JPH10165181A - 耐熱性イソクエン酸脱水素酵素遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【解決手段】 耐熱性イソクエン酸脱水素酵素をコード
するＤＮＡ、該ＤＮＡを含有する組換えベクター、該組
換えベクターで形質転換した形質転換体、および該形質
転換体を培地に培養して耐熱性イソクエン酸脱水素酵素
を採取することを特徴とする耐熱性イソクエン酸脱水素
酵素の製造法。 【効果】 本発明によれば、耐熱性イソクエン酸脱水素
酵素を効率良く生産できる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、サーマス アクア
ティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）由来
の耐熱性イソクエン酸脱水素酵素をコードするＤＮＡ、
該ＤＮＡを含有する組換えベクター、該組換えベクター
で形質転換した形質転換体、および該形質転換体を用い
たイソクエン酸脱水素酵素の製造法に関する。

【０００２】

【従来の技術】イソクエン酸脱水素酵素は、基質イソク
エン酸を補酵素ＮＡＤＰと必須金属Ｍｇ²⁺を伴って酸化
的脱炭酸によりα−ケトグルタル酸を生成する反応を触
媒する酵素であり、Ｄ−イソクエン酸の測定用試薬とし
て有用である。しかしながら、これまで知られているイ
ソクエン酸脱水素酵素は、一般に熱に対して失活しやす
く、上記測定系における酵素試薬として利用する際の安
定性に欠け、また製造法が煩雑であり、高い生産量を安
価にあげることができない等の問題があった。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の課題
は、高温でも失活しない耐熱性イソクエン酸脱水素酵素
を簡便に、しかも高生産量で生産すべく、その生産の元
となる耐熱性イソクエン酸脱水素酵素をコードするＤＮ
Ａ、該ＤＮＡを含む組換えベクター、該組換えベクター
で形質転換した形質転換体を用いた耐熱性イソクエン酸
脱水素酵素の製造法を提供することにある。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、高度好熱菌サーマ
ス アクアティカスより耐熱性イソクエン酸脱水素酵素
遺伝子を単離・構造決定するとともに、更に、遺伝子工
学的手法を用いて耐熱性イソクエン酸脱水素酵素を効率
よく生産できることに成功し、本発明を完成するに到っ
た。

【０００５】即ち、本発明は、配列番号１で表されるア
ミノ酸配列、又は該アミノ酸配列において１もしくは複
数のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換されたものであ
って、且つイソクエン酸脱水素酵素活性をもたらすアミ
ノ酸配列をコードする耐熱性イソクエン酸脱水素酵素を
コードするＤＮＡである。本発明はまた、該ＤＮＡを含
有する組換えベクター、該組換えベクターで形質転換し
た形質転換体、および該形質転換体を培地に培養して耐
熱性イソクエン酸脱水素酵素を採取することを特徴とす
る耐熱性イソクエン酸脱水素酵素の製造法である。以
下、本発明を詳細に説明する。

【０００６】

【発明の実施の形態】本発明の耐熱性イソクエン酸脱水
素酵素をコードするＤＮＡは、例えば耐熱性イソクエン
酸脱水素酵素を生産する耐熱性イソクエン酸脱水素酵素
遺伝子の供与体である微生物より得られる。かかる微生
物としてはサーマス アクアティカスに属する微生物、
具体的にはサーマス アクアティカスＹＴ１（ATCC 251
04) が使用できる。

【０００７】本発明の耐熱性イソクエン酸脱水素酵素を
コードするＤＮＡは、以下の工程を経て取得できる。 (i) 耐熱性イソクエン酸脱水素酵素を生産する耐熱性
イソクエン酸脱水素酵素遺伝子の供与体である微生物か
らＤＮＡを分離・精製し、該ＤＮＡを制限酵素を用いて
切断したものと、リニヤーなベクターとを両ＤＮＡの接
着末端部においてＤＮＡリガーゼなどによって結合閉環
させて組換えＤＮＡベクターを得、(ii) 該組換えＤＮ
Ａベクターを複製可能な宿主微生物に移入し、耐熱性イ
ソクエン酸脱水素酵素由来の部分アミノ酸配列を基に作
成された合成ＤＮＡプローブなどによりコロニーハイブ
リダイゼーションを行って、該組換えＤＮＡベクターを
保持する微生物を単離し、そして、(iii)該微生物培養
菌体から該組換えＤＮＡベクターを分離・精製し、これ
より制限酵素にて目的するＤＮＡを切り出す。

【０００８】以下に、上記取得方法を詳細に説明する。
まず、供与微生物である上述した細菌を例えば液体培地
で約１〜２日間通気撹拌培養し、得られる培養物を遠心
分離して集菌し、次いでこれを溶菌させることにより耐
熱性イソクエン酸脱水素酵素遺伝子の含有溶菌物を調製
することができる。溶菌方法としては、例えばリゾチー
ムなどの細胞壁溶解酵素により処理を施し、必要により
プロテアーゼなどの他の酵素やラウリル硫酸ナトリウム
などの界面活性剤が併用して、さらに細胞壁の物理的破
壊方法である凍結融解やフレンチプレス処理を上述の溶
菌法と組合わせて行ってもよい。

【０００９】このようにして得られた溶菌物からＤＮＡ
を分離・精製するには常法に従って、例えばフェノール
抽出による除蛋白処理、プロテアーゼ処理、リボヌクレ
アーゼ処理、アルコール沈殿遠心分離などの方法を適宜
組合わせることにより行うことができる。

【００１０】分離・精製された微生物のＤＮＡを切断す
る方法は、例えば超音波処理、制限酵素処理などにより
行うことができるが、得られるＤＮＡ断片とベクターと
の結合を容易ならしめるため制限酵素処理により行うこ
とがことが好ましい。制限酵素としてはとりわけ特定ヌ
クレオチド配列に作用する、例えばＨｉｎｄＩＩＩ、Ｂ
ａｍＨＩ、ＳａｃＩなどのＩＩ型制限酵素が適してい
る。

【００１１】ベクターとしては、宿主微生物で自律的に
増殖しうるファージまたはプラスミドから遺伝子組換え
用として構築されたものが適している。ファージとして
は、例えばエシェリシア コリー（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈ
ｉａ ｃｏｌｉ）を宿主微生物とする場合にはＭ１３ｍ
ｐ１８、λｇｔ１０、λｇｔ１１などが使用できる。ま
たプラスミドとしては、例えばエシェリシア コリーを
宿主微生物とする場合にはｐＢＲ３２２、ｐＡＣＹＣ１
８４、ｐＵＣ１１８、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔなどが使
用できる。このようなベクターを先に述べた耐熱性イソ
クエン酸脱水素酵素遺伝子供与体である微生物ＤＮＡの
切断に使用した制限酵素と同じ制限酵素で切断して、ベ
クター断片を得ることが望ましい。

【００１２】微生物ＤＮＡ断片とベクター断片とを結合
させる方法は、公知のＤＮＡリガーゼを用いる方法であ
ればよく、例えば微生物ＤＮＡ断片の接着末端とベクタ
ー断片の接着末端とのアニーリングの後、適当なＤＮＡ
リガーゼの使用により微生物ＤＮＡ断片とベクター断片
との組換えＤＮＡを作成する。必要ならばアニーリング
の後、宿主微生物に移して、生体内のＤＮＡリガーゼを
利用し、組換えＤＮＡを作成することもできる。

【００１３】宿主微生物としては、組換えＤＮＡが安定
かつ自律的に増殖可能であればよく、例えばエシェリシ
ア コリーＸＬ１−ＢｌｕｅＭＲＦ’、エシェリシア
コリーＪＭ１０９、エシェリシア コリーＨＢ１０１な
どが利用できる。

【００１４】宿主微生物に組換えＤＮＡを移入する方法
としては、例えば宿主微生物がエシェリシア属に属する
微生物の場合には、市販のコンピテントセルを用いて組
換えＤＮＡの移入を行い、さらにマイクロインジェクシ
ョン法を用いてもよい。

【００１５】宿主微生物への目的組換えＤＮＡ移入の有
無についての選択は、目的組換えＤＮＡを保持するベク
ターの薬剤体制マーカーと耐熱性イソクエン酸脱水素酵
素とを同時に発現しうる微生物を検索する方法、あるい
は選択培地に生育したコロニーについて、アミノ酸配列
をもとに合成したＤＮＡプローブとハイブリダイゼーシ
ョンを行い検索する方法などが挙げられる。

【００１６】上述の方法により得られた耐熱性イソクエ
ン酸脱水素酵素遺伝子の塩基配列は、サイエンス（Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ）、２１４、１２０５−１２１０（１９８
１）に記載されているジデオキシ法で解読し（配列番号
２）、また耐熱性イソクエン酸脱水素酵素の全アミノ酸
配列は塩基配列より推定する（配列番号１）。一方、配
列番号１で表されるアミノ酸配列において１もしくは複
数のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換された配列をコ
ードするＤＮＡを得るには、多くの方法を用いることが
できる。例えば、点変異又は欠失変異を生じさせるため
に遺伝子を変異源処理する方法；遺伝子を選択的に開裂
し、次に選択されたヌクレオチドを除去又は付加し、そ
して遺伝子を連結する方法；オリゴヌクレオチド変異誘
発法等が挙げられる。このようにして一度選択された耐
熱性イソクエン酸脱水素酵素遺伝子を保有する組換えＤ
ＮＡは、形質転換微生物から取り出され、他の宿主微生
物に移入することも容易に実施できる。また、耐熱性イ
ソクエン酸脱水素酵素遺伝子を保有する組換えＤＮＡか
ら制限酵素などにより切断して、耐熱性イソクエン酸脱
水素酵素遺伝子ＤＮＡを切り出し、これを同様な方法に
より切断して得られるベクター断片とを結合させて、宿
主微生物に移入することも容易に実施できる。

【００１７】形質転換体である宿主微生物の培養形態は
宿主の栄養生理的性質を考慮して培養条件を選択すれば
よく、通常多くの場合は液体培養で行うが、工業的には
通気撹拌培養を行うのが有利である。培地の栄養源とし
ては、微生物の培養に通常用いられるものが広く使用さ
れうる。炭素源としては、資化可能な炭素化合物であれ
ばよく、例えばグルコース、スクロース、ラクトース、
糖蜜、ピルビン酸などが使用される。窒素源としては、
利用可能な窒素化合物であればよく、例えばペプトン、
肉エキス、酵母エキスなどが使用される。その他、リン
酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カルシウム、カ
リウム、鉄、マンガン、亜鉛などの塩類、特定のアミノ
酸、特定のビタミンなどが必要に応じて使用される。

【００１８】培養温度は菌が生育し、耐熱性イソクエン
酸脱水素酵素を生産する範囲で適宜変更しうるが、エシ
ェリシア コリーの場合、好ましくは、２０〜４２℃程
度である。培養時間は条件によって多少異なるが、耐熱
性イソクエン酸脱水素酵素が最高収量に達する時間を見
計らって適当な時期に培養を終了すればよく、通常は、
１２〜３６時間程度である。培地pHは菌が発育し、耐熱
性イソクエン酸脱水素酵素を生産する範囲で適宜変更し
うるが、特に好ましくはｐＨ６．０〜８．０程度であ
る。

【００１９】培養物中の耐熱性イソクエン酸脱水素酵素
は、培養物をろ過または遠心分離などの手段により、菌
体を採取し、次いでこの菌体を機械的方法またはリゾチ
ームなどの酵素法で破壊し、また必要に応じてエチレン
ジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）などのキレート剤および／
または界面活性剤を添加して耐熱性イソクエン酸脱水素
酵素を可溶化し、水溶液として分離採取する。

【００２０】このようにして得られた耐熱性イソクエン
酸脱水素酵素を、例えば減圧濃縮、膜濃縮、さらに硫酸
アンモニウム、硫酸ナトリウムなどの塩析処理、あるい
は親水性有機溶媒、例えばメタノール、エタノール、ア
セトンなどによる分別沈殿法により沈殿せしめればよ
い。以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本
発明はこれらに限定されるものではない。

【００２１】

【実施例】

〔実施例１〕（染色体ＤＮＡの分離） サーマス アクアティカスＹＴ１（ATCC 25104) の染色
体ＤＮＡを次の方法で分離した。同菌株を２００ｍｌの
０．５％ポリペプトン、０．３％酵母エキス、０．２％
塩化ナトリウム（ｐＨ７．５）よりなる液体培地で７０
℃一晩振とう培養後、遠心（４０００ｒｐｍ、１０分）
により集菌した。０．１５Ｍ塩化ナトリウム、０．１Ｍ
ＥＤＴＡにより菌体を一度洗浄し、再度遠心（４００
０ｒｐｍ、１０分）により集菌した。菌体の一部（０．
６ｇ）を１２ｍｌのトリス・塩酸（ｐＨ９．０）、１％
ラウリル硫酸ナトリウム、０．１Ｍ塩化ナトリウムを含
む溶液に懸濁し、凍結・融解を２度繰り返し、溶菌させ
た。この溶液にプロテイナーゼＫを１ｍｇ加え、５０℃
で３時間放置した。その後、等量のフェノールを加え、
ゆっくり撹拌し、遠心（４０００ｒｐｍ、１０分）によ
り水層と油層を分離し、水層を回収した。この操作をさ
らに２度繰り返し、最終的に採取した水層に２倍量のエ
タノールを静かに加えた。析出してきたＤＮＡをガラス
棒により巻取り、７０％エタノールにより洗浄後、２ｍ
ｌの１０ｍＭトリス・塩酸、１ｍＭＥＤＴＡに溶解し
た。エシェリシア コリーＸＬ１−ＢｌｕｅＭＲＦ’は
ストラタジーン社より購入し、ハナハンの方法によりコ
ンピテントセルを作成し、ライブラリー作成の宿主とし
て用いた。

【００２２】〔実施例２〕（耐熱性イソクエン酸脱水素
酵素をコードする遺伝子を含有するＤＮＡ断片および該
ＤＮＡ断片を有する組換えベクターの調製） 実施例１で得たＤＮＡ１μｇを制限酵素ＢａｍＨＩによ
り３７℃、２時間反応させ完全分解した後、制限酵素Ｂ
ａｍＨＩにより完全分解したベクター、ｐＢｌｕｅｓｃ
ｒｉｐｔＩＩＳＫ（＋）（ストラタジーン社製）１μｇ
とＴ４ＤＮＡリガーゼで１６℃一晩反応させ、ベクター
と連結した。連結したＤＮＡの一部を、エシェリシア
コリーＸＬ１−ＢｌｕｅＭＲＦ’のコンピテントセルに
導入し、約４０００個の形質転換体のコロニーを得た。
一方、サーマス アクアティカスの菌体より直接精製さ
れた該耐熱性イソクエン酸脱水素酵素のＮ末端アミノ酸
配列を決定し、この配列に基づく縮退合成ＤＮＡプロー
ブ（５’−ＡＴＣＣＡＧＡＴＣＣＣ［ＣＧ］ＣＡＧＧＡ
ＧＧＧ［ＣＧ］ＧＡＧＡＡＧＡＴＣＡＣ［ＣＧ］ＡＴＣ
ＣＡＧＧＡＧＧＧ−３’、［］で囲まれた箇所は縮退部
分）を作成した。先述の出現コロニーのレプリカを公知
の方法によりニトロセルロース膜に写し取り、公知の方
法により溶菌させＤＮＡを膜上に固定し、アマシャム社
製の合成ＤＮＡプローブラベリングキットによりラベル
された先のプローブを用いてコロニーハイブリダイゼー
ションを行った。この結果、２つのポジティブクローン
が得られ、両クローンとも同じ約３．０ｋｂのＢａｍＨ
Ｉ挿入断片をもっていた。このプラスミドの一つをｐＴ
ａｃ３１−１とした。

【００２３】〔実施例３〕（塩基配列の決定） ｐＴａｃ３１−１の３．０ｋｂのＢａｍＨＩ挿入断片に
ついて、ファルマシア製ＡｕｔｏＲｅａｄシーケンシン
グキットを用いて塩基配列の決定を行った。決定した塩
基配列を配列番号１に、またこれより推定されるアミノ
酸配列を配列番号２に示した。

【００２４】〔実施例４〕（発現プラスミドの構築） ｐＴａｃ３１−１の耐熱性イソクエン酸脱水素酵素遺伝
子の開始コドン近傍にＮｄｅＩ制限酵素部位を部位指定
突然変異により導入し、得られたプラスミドより制限酵
素ＮｄｅＩ、ＸｈｏＩを用いてコード領域を切り出し、
別に用意した発現ベクターｐｔＫＳＮｄ（−）に連結し
た。ｐｔＫＳＮｄ（−）は、ストラタジーン社製のベク
ターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ（−）のｌａｃプ
ロモーターをｔａｃプロモーターに改変し、また、ｌａ
ｃＺ遺伝子の開始コドンに重なるようにＮｄｅＩ制限酵
素部位を導入したものである。こうして耐熱性イソクエ
ン酸脱水素酵素の高発現プラスミドｐＥＸＡＣ１を作成
した。このｐＥＸＡＣ１を用いて大腸菌 (Escherichia
coli) を形質転換した。得られた形質転換株は平成8 年
11月28日付けで工業技術院生命工学工業技術研究所にFE
RM P−15962 として寄託されている。

【００２５】〔実施例５〕（組換え耐熱性イソクエン酸
脱水素酵素遺伝子の発現） 実施例４で得た耐熱性イソクエン酸脱水素酵素の高発現
プラスミドｐＥＸＡＣ１をエシェリシア コリーＸＬ１
−ＢｌｕｅＭＲＦ’のコンピテントセルに導入し形質転
換体を得た。該形質転換体を２Ｌの１．６％トリプト
ン、１．０％酵母エキス、０．５％塩化ナトリウム、
０．１ｍＭイソプロピル−β−D−チオガラクトピラノ
シド、１００μｇ/μｌアンピシリン（ｐＨ７．５）を
含む液体培地で３７℃一晩振とう培養後、遠心（４００
０ｒｐｍ、１０分）により集菌した。菌体を３倍量の１
０ｍＭトリス・塩酸（ｐＨ７．６）、０．５ｍＭ ＥＤ
ＴＡを含む溶液に懸濁し、超音波により破砕した。懸濁
液を４５０００ｒｐｍ、３０分の超遠心を行うことによ
り細胞抽出液を得、上清を別のチューブに移し、７０
℃、３０分加熱処理をした。析出した変性蛋白質を遠心
除去し、次いで、上清をＤＥＡＥトヨパール（東ソー）
に通すことにより精製を行った。あらかじめ１０ｍＭト
リス・塩酸（ｐＨ７．６）、０．５ｍＭ ＥＤＴＡを含
む溶液で平衡化したＤＥＡＥトヨパールに先述の熱処理
済み蛋白質溶液を吸着させ、平衡化液で非吸着物質を洗
い流し、平衡化液にさらに１．０Ｍ塩化ナトリウムを加
えた溶液による濃度勾配をかけ、溶出する耐熱性イソク
エン酸脱水素酵素１００ｍｇを回収した。

【００２６】〔実施例６〕（耐熱性イソクエン酸脱水素
酵素の諸性質） (1) 至適温度 耐熱性イソクエン酸脱水素酵素の至適温度の測定は、５
０ｍＭトリス・塩酸（ｐＨ７．６）、０．５ｍＭ塩化マ
グネシウム、０．５ｍＭ ＮＡＤＰ、０．５ｍＭイソク
エン酸を含む、各温度に温めた活性測定溶液２００μｌ
に酵素液４μｌを加えることにより行った。活性の測定
は、補酵素ＮＡＤＰがＮＡＤＰＨに変換される際に生ず
る３４０ｎｍにおける吸収増大を追跡し、初速度を活性
値とした。図１に示すように、活性の至適温度は８５℃
付近であった。

【００２７】(2) 至適ｐＨ 耐熱性イソクエン酸脱水素酵素の活性の至適ｐＨの測定
は、０．５ｍＭ塩化マグネシウム、０．５ｍＭ ＮＡＤ
Ｐ、０．５ｍＭイソクエン酸を含む溶液に、終濃度５０
ｍＭとなる種々のｐＨのビストリスプロパンを加え、全
量を２００μｌとした溶液を作成し、酵素液４μｌを加
えることにより行った。活性の測定は、上記と同様であ
る。活性測定温度は６０℃に統一した。図２に示すよう
に、活性の至適ｐＨは８〜９．５付近であった。

【００２８】(3) 耐熱性 耐熱性イソクエン酸脱水素酵素の耐熱性の測定は、５０
ｍＭトリス・塩酸（ｐＨ７．６）、０．５ｍＭ塩化マグ
ネシウム、０．５ｍＭ ＮＡＤＰ、０．５ｍＭイソクエ
ン酸を含む活性測定溶液２００μｌに酵素液４μｌを加
えることにより行った。酵素液は、１０μｌを各温度で
１０分間加熱した後、そのうち４μｌを分取し活性測定
に用いた。図３に示すように、該耐熱性イソクエン酸脱
水素酵素は、８０℃、１０分の加熱処理に対しても活性
を損なうことなく、９０℃での熱処理後も２／３程度の
活性を有していた。

【００２９】

【発明の効果】本発明によれば、耐熱性イソクエン酸脱
水素酵素をコードする遺伝子、及び該遺伝子を用いた遺
伝子工学的手法による効率的な耐熱性イソクエン酸脱水
素酵素の製造法が提供される。

【００３０】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：４２６ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：２本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Met Ala Tyr Gln Arg Ile Gln Ile Pro Gln Glu Gly Glu Lys Ile Thr 1 5 10 15 Ile Gln Glu Gly Val Leu Lys Val Pro Asp Gln Pro Ile Ile Gly Phe 20 25 30 Ile Glu Gly Asp Gly Thr Gly Pro Asp Ile Trp Arg Ala Ala Gln Pro 35 40 45 Val Leu Asp Ala Ala Val Ala Lys Ala Tyr Gly Gly Gln Arg Arg Ile 50 55 60 Val Trp Val Glu Leu Tyr Ala Gly Glu Lys Ala Asn Gln Val Tyr Gly 65 70 75 80 Glu Pro Ile Trp Leu Pro Glu Glu Thr Leu Glu Phe Ile Arg Glu Tyr 85 90 95 Leu Val Ala Ile Lys Gly Pro Leu Thr Thr Pro Val Gly Gly Gly Ile 100 105 110 Arg Ser Ile Asn Val Ala Leu Arg Gln Glu Leu Asp Leu Tyr Ala Cys 115 120 125 Val Arg Pro Val Arg Trp Phe Gln Gly Val Pro Ser Pro Val Lys His 130 135 140 Pro Glu Leu Val Asn Met Val Ile Phe Arg Glu Asn Thr Glu Asp Ile 145 150 155 160 Tyr Ala Gly Ile Glu Trp Pro Ala Gly Ser Glu Glu Val Lys Lys Val 165 170 175 Leu Asp Phe Leu Lys Arg Glu Phe Pro Lys Ala Tyr Ala Lys Ile Arg 180 185 190 Phe Pro Glu Thr Ser Gly Leu Gly Leu Lys Pro Ile Ser Lys Glu Gly 195 200 205 Thr Glu Arg Leu Val Glu Ala Ala Ile Glu Tyr Ala Ile Lys Glu Asp 210 215 220 Leu Pro Ser Val Thr Leu Val His Lys Gly Asn Ile Met Lys Phe Thr 225 230 235 240 Glu Gly Ala Phe Arg Glu Trp Gly Tyr Ala Leu Ala Arg Glu Lys Tyr 245 250 255 Gly Ala Thr Pro Leu Asp Gly Gly Pro Trp His Val Leu Lys Asn Pro 260 265 270 Arg Thr Gly Arg Glu Ile Val Ile Lys Asp Met Ile Ala Asp Asn Phe 275 280 285 Leu Gln Gln Ile Leu Leu Arg Pro Asp Glu Tyr Ser Val Ile Ala Thr 290 295 300 Met Asn Leu Asn Gly Asp Tyr Ile Ser Asp Ala Leu Ala Ala Gln Val 305 310 315 320 Gly Gly Ile Gly Ile Ala Pro Gly Ala Asn Ile Asn Tyr Lys Thr Gly 325 330 335 His Ala Val Phe Glu Ala Thr His Gly Thr Ala Pro Lys Tyr Ala Gly 340 345 350 Gln Asp Lys Val Asn Pro Ser Ser Val Ile Leu Ser Gly Glu Met Met 355 360 365 Leu Arg Tyr Leu Gly Trp Asn Glu Ala Ala Asp Leu Ile Ile Arg Ala 370 375 380 Met Glu Arg Thr Ile Ser Lys Gly Leu Val Thr Tyr Asp Phe His Arg 385 390 395 400 Leu Leu Val Ala Glu Gly Lys Pro Ala Thr Leu Leu Lys Thr Ser Glu 405 410 415 Phe Gly Gln Ala Leu Ile Gln His Met Asp *** 420 425

【００３１】配列番号：２ 配列の長さ：２８７２ 配列の型：核酸 鎖の数：２本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：染色体ＤＮＡ 起源：サーマス アクアティカス 株名：ＹＴ１（ＡＴＣＣ２５１０４） 配列 GCTCCTTCCC GTGGACCCCT GGGCGAAGGT GGCCTCCTTC TCCAAAAGGA GGACCTTAAG 60 CCCCGCCTCC GCTAGCCGGT AGGCCGAGGC CGCCCCTACG ATCCCCGCCC CCACCACCAG 120 CACATCCGCC ACCTCCCCAG TTTAGGAAGC CGGGAGTATG CTAGGCCCCG GAGGTACCT 179 ATG GCC TAC CAG CGC ATC CAG ATT CCC CAG GAG GGC GAA AAG ATC ACC 227 Met Ala Tyr Gln Arg Ile Gln Ile Pro Gln Glu Gly Glu Lys Ile Thr 1 5 10 15 ATC CAA GAG GGC GTC CTG AAG GTG CCG GAC CAG CCC ATC ATC GGC TTC 275 Ile Gln Glu Gly Val Leu Lys Val Pro Asp Gln Pro Ile Ile Gly Phe 20 25 30 ATT GAG GGG GAT GGG ACC GGC CCT GAC ATC TGG AGA GCG GCC CAA CCC 323 Ile Glu Gly Asp Gly Thr Gly Pro Asp Ile Trp Arg Ala Ala Gln Pro 35 40 45 GTC CTA GAC GCC GCC GTG GCC AAA GCC TAC GGC GGG CAA CGG CGC ATC 371 Val Leu Asp Ala Ala Val Ala Lys Ala Tyr Gly Gly Gln Arg Arg Ile 50 55 60 GTC TGG GTG GAG CTT TAC GCC GGG GAA AAG GCC AAC CAG GTC TAC GGG 419 Val Trp Val Glu Leu Tyr Ala Gly Glu Lys Ala Asn Gln Val Tyr Gly 65 70 75 80 GAG CCC ATC TGG CTC CCC GAG GAG ACC CTG GAG TTC ATC CGG GAG TAC 467 Glu Pro Ile Trp Leu Pro Glu Glu Thr Leu Glu Phe Ile Arg Glu Tyr 85 90 95 CTG GTG GCC ATC AAG GGC CCC CTG ACC ACG CCG GTG GGC GGC GGC ATC 515 Leu Val Ala Ile Lys Gly Pro Leu Thr Thr Pro Val Gly Gly Gly Ile 100 105 110 CGG AGC ATC AAC GTG GCC CTC AGG CAG GAG CTG GAC CTC TAC GCC TGC 563 Arg Ser Ile Asn Val Ala Leu Arg Gln Glu Leu Asp Leu Tyr Ala Cys 115 120 125 GTG CGC CCC GTG CGC TGG TTC CAG GGG GTG CCC AGT CCG GTG AAG CAC 611 Val Arg Pro Val Arg Trp Phe Gln Gly Val Pro Ser Pro Val Lys His 130 135 140 CCG GAG CTG GTC AAC ATG GTC ATC TTC CGG GAG AAC ACC GAG GAC ATC 659 Pro Glu Leu Val Asn Met Val Ile Phe Arg Glu Asn Thr Glu Asp Ile 145 150 155 160 TAC GCC GGG ATT GAG TGG CCG GCG GGG AGC GAG GAG GTA AAG AAG GTC 707 Tyr Ala Gly Ile Glu Trp Pro Ala Gly Ser Glu Glu Val Lys Lys Val 165 170 175 CTA GAC TTC TTG AAG CGG GAG TTC CCC AAG GCC TAC GCC AAG ATC CGC 755 Leu Asp Phe Leu Lys Arg Glu Phe Pro Lys Ala Tyr Ala Lys Ile Arg 180 185 190 TTC CCC GAG ACC TCG GGC CTG GGC CTG AAG CCC ATC TCC AAG GAG GGC 803 Phe Pro Glu Thr Ser Gly Leu Gly Leu Lys Pro Ile Ser Lys Glu Gly 195 200 205 ACG GAG CGC CTG GTG GAG GCG GCC ATT GAG TAC GCC ATC AAG GAG GAC 851 Thr Glu Arg Leu Val Glu Ala Ala Ile Glu Tyr Ala Ile Lys Glu Asp 210 215 220 CTC CCC AGC GTG ACC CTG GTC CAC AAA GGC AAC ATC ATG AAG TTC ACC 899 Leu Pro Ser Val Thr Leu Val His Lys Gly Asn Ile Met Lys Phe Thr 225 230 235 240 GAA GGG GCC TTC CGG GAG TGG GGC TAC GCC CTG GCC CGG GAA AAG TAC 947 Glu Gly Ala Phe Arg Glu Trp Gly Tyr Ala Leu Ala Arg Glu Lys Tyr 245 250 255 GGG GCC ACG CCC CTG GAC GGC GGG CCC TGG CAC GTC CTC AAA AAC CCC 995 Gly Ala Thr Pro Leu Asp Gly Gly Pro Trp His Val Leu Lys Asn Pro 260 265 270 CGC ACC GGC AGG GAG ATC GTT ATC AAG GAC ATG ATC GCC GAC AAC TTC 1043 Arg Thr Gly Arg Glu Ile Val Ile Lys Asp Met Ile Ala Asp Asn Phe 275 280 285 CTG CAG CAG ATC CTC CTC CGC CCC GAC GAA TAC TCG GTG ATC GCC ACC 1091 Leu Gln Gln Ile Leu Leu Arg Pro Asp Glu Tyr Ser Val Ile Ala Thr 290 295 300 ATG AAC CTG AAC GGG GAC TAC ATC TCC GAT GCC CTG GCC GCC CAG GTG 1139 Met Asn Leu Asn Gly Asp Tyr Ile Ser Asp Ala Leu Ala Ala Gln Val 305 310 315 320 GGG GGC ATC GGC ATC GCC CCC GGG GCC AAC ATC AAC TAC AAG ACG GGC 1187 Gly Gly Ile Gly Ile Ala Pro Gly Ala Asn Ile Asn Tyr Lys Thr Gly 325 330 335 CAC GCC GTC TTT GAG GCC ACC CAC GGC ACC GCC CCC AAG TAC GCT GGC 1235 His Ala Val Phe Glu Ala Thr His Gly Thr Ala Pro Lys Tyr Ala Gly 340 345 350 CAG GAC AAG GTG AAC CCC AGC AGC GTC ATC CTC TCC GGG GAG ATG ATG 1283 Gln Asp Lys Val Asn Pro Ser Ser Val Ile Leu Ser Gly Glu Met Met 355 360 365 CTT CGC TAC CTG GGC TGG AAC GAG GCG GCG GAC CTC ATC ATC AGG GCC 1331 Leu Arg Tyr Leu Gly Trp Asn Glu Ala Ala Asp Leu Ile Ile Arg Ala 370 375 380 ATG GAG AGG ACC ATC AGC AAG GGC CTG GTC ACC TAC GAC TTC CAC CGC 1379 Met Glu Arg Thr Ile Ser Lys Gly Leu Val Thr Tyr Asp Phe His Arg 385 390 395 400 CTC CTG GTG GCC GAG GGC AAG CCC GCC ACG CTT CTT AAG ACC AGC GAG 1427 Leu Leu Val Ala Glu Gly Lys Pro Ala Thr Leu Leu Lys Thr Ser Glu 405 410 415 TTC GGC CAG GCC CTG ATC CAG CAC ATG GAC TGA AAACGTTTGG GGCCCCCGCC 1480 Phe Gly Gln Ala Leu Ile Gln His Met Asp *** 420 425 GTGGCAAAAG CCACGGCGGG GTGCTTAGAC CAGGGCGAAG CGGGCCTCGA GGGCCGGAAG 1540 GTCCGCCTCC AGGAAGCGGA GGCGGACCTC GGCGTTGAGG GCAAGAGGCC CGGAGAGGGC 1600 CACCTGGGCG GAAAGCCCGA GCTCCGGGAG GAGGAAGACC CCCTGTCCCC CCGGCCTCTC 1660 CACCAGGACG CCCGGGCCCT CGTAGCCCTT TTCCATCAGG TAGAGGAGGG TCCAGTGGAG 1720 CTTGCTCCGC CTCTCCCCTT CCCGCACCAG GTCGGCCACC GCCTCCGCCG CCCCCACCCG 1780 CTCCAGGACC TCCCCCTGGG AAAGGGGCCT TTCCCCCTTG AGCCAGGCCC TGAGCTGCTG 1840 GTGAGCCACC AGGTCCAGGT AGCGCCTTAA GGGGCTCGTC ACCTGGGCGT AGAGGGGAAG 1900 GCCGAGGCCC CGGTGGGGGG CGGGGACGGCC TTGAGCTGCG CCCTCTTCA GGGTCTTCCG 1960 CTGCGCCCAC ATGGCGGCGA GGCCCTCCCCC TCCACCCGGT GGGAAGGGGC CTCCTGGGT 2020 GGCGAAGGGA AAGGGAAGGC CCTCCCTCAGG GCCAGGTGGG CGGCGCGTAG GCGAAGGAG 2080 CATGGCCTCC CGCACCCAGA CCCGGCTTTCA TAGGGGGGAA GGGGGGTGAT CCGGATCTC 2140 CTCCCCCTCC ACCCGAACCT TGACCTCGGGC AGGGCGATGT CCAAAGCCCC CTGGGCCAG 2200 GCGCTTCCGA AAAAAGTCCC CCGCCAAGGCC TTCATGGGCG CCAGGGCCTC CACCTCGAG 2260 GGCTCCCGGT AGAAAGCCGC CTCACCCGCAC CCAGGAGAGG TAAAGGTCCT CCCGCAAAA 2320 GGCTCCTTCC GGGGAGACCA GAAGCTCAAAG GTGAGGGCTG GGGAGACCTC CTTAAGCCC 2380 CAGCCCAGGG CCTCGGTCAC CGCCAGGGGGA GCATGGGCAC CGTGCCCTCG GGCAGATAG 2440 AGGTTGGCCC CCCGGCGGAG GGCCTCCTGGT CCAGGGGGCT TCCCGGCCCG ACCAAAGCG 2500 GCCACATCGG CCACATGGAC GAAAAGGTGGA AGCCCTCCTC CACCCTTTCG GCGTAAAGG 2560 GCGTCGTCCG GGTCCTGGCT CCCCTCGTCGT CAATGGCGAA GGCGGGGAGG TGGGTGAGG 2620 TCCACCCGCT CCTCCTCGGG CAGGGGGGGGA CGGGGAGGTC CGGCGGGGCC AGGGGAAGG 2680 CCAAGCCGCC TGGGGTGGGG GTTTTCCCGCC GCCAGAGGCC CAGGCGGAGA AGGAGCCGT 2740 GGGCGGCCTC GGGGGTTTCG GGAAGGCCCAG GGCCTTGAGA AGCCGGCTTT CCTTCCTCT 2800 CGCCGTGGGC CAGAGCCTCC ACCTCGGCCAG GAGGGGGCGG TCCTCGAGGG AGGGCCGTC 2860 CCTGGCGGAT CC 2872

【図面の簡単な説明】

【図１】 各温度における耐熱性イソクエン酸脱水素酵
素活性を示す。

【図２】 各ｐＨにおける耐熱性イソクエン酸脱水素酵
素活性を示す。

【図３】 耐熱性イソクエン酸脱水素酵素活性の熱安定
性を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/04 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号１記載のアミノ酸配列、又は該
   アミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が付
   加、欠失もしくは置換されたものであって、且つイソク
   エン酸脱水素酵素活性をもたらすアミノ酸配列を有する
   耐熱性イソクエン酸脱水素酵素をコードするＤＮＡ。
2. 【請求項２】 配列番号２記載の塩基配列を有する、耐
   熱性イソクエン酸脱水素酵素をコードするＤＮＡ。
3. 【請求項３】 サーマス アクアティカス由来である請
   求項２記載のＤＮＡ。
4. 【請求項４】 請求項１〜３いずれかに記載のＤＮＡを
   ベクターＤＮＡに挿入してなることを特徴とする組換え
   ベクター。
5. 【請求項５】 請求項４記載の組換えベクターで形質転
   換した形質転換体。
6. 【請求項６】 請求項５記載の形質転換体を培地に培養
   し、培養物から耐熱性イソクエン酸脱水素酵素を採取す
   ることを特徴とする耐熱性イソクエン酸脱水素酵素の製
   造法。
7. 【請求項７】 配列番号１記載のアミノ酸配列、又は該
   アミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が付
   加、欠失もしくは置換されたものであって、且つイソク
   エン酸脱水素酵素活性をもたらすアミノ酸配列を有する
   耐熱性イソクエン酸脱水素酵素。