントセンチカス（Ｂ．ｐａｎｔｏｔｈｅｎｔｉｃ
ｕｓ）、バチルスシェゲリ（Ｂ．ｓｃｈｅｇｅｌｌ
ｉ）、バチルスステアロサーモフィルス（Ｂ．ｓｔｅａ
ｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）の９菌種が記載されて
いる。その内で、嫌気下で生育する菌種はバチルスＢ．
ｃｏａｇｕｌａｎｎｓとＢ．ｌｉｃｈｅｎｆｏｒｍｉｓ
の２菌種のみである。即ち、Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｎｓ
（以下、「Ｃ」と略記することがある）およびＢ．ｌｉ
ｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ（以下、「Ｌ」と略記すること
がある）と本菌とを対比した結果は、次の通りである。

尚、Ｃ、Ｌおよび本菌で示される「＋」は陽性、
「（＋）」は弱陽性、「−」は陰性、「ｄ」は菌株によ
って異なる、ＮＤはデータなしであることを示す。

以上対比した結果によれば、本菌株NO.３の諸性状はＢ
ａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓに近いと考えられ
るが、アセトイン産生能、ＤＮＡのＧＣモル％、また上
記対比表には載せていないが、リトモスミルク培地での
反応も違っている。

よって、本菌株を公知のものと区別するため、バチルス
・エスピーNO.３（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．NO.３）と
命名し、通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所に
受託番号微工研条寄第３０１３号（ＦＥＲＭ ＢＰ−３
０１３）として寄託した。

本発明においては、先ずバチルス属に属するミオイノシ
トールデヒドロゲナーゼ生産菌が適当な培地に培養され
る。

上記のミオイノシトールデヒドロゲナーゼ生産菌として
は、前述のバチルス・エスピーNO.３が挙げられるが、
細菌の一般的性状として菌学上の性質は変異し得るもの
であるから、自然的にあるいは通常行われる紫外線照
射、放射線照射または変異誘導剤、例えばＮ−メチル−
Ｎ−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、エチルメタンス
ルホネートなどを用いる人工的変異手段により変異し得
る人工変異株は勿論、自然変異株も含め、バチルス属に
属し、ミオイノシトールデヒドロゲナーゼを生産する能
力を有する菌株は、すべて本発明に使用することができ
る。

上記の培養は、細菌の培養に一般に用いられる条件によ
って行うことができるが、本菌株の培養にあたっては、
ミオイノシトールデヒドロゲナーゼがミオイノシトール
によって誘導的に生成される誘導酵素であることから、
例えばミオイノシトール０．５％〜５％を含む培地で培
養することが、ミオイノシトールデヒドロゲナーゼの生
産性を１０〜３００倍程度良好とするので好ましい。

培地としては、ミオイノシトールを添加する以外に微生
物が同化し得る炭素源、消化し得る窒素源、さらには必
要に応じ、無機塩などを含有させた栄養培地が使用され
る。

同化し得る炭素源としては、グルコース、フラクトー
ス、サッカロースなどが単独または組み合わせて用いら
れる。消化し得る窒素源としては、例えばペプトン、肉
エキス、酵母エキスなどが単独または組み合わせて用い
られる。その他必要に応じてリン酸塩、マグネシウム
塩、カルシウム塩、カリウム塩、ナトリウム塩、その
他、鉄、マンガンなどの種々の重金属塩などが使用され
る。上記以外に公知の同化し得る炭素源、消化し得る窒
素源が使用できることはいうまでもない。

培養は、通常振とうまたは通気攪拌培養などの好気的条
件下で行うのがよく、工業的には深部通気攪拌培養が好
ましい。培養温度はミオイノシトールデヒドロゲナーゼ
生産菌が発育し、本酵素を生産する範囲内で適宜変更し
得るが、通常は４０〜６０℃、特に５０℃付近が好まし
い。培養時間は培養条件によって異なるが、本酵素が最
高力価に達する時期を見計らって適当な時期に培養すれ
ばよいが、通常は１〜２日間程度である。

これらの培地組成、培地の液性、培養温度、攪拌速度、
通気性などの培養条件は使用する菌株の種類や外部の条
件などに応じて好ましい結果が得られるように適宜調
節、選択されることは言うまでもない。液体培養におい
て発泡があるときは、シリコン油、植物油などの消泡剤
が適宜使用される。

このようにして得られたミオイノシトールデヒドロゲナ
ーゼは、主として菌体内に含有されるので、得られた培
養物から濾過または遠心分離等の手段により集菌し、こ
の菌体を超音波処理、フレンチプレス処理、ガラスビー
ズ処理、凍結破砕処理等の機械的破壊手段やリゾチーム
等の酵素的破壊手段等の種々の菌体処理手段を適宜組み
合わせて、粗製のミオイノシトールデヒドロゲナーゼ含
有液が得られる。

次いで、この粗製のミオイノシトールデヒドロゲナーゼ
含有液から公知の蛋白質、酵素等の単離、精製手段を用
いることによりさらに精製されたミオイノシトールデヒ
ドロゲナーゼを得ることができる。例えば粗製のミオイ
ノシトールデヒドロゲナーゼ含有液に、硫安、硫酸ナト
リウム等を添加する塩析沈澱法により本酵素を回収すれ
ばよい。さらにこの沈澱物は、分子篩、各種の樹脂を用
いたクロマトグラフイー法、電気泳動法あるいは超遠心
分析法を適宜組み合わせ用いて、必要に応じて精製すれ
ばよく、その精製手段としては、目的とするミオイノシ
トールデヒドロゲナーゼの性質を利用した手段を用いれ
ばよく、例えば上記の沈澱物を水または緩衝液に溶解し
た後、必要に応じて半透膜にて透析し、さらにＤＥＡＥ
−セルロース、ＤＥＡＥ−セファセル、ＤＥＡＥ−セフ
ァロース、ＤＥＡＥ−セファデックス、Ｑ−セファロー
ス（ファルマシア製）、ＤＥＡＥ−トヨパール（東洋曹
達社製）ハイドロキシルアパタイト等のイオン交換樹脂
や、オクチルセファロース、フェニル−セファロース
（ファルマシア社製）等の疎水クロマト樹脂や、その他
のアフィニティークロマト樹脂が使用される。また、セ
ファデックスＧ−１００、セファアクリルＳ−２００等
のゲル濾過剤による分子篩クロマトや、さらに必要に応
じて透析膜を用いて脱塩すればよい。その後、必要に応
じて糖類、例えばマンニトール、サッカロース、ソルビ
トール等、アミノ酸、例えばグルタミン酸、グリシン
等、ペプタイドまたは蛋白質として牛血清アルブミン等
の安定剤の０．０５〜１０％程度を添加し、凍結乾燥後
の処理により精製されたミオイノシトールデヒドロゲナ
ーゼの粉体を得ることができる。

ミオイノシトールデヒドロゲナーゼの性状は以下の通り
である。

(1)基質特異性 ミオイノシトール １００％ グルコース ０ フルクトース ０ ガラクトース ０ ソルビトール ０ マンノース ０ マルトース ０ サッカロース ０ ラクトース ０ (2)酵素作用 下記式に示すように少なくともミオイノシトールおよび
ＮＡＤ^＋よりミオイノソースおよびＮＡＤＨを生成する
反応を触媒する。

ミオイノシトール＋ＮＡＤ^＋ ミオイノソース^＊＋ＮＡＤＨ＋Ｈ^＋ ＊（２，４，６／３，５−ペンタヒドロキシシクロヘキ
サノン） (3)分子量 １３０，０００±１５，０００ トーソー社製ＴＳＫゲル３０００ＳＷ（０．７５×６０
cm）による値、溶出液；０．２Ｍ ＮａＣｌ含有０．１
Ｍリン酸緩衝液（pH７．０）、標準品はオリエンタル酵
母社製の次の分子量マーカーを使用。

Ｍ．Ｗ．１２，４００ シトクロムＣ Ｍ．Ｗ．３２，０００ アデニレイトキナーーゼ Ｍ．Ｗ．６７，０００ 牛血清アルブミン Ｍ．Ｗ．１４２，０００ ラクテートデヒドロゲナ
ーゼ Ｍ．Ｗ．２９０，０００ グルタメートデヒドロゲ
ナーゼ (4)等電点 pH４．５±０．５ キャリアアンフォライトを用いる焦点電気泳動法により
４℃、７００Ｖの定電圧で４０時間通電した後、分画
し、各画分の酵素活性を測定した。

(5)Ｋｍ値 １００ｍＭ トリス塩酸緩衝液（pH８．５）、 ５Ｕ ジアフォラーゼ（東洋醸造社製）、 １ｍＭ ＮＡＤ^＋（オリエンタル酵母社製）、 ０．０２５％ ＮＴＢ（和光純薬工業社製） ０．１％牛血清アルブミン（シグマ社製） を含む反応液中でミオイノシトールの濃度を変化させ
て、ミオイノシトールに対するＫｍ値を測定した結果
は、０．６４ｍＭの値を示した。

一方、前記反応液中でＮＡＤ^＋の代わりに１５ｍＭのミ
オイノシトールを添加し、ＮＡＤ^＋の濃度を変化させて
ＮＡＤ^＋に対するＫｍ値を測定した結果は、０．００４
ｍＭの値を示した。

また、補酵素として１ｍＭのＮＡＤ^＋の代わりに１ｍＭ
チオＮＡＤ^＋（シグマ社製）を用いて同様にミオイノシ
トールに対するＫｍ値を測定した結果は１０．０ｍＭの
値を示した。

一方、チオＮＡＤ^＋の代わりに１５０ｍＭのミオイノシ
トールを添加したところ、チオＮＡＤ^＋に対するＫｍ値
は０．１７ｍＭの値を示した。さらに、ＮＡＤＰ^＋とミ
オイノシトールとの反応におけるＮＡＤＰ^＋に対するＫ
ｍ値は０．１９ｍＭ、ミオイノシトールに対するＫｍ値
は３０．９１ｍＭであり、さらにまたチオＮＡＤＰ^＋と
ミオイノシトールの反応におけるチオＮＡＤＰ^＋に対す
るＫｍ値は２．５４ｍＭ、ミオイノシトールに対するＫ
ｍ値は１７９．６２ｍＭであった。

また以上のことからも、本酵素はＮＡＤ（Ｐ）^＋のみな
らず、チオＮＡＤ（Ｐ）^＋についても補酵素として利用
するものであることが明らかである。

(6)至適pH 後記の酵素活性測定法に従い、反応液中の１００ｍＭト
リス塩酸緩衝液（pH８．５）に代えて１００ｍＭのリン
酸緩衝液（pH６．５〜８．０、−○−）、トリス塩酸緩
衝液（pH８．０〜９．０、−□−）およびグリシン−水
酸化ナトリウム緩衝液（pH９．０〜１０．０、−■−）
の各緩衝液を用いて測定した活性の相対値の結果は第４
図に示す通りであって、pH９．５付近で最大の活性を示
す。

(7)pH安定性 本酵素（１μ／ｍ）を４０ｍＭの酢酸緩衝液（pH４．
５〜６．０、−▲−）、リン酸緩衝液（pH６．０〜８．
０、−○−）、トリス塩酸緩衝液（pH８．０〜９．５、
−□−）およびグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（pH
９．０〜１０．０、−■−）の各緩衝液で調製し、５０
℃で１５分間加熱処理した後、その残存活性を後記の酵
素活性測定法に従って測定した結果は、第３図に示す通
りであって、pH６．５〜９．０の範囲で８０％以上の活
性を保持している。

(8)熱安定性 本酵素液（１μ／ｍ）を２０ｍＭリン酸緩衝液（pH
７）で調製し、１５分間加熱処理後、その残存活性を後
記の酵素活性測定法に従って測定した結果は、第１図に
示される通りであって、６０℃までは残存活性として９
５％以上を有する安定なものであった。

(9)至適温度 １００ｍＭトリス塩酸緩衝液（pH８．５）を用い、後記
の酵素活性測定法に従い、３５、４０、４５、５０、５
５、６０および６５℃の各温度で１０分間反応後、０．
１Ｎ塩酸２ｍで反応を停止し、波長５５０ｎｍで吸光
度を測定した相対値の結果は、第２図に示す通りであっ
て、６０℃付近で最大の活性を有している。

(10)ミオ・イノシトールデヒドロゲナーゼ活性測定法 反応液組成 １００ｍＭ トリス塩酸緩衝液（pH８．５）、 １５ｍＭ ミオイノシトール（和光純薬社製） １ｍＭ ＮＡＤ^＋（オリエンタル酵母社製） ５Ｕ ジアフォラーゼ（東洋醸造社製）、 ０．０２５％ＮＢＴ（和光純薬工業社製）、 ０．１％牛血清アルブミン（シグマ社製） 酵素活性測定 上記の反応液１ｍを小試験管に入れ、３７℃で５分間
インキュベートした後に、適当に希釈した酵素液０．０
２ｍを添加して攪拌し、反応を開始する。正確に１０
分間反応の後に、０．１Ｎ塩酸２．０ｍを添加して攪
拌し、反応を停止して、Ａ₅₅₀ｎｍを測定して吸光度Ａ
_１を求める。上記反応液よりミオイノシトールを除いた
反応液を用いて同様の測定を行い、その吸光度Ａ_０を求
める。

１８．３；分子吸光係数ｃｍ²／μｍｏｌ Ｘ ；希釈倍数 前記反応式(I)においてＡ_１およびＢ_２はチオＮＡＤＰ
類、チオＮＡＤ類、ＮＡＤＰ類、ＮＡＤ類を示すが、チ
オＮＡＤＰ類またはチオＮＡＤ類としては、例えばチオ
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェート
（チオＮＡＤＰ）、チオニコチンアミドヒポキサンチン
ジヌクレオチドホスフェート、およびチオニコチンアミ
ドアデニンジヌクレオチド（チオＮＡＤ）、チオニコチ
ンアミドヒポキサンチンジヌクレオチドが挙げられ、
又、ＮＡＤＰ類またはＮＡＤ類としては、例えばニコチ
ンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェート（ＮＡＤ
Ｐ）、アセチルピリジンアデニンジヌクレオチドホスフ
ェート（アセチルＮＡＤＰ）、ニコチンアミドヒポキサ
ンチンジヌクレオチドホスフェート（デアミノＮＡＤ
Ｐ）；及びニコチンアミノドアデニンジヌクレオチド
（ＮＡＤ）、アセチルピリジンアデニンジヌクレオチド
（アセチルＮＡＤ）、ニコチンアミドヒポキサンチンジ
ヌクレオチド（デアミノＮＡＤ）が挙げられる。

本発明のＡ_１およびＢ_１において例えばＡ_１がチオＮＡ
Ｄ（Ｐ）類である場合Ｂ_１はＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類であるこ
とが必要であり、Ｂ_１がチオＮＡＤ（Ｐ）類である場合
Ａ_１はＮＡＤ（Ｐ）類であることが必要であり、Ａ_１お
よびＢ_１の関係において１つのチオ型補酵素を使用する
ものである。

又、定量に用いるミオイノシトールデヒドロゲナーゼが
チオＮＡＤ類とＮＡＤ類を補酵素とする場合は、上述の
チオＮＡＤ類とＮＡＤ類より、また、用いるミオイノシ
トールデヒドロゲナーゼがチオＮＡＤ（Ｐ）類及びＮＡ
Ｄ（Ｐ）類を共に補酵素とする場合は、上述のチオＮＡ
Ｄ類及びチオＮＡＤＰ類とＮＡＤ類及びＮＡＤＰ類より
適宜選択して用いればよい。

Ａ_１およびＢ_１の量は、被検体中のミオイノシトールの
量に比較して過剰量であり、またミオイノシトールデヒ
ドロゲナーゼのＡ_１及びＢ_１それぞれに対するＫｍ値に
比較しても過剰量であることが必要であり、特にミオイ
ノシトール量の２０〜１００００倍モルが好ましい。

本発明のミオイノシトール定量用組成物においては、Ａ
_１及びＢ_１の濃度は０．０２〜１００ｍＭ、特に０．０
５〜２０ｍＭが好ましく、ミオイノシトールデヒドロゲ
ナーゼの量は５〜１０００μ／ｍ、特に２０〜５００
μ／ｍが好ましいが、その量は被検体の種類等により
適宜決定することができ、これ以上の量を用いることも
できる。

また、本発明定量法は更に被検体に成分としてミオイ
ノシトールに作用せず、Ｂ_２→Ｂ_１の反応を形成する第
二のデヒドロゲナーゼ及び該第二のデヒドロゲナーゼの
基質を組み合わせて作用せしめることにより、後記反応
式（II）のごとく、Ｂ_１とＢ_２の間にＢ_１の再生のため
の反応系を付与せしめることによりミオイノシトールの
サイクリング反応を形成せしめ得る。この場合、定量の
際には反応により生成したＡ_２の量を測定する。

（式中、Ａ_１はチオＮＡＤＰ類、チオＮＡＤ類、ＮＡＤ
Ｐ類またはＮＡＤ類を示し、Ａ_２はＡ_１の還元型生成物
を示し、Ｂ_１はＡ_１がチオＮＡＤＰ類またはチオＮＡＤ
類のときは還元型ＮＡＤＰ類または還元型ＮＡＤ類を、
Ａ_１がＮＡＤＰ類またはＮＡＤ類のときは還元型チオＮ
ＡＤＰ類または還元型チオＮＡＤ類を示し、Ｂ_２はＢ_１
の酸化型生成物を示し、Ｂ_２→Ｂ_１への反応はＢ_２を補
酵素として第二のデヒドロゲナーゼにてＢ_１を生成する
酵素反応を示す） すなわち、第二のデヒドロゲナーゼはＢ_１の再生のため
に補助的に添加するものであり、これによってＢ_１の使
用量を少なくすることが可能となり、特にＢ_１が高価な
場合は有効である。又、Ｂ_１の代わりにＢ_２あるいはＢ
_１とＢ_２の混合物を用いて反応を行ってもよい。この場
合、Ｂ_１または／及びＢ_２の使用量は特に限定されるも
のではないが、一般的にはＡ_１の１／１０モル以下が好
ましく、より好ましくは１／５０〜１／１０００モルま
たはそれ以下であってもよい。

この成分を用いるミオイノシトール定量用組成物にお
いて、Ａ_１の濃度は０．０２〜１００ｍＭ、特に０．０
５〜２０ｍＭが好ましく、Ｂ_２または／及びＢ_１の濃度
は０．０５〜５０００μＭ、特に５〜５００μＭが好ま
しく、ミオイノシトールデヒドロゲナーゼの濃度は５〜
１０００μ／ｍ、特に２０〜５００μ／ｍが好まし
く、第二のデヒドロゲナーゼはＢ_２に対するＫｍ値（ｍ
Ｍ単位）の２０倍量（μ／ｍ単位）以上になるように
調製すればよく、例えば１〜１００μ／ｍが好まし
く、また第二のデヒドロゲナーゼの基質は過剰量、例え
ば０．０５〜２０ｍＭが好ましい。これらの量は被検体
の種類等により適宜決定することができ、これ以上の量
を用いることもできる。

第二のデヒドロゲナーゼ及び第二のデヒドロゲナーゼの
基質としては、例えば、Ｂ_２がＮＡＤ類またはチオＮＡ
Ｄ類のときは、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ．
１．１．１．１）とエタノール、グリセロールデヒドロ
ゲナーゼ（ＥＣ．１．１．１．６）（Ｅ．Ｃｏｌｉ由
来）とグリセロール、グリセロール−３−リン酸デヒド
ロゲナーゼ（ＥＣ．１．１．１．８）（ウサギ筋肉由
来）とＬ−グリセロール−３−リン酸、リンゴ酸デヒド
ロゲナーゼ（ＥＣ．１．１．１．３７）（ブタ心筋、ウ
シ心筋由来）とＬ−リンゴ酸、グリセロアルデヒドリン
酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ．１．１．１．１２）（ウサ
ギ骨格筋、肝、酵母、Ｅ．Ｃｏｌｉ由来）とＤ−グリセ
ロアルデヒドリン酸とリン酸、Ｂ_２がＮＡＤＰ類または
チオＮＡＤＰ類のときは、グルコース−６−リン酸デヒ
ドロゲナーゼ（ＥＣ．１．１．１．４９）（酵母由来）
とグルコース−６−リン酸、イソクエン酸デヒドロゲナ
ーゼ（ＥＣ．１．１．１．４２）（酵母、ブタ心筋由
来）とイソクエン酸、グリオキシル酸デヒドロゲナーゼ
（ＥＣ．１．２．１．１７）（Ｐｓｕｅｄｏｍｏｎａｓ
ｏｘａｌａｔｉｃｕｓ由来）とＣｏＡとグリオキシル
酸、ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ．１．
１．１．４４）（ラット肝、ビール酵母、Ｅ．Ｃｏｌｉ
由来）と６−ホスホ−Ｄ−グルコン酸、グリセロアルデ
ヒドリン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ．１．２．１．１
３）（植物葉緑体由来）とＤ−グリセロアルデヒド−３
−リン酸とリン酸、ベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼ
（ＥＣ．１．２．１．７）（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ由来）とベンズアルデヒド等が
挙げられる。

更にまた、本発明定量法は更に被検体に成分としてミ
オイノシトールに作用せず、Ａ_２→Ａ_１への反応を形成
する第３のデヒドロゲナーゼ及び該第三のデヒドロゲナ
ーゼの基質を作用せしめることにより、後記反応式（II
I）の如く、Ａ_１とＡ_２の間にＡ_１の再生の為の反応系
を付与せしめることによりミオイノシトールのサイクリ
ング反応を形成し得る。この場合、定量の際にＢ_１の消
費量を測定する。

（式中、Ａ_１はチオＮＡＤＰ類、チオＮＡＤ類、ＮＡＤ
Ｐ類またはＮＡＤ類を示し、Ａ_２はＡ_１の還元型生成物
を示し、Ｂ_１はＡ_１がチオＮＡＤＰ類またはチオＮＡＤ
類のときは還元型ＮＡＤＰ類または還元型ＮＡＤ類を、
Ａ_１がＮＡＤＰ類またはＮＡＤ類のときは還元型チオＮ
ＡＤＰ類または還元型チオＮＡＤ類を示し、Ｂ_２はＢ_１
の酸化型生成物を示し、Ａ_２→Ａ_１への反応はＡ_２を補
酵素として第三のデヒドロゲナーゼにてＡ_１を生成する
酵素反応を示す） すなわち、第三のデヒドロゲナーゼはＡ_１の再生のため
に補助的に添加するものであり、これによってＡ_１の使
用量を少なくすることが可能となり、特にＡ_１が高価な
場合には有効である。又、Ａ_１の代わりにＡ_２あるいは
Ａ_１とＡ_２の混合物を用いて反応を行ってもよい。この
場合、Ａ_１または／及びＡ_２の使用量は特に限定される
ものではないが、一般的にはＢ_１の１／１０モル以下が
好ましく、より好ましくは１／５０〜１／１０００モル
またはそれ以下であってもよい。

この成分を用いるミオイノシトール定量用組成物にお
いて、Ｂ_１の濃度は０．０２〜１００ｍＭ、特に０．０
５〜２０ｍＭが好ましく、Ａ_２または／及びＡ_１の濃度
は０．０５〜５０００μＭ、特に５〜５００μＭが好ま
しく、ミオイノシトールデヒドロゲナーゼの濃度は５〜
１０００μ／ｍ、特に２０〜５００μ／ｍが好まし
く、第三のデヒドロゲナーゼはＡ_２に対するＫｍ値（ｍ
Ｍ値）の２０倍量（μ／ｍ単位）以上になるように調
製すればよく、例えば１〜１００μ／ｍが好ましく、
また第三のデヒドロゲナーゼの基質は過剰量、例えば
０．０５〜２０ｍＭが好ましい。これらの量は被検体の
種類等により適宜決定することができ、これ以上の量を
用いることもできる。

第三のデヒドロゲナーゼ及びその基質としては、例えば
Ａ_１がＮＡＤ類またはチオＮＡＤ類のときは、アルコー
ルデヒドロゲナーゼ（ＥＣ．１．１．１．１）とアセト
アルデヒド、グリセロールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ．
１．１．１．６）（Ｅ．Ｃｏｌｉ由来）とジヒドロキシ
アセトン、グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ
（ＥＣ．１．１．１．８）（ウサギ筋肉由来）とジヒド
ロキシアセトリン酸、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（Ｅ
Ｃ．１．１．１．３７）（ブタ心筋、ウシ心筋由来）と
オギザロ酸、グリセロアルデヒドリン酸デヒドロゲナー
ゼ（ＥＣ．１．１．１．１２）（ウサギ骨格筋、肝、酵
母、Ｅ．Ｃｏｌｉ由来）と１，３−ジホスホ−Ｄ−グリ
セリン酸、Ａ_１がＮＡＤＰ類またはチオＮＡＤＰ類のと
きは、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｅ
Ｃ．１．１．１．４９）（酵母由来）とグルコノラクト
ン−６−リン酸、グリセロアルデヒドリン酸デヒドロゲ
ナーゼ（ＥＣ．１．２．１．１．３）（植物葉緑体由
来）と１，３−ジホスホ−Ｄ−グリセリン等が挙げられ
る。

本発明のミオイノシトール定量用組成物の調製にあたっ
て、使用できるミオイノシトールデヒドロゲナーゼに関
しては、例えば補酵素としてＮＡＤ類（好ましくはＮＡ
Ｄ）、チオＮＡＤ類（好ましくはチオＮＡＤ）、あるい
はＮＡＤＰ類（好ましくはＮＡＤＰ）、チオＮＡＤＰ類
（好ましくはチオＮＡＤＰ）を用いて基質であるミオイ
ノシトールに対する反応性を有するものであればよく、
本発明の知見に基づき、これら補酵素と基質を用いて確
認できるものである。

反応液組成については、使用するミオイノシトールデヒ
ドロゲナーゼの各種補酵素間の相対活性等を考慮して二
種の補酵素を適宜選択し、その後正反応／逆反応の至適
pHの間でpH条件をサイクリング反応が効率よく進行する
ように設定すればよい。例えばＢａｃｉｌｌｕｓ、ｓ
ｐ．NO.３（東洋醸造社製）由来のミオイノシトールデ
ヒドロゲナーゼについてみれば、補酵素にチオＮＡＤを
用いた場合のＮＡＤを用いた場合に対する相対活性は約
１０〜１５％であり、又、正反応の至適pHは９．５付近
で、また逆反応の至適pHは７〜７．５である。本酵素は
更にＮＡＤ類のみでなくＮＡＤＰ類をも補酵素とする。
これら使用する酵素は単独でも、あるいは適宜２種以上
を組み合わせて用いてもよい。

かくして、調製された本発明のミオイノシトール定量用
組成物によって被検体中のミオイノシトールを測定する
には、上記成分〜、〜、あるいは〜及び
を含有する組成物に被検体０．００１〜０．５ｍを加
え、約３７℃の温度にて反応させ、反応開始一定時間後
の２点間の数分ないし数十分間、例えば３分後と４分後
の１分間、または３分後と８分後の５分間における生成
されたＡ_２の量または消費されたＢ_１の量を、それぞれ
の吸収波長に基づく吸光度の変化によって測定すればよ
い。例えば、Ａ_２がチオＮＡＤＨ、Ｂ_１がＮＡＤＨの場
合、Ａ_２の生成を４００ｎｍの吸光度の増加により測定
するか、あるいはＢ_１の消費を３４０ｎｍの吸光度の減
少により測定し、既知濃度のミオイノシトールを用いて
測定したときの値と比較すれば、被検液中のミオイノシ
トール量をリアルタイムで求めることができる。

また、本発明定量法は、被検液中のミオイノシトールそ
のものを酵素サイクリング反応に導くものであり、被検
液中の共存物質の影響を受けにくいため、被検液のブラ
ンク測定を省略することができ、レイトアッセイによる
簡便な測定を成し得る。

尚、本発明においてはＡ_２またはＢ_１の測定に当たり、
吸光度速度の代わりに他の公知の測定法を使用して定量
を行うこともできる。

〔発明の効果〕

上述のごとく、本発明は還元型の吸収波長の異なる補酵
素を用いるため測定誤差を生じず、また、酵素サイクリ
ング反応を組み合わせることによって感度を増大させる
ことができるため、少量の検体で迅速かつ正確に被検体
中のミオイノシトールを定量することができる。特に６
０℃にて９５％以上の残存活性を有する熱に安定なミオ
イノシトールデヒドロゲナーゼを用いることが好まし
い。

〔実施例〕

次いで本発明の実施例および参考例を挙げて具体的に述
べるが、本発明はこれによって何ら限定されるものでな
い。

参考例１ バチルス・エスピーNO.３の培養： 酵母エキス（極東製薬社製）２％、ペプトン（極東製薬
社製）２％、リン酸２カリウム（和光純薬社製）０．２
％、塩化カルシウム（和光純薬社製）０．０２％、硫酸
マグネシウム（和光純薬社製）０．０５％、ミオイノシ
トール（和光純薬社製）２％、pH７．３を含む液体培地
１００ｍを５００ｍ容三角フラスコに分注し、１２
０℃で２０分間加熱滅菌した後、これにバチルス・エス
ピーNO.３の１白金耳を接種し、５０℃で１２０ｒ．
ｐ．ｍ．の振とう培養器で３０時間培養して種母８５ｍ
（酵素活性１．２μ／ｍ）を得た。

一方、上記と同様の培地組成にて消泡剤としてディスフ
ォーム４４２（日本油脂）を０．１％添加した液体培地
２０Ｌを３０Ｌ容ジャーファメンターに仕込み、加熱滅
菌した後に上記の種母８５ｍを移植し、培養温度５０
℃、通気量２０Ｌ／分、内圧０．４kg／ｃｍ²、攪拌速
度１５０ｒ．ｐ．ｍ．で２４時間通気培養し、培養物１
８．０Ｌ（酵素活性１．８μ／ｍ）を得た。

参考例２ 実施例１で得た培養物を遠心分離で集菌し、これに０．
１％リゾチーム（エーザイ社製）を含む２０ｍＭリン酸
緩衝液（pH７．５）５Ｌを加え、３７℃で１時間インキ
ュベイトした後、遠心分離して沈澱物を除去し、上清
４．５Ｌ（６μ／ｍ）を得た。この上清にアセトンを
１．８Ｌ添加攪拌し、生じた沈澱物を遠心分離して集
め、これを２０ｍＭリン酸緩衝液で溶解し１Ｌの粗酵素
液（２４．２μ／ｍ）を得た。この溶液に固形硫安を
２００ｇ溶解し、生じた沈澱物を遠心分離して除去し、
得られた上清に再び固形硫安を５０ｇ溶解した。この処
理液を遠心分離して得られた沈澱物を２０ｍＭリン酸緩
衝液（pH７．５）で溶解し、５００ｍの酵素液（３
６．３μ／ｍ）を得た。この酵素液を透析膜（三光純
薬社製）を用いて２０Ｌの２０ｍＭリン酸緩衝液（pH
７．５）に対して一晩透析し、得られた酵素液を２０ｍ
Ｍリン酸緩衝液（pH７．５）で緩衝化したＤＥＡＥ−セ
ファロースＣＬ−６Ｂ（ファルマシア）２５０ｍのカ
ラムに通し、０．１Ｍ ＫＣｌを含む２０ｍＭリン酸緩
衝液（pH７．５）１Ｌを流した後、次いで０．３Ｍ Ｋ
Ｃｌを含む２０ｍＭリン酸緩衝液（pH７．５）で溶出
し、酵素液３５０ｍ（３５．２μ／ｍ）を得た。得
られた酵素液を１０ｍＭリン酸緩衝液（pH７．０）２０
Ｌに対して一晩透析した。こうして得られた酵素液に牛
血清アルブミン（シグマ社製）を０．２ｇ溶解した後に
凍結乾燥して、凍結乾燥標品１．１ｇ（１０．６μ／m
g）を得た。

実施例１ ＜反応系＞ ４０ｍＭ グリシン−ＮａＯＨ緩衝液（pH
１０．０） ０．２ｍＭ 還元型ＮＡＤ（オリエンタル酵
母） ２ｍＭ チオＮＡＤ（三共） １５０ｕ／ｍ ミオイノシトールデヒドロゲナーゼ
（東洋醸造、バチルス ・エス
ピーNO.３由来） ＜操作＞ 上記試薬１ｍをキュベットにとり、０、１０、２０、
３０、４０、５０μＭのミオイノシトール溶液をそれぞ
れ２０μｌを添加し、３７℃にて反応を開始させた。反
応開始後２分目と７分目の４００ｎｍにおける吸光度を
読み取りその差を求めた。その結果を第５図に示した。
第５図から明らかなように、ミオイノシトール量に対す
る吸光度変化量は良好な直線を示した。

実施例２ ＜反応系＞ ４０ｍＭ グリシン−ＮａＯＨ緩衝液（pH
９．５） ０．１ｍＭ 還元型デアミノＮＡＤ（シグ
マ） ２ｍＭ チオＮＡＤ（三共） ２００ｕ／ｍ ミオイノシトールデヒドロゲナーゼ
（東洋醸造、バチルス ・エス
ピーNO.３由来） ＜操作＞ 上記試薬１ｍをキュベットにとり、０、２、４、６、
８、１０μＭのミオイノシトール溶液をそれぞれ５０μ
ｌ添加し、３７℃にて６０分間反応させたのち、０．５
％ドデシル硫酸ナトリウム液１ｍを加え反応を停止さ
せた。４００ｎｍにける吸光度を測定し、第６図に示す
ようなような良好な定量曲線を得た。

実施例３ ＜反応系＞ ５０ｍＭ グリシン−ＮａＯＨ緩衝液（pH
１０．０） ０．２ｍＭ 還元型ＮＡＤ（オリエンタル酵
母） ４ｍＭ チオＮＡＤ（三共） ２５０ｕ／ｍ ミオイノシトールデヒドロゲナーゼ
（東洋醸造、バチルス ・エス
ピーNO.３由来） ０．２％ トリトンＸ−１００ ＜操作＞ キュベットに上記反応液１ｍを加え、３７℃にて予備
加温する。３種類の血清サンプルをそれぞれについて２
０μｌキュベットに加え、３７℃にて反応を開始させ
た。反応開始後の５分目と６分目の４００ｎｍにおける
吸光度を読み取り、その差を計算した。別に、標準液と
して５０μＭミオイノシトール溶液を、また試薬ブラン
クとしてサンプルの代わりに蒸留水を加えたものそれぞ
れについて同様の測定を行った。標準液の吸光度差より
それぞれの血清サンプルのイノシトール濃度を算出し下
記の表を得た。

実施例４ ＜反応系＞ ４０ｍＭ グリシン−ＮａＯＨ緩衝液（pH
１０．０） １５ｍＭ ＮＡＤＰ（オリエンタル酵母） ５０μＭ チオＮＡＤ（三共） ０．４Ｍ エタノール ３０ｕ／ｍ アルコールデヒドロゲナーゼ（オリエ
ンタル酵母） ２５０ｕ／ｍ ミオイノシトールデヒドロゲナーゼ
（東洋醸造、バチルス ・エス
ピーNO.３由来） ＜操作＞ 上記試薬１ｍをキュベットにとり、０、２０、４０、
６０、８０、１００μＭのミオイノシトール溶液をそれ
ぞれ５０μｌ添加し、３７℃にて反応を開始させた。は
んおう開始後３分目と８分目の３４０ｎｍにおける吸光
度を読み取りその差を求めた。その結果を第７図に示し
た。

実施例５ ＜反応系＞ ５０ｍＭ リン緩衝液（pH７．０） ０．２５ｍＭ 還元型ＮＡＤＰ（オリエンタル
酵母） ５０μＭ チオＮＡＤ（三共） ５ｍＭ ジヒドロキシアセトンリン酸 １０ｕ／ｍ グリセロール−３−リン酸デヒドロゲ
ナーゼ（ベーリンガ ー社製；
ウサギ筋肉由来） ２５０ｕ／ｍ ミオイノシトールデヒドロゲナーゼ
（東洋醸造、バチルス エスピ
ーNO.３由来） ＜操作＞ 上記試薬１ｍをキュベットにとり、０、５０、１０
０、１５０、２００、２５０μＭのミオイノシトール溶
液をそれぞれ５０μｌ添加し、３７℃にて反応を開始さ
せた。はんおう開始後３分目と８分目の３４０ｎｍにお
ける吸光度を読み取りその差を求めた。その結果を第８
図に示した。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明のミオイノシトールデヒドロゲナーゼの
熱安定性を示す曲線、第２図はその至適温度を示す曲
線、第３図はそのpH安定性を示す曲線、第４図はその至
適pHを示す曲線、第５図ないし第８図は本発明に基づく
ミオイノシトールの定量曲線である。

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】被検液に、 チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェ
   ート類（以下、チオＮＡＤＰ類という）およびチオニコ
   チンアミドアデニンジヌクレオチド類（以下、チオＮＡ
   Ｄ類という）のいずれか１つと、ニコチンアミドアデニ
   ンジヌクレオチドホスフェート類（以下、ＮＡＤＰ類と
   いう）およびニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類
   （以下、ＮＡＤ類という）からなる群より選ばれる１つ
   とを補酵素とし、少なくともミオイノシトールを基質と
   してミオイノソースを生成する可逆反応をなすミオイノ
   シトールデヒドロゲナーゼ、 Ａ_１、 Ｂ_１、 を含有する試薬を作用せしめて、次の反応式 （式中、Ａ_１はチオＮＡＤＰ類、チオＮＡＤ類、ＮＡＤ
   Ｐ類またはＮＡＤ類を示し、Ａ_２はＡ_１の還元型生成物
   を示し、Ｂ_１はＡ_１がチオＮＡＤＰ類またはチオＮＡＤ
   類のときは還元型ＮＡＤＰ類または還元型ＮＡＤ類を、
   Ａ_１がＮＡＤＰ類またはＮＡＤ類のときは還元型チオＮ
   ＡＤＰ類または還元型チオＮＡＤ類を示し、Ｂ_２はＢ_１
   の酸化型生成物を示す）で表されるサイクリング反応を
   形成せしめ、該反応によって変化するＡ_２またはＢ_１の
   量を決定することを特徴とするミオイノシトールの高感
   度定量法。
2. 【請求項２】被験液に、 チオＮＡＤＰ類およびチオＮＡＤ類のいずれか１つ
   と、ＮＡＤＰ類およびＮＡＤ類からなる群より選ばれる
   １つとを補酵素とし、少なくともミオイノシトールを基
   質としてミオイノソースを生成する可逆反応をなすミオ
   イノシトールデヒドロゲナーゼ、 Ａ_１、 Ｂ_１または／およびＢ_２、 ミオイノシトールに作用せず、Ｂ_２からＢ_１への反応
   を形成する第二のデヒドロゲナーゼおよび該第二のデヒ
   ドロゲナーゼの基質、を含有する試薬を作用せしめて、
   次の反応式 （式中、Ａ_１はチオＮＡＤＰ類、チオＮＡＤ類、ＮＡＤ
   Ｐ類またはＮＡＤ類を示し、Ａ_２はＡ_１の還元型生成物
   を示し、Ｂ_１はＡ_１がチオＮＡＤＰ類またはチオＮＡＤ
   類のときは還元型ＮＡＤＰ類または還元型ＮＡＤ類を、
   Ａ_１がＮＡＤＰ類またはＮＡＤ類のときは還元型チオＮ
   ＡＤＰ類または還元型チオＮＡＤ類を示し、Ｂ_２はＢ_１
   の酸化型生成物を示し、Ｂ_２からＢ_１への反応はＢ_２を
   補酵素として第二のデヒドロゲナーゼにてＢ_１を生成す
   る酵素反応を示す）で表されるサイクリング反応を形成
   せしめ、該反応によって変化するＡ_２の量を測定するこ
   とを特徴とするミオイノシトールの高感度定量法。
3. 【請求項３】被験液に、 チオＮＡＤＰ類およびチオＮＡＤ類のいずれか１つ
   と、ＮＡＤＰ類およびＮＡＤ類からなる群より選ばれる
   １つとを補酵素とし、少なくともミオイノシトールを基
   質としてミオイノソースを生成する可逆反応をなすミオ
   イノシトールデヒドロゲナーゼ、 Ａ_１または／およびＡ_２、 Ｂ_１、 ミオイノシトールに作用せず、Ａ_２からＡ_１への反応
   を形成する第三のデヒドロゲナーゼおよび該第三のデヒ
   ドロゲナーゼの基質、を含有する試薬を作用せしめて、
   次の反応式 （式中、Ａ_１はチオＮＡＤＰ類、チオＮＡＤ類、ＮＡＤ
   Ｐ類またはＮＡＤ類を示し、Ａ_２はＡ_１の還元型生成物
   を示し、Ｂ_１はＡ_１がチオＮＡＤＰ類またはチオＮＡＤ
   類のときは還元型ＮＡＤＰ類または還元型ＮＡＤ類を、
   Ａ_１がＮＡＤＰ類またはＮＡＤ類のときは還元型チオＮ
   ＡＤＰ類または還元型チオＮＡＤ類を示し、Ｂ_２はＢ_１
   の酸化型生成物を示し、Ａ_２からＡ_１への反応はＡ_２を
   補酵素として第三のデヒドロゲナーゼにてＡ_１を生成す
   る酵素反応を示す）で表されるサイクリング反応を形成
   せしめ、該反応によって変化するＢ_１の量を測定するこ
   とを特徴とするミオイノシトールの高感度定量法。
4. 【請求項４】チオＮＡＤＰ類が、チオニコチンアミドア
   デニンジヌクレオチドホスフェート（チオＮＡＤＰ）ま
   たはチオニコチンアミドピポキサンチンジヌクレオチド
   ホスフェートである請求項(1)から(3)のいずれかの請求
   項記載のミオイノシトールの高感度定量法。
5. 【請求項５】チオＮＡＤ類が、チオニコチンアミドアデ
   ニンジヌクレオチド（チオＮＡＤ）またはチオニコチン
   アミドピポキサンチンジヌクレオチドである請求項(1)
   から(3)のいずれかの請求項記載のミオイノシトールの
   高感度定量法。
6. 【請求項６】ＮＡＤＰ類が、ニコチンアミドアデニンジ
   ヌクレオチドホスフェート（ＮＡＤＰ）、アセチルピリ
   ジンアデニンジヌクレオチドホスフェート（アセチルＮ
   ＡＤＰ）およびニコチンアミドピポキサンチンジヌクレ
   オチドホスフェート（デアミノＮＡＤＰ）からなる群よ
   り選ばれた補酵素である請求項(1)から(3)のいずれかの
   請求項記載のミオイミノシトールの高感度定量法。
7. 【請求項７】ＮＡＤ類が、ニコチンアミドアデニンジヌ
   クレオチド（ＮＡＤ）、アセチルピリジンアデニンヌク
   レオチド（アセチルＮＡＤ）およびニコチンアミドピポ
   キサンチンヌクレオチド（デアミノＮＡＤ）からなる群
   より選ばれた補酵素である請求項(1)から(3)のいずれか
   の請求項記載のミオイノシトールの高感度定量法。
8. 【請求項８】次の成分〜 チオＮＡＤＰ類およびＮＡＤ類のいずれか１つと、Ｎ
   ＡＤＰ類およびＮＡＤ類からなる群より選ばれる１つと
   を補酵素とし、少なくともミオイノシトールを基質とし
   てミオイノソースを生成する可逆反応をなすミオイノシ
   トールデヒドロゲナーゼ、 Ａ_１、 Ｂ_１、 （但し、Ａ_１はチオＮＡＤＰ類、チオＮＡＤ類、ＮＡＤ
   Ｐ類またはＮＡＤ類を示し、Ｂ_１はＡ_１がチオＮＡＤＰ
   類またはチオＮＡＤ類のときは還元型ＮＡＤＰ類または
   還元型ＮＡＤ類を、Ａ_１がＮＡＤＰ類またはＮＡＤ類の
   ときは還元型チオＮＡＤＰ類または還元型チオＮＡＤ類
   を示す）を含有することを特徴とするミオイノシトール
   定量用組成物。
9. 【請求項９】次の成分〜 チオＮＡＤＰ類およびチオＮＡＤ類のいずれか１つ
   と、ＮＡＤＰ類およびＮＡＤ類からなる群より選ばれる
   １つとを補酵素とし、少なくともミオイノシトールを基
   質としてミオイノソースを生成する可逆反応をなすミオ
   イノシトールデヒドロゲナーゼ、 Ａ_１、 Ｂ_１または／およびＢ_２、 ミオイノシトールに作用せず、Ｂ_２からＢ_１への反応
   を形成する第二のデヒドロゲナーゼおよび該第二のデヒ
   ドロゲナーゼの基質、 （但し、Ａ_１はチオＮＡＤＰ類、チオＮＡＤ類、ＮＡＤ
   Ｐ類またはＮＡＤ類を示し、Ｂ_１はＡ_１がチオＮＡＤＰ
   類またはチオＮＡＤ類のときは還元型ＮＡＤＰ類または
   還元型ＮＡＤ類を、Ａ_１がＮＡＤＰ類またはＮＡＤ類の
   ときは還元型チオＮＡＤＰ類または還元型チオＮＡＤ類
   を示し、Ｂ_２はＢ_１の酸化型生成物を示す）を含有する
   ことを特徴とするミオイノシトール定量用組成物。
10. 【請求項１０】次の成分〜および チオＮＡＤＰ類およびチオＮＡＤ類のいずれか１つ
    と、ＮＡＤＰ類およびＮＡＤ類からなる群より選ばれる
    １つとを補酵素とし、少なくともミオイノシトールを基
    質としてミオイノソースを生成する可逆反応をなすミオ
    イノシトールデヒドロゲナーゼ、 Ａ_１または／およびＡ_２、 Ｂ_１、 ミオイノシトールに作用せず、Ａ_２からＡ_１への反応
    を形成する第三のデヒドロゲナーゼおよび該第三のデヒ
    ドロゲナーゼの基質、 （但し、Ａ_１はチオＮＡＤＰ類、チオＮＡＤ類、ＮＡＤ
    Ｐ類またはＮＡＤ類を示し、Ｂ_１はＡ_１がチオＮＡＤＰ
    類またはチオＮＡＤ類のときは還元型ＮＡＤＰ類または
    還元型ＮＡＤ類を、Ａ_１がＮＡＤＰ類またはＮＡＤ類の
    ときは還元型チオＮＡＤＰ類または還元型チオＮＡＤ類
    を示し、Ａ_２はＡ_１の還元型生成物を示す）を含有する
    ことを特徴とするミオイノシトール定量用組成物。