JPH10160732A - 抗チューブリン活性および抵抗性の検出のためのプローブとしてある種のアミドを使用する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 真核細胞の生長を阻害するある種のアミドを
使用する、真核細胞、細胞抽出物およびチューブリン調
製物中のチューブリン含量を監視かつ測定し、抗チュー
ブリン活性、抵抗性の化合物をスクリーニングするため
に有用なバインディングアッセイの実施方法。 【解決手段】 アミドが次の構造式（Ｉ）を有している
前記方法： 【化１】

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】微小管は全ての真核細胞中に存在している
細胞内の繊維状構造物である。分裂紡錘体、中心小体、
基底小体、繊毛、鞭毛、軸足（ａｘｏｐｏｄｉａ）およ
び細胞骨格のような異なった細胞小器官の成分として、
微小管は、有糸分裂中の染色体運動、細胞運動性、細胞
小器官移送、細胞質分裂、細胞板形成、細胞の形状の維
持、植物細胞壁の発生における細胞ミクロフィブリル沈
着物（ｍｉｃｒｏｆｉｂｒｉｌ ｄｅｐｏｓｉｔｉｏ
ｎ）の配向を包含する多くの細胞機能に関与する。微小
管の主成分は、チューブリン（ｔｕｂｕｌｉｎ）であ
り、それはアルファおよびベータと称される２つのサブ
ユニットから構成されるタンパク質である。細胞中のチ
ューブリンの重要な性質は、適当な条件下で重合をして
微小管を形成する能力または解重合をする能力があるこ
とである。また、このプロセスは、単離されたチューブ
リンを使用して生体外で出現させることができる。

【０００２】微小管は、２つの娘核の間で正確に分裂細
胞内に染色体を分布させることに関与する細胞小器官で
ある分裂紡錘体の成分として細胞分裂において重要な役
割を演じる。種々の薬剤および有害生物防除剤は、チュ
ーブリンまたは微小管に結合することによって細胞分裂
を防止する。このメカニズムによって作用する制がん性
薬剤には、アルカロイドのビンクリスチン（ｖｉｎｃｒ
ｉｓｔｉｎｅ）およびビンブラスチン（ｖｉｎｂｌａｓ
ｔｉｎｅ）、およびタクサン−ベース（ｔａｘａｎｅ−
ｂａｓｅｄ）化合物であるパクリタクセル（ｐａｃｌｉ
ｔａｘｅｌ）およびドセタクセル（ｄｏｃｅｔａｘｅ
ｌ）｛例えば、Ｅ．Ｋ．Ｒｏｗｉｎｓｋｙａｎｄ Ｒ．
Ｃ．Ｄｏｎｅｈｏｗｅｒ，Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ
ａｎｄＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，５２，３５−８４
（１９９１）、参照｝が包含される。哺乳類の細胞に対
して活性の他の抗チュ−ブリン化合物（ａｎｔｉｔｕｂ
ｕｌｉｎ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）には、ノコダゾール（ｎ
ｏｃｏｄａｚｏｌｅ）のようなベンゾイミダゾールおよ
びコルヒチン（ｃｏｌｃｈｉｃｉｎｅ）、ポドフィロト
キシン（ｐｏｄｏｐｈｙｌｌｏｔｏｘｉｎ）およびコン
ブレタスタチンス（ｃｏｍｂｒｅｔａｓｔａｔｉｎｓ）
のような天然物が包含される。また、チューブリンに結
合するベンゾイミダゾールは広く使用されている駆虫薬
である｛ＭｃＫｅｌｌａｒ，Ｑ．Ａ．ａｎｄ Ｓｃｏｔ
ｔ，Ｅ．Ｗ．，Ｊ．Ｖｅｔ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈ
ｅｒ．，１３，２２３−２４７（１９９０）、参照｝。
抗チューブリン除草剤は、Ｊ．Ｒ．Ｃｏｒｂｅｔｔ、
Ｋ．ＷｒｉｇｈｔおよびＡ．Ｃ．Ｂａｉｌｌｉｅによる
“Ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｏｄｅ ｏｆ
Ａｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｅｓｔｉｃｉｄｅｓ”，ｐｐ．
２０２−２２３に記載されており、そしてトリフルラリ
ン（ｔｒｉｆｌｕｒａｌｉｎ）のようなジニトロアニリ
ン、クロルプロファム（ｃｈｌｏｒｐｒｏｐｈａｍ）の
ようなＮ−フェニルカルバメート、アミプロフォス−メ
チル（ａｍｉｐｒｏｐｈｏｓ−ｍｅｔｈｙｌ）、および
プロナミド（ｐｒｏｎａｍｉｄｅ）が包含される。チュ
ーブリンに結合することによって作用すると考えられる
殺菌剤には、ザリルアミド（ｚａｒｉｌａｍｉｄｅ）
｛Ｙｏｕｎｇ，Ｄ．Ｈ．ａｎｄ Ｒｅｉｔｚ，Ｅ．
Ｍ．，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ １０ｔ
ｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ
ｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｉｃ Ｆｕｎｇｉｃｉｄｅｓ ａ
ｎｄＡｎｔｉｆｕｎｇａｌ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ，Ｈ．
ＬｙｒおよびＣ．Ｐｏｌｔｅｒによって編集されたＲｅ
ｉｎｈａｒｄｓｂｒｕｎｎ，３８１−３８５，（１９９
３）｝、ベンゾイミダゾールベノミル（ｂｅｎｏｍｙ
ｌ）およびカルベンダジム（ｃａｒｂｅｎｄａｚｉ
ｍ）、およびＮ−フェニルカルバメートジエトフェンカ
ルブ（ｄｉｅｔｈｏｆｅｎｃａｒｂ）｛Ｈ．Ｌｙｒによ
って編集された“Ｍｏｄｅｒｎ Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ
Ｆｕｎｇｉｃｉｄｅｓ”中のＤａｖｉｄｓｅ，Ｌ．Ｃお
よびＩｓｈｉ，Ｈ．３０５−３２２（１９９５）｝が包
含される。

【０００３】薬剤および有害生物防除剤のための生化学
的目標としてのチューブリンの成功のために、チューブ
リンに結合する新規な化合物を見出すことにかなりの関
心がある。種々な無細胞法（ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ ｐｒ
ｏｃｅｓｓ）はそのような化合物を見つけるのに利用で
きる。普通の方法には、生体外において、単離されたチ
ューブリンが重合して微小管になるのを阻害する試験化
合物の能力を測定することが含まれる｛例えば、Ｅ．Ｈ
ａｍｅｌ，Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｒ
ｅｖｉｅｗｓ，１６，２０７−２３１（１９９６）、参
照｝。第２の方法においては、試験用化合物と単離され
たチューブリンとの相互作用により、プローブ（ｐｒｏ
ｂｅ）として使用された第２のチューブリン−バインデ
ィングリガンド（ｔｕｂｕｌｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｌ
ｉｇａｎｄ）の結合に影響を与える試験化合物の能力を
測定することによって、バインダーをアッセイすること
ができる。典型的には、プローブは、結合を測定するの
を可能にするためにラジオラベル（ｒａｄｉｏｌａｂｅ
ｌ）される。チューブリンに結合する試験化合物は、チ
ューブリンタンパク質上でプローブと同じ部位に結合す
ることによって、プローブの結合に影響を与えることが
でき、それゆえ、結合するプローブの量を減少させる。
別法として、結合は試験用化合物がプローブの結合部位
とは異なる部位に結合し、チューブリンタンパク質の高
次構造の変化を誘発し、プローブの結合部位に影響を及
ぼす「アロステリック（ａｌｌｏｓｔｅｒｉｃ）」相互
作用の手段により影響される。そのようなアロステリッ
ク相互作用は、プローブの結合を増加させるかまたは減
少させる。第３の方法としては、チューブリンと会合さ
せたグアノシントリホスファターゼ活性についての試験
用化合物の影響を測定することがある｛Ｄｕａｎｍｕ，
Ｃ．，Ｓｈａｈｒｉｋ，Ｌ．Ｋ．，Ｈｏ，Ｈ．Ｈ．およ
びＨａｍｅｌ，Ｅ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃ
ｈ，４９，１３４４−１３４８（１９８９）｝。

【０００４】これらの方法のいずれかによって多数の化
合物をスクリーニングすることは、現在においては、哺
乳類の脳の組織からのチューブリンを使用する場合にの
み実現可能である。なぜなら、それは、他のソースから
純粋なチューブリンを充分多量に単離することが可能で
なかったからである。多くの抗チューブリン化合物が異
なったソースからの微小管に対して、その効果の点で大
きな特異性を示すので、これらの方法の有効性が制限さ
れていた。例えば、除草剤であるオリザリン（ｏｒｙｚ
ａｌｉｎ）およびアミプロホスメチル（ａｍｉｐｒｏｐ
ｈｏｓｍｅｔｙｌ）は、植物チューブリンの重合を阻害
するが、脳チューブリンの重合を阻害しない。ところ
が、コルヒチンは、植物チューブリンの重合の阻害剤と
してよりも脳チューブリンの重合の阻害剤として１００
倍以上より多く有効である｛Ｊ．Ｗ．Ｓｈａｙ，によっ
て編集された“Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅ
ｔｏｎ”の中のＭｏｒｅｊｏｈｎ，Ｌ．Ｃ．およびＦｏ
ｓｋｅｔ，Ｄ．Ｅ．，“Ｔｕｂｕｌｉｎ ｆｒｏｍＰｌ
ａｎｔｓ，Ｆｕｎｇｉ，ａｎｄ Ｐｒｏｔｉｓｔｓ”２
５７−３２９（１９８６）｝。

【０００５】本発明は、菌細胞および植物細胞を包含す
る真核細胞の生長を阻害することが知られている既知の
ある種のアミド誘導体の、抗チューブリン活性のための
化合物をスクリーニングするバインディングアッセイに
おけるプローブとしての使用に関する｛例えば、米国特
許第３，６６１，９９１号、同第４，８６３，９４０号
および同第５，２５４，５８４号、参照｝。ラジオラベ
ルした、コルヒチン｛例えば、Ｍ．Ｈ．Ｚｗｅｉｇおよ
びＣ．Ｆ．Ｃｈｉｇｎｅｌｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ
Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，２２，２１４１−２１５
０（１９７３）、参照｝およびビンブラスチン｛例え
ば、Ｒ．Ｂａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ
Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２６
５，１７１４１（１９９０）｝のようなラジオラベルし
たプローブは、単離されたチューブリンを使用するバイ
ンディングアッセイに広く使用されているが、これらの
化合物は、チューブリンに非共有結合的に結合してい
る。拮抗的なバインディングアッセイにおいて現存の抗
チューブリン化合物を越える本発明のアミド誘導体の１
つの利点は、チューブリンに、特にチューブリンのベー
タ−サブユニットに、高度に特別な仕方において共有結
合的に結合する本発明のアミド誘導体の独特な能力から
生じる。バインディングアッセイにおいては、チューブ
リンに結合するプローブの量を測定することが必要であ
り、これには、一般的に、未結合のプローブからチュー
ブリンに結合したプローブを分離することが含まれる。
アミドの場合においては、結合が共有結合であるので、
チューブリンに結合したプローブは化学的に安定であ
り、濾過または遠心分離のような方法によって未結合の
プローブから容易に分離することができる。これは、単
離されたチューブリンを使用するアッセイにアミドを使
用することを可能にするだけでなく、全細胞、クルード
細胞抽出物、および部分的に精製されたチューブリン調
製物を使用するアッセイにおいてアミドを使用すること
を可能にする。それ故、単離されたチューブリンの必要
性を解消し、チューブリン−バインディングアッセイ
を、多くの異なったタイプの細胞または細胞抽出物につ
いて行うことを可能にする。例えば、植物または菌のチ
ューブリンに結合する試験化合物は、植物または菌の細
胞または細胞抽出物およびアミドプローブを使用するア
ッセイにおいて見つけることができ、多数の化合物をス
クリーニングするための適当なアッセイを提供する。ま
た、アミドプローブは、哺乳類の細胞中のチューブリン
に結合する化合物を探査するために使用することがで
き、脳以外のソースからの哺乳類のチューブリンについ
ての試験用化合物の効果を研究する手段を提供する。典
型的には、アミドプローブの結合の初期速度（ｉｎｉｔ
ｉａｌ ｒａｔｅ）についての試験用化合物の効果が測
定される。単離されたチューブリンを使用する無細胞ア
ッセイに勝る全細胞アッセイの利点は、生物的な活性に
影響を及ぼす重要な因子である細胞の代謝の活性化また
は不活性化の可能性のアッセイとともに、細胞中に試験
化合物の蓄積を可能にすることである。

【０００６】本発明の第２の態様は、チューブリンに結
合することによって作用する有害生物防除剤または薬剤
に対する真核細胞の感受性を評価するための、バインデ
ィングアッセイにおけるアミドプローブの使用に関す
る。抗チューブリンのための有害生物防除剤または薬剤
のある期間にわたる使用は、その結果として、抗チュー
ブリン化合物に対して減少した感受性（抵抗性）を示す
細胞が出現する。抵抗性はチューブリンの変化に起因す
るか、または抗チューブリン化合物の捕捉（ｕｐｔａｋ
ｅ）または代謝における変化のような他のメカニズムに
関係するかもしれない。チューブリンの変化に起因する
抗チューブリン化合物に対する抵抗性は、菌病原体類
｛Ｈ．Ｌｙｒによって編集された“Ｍｏｄｅｒｎ Ｓｅ
ｌｅｃｔｉｖｅ Ｆｕｎｇｉｃｉｄｅｓ”中のＤａｖｉ
ｄｅｓ，Ｌ．Ｃ．およびＩｓｈｉ，Ｈ，３０５−３２２
（１９９５）｝、藻類｛Ｊａｍｅｓ，Ｓ．Ｗ．ｅｔ ａ
ｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ，１０６，２０９−２１８（１９９３）｝およびぜん
虫類（ｈｅｌｍｉｎｔｈｓ）｛Ｂｅｅｃｈ，Ｒ．Ｎ．ｅ
ｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１３８，１０３−１１
０（１９９４）｝においても発生した。変化したチュー
ブリンを含有する抵抗性細胞は、アミドに対する結合親
和力において差異を示し、バインディングアッセイに使
用されるアミドプローブがそのような変異体を検出する
のを可能にする。そのようなアッセイは、抗チューブリ
ン有害生物防除剤または薬剤に予め暴露された細胞また
は細胞抽出物に対するアミドプローブの結合の速度（ｒ
ａｔｅ ｏｆ ｂｉｎｄｉｎｇ）と、未処理の対照細胞
または細胞抽出物に対する結合の速度とを比較すること
によって行うことができる。

【０００７】例えば、ベンゾイミダゾール殺菌剤および
チオファネート殺菌剤、例えばベノミル（ｂｅｎｏｍｙ
ｌ）（メチル １−（ブチルカルバモイル）ベンゾイミ
ダゾール−２−イルカルバメート）、フベリダゾール
（ｆｕｂｅｒｉｄａｚｏｌｅ）（２−（２’−フリル）
ベンゾイミダゾール）、チアベンダゾール（ｔｈｉａｂ
ｅｎｄａｚｏｌｅ）（２−（４−チアゾリル）ベンゾイ
ミダゾール）、カルベンダジム（ｃａｒｂｅｎｄａｚｉ
ｍ）（メチル ベンゾイミダゾール−２−イルカルバメ
ート）、チオファネート−メチル（ｔｈｉｏｐｈａｎａ
ｔｅ−ｍｅｔｈｙｌ）（１，２−ビス（３−メトキシカ
ルボニル−２−チオウレイド）ベンゼン、およびチオフ
ァネート（ｔｈｉｏｐｈａｎａｔｅ）（１，２−ビス
（３−エトキシカルボニル−２−チオウレイド）ベンゼ
ンは、植物病原菌に対する使用のために当業界において
知られている。しかし、ベンゾイミダゾール殺菌剤およ
びチオファネート殺菌剤をある期間にわたって使用する
と、その結果としてこれらの殺菌剤に対して減少した感
受性を有する菌株が出現し、それにより、殺菌剤は、あ
る種の菌による疾病を防除する有効性が極めて少なくな
る。典型的には、純粋な培養物として単離したときのそ
のような“抵抗性”菌は、これらの殺菌剤にさらされな
かった場所からの菌よりも、ベンゾイミダゾールおよび
チオファネートに対して１０倍ないし１０００倍以上も
感受性が小さい。更に、１種のベンゾイミダゾール殺菌
剤またはチオファネート殺菌剤に対して減少した感受性
を発現させた菌は、また、しばしば、他のベンゾイミダ
ゾール殺菌剤またはチオファネート殺菌剤に対しても減
少した感受性を示す。Ｎ−フェニルカルバメート殺菌剤
であるジエトフェンカルブ（ｄｉｅｔｈｏｆｅｎｃａｒ
ｂ）は、商業的に、ボトリティス シネリア（Ｂｏｔｒ
ｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ）のようなベンゾイミダゾー
ル−抵抗性菌を防除するのに使用される。しかし、その
使用は、ベンゾイミダゾールおよびジエトフェンカルブ
の両方に抵抗性のある菌株へ導いた。ベンゾイミダゾー
ル、チオファネートまたはジエトフェンカルブに抵抗性
の菌株を見つける現在の方法は、労働集約的でありかつ
時間を消費する。ある種の方法には、純粋な試験培養物
の単離、次いで殺菌剤で修正（ａｍｅｎｄ）した寒天プ
レートを使用する菌糸体の生長による生体外アッセイ、
または殺菌剤で処理された葉を使用する生体内アッセイ
が包含される。別法として、胞子のスライド発芽試験
（ｓｌｉｄｅ ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｔｅｔｓ）を
殺菌剤の存在下において行ってもよい。ジエトフェンカ
ルブおよび／またはベンゾイミダゾールおよびチオファ
ネートに抵抗性である菌株は、典型的には、変化したチ
ューブリンタンパク質を含んでいる。｛例えば、Ｋｏｅ
ｎｒａａｄｔ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｈｙｔｏｐａｔｈ
ｏｌｏｇｙ，８２，１３４８−１３５４（１９９２）お
よびＹａｒｄｅｎ，Ｏ．およびＫａｔｅｎ，Ｔ．，Ｐｈ
ｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，８３，１４７８−１４８３
（１９９３）、参照｝。ベンゾイミダゾール抵抗性、ジ
エトフェンカルブ感受性の菌株は、典型的には、本発明
のアミド誘導体に対して増加した感受性を示すが、ベン
ゾイミダゾール抵抗性、ジエトフェンカルブ抵抗性の菌
株は、典型的には、減少した感受性を示す。理論によっ
てしばられることは欲しないが、アミドプローブは、抵
抗性でない菌株から、全細胞または細胞抽出物を使用す
るアッセイにおいてアミドプローブと結合する増加した
能力を示すベンゾイミダゾール抵抗性、ジエトフェンカ
ルブ感受性の菌株、またはアミドプローブと結合する減
少した能力を示すベンゾイミダゾール抵抗性、ジエトフ
ェンカルブ抵抗性の菌株を識別するために、バインディ
ングアッセイに使用することができると考えられる。そ
のようなアッセイは、労働集約もより少なく、かつ時間
の消費もより少なく、また抵抗性のメカニズムがチュー
ブリンの変化を含んでいるかどうかに関する情報も提供
する。抵抗性のメカニズムについての情報は、抵抗性を
管理する方策を設計するのに有用である。

【０００８】本発明の第３の態様は、細胞または細胞抽
出物中のチューブリンを検出しそして定量するために、
バインディングアッセイにおいてアミドプローブを使用
することが含まれる。チューブリンは、薬剤および有害
生物防除剤のための目標としての成功のために、またチ
ューブリンの重要な細胞機能のために、研究対象とされ
ている。そのような研究においては、細胞または細胞抽
出物中のチューブリンを検出し定量することがしばしば
望ましい。現在においては、これは、種々なイムノアッ
セイ法｛Ｄ．Ｔｈｒｏｗｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ ｉｎＣｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．３
７，ｐｐ．１２９−１４５（１９９３）、｝ドデシル硫
酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動｛Ｂ．
Ｍ．Ｓｐｉｅｇｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，
ｖｏｌ．１２，ｐｐ．５８７−６００（１９９７）｝、
ＤＥＡＥ−セルロースへの結合｛Ｊ．Ｃ．Ｂｕｌｉｎｓ
ｋｉｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ，ｖｏｌ．１０４，４３２−４３９（１
９８０）｝により、またはコルヒチン−結合活性を測定
することにより｛Ｗｉｌｓｏｎ，Ｌ．，Ｂｉｏｃｈｍｉ
ｓｔｒｙ，ｖｏｌ，９，ｐｐ．４９９９−５００７（１
９７０）｝達成されている。アミドプローブにより、ア
ミド−結合活性の測定に基づいてチューブリンを検出し
定量するための別の方法が提供される。アミドプローブ
を使用することにより、チューブリンに対する抗体の必
要性が解消され、そしてドデシル硫酸ナトリウムポリア
クリルアミドゲル電気泳動またはＤＥＡＥ−セルロース
への結合法のいずれよりもより簡単かつより迅速な方法
が提供され、そしてコルヒチンに感受性のない植物細胞
また菌細胞のようないろいろな細胞中のチューブリンの
レベルを測定するのに適用できる。

【０００９】当業者に知られている種々な方法を使用し
て全細胞、クルード細胞抽出物、部分的に精製したチュ
ーブリン調製物または単離されたチューブリンを使用す
るアッセイにおけるアミドプローブのチューブリンに対
する結合を検出することができる。これには、例えば、
ラジオラベルしたアミドプローブまたは蛍光アミドプロ
ーブを使用することが含まれる。典型的には、プローブ
は、細胞、細胞抽出物またはチューブリン調製物ととも
にインキュベート（ｉｎｃｕｂａｔｅ）され、そして種
々な分離技術またはそのような技術の組み合わせにより
未結合のプローブから結合したプローブを分離後、結合
したプローブの量が決定される。分離技術には、遠心分
離、クロマトグラフィー、相分離、結合したプローブま
たは未結合プローブのいずれかの沈殿、または結合した
プローブまたは未結合のプローブの固体基体に対する接
着が包含されるが、これらに限定されない。シンチレー
ションプロキシミティアッセイ技術（ｓｃｉｎｔｉｌｌ
ａｔｉｏｎ ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ ａｓｓａｙ ｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｙ）（米国特許第４，５６８，６４９号）
は、チューブリンに対するプローブの結合を測定するた
めの潜在的な方法を提供する。更に他の方法にはアミド
結合チューブリンの検出、または化学処理または酵素処
理により、質量分光分析技術により、チューブリンから
解離されたアミド結合ペプチドを検出することが含まれ
ている。

【００１０】本発明は、真核細胞の生長を阻害するある
種のアミドを使用する、真核細胞、細胞抽出物およびチ
ューブリン調製物中のチューブリン含量を監視かつ測定
し、抗チューブリン活性、抵抗性の化合物をスクリーニ
ングするために有用なバインディングアッセイの実施方
法であって、前記アミドは、次の構造式（Ｉ）を有して
いる前記方法：

【００１１】

【化７】

【００１２】〔式中、Ａは（Ｃ₃−Ｃ₇）シクロアルキ
ル、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル、ハロ（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキ
ル、（Ｃ₂−Ｃ₆）アルケニル、ハロ（Ｃ₂−Ｃ₆）アルケ
ニル、（Ｃ₂−Ｃ₆）アルキニル、ハロ（Ｃ₂−Ｃ₆）アル
キニル、フェニル、ピリジル、フリル、チエニル、イソ
オキサゾリル、オキサゾリル、ピロリル、イソチアゾリ
ル、チアゾリル、ピラゾリル、イミダゾリル、ピリミジ
ニル、キノリル、イソキノリル、ナフチル、ピリダジニ
ル、ピラジニル、ベンゾチエニル、インドリル、ベンゾ
フラニルまたはベンジル；または、それぞれ独立して、
ハロ、シアノ、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル、ハロ（Ｃ₁−
Ｃ₆）アルキル、（Ｃ₂−Ｃ₆）アルケニル、ハロ（Ｃ₂−
Ｃ₆）アルケニル、（Ｃ₂−Ｃ₆）アルキニル、ハロ（Ｃ₂
−Ｃ₆）アルキニル、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルコキシ、ハロ
（Ｃ₁−Ｃ₆）アルコキシ、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキルチオ、
ハロ（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキルチオ、ニトロ、−ＮＲ⁶Ｒ⁷、
−ＣＲ⁸＝ＮＯＲ⁹、−ＮＨＣＯＯＲ¹⁰、ＣＯＮＲ¹¹Ｒ¹²
または−ＣＯＯＲ¹³から選ばれた４個またはそれより少
ない置換基で置換された、フェニル、ピリジル、フリ
ル、チエニル、イソオキサゾリル、オキサゾリル、ピロ
リル、イソチアゾリル、チアゾリル、ピラゾリル、イミ
ダゾリル、ピリミジニル、キノリル、イソキノリル、ナ
フチル、ピリダジニル、ピラジニル、ベンゾチエニル、
インドリル、ベンゾフラニル、またはベンジルであり；
またはＡが不飽和環であり、かつ互いに隣接している２
個またはそれより多くの置換基で置換されているとき
は、前記置換基の２個は、酸素、窒素、硫黄およびリン
から選ばれた２個までのヘテロ原子を含有する５、６、
または７員の縮合環を形成してもよく；Ｒ¹およびＲ
²は、それぞれ独立して、水素原子、（Ｃ₁−Ｃ₆）アル
キル、ハロ（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル、（Ｃ₂−Ｃ₆）アルケ
ニル、ハロ（Ｃ₂−Ｃ₆）アルケニル、（Ｃ₂−Ｃ₆）アル
キニルまたはハロ（Ｃ₂−Ｃ₆）アルキニルであり、ただ
し、Ｒ¹およびＲ²の両方が水素原子ではない；Ｒ⁶およ
びＲ⁷は、それぞれ独立して、水素原子、（Ｃ₁−Ｃ₆）
アルキルまたは（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキルカルボニルであ
り；Ｒ⁸は、水素原子、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル、（Ｃ₂−
Ｃ₆）アルケニルまたは（Ｃ₂−Ｃ₆）アルキニルであ
り；Ｒ⁹は、水素原子、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル、（Ｃ₂−
Ｃ₆）アルケニル、（Ｃ₂−Ｃ₆）アルキニルまたは（Ｃ₁
−Ｃ₄）アルキルカルボニルであり；Ｒ¹⁰、Ｒ¹¹、Ｒ¹²
およびＲ¹³は、それぞれ独立して、水素原子、（Ｃ₁−
Ｃ₆）アルキル、（Ｃ₂−Ｃ₆）アルケニルまたは（Ｃ₂−
Ｃ₆）アルキニルであり；そしてＸ、ＹおよびＺは、そ
れぞれ独立して、水素原子、ハロ、シアノ、チオシア
ノ、イソチオシアノまたは（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキルスルホ
ニルオキシであり、ただし、Ｘ、ＹおよびＺの少なくと
も１つは水素原子でない〕または、それらの光学的対掌
体を提供する。

【００１３】本明細書に使用されている用語「ハロ」に
は、フルオロ、ブロモ、クロロ、またはヨードが包含さ
れる。

【００１４】用語「アルキル」には、１個の基につき１
−６個の炭素を有する直鎖または分枝鎖の飽和炭化水素
基、例えばメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピ
ル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペン
チルおよびへキシルが包含される。

【００１５】用語「アルケニル」には、１個の基につき
少なくとも１個の二重結合および２−６個の炭素を有す
る直鎖または分枝鎖の炭化水素基、例えばビニル、２−
プロペニル、２−ブテニルおよび２−メチル−２−プロ
ペニルが包含される。

【００１６】用語「アルキニル」には、１個の基につき
少なくとも１個の三重結合および２−６個の炭素を有す
る直鎖または分枝鎖の炭化水素基、例えばエチニル、２
−プロピニル、および２−ブチニルが包含される。

【００１７】用語「アルコキシ」には、１個の基につき
１−６個の炭素を有する直鎖または分枝鎖のアルコキ
シ、例えばメトキシ、プロポキシ、ｎ−ブトキシおよび
ｔｅｒｔ−ブトキシが包含される。

【００１８】用語「アルキルチオ」には、１つの基につ
き１−６個の炭素を有する直鎖または分枝鎖のアルキル
チオ基、例えばメチルチオおよびプロピルチオが包含さ
れる。

【００１９】用語「ハロアルキル」、「ハロアルケニ
ル」、「ハロアルキニル」、「ハロアルコキシ」、およ
び「ハロアルキルチオ」の基は、それぞれ、１−５個の
ハロ置換基を有する、「アルキル」、「アルケニル」、
「アルキニル」、「アルコキシ」、および「アルキルチ
オ」の基である。

【００２０】用語「シクロアルキル」には、３−７個の
炭素原子の環、例えばシクロプロピル、シクロペンチル
およびシクロヘキシルが包含される。

【００２１】用語「アルキルカルボニル」には、カルボ
ニル基に結合しており、１個の基につき１−６個の炭素
原子を有する直鎖または分枝鎖のアルキル基、例えばメ
チルカルボニルおよびブチルカルボニルが包含される。

【００２２】用語「アルキルスルホニルオキシ」には、
スルホニルオキシ基に結合しており、１個の基につき１
−６個の炭素原子を有する直鎖または分枝鎖のアルキル
基、例えばメチルスルホニルオキシおよびプロピルスル
ホニルオキシが包含される。

【００２３】本発明の好ましい方法は、構造式（Ｉ
Ｉ）：

【００２４】

【化８】

【００２５】〔式中、Ｒ¹およびＲ²は、それぞれ独立し
て、水素原子、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル、ハロ（Ｃ₁−
Ｃ₆）アルキル、（Ｃ₂−Ｃ₆）アルケニルまたは（Ｃ₂−
Ｃ₆）アルキニルであり、ただし、Ｒ¹およびＲ²の両方
が水素原子ではない；Ｒ³、Ｒ⁴、およびＲ⁵は、それぞ
れ独立して、水素原子、ハロ、シアノ、（Ｃ₁−Ｃ₆）ア
ルキル、ハロ（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル、（Ｃ₂−Ｃ₆）アル
ケニル、（Ｃ₂−Ｃ₆）アルキニル、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルコ
キシ、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキルチオ、ハロ（Ｃ₁−Ｃ₆）ア
ルコキシ、ニトロ、−ＮＲ⁶Ｒ⁷、−ＣＲ⁸＝ＮＯＲ⁹、−
ＮＨＣＯＯＲ¹⁰、−ＣＯＮＲ¹¹Ｒ¹²または−ＣＯＯＲ¹³
であり；またはＲ⁴およびＲ⁵は、いっしょになって、
Ｏ、Ｓ、ＮおよびＰから成る群から選ばれた２個までの
ヘテロ原子を含有してもよい５、６、または７員の縮合
環を形成しており；Ｒ⁶、Ｒ⁷、Ｒ⁸、Ｒ⁹、Ｒ¹⁰、Ｒ¹¹、
Ｒ¹²、およびＲ¹³は、それぞれ独立して、水素原子また
は（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキルであり；そしてＸおよびＹは、
それぞれ独立して、水素原子、ハロ、シアノ、チオシア
ノ、イソチオシアノまたは（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキルスルホ
ニルオキシであり、ただし、ＸおよびＹの両方が水素原
子ではない〕を有するアミド；または、それらの光学的
対掌体を使用する。

【００２６】本発明の更に好ましい方法は、構造式（Ｉ
Ｉ）：〔式中、Ｒ¹は、メチルであり；Ｒ²は、メチルま
たはエチルであり；Ｒ³およびＲ⁵は、それぞれ独立し
て、水素原子、ハロ、メチル、ニトロ、シアノ、−ＮＲ
⁶Ｒ⁷、−ＣＲ⁸＝ＮＯＲ⁹または−ＮＨＣＯＯＲ¹⁰であ
り、ただし、Ｒ³およびＲ⁵の両方が水素原子ではない；
Ｒ⁴は、水素原子、ハロ、−ＮＲ⁶Ｒ⁷、シアノ、−ＣＲ⁸
＝ＮＯＲ⁹、−ＮＨＣＯＯＲ¹⁰、−ＣＯＯＲ¹³または
（Ｃ₁−Ｃ₄）アルキルであり；Ｒ⁶、Ｒ⁷、Ｒ⁸、Ｒ⁹、Ｒ
¹⁰およびＲ¹³は、それぞれ独立して、水素原子または
（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキルであり；Ｘは、クロロであり；そ
してＹは、水素原子である〕を有する安息香酸アミド；
またはそれらの光学的対掌体を使用する。

【００２７】哺乳類の細胞、細胞抽出物またはチューブ
リンを使用するアッセイにおいて、本発明のさらに好ま
しい方法は、構造式（ＩＩ）：〔式中、Ｒ¹は、メチル
であり；Ｒ²は、エチルであり；Ｒ³は、ハロまたはシア
ノであり；Ｒ⁴およびＲ⁵は、アミノまたは−ＣＨ＝ＮＯ
ＣＨ₃であり、ただし、Ｒ⁴およびＲ⁵は同じでない；Ｘ
は、クロロであり、そしてＹは、水素原子である〕を有
する安息香酸アミド；またはそれらの光学的対掌体を使
用する。

【００２８】菌が子のう菌類（Ａｓｃｏｍｙｃｅｔ
ｅ）、不完全菌類（Ｄｅｕｔｅｒｏｍｙｃｅｔｅ）また
は担子菌類（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅ）に属する菌
の細胞、細胞抽出物またはチューブリンを使用するアッ
セイにおいて、構造式（ＩＩ）：〔式中、Ｒ¹は、メチ
ルであり；Ｒ²は、メチルまたはエチルであり；Ｒ³は、
−ＣＨ＝ＮＯＣＨ₃であり；Ｒ⁴は、水素原子、ハロ、ア
ミノ、シアノまたはメチルであり；Ｒ⁵は、ハロ、メチ
ル、ニトロ、またはシアノであり、Ｘは、クロロであ
り、そしてＹは、水素原子である〕を有する安息香酸ア
ミド；またはそれらの光学的対掌体を使用する。

【００２９】菌が卵菌類（Ｏｏｍｙｃｅｔｅ）に属する
菌の細胞、細胞抽出物またはチューブリンを使用するア
ッセイにおいては、本発明のさらに好ましい方法は、構
造式（ＩＩ）：〔式中、Ｒ¹は、メチルであり；Ｒ²は、
エチルであり；Ｒ³およびＲ⁵は、それぞれ独立して、水
素原子、ハロ、メチル、ニトロ、シアノ、−ＮＲ⁶Ｒ⁷、
−ＣＲ⁸＝ＮＯＲ⁹または−ＮＨＣＯＯＲ¹⁰であり、ただ
し、Ｒ³およびＲ⁵の両方が水素原子ではない；Ｒ⁴は、
水素原子、ハロ、−ＮＲ⁶Ｒ⁷、シアノ、−ＣＲ⁸＝ＮＯ
Ｒ⁹、−ＮＨＣＯＯＲ¹⁰、−ＣＯＯＲ¹³または（Ｃ₁−Ｃ
₄）アルキルであり；Ｒ⁶、Ｒ⁷、Ｒ⁸、Ｒ⁹、Ｒ¹⁰および
Ｒ¹³は、それぞれ独立して、水素原子またはメチルであ
り；Ｘは、クロロであり、そしてＹは、水素原子であ
る〕を有する安息香酸アミド；またはそれらの光学的対
掌体を使用する。

【００３０】植物の細胞、細胞抽出物またはチューブリ
ンを使用するアッセイにおいては、本発明のさらに好ま
しい方法は、構造式（ＩＩ）：〔式中、Ｒ¹は、メチル
であり；Ｒ²は、メチルまたはエチルであり；Ｒ³および
Ｒ⁵は、それぞれ独立して、水素原子、ハロ、メチル、
ニトロまたはシアノであり、ただしＲ³およびＲ⁵の両方
が水素原子ではない；Ｒ⁴は、水素原子であり；Ｘは、
クロロであり；そしてＹは、水素原子である〕を有する
安息香酸アミド；またはそれらの光学的対掌体を使用す
る。

【００３１】本発明の他の好ましい方法は、構造式（Ｉ
ＩＩ）：

【００３２】

【化９】

【００３３】〔式中、Ｒ¹およびＲ²はそれぞれ独立し
て、水素原子、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル、ハロ（Ｃ₁−
Ｃ₆）アルキル、（Ｃ₂−Ｃ₆）アルケニルまたは（Ｃ₂−
Ｃ₆）アルキニルであり、ただしＲ¹およびＲ²の両方が
水素原子ではない；Ｒ³およびＲ⁵は、それぞれ独立し
て、水素原子、ハロ、シアノ、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル、
ハロ（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル、（Ｃ₂−Ｃ₆）アルケニル、
（Ｃ₂−Ｃ₆）アルキニル、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルコキシ、
（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキルチオ、ハロ（Ｃ₁−Ｃ₆）アルコキ
シ、ニトロ、カルボキシ、−ＮＲ⁶Ｒ⁷、−ＣＲ⁸＝ＮＯ
Ｒ⁹、−ＮＨＣＯＯＲ¹⁰、−ＣＯＮＲ¹¹Ｒ¹²または−Ｃ
ＯＯＲ¹³であり；Ｒ⁶、Ｒ⁷、Ｒ⁸、Ｒ⁹、Ｒ¹⁰、Ｒ¹¹、Ｒ
¹²およびＲ¹³は、水素原子または（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル
であり、そしてＸおよびＹは、それぞれ独立して、水素
原子、ハロ、シアノ、チオシアノ、イソチオシアノまた
は（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキルスルホニルオキシであり、ただ
し、ＸおよびＹの両方が水素原子ではない〕を有するピ
リジンカルボキサミド（ｐｙｒｉｄｉｎｅｃａｒｂｏｘ
ａｍｉｄｅｓ）；またはそれらの光学的対掌体を使用す
る。

【００３４】本発明の更に他の好ましい方法は、構造式
（ＩＶ）：

【００３５】

【化１０】

【００３６】〔式中、Ｒ¹およびＲ²はそれぞれ独立し
て、水素原子、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル、ハロ（Ｃ₁−
Ｃ₆）アルキル、（Ｃ₂−Ｃ₆）アルケニルまたは（Ｃ₂−
Ｃ₆）アルキニルであり、ただしＲ¹およびＲ²の両方が
水素原子ではない；Ｒ³およびＲ⁴は、それぞれ独立し
て、水素原子、ハロ、シアノ、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル、
ハロ（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル、（Ｃ₂−Ｃ₆）アルケニル、
（Ｃ₂−Ｃ₆）アルキニル、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルコキシ、
（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキルチオ、ハロ（Ｃ₁−Ｃ₆）アルコキ
シ、ニトロ、カルボキシ、−ＮＲ⁶Ｒ⁷、−ＣＲ⁸＝ＮＯ
Ｒ⁹、−ＮＨＣＯＯＲ¹⁰、−ＣＯＮＲ¹¹Ｒ¹²または−Ｃ
ＯＯＲ¹³であり；またはＲ³およびＲ⁴はいっしょになっ
てＯ、Ｓ、ＮおよびＰからなる群から選ばれた２個まで
のヘテロ原子を含有してもよい５、６または７員の縮合
環を形成してもよく；Ｒ⁶、Ｒ⁷、Ｒ⁸、Ｒ⁹、Ｒ¹⁰、
Ｒ¹¹、Ｒ¹²およびＲ¹³は、それぞれ独立して、水素原子
または（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキルであり、そしてＸおよびＹ
は、それぞれ独立して、水素原子、ハロ、シアノ、チオ
シアノ、イソチオシアノまたは（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキルス
ルホニルオキシであり、ただし、ＸおよびＹの両方が水
素原子ではない〕を有するピリジンカルボキサミド；ま
たはそれらの光学的対掌体を使用する。

【００３７】本発明の他の更に好ましい方法は、構造式
（ＩＶ）：〔式中、Ｒ¹は、メチルであり；Ｒ²は、メチ
ルまたはエチルであり；Ｒ³およびＲ⁴は、それぞれ独立
して、水素原子、ハロ、シアノ、メチル、ニトロ、−Ｎ
Ｒ⁶Ｒ⁷、−ＣＲ⁸＝ＮＯＲ⁹または−ＮＨＣＯＯＲ¹⁰であ
り、ただし、Ｒ³およびＲ⁴の両方が水素原子ではない；
Ｒ⁶、Ｒ⁷、Ｒ⁸、Ｒ⁹、Ｒ¹⁰およびＲ¹³は、それぞれ独立
して、水素原子または（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキルであり；Ｘ
は、クロロであり；そしてＹは、水素原子である〕を有
するピリジンカルボキサミド；またはそれらの光学的対
掌体を使用する。

【００３８】本発明の更に他の好ましい方法は、構造式
（Ｖ）：

【００３９】

【化１１】

【００４０】〔式中、Ｄは、ＯまたはＳであり；Ｒ¹お
よびＲ²は、それぞれ独立して、水素原子、（Ｃ₁−
Ｃ₆）アルキル、ハロ（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル、（Ｃ₂−Ｃ
₆）アルケニルまたは（Ｃ₂−Ｃ₆）アルキニルであり、
ただしＲ¹およびＲ²の両方が水素原子ではない；Ｒ³、
Ｒ⁴およびＲ⁵は、それぞれ独立して、水素原子、ハロ、
シアノ、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル、ハロ（Ｃ₁−Ｃ₆）アル
キル、（Ｃ₂−Ｃ₆）アルケニル、（Ｃ₂−Ｃ₆）アルキニ
ル、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルコキシ、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキルチ
オ、ハロ（Ｃ₁−Ｃ₆）アルコキシ、ニトロ、カルボキ
シ、−ＮＲ⁶Ｒ⁷、−ＣＲ⁸＝ＮＯＲ⁹、−ＮＨＣＯＯ
Ｒ¹⁰、−ＣＯＮＲ¹¹Ｒ¹²または−ＣＯＯＲ¹³であり；ま
たはＲ³およびＲ⁴はいっしょになってＯ、Ｓ、Ｎおよび
Ｐからなる群から選ばれた２個までのヘテロ原子を含有
してもよい５、６または７員の縮合環を形成してもよ
く；Ｒ⁶、Ｒ⁷、Ｒ⁸、Ｒ⁹、Ｒ¹⁰、Ｒ¹¹、Ｒ¹²およびＲ¹³
は、それぞれ独立して、水素原子または（Ｃ₁−Ｃ₆）ア
ルキルであり、そしてＸおよびＹは、それぞれ独立し
て、水素原子、ハロ、シアノ、チオシアノ、イソチオシ
アノまたは（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキルスルホニルオキシであ
り、ただし、ＸおよびＹの両方が水素原子ではない〕を
有するフリルカルボキサミドまたはチエニルカルボキサ
ミド；またはそれらの光学的対掌体を使用する。

【００４１】本発明の更に他の好ましい方法は、構造式
（ＶＩ）：

【００４２】

【化１２】

【００４３】〔式中、Ｄは、ＯまたはＳであり；Ｒ¹お
よびＲ²はそれぞれ独立して、水素原子、（Ｃ₁−Ｃ₆）
アルキル、ハロ（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル、（Ｃ₂−Ｃ₆）ア
ルケニルまたは（Ｃ₂−Ｃ₆）アルキニルであり、ただし
Ｒ¹およびＲ²の両方が水素原子ではない；Ｒ³、Ｒ⁴およ
びＲ⁵はそれぞれ独立して、水素原子、ハロ、シアノ、
（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル、ハロ（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル、
（Ｃ₂−Ｃ₆）アルケニル、（Ｃ₂−Ｃ₆）アルキニル、
（Ｃ₁−Ｃ₆）アルコキシ、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキルチオ、
ハロ（Ｃ₁−Ｃ₆）アルコキシ、ニトロ、カルボキシ、−
ＮＲ⁶Ｒ⁷、−ＣＲ⁸＝ＮＯＲ⁹、−ＮＨＣＯＯＲ¹⁰、−Ｃ
ＯＮＲ¹¹Ｒ¹²または−ＣＯＯＲ¹³であり；Ｒ⁶、Ｒ⁷、Ｒ
⁸、Ｒ⁹、Ｒ¹⁰、Ｒ¹¹、Ｒ¹²およびＲ¹³は、それぞれ独立
して、水素原子または（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキルであり；そ
してＸおよびＹは、それぞれ独立して、水素原子、ハ
ロ、シアノ、チオシアノ、イソチオシアノおよび（Ｃ₁
−Ｃ₆）アルキルスルホニルオキシから選ばれ、ただ
し、ＸおよびＹの両方が水素原子ではない〕を有するフ
リルカルボキサミドまたはチエニルカルボキサミド；ま
たはそれらの光学的対掌体を使用する。

【００４４】Ｒ¹およびＲ²が異なっているときは、Ｒ¹
およびＲ²を連結する不整炭素原子の存在のために、本
発明の化合物の光学的対掌体が存在することが可能であ
る。そのようなケースにおいては、両方の対掌体が本発
明の範囲内である。多くの生物学的に活性な化合物は光
学的対掌体を有し、それらの１方は、他方のものよりも
特定のタンパク質により有効に結合することは知られて
いる。同様に、本発明の方法に使用される化合物につい
ては、１つの対掌体が他の対掌体よりもチュービリンに
対しより有効に結合する。例えば、化合物１、２および
３の「Ｓ対掌体」は、相応する「Ｒ対掌体」よりもチュ
ーブリンに対してより有効に結合する。用語「Ｓ対掌
体」は、Ｒ¹およびＲ²が結合している炭素上の４つの基
は、カーン−インゴールド−プレログシステム（Ｃａｈ
ｎ−Ｉｎｇｏｌｄ−Ｐｒｅｌｏｇ ｓｙｓｔｅｍ）｛Ａ
ｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．５，３
８５−４１５（１９６６）｝の一連のシーケンスルール
に従ってランクをつけたときに、炭素がＳ配置を有する
として定義されることを意味する。用語「Ｒ対掌体」
は、４つの基がＲ配置を形成していることを意味する。

【００４５】本発明の方法において造られ、また有用で
ある、具体的な化合物には、表１−６に列挙された化合
物が包含されているが、これらに限定されない。

【００４６】

【表１】

【００４７】

【表２】

【００４８】

【表３】

【００４９】

【表４】

【００５０】

【表５】

【００５１】

【表６】

【００５２】＊：左手原子（ｌｅｆｔ ｈａｎｄ ａｔ
ｏｍ）の多くは安息香酸アミド環の４位置に結合してお
り、そして右手原子の多くは安息香酸アミド環の５位置
に結合している。

【００５３】次の方法および実施例において本発明の利
用を更に例示する。

【００５４】表１−６に列挙された化合物を製造するの
に使用された方法

【００５５】表１中の化合物１、６、８、９、１０、１
１、１３、１５、１７、１８、１９、２０、２２、２
３、２４、２５、２６、２７、２８および２９：表１中
の化合物１、６、８、９、１０、１１、１３、１５、１
７、１８、１９、２０、２２、２３、２４、２５、２
６、２７、２８および２９は、米国特許第４，８２２，
９０２号、５−８欄および１１−１７欄に記載された合
成方法によって造った。

【００５６】表１中の化合物７および１６：表１中の化
合物および１６は、米国特許第５，２５４，５８４号、
７欄および８欄（化合物１６）および１０−１４欄（化
合物７）に記載された合成方法により造った。

【００５７】表１中の化合物３、１４および２１：化合
物３、１４および２１は、米国特許第５，３０４，５７
２号、４−８欄に記載された合成方法によって造った。

【００５８】表１中の化合物５および１２：化合物５お
よび１２は、例えば米国特許第４，８６３，９４０号、
５−７欄に記載されているような公知の合成技術を使用
して、適当な安息香酸または塩化ベンゾイルから造っ
た。化合物５および１２は、それぞれ、４−アミノ−
３，５−ジクロロベンゾイルクロライドおよび４−アミ
ノ−３，５−ジブロモベンゾイルクロライドを使用して
造った。

【００５９】表１中の化合物２：化合物２は、経路図Ａ
に示されているように、塩化ベンゾイルＶＩＩ（式中Ｒ
³はＣｌであり、Ｒ⁴はＮＨ₂であり、そしてＲ⁵は−ＣＨ
＝ＮＯＣＨ₃である）と、α−アミノ−α’−クロロケ
トン誘導体ＶＩＩＩ（式中、Ｒ¹はメチルであり、そし
てＲ²はエチルである）との反応により造った：

【００６０】経路図Ａ

【化１３】

【００６１】化合物２を造るのに使用した塩化ベンゾイ
ルは、次の経路図Ｂに指示されているようにして造っ
た。

【００６２】経路図Ｂ

【化１４】

【００６３】化合物ＶＩＩＩは、アセチレン性アミン
（Ｘ）を、塩化メチレン、クロロホルム、エチルエーテ
ル、または水のような溶媒およびトリエチルアミン、炭
酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、または水酸化ナトリ
ウムのような塩基の存在下において、無水トリフルオロ
酢酸と反応させてアセチレン性アミドＸＩを生成させる
ことにより造った。

【００６４】

【化１５】

【００６５】アセチレン性アミド（ＸＩ）を、塩化メチ
レンまたはクロロホルムのような溶媒の存在下におい
て、−７８℃〜０℃の温度において、塩素または塩素源
で処理することにより中間体オキサゾリン（ＸＩＩ）を
生成した。オキサゾリン（ＸＩＩ）は、塩酸または硫酸
のような酸を使用する酸性条件下で、４０℃〜６０℃の
温度において、メタノールまたはテトラヒドロフランの
ような溶媒を使用して容易に加水分解され、α−アミノ
−α’，α’−ジクロロケトン（ＸＩＩＩ）を生成し
た。

【００６６】

【化１６】

【００６７】ＸＩＩＩの選択的接触脱ハロゲン化によ
り、対応するα−アミノ−α’−クロロケトン誘導体Ｖ
ＩＩＩを生成した：

【００６８】

【化１７】

【００６９】（ａ）メチル ３−メチル−４−ニトロベ
ンゾエートの製造 還流凝縮器、オーバーヘッド撹拌機およびガス導入口を
備えた５Ｌの３っ口丸底フラスコに、３−メチル−４−
ニトロ安息香酸の３００ｇおよびメタノールの３Ｌを入
れた。その結果得られたよく撹拌された溶液に、塩化水
素の２０．８ｇをバブリングして入れ、得られた混合物
を３時間還流した。反応混合物を室温に冷却し、一夜静
置した。所期のメチル ３−メチル−４−ニトロベンゾ
エートは淡黄色結晶として沈殿した。それを吸引濾過に
より集め、乾燥後２５９．３ｇを得た。この固体はその
まま次の工程において使用した。

【００７０】（ｂ）メチル ３−ブロモメチル−４−ニ
トロベンゾエートの製造 還流凝縮器、オーバーヘッド撹拌機、添加用漏斗および
窒素導入口を備えた５Ｌの３っ口丸底フラスコに、メチ
ル ３−メチル−４−ニトロベンゾエートの２２０ｇ、
無水四塩化炭素の２Ｌおよび過酸化ベンゾイルの４ｇを
入れた。得られた溶液に、２７５ワットのＵＶ光線を照
射し、還流させながら、臭素の１９８ｇを２時間かけて
加えた。添加完了後、反応混合物をさらに６０時間還流
した。反応混合物を室温に冷却した。生成した固体を吸
引濾過により分離した。この固体（１５９．１ｇ）は、
所期のメチル ３−ブロモメチル−４−ニトロベンゾエ
ートと少量の出発物資から成っていた。母液を他のメチ
ル ３−メチル−４−ニトロベンゾエート２２０ｇおよ
び過酸化ベンゾイルの４ｇと共にフラスコに返し、前述
の方法で臭素１９８ｇで処理した。添加完了後、反応混
合物をさらに９６時間還流し、室温に冷却し、そして得
られた固体を濾過により分離し、メチル ３−ブロモメ
チル−４−ニトロベンゾエートをさらに２５２ｇ得た。
これらの固体をいっしょにすると、少量の出発物質のメ
チル ３−メチル−４−ニトロベンゾエート、および少
量のメチル ３−ジブロモメチル−４−ニトロベンゾエ
ートを含むメチル ３−ブロモメチル−４−ニトロベン
ゾエート、４１１．１ｇを得た。この固体はそのまま次
の工程において使用した。

【００７１】（ｃ）メチル ３−アセトキシメチル−４
−ニトロベンゾエートの製造 還流凝縮器、オーバーヘッド撹拌機および窒素導入口を
備えた５Ｌの３っ口丸底フラスコに、前に造ったメチル
３−ブロモメチル−４−ニトロベンゾエートの４１１
ｇ、無水酢酸カリウムの４４１ｇおよび氷酢酸の２Ｌを
入れた。得られた混合物を４時間還流し、室温に冷却し
そして一夜撹拌した。溶媒をロータリーエバポレーター
で除去し、得られた淡黄色固体を酢酸エチルの２Ｌおよ
び水の１Ｌの混合液で処理した。有機相を分離し、水
（３×４００ｍＬ）、ブライン（１×４００ｍＬ）で洗
い、無水硫酸マグネシウム上で乾燥し、そして溶媒をロ
ータリーエバポレーターを使用して除去した。粗反応混
合物をヘキサンでトリチュレート（ｔｒｉｔｕｒａｔ
ｅ）し、濾過して所期のメチル ３−アセトキシメチル
−４−ニトロベンゾエート３１８ｇを得た。この化合物
はそのまま次の工程において使用した。

【００７２】（ｄ）メチル ３−ヒドロキシメチル−４
−ニトロベンゾエートの製造 還流凝縮器、オーバーヘッド撹拌機および窒素導入口を
備えた５Ｌの３っ口丸底フラスコに、前に造ったメチル
３−アセトキシメチル−４−ニトロベンゾエートの３
１８ｇおよび無水メタノールの３．２Ｌを入れた。得ら
れた溶液に、塩化水素の４０ｇをバブリングし、得られ
た混合物を３時間還流した。室温に冷却後、溶媒をロー
タリーエバポレーターを使用して除去し、微量のメタノ
ールを含有する黄色固体として、メチル ３−ヒドロキ
シメチル−４−ニトロベンゾエートの２７３ｇを得た。
これはそのまま次の工程において使用した。

【００７３】（ｅ）メチル ３−ホルミル−４−ニトロ
ベンゾエートの製造 ５Ｌの４っ口丸底フラスコの中で、塩化メチレンの１．
５Ｌを−７８℃に冷却した。塩化オキサリル（１６４
ｇ、１．２９モル）をゆっくり加え、次いで、温度を−
７０℃以下に保持しながら、塩化メチレンの１２５ｍＬ
中の乾燥ジメチルスルホキシドの２０２ｇ（２．５９モ
ル）を滴下して加えた。添加完了後、反応混合物を−７
８℃において３０分間撹拌し、塩化メチレンの２５０ｍ
Ｌに溶解されたメチル ３−ヒドロキシメチル−４−ニ
トロベンゾエートの２７３ｇ（１．２９モル）を滴下し
て加えた。反応混合物をさらに３０分間撹拌した。塩化
メチレンの１２５ｍＬ中のトリエチルアミン（３９２
ｇ、３．８８モル）を、温度を−６５℃以下に保持しな
がら滴下して加えた。反応混合物を室温にゆっくり温
め、一夜撹拌した。溶媒をロータリーエバポレーターを
使用して除去し、得られた固体を、酢酸エチルの２Ｌお
よび水の１Ｌの混合液で処理した。有機相を分離し、珪
藻土を通して濾過し、そして希塩酸（２×２５０ｍ
Ｌ）、水（２×２５０ｍＬ）、飽和重炭酸ナトリウム水
溶液（２×２５０ｍＬ）、水（２×２００ｍＬ）、ブラ
イン（１×２００ｍＬ）で続いて洗い、そして無水硫酸
マグネシウム上で乾燥した。溶媒はロータリーエバポレ
ーターを使用して除去した。粗反応混合物をヘキサンで
トリチュレートし、濾過し、黄色固体として、所期のメ
チル ３−ホルミル−４−ニトロベンゾエート２３４．
１ｇを得た。この化合物はそのまま次の工程において使
用した。

【００７４】（ｆ）メチル ３−メトキシイミノメチル
−４−ニトロベンゾエートの製造 メチル ３−ホルミル−４−ニトロベンゾエートの１９
５ｇ、塩化メチレンの１Ｌおよび水の３７０ｍＬのよく
撹拌された混合物に、メトキシアミン塩酸塩の７７．６
ｇ、酢酸ナトリウムの７６．２ｇおよびテトラ−ｎ−ブ
チルアンモニウム水素スルフェートの６．８ｇを続けて
加えた。得られた混合物を室温において一夜撹拌し、次
いでエチルエーテルの２Ｌで希釈した。有機相を分離
し、そして水（１×５００ｍＬ）、２％塩酸水溶液（２
×５００ｍＬ）、水（２×２５０ｍＬ）、およびブライ
ン（１×２５０ｍＬ）で続けて洗い、次いで無水硫酸マ
グネシウム上で乾燥した。溶媒をロータリーエバポレー
ターを使用して除去し、赤みを帯びた油として、所期の
メチル ３−メトキシイミノメチル−４−ニトロベンゾ
エートの２１８．６ｇを得た。これは静置すると固化し
た。また、これはそのまま次の工程において使用した。

【００７５】（ｇ）メチル ４−アミノ−３−メトキシ
イミノメチルベンゾエートの製造 ５Ｌの３っ口丸底フラスコに、５％酢酸水溶液の０．９
Ｌおよび鉄の１５７ｇ（２．８モル）を入れた。得られ
たよく撹拌された混合液に、酢酸エチルの０．９Ｌに溶
解した前に造ったメチル ３−メトキシイミノメチル−
４−ニトロベンゾエートの１６６．６ｇ（０．７モル）
を加え、次いで温度を３５℃以下に保持しながら酢酸の
０．９Ｌを滴下して加えた。得られた混合物を３５℃に
おいて３０分間撹拌し、そして珪藻土を通して濾過し
た。濾液を水の５Ｌ中に注ぎ入れた。水性層を分離し、
エチルエーテル（２×５００ｍＬ）で洗った。いっしょ
にした有機相を、水（４×５００ｍＬ）、飽和重炭酸ナ
トリウム水溶液（２×５００ｍＬ）、水（２×５００ｍ
Ｌ）、およびブライン（１×４００ｍＬ）で続けて洗っ
た。有機相を無水硫酸マグネシウム上で乾燥し、そして
溶媒をロータリーエバポレーターを使用して除去し、所
期のメチル ４−アミノ−３−メトキシイミノメチルベ
ンゾエート１３０ｇを得た。

【００７６】（ｈ）メチル ４−アミノ−３−クロロ−
５−メトキシイミノメチルベンゾエートの製造 ２Ｌの３っ口丸底フラスコに、前に造った４−アミノ−
３−メトキシイミノメチルベンゾエートの１０６ｇ
（０．５１モル）およびアセトニトリルの５００ｍＬを
入れた。得られた混合物を７０℃に加熱し、温度を８０
℃以下に保持しながらＮ−クロロスクシンイミドの７
５．２ｇ（０．５６モル）を分割して加えた。添加完了
後、反応混合物を１時間還流した。反応混合物を室温に
冷却し、溶媒はロータリーエバポレーターで除去した。
粗生成物を酢酸エチルの５Ｌに溶解した。有機溶液を水
（３×５００ｍＬ）、次いでブレインで洗い、硫酸マグ
ネシウム上で乾燥した。反応混合物をロータリーエバポ
レーターで濃縮してスラリーにし、ヘキサンでトリチュ
レートし、そして濾過し、黄色固体として所期のメチル
４−アミノ−３−クロロ−５−メトキシイミノメチルベ
ンゾエートを得た。この反応を同じ量を使用して繰り返
し、メチル ４−アミノ−３−クロロ−５−メトキシイ
ミノメチルベンゾエートを全部で２１０．５ｇ得た。こ
れはそのまま次の工程において使用した。

【００７７】（ｉ）４−アミノ−３−クロロ−５−メト
キシイミノメチル安息香酸の製造 ５Ｌの３っ口丸底フラスコに、前に造ったメチル ４−
アミノ−３−クロロ−５−メトキシイミノメチルベンゾ
エートの２１０ｇ（０．８６モル）、メタノールの１．
７Ｌおよび１５％水酸化ナトリウム水溶液の４６２ｇ
（１．７３モル）を入れた。得られた混合物を３時間還
流し、その後、反応混合物を室温において一夜撹拌し
た。反応混合物をロータリーエバポレーターを使用して
濃縮した。粗反応混合物を水の２Ｌに溶解した。得られ
た水性溶液を酢酸エチルの５００ｍＬで１回洗い、氷浴
中で冷却し、そして濃塩酸でｐＨ＝２の酸性にした。所
期の４−アミノ−３−クロロ−５−メトキシイミノメチ
ル安息香酸は淡黄色として沈殿した。これを吸引濾過に
より分離した。フィルターケーキをエチルエーテル：ヘ
キサンの１：２混合液で洗い、乾燥後、１８５．２ｇ
（収率９４％）を得た。

【００７８】（ｊ）４−アミノ−３−クロロ−５−メト
キシイミノメチルベンゾイルクロライドの製造 ５Ｌの３っ口丸底フラスコに、前に造った４−アミノ−
３−クロロ−５−メトキシイミノメチル安息香酸の１８
０ｇ、トルエンの２Ｌ、ジメチルホルムアミドの３ｍＬ
および塩化チオニルの１０４ｇ（６４ｍＬ）を入れた。
得られた混合物を７０℃において２時間加熱し、熱い間
に濾過し、そして溶媒をロータリーエバポレーターを使
用して除去し、所期の４−アミノ−３−クロロ−５−メ
トキシイミノメチルベンゾイルクロライド１７８．１ｇ
を得た。

【００７９】（ｋ）３−アミノ−１−クロロ−３−メチ
ル−２−ペンタノン塩酸塩（化合物ＶＩＩＩ（式中、Ｒ
¹はメチルであり、そしてＲ²はエチルである）の製造 （ｉ）Ｎ−〔３−（３−メチル−１−ペンチニル）〕ト
リフルオロアセトアミドの製造〕 機械式撹拌機、窒素導入口および温度計を備えた３Ｌの
４っ口丸底フラスコに、３−アミノ−３−メチル−１−
ペンチン塩酸塩の２３４ｇ（１．７５モル）および塩化
メチレンの１，０００ｍＬを入れた。得られたよく撹拌
された混合物に、温度を３０℃以下に保持しながら、ト
リエチルアミン（ＴＥＡ）の３５４ｇ（３．５１モル）
を滴下しながらゆっくり加えた。添加完了後、反応混合
物を１２０分間撹拌し、次いで塩化メチレンの５００ｍ
Ｌに溶解した無水トリフルオロ酢酸の３３４．５ｇ
（１．５９モル）を、反応温度を０℃に維持するような
速さで、滴下しながら加えた。添加完了後、反応混合物
を室温において一夜撹拌し、そして真空下で濃縮した。
得られたスラリーをエチルエーテルで洗った。エチルエ
ーテル層を、水、飽和重炭酸ナトリウム水溶液およびブ
ラインで続けて洗い、無水硫酸マグネシウム上で乾燥
し、活性チャコールで処理し、そしてセライト〔Ｃｅｌ
ｉｔｅ（登録商標）〕を通して濾過した。溶媒は減圧下
で除去した。得られた粗生成物を冷ペンタンで処理し、
濾過し、そして乾燥し、白色固体として所期のＮ−〔３
−（３−メチル−１−ペンチニル）〕トリフルオロアセ
トアミド、２５５．５ｇ（８３％）を得た。

【００８０】（ｉｉ）５−クロロ−５−（ジクロロメチ
ル）−４−エチル−４−メチル−２−トリフルオロメチ
ルオキサゾリン塩酸塩の製造 機械式撹拌機、温度計、およびガス導入口を備えた５Ｌ
の４っ口丸底フラスコの中において、Ｎ−〔３−（３−
メチル−１−ペンチニル）〕トリフルオロアセトアミド
の２５５．５ｇ（１．３２モル）を塩化メチレンの４，
０００ｍＬに溶解した。得られた混合物を−３０℃に冷
却し。塩素の２３５ｇを２時間かけてバブリングさせ
た。添加完了後、反応混合物を−３０℃において３０分
間撹拌し、そして室温に温めた。粗反応混合物をロータ
リーエバポレーターで蒸発させ、所期の５−クロロ−５
−（ジクロロメチル）−４−エチル−４−メチル−２−
トリフルオロメチルオキサゾリン塩酸塩を得た。これは
そのまま次の工程において使用した。

【００８１】（ｉｉｉ）３−アミノ−１，１−ジクロロ
−３−メチル−２−ペンタノン塩酸塩 前記工程において造った５−クロロ−５−（ジクロロメ
チル）−４−エチル−４−メチル−２−トリフルオロメ
チルオキサゾリン塩酸塩を、メタノールの１８００ｍ
Ｌ、水の７２ｍＬ、および濃酸塩の１９０ｍＬに溶解
し、５０℃に温め、そしてその温度において一夜撹拌し
た。粗反応混合物を冷却し、そして氷／水／エチルエー
テル混合物の中に注ぎ入れた。これらの相を分離し、エ
ーテル相を水で１回抽出した。このエーテルは有機物Ｉ
として保存した。いっしょにした水性相をエチルエーテ
ルで１回洗い、そしてこの有機相を有機物Ｉといっしょ
にした（有機物ＩＩ）。水性相を飽和重炭酸ナトリウム
水溶液で中和し、エチルエーテルで２回抽出した。いっ
しょにしたエーテル相を水、ブラインで洗い、無水硫酸
マグネシウム上で乾燥し、活性チャコールで処理し、そ
してセライトを通して濾過した。得られた無色溶液に、
温度を２０℃以下に維持しながら無水塩化水素をバブリ
ングさせた。得られた白色固体を濾過し、乾燥し、白色
固体として所期の３−アミノ−１，１−ジクロロ−３−
メチル−２−ペンタノン塩酸塩の１２４．８ｇを得た。
エチルエーテル濾液を有機物ＩＩといっしょにし、真空
下で濃縮した。得られた残留物（１５０ｇ）をメタノー
ル／水／濃塩酸の混合液中に入れ、週末の間、５０℃で
加熱した。３−アミノ−１，１−ジクロロ−３−メチル
−２−ペンタノン塩酸塩５１ｇを得た。従って、得られ
た全量は１７５．８ｇ（収率６１％）であった。

【００８２】（ｉｖ）３−アミノ−１−クロロ−３−メ
チル−２−ペンタノン塩酸塩の製造 ２Ｌのパー瓶〔Ｐａｒｒ（登録商標）ｂｏｔｔｌｅ〕
に、３−アミノ−１，１−ジクロロ−３−メチル−２−
ペンタノン塩酸塩の４１ｇ、チャコール上の１０％パラ
ジウムの０．８ｇ、およびエタノールの４００ｍＬを入
れた。得られた混合物を、パー装置〔Ｐａｒｒ（登録商
標）ａｐｐａｒａｔｕｓ〕で５０ｐｓｉにおいて３時間
振とうした。粗反応混合物をセライトを通して濾過し、
真空下で蒸発させ、粘稠な油を得た。それを酢酸エチル
の３００−４００ｍＬ中に入れ、室温において数時間撹
拌した。所期の３−アミノ−１−クロロ−３−メチル−
２−ペンタノン塩酸塩が白色固体として結晶化した。ヘ
キサンの３００ｍＬを得られた懸濁液に加え、濾過し、
所期の３−アミノ−１−クロロ−３−メチル−２−ペン
タノン塩酸塩の３４ｇ（９８％）を得た。この反応を、
３−アミノ−１，１−ジクロロ−３−メチル−２−ペン
タノン塩酸塩の４１ｇ；４１ｇ；および５１ｇを使用し
て繰り返し、全部で３−アミノ−１−クロロ−３−メチ
ル−１−ペンタノン塩酸塩１３２．１ｇ（全体の収率９
０％）を得た。

【００８３】（ｌ）４−アミノ−３−クロロ−５−メト
キシイミノメチル−Ｎ−（３−クロロ−１−エチル−１
−メチル−２−オキソプロピル）ベンズアミドの製造
（化合物２） ５Ｌの３っ口丸底フラスコに、３−アミノ−１−クロロ
−３−メチル−２−ペンタノン塩酸塩の９３ｇおよび水
の８８５ｍＬを入れた。得られた溶液に、重炭酸ナトリ
ウムの１３８．６ｇを加え、次いで酢酸エチルの５００
ｍＬを加えた。得られたよく撹拌された混合物に、酢酸
エチルの１０００ｍＬに溶解した４−アミノ−３−クロ
ロ−５−メトキシイミノメチルベンゾイルクロライドの
１２３．５ｇを、室温において５０分間かけて加えた。
添加完了後、反応混合物を室温において１時間撹拌し
た。２つの相を分離し、有機相を水（２×５００ｍ
Ｌ）、ブライン（１×１５０ｍＬ）で洗い、無水硫酸マ
グネシウム上で乾燥し、そして溶剤をロータリーエバポ
レーターで除去し、褐色の油として粗生成物を得た。こ
の油を、溶離用溶媒として塩化メチレンを使用して短い
シリカゲルカラムを通した。溶媒を蒸発させ、オフホワ
イトの固体として所期の４−アミノ−３−クロロ−５−
メトキシイミノメチル−Ｎ−（３−クロロ−１−エチル
−１−メチル−２−オキソプロピル）ベンズアミド（ｍ
ｐ１４０−１４１℃）、１３３．３ｇを得た。

【００８４】表１中の化合物４および３０：化合物３０
は次の手順によって造った。３−ニトロ−Ｎ−（３−ク
ロロ−１−エチル−１−メチル−２−オキソプロピル）
ベンズアミドを（前述の）経路図Ａのようにして３−ニ
トロベンゾイルクロライドとＶＩＩＩとの反応により造
り、次いで触媒としてパラジウムを使用する接触水素添
加により、３−アミノ−Ｎ−（３−クロロ−１−エチル
−１−メチル−２−オキソプロピル）ベンズアミドに転
化した。

【００８５】機械式撹拌機、温度計および添加用漏斗を
備えた３００ｍＬの４っ口丸底フラスコの中において、
３．５ｇの３−アミノ−Ｎ−（３−クロロ−１−エチル
−１−メチル−２−オキソプロピル）ベンズアミドをジ
クロロメタンの１００ｍＬ中に懸濁させた。この混合物
を氷浴中において０−５℃に冷却し、次いでトリエチル
アミンの１．８ｍＬを加え、そしてその混合物を数分間
撹拌した。クロロギ酸メチル（１．１ｍＬ）を、温度を
５℃以下に維持しながらゆっくり滴下して加え、そして
混合物を２０分間撹拌した。氷浴を取り除き、反応混合
物を室温に温めた。反応混合物を水の５０ｍＬで２回洗
い、そして無水硫酸マグネシウム上で乾燥した。溶媒を
ロータリーエバポレーターを使用して除去し、粗生成物
を得た。粗生成物をシリカゲルのクロマトグラフィーに
より精製し、化合物３０を２３０ｍｇ得た。

【００８６】化合物４は、化合物３０と同じ手順により
造ったが、出発物質として４−ニトロベンゾイルクロラ
イドを使用した。

【００８７】表２、３、４および５中の化合物：表２、
３、４および５中の化合物は、米国特許第４，８６３，
９４０号に記載された合成方法により造った。

【００８８】表６中の化合物４０、４１、４２、４３お
よび４４：化合物４０、４１、４３、および４４は、前
述の経路図Ａに例示されているように、相応する芳香族
誘導体（ＶＩＩ）（ただし、Ｒ⁴およびＲ⁵は、いっしょ
になって縮合環を形成する）と、３−アミノ−１−クロ
ロ−３−メチル−２−ペンタノン塩酸塩｛化合物ＶＩＩ
Ｉ（ただしＲ¹はメチルであり、そしてＲ²はエチルであ
る）｝との反応によって造った。

【００８９】化合物４２を造るためには、まず最初に、
６−カルボキシ−１，３−ベンゾチアゾール（Ｍａｙｂ
ｒｉｄｇｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ Ｌｔ
ｄ．から販売されている）を、塩化チオニルで処理して
酸塩化物を造った。この酸塩化物を、トリエチルアミン
の存在下において３−アミノ−１−クロロ−３−メチル
−２−ペンタノン塩酸塩で処理して化合物４２を得た。

【００９０】化合物４１の芳香族部分を造るためには、
５−カルボキシベンゾオキサゾール誘導体ＸＩＶを、相
応する２−アミノフェノール誘導体から、当業界におけ
る既知の手順によって、例えばＥ．Ｃ．Ｔａｙｌｏｒ編
集のＴｈｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｈｅｔｅｒｏ
ｃｙｃｌｉｃ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ，ｖｏｌ．４７，Ｊ
ｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，１９８７、Ｇ．
Ｐ．Ｅｌｌｉｓによって編集された“Ｓｙｎｔｈｅｓｉ
ｓ ｏｆ Ｆｕｓｅｄ Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｅｓ”；
ｐ．５０，ｐａｒｔ Ｉ ａｎｄ ｐｐ．７１３−７１
４，ｐａｒｔ ＩＩに記載されている手順によって、造
った。この手順を次に示す：

【００９１】

【化１８】

【００９２】次いで、ＸＩＶを、トリエチルアミンの存
在下において、３−アミノ−１−クロロ−３−メチル−
２−ペンタノン塩酸塩で処理して化合物４１を得た。

【００９３】化合物４０、４３および４４の芳香族部分
を造るためには、６−カルボキシベンゾオキサゾール誘
導体（ＸＶ）を、後述する手順によって、相応する２−
アミノフェノール誘導体から造った：

【００９４】

【化１９】

【００９５】（式中Ｒ¹⁴は、ＨまたはＣＨ₃である）

【００９６】化合物４０を造るためには、６−カルボキ
シ−１，３−ベンゾオキサゾールを４−アミノ−３−ヒ
ドロキシ安息香酸から、オルトギ酸トリメチルで処理す
ることにより造った。最初に、６−カルボキシ−１，３
−ベンゾオキサゾールを塩化チオニルで処理して酸塩化
物を造った。この酸塩化物を、トリエチルアミンの存在
下において、３−アミノ−１−クロロ−３−メチル−２
−ペンタノン塩酸塩で処理して化合物４０を得た。

【００９７】化合物４３を造るためには、６−カルボキ
シ−４−クロロ−１，３−ベンゾオキサゾールを、４−
アミノ−５−クロロ−３−ヒドロキシ安息香酸から、オ
ルトギ酸トリメチルで処理することにより造った。最初
に、６−カルボキシ−４−クロロ−１，３−ベンゾオキ
サゾールを塩化チオニルで処理して酸塩化物を造った。
この酸塩化物を、トリエチルアミンの存在下において、
３−アミノ−１−クロロ−３−メチル−２−ペンタノン
塩酸塩で処理して化合物４３を得た。

【００９８】化合物４４を造るためには、６−カルボキ
シ−２−メチル−４−クロロ−１，３−ベンゾオキサゾ
ールを、４−アミノ−５−クロロ−３−ヒドロキシ安息
香酸から、オルト酢酸トリメチルで処理することにより
造った。最初に、６−カルボキシ−２−メチル−４−ク
ロロ−１，３−ベンゾオキサゾールを塩化チオニルで処
理して酸塩化物を得た。この酸塩化物を、トリエチルア
ミンの存在下において、３−アミノ−１−クロロ−３−
メチル−２−ペンタノン塩酸塩で処理して化合物４４を
得た。

【００９９】次の実施例は、本発明の方法を例示するた
めに提供された。

【０１００】実施例１ 卵菌類菌、Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｃａｐｓｉｃｉ
に適用したときの、ベータ−チューブリンに共有結合す
る化合物３の能力をこの実施例において示した。

【０１０１】Ｐ．ｃａｐｓｉｃｉ（ＡＴＣＣ１５３９
９）を、１Ｌにつき２００ｍＬのＶ−８ジュース、４ｇ
のＣａＣＯ₃、および２０ｇの寒天を含有するＶ−８寒
天培地、ｐＨ７．０の上に維持した。Ｅｒｗｉｎ，Ｄ．
Ｃ．およびＫａｔｚｎｅｌｓｏｎ，Ｋ．，１９７１，Ｃ
ａｎａｄｉａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂ
ｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．７，ｐ．１５−２５（１９７
１）に記載されているアスパラギン−スクロース培地の
２０ｍＬを含有するエルレンマイヤーフラスコに、Ｖ−
８寒天上で生長したＰ．ｃａｐｓｉｃｉの培養物の生長
端から切り取った菌糸体プラグ（ｍｙｃｅｌｉａｌ ｐ
ｌｕｇ）（直径７ｍｍ）を接種した。このフラスコを、
２６℃においてジャイロタリーシェーカー（ｇｙｒｏｔ
ａｒｙ ｓｈａｋｅｒ）上で１２０ｒｐｍにおいて振と
うしながら７２時間インキュベート（ｉｎｃｕｂａｔ
ｅ）し、次いで０．８ｍＭの¹⁴Ｃ−ラベルされた（ｌａ
ｂｅｌｅｄ）化合物３の５０μＬを加えた。１時間更に
インキュベーションした後、菌糸体を濾過により集め、
水１００ｍＬで洗った。菌糸体を液体窒素で凍結し、微
粉末に粉砕した。タンパク質を、非共有結合のリガンド
の解離を生じると考えられる変性条件（ｄｅｎａｔｕｒ
ｉｎｇ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）下（３％ドデシル硫酸
ナトリウム、５％メルカプトエタノールおよび１０％グ
リセロールを含有する６２ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液中
において、１００℃で５分間加熱）で抽出した。抽出し
たタンパク質のアリコート（ａｌｌｉｑｕｏｔｓ）をド
デシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動
（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）にかけ、Ｌａｅｍｍｌｉ，Ｕ．
Ｋ．，Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ），ｖｏｌ．２７
７，ｐｐ．６８０−６８５，１９７０にしたがって、２
つ（ｄｕｐｌｉｃａｔｅ）の７．５％ポリアクリルアミ
ドゲルにタンパク質を分離した。１つのゲルはコオマス
イブリリアント ブルー Ｒ２５０（Ｃｏｏｍａｓｓｉ
ｅ ｂｒｉｌｌｉａｎｔｂｌｕｅ Ｒ２５０）でタンパ
ク質を染色した。第２のゲルからのタンパク質は、電気
泳動でニトロセルロース膜に移した。この膜に、ＥＮ³
ＨＡＮＣＥ（登録商標）スプレー（Ｄｕｐｏｎｔ ＮＥ
Ｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）を噴霧し、
ラジオラベルしたタンパク質の場所を、コダック（Ｋｏ
ｄａｋ）Ｘ−ＯＭＡＴ ＡＲフィルムを使用して、３週
間露光で、オートラジオグラフィー（ａｕｔｏｒａｄｉ
ｏｇｒａｐｈｙ）により測定した。ニトロセルロース上
のベータ−チューブリンの場所は、ベータ−チューブリ
ンに対するモノクローナル抗体でイムノラベリング（ｉ
ｍｍｕｎｏｌａｂｅｌｉｎｇ）することにより測定し
た。それらの結果を図１に示した。点線は、コオマスイ
で着色したゲルの濃度分布（ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｒｉ
ｃ ｓｃａｎ）を表し、タンパク質の分布を示してい
る。連続線は、オートラジオグラフィーでの濃度分布を
表し、単一の¹⁴Ｃ−ラベルバンドを示している。イムノ
ラベリングにより測定したようなベータ−チューブリン
の場所は、矢印によって示され、そして¹⁴Ｃ−ラベルさ
れたタンパク質バンドと一致した。

【０１０２】実施例２ 懸濁培養したタバコ細胞に適用したときのベータ−チュ
ーブリンに共有結合する化合物１の能力をこの実施例に
おいて示した。

【０１０３】懸濁培養したタバコ細胞を、Ｎａｇａｔ
ａ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ
Ｇｅｎｅｒａｌ Ｇｎｅｔｉｃｓ，ｖｏｌ．１８４，ｐ
ｐ．１６１−１６５（１９８１）により調製した生長培
地（ｇｒｏｗｔｈ ｍｅｄｉｕｍ）の中で、２７℃にお
いて２００ｒｐｍのジヤイロタリーシェーカー上で生長
させた。細胞を、１０μＭの濃度において¹⁴Ｃでラベル
された化合物１で１時間処理し、次いで濾過により集め
た。これらの細胞を液体窒素で凍結し、微粉末に粉砕
し、次いで実施例１に記載されているように、タンパク
質を抽出し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥにより２つのゲル
に分離した。実施例１に記載されているように、１つの
ゲルではタンパク質を染色し、そして第２のゲルは、オ
ートラジオグラフィーおよびイムノラベリングにより分
析した。それらの結果を図２に示した。点線は、コオマ
スイで染色したゲルの濃度分布を表し、タンパク質の分
布を示している。連続線は、オートラジオグラフィーに
よる濃度分布を表し、単一の¹⁴Ｃラベルバンドを示して
いる。イムノラベリングにより測定したベータ−チュー
ブリンの場所は矢印によって指示され、そして¹⁴Ｃでラ
ベルされたタンパク質のバンドと一致していた。

【０１０４】実施例３ 単離したウシ（ｂｏｖｉｎｅ）のチューブリンのベータ
−サブユニットに共有結合する化合物１の能力をこの実
施例において示した。

【０１０５】チューブリンを、ウシの脳から、Ｍｅｔｈ
ｏｄ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙｖｏｌ．１３４，ｐ
ｐ．８９−１０４（１９８６）中のＶａｌｌｅｅ，Ｒ．
Ｂ．によって記載されている方法によって単離した。１
ｍＭのＭｇＣｌ₂を含有するｐＨ６．６の、１．０Ｍグ
ルタミン酸ナトリウム中のチューブリン（１０μＭ）
を、３７℃において、２５μＭの¹⁴Ｃ−ラベルされた化
合物１で４時間インキュベートした。試料を氷浴に３分
間移し、２０％トリクロロ酢酸を添加してチューブリン
を沈殿させ、氷上で更に２０分間インキュベートした。
１２，０００ｒｐｍにおいて５分間遠心分離した後、チ
ューブリンペレットを８０％の氷冷アセトンで１回洗
い、そして室温において３％ドデシル硫酸ナトリウム、
５％メルカプトエタノールおよび１０％グリセロールを
含有する、ｐＨ６．８の６２ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液
に溶解した。試料を１００℃において２分間加熱し、次
いで、実施例１に記載したように、アリコートをＳＤＳ
−ＰＡＧＥにかけ、２つのゲルに分離した。実施例１に
記載したように、１つのゲルではタンパク質を染色し、
そして第２のゲルはオートラジオグラフィーおよびイム
ノラベリングにより分析した。イムノラベリングは、ベ
ータ−チューブリンおよびアルファ−チューブリンの両
方に対するモノクローナル抗体を使用して行った。それ
らの結果を図３に示した。イムノラベリングにより測定
されたアルファ−チューブリンおよびベータ−チューブ
リンの場所は、矢印によって示されている。点線は、コ
オマスイで染色したゲルの濃度分布を表し、タンパク質
の分布を示しており、アルファ−チューブリンおよびベ
ータ−チューブリンに対応する２つの主なタンパク質バ
ンドを有している。連続線は、オートラジオグラフィー
での濃度分布を表し、主にベータ−チューブリンサブユ
ニットのラベリングを示している。

【０１０６】実施例４ タバコを懸濁培養した細胞中のチューブリンへの化合物
１の結合に対する異なった種類の化学薬剤である種々の
抗チューブリン化合物の効果をこの実施例に示した。

【０１０７】実施例２に記載したように生長させた懸濁
培養したタバコの細胞のアリコート（２ｍＬ）を２５ｍ
Ｌ容量のガラス製バイアル（ｖｉａｌｓ）に加えた。次
いで、各バイアルに、ＤＭＳＯ（対照）の５μＬまたは
ＤＭＳＯに溶解した抗チューブリン化合物の５μＬを入
れた。これらバイアルを、２７℃において振とうしなが
ら２時間インキュベートし、次いでＤＭＳＯに溶かした
トリチウム−ラベルされた化合物１の１００μＭ溶液の
５μＬを加えた。バイアルを２７℃において振とうしな
がら２０分間インキュベートし、次いで、ラジオリガン
ド（ｒａｄｉｏｌｉｇａｎｄ）の結合をラベルをしてい
ない４０ｍＭの化合物１の５μＬを加えることによって
停止した。試料を２７℃において振とうしながら更に２
０分間インキュベートし、次いで氷浴中の１５ｍＬ容量
のポリプロピレン遠心分離用管に移した。各バイアルを
（実施例２に記載した）２ｍＬの氷冷生長培地ですす
ぎ、次いですすいだ溶液を試料の残部に加えた。４℃に
おいて３分間２，５００ｒｐｍにおいて遠心分離後、上
澄み液を捨て、そしてペレットになった細胞を氷冷した
１０％トリクロロ酢酸の４ｍＬ中に再懸濁した。試料を
氷浴中で１時間保持し、再び遠心分離し、そして細胞を
氷冷エタノールの４ｍＬ中に再懸濁した。氷浴中で更に
１時間インキュベートした後、細胞を濾過によりガラス
繊維フィルター上に集め、氷冷エタノールの１０ｍＬで
２回洗った。洗った細胞を有するフィルターをシンチレ
ーションバイアルに移し、ハイドロフルオー〔Ｈｙｄｒ
ｏｆｌｕｏｒ（登録商標）〕シンチレーション流体（Ｎ
ａｔｉｏｎａｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｍａｎｖｉ
ｌｌｅ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）の１０ｍＬを各バイア
ルに加え、そして試料をシンチレーションカウンターで
カウントし、結合した放射能の量を測定した。ラジオリ
ガンドの結合に対する異なった抗チューブリン化合物の
効果を表７に示した。各抗チューブリン化合物の存在下
における結合したラジオリガンドの量は、ＤＭＳＯ対照
における結合したラジオリガンドの量に対する百分率と
して表した。パクリタクセルおよび抗チューブリン除草
剤プロナミドおよびクロルプロファムは、ラジオリガン
ドの結合を減少させたが、抗チューブリン除草剤トリフ
ルラリンはラジオリガンドの結合を増加させた。

【０１０８】

【表７】

【０１０９】実施例５ Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｃａｐｓｉｃｉ中のチュー
ブリンへの化合物１の結合に対するパクリタクセルの効
果をこの実施例において示した。

【０１１０】アスパラギン−スクロース培地中のＰ．ｃ
ａｐｓｉｃｉの液体菌糸体振とう培養物を使用して、バ
インディングアッセイ用の菌物質の均質懸濁液を造っ
た。アスパラギン−スクロース培地（１００ｍＬ）に、
Ｖ−８寒天培地上で生長した培養物から切り取った菌糸
体プラグを接種し、２６℃において、ジャイロタリーシ
ェーカー上で４８時間インキュベートした。培養物をブ
レンダー（ｂｌｅｎｄｅｒ）中において均質化し、均質
物の３０ｍＬを新しい培地の１００ｍＬの中で二次培養
し、次いで２６℃において、ジャイロタリーシェーカー
上で１７時間インキュベートした。得られた菌糸体を遠
心分離により培地から回収し、新しい、培地の１１７０
ｍＬ中に再懸濁した。この懸濁液のアリコート（２ｍ
Ｌ）を２５ｍＬ容量のガラス製バイアルに入れた。それ
ぞれのバイアルにＤＭＳＯ（対照）の５μＬまたはＤＭ
ＳＯに溶解したパクリタクセルの５μＬを入れた。これ
らバイアルを、２６℃において振とうしながら１時間イ
ンキュベートし、次いでＤＭＳＯに溶かしたトリチウム
−ラベルされた化合物１の１００μＭ溶液の５μＬを加
えた。これらバイアルを、２６℃において振とうしなが
ら２０分間インキュベートし、次いで、ラジオリガンド
の結合をラベルしていない４０ｍＭの化合物１の５μＬ
を加えることによって停止した。試料を２７℃において
振とうしながら更に２０分間インキュベートし、次いで
氷浴中の１５ｍＬ容量の遠心分離用管に移した。各バイ
アルを２ｍＬの氷冷培地ですすぎ、次いでそれを試料の
残部に加えた。４℃において５分間３，４００ｒｐｍに
おいて遠心分離後、上澄み液を捨て、そしてペレットに
なった細胞を氷冷の１０％トリクロロ酢酸の４ｍＬ中に
再懸濁した。試料を氷浴中で１時間保持し、再び遠心分
離し、そして細胞を氷冷エタノールの４ｍＬ中に再懸濁
した。氷浴中で更に２時間インキュベートした後、細胞
を濾過によりガラス繊維フィルター上に集め、氷冷エタ
ノールで２回洗った。洗った細胞を有するフィルターを
シンチレーションバイアルに移し、ハイドロフルオーシ
ンチレーション流体の１０ｍＬを加え、そして試料をシ
ンチレーションカウンチーでカウントし、結合した放射
能の量を測定した。ラジオリガンドの結合に対する種々
の濃度におけるパクリタクセルの効果を表８に示した。
パクリタクセルの存在下における結合したラジオリガン
ドの量は、ＤＭＳＯ対照中における結合したラジオリガ
ンドの量に対する百分率として表した。

【０１１１】

【表８】

【０１１２】実施例６ Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｃａｐｓｉｃｉ中のチュー
ブリンに対する化合物１の結合によるザリルアミド（ｚ
ａｉｌａｍｉｄｅ）および表１に記載された化合物７、
８、１６、１９、２３および２７の効果をこの実施例に
おいて示した。

【０１１３】Ｐ．ｃａｐｓｉｃｉの遊走子（ｚｏｏｓｐ
ｏｒｅｓ）を次のように造った。Ｖ−８寒天培地の１５
ｍＬを含有する直径９ｃｍのペトリ皿に、Ｐ．ｃａｐｓ
ｉｃｉの菌糸体プラグを接種し、暗所において２５℃で
４日間インキュベートし、次いで連続蛍光線灯（ｃｏｎ
ｔｉｎｕｏｕｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｌｉｇｈ
ｔ）下に３日間放置して胞子形成を誘発した。遊走子リ
リース（ｚｏｏｓｐｏｒｅｒｅｌｅａｓｅ）を誘発する
ために、滅菌した水１５ｍＬを各皿に加えた。これらの
皿を室温において１０分間インキュベートし、次いで４
℃において２０分間インキュベートし、最後に室温に１
５分間もどした。次いで、遊走子含有流体を各皿から除
き、１ｍＬにつき５×１０⁵遊走子の密度に調節した。
発芽した遊走子シスト（ｇｅｒｍｉｎａｔｅｄ ｚｏｏ
ｓｐｏｒｅｓ ｓｙｓｔｓ）を含有するアッセイ用管
を、１６×１．２５ｃｍのポリプロピレン管中のアスパ
ラギン−スクロース培地の４００μＬに遊走子懸濁液の
１００μＬを加えることにより造り、次いでゆるくふた
をし、そして１２０ｒｐｍのジャイロタリーシェーカー
上で２６℃において２４時間インキュベートした。

【０１１４】次いで、発芽した遊走子シストを含有する
管に、ＤＭＳＯ（対照）の２．５μＬまたはＤＭＳＯに
溶解した試験化合物の２．５μＬを入れた。各化合物を
一連の濃度において試験した。これら管を２６℃におい
て振とうしながら１時間インキュベートし、次いでＤＭ
ＳＯ中のトリチウム−ラベルされた化合物１の４０μＭ
溶液の２．５μＬを加えた。バイアルを２６℃において
振とうしながら２０分間インキュベートし、次いで、ラ
ジオリガンドの結合を氷冷したラベルしていない１３３
μＭの化合物１の１．５ｍＬを加えることによって停止
し、そして管を氷浴に移した。３，４００ｒｐｍにおい
て３分間遠心分離後、上澄み液を捨て、そしてペレット
になった細胞を氷冷の１０％トリクロロ酢酸の２ｍＬ中
に再懸濁した。試料を氷浴中で１時間保持し、再び遠心
分離し、そして細胞を氷冷エタノールの２ｍＬ中に再懸
濁した。氷浴中で更に１時間インキュベートした後、氷
冷エタノールをさらに４ｍＬ、それぞれの管に加え、そ
して細胞を濾過によりＢｒａｎｄｅｌｌ ｃｅｌｌ ｈ
ａｒｖｅｓｔｅｒ（Ｂｒａｎｄｅｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃ
ａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅ
ｎｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔ
ｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）中のガラス繊維
フィルター上に集め、氷冷エタノールの４ｍＬで２回洗
った。洗った細胞を有するフィルターをシンチレーショ
ンバイアルに移し、そして水の０．１ｍＬを加え、次い
で１ｍＬのプロトソル〔Ｐｒｏｔｏｓｏｌ（登録商
標）〕（Ｄｕｐｏｎｔ ＮＥＮ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐ
ｒｏｄｕｃｔｓ）を加えた。バイアルを６０℃において
３０分間インキュベートし、そして室温に冷却した。エ
コノフルオー〔Ｅｃｏｎｏｆｌｕｏｒ（登録商標）〕シ
ンチレーション流体（Ｄｕｐｏｎｔ ＮＥＮ Ｒｅｓｅ
ａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）の１０ｍＬを加え、試料
をシンチレーションカウンターでカウントし、結合した
放射能の量を測定した。各試験化合物のためのＩＣ５０
値（試験化合物を含まない対照に比較してラジオリガン
ドの結合を５０％阻害するのに要する濃度として定義し
た）は、用量−応答曲線（ｄｏｓｅ−ｒｅｓｐｏｎｓｅ
ｃｕｒｖｅ）から決定し、表９に示した。

【０１１５】

【表９】

【０１１６】実施例７ 本実施例は、単離したウシ（ｂｏｖｉｎｅ）のチューブ
リンにおける抗チューブリン化合物の効果を検出するた
めのプローブとしての化合物１の利用について示す。

【０１１７】アッセイ混合物は、０．５ｍＬのポリプロ
ピレン管の中に、１．０Ｍのグルタミン酸ナトリウム中
の１０μＭの単離したチューブリンを含有し、ｐＨ６．
６であり、１ｍＭのＭｇＣｌ₂および２５μＬのＤＭＳ
Ｏ（対照）またはＤＭＳＯに溶解した試験化合物の２．
５μＬを含有していた。この混合物を３７℃において３
０分間インキュベートし、次いでＤＭＳＯに溶かしたト
リチウム−ラベルされた化合物１の６４０μＭ溶液の
２．５μＬを加えた。３７℃において１２０分間更にイ
ンキュベートした後、アッセイ混合物のアリコート（８
０μＬ）を、直径２．３ｃｍのワットマン（Ｗｈａｔｍ
ａｎ）３ＭＭ濾紙ディスク（ｄｉｓｋｓ）に適用し、暖
かい空気下で１５秒間乾燥し、氷冷した１０％トリクロ
ロ酢酸の３ｍＬに浸漬し、そして４℃において一夜放置
した。これらディスクを５％トリクロロ酢酸中に３０分
間移し、５％トリクロロ酢酸で更に２回洗い、３７℃に
おいて、エタノール／エーテル（１：１、ｖ／ｖ）で３
０分間洗い、次いで室温において、エタノール／エーテ
ル（１：１、ｖ／ｖ）で１５分間洗い、最後に、室温に
おいて、エーテル中でそれぞれ１５分間２回続けて洗っ
た。ディスクを乾燥し、ハイドロフルオーの１０ｍＬを
含有するシンチレーションバイアルに移し、そしてシン
チレーションカウンターでカウントした。ラジオリガン
ドの結合に対する１００μＭの最終濃度における抗チュ
ーブリン化合物の効果を表１０に示した。各抗チューブ
リン化合物の存在下における結合したラジオリガンドの
量は、ＤＭＳＯ対照において結合したラジオリガンドの
量に対する百分率として表した。

【０１１８】

【表１０】

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｃａｐｓ
ｉｃｉを¹⁴Ｃラベルされた化合物３で処理した後の、ド
デシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動
およびオートラジオグラフィーによるラジオラベルされ
たタンパク質の分析を示している。

【図２】図２は、懸濁培養したタバコ細胞を¹⁴Ｃラベル
された化合物１で処理した後の、ドデシル硫酸ナトリウ
ムポリアクリルアミドゲル電気泳動およびオートラジオ
グラフィーによるラジオラベルされたタンパク質の分析
を示している。

【図３】図３は、単離したウシのチューブリンを¹⁴Ｃラ
ベルされた化合物１で処理した後の、ドデシル硫酸ナト
リウムポリアクリルアミドゲル電気泳動およびオートラ
ジオグラフィーによるラジオラベルされたタンパク質の
分析を示している。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ０７Ｃ 271/24 Ｃ０７Ｃ 271/24 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｚ

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 真核細胞の生長を阻害するある種のアミ
   ドを使用する、真核細胞、細胞抽出物およびチューブリ
   ン調製物中のチューブリン含量を監視かつ測定し、抗チ
   ューブリン活性、抵抗性の化合物をスクリーニングする
   ために有用なバインディングアッセイの実施方法であっ
   て、前記アミドは、次の構造式（Ｉ）を有している前記
   方法： 【化１】 〔式中、Ａは（Ｃ₃−Ｃ₇）シクロアルキル、（Ｃ₁−
   Ｃ₆）アルキル、ハロ（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル、（Ｃ₂−Ｃ
   ₆）アルケニル、ハロ（Ｃ₂−Ｃ₆）アルケニル、（Ｃ₂−
   Ｃ₆）アルキニル、ハロ（Ｃ₂−Ｃ₆）アルキニル、フェ
   ニル、ピリジル、フリル、チエニル、イソオキサゾリ
   ル、オキサゾリル、ピロリル、イソチアゾリル、チアゾ
   リル、ピラゾリル、イミダゾリル、ピリミジニル、キノ
   リル、イソキノリル、ナフチル、ピリダジニル、ピラジ
   ニル、ベンゾチエニル、インドリル、ベンゾフラニルま
   たはベンジル；または、それぞれ独立して、ハロ、シア
   ノ、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル、ハロ（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキ
   ル、（Ｃ₂−Ｃ₆）アルケニル、ハロ（Ｃ₂−Ｃ₆）アルケ
   ニル、（Ｃ₂−Ｃ₆）アルキニル、ハロ（Ｃ₂−Ｃ₆）アル
   キニル、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルコキシ、ハロ（Ｃ₁−Ｃ₆）ア
   ルコキシ、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキルチオ、ハロ（Ｃ₁−
   Ｃ₆）アルキルチオ、ニトロ、−ＮＲ⁶Ｒ⁷、−ＣＲ⁸＝Ｎ
   ＯＲ⁹、−ＮＨＣＯＯＲ¹⁰、ＣＯＮＲ¹¹Ｒ¹²または−Ｃ
   ＯＯＲ¹³から選ばれた４個またはそれより少ない置換基
   で置換された、フェニル、ピリジル、フリル、チエニ
   ル、イソオキサゾリル、オキサゾリル、ピロリル、イソ
   チアゾリル、チアゾリル、ピラゾリル、イミダゾリル、
   ピリミジニル、キノリル、イソキノリル、ナフチル、ピ
   リダジニル、ピラジニル、ベンゾチエニル、インドリ
   ル、ベンゾフラニル、またはベンジルであり；またはＡ
   が不飽和環であり、かつ互いに隣接している２個または
   それより多くの置換基で置換されているときは、前記置
   換基の２個は、酸素、窒素、硫黄およびリンから選ばれ
   た２個までのヘテロ原子を含有する５、６、または７員
   の縮合環を形成してもよく；Ｒ¹およびＲ²は、それぞれ
   独立して、水素原子、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル、ハロ（Ｃ
   ₁−Ｃ₆）アルキル、（Ｃ₂−Ｃ₆）アルケニル、ハロ（Ｃ
   ₂−Ｃ₆）アルケニル、（Ｃ₂−Ｃ₆）アルキニルまたはハ
   ロ（Ｃ₂−Ｃ₆）アルキニルであり、ただし、Ｒ¹および
   Ｒ²の両方が水素原子ではなく；Ｒ⁶およびＲ⁷は、それ
   ぞれ独立して、水素原子、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキルまたは
   （Ｃ₁−Ｃ₆）アルキルカルボニルであり；Ｒ⁸は、水素
   原子、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル、（Ｃ₂−Ｃ₆）アルケニル
   または（Ｃ₂−Ｃ₆）アルキニルであり；Ｒ⁹は、水素原
   子、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル、（Ｃ₂−Ｃ₆）アルケニル、
   （Ｃ₂−Ｃ₆）アルキニルまたは（Ｃ₁−Ｃ₄）アルキルカ
   ルボニルであり；Ｒ¹⁰、Ｒ¹¹、Ｒ¹²およびＲ¹³は、それ
   ぞれ独立して、水素原子、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル、（Ｃ
   ₂−Ｃ₆）アルケニルまたは（Ｃ₂−Ｃ₆）アルキニルであ
   り；そしてＸ、ＹおよびＺは、それぞれ独立して、水素
   原子、ハロ、シアノ、チオシアノ、イソチオシアノまた
   は（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキルスルホニルオキシであり、ただ
   し、Ｘ、ＹおよびＺの少なくとも１つは水素原子でな
   い〕または、それらの光学的対掌体。
2. 【請求項２】 構造式（ＩＩ）： 【化２】 〔式中、Ｒ¹およびＲ²は、それぞれ独立して、水素原
   子、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル、ハロ（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキ
   ル、（Ｃ₂−Ｃ₆）アルケニルまたは（Ｃ₂−Ｃ₆）アルキ
   ニルであり、ただし、Ｒ¹およびＲ²の両方が水素原子で
   はない；Ｒ³、Ｒ⁴、およびＲ⁵は、それぞれ独立して、
   水素原子、ハロ、シアノ、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル、ハロ
   （Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル、（Ｃ₂−Ｃ₆）アルケニル、（Ｃ
   ₂−Ｃ₆）アルキニル、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルコキシ、（Ｃ₁
   −Ｃ₆）アルキルチオ、ハロ（Ｃ₁−Ｃ₆）アルコキシ、
   ニトロ、−ＮＲ⁶Ｒ⁷、−ＣＲ⁸＝ＮＯＲ⁹、−ＮＨＣＯＯ
   Ｒ¹⁰、−ＣＯＮＲ¹¹Ｒ¹²または−ＣＯＯＲ¹³であり；ま
   たはＲ⁴およびＲ⁵は、いっしょになって、Ｏ、Ｓ、Ｎお
   よびＰから成る群から選ばれた２個までのヘテロ原子を
   含有してもよい５、６、または７員の縮合環を形成して
   おり；Ｒ⁶、Ｒ⁷、Ｒ⁸、Ｒ⁹、Ｒ¹⁰、Ｒ¹¹、Ｒ¹²、および
   Ｒ¹³は、それぞれ独立して、水素原子または（Ｃ₁−
   Ｃ₆）アルキルであり；そしてＸおよびＹは、それぞれ
   独立して、水素原子、ハロ、シアノ、チオシアノ、イソ
   チオシアノまたは（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキルスルホニルオキ
   シであり、ただし、ＸおよびＹの両方が水素原子ではな
   い〕を有するアミド；または、それらの光学的対掌体を
   使用する、請求項１に記載の方法。
3. 【請求項３】 構造式（ＩＩ）：〔式中、Ｒ¹は、メチ
   ルであり；Ｒ²は、メチルまたはエチルであり；Ｒ³およ
   びＲ⁵は、それぞれ独立して、水素原子、ハロ、メチ
   ル、ニトロ、シアノ、−ＮＲ⁶Ｒ⁷、−ＣＲ⁸＝ＮＯＲ⁹ま
   たは−ＮＨＣＯＯＲ¹⁰であり、ただし、Ｒ³およびＲ⁵の
   両方が水素原子ではない；Ｒ⁴は、水素原子、ハロ、−
   ＮＲ⁶Ｒ⁷、シアノ、−ＣＲ⁸＝ＮＯＲ⁹、−ＮＨＣＯＯＲ
   ¹⁰、−ＣＯＯＲ¹³または（Ｃ₁−Ｃ₄）アルキルであり；
   Ｒ⁶、Ｒ⁷、Ｒ⁸、Ｒ⁹、Ｒ¹⁰およびＲ¹³は、それぞれ独立
   して、水素原子または（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキルであり；Ｘ
   は、クロロであり；そしてＹは、水素原子である〕を有
   する安息香酸アミド；またはそれらの光学的対掌体を使
   用する、請求項２に記載の方法。
4. 【請求項４】 哺乳類の細胞、細胞抽出物またはチュー
   ブリンを使用するアッセイにおいて、構造式（ＩＩ）：
   〔式中、Ｒ¹は、メチルであり；Ｒ²は、エチルであり；
   Ｒ³は、ハロまたはシアノであり；Ｒ⁴およびＲ⁵は、ア
   ミノまたは−ＣＨ＝ＮＯＣＨ₃であり、ただし、Ｒ⁴およ
   びＲ⁵は同じでない；Ｘは、クロロであり、そしてＹ
   は、水素原子である〕を有する安息香酸アミド；または
   それらの光学的対掌体を使用する、請求項３に記載の方
   法。
5. 【請求項５】 菌が子のう菌類、不完全菌類または担子
   菌類に属する菌の細胞、細胞抽出物またはチューブリン
   を使用するアッセイにおいて、構造式（ＩＩ）：〔式
   中、Ｒ¹は、メチルであり；Ｒ²は、メチルまたはエチル
   であり；Ｒ³は、−ＣＨ＝ＮＯＣＨ₃であり；Ｒ⁴は、水
   素原子、ハロ、アミノ、シアノまたはメチルであり；Ｒ
   ⁵は、ハロ、メチル、ニトロ、またはシアノであり、Ｘ
   は、クロロであり、そしてＹは、水素原子である〕を有
   する安息香酸アミド；またはそれらの光学的対掌体を使
   用する、請求項３に記載の方法。
6. 【請求項６】 菌が卵菌類に属する菌の細胞、細胞抽出
   物またはチューブリンを使用するアッセイにおいて、構
   造式（ＩＩ）：〔式中、Ｒ¹は、メチルであり；Ｒ²は、
   エチルであり；Ｒ³およびＲ⁵は、それぞれ独立して、水
   素原子、ハロ、メチル、ニトロ、シアノ、−ＮＲ⁶Ｒ⁷、
   −ＣＲ⁸＝ＮＯＲ⁹または−ＮＨＣＯＯＲ¹⁰であり、ただ
   し、Ｒ³およびＲ⁵の両方が水素原子ではない；Ｒ⁴は、
   水素原子、ハロ、−ＮＲ⁶Ｒ⁷、シアノ、−ＣＲ⁸＝ＮＯ
   Ｒ⁹、−ＮＨＣＯＯＲ¹⁰、−ＣＯＯＲ¹³または（Ｃ₁−Ｃ
   ₄）アルキルであり；Ｒ⁶、Ｒ⁷、Ｒ⁸、Ｒ⁹、Ｒ¹⁰および
   Ｒ¹³は、それぞれ独立して、水素原子またはメチルであ
   り；Ｘは、クロロであり、そしてＹは、水素原子であ
   る〕を有する安息香酸アミド；またはそれらの光学的対
   掌体を使用する、請求項３に記載の方法。
7. 【請求項７】 植物の細胞、細胞抽出物またはチューブ
   リンを使用するアッセイにおいて、構造式（ＩＩ）：
   〔式中、Ｒ¹は、メチルであり；Ｒ²は、メチルまたはエ
   チルであり；Ｒ³およびＲ⁵は、それぞれ独立して、水素
   原子、ハロ、メチル、ニトロまたはシアノであり、ただ
   しＲ³およびＲ⁵の両方が水素原子ではない；Ｒ⁴は、水
   素原子であり；Ｘは、クロロであり；そしてＹは、水素
   原子である〕を有する安息香酸アミド；またはそれらの
   光学的対掌体を使用する、請求項３に記載の方法。
8. 【請求項８】 構造式（ＩＩＩ）： 【化３】 〔式中、Ｒ¹およびＲ²はそれぞれ独立して、水素原子、
   （Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル、ハロ（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル、
   （Ｃ₂−Ｃ₆）アルケニルまたは（Ｃ₂−Ｃ₆）アルキニル
   であり、ただしＲ¹およびＲ²の両方が水素原子ではな
   い；Ｒ³およびＲ⁵は、それぞれ独立して、水素原子、ハ
   ロ、シアノ、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル、ハロ（Ｃ₁−Ｃ₆）
   アルキル、（Ｃ₂−Ｃ₆）アルケニル、（Ｃ₂−Ｃ₆）アル
   キニル、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルコキシ、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキ
   ルチオ、ハロ（Ｃ₁−Ｃ₆）アルコキシ、ニトロ、カルボ
   キシ、−ＮＲ⁶Ｒ⁷、−ＣＲ⁸＝ＮＯＲ⁹、−ＮＨＣＯＯＲ
   ¹⁰、−ＣＯＮＲ¹¹Ｒ¹²または−ＣＯＯＲ¹³であり；
   Ｒ⁶、Ｒ⁷、Ｒ⁸、Ｒ⁹、Ｒ¹⁰、Ｒ¹¹、Ｒ¹²およびＲ¹³は、
   水素原子または（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキルであり、そしてＸ
   およびＹは、それぞれ独立して、水素原子、ハロ、シア
   ノ、チオシアノ、イソチオシアノまたは（Ｃ₁−Ｃ₆）ア
   ルキルスルホニルオキシであり、ただし、ＸおよびＹの
   両方が水素原子ではない〕を有するピリジンカルボキサ
   ミド；またはそれらの光学的対掌体を使用する、請求項
   １に記載の方法。
9. 【請求項９】 構造式（ＩＶ）： 【化４】 〔式中、Ｒ¹およびＲ²はそれぞれ独立して、水素原子、
   （Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル、ハロ（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル、
   （Ｃ₂−Ｃ₆）アルケニルまたは（Ｃ₂−Ｃ₆）アルキニル
   であり、ただしＲ¹およびＲ²の両方が水素原子ではな
   い；Ｒ³およびＲ⁴は、それぞれ独立して、水素原子、ハ
   ロ、シアノ、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル、ハロ（Ｃ₁−Ｃ₆）
   アルキル、（Ｃ₂−Ｃ₆）アルケニル、（Ｃ₂−Ｃ₆）アル
   キニル、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルコキシ、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキ
   ルチオ、ハロ（Ｃ₁−Ｃ₆）アルコキシ、ニトロ、カルボ
   キシ、−ＮＲ⁶Ｒ⁷、−ＣＲ⁸＝ＮＯＲ⁹、−ＮＨＣＯＯＲ
   ¹⁰、−ＣＯＮＲ¹¹Ｒ¹²または−ＣＯＯＲ¹³であり；また
   はＲ³およびＲ⁴はいっしょになってＯ、Ｓ、ＮおよびＰ
   からなる群から選ばれた２個までのヘテロ原子を含有し
   てもよい５、６または７員の縮合環を形成してもよく；
   Ｒ⁶、Ｒ⁷、Ｒ⁸、Ｒ⁹、Ｒ¹⁰、Ｒ¹¹、Ｒ¹²およびＲ¹³は、
   それぞれ独立して、水素原子または（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキ
   ルであり、そしてＸおよびＹは、それぞれ独立して、水
   素原子、ハロ、シアノ、チオシアノ、イソチオシアノま
   たは（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキルスルホニルオキシであり、た
   だし、ＸおよびＹの両方が水素原子ではない〕を有する
   ピリジンカルボキサミド；またはそれらの光学的対掌体
   を使用する、請求項１に記載の方法。
10. 【請求項１０】 構造式（ＩＶ）：〔式中、Ｒ¹は、メ
    チルであり；Ｒ²は、メチルまたはエチルであり；Ｒ³お
    よびＲ⁴は、それぞれ独立して、水素原子、ハロ、シア
    ノ、メチル、ニトロ、−ＮＲ⁶Ｒ⁷、−ＣＲ⁸＝ＮＯＲ⁹ま
    たは−ＮＨＣＯＯＲ¹⁰であり、ただし、Ｒ³およびＲ⁴の
    両方が水素原子ではない；Ｒ⁶、Ｒ⁷、Ｒ⁸、Ｒ⁹、Ｒ¹⁰お
    よびＲ¹³は、それぞれ独立して、水素原子または（Ｃ₁
    −Ｃ₆）アルキルであり；Ｘは、クロロであり；そして
    Ｙは、水素原子である〕を有するピリジンカルボキサミ
    ド；またはそれらの光学的対掌体を使用する、請求項９
    に記載の方法。
11. 【請求項１１】 構造式（Ｖ）： 【化５】 〔式中、Ｄは、ＯまたはＳであり；Ｒ¹およびＲ²は、そ
    れぞれ独立して、水素原子、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル、ハ
    ロ（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル、（Ｃ₂−Ｃ₆）アルケニルまた
    は（Ｃ₂−Ｃ₆）アルキニルであり、ただしＲ¹およびＲ²
    の両方が水素原子ではない；Ｒ³、Ｒ⁴およびＲ⁵は、そ
    れぞれ独立して、水素原子、ハロ、シアノ、（Ｃ₁−
    Ｃ₆）アルキル、ハロ（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル、（Ｃ₂−Ｃ
    ₆）アルケニル、（Ｃ₂−Ｃ₆）アルキニル、（Ｃ₁−
    Ｃ₆）アルコキシ、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキルチオ、ハロ
    （Ｃ₁−Ｃ₆）アルコキシ、ニトロ、カルボキシ、−ＮＲ
    ⁶Ｒ⁷、−ＣＲ⁸＝ＮＯＲ⁹、−ＮＨＣＯＯＲ¹⁰、−ＣＯＮ
    Ｒ¹¹Ｒ¹²または−ＣＯＯＲ¹³であり；またはＲ³および
    Ｒ⁴はいっしょになってＯ、Ｓ、ＮおよびＰからなる群
    から選ばれた２個までのヘテロ原子を含有してもよい
    ５、６または７員の縮合環を形成してもよく；Ｒ⁶、
    Ｒ⁷、Ｒ⁸、Ｒ⁹、Ｒ¹⁰、Ｒ¹¹、Ｒ¹²およびＲ¹³は、それ
    ぞれ独立して、水素原子または（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキルで
    あり、そしてＸおよびＹは、それぞれ独立して、水素原
    子、ハロ、シアノ、チオシアノ、イソチオシアノまたは
    （Ｃ₁−Ｃ₆）アルキルスルホニルオキシであり、ただ
    し、ＸおよびＹの両方が水素原子ではない〕を有するフ
    リルカルボキサミドまたはチエニルカルボキサミド；ま
    たはそれらの光学的対掌体を使用する、請求項１に記載
    の方法。
12. 【請求項１２】 構造式（ＶＩ）： 【化６】 〔式中、Ｄは、ＯまたはＳであり；Ｒ¹およびＲ²は、そ
    れぞれ独立して、水素原子、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル、ハ
    ロ（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル、（Ｃ₂−Ｃ₆）アルケニルまた
    は（Ｃ₂−Ｃ₆）アルキニルであり、ただしＲ¹およびＲ²
    の両方が水素原子ではない；Ｒ³、Ｒ⁴およびＲ⁵は、そ
    れぞれ独立して、水素原子、ハロ、シアノ、（Ｃ₁−
    Ｃ₆）アルキル、ハロ（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル、（Ｃ₂−Ｃ
    ₆）アルケニル、（Ｃ₂−Ｃ₆）アルキニル、（Ｃ₁−
    Ｃ₆）アルコキシ、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキルチオ、ハロ
    （Ｃ₁−Ｃ₆）アルコキシ、ニトロ、カルボキシ、−ＮＲ
    ⁶Ｒ⁷、−ＣＲ⁸＝ＮＯＲ⁹、−ＮＨＣＯＯＲ¹⁰、−ＣＯＮ
    Ｒ¹¹Ｒ¹²または−ＣＯＯＲ¹³であり；Ｒ⁶、Ｒ⁷、Ｒ⁸、
    Ｒ⁹、Ｒ¹⁰、Ｒ¹¹、Ｒ¹²およびＲ¹³は、それぞれ独立し
    て、水素原子または（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキルであり；そし
    てＸおよびＹは、それぞれ独立して、水素原子、ハロ、
    シアノ、チオシアノ、イソチオシアノおよび（Ｃ₁−
    Ｃ₆）アルキルスルホニルオキシから選ばれ、ただし、
    ＸおよびＹの両方が水素原子ではない〕を有するフリル
    カルボキサミドまたはチエニルカルボキサミド；または
    それらの光学的対掌体を使用する、請求項１に記載の方
    法。