JPH1014570A - 抗体ｄｎａ - Google Patents
抗体ｄｎａInfo
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- JPH1014570A JPH1014570A JP19409596A JP19409596A JPH1014570A JP H1014570 A JPH1014570 A JP H1014570A JP 19409596 A JP19409596 A JP 19409596A JP 19409596 A JP19409596 A JP 19409596A JP H1014570 A JPH1014570 A JP H1014570A
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- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cdr
- antibody
- monoclonal antibody
- human monoclonal
- cdna
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- Pending
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- Saccharide Compounds (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 破傷風菌による中毒性感染症に対する抗毒素
療法及び予防等に利用できる抗体を遺伝子工学的手法に
より工業的規模で大量生産すること。 【解決手段】 抗体重鎖及び軽鎖の可変領域をコードす
るＤＮＡ。
療法及び予防等に利用できる抗体を遺伝子工学的手法に
より工業的規模で大量生産すること。 【解決手段】 抗体重鎖及び軽鎖の可変領域をコードす
るＤＮＡ。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ヒトモノクローナ
ル抗体をコードするｃＤＮＡ並びに抗体のＣＤＲをコー
ドするＤＮＡに関する。該ヒトモノクローナル抗体は、
破傷風菌による中毒性感染症に対する抗毒素療法及び予
防等に利用することができる。また該ｃＤＮＡ等は、該
ヒトモノクローナル抗体の、遺伝子工学的手法を用いた
工業的規模の大量生産に用いることができる。
ル抗体をコードするｃＤＮＡ並びに抗体のＣＤＲをコー
ドするＤＮＡに関する。該ヒトモノクローナル抗体は、
破傷風菌による中毒性感染症に対する抗毒素療法及び予
防等に利用することができる。また該ｃＤＮＡ等は、該
ヒトモノクローナル抗体の、遺伝子工学的手法を用いた
工業的規模の大量生産に用いることができる。
【０００２】
【従来の技術】ジフテリア、破傷風のウマ抗毒素血清療
法が実用化されて１００年以上になる。その間、抗毒素
療法は、中毒性感染症の治療・予防に大きな効果をあげ
てきた。しかしウマ抗毒素は、ヒトにとって異種タンパ
ク質であり、血清病などの副作用反応の危険がある。そ
こで、副作用のより少ない、より安全な破傷風抗毒素と
して、成人を破傷風トキソイドで免疫したヒト抗血清か
ら調製した、ヒトにとって同種タンパク質である抗破傷
風ヒト免疫グロブリンＧ製剤が先進工業国ではひろく用
いられている。しかしながら、これは、ヒトの免疫血清
を供給源としているため供給に限度があり、かつ肝炎や
ＡＩＤＳなどのウイルス感染の危険がある。ところで、
これまで実用化されている抗毒素はすべていわゆるポリ
クローナル抗体である。これに対して抗体産生能をもつ
リンパ球と永久増殖能をもつミエローマ細胞とを融合さ
せたハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体は、
試験管内で培養することができるので供給が十分できる
うえ、肝炎やＡＩＤＳなどのウイルス感染の危険を回避
することができる。特に、ヒトモノクローナル抗体を用
いる場合には、抗原性の問題ははじめから考えられない
ため、中毒性感染症に対する抗毒素療法だけでなく、ウ
イルス感染症や、がんの免疫療法への応用も期待されて
いる。
法が実用化されて１００年以上になる。その間、抗毒素
療法は、中毒性感染症の治療・予防に大きな効果をあげ
てきた。しかしウマ抗毒素は、ヒトにとって異種タンパ
ク質であり、血清病などの副作用反応の危険がある。そ
こで、副作用のより少ない、より安全な破傷風抗毒素と
して、成人を破傷風トキソイドで免疫したヒト抗血清か
ら調製した、ヒトにとって同種タンパク質である抗破傷
風ヒト免疫グロブリンＧ製剤が先進工業国ではひろく用
いられている。しかしながら、これは、ヒトの免疫血清
を供給源としているため供給に限度があり、かつ肝炎や
ＡＩＤＳなどのウイルス感染の危険がある。ところで、
これまで実用化されている抗毒素はすべていわゆるポリ
クローナル抗体である。これに対して抗体産生能をもつ
リンパ球と永久増殖能をもつミエローマ細胞とを融合さ
せたハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体は、
試験管内で培養することができるので供給が十分できる
うえ、肝炎やＡＩＤＳなどのウイルス感染の危険を回避
することができる。特に、ヒトモノクローナル抗体を用
いる場合には、抗原性の問題ははじめから考えられない
ため、中毒性感染症に対する抗毒素療法だけでなく、ウ
イルス感染症や、がんの免疫療法への応用も期待されて
いる。
【０００３】本発明者らはこれまでの精力的な研究の結
果、破傷風毒素に対して高い毒素中和活性を有する抗破
傷風毒素ヒトモノクローナル抗体を産生するハイブリド
ーマを取得することに成功している（Kamei M. et al.,
Eur. J. Epidemiol., Vol.6, No. 4, p.386-397 (199
0); 及び特開平２−５７１９５）。かかるハイブリドー
マは無血清培地中でも抗体を安定に産生し得ることか
ら、安価で高純度のヒトモノクローナル抗体を得ること
ができる。また、一方で、遺伝子工学的手法はこれまで
インシュリンを初めとする種々の有用タンパク質を工業
的なスケールで大量に製造する技術を与えている。この
遺伝子工学的手法によるモノクローナル抗体の生産はモ
ノクローナル抗体の染色体ＤＮＡ、あるいは相補性ＤＮ
Ａ（ｃＤＮＡ）を取得することに始まる。
果、破傷風毒素に対して高い毒素中和活性を有する抗破
傷風毒素ヒトモノクローナル抗体を産生するハイブリド
ーマを取得することに成功している（Kamei M. et al.,
Eur. J. Epidemiol., Vol.6, No. 4, p.386-397 (199
0); 及び特開平２−５７１９５）。かかるハイブリドー
マは無血清培地中でも抗体を安定に産生し得ることか
ら、安価で高純度のヒトモノクローナル抗体を得ること
ができる。また、一方で、遺伝子工学的手法はこれまで
インシュリンを初めとする種々の有用タンパク質を工業
的なスケールで大量に製造する技術を与えている。この
遺伝子工学的手法によるモノクローナル抗体の生産はモ
ノクローナル抗体の染色体ＤＮＡ、あるいは相補性ＤＮ
Ａ（ｃＤＮＡ）を取得することに始まる。
【０００４】以下に、抗体（免疫グロブリン）のうち、
本発明に関連するヒトのＩｇＧの基本構造および遺伝子
について簡単に述べる。
本発明に関連するヒトのＩｇＧの基本構造および遺伝子
について簡単に述べる。
【０００５】ＩｇＧ分子は、分子量約５０，０００のポ
リペプチド鎖の重鎖および分子量約２５，０００のポリ
ペプチド鎖の短鎖それぞれ２本ずつから構成される。重
鎖−軽鎖間および重鎖−重鎖間はＳ−Ｓ結合によって連
結されている。重鎖および軽鎖のアミノ末端から約１０
０個のアミノ酸配列は、抗原特異的であり、この領域に
よって抗原と結合する。この領域を「可変領域」とい
う。これに続く領域は「定常領域」と呼ばれる一定構造
を有している。重鎖はγ鎖で軽鎖はκ鎖又はλ鎖と呼ば
れる。ある特定のモノクローナル抗体はその重鎖および
軽鎖の可変領域がそれぞれある特定のアミノ酸配列であ
る均質な抗体分子の集団であり、モノクローナル抗体毎
に可変領域のアミノ酸配列が大きく異なる。可変領域は
さらに相補性決定領域群（ＣＤＲ: Complementarity de
termining region）とよばれる超可変領域（Hyper vari
able region ）と、比較的共通性の高い枠組み残基群
（ＦＲ: Framework region）から成る。重鎖、軽鎖には
それぞれ３個のＣＤＲがあり、抗原結合部位は、重鎖と
軽鎖の折りたたみによって集まったＣＤＲによって形成
される。このためモノクローナル抗体の抗原結合の特異
性および結合強度は、おもにＣＤＲのアミノ酸配列が規
定している。
リペプチド鎖の重鎖および分子量約２５，０００のポリ
ペプチド鎖の短鎖それぞれ２本ずつから構成される。重
鎖−軽鎖間および重鎖−重鎖間はＳ−Ｓ結合によって連
結されている。重鎖および軽鎖のアミノ末端から約１０
０個のアミノ酸配列は、抗原特異的であり、この領域に
よって抗原と結合する。この領域を「可変領域」とい
う。これに続く領域は「定常領域」と呼ばれる一定構造
を有している。重鎖はγ鎖で軽鎖はκ鎖又はλ鎖と呼ば
れる。ある特定のモノクローナル抗体はその重鎖および
軽鎖の可変領域がそれぞれある特定のアミノ酸配列であ
る均質な抗体分子の集団であり、モノクローナル抗体毎
に可変領域のアミノ酸配列が大きく異なる。可変領域は
さらに相補性決定領域群（ＣＤＲ: Complementarity de
termining region）とよばれる超可変領域（Hyper vari
able region ）と、比較的共通性の高い枠組み残基群
（ＦＲ: Framework region）から成る。重鎖、軽鎖には
それぞれ３個のＣＤＲがあり、抗原結合部位は、重鎖と
軽鎖の折りたたみによって集まったＣＤＲによって形成
される。このためモノクローナル抗体の抗原結合の特異
性および結合強度は、おもにＣＤＲのアミノ酸配列が規
定している。
【０００６】一方、可変領域は、重鎖ではＶ遺伝子、Ｄ
遺伝子、Ｊ遺伝子、軽鎖ではＶ遺伝子、Ｊ遺伝子にコー
ドされていることが知られている。ヒト重鎖ではＶ遺伝
子が１００個以下、Ｄ遺伝子が６個、Ｊ遺伝子が１２
個、ヒトκ鎖ではＶ遺伝子が１００個以下、Ｊ遺伝子が
５個存在する。Ｂ細胞の分化に伴って、重鎖ではＶ、
Ｄ、Ｊの各遺伝子群の中からそれぞれ任意の１つの遺伝
子が再配列により隣接し、可変領域に相当する遺伝子が
形成される。軽鎖においても同様にＶ、Ｊ遺伝子の再配
列により、可変領域の遺伝子が形成される。また定常領
域をコードする遺伝子は、可変領域遺伝子群の下流に位
置している。この遺伝子は可変領域遺伝子の組換えが終
了すると可変領域遺伝子と連なって発現され、重鎖およ
び軽鎖のポリペプチドが生成される。
遺伝子、Ｊ遺伝子、軽鎖ではＶ遺伝子、Ｊ遺伝子にコー
ドされていることが知られている。ヒト重鎖ではＶ遺伝
子が１００個以下、Ｄ遺伝子が６個、Ｊ遺伝子が１２
個、ヒトκ鎖ではＶ遺伝子が１００個以下、Ｊ遺伝子が
５個存在する。Ｂ細胞の分化に伴って、重鎖ではＶ、
Ｄ、Ｊの各遺伝子群の中からそれぞれ任意の１つの遺伝
子が再配列により隣接し、可変領域に相当する遺伝子が
形成される。軽鎖においても同様にＶ、Ｊ遺伝子の再配
列により、可変領域の遺伝子が形成される。また定常領
域をコードする遺伝子は、可変領域遺伝子群の下流に位
置している。この遺伝子は可変領域遺伝子の組換えが終
了すると可変領域遺伝子と連なって発現され、重鎖およ
び軽鎖のポリペプチドが生成される。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】今回、本発明者らは、
上記抗破傷風毒素ヒトモノクローナル抗体を産生するハ
イブリドーマより採取した伝令ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）をも
とに作製した相補性ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）の中から、該ヒ
トモノクローナル抗体を構成する重鎖及び軽鎖の可変領
域をコードするｃＤＮＡをそれぞれクローニングするこ
とに成功した。さらにこれらのｃＤＮＡの塩基配列を解
明すると共にアミノ酸配列を決定することにも成功し、
本発明を完成した。
上記抗破傷風毒素ヒトモノクローナル抗体を産生するハ
イブリドーマより採取した伝令ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）をも
とに作製した相補性ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）の中から、該ヒ
トモノクローナル抗体を構成する重鎖及び軽鎖の可変領
域をコードするｃＤＮＡをそれぞれクローニングするこ
とに成功した。さらにこれらのｃＤＮＡの塩基配列を解
明すると共にアミノ酸配列を決定することにも成功し、
本発明を完成した。
【０００８】
【課題を解決するための手段】即ち、本発明は、抗体重
鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡが図１に記載のヌク
レオチド配列を含むことを特徴とする、ヒトモノクロー
ナル抗体をコードするｃＤＮＡ、抗体軽鎖の可変領域を
コードするｃＤＮＡが図２に記載のヌクレオチド配列を
含むことを特徴とする、ヒトモノクローナル抗体をコー
ドするｃＤＮＡ、図１に記載のアミノ酸配列から成る抗
体重鎖の可変領域をコードすることを特徴とするＤＮ
Ａ、図２に記載のアミノ酸配列から成る抗体軽鎖の可変
領域をコードすることを特徴とするＤＮＡ、抗体重鎖の
ＣＤＲ−１、ＣＤＲ−２およびＣＤＲ−３がそれぞれ図
１に記載のヌクレオチド配列でコードされることを特徴
とするヒトモノクローナル抗体をコードするｃＤＮＡ、
抗体軽鎖のＣＤＲ−１、ＣＤＲ−２およびＣＤＲ−３が
それぞれ図２に記載のヌクレオチド配列でコードされる
ことを特徴とするヒトモノクローナル抗体をコードする
ｃＤＮＡ、それぞれ図１に記載のアミノ酸配列から成る
抗体重鎖のＣＤＲ−１、ＣＤＲ−２およびＣＤＲ−３を
コードすることを特徴とするＤＮＡ、及びそれぞれ図２
に記載のアミノ酸配列から成る抗体軽鎖のＣＤＲ−１、
ＣＤＲ−２およびＣＤＲ−３をコードすることを特徴と
するＤＮＡ、に係わる。
鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡが図１に記載のヌク
レオチド配列を含むことを特徴とする、ヒトモノクロー
ナル抗体をコードするｃＤＮＡ、抗体軽鎖の可変領域を
コードするｃＤＮＡが図２に記載のヌクレオチド配列を
含むことを特徴とする、ヒトモノクローナル抗体をコー
ドするｃＤＮＡ、図１に記載のアミノ酸配列から成る抗
体重鎖の可変領域をコードすることを特徴とするＤＮ
Ａ、図２に記載のアミノ酸配列から成る抗体軽鎖の可変
領域をコードすることを特徴とするＤＮＡ、抗体重鎖の
ＣＤＲ−１、ＣＤＲ−２およびＣＤＲ−３がそれぞれ図
１に記載のヌクレオチド配列でコードされることを特徴
とするヒトモノクローナル抗体をコードするｃＤＮＡ、
抗体軽鎖のＣＤＲ−１、ＣＤＲ−２およびＣＤＲ−３が
それぞれ図２に記載のヌクレオチド配列でコードされる
ことを特徴とするヒトモノクローナル抗体をコードする
ｃＤＮＡ、それぞれ図１に記載のアミノ酸配列から成る
抗体重鎖のＣＤＲ−１、ＣＤＲ−２およびＣＤＲ−３を
コードすることを特徴とするＤＮＡ、及びそれぞれ図２
に記載のアミノ酸配列から成る抗体軽鎖のＣＤＲ−１、
ＣＤＲ−２およびＣＤＲ−３をコードすることを特徴と
するＤＮＡ、に係わる。
【０００９】特開平２−５７１９５に詳しく記載されて
いるように、本発明のヒトモノクローナル抗体を産生す
るハイブリドーマは、例えば、以下の通り作製すること
ができる。破傷風毒素（Ｔ．Ｔ．）によって免疫され、
高力価の抗破傷風毒素中和抗体を有しているヒトから採
取されたリンパ球を、 in vitro において更にＴ．Ｔ．
により抗原刺激した後に親細胞との融合を行なう。リン
パ球は末梢血から、例えば、フィコールパック（ファル
マシア社）を用いた密度勾配遠心分離法により分離す
る。親細胞としては融合効率がよく、得られたハイブリ
ドーマが比較的安定にＩｇＧタイプの抗体を産生し、し
かもヌードマウスで腹水を容易に生産することのできる
ヒト・マウスヘテロミエローマ、例えば、ＲＦ−Ｓ１を
用いる。親細胞との融合はポリエチレングリコールを用
いた公知の方法で行ない、特異抗体を産生するハイブリ
ドーマの判定は、Ｔ．Ｔ．をコートしたプレートを用い
たＥＩＡ法（酵素免疫測定法）により行なう。クローニ
ングは限界希釈法又は軟寒天法により行なう。抗体はヌ
ードマウスの腹水、又は連続培養装置を用いた培養上清
中から硫安分画法及び／又はProtein-A カラムクロマト
グラフィーにより容易に高純度品を大量に得ることが可
能である。こうして得られたハイブリドーマの産生する
ヒトモノクローナル抗体のうち、破傷風毒素に対する中
和抗体価が数ＩＵ／１００μg ＩｇＧに達するものもあ
り、その一具体例として、平成８年７月４日付で工業技
術院生命工学工業技術研究所に寄託したハイブリドーマ
ＴＴＧ６（微工研菌寄第１５７１９号：ＦＥＲＭＰ−１
５７１９）を挙げることができる。
いるように、本発明のヒトモノクローナル抗体を産生す
るハイブリドーマは、例えば、以下の通り作製すること
ができる。破傷風毒素（Ｔ．Ｔ．）によって免疫され、
高力価の抗破傷風毒素中和抗体を有しているヒトから採
取されたリンパ球を、 in vitro において更にＴ．Ｔ．
により抗原刺激した後に親細胞との融合を行なう。リン
パ球は末梢血から、例えば、フィコールパック（ファル
マシア社）を用いた密度勾配遠心分離法により分離す
る。親細胞としては融合効率がよく、得られたハイブリ
ドーマが比較的安定にＩｇＧタイプの抗体を産生し、し
かもヌードマウスで腹水を容易に生産することのできる
ヒト・マウスヘテロミエローマ、例えば、ＲＦ−Ｓ１を
用いる。親細胞との融合はポリエチレングリコールを用
いた公知の方法で行ない、特異抗体を産生するハイブリ
ドーマの判定は、Ｔ．Ｔ．をコートしたプレートを用い
たＥＩＡ法（酵素免疫測定法）により行なう。クローニ
ングは限界希釈法又は軟寒天法により行なう。抗体はヌ
ードマウスの腹水、又は連続培養装置を用いた培養上清
中から硫安分画法及び／又はProtein-A カラムクロマト
グラフィーにより容易に高純度品を大量に得ることが可
能である。こうして得られたハイブリドーマの産生する
ヒトモノクローナル抗体のうち、破傷風毒素に対する中
和抗体価が数ＩＵ／１００μg ＩｇＧに達するものもあ
り、その一具体例として、平成８年７月４日付で工業技
術院生命工学工業技術研究所に寄託したハイブリドーマ
ＴＴＧ６（微工研菌寄第１５７１９号：ＦＥＲＭＰ−１
５７１９）を挙げることができる。
【００１０】以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説
明する。
明する。
【００１１】
実施例１ｍＲＮＡの調製 （ａ）細胞培養 抗破傷風毒素ヒトモノクローナル抗体産生ハイブリドー
マ細胞株ＴＴＧ６〔前記 Kamei M. et al., Eur. J. Ep
idemiol., Vol. 6, No. 4, p.386-397 (1990）中には
「Ｇ６」として記載されている〕を、２０％ウシ胎児血
清、１０mg／mlのトランスフェリン、０．００４３mg／
mlの亜セレン酸ナトリウム、１．５３mg／mlのエタノー
ルアミン、５mg／mlのインスリンを含有するダルベッコ
変法イーグル培地（DMEM）中、３７℃、５％ＣＯ2 の環
境下で培養した。 （ｂ）総ＲＮＡ回収 対数増殖期にあり、モノクローナル抗体を産生している
ハイブリドーマ細胞株１０7 個をリン酸緩衝生理食塩液
で洗浄後、ＲＮＡの回収に供した。総ＲＮＡの回収は、
Pharmacia社 QuickPrep Total RNA Extraction Kit を
用いて以下のように行なった。ハイブリドーマ細胞を２
０％ FCS-DMEM 培地に１×１０5 cells/mlでまきこん
だ。３日間培養の後、１×１０7 の細胞を得た。細胞を
４℃においてＰＢＳ（予め氷冷しておく）で３回洗浄し
た（２，０００×ｇ，５min)。細胞を５２５μl のLith
ium Chloride Solution に懸濁し、更に４．５μl のβ
メルカプトエタノール、２２５μl の Extraction buff
erを加え、グラス−テフロンホモゲナイザーを用いて氷
冷しながら破砕した（２〜３min)。７５０μl のＣｓＴ
ＦＡを加えて攪拌した後、破砕液を１．５mlの遠心チュ
ーブに移し、１５，０００rpm で３０分遠心分離した。
この沈渣を、１１３μl のExtraction buffer 、２６３
μl のLithium Chloride Solution 、３７５μl のＣｓ
ＴＦＡ混液に懸濁した後、１５０００rpm 、１０分間遠
心分離した。沈渣を７０％エタノールで洗浄（１５００
０rpm 、５分間）したのち、１００μl のＴＥ緩衝液に
溶解し、以下のｃＤＮＡ合成に用いた。
マ細胞株ＴＴＧ６〔前記 Kamei M. et al., Eur. J. Ep
idemiol., Vol. 6, No. 4, p.386-397 (1990）中には
「Ｇ６」として記載されている〕を、２０％ウシ胎児血
清、１０mg／mlのトランスフェリン、０．００４３mg／
mlの亜セレン酸ナトリウム、１．５３mg／mlのエタノー
ルアミン、５mg／mlのインスリンを含有するダルベッコ
変法イーグル培地（DMEM）中、３７℃、５％ＣＯ2 の環
境下で培養した。 （ｂ）総ＲＮＡ回収 対数増殖期にあり、モノクローナル抗体を産生している
ハイブリドーマ細胞株１０7 個をリン酸緩衝生理食塩液
で洗浄後、ＲＮＡの回収に供した。総ＲＮＡの回収は、
Pharmacia社 QuickPrep Total RNA Extraction Kit を
用いて以下のように行なった。ハイブリドーマ細胞を２
０％ FCS-DMEM 培地に１×１０5 cells/mlでまきこん
だ。３日間培養の後、１×１０7 の細胞を得た。細胞を
４℃においてＰＢＳ（予め氷冷しておく）で３回洗浄し
た（２，０００×ｇ，５min)。細胞を５２５μl のLith
ium Chloride Solution に懸濁し、更に４．５μl のβ
メルカプトエタノール、２２５μl の Extraction buff
erを加え、グラス−テフロンホモゲナイザーを用いて氷
冷しながら破砕した（２〜３min)。７５０μl のＣｓＴ
ＦＡを加えて攪拌した後、破砕液を１．５mlの遠心チュ
ーブに移し、１５，０００rpm で３０分遠心分離した。
この沈渣を、１１３μl のExtraction buffer 、２６３
μl のLithium Chloride Solution 、３７５μl のＣｓ
ＴＦＡ混液に懸濁した後、１５０００rpm 、１０分間遠
心分離した。沈渣を７０％エタノールで洗浄（１５００
０rpm 、５分間）したのち、１００μl のＴＥ緩衝液に
溶解し、以下のｃＤＮＡ合成に用いた。
【００１２】実施例２ファーストストランドｃＤＮＡの合成及びＲＴ−ＰＣＲ
法による抗体可変領域ｃＤＮＡの増幅 各モノクローナル抗体の軽鎖、重鎖の可変部領域をコー
ドするｃＤＮＡを得るために、Welschofらの方法（J. I
mmunol. Meth., vol. 179, p.203-214 (1995))に従い、
ＲＴ−ＰＣＲ(Reverse Transcriptase Polymerase Chai
n Reaction）を行なった。ＰＣＲには、ヒトＩｇＧの軽
鎖のアミノ酸の１から１０（kappaCL primer, LambdaCL
primer)及び重鎖のアミノ酸の１から７（IgG primer)
のアミノ酸配列に相当する塩基配列を含むオリゴヌクレ
オチドを forward primer として用いた。また、ヒトＩ
ｇＧκ軽鎖のアミノ酸１０９から１１６（κシリーズ p
rimer)、λ軽鎖のアミノ酸１１５から１２２（λシリー
ズ primer)、重鎖のアミノ酸１１５から１２１（ＶＨシ
リーズ primer)のアミノ酸配列に相当する塩基配列を含
んだオリゴヌクレオチドを back primerとして用いた
（表１）。
法による抗体可変領域ｃＤＮＡの増幅 各モノクローナル抗体の軽鎖、重鎖の可変部領域をコー
ドするｃＤＮＡを得るために、Welschofらの方法（J. I
mmunol. Meth., vol. 179, p.203-214 (1995))に従い、
ＲＴ−ＰＣＲ(Reverse Transcriptase Polymerase Chai
n Reaction）を行なった。ＰＣＲには、ヒトＩｇＧの軽
鎖のアミノ酸の１から１０（kappaCL primer, LambdaCL
primer)及び重鎖のアミノ酸の１から７（IgG primer)
のアミノ酸配列に相当する塩基配列を含むオリゴヌクレ
オチドを forward primer として用いた。また、ヒトＩ
ｇＧκ軽鎖のアミノ酸１０９から１１６（κシリーズ p
rimer)、λ軽鎖のアミノ酸１１５から１２２（λシリー
ズ primer)、重鎖のアミノ酸１１５から１２１（ＶＨシ
リーズ primer)のアミノ酸配列に相当する塩基配列を含
んだオリゴヌクレオチドを back primerとして用いた
（表１）。
【００１３】
【表１】
【００１４】上記ハイブリドーマ株より得た総ＲＮＡ１
μg を鋳型に、 random ９mer をプライマーとして Sup
erscript II reverse transcriptase (GIBCO-BRL社）を
用い、５０mM Tris-HCl (pH 8.3)、４０mM KCl、６mM M
gCl2、１mM DTT、0.７５mM dNTP 、２００unit Supersc
ript II reverse transcriptase を含む反応液中で４５
℃、１時間反応させて第一鎖を合成した。沸騰水中に１
０分間放置し、逆転写酵素を失活させた後、終濃度１μ
M のforward 並びにback primer と混合し、Boehringer
Mannheim 社 Expand Long Template PCR Systemを用い
て、ＰＣＲを行ない〔５０mM Tris-HCl (pH 9.2)、１６
mM (NH4)2SO4、1.７５mM MgCl2、0.３５mM dNTP を含む
反応液中、９４℃３０秒、５５℃６０秒、６８℃３０秒
を１サイクルとし、３５サイクル〕、重鎖ｃＤＮＡ、軽
鎖ｃＤＮＡを増幅した。
μg を鋳型に、 random ９mer をプライマーとして Sup
erscript II reverse transcriptase (GIBCO-BRL社）を
用い、５０mM Tris-HCl (pH 8.3)、４０mM KCl、６mM M
gCl2、１mM DTT、0.７５mM dNTP 、２００unit Supersc
ript II reverse transcriptase を含む反応液中で４５
℃、１時間反応させて第一鎖を合成した。沸騰水中に１
０分間放置し、逆転写酵素を失活させた後、終濃度１μ
M のforward 並びにback primer と混合し、Boehringer
Mannheim 社 Expand Long Template PCR Systemを用い
て、ＰＣＲを行ない〔５０mM Tris-HCl (pH 9.2)、１６
mM (NH4)2SO4、1.７５mM MgCl2、0.３５mM dNTP を含む
反応液中、９４℃３０秒、５５℃６０秒、６８℃３０秒
を１サイクルとし、３５サイクル〕、重鎖ｃＤＮＡ、軽
鎖ｃＤＮＡを増幅した。
【００１５】実施例３増幅断片のサブクローニング 増幅したｃＤＮＡは、Ｔ４ＤＮＡ polymerase （宝酒造
株式会社）を用いて末端を平滑化した後、Ｔ４ polynuc
leotide kinase（宝酒造株式会社）を用いてリン酸化
し、ＥｃｏＲＶ（New England Biolab社）で切断した
後、E. coli alkaline phosphatase（宝酒造株式会社）
で脱リン酸化したpBluescript ＳＫ−（Stratagene社）
ベクターに挿入し、常法に従い、大腸菌ＤＨ−５α株を
形質転換した。その結果、挿入断片を含むものが約８５
％得られた。これらについてアルカリラピッド法を用い
てサイズ確認したところ、２０クローン中９クローンが
目的サイズの断片を含んでいた。そこで次に塩基配列決
定を行った。
株式会社）を用いて末端を平滑化した後、Ｔ４ polynuc
leotide kinase（宝酒造株式会社）を用いてリン酸化
し、ＥｃｏＲＶ（New England Biolab社）で切断した
後、E. coli alkaline phosphatase（宝酒造株式会社）
で脱リン酸化したpBluescript ＳＫ−（Stratagene社）
ベクターに挿入し、常法に従い、大腸菌ＤＨ−５α株を
形質転換した。その結果、挿入断片を含むものが約８５
％得られた。これらについてアルカリラピッド法を用い
てサイズ確認したところ、２０クローン中９クローンが
目的サイズの断片を含んでいた。そこで次に塩基配列決
定を行った。
【００１６】実施例４ pBluescript ＳＫ−にサブクローニングした軽鎖、重鎖
のｃＤＮＡクローンの塩基配列は、Amersham社、Thermo
Sequenase Fluorescent labelled primer cycle seque
ncing kit によりシークエンス反応を行なった後、自動
シークエンサー（LI-COR社、DNA sequencer model 400
0) を用いて解析し、決定した。シークエンス反応は、
Ｍ１３forward primer（５′−ＣＡＣＧＡＣＧＴＴＧＴ
ＡＡＡＡＣＧＡＣ−３′）およびＭ１３ reverse prime
r （５′−ＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧ
−３′）を用いて sense並びにanti-sense鎖の両方につ
いて行ない確認した。その結果、図１及び図２に夫々示
されるような、本発明抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域を
コードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列が得られた。こ
のヌクレオチド配列を翻訳することによって、該抗体重
鎖及び軽鎖の可変領域のアミノ酸配列を解明し、１文字
表記で夫々の図中に示した。
のｃＤＮＡクローンの塩基配列は、Amersham社、Thermo
Sequenase Fluorescent labelled primer cycle seque
ncing kit によりシークエンス反応を行なった後、自動
シークエンサー（LI-COR社、DNA sequencer model 400
0) を用いて解析し、決定した。シークエンス反応は、
Ｍ１３forward primer（５′−ＣＡＣＧＡＣＧＴＴＧＴ
ＡＡＡＡＣＧＡＣ−３′）およびＭ１３ reverse prime
r （５′−ＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧ
−３′）を用いて sense並びにanti-sense鎖の両方につ
いて行ない確認した。その結果、図１及び図２に夫々示
されるような、本発明抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域を
コードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列が得られた。こ
のヌクレオチド配列を翻訳することによって、該抗体重
鎖及び軽鎖の可変領域のアミノ酸配列を解明し、１文字
表記で夫々の図中に示した。
【００１７】図１及び図２に示したアミノ酸配列を、既
知のヒト型抗体のアミノ酸配列データのリスト（Elvin
A. Kabat et al., SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLO
GICAL INTEREST, FIFTH EDITION, U.S. DEPARTMENT OF
HEALTH AND HUMAN SERVICES,Public Health Service, N
ational Institute of Health (1991))と比較し、さら
に図１及び図２の核酸配列及びアミノ酸配列をＤＮＡ及
びタンパク質のデータベース（ＥＭＢＬ−ＧＤＢ（Rele
ase 41) ，ＬＡＳＬ−ＧＤＢ（Release 86) ，ＮＢＲＦ
−ＰＤＢ（Release 43) 及びＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ（Re
lease 30))に対してホモロジー検索を行うことにより、
該抗体重鎖が、サブグループＩ〜III の分類のうちのサ
ブグループIII に属すると判定した。さらに、３つのＣ
ＤＲを挟む位置に存在する４つのＦＲのアミノ酸配列
が、サブグループ毎に大略において保存されていること
から、図１中に示したアミノ酸配列及びそれをコードす
るヌクレオチド配列が、それぞれ該抗体重鎖のＣＤＲ−
１、ＣＤＲ−２及びＣＤＲ−３を含有するものであると
決定した。
知のヒト型抗体のアミノ酸配列データのリスト（Elvin
A. Kabat et al., SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLO
GICAL INTEREST, FIFTH EDITION, U.S. DEPARTMENT OF
HEALTH AND HUMAN SERVICES,Public Health Service, N
ational Institute of Health (1991))と比較し、さら
に図１及び図２の核酸配列及びアミノ酸配列をＤＮＡ及
びタンパク質のデータベース（ＥＭＢＬ−ＧＤＢ（Rele
ase 41) ，ＬＡＳＬ−ＧＤＢ（Release 86) ，ＮＢＲＦ
−ＰＤＢ（Release 43) 及びＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ（Re
lease 30))に対してホモロジー検索を行うことにより、
該抗体重鎖が、サブグループＩ〜III の分類のうちのサ
ブグループIII に属すると判定した。さらに、３つのＣ
ＤＲを挟む位置に存在する４つのＦＲのアミノ酸配列
が、サブグループ毎に大略において保存されていること
から、図１中に示したアミノ酸配列及びそれをコードす
るヌクレオチド配列が、それぞれ該抗体重鎖のＣＤＲ−
１、ＣＤＲ−２及びＣＤＲ−３を含有するものであると
決定した。
【００１８】以上の操作を本発明抗体の軽鎖についても
実施し、夫々の配列を決定した。
実施し、夫々の配列を決定した。
【図１】本発明抗体の重鎖の可変領域のアミノ酸配列及
びそれをコードするヌクレオチド配列。
びそれをコードするヌクレオチド配列。
【図２】本発明抗体の軽鎖の可変領域のアミノ酸配列及
びそれをコードするヌクレオチド配列。
びそれをコードするヌクレオチド配列。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/577 Ｇ０１Ｎ 33/577 Ｂ // Ａ６１Ｋ 39/395 Ａ６１Ｋ 39/395 Ｒ ＡＤＺ ＡＤＺＨ Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｑ 1/68 7823−4Ｂ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ (Ｃ１２Ｎ 15/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19）
Claims (8)
- 【請求項１】 抗体重鎖の可変領域をコードするｃＤＮ
Ａが図１に記載のヌクレオチド配列を含むことを特徴と
する、ヒトモノクローナル抗体をコードするｃＤＮＡ。 - 【請求項２】 抗体軽鎖の可変領域をコードするｃＤＮ
Ａが図２に記載のヌクレオチド配列を含むことを特徴と
する、ヒトモノクローナル抗体をコードするｃＤＮＡ。 - 【請求項３】 図１に記載のアミノ酸配列から成る抗体
重鎖の可変領域をコードすることを特徴とするＤＮＡ。 - 【請求項４】 図２に記載のアミノ酸配列から成る抗体
軽鎖の可変領域をコードすることを特徴とするＤＮＡ。 - 【請求項５】 抗体重鎖のＣＤＲ−１、ＣＤＲ−２およ
びＣＤＲ−３がそれぞれ図１に記載のヌクレオチド配列
でコードされることを特徴とするヒトモノクローナル抗
体をコードするｃＤＮＡ。 - 【請求項６】 抗体軽鎖のＣＤＲ−１、ＣＤＲ−２およ
びＣＤＲ−３がそれぞれ図２に記載のヌクレオチド配列
でコードされることを特徴とするヒトモノクローナル抗
体をコードするｃＤＮＡ。 - 【請求項７】 それぞれ図１に記載のアミノ酸配列から
成る抗体重鎖のＣＤＲ−１、ＣＤＲ−２およびＣＤＲ−
３をコードすることを特徴とするＤＮＡ。 - 【請求項８】 それぞれ図２に記載のアミノ酸配列から
成る抗体軽鎖のＣＤＲ−１、ＣＤＲ−２およびＣＤＲ−
３をコードすることを特徴とするＤＮＡ。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP19409596A JPH1014570A (ja) | 1996-07-05 | 1996-07-05 | 抗体ｄｎａ |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP19409596A JPH1014570A (ja) | 1996-07-05 | 1996-07-05 | 抗体ｄｎａ |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1014570A true JPH1014570A (ja) | 1998-01-20 |
Family
ID=16318872
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP19409596A Pending JPH1014570A (ja) | 1996-07-05 | 1996-07-05 | 抗体ｄｎａ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH1014570A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2018018123A2 (pt) | 2016-07-29 | 2018-02-01 | Fundação Butantan | Anticorpos monoclonais humanos antitetânicos neutralizantes para a infecção por c.tetani, método de obtenção dos ditos anticorpos monoclonais e seu uso na imunoterapia para acidentes susceptíveis à infecção pelo bacilo tetânico |
-
1996
- 1996-07-05 JP JP19409596A patent/JPH1014570A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2018018123A2 (pt) | 2016-07-29 | 2018-02-01 | Fundação Butantan | Anticorpos monoclonais humanos antitetânicos neutralizantes para a infecção por c.tetani, método de obtenção dos ditos anticorpos monoclonais e seu uso na imunoterapia para acidentes susceptíveis à infecção pelo bacilo tetânico |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20051013 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20060530 |