JPH10132812A - 走査型光学測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】本発明は、マルチプルセルの判定を精度よく、
しかも速やかに行うことができる走査型光学測定方法を
提供する。 【解決手段】ストリップ内で抽出された細胞領域につい
て複数の画像処理パラメータを用いてマルチプルセルの
判定を行い（ステップ９０１、９０２）、これら複数の
判定結果の中から、予め記憶された細胞領域中の全細胞
数とマルチプルセル数の比率に基づく基準値に最も近い
結果が得られる画像処理パラメータを最適なものとして
選択し（ステップ９０３）、この最適パラメータより得
られた細胞データを採用する（ステップ９０４）。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、細胞集団上にレー
ザビームを走査し、該細胞集団からの光学的データより
形成される画像を用いて測定を行う走査型光学測定方法
に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】従来、スライドガラス上の細胞集団を光
ビーム（レーザー光線）を収束させたスポットで走査
し、この細胞集団の個々の細胞が発する蛍光等を検出し
てデータ処理する、いわゆる走査型サイトメータとし
て、特開平３−２５５３６５号公報に開示されるものが
知られている。すなわち、かかる走査型サイトメータ
は、蛍光色素で生化学的に標識された生物細胞集団の個
々の細胞にレーザスポットを照射、励起し、個々の細胞
が発する蛍光を測定し、得られたデータを細胞集団の免
疫特性、遺伝的特性及び細胞増殖性を表す統計的なデー
タとして解析し、提示することを目的としたものであ
る。

【０００３】走査型サイトメータは、走査波形に従って
駆動するスキャナによってレーザビームを偏向しながら
電動ステージを移動することにより、スライドガラス上
の細胞集団を走査する。そして、この走査によりレーザ
スポットに励起された細胞から発した蛍光を電気信号に
変換し、走査波形とともに出力されるデータ入力信号の
論理に従って収集し、さらに画像を形成し、この画像を
画像処理して、個々の細胞の面積、最大蛍光値、蛍光値
の総和、スライドガラス上の座標などの測定データを抽
出する。

【０００４】そして、このような測定後は、個々の細胞
データを統計的に表示するとともに、統計データ上の癌
等の異常ピークなど、ある部分集合内のデータの座標を
顕微鏡下で再現することにより、個々の細胞の形態を観
察することを可能にしている（リコール機能）。

【０００５】一方、走査型サイトメータと同じ目的を持
つものにフローサイトメータが知られているが、このフ
ローサイトメータは、レーザ及びこのレーザビームを収
束させたスポットが固定され、このスポット上を単離浮
遊状態の細胞がジェット水流として流れ出るようになっ
ており、この走査手法の基本構成において、走査型サイ
トメータと異なっている。また、走査型サイトメータは
先述したように、ある部分集合のデータの座標を顕微鏡
下で再現することにより個々の細胞形態を観察できる
が、フローサイトメータは、単離浮遊液状態の細胞をジ
ェット水流とともに流してしまうため、異常ピークにあ
る部分集合内のデータに対応する細胞を探し出し、形態
を観察することは不可能である。このように機能的にも
走査型サイトメータとフローサイトメータは異なってい
る。

【０００６】ところで、走査型サイトメータに使用する
標本は、浮遊細胞液のスメア、組織細胞のタッチスメア
などスライドガラス上の細胞集団である。そして、サイ
トメータとしては、数千個〜一万個の細胞データを収集
するが、実際のスライドガラス上の細胞は個々が単離し
ているとは限らず、複数の細胞が接触している場合があ
る。このような場合、画像処理によって単離している細
胞（以下、シングルセル）か、複数の細胞が接触して一
つとして認識されている細胞（以下、マルチプルセル）
かを判断している。このように識別された細胞データ
は、ユーザが後で、統計的なデータとして利用するかど
うか選択できるようになっている。

【０００７】しかし、実際にはシングルセルでもマルチ
プルセルと誤認識する場合や、逆にマルチプルセルでも
シングルセルと誤認識する場合がある。これは、マルチ
プルセルの判定が画像処理によって行われ、細胞径や状
態によって最適な画像処理パラメータが異なるためであ
る。

【０００８】図１２（ａ）、（ｂ）は、それぞれＸ軸を
細胞の蛍光値の総和、Ｙ軸を細胞の面積とした時の個々
の細胞の測定結果をプロットした図である。同図中の
（ａ）、（ｂ）は同じデータをもとに表示しているが、
（ｂ）はマルチプルセルと判定された細胞のデータをプ
ロットしないように指定している。この結果、（ｂ）は
（ａ）の約１／５のデータ数になっている。これは、シ
ングルセルをマルチプルセルと誤認識している数が多い
ことに原因している。

【０００９】そこで、従来では、マルチプルセルの認識
精度を上げるために、図１３に示すように、ステップ１
３０１で、データを収集し、ステップ１３０２で、統計
データや個々の細胞形態を参照し、誤認識が高いと判断
すると、ステップ１３０３で画像処理パラメータを設定
し直し、再度ステップ１３０１に戻ってデータを収集す
るようにしている。これは、通常は１回で終了すること
なく何回か繰り返すようにしている。

【００１０】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、このよ
うにデータ収集を１回で終了せず何回か繰り返すので
は、ユーザにとって煩わしい作業となり、さらに、デー
タ収集を繰り返す間に細胞の蛍光の褪色が進んでしまう
こともあり、安定したマルチプルセルの判定ができなく
なるという問題があった。

【００１１】本発明は、上記事情に鑑みてなされたもの
で、マルチプルセルの判定を精度よく、しかも速やかに
行うことができる走査型光学測定方法を提供することを
目的とする。

【００１２】

【課題を解決するための手段】請求項１記載の発明は、
細胞集団上にレーザビームを走査し、該細胞集団からの
光学的データを取り込み画像を形成するとともに、該画
像を用いて測定を行う走査型光学測定方法において、前
記画像の画像処理により細胞領域を抽出するとともに、
該細胞領域に対して予め設定した複数の画像処理パラメ
ータでマルチプルセルの判定を行い、これらの判定結果
から、予め用意される前記細胞領域中の全細胞数とマル
チプルセル数の比率に基づく基準値に最も近い結果が得
られる画像処理パラメータを最適な画像処理パラメータ
として選択するようにしている。

【００１３】請求項２記載の発明は、細胞集団上にレー
ザビームを走査し、該細胞集団からの光学的データを取
り込み画像を形成するとともに、該画像を用いて測定を
行う走査型光学測定方法において、前記画像の画像処理
により細胞領域を抽出するとともに、該細胞領域に対し
て予め設定した複数の異なる画像処理パラメータでマル
チプルセルの判定を行い、これらの判定結果を、予め用
意された論理式に当てはめ、最適な画像処理パラメータ
を選択するようにしている。

【００１４】請求項３記載の発明は、細胞集団上にレー
ザビームを走査し、該細胞集団からの光学的データを取
り込み画像を形成するとともに、該画像を用いて測定を
行う走査型光学測定方法において、前記画像の画像処理
により細胞領域を抽出するとともに、該細胞領域に対し
て予め設定した複数の画像処理パラメータでマルチプル
セルの判定を行い、これらの判定結果から求められる細
胞径の平均値から最適な画像処理パラメータを選択する
ようにしている。

【００１５】この結果、請求項１記載の発明によれば、
パラメータの設定の煩雑さを軽減でき、作業効率を飛躍
的に改善でき、さらに、一度に複数の画像処理パラメー
タを用いてマルチプルセル判定を行うことから、蛍光の
褪色を防止して測定条件を一定にすることができる。

【００１６】請求項２記載の発明によれば、複数の画像
処理パラメータによるマルチプルセルの判定結果を論理
式に当てはめ、最終的な判定結果を求めるようになるの
で、複数のマルチプルセルの判定結果を組み合わせるこ
とで、マルチプルセル判定のための最適な条件を設定で
きる。

【００１７】請求項３記載の発明によれば、画像処理パ
ラメータを、データ収集後の細胞の平均径から割り出し
た値を適用することにより、マルチプルセル判定の煩雑
なパラメータの設定を自動化できる。

【００１８】

【発明の実施の形態】以下、本発明の実施の形態を図面
に従い説明する。 （第１の実施の形態）図１は、本発明の走査型光学測定
方法が適用される走査型光学測定装置の概略構成を示し
ている。

【００１９】この場合、レーザ光源１から出射されたレ
ーザビームは、スポット投影レンズ１８で集光された
後、ダイクロイックミラー２で反射され、さらに紙面に
直交する回転軸を中心に回転するガルバノミラー３で反
射され、瞳投影レンズ４で対物像面に結像され、その
後、光路切替ミラー５に入射される。これにより、レー
ザビームは、回転するガルバノミラー３の存在によって
光路切替ミラー５位置において紙面に沿って上下方向に
走査される。

【００２０】また、レーザビームは、光路切替ミラー５
で反射された後、対物レンズ６に入射され、標本７上に
結像される。この場合、標本７上に結像されるレーザス
ポットは、ガルバノミラー３の回転により標本７面で紙
面に沿って左右方向に走査される。また、ガルバノミラ
ー３により、標本７面でレーザビームを紙面に沿って左
右方向に走査すると同時に、走査ステージ１７を紙面と
直交する方向に移動させることで、標本７面において、
レーザスポットが二次元走査される。

【００２１】この場合、標本７は、細胞集団よりなるも
ので、これら細胞は、予め生化学的に蛍光色素で標識さ
れており、レーザスポットにより励起され蛍光を放射す
る。標本７からの蛍光は、前述した光路を逆に進み、対
物レンズ６、光路切替ミラー５、瞳投影レンズ４、ガル
バノミラー３を経てダイクロイックミラー２の上方へ透
過され、さらにバリアフィルタ１３を透過され、集光レ
ンズ１４により光電子倍増管（ＰＭＴ）１５の受光面に
集光され検出される。また、標本７の散乱光は、コンデ
ンサレンズ８、ダイクロイックミラー９を介してフォト
ダイオード１１によって検出される。

【００２２】一方、透過照明光源１２や落射照明光源１
９を用いることで、通常の顕微鏡として用いることもで
きる。この場合、光路切替ミラー５がレーザ光の光路に
対して挿脱可能に設けられ、この光路切替ミラー５を光
路から取り除くことにより、標本７の観察像を顕微鏡観
察光学系１６に導くようになる。この結果、観察者は、
標本７の透過像や蛍光像を肉眼で顕微鏡観察したりテレ
ビカメラや写真撮影装置で顕微鏡撮影することができ
る。

【００２３】次に、図２は、光電子倍増管１５およびフ
ォトダイオード１１より取り込まれた蛍光を画像に変換
して処理する電気回路および標本７上をレーザスポット
で二次元走査させるための走査制御回路などを示してい
る。

【００２４】この場合、光電子倍増管１５は、３本の光
電子倍増管１５ａ、１５ｂ、１５ｃ（ＰＭＴ１，２，
３）からなり、これら光電子倍増管１５ａ、１５ｂ、１
５ｃから得られる蛍光強度に対応する電気信号は信号処
理回路２０ａ，２０ｂ，２０ｃにより画像データに変換
され、また、フォトダイオード１１（ＰＤ１１）から得
られる散乱光強度に対応する電気信号は信号処理回路２
０ｄにより画像データに変換される。これら信号処理回
路２０ａ〜２０ｄから得られる画像データは、コンピュ
ータ２２で処理され走査画像及び処理画像が作成され
る。

【００２５】また、走査制御回路２３により標本７上の
レーザスポットの二次元走査が制御され、さらに、この
走査制御回路２３を含め信号処理回路２０ａ〜２０ｄの
動作が本体制御部２４により制御される。

【００２６】そして、本体制御部２４のＣＰＵバス３２
には信号処理回路２０ａが接続され、本体制御部２４の
ＣＰＵ３３よりＣＰＵバス３２を介して前記光電子倍増
管（ＰＭＴ１）１５ａの陰極へ信号処理回路２０ａ内部
のＤ／Ａ変換器を介して所定の電圧が印加され倍増率が
制御される。また、ＣＰＵ３３では、光電子倍増管（Ｐ
ＭＴ１）１５ａで検出された光電信号のオフセット調整
電圧を信号処理回路２０ａ内部のオフセット調整回路に
設定する。オフセット調整回路は、設定されたオフセッ
ト調整電圧を内部のＤ／Ａ変換器によって所定の電圧に
変換し、光電子倍増管（ＰＭＴ１）１５ａで検出された
光電信号のオフセット電圧を変更する。

【００２７】他の光電子倍増管（ＰＭＴ２，ＰＭＴ３）
１５ｂ，１５ｃに対する信号処理回路２０ｂ，２０ｃに
ついても、上述した光電子倍増管（ＰＭＴ１）１５ａに
対する信号処理回路２０ａと同一なので、説明を省略す
る。また、フォダイオード１１に対する信号処理回路２
０ｄも陰極電圧印加用のＤ／Ａ変換器が備えられていな
いだけで、他の信号処理回路２０ａ〜２０ｃとほぼ同一
なので、ここでの説明を省略する。

【００２８】また、本体制御部２４のＣＰＵバス３２に
は、ＣＰＵ３３、コンピュータ２２とを間で各種通信を
行うためのＧＰＩＢインターフェース制御回路（ＧＰＩ
ＢＩ／Ｆ）３６、ＲＣＵ３７、入出力回路３８が接続さ
れ、さらに、ＣＰＵバス３２には、走査ステージ１７を
Ｘ軸、Ｙ軸方向へ移動させる２個のステッピングモータ
３９，４０の駆動回路４１，４２、ガルバノミラー３を
駆動する波形を形成する波形発生回路４５、生成された
波形をガルバノミラー３へ印加するためのＤ／Ａ変換器
４６が接続され、かように構成された走査制御回路２３
により走査ステージ１７及びガルバノミラー３の動作を
制御することで、標本７上でのレーザスポットの二次元
走査を可能にしている。

【００２９】一方、コンピュータ２２には、ＧＰＩＢ制
御を行うＧＰＩＢボード４７が設けられ、本体制御部２
４側のＧＰＩＢインターフェース制御回路３６を介し
て、本体制御部２４との間の通信を可能にしている。

【００３０】また、コンピュータ２２は、拡張スロット
に２枚のメモリボード４８ａ，４８ｂと上述した１枚の
ＧＰＩＢボード４７が実装される。これらメモリボード
４８ａ，４８ｂには、２チャンネル分のメモリ回路が実
装されている。そして、メモリボード４８ａのチャンネ
ル１のメモリ回路に信号処理回路２０ａからの転送デー
タが入力され、チャンネル２のメモリ回路に信号処理回
路２０ｂからの転送データが入力され、メモリボード４
８ｂのチャンネル３のメモリ回路に信号処理回路２０ｃ
からの転送データが入力され、チャンネル４のメモリ回
路に信号処理回路２０ｄからの転送データが入力され
る。この場合、各チャンネルは２つのバンクメモリで構
成され、一方のバンクにデータを転送中に、もう一方の
バンクにコンピュータ２２がアクセスできるようになっ
ている。

【００３１】次に、このように構成した走査型光学測定
装置について説明する。まず、図３に示すようにコンピ
ュータ２２により、ユーザが予め設定した走査領域５１
を分割して複数のストリップ５２を作成し、次いで、１
ストリップを走査してデータを収集するためのＧＰＩＢ
コマンドを本体制御部２４のＣＰＵ３３へ送出する。

【００３２】本体制御部２４のＣＰＵ３３では、ＧＰＩ
Ｂコマンドを受信すると、走査制御回路２３を駆動して
走査ステージ１７を走査開始座標へ移動させた後、ガル
バノミラー３へ印加する走査波形を波形発生回路４５よ
り発生させながら走査ステージ１７を移動させて標本７
上をレーザ光で走査させる。

【００３３】すると、信号処理回路２０ａでは、ＣＰＵ
バス３２を介して本体制御部２４のＣＰＵ３３からのデ
ータ収集命令を受けた後に、走査波形のデータ入力信号
と同期して１６ビットデータをメモリボード４８ａの一
方のバンクメモリに順次転送する。

【００３４】そして、標本７上の１ストリップ分の走査
領域を走査し終わったら、信号処理回路２０ａはメモリ
ボード４８ａにデータ転送が終了したことを知らせるデ
ータエンド信号を送る。データエンド信号を受け取った
メモリボード４８ａは、走査データが書き込まれた一方
のバンクメモリをコンピュータ２２がアクセスできる状
態に切り替える。

【００３５】その後、コンピュータ２２は、次の１スト
リップ分の走査領域を走査してデータを収集するＧＰＩ
Ｂコマンドを本体制御部２４のＣＰＵ３３へ送出する。
コンピュータ２２は、収集したデータがアクセスできる
ようになると、転送されたデータをアクセして所定の画
像処理を行い、細胞の座標位置と測光データなどを計測
して記録や表示を行う。

【００３６】次に、各ストリップ５２に於ける画像処理
について説明する。この場合、転送されたデータは、蛍
光値を２次元的に並べた画像データになり、先ず、しき
い値処理によって、細胞領域が抽出される。次に、抽出
された細胞領域毎に、最大蛍光値、合計値、面積等の特
徴量が計算される。このとき、特徴量の一つとして、対
象としている細胞がマルチプルセルかどうかの判断が行
われる。

【００３７】図４は、マルチプルセルの判定方法を説明
するためのもので、同図では、走査画像のうちで２つの
細胞が接触している状態を示している。つまり、この場
合、細胞１，細胞２は、しきい値処理によって抽出され
たが、互いに接触しているため、一つの細胞として認識
されている。

【００３８】このような細胞領域に対しては、先ず領域
内で蛍光値が最大値を示す座標ａを求め、次に、細胞領
域を囲む矩形内で、最大値の座標ａ点から８方向に画像
データをトレースし、最大値以外の座標にピークが存在
するトレースラインが一つでも存在すれば、マルチプル
セルと判断する。図４おいては、トレースライン（１）
（２）（３）（４）のうちトレースライン（１）上に細
胞１，細胞２のピークｂ、ｃが複数存在するのでマルチ
プルセルと判断される。

【００３９】この場合、ノイズや細胞の状態によって
は、シングルセルでもピークが複数存在することが考え
られるので、トレースするときのデータ参照ステップ数
を可変するようにしている。この場合の参照ステップ数
は、図５に示すように、細胞領域をトレースするとき
は、走査画像のデータ参照する間隔を示す値であり、参
照ステップ数を小さくするとマルチプルセルの検出感度
が敏感になり、シングルセルをマルチプセルと誤認識す
る頻度が高くなる。逆に、参照ステップ数を大きくする
とマルチプセルをシングルセルと認識する頻度が高くな
る。

【００４０】図６（ａ）（ｂ）（ｃ）は、ステップ数を
４、２、１と変化させてデータを収集し、マルチプルセ
ルと判断されたデータは表示しないように指定したプロ
ット図を示すもので、これらの図からステップ数が小さ
い程マルチプルセルと判断されるデータが多くなること
が分かる。

【００４１】しかして、この実施の形態では、以下のよ
うにしてマルチプルセルの判定を行い、その結果から細
胞データを決定するようにしている。マルチプルセルの
判定は、図７に示すフローチャートが実行される。ま
ず、マルチプルセルの判定に使用する画像処理パラメー
タを予め用意しておく。ここでのパラメータは参照ステ
ップ数のことであり、パラメータ１が参照ステップ数
１、パラメータ２が参照ステップ数２、パラメータ３が
参照ステップ数３、パラメータｉが参照ステップ数ｉ…
のように対応している。

【００４２】そして、ステップ７０１で、パラメータ
１、つまりｉ＝１を設定し、ステップ７０２で、パラメ
ータ１によるマルチプルセル判定を行い、ステップ７０
３で、判定結果を結果１に保存し、以下、ステップ７０
４で、ｉ＜パラメータ数が判断されるまで、ステップ７
０５で、ｉを＋１しながら同様な動作を繰り返し、パラ
メータ数ｎまでの判定結果を結果１から結果ｎに保存し
ていく。

【００４３】このようにして、１ストリップ内で抽出さ
れた個々の細胞領域の特徴量を求めるのに、複数の画像
処理パラメータによるマルチプルセルの判定を行う。ま
た、このような処理をストリップ内で抽出された全ての
細胞について行い、ユーザが指定した走査範囲を全て処
理した時点でデータの収集を終了する。

【００４４】この場合、それぞれの判定結果１〜ｎは、
図８に示すようなテーブルによってパラメータ１の場合
の判定結果、パラメータ２の場合の判定結果…のように
個々の細胞データについて記憶するようにする。

【００４５】そして、これらの判定結果の中から細胞デ
ータを決定するには、図９に示すフローチャートが実行
される。まず、ステップ９０１で、データを収集する。
このデータ収集は、上述した図７に示すフローチャート
により行われる。

【００４６】次いで、ステップ９０２に進み、各画像処
理パラメータによる収集データを参照し、ステップ９０
３で、最適な画像処理パラメータを選択する。この場合
の画像処理パラメータの選択基準は、測定対象となる細
胞集団によって経験的に求められるもので、例えば、細
胞集団によって妥当と考えられる領域中の全細胞数とマ
ルチプルセル数の比率を基準値とし予め記憶しておき、
上述の判定結果１〜ｎの中から基準値に最も近い細胞デ
ータが得られる画像処理パラメータを最適なものとして
選択するようにする。そして、ステップ９０４で、最適
の画像処理パラメータにより得られた細胞データは、さ
らに画像処理が実行され、細胞の座標位置や測光データ
などが計測され、記録や表示が行われる。

【００４７】従って、このようにすれば、ストリップ内
で抽出された細胞領域について複数の画像処理パラメー
タを用いてマルチプルセルの判定を行い、これら複数の
判定結果の中から、予め記憶された細胞領域中の全細胞
数とマルチプルセル数の比率に基づく基準値に最も近い
結果が得られる画像処理パラメータを最適なものとして
選択し、この最適パラメータより得られた細胞データを
採用するようにしたので、従来のユーザの判断で画像処
理パラメータを設定し直しながらデータ収集を繰り返す
のと比べ、パラメータの設定の煩雑さを軽減でき、作業
効率を飛躍的に改善できる。しかも、一度に複数の画像
処理パラメータを用いてマルチプルセル判定を行うこと
から、蛍光の褪色を防止して測定条件を一定にすること
ができ、精度の高いマルチプルセルの判定を行うことが
できる。

【００４８】なお、上述では、マルチプルセルの判定に
８方向にトレースして画像処理パラメータに参照ステッ
プ数を用いているが、他のパラメータに置き換えて処理
できることは言うまでもない。例えば、細胞領域内の細
胞の異形度（細胞の外周＾２／面積）（ここで、外周＾
２は、外周の二乗の意味である。）を求め、しきい値に
より判定する方法や細胞領域内の各細胞の蛍光値の標準
偏差を求め、しきい値により判定する方法があり、さら
に、シングルセルの蛍光像を２次元的な正規分布でモデ
ル化し、細胞領域内のデータをデコンボリューションに
よって複数の２次元的な正規分布に分割することによっ
てマルチプルセルと判定する方法などがある。 （第２の実施の形態）上述の第１の実施の形態では、画
像処理パラメータとして参照ステップ数を用いたが、こ
の第２の実施の形態では、参照ステップ数の他に、細胞
領域内の異形度（細胞の外周＾２／面積）および細胞領
域内の蛍光値の標準偏差を用いるようにしている。

【００４９】また、この第２の実施の形態の光学的構
成、電気的構成については、上述した図１および図２と
同様なので、これらの図を援用するものとする。この場
合、パラメータ１として細胞領域内の細胞の異形度（細
胞の外周＾２／面積）により設定したしきい値、パラメ
ータ２として細胞領域内の蛍光値の標準偏差により設定
したしきい値、パラメータ３として所定の参照ステップ
数をそれぞれ設定している。

【００５０】この状態で、図１０に示すフローチャート
が実行される。まず、ステップ１００１で、データ収集
時にストリップ内で抽出された細胞領域について、
（１）細胞の異形度に対するパラメータ１によるしきい
値処理、（２）細胞領域内の蛍光値の標準偏差に対する
パラメータ２のしきい値処理、（３）参照ステップ数を
パラメータ３としたマルチプルセル判定処理を順番に行
い、これらの判定結果を、それぞれ判定結果１〜３に保
存する。

【００５１】次に、ステップ１００２に進み、これらの
判定結果１〜３を予め用意された論理式に当てはめ、マ
ルチプルセルの判定結果の採用の可否を決定する。この
場合の論理式は、測定対象となる細胞集団によって経験
的に設定されるもので、例えば、細胞集団によって妥当
な論理式として、（結果１）ＡＮＤ（結果２）ＡＮＤ
（結果３）とした場合は、全のマルチプルセル判定条件
を満たしている場合のみ、この時のマルチプルセルの判
定結果を採用し、また、（結果１）ＯＲ（結果２）ＯＲ
（結果３）とした場合は、何れかのマルチプルセル判定
条件を満たしている場合に、この時のマルチプルセルの
判定結果を採用するようにしている。そして、データの
後処理としてステップ１００３で、採用されたマルチプ
ルセルの判定結果による細胞データは、さらに画像処理
が実行され、細胞の座標位置や測光データなどが計測さ
れ、記録や表示が行われる。

【００５２】また、このフローとは別に、抽出した細胞
について画像処理により細胞の座標位置や測光データな
どを計測し、これらのデータ解析時に複数のマルチプル
セルの判定結果に論理式を当て嵌めて最終的な判定結果
を求め、解析処理することもできる。

【００５３】従って、このようにすれば、複数の画像処
理パラメータによるマルチプルセルの判定結果を論理式
に当てはめ、最終的な判定結果を求めるようにしたの
で、複数のマルチプルセルの判定結果を任意に組み合わ
せることで、マルチプルセル判定のための最適な条件を
設定でき、精度の高いマルチプルセルの判定を行うこと
ができる。

【００５４】なお、第２の実施の形態では、３つのパラ
メータを使用した場合を述べているが、このパラメータ
数は３つ以上であってもよいことは勿論である。 （第３の実施の形態）第１の実施の形態では、画像処理
パラメータの選択の根拠に参照ステップ数を用いたが、
この第３の実施の形態では、収集したデータから細胞径
の平均値を用いてマルチプルセルの判定を行うようにし
ている。

【００５５】また、この第３の実施の形態の光学的構
成、電気的構成についても、上述した図１および図２と
同様なので、これらの図を援用するものとする。そし
て、図１１に示すフローチャートが実行される。まず、
ステップ１１０１で、第１の実施の形態と同様に、測定
対象となる細胞集団に対して複数のパラメータによるマ
ルチプルセルの判定を行いながら、データを収集する。
次いで、ユーザが指定した走査範囲を全て処理した後
に、ステップ１１０２で、収集したデータから細胞径の
平均値を求める。そして、ステップ１１０３で、この平
均値の１／ｋに最も近い参照ステップ数でマルチプルセ
ルを検出したデータを解析処理に採用する。

【００５６】この場合の平均値の１／ｋは、測定対象と
なる細胞集団によって経験的に設定されるもので、細胞
集団によって妥当なｋが用意されている。従って、この
ようにすればマルチプルセル判定の煩雑なパラメータの
設定を自動化でき、ユーザ操作の省力化を実現できる。

【００５７】

【発明の効果】以上述べたように、本発明によれば、パ
ラメータの設定の煩雑さを軽減でき、作業効率を飛躍的
に改善でき、さらに、一度に複数の画像処理パラメータ
を用いてマルチプルセル判定を行うことから、蛍光の褪
色を防止して測定条件を一定にでき、精度の高いマルチ
プルセルの判定を行うことができる。

【００５８】また、複数の画像処理パラメータによるマ
ルチプルセルの判定結果を論理式に当てはめ、最終的な
判定結果を求めるようになるので、複数のマルチプルセ
ルの判定結果を組み合わせることで、マルチプルセル判
定のための最適な条件を設定でき、精度の高いマルチプ
ルセルの判定を行うことができる。

【００５９】さらに、画像処理パラメータを、データ収
集後の細胞の平均径から割り出した値を適用することに
より、マルチプルセル判定の煩雑なパラメータの設定を
自動化でき、ユーザ操作の省力化を実現できる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の第１の実施の形態の走査型光学測定方
法が適用される走査型光学測定装置の概略構成を示す
図。

【図２】第１の実施の形態に適用される走査型光学測定
装置の電気回路および走査制御回路の概略構成を示す
図。

【図３】第１の実施の形態においてユーザが予め分割設
定する複数のストリップを有する走査領域を示す図。

【図４】第１の実施の形態のマルチプルセル判定の考え
方を説明するための図。

【図５】第１の実施の形態のマルチプルセル判定の考え
方を説明するための図。

【図６】第１の実施の形態においてステップ数を変化さ
せてデータを収集した場合の結果を説明する図。

【図７】第１の実施の形態のマルチプルセルの判定方法
を説明するフローチャート。

【図８】第１の実施の形態のマルチプルセルの判定結果
を記憶するためのテーブルを示す図。

【図９】第１の実施の形態のマルチプルセルの判定方法
を説明するフローチャート。

【図１０】本発明の第２の実施の形態を説明するための
フローチャート。

【図１１】本発明の第３の実施の形態を説明するための
フローチャート。

【図１２】従来のマルチプルセルの判定方法を説明する
ための図。

【図１３】従来のマルチプルセルの判定方法を説明する
ための図。

【符号の説明】

１…レーザ光源、 ２…ダイクロイックミラー、 ３…ガルバノミラー、 ４…瞳投影レンズ、 ５…光路切替ミラー、 ６…対物レンズ、 ７…標本、 ８…コンデンサレンズ、 ９…ダイクロイックミラー、 １１…フォトダイオード、 １２…透過照明光源、 １３…バリアフィルタ、 １４…集光レンズ、 １５…光電子倍増管（ＰＭＴ）、 １６…顕微鏡観察光学系、 １７…走査ステージ、 １８…スポット投影レンズ、 １９…落射照明光源、 ２０ａ〜２０ｄ…信号処理回路、 ２２…コンピュータ、 ２３…走査制御回路、 ２４…本体制御部、 ３２…ＣＰＵバス、 ３３…ＣＰＵ、 ３６…ＧＰＩＢインターフェース制御回路、 ３７…ＲＣＵ、 ３８…入出力回路、 ３９、４０…ステッピングモータ、 ４１、４２…駆動回路、 ４５…波形発生回路、 ４６…Ｄ／Ａ変換器、 ４７…ＧＰＩＢボード、 ４８ａ、４８ｂ…メモリボード。

【手続補正書】

【提出日】平成９年４月２日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】請求項２

【補正方法】変更

【補正内容】

【手続補正２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００２１

【補正方法】変更

【補正内容】

【００２１】この場合、標本７は、細胞集団よりなるも
ので、これら細胞は、予め生化学的に蛍光色素で標識さ
れており、レーザスポットにより励起され蛍光を放射す
る。標本７からの蛍光は、前述した光路を逆に進み、対
物レンズ６、光路切替ミラー５、瞳投影レンズ４、ガル
バノミラー３を経てダイクロイックミラー２の上方へ透
過され、さらにバリアフィルタ１３を透過され、集光レ
ンズ１４により光電子倍増管（ＰＭＴ）１５の受光面に
集光され検出される。また、標本７の散乱光は、コンデ
ンサレンズ８、ビームスプリッター９を介してフォトダ
イオード１１によって検出される。

【手続補正３】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００２８

【補正方法】変更

【補正内容】

【００２８】また、本体制御部２４のＣＰＵバス３２に
は、ＣＰＵ３３、コンピュータ２２との間で各種通信を
行うためのＧＰＩＢインターフェース制御回路（ＧＰＩ
ＢＩ／Ｆ）３６、ＲＣＵ３７、入出力回路３８が接続さ
れ、さらに、ＣＰＵバス３２には、走査ステージ１７を
Ｘ軸、Ｙ軸方向へ移動させる２個のステッピングモータ
３９，４０の駆動回路４１，４２、ガルバノミラー３を
駆動する波形を形成する波形発生回路４５、生成された
波形をガルバノミラー３へ印加するためのＤ／Ａ変換器
４６が接続され、かように構成された走査制御回路２３
により走査ステージ１７及びガルバノミラー３の動作を
制御することで、標本７上でのレーザスポットの二次元
走査を可能にしている。

【手続補正４】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】符号の説明

【補正方法】変更

【補正内容】

【符号の説明】 １…レーザ光源、 ２…ダイクロイックミラー、 ３…ガルバノミラー、 ４…瞳投影レンズ、 ５…光路切替ミラー、 ６…対物レンズ、 ７…標本、 ８…コンデンサレンズ、 ９…ビームスプリッター、 １１…フォトダイオード、 １２…透過照明光源、 １３…バリアフィルタ、 １４…集光レンズ、 １５…光電子倍増管（ＰＭＴ）、 １６…顕微鏡観察光学系、 １７…走査ステージ、 １８…スポット投影レンズ、 １９…落射照明光源、 ２０ａ〜２０ｄ…信号処理回路、 ２２…コンピュータ、 ２３…走査制御回路、 ２４…本体制御部、 ３２…ＣＰＵバス、 ３３…ＣＰＵ、 ３６…ＧＰＩＢインターフェース制御回路、 ３７…ＲＣＵ、 ３８…入出力回路、 ３９、４０…ステッピングモータ、 ４１、４２…駆動回路、 ４５…波形発生回路、 ４６…Ｄ／Ａ変換器、 ４７…ＧＰＩＢボード、 ４８ａ、４８ｂ…メモリボード。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｇ０２Ｂ 21/00 Ｇ０２Ｂ 21/00 Ｇ０６Ｔ 7/00 Ｇ０６Ｆ 15/62 ３９５

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 細胞集団上にレーザビームを走査し、該
   細胞集団からの光学的データを取り込み画像を形成する
   とともに、該画像を用いて測定を行う走査型光学測定方
   法において、 前記画像の画像処理により細胞領域を抽出するととも
   に、該細胞領域に対して予め設定した複数の画像処理パ
   ラメータでマルチプルセルの判定を行い、これらの判定
   結果から、予め用意される前記細胞領域中の全細胞数と
   マルチプルセル数の比率に基づく基準値に最も近い結果
   が得られる画像処理パラメータを最適な画像処理パラメ
   ータとして選択することを特徴とする走査型光学測定方
   法。
2. 【請求項２】 細胞集団上にレーザビームを走査し、該
   細胞集団からの光学的データを取り込み画像を形成する
   とともに、該画像を用いて測定を行う走査型光学測定方
   法において、尾や寄れろ目 前記画像の画像処理により
   細胞領域を抽出するとともに、該細胞領域に対して予め
   設定した複数の異なる画像処理パラメータでマルチプル
   セルの判定を行い、これらの判定結果を、予め用意され
   た論理式に当てはめ、最適な画像処理パラメータを選択
   することを特徴とする走査型光学測定方法。
3. 【請求項３】 細胞集団上にレーザビームを走査し、該
   細胞集団からの光学的データを取り込み画像を形成する
   とともに、該画像を用いて測定を行う走査型光学測定方
   法において、 前記画像の画像処理により細胞領域を抽出するととも
   に、該細胞領域に対して予め設定した複数の画像処理パ
   ラメータでマルチプルセルの判定を行い、これらの判定
   結果から求められる細胞径の平均値から最適な画像処理
   パラメータを選択することを特徴とする走査型光学測定
   方法。